JPH0681598B2 - 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法 - Google Patents
澱粉の糖化によるグルコースの製造方法Info
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- JPH0681598B2 JPH0681598B2 JP3126224A JP12622491A JPH0681598B2 JP H0681598 B2 JPH0681598 B2 JP H0681598B2 JP 3126224 A JP3126224 A JP 3126224A JP 12622491 A JP12622491 A JP 12622491A JP H0681598 B2 JPH0681598 B2 JP H0681598B2
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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Description
【０００１】
【技術分野】本発明は、新規な澱粉糖酵素剤を用いた澱
粉の糖化によるグルコースの製造方法に関するものであ
る。
粉の糖化によるグルコースの製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】プルラナーゼはプルランのα−１，６−
グルコシド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放線菌などに広く存
在することが知られている。プルラナーゼはアミロペク
チン、あるいはこれを含む澱粉に作用させたとき、その
分岐結合（α−１，６−グルコシド結合）を切断してア
ミロース様多糖を生成することから沃度反応の増加をと
もなうことが知られているが、α−１，４−グルコシド
結合は切断することはできない。一方、α−１，４−グ
ルコシド結合を切断するα−アミラーゼやβ−アミラー
ゼなどの各種アミラーゼはα−１，６−グルコシド結合
を切断することはできない。極めて、まれな例外とし
て、グルコアミラーゼはα−１，４−グルコシド結合の
みでなく、α−１，６−グルコシド結合も切断すること
ができる。
グルコシド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放線菌などに広く存
在することが知られている。プルラナーゼはアミロペク
チン、あるいはこれを含む澱粉に作用させたとき、その
分岐結合（α−１，６−グルコシド結合）を切断してア
ミロース様多糖を生成することから沃度反応の増加をと
もなうことが知られているが、α−１，４−グルコシド
結合は切断することはできない。一方、α−１，４−グ
ルコシド結合を切断するα−アミラーゼやβ−アミラー
ゼなどの各種アミラーゼはα−１，６−グルコシド結合
を切断することはできない。極めて、まれな例外とし
て、グルコアミラーゼはα−１，４−グルコシド結合の
みでなく、α−１，６−グルコシド結合も切断すること
ができる。
【０００３】α−１，６−グルコシド結合を切断する酵
素にはプルラナーゼの他に、イソアミラーゼ、Ｒ−酵
素、アミロ−１，６−グルコシダーゼと呼ばれる種々な
酵素があり、総称してα−１，６−グルコシダーゼある
いは、一般に、枝切り酵素(debranching enzyme)と呼ば
れている。プルラナーゼなど枝切り酵素は、最近、β−
アミラーゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させること
により、マルトースを収量よく生産するのに使用した
り、また、グルコアミラーゼの分岐（α−１，６−グル
コシド結合）切断能力をおぎなうために、グルコアミラ
ーゼと併用することにより、澱粉からグルコースを収量
よく製造するために使用される有用な酵素である。
素にはプルラナーゼの他に、イソアミラーゼ、Ｒ−酵
素、アミロ−１，６−グルコシダーゼと呼ばれる種々な
酵素があり、総称してα−１，６−グルコシダーゼある
いは、一般に、枝切り酵素(debranching enzyme)と呼ば
れている。プルラナーゼなど枝切り酵素は、最近、β−
アミラーゼと組み合わせて澱粉に同時に作用させること
により、マルトースを収量よく生産するのに使用した
り、また、グルコアミラーゼの分岐（α−１，６−グル
コシド結合）切断能力をおぎなうために、グルコアミラ
ーゼと併用することにより、澱粉からグルコースを収量
よく製造するために使用される有用な酵素である。
【０００４】しかし、例えば、プルラナーゼをグルコア
ミラーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがpH４
〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつために、少なく
とも55〜60℃で長時間使用できる熱安定性をもち、且つ
pH４〜５で作用できる酵素であることが要求される。し
かるに、従来、知られている多くの枝切り酵素は、一部
の微生物のもの〔バシルス・ステアロサーモフイラス
（日本農芸化学会大会昭和47年度講演要旨、第88頁）、
バシルス・アシドプルリティカス（特開昭57-174089 号
公報、Starch,34, 340 (1982)）〕を除き、殆どは最適
作用温度が40〜50℃付近にあって、熱安定性に劣ること
が欠点であった。
ミラーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがpH４
〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつために、少なく
とも55〜60℃で長時間使用できる熱安定性をもち、且つ
pH４〜５で作用できる酵素であることが要求される。し
かるに、従来、知られている多くの枝切り酵素は、一部
の微生物のもの〔バシルス・ステアロサーモフイラス
（日本農芸化学会大会昭和47年度講演要旨、第88頁）、
バシルス・アシドプルリティカス（特開昭57-174089 号
公報、Starch,34, 340 (1982)）〕を除き、殆どは最適
作用温度が40〜50℃付近にあって、熱安定性に劣ること
が欠点であった。
【０００５】〔目 的〕本発明者らは、前記目的にかな
った枝切り酵素を開発することを目的として、広く自然
界より微生物の検索を行ってきた結果pH約５〜約7.5 の
広いpH範囲に最適pHをもつ耐熱性のプルラナーゼ様酵素
がバシルス・スブチルス(Bacillus subtilis) ＴＵと同
定した細菌により生産させることを認めた。前記の細菌
は、後述する菌学的性質を有し、微工研条寄第684 号と
して、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
った枝切り酵素を開発することを目的として、広く自然
界より微生物の検索を行ってきた結果pH約５〜約7.5 の
広いpH範囲に最適pHをもつ耐熱性のプルラナーゼ様酵素
がバシルス・スブチルス(Bacillus subtilis) ＴＵと同
定した細菌により生産させることを認めた。前記の細菌
は、後述する菌学的性質を有し、微工研条寄第684 号と
して、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
【０００６】本酵素はプルランに作用させたとき、殆ど
マルトトリオースに分解するα−１，６−グルコシダー
ゼ活性を示すが、同時に、同酵素を澱粉などに作用させ
た場合、主としてマルトースとマルトトリオースに分解
する新規なα−アミラーゼ活性をもっている。そして、
本酵素剤を、グルコアミラーゼと併用して澱粉を糖化す
るとき、グルコアミラーゼ単独の場合よりも糖化反応が
著しく促進されるばかりか、最終的なグルコースの収量
が0.5 〜３％増加できる極めて有用な酵素である。そし
て、また、本発明の酵素剤のもつα−アミラーゼ活性
は、アミロース、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン
などに作用させた場合、マルトースとマルトトリオース
を約40〜約50％の高収量で生成する興味ある新規な酵素
活性である。これは、本酵素剤がα−１，６−グルコシ
ド結合を分解する酵素活性を併せて保持しているため、
アミロペクチンや澱粉のように分岐結合をもつ基質から
も、マルトースとマルトトリオースが極めて高い収量で
得られるものと考えられる。本発明はこのような知見に
もとづいてなされたものである。
マルトトリオースに分解するα−１，６−グルコシダー
ゼ活性を示すが、同時に、同酵素を澱粉などに作用させ
た場合、主としてマルトースとマルトトリオースに分解
する新規なα−アミラーゼ活性をもっている。そして、
本酵素剤を、グルコアミラーゼと併用して澱粉を糖化す
るとき、グルコアミラーゼ単独の場合よりも糖化反応が
著しく促進されるばかりか、最終的なグルコースの収量
が0.5 〜３％増加できる極めて有用な酵素である。そし
て、また、本発明の酵素剤のもつα−アミラーゼ活性
は、アミロース、アミロペクチン、澱粉、グリコーゲン
などに作用させた場合、マルトースとマルトトリオース
を約40〜約50％の高収量で生成する興味ある新規な酵素
活性である。これは、本酵素剤がα−１，６−グルコシ
ド結合を分解する酵素活性を併せて保持しているため、
アミロペクチンや澱粉のように分岐結合をもつ基質から
も、マルトースとマルトトリオースが極めて高い収量で
得られるものと考えられる。本発明はこのような知見に
もとづいてなされたものである。
【０００７】〔構 成〕本発明は、澱粉又は液化澱粉
に、バシルス属細菌の生産する新規なα−アミラーゼ活
性をもつプルラナーゼ様酵素剤を、グルコアミラーゼ、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼなどの、他のアミラー
ゼと併用することからなる澱粉の糖化方法に関するもの
である。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。
に、バシルス属細菌の生産する新規なα−アミラーゼ活
性をもつプルラナーゼ様酵素剤を、グルコアミラーゼ、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼなどの、他のアミラー
ゼと併用することからなる澱粉の糖化方法に関するもの
である。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。
【０００８】本発明において使用されるα−アミラーゼ
活性をもつ新規なプルラナーゼ様酵素剤は、プルランを
基質とするとき、最終的に主としてマルトトリオースを
生成するプルラナーゼ活性を示すが、同時に、アミロー
ス、アミロペクチン、グリコーゲンなどのα−１，４−
グルコシド結合分解活性をもち、マルトースとマルトト
リオースをほぼ半量に、且つ主成分として生成するα−
アミラーゼ活性をもつ、興味ある新規な酵素剤である
が、このプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫
安分画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交換体によ
る吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、無機担体などへ
の吸着などのタンパク質精製方法によっては分離され
ず、SephadexG-200 (Phermacia Fine Chemicals 製）、
CellulofineGC700m（チツソ（株）製）やBiogel A 0.5m
(Bio-Rad Lab. （株））などを用いたゲル濾過法によ
り測定した分子量が45〜55万の高分子量である（通常の
プルラナーゼの分子量は10万前後）であることから、そ
れぞれの活性をもつ複数個のサブユニットがかなり強固
に結合し、複合酵素を形成していることが考えられる。
（図３はBiogel A 1.5m によるα−アミラーゼ活性、プ
ルラナーゼ活性及びタンパク質の溶出曲線を示している
が、これら三者の溶出パターンは完全に一致してい
る）。
活性をもつ新規なプルラナーゼ様酵素剤は、プルランを
基質とするとき、最終的に主としてマルトトリオースを
生成するプルラナーゼ活性を示すが、同時に、アミロー
ス、アミロペクチン、グリコーゲンなどのα−１，４−
グルコシド結合分解活性をもち、マルトースとマルトト
リオースをほぼ半量に、且つ主成分として生成するα−
アミラーゼ活性をもつ、興味ある新規な酵素剤である
が、このプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫
安分画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交換体によ
る吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、無機担体などへ
の吸着などのタンパク質精製方法によっては分離され
ず、SephadexG-200 (Phermacia Fine Chemicals 製）、
CellulofineGC700m（チツソ（株）製）やBiogel A 0.5m
(Bio-Rad Lab. （株））などを用いたゲル濾過法によ
り測定した分子量が45〜55万の高分子量である（通常の
プルラナーゼの分子量は10万前後）であることから、そ
れぞれの活性をもつ複数個のサブユニットがかなり強固
に結合し、複合酵素を形成していることが考えられる。
（図３はBiogel A 1.5m によるα−アミラーゼ活性、プ
ルラナーゼ活性及びタンパク質の溶出曲線を示している
が、これら三者の溶出パターンは完全に一致してい
る）。
【０００９】本発明により生産される酵素のプルラン分
解活性の酵素的性質を以下に記載する。 （１）作用；プルランのα−１，６−グルコシド結合を
分解し、主としてマントトリオースを生成する。 （２）作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、0.05
Ｍトリス緩衝液（pH7.0)の下で30分間反応したとき、約
80℃まで作用し、最適作用温度は60〜63℃（図２）。 （３）作用pH及び最適作用pH；１％プルラン、0.05Ｍ緩
衝液で測定したとき、pH約４〜約10の広い範囲に作用す
る。図１に示す通り、pH５付近とpH７〜7.5 にピークが
認められ、最適作用pHは約５〜約7.5 の広い範囲にある
と考えられる（図１、クエン酸−リン酸ニナトリウム緩
衝液とリン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分間反
応）。 （４）熱安定性；0.05Ｍトリス緩衝液（pH7.0 ）のもと
で各温度で10分間加熱後、プルランを基質として残存活
性を測定した。その結果、50℃、10分間の加熱までは殆
ど失活が認められず、55℃、10分間の加熱で約30％失活
した。そして、60℃、10分間の加熱で約80％失活した。 （５）pH安定性；0.1 Ｍ緩衝液のもとで30℃で３時間放
置後、プルランを基質として残存活性を測定した結果、
pH約５〜約10で安定であった。 （６）阻害剤；１×10-3ＭのHgCl2 、AgNO3 で90％以上
阻害された。また同濃度のZnSO4 により約70％阻害され
た。 （７）安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安定性
が著しく増加する。１×10-2Ｍ塩化カルシウムの存在下
では、最適作用温度は約65℃に認められた（１％プルラ
ン、30分反応）。 （８）精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾液から、
リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸溜水で洗浄後、0.
5 Ｍ KClまたはリン酸−カリウム溶液で抽出し、次い
で、DEAE−セファロース カラムクロマトグラフィー、
Biogel A 1.5m によるカラムクロマトグラフィー、同カ
ラムによる再クロマトグラフィー等により、クロマト的
及び電気泳動的に均一までに精製することができる。 （９）分子量；Biogel A 5.0m で測定した分子量は約55
万であった。 （10）活性測定法；プルラナーゼ活性の測定は、0.1 Ｍ
リン酸緩衝液に溶解させた１％プルラン溶液（pH7.0)
0.5mlに適量の酵素を加え、水で全量１mlとし、40℃で
反応させる。この条件で１分間に１μmol のグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
解活性の酵素的性質を以下に記載する。 （１）作用；プルランのα−１，６−グルコシド結合を
分解し、主としてマントトリオースを生成する。 （２）作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、0.05
Ｍトリス緩衝液（pH7.0)の下で30分間反応したとき、約
80℃まで作用し、最適作用温度は60〜63℃（図２）。 （３）作用pH及び最適作用pH；１％プルラン、0.05Ｍ緩
衝液で測定したとき、pH約４〜約10の広い範囲に作用す
る。図１に示す通り、pH５付近とpH７〜7.5 にピークが
認められ、最適作用pHは約５〜約7.5 の広い範囲にある
と考えられる（図１、クエン酸−リン酸ニナトリウム緩
衝液とリン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分間反
応）。 （４）熱安定性；0.05Ｍトリス緩衝液（pH7.0 ）のもと
で各温度で10分間加熱後、プルランを基質として残存活
性を測定した。その結果、50℃、10分間の加熱までは殆
ど失活が認められず、55℃、10分間の加熱で約30％失活
した。そして、60℃、10分間の加熱で約80％失活した。 （５）pH安定性；0.1 Ｍ緩衝液のもとで30℃で３時間放
置後、プルランを基質として残存活性を測定した結果、
pH約５〜約10で安定であった。 （６）阻害剤；１×10-3ＭのHgCl2 、AgNO3 で90％以上
阻害された。また同濃度のZnSO4 により約70％阻害され
た。 （７）安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安定性
が著しく増加する。１×10-2Ｍ塩化カルシウムの存在下
では、最適作用温度は約65℃に認められた（１％プルラ
ン、30分反応）。 （８）精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾液から、
リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸溜水で洗浄後、0.
5 Ｍ KClまたはリン酸−カリウム溶液で抽出し、次い
で、DEAE−セファロース カラムクロマトグラフィー、
Biogel A 1.5m によるカラムクロマトグラフィー、同カ
ラムによる再クロマトグラフィー等により、クロマト的
及び電気泳動的に均一までに精製することができる。 （９）分子量；Biogel A 5.0m で測定した分子量は約55
万であった。 （10）活性測定法；プルラナーゼ活性の測定は、0.1 Ｍ
リン酸緩衝液に溶解させた１％プルラン溶液（pH7.0)
0.5mlに適量の酵素を加え、水で全量１mlとし、40℃で
反応させる。この条件で１分間に１μmol のグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。
【００１０】以上から明らかなように、本発明のプルラ
ナーゼ活性はpH約５〜約7.5 の極めて広い範囲に最適作
用pHが認められ、また、最適作用温度は60〜63℃にある
極めて熱安定性の優れた酵素であり、本発明以前に知ら
れているバシルス属のプルラナーゼ〔例えば、Agric. B
iol. Chem. 40, 1523 (1976)(最適pH６〜6.5 、最適温
度50℃）、特公昭59-39630号公報（最適pH7.0 、最適温
度45℃）、特開昭57-174089 号公報（最適pH3.5 〜5.5
、最適温度約60℃）〕とは違った新規なプルラナーゼ
様酵素であるということができる。
ナーゼ活性はpH約５〜約7.5 の極めて広い範囲に最適作
用pHが認められ、また、最適作用温度は60〜63℃にある
極めて熱安定性の優れた酵素であり、本発明以前に知ら
れているバシルス属のプルラナーゼ〔例えば、Agric. B
iol. Chem. 40, 1523 (1976)(最適pH６〜6.5 、最適温
度50℃）、特公昭59-39630号公報（最適pH7.0 、最適温
度45℃）、特開昭57-174089 号公報（最適pH3.5 〜5.5
、最適温度約60℃）〕とは違った新規なプルラナーゼ
様酵素であるということができる。
【００１１】本発明において例示菌として使用されるバ
シルス、ズブチルスＴＵ株の菌学的性質は下記の通りで
あり、本菌は微工研条寄第684 号として工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている。 （１）形態的性質；桿菌で大きさが0.5 〜0.7 ×0.8 〜
1.2 μ、非運動性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円形。 （２）培養的性質； （ａ）肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良好、培
養後期は淡黄色を示す。
シルス、ズブチルスＴＵ株の菌学的性質は下記の通りで
あり、本菌は微工研条寄第684 号として工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されている。 （１）形態的性質；桿菌で大きさが0.5 〜0.7 ×0.8 〜
1.2 μ、非運動性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円形。 （２）培養的性質； （ａ）肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良好、培
養後期は淡黄色を示す。
【００１２】（ｂ）グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁
寒天培養よりも生育劣る。 （ｃ）肉汁液体培養；生育はよくないが、混濁を生じ、
沈降する。 （ｄ）クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育する。 （ｅ）ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆっくり液化す
る。 （ｆ）ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次いでペプ
トン化する。
寒天培養よりも生育劣る。 （ｃ）肉汁液体培養；生育はよくないが、混濁を生じ、
沈降する。 （ｄ）クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育する。 （ｅ）ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆっくり液化す
る。 （ｆ）ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次いでペプ
トン化する。
【００１３】（ｇ）ポテト培養；生育はあまりよくな
い。 （３）生化学的性質； （ａ）硝酸塩の還元；陰性 （ｂ）カタラーゼ；陽性 （ｃ）チロシナーゼ；陰性 （ｄ）インドール；生成しない （ｅ）クエン酸の利用；陽性 （ｆ）硫化水素の生成；陽性 （ｇ）ウレアーゼ；陰性 （ｈ）澱粉の加水分解；陽性 （ｉ）炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、シュークロ
ース、マントース、ラクトース、デンプン、デキストリ
ン、グリコーゲン、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノー
ス、Ｌ−アラビノースなどの炭水化物から酸を生成する
が、ガスの発生は認められない。 （４）生育pH及び生育温度；本菌は、中性付近よりも、
弱アルカリ性のpH7.5 、pH8.5 で良好に生育する。生育
最適温度は35〜45℃にあり、最高生育温度は約50℃であ
る。
い。 （３）生化学的性質； （ａ）硝酸塩の還元；陰性 （ｂ）カタラーゼ；陽性 （ｃ）チロシナーゼ；陰性 （ｄ）インドール；生成しない （ｅ）クエン酸の利用；陽性 （ｆ）硫化水素の生成；陽性 （ｇ）ウレアーゼ；陰性 （ｈ）澱粉の加水分解；陽性 （ｉ）炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、シュークロ
ース、マントース、ラクトース、デンプン、デキストリ
ン、グリコーゲン、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノー
ス、Ｌ−アラビノースなどの炭水化物から酸を生成する
が、ガスの発生は認められない。 （４）生育pH及び生育温度；本菌は、中性付近よりも、
弱アルカリ性のpH7.5 、pH8.5 で良好に生育する。生育
最適温度は35〜45℃にあり、最高生育温度は約50℃であ
る。
【００１４】〔効 果〕本発明において使用される新規
なα─アミラーゼ活性をもつプルラナーゼ様酸素剤は、
プルランをマルトトリオースに分解するα─１，６─グ
ルコシド結合分解活性の他に、アミロース、アミロペク
チンやグリコーゲンなどに存在するα─１，４─グルコ
シド結合を分解して、マルトースやマルトトリオースを
生成するα─アミラーゼ活性をもっているため、この活
性をもたないプルラナーゼやイソアミラーゼなどに比
べ、グルコアミラーゼと併用して澱粉の糖化に使用する
場合、澱粉の糖化反応を促進し、且つ最終的なグルコー
スの収量は、通常、0.5 〜３％高く収得することができ
る。例えば、グルコアミラーゼ単独で30％濃度の液化澱
粉に作用させた場合、グルコースの収量は約94％であ
る。そして、グルコアミラーゼに市販のプルラナーゼを
共存させた場合、グルコースの収量は約96.5％であった
が、同一プルラナーゼ活性の本発明のプルラナーゼ様酵
素を共存させた場合は97.0〜97.5％の収量でグルコース
が得られた。このように、グルコースの収量が高いばか
りでなく、最高の糖化率に到達する時間も、本発明の酵
素剤を使用する場合、著しく短縮することができる。す
なわち、このことはグルコアミラーゼの使用量を節減で
きることを意味している。
なα─アミラーゼ活性をもつプルラナーゼ様酸素剤は、
プルランをマルトトリオースに分解するα─１，６─グ
ルコシド結合分解活性の他に、アミロース、アミロペク
チンやグリコーゲンなどに存在するα─１，４─グルコ
シド結合を分解して、マルトースやマルトトリオースを
生成するα─アミラーゼ活性をもっているため、この活
性をもたないプルラナーゼやイソアミラーゼなどに比
べ、グルコアミラーゼと併用して澱粉の糖化に使用する
場合、澱粉の糖化反応を促進し、且つ最終的なグルコー
スの収量は、通常、0.5 〜３％高く収得することができ
る。例えば、グルコアミラーゼ単独で30％濃度の液化澱
粉に作用させた場合、グルコースの収量は約94％であ
る。そして、グルコアミラーゼに市販のプルラナーゼを
共存させた場合、グルコースの収量は約96.5％であった
が、同一プルラナーゼ活性の本発明のプルラナーゼ様酵
素を共存させた場合は97.0〜97.5％の収量でグルコース
が得られた。このように、グルコースの収量が高いばか
りでなく、最高の糖化率に到達する時間も、本発明の酵
素剤を使用する場合、著しく短縮することができる。す
なわち、このことはグルコアミラーゼの使用量を節減で
きることを意味している。
【００１５】また、本発明で使用される酵素は、極めて
熱安定性に優れた酵素であり、グルコアミラーゼの作用
最適かつ限界温度である60℃においても長時間の反応を
おこなうことができるばかりか、pH4.5 〜5.0 のグルコ
アミラーゼの良好な作用pH範囲でも好適に利用すること
ができる。このように、本発明において使用される酵素
を用いれば、澱粉の糖化において種々の効果をもたらす
ものである。
熱安定性に優れた酵素であり、グルコアミラーゼの作用
最適かつ限界温度である60℃においても長時間の反応を
おこなうことができるばかりか、pH4.5 〜5.0 のグルコ
アミラーゼの良好な作用pH範囲でも好適に利用すること
ができる。このように、本発明において使用される酵素
を用いれば、澱粉の糖化において種々の効果をもたらす
ものである。
【００１６】本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産する
ためには、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン、コーン・スティープ・リカー、大豆
粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、リン酸アンモニウムのようなアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのような硝酸塩
あるいは尿素のような無機窒素源のいずれか、または両
方を使用する。
ためには、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン、コーン・スティープ・リカー、大豆
粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、リン酸アンモニウムのようなアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのような硝酸塩
あるいは尿素のような無機窒素源のいずれか、または両
方を使用する。
【００１７】炭素源としては、通常、澱粉、デキストリ
ン、マルトース、グルコース等が使用される。そしてこ
れに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネシウム塩
や、水量のマンガンや鉄化合物が添加される。培養は、
pH約５〜約９、温度25〜55℃で行うことができるが、通
常、pH７〜９、温度30℃前後で２〜４日間好気的に行わ
れる。該酵素は殆ど菌体外に生産されるので、培養後、
濾過または遠心分離して除菌し、上溶液を回収する。そ
して、必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセトン、イソ
プロパノール、エタノール、メタノール等の有機溶剤を
加えて該酵素を沈澱物として回収し、濃厚溶液として、
または乾燥物として保存する。
ン、マルトース、グルコース等が使用される。そしてこ
れに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネシウム塩
や、水量のマンガンや鉄化合物が添加される。培養は、
pH約５〜約９、温度25〜55℃で行うことができるが、通
常、pH７〜９、温度30℃前後で２〜４日間好気的に行わ
れる。該酵素は殆ど菌体外に生産されるので、培養後、
濾過または遠心分離して除菌し、上溶液を回収する。そ
して、必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセトン、イソ
プロパノール、エタノール、メタノール等の有機溶剤を
加えて該酵素を沈澱物として回収し、濃厚溶液として、
または乾燥物として保存する。
【００１８】本酵素を使用し、単独又は、グルコアミラ
ーゼ、β─アミラーゼなど、各種アミラーゼと併用し
て、澱粉を糖化する反応は、通常、pH４〜９、温度40℃
〜70℃で行われる。以下に、実施例により本発明の詳細
を説明する。
ーゼ、β─アミラーゼなど、各種アミラーゼと併用し
て、澱粉を糖化する反応は、通常、pH４〜９、温度40℃
〜70℃で行われる。以下に、実施例により本発明の詳細
を説明する。
【００１９】
【実施例１】大豆粕５％、コーン・スティープ・リカ─
0.6 ％、肉エキス0.4 ％、リン酸二カリ0.3 ％、硫酸マ
グネシウム0.1 ％、可溶性澱粉２％、尿素0.3 ％、ソデ
ィウム・ドデシルサルフェート0.1 ％、硫酸銅５×10-5
Ｍ、塩化マンガン2.5 ×10-6Ｍ、塩化カルシウム１×10
-3Ｍ、硫酸亜鉛１×10-4Ｍ、硫酸鉄１×10-5Ｍからなる
培地（pH7.2) 30ml を200ml 容三角フラスコに入れ、常
法により殺菌後、バシルス、ズブチルスＴＵ株 (FERM B
P-684)を接種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、
遠心分離して得た上澄液中のプルラナーゼ活性は培地１
ml当たり9.6 単位であった。またα─アミラーゼ活性は
培地１ml当たり45.2単位であった。
0.6 ％、肉エキス0.4 ％、リン酸二カリ0.3 ％、硫酸マ
グネシウム0.1 ％、可溶性澱粉２％、尿素0.3 ％、ソデ
ィウム・ドデシルサルフェート0.1 ％、硫酸銅５×10-5
Ｍ、塩化マンガン2.5 ×10-6Ｍ、塩化カルシウム１×10
-3Ｍ、硫酸亜鉛１×10-4Ｍ、硫酸鉄１×10-5Ｍからなる
培地（pH7.2) 30ml を200ml 容三角フラスコに入れ、常
法により殺菌後、バシルス、ズブチルスＴＵ株 (FERM B
P-684)を接種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、
遠心分離して得た上澄液中のプルラナーゼ活性は培地１
ml当たり9.6 単位であった。またα─アミラーゼ活性は
培地１ml当たり45.2単位であった。
【００２０】ここでα─アミラーゼ活性は以下のように
して測定した。0.1 Ｍリン酸緩衝液に溶解させた１％可
溶性澱粉液（pH7.0) 0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１分間に
１μmol のグルコースに相当する還元力を生成する酵素
量を１単位とした。
して測定した。0.1 Ｍリン酸緩衝液に溶解させた１％可
溶性澱粉液（pH7.0) 0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１分間に
１μmol のグルコースに相当する還元力を生成する酵素
量を１単位とした。
【００２１】
【実施例２】実施例１で使用した培地と同じ組成の培地
で培養した、バシルス、ズブチルスＴＵ株(FERM BP-68
4) の培養上澄250ml に、0.4 Ｍリン酸二ナトリウム溶
液及び0.4 Ｍ塩化カルシウム溶液各150ml を滴下しなが
ら添加してリン酸カルシウムゲルを形成させるととも
に、これに酵素を吸着させた。次いで、ガラスフィルタ
ーで濾過して吸着物を回収し、蒸溜水で充分洗浄後、0.
5 Ｍリン酸一カリウム溶液200ml で酵素を溶出し、透
析、濃縮した。
で培養した、バシルス、ズブチルスＴＵ株(FERM BP-68
4) の培養上澄250ml に、0.4 Ｍリン酸二ナトリウム溶
液及び0.4 Ｍ塩化カルシウム溶液各150ml を滴下しなが
ら添加してリン酸カルシウムゲルを形成させるととも
に、これに酵素を吸着させた。次いで、ガラスフィルタ
ーで濾過して吸着物を回収し、蒸溜水で充分洗浄後、0.
5 Ｍリン酸一カリウム溶液200ml で酵素を溶出し、透
析、濃縮した。
【００２２】次いで、2.5 ×10-3Ｍトリス緩衝液（pH7.
0)で緩衝化したDEAE−セファロースカラムで処理し、同
緩衝液で流出するプルラナーゼ活性区分を集め、濃縮、
透析後、2.5 ×10-3Ｍトリス緩衝液（pH7.0)で緩衝化し
たBiogel A 1.5m カラムでゲル濾過を行い、活性区分を
集め、同カラムで再クロマトグラフィーを繰り返した。
図３はBiogel A 1.5m カラム(1.5×87cm) による溶出曲
線を示している。精製された酵素はタンパク質曲線、プ
ルラナーゼ活性曲線及びα─アミラーゼ活性曲線は完全
に一致している。最終的に回収された酵素標品のプルラ
ナーゼ活性は585 単位、そしてα─アミラーゼ活性は10
70単位であった。
0)で緩衝化したDEAE−セファロースカラムで処理し、同
緩衝液で流出するプルラナーゼ活性区分を集め、濃縮、
透析後、2.5 ×10-3Ｍトリス緩衝液（pH7.0)で緩衝化し
たBiogel A 1.5m カラムでゲル濾過を行い、活性区分を
集め、同カラムで再クロマトグラフィーを繰り返した。
図３はBiogel A 1.5m カラム(1.5×87cm) による溶出曲
線を示している。精製された酵素はタンパク質曲線、プ
ルラナーゼ活性曲線及びα─アミラーゼ活性曲線は完全
に一致している。最終的に回収された酵素標品のプルラ
ナーゼ活性は585 単位、そしてα─アミラーゼ活性は10
70単位であった。
【００２３】
【実施例３】実施例２で調製した酵素剤を市販のグルコ
アミラーゼと併用して澱粉の糖化反応を行った。基質と
しては、ポテト澱粉を市販液化酵素で液化したDE7.7 の
ものを使用した（グルコアミラーゼ、液化酵素は、天野
製薬（株）、ノボ・ジャパン（株）などより入手するこ
とができる）。
アミラーゼと併用して澱粉の糖化反応を行った。基質と
しては、ポテト澱粉を市販液化酵素で液化したDE7.7 の
ものを使用した（グルコアミラーゼ、液化酵素は、天野
製薬（株）、ノボ・ジャパン（株）などより入手するこ
とができる）。
【００２４】固形分として、各３ｇの液化澱粉に、グル
コアミラーゼを液化澱粉固形分に対して、0.2 ％量と実
施例２で調製した本発明の酵素剤または市販のプルラナ
ーゼを加え、１×10-2Ｍ塩化カルシウムの存在下、pH4.
8 〜5.0 で、57.5℃で糖化反応を行った（各プルラナー
ゼ剤は、前記の活性測定法において、リン酸緩衝液の代
わりに、酢酸緩衝液を用い、pH5.0 で測定する以外、同
じ条件で行い、基質１ｇに対し0.5 単位の酵素量を添加
した）。得られた結果は表１及び表２に示す通りであっ
た。
コアミラーゼを液化澱粉固形分に対して、0.2 ％量と実
施例２で調製した本発明の酵素剤または市販のプルラナ
ーゼを加え、１×10-2Ｍ塩化カルシウムの存在下、pH4.
8 〜5.0 で、57.5℃で糖化反応を行った（各プルラナー
ゼ剤は、前記の活性測定法において、リン酸緩衝液の代
わりに、酢酸緩衝液を用い、pH5.0 で測定する以外、同
じ条件で行い、基質１ｇに対し0.5 単位の酵素量を添加
した）。得られた結果は表１及び表２に示す通りであっ
た。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１は、糖化開始１、２、３、５と20時間
目におけるDE値（全糖中の還元糖をグルコースとして表
わしてた）を示す。全糖はフェノール─硫酸法で定量
し、還元糖はフェリシアン化カリ法により定量した。表
から明らかなように、本発明の酵素を用いた場合、糖化
開始初期における糖化が促進されていることがわかる。
表２は、糖化開始後、22時間、25時間と２時間目の糖化
物を高速液体クロマトグラフィーにより糖組成を分析し
た結果を示している。表から明らかなように、本発明の
酵素を用いた場合、最高97.1％の収量でグルコースが得
られた。また糖化22時間目のグルコース収量から明らか
なように、糖化反応は著しく促進されていることがわか
る。
目におけるDE値（全糖中の還元糖をグルコースとして表
わしてた）を示す。全糖はフェノール─硫酸法で定量
し、還元糖はフェリシアン化カリ法により定量した。表
から明らかなように、本発明の酵素を用いた場合、糖化
開始初期における糖化が促進されていることがわかる。
表２は、糖化開始後、22時間、25時間と２時間目の糖化
物を高速液体クロマトグラフィーにより糖組成を分析し
た結果を示している。表から明らかなように、本発明の
酵素を用いた場合、最高97.1％の収量でグルコースが得
られた。また糖化22時間目のグルコース収量から明らか
なように、糖化反応は著しく促進されていることがわか
る。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【実施例４】実施例３と同様にして、本発明の酵素剤を
基質ｇ当たり0.5 単位添加し、pH4.5 〜5.3 、温度55℃
で糖化した。糖化開始24時間後、２時間毎に生成したグ
ルコース収量を高速液体クロマトグラフィーにより求め
た。表３は各糖化pHにおける最高値を示したときのグル
コース収量を示している。
基質ｇ当たり0.5 単位添加し、pH4.5 〜5.3 、温度55℃
で糖化した。糖化開始24時間後、２時間毎に生成したグ
ルコース収量を高速液体クロマトグラフィーにより求め
た。表３は各糖化pHにおける最高値を示したときのグル
コース収量を示している。
【００２９】
【表３】
【００３０】表から明らかなように、本発明の酵素はpH
4.5 〜５のグルコアミラーゼの最適作用pH条件下で効果
的に作用し、無添加の場合に比べグルコースの収量を約
２％増加することができた。
4.5 〜５のグルコアミラーゼの最適作用pH条件下で効果
的に作用し、無添加の場合に比べグルコースの収量を約
２％増加することができた。
【００３１】
【実施例５】実施例３において、使用した本発明の酵素
を基質ｇ当たり0.2 、0.5 と0.75単位に変化させて、pH
約５、温度55℃で糖化反応を行った。得られた結果を表
４に示す。
を基質ｇ当たり0.2 、0.5 と0.75単位に変化させて、pH
約５、温度55℃で糖化反応を行った。得られた結果を表
４に示す。
【００３２】
【表４】
【００３３】
【実施例６】本発明の酵素剤はリン酸カルシウムゲルに
強固に結合することから、本実施例においては、リン酸
カルシウムに吸着固定化した酵素による実施例を示す。
リン酸カルシウムは、0.5 Ｍリン酸二ナトリウムと0.5
Ｍ塩化カルシウムを等量混合する方法により調製し、こ
れに本発明の酵素を固定化し、ゲル懸濁液ml当たり1.2
単位結合したものを使用した。
強固に結合することから、本実施例においては、リン酸
カルシウムに吸着固定化した酵素による実施例を示す。
リン酸カルシウムは、0.5 Ｍリン酸二ナトリウムと0.5
Ｍ塩化カルシウムを等量混合する方法により調製し、こ
れに本発明の酵素を固定化し、ゲル懸濁液ml当たり1.2
単位結合したものを使用した。
【００３４】反応液組成は、リン酸カルシウムゲルに固
定化した酵素（１単位／ｇ基質）を使用する以外は実施
例３と同様にしておこない、pH約５、温度55℃でかるく
振盪しながら反応を行った。そして、24時間毎に、遠心
分離機により固定化酵素を回収し、新しい反応液に取り
かえ、固定化酵素を繰返し使用した。得られた結果を表
５に示す。
定化した酵素（１単位／ｇ基質）を使用する以外は実施
例３と同様にしておこない、pH約５、温度55℃でかるく
振盪しながら反応を行った。そして、24時間毎に、遠心
分離機により固定化酵素を回収し、新しい反応液に取り
かえ、固定化酵素を繰返し使用した。得られた結果を表
５に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】表から明らかなように、固定化酵素を使用
する場合、遊離酵素に比べ、グルコースの収量は0.5 〜
１％程度少なく、96％程度であるが、無添加の場合の9
4.4％に比べ、1.5 〜２％程度のグルコースの増収がみ
られ、酵素は繰返し再使用できることがわかった。
する場合、遊離酵素に比べ、グルコースの収量は0.5 〜
１％程度少なく、96％程度であるが、無添加の場合の9
4.4％に比べ、1.5 〜２％程度のグルコースの増収がみ
られ、酵素は繰返し再使用できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】プルランを基質としたときの最適pHを示す図。
【図２】プルランを基質としたときの最適温度を示す
図。
図。
【図３】Biogel A 1.5m カラム(1.5×87cm) によるプル
ラナーゼ活性、アミラーゼ活性及びタンパク質(280nmに
おける吸収）の溶出曲線を示す。
ラナーゼ活性、アミラーゼ活性及びタンパク質(280nmに
おける吸収）の溶出曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (2)
- 【請求項１】 澱粉または液化澱粉をグルコアミラーゼ
で糖化してグルコースを製造するに際し、バシルス属細
菌が生産し、澱粉を、主としてマルトースとマルトトリ
オースに分解する新規なα−アミラーゼ活性をもつプル
ナーゼ様複合酵素剤を存在させることを特徴とする澱粉
の糖化によるグルコースの製造方法。 - 【請求項２】 バシルス属細菌が、寄託No. 微工研条寄
第684 号 (FERM. BP-684) のバシルス・ズブチルスＴＵ
株である請求項１記載の澱粉の糖化によるグルコースの
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3126224A JPH0681598B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3126224A JPH0681598B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60000586A Division JPS61162197A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | 澱粉の糖化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662882A JPH0662882A (ja) | 1994-03-08 |
| JPH0681598B2 true JPH0681598B2 (ja) | 1994-10-19 |
Family
ID=14929830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3126224A Expired - Lifetime JPH0681598B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0681598B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1802406B (zh) | 2003-06-04 | 2010-09-01 | 新时代技研株式会社 | 糊状加热发泡填充材料组合物及车身构件闭合截面的填充隔音方法 |
| JP5794774B2 (ja) * | 2010-11-29 | 2015-10-14 | 渡辺 昌規 | 洗米排水の液化糖化方法 |
-
1991
- 1991-05-29 JP JP3126224A patent/JPH0681598B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662882A (ja) | 1994-03-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |