JPH0742324B2 - Ｎ―アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体及びその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は新規なＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン
誘導体及びその製法に関する。更に詳しくは、本発明
は、医薬化合物の生体内ターゲティングの技術に関する
ものであり、該医薬化合物の血液中での安定性、臓器へ
の標的指向性並びに体内での被代謝性を高める上で有用
な多糖型高分子担体としての新規なＮ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン誘導体に関する。また、本発明は該
医薬化合物と結合した複合体の形としての新規なＮ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン誘導体に関する。

背景技術 水溶性高分子物質を薬物すなわち医薬化合物の担体とし
て使用することは、従来からとりわけ医薬品製剤の分野
において試みられ、関連する多数の技術が提供されてき
た。それら薬物担体用の水溶性高分子物質はすでに一般
に公知であり、多くの場合においてカルボキシメチルセ
ルローズ、ヒドロキシプロピルセルローズ、ヒドロキシ
プロピルメチルセルローズ等のセルローズ誘導体が使用
されている。しかしこれらの従来技術は薬物のいわゆる
徐放に関するものであり、薬物の送達、すなわち薬物を
薬物が必要とされる組織に必要な時に必要な量だけ送達
する技術には至っておらず、水溶性高分子を薬物送達の
担体として使用する技術は末だ十分に開発されていない
のが実状である。例えば下記文献１）２）があり、文献
１）にはカルボキシメチルキチンを体内埋め込み型の微
粒子性担体として使用する技術が、また文献２）にはカ
ルボキシル化デキストランを薬物との複合体のための担
体として使用する技術が開示されている。

１）Watanabe,K.et al.,Chem.Pharm.Bull.,38.506−50
9,（1990） ２）瀬崎 仁、薬学雑誌、109,611−621,（1989） しかしながら、文献１）記載の技術はカルボキシメチル
キチンのゲル化能と生体内被分解性とに着目してそれら
の性質を利用したものではあるものの、体内局所への埋
め込み型であって、機能としては薬物の放出制御の範囲
を出ておらず、癌組織や臓器への薬物の標的指向性を高
めることは期待できない。また文献２）記載の薬物複合
体は、優れた薬物送達の可能性を示しているが、薬物送
達を計るための薬物複合体の分子の修飾に利用できる官
能基はアルコール性水酸基に限定される。

制癌剤あるいは脳疾患治療剤等が次第に開発されるのに
伴い、水溶性高分子を利用したこれら薬物のターゲティ
ング技術の完成が急がれているのにもかかわらず、従来
技術は十分なる解決を与えていない。

水溶性高分子担体を利用した薬物すなわち医薬化合物の
ターゲティング技術が完成されるためには、その前提条
件として、第一に担体と薬物との複合体が静注投与後に
標的臓器に到達するまでの時間内において血中で安定で
あること、換言すれば血中で必要な薬物濃度を持続でき
ること、また第二に該担体が生体内で徐々に分解を受
け、その結果その担体が長時間の体内残留を起こさない
こと、第三に薬物との複合体の形で結合している該担体
それ自体が臓器指向の傾向を示すことが必要であり、従
って担体はまずこれらの条件を同時に満足するものとし
て提供されなければならない。

発明の開示 かかる課題の解決を目的として、本発明者等は種々の検
討を繰り返した。その結果、前記のカルボキシメチルキ
チンを酵素処理およびアルカリ処理して得られた低分子
化カルボキシメチルキトサンにこれのアミノ基の所でＮ
−ペプチド鎖およびＮ−アセチル基を導入することによ
り本発明者らは、新規な物質として、Ｎ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン誘導体を今回合成することに成功
すると共に、この誘導体が意外にも前記の諸条件を満足
する担体として有用であること、またこれを利用すると
該目的を達成できるものであることを見出だした。しか
も、上記の導入されるＮ−ペプチド鎖は、適切なペプチ
ド鎖を選択することによって、適用可能な医薬化合物の
範囲がカルボン酸化合物、アミノ化合物、アルコール化
合物の広い範囲に及ぶことを可能にし、かつ複合体にあ
る特定の臓器に対する臓器指向の傾向をもたらすことも
見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成するに
至った。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明の新規物質は、後記の一般式（Ｉ）で示されるＮ
−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体であり、そ
れのキトサンの構成糖単位であるグルコサミンの６位及
び／または３位の水酸基の一部のＨがカルボキシメチル
基で置換され、また一部の糖単位においては２位のアミ
ノ基のＨがアセチル基で置換されていること並びに他の
部分の糖単位の２位アミノ基のＨがペプチド鎖又は１個
のアミノ酸で置換されていることが一つの特徴である。

第１の本発明による新規なＮ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサン誘導体は、下記式（Ｉ）によって示される。

式（Ｉ）においてR₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキ
シメチル基を表すが、ともにＨであることはない。

また、ここにＰはR₃CO基、R₄NH基またはR₅O基を表す。
ここでＰは、ＸをなすＮ−ペプチド鎖のＮ末端側アミノ
酸に連結する場合があり、このときはＰはR₃CO基であ
り、更にＰがＸをなすＮ−ペプチド鎖のＣ末端側アミノ
酸に連結する場合もあり、このときのＰはR₄NH基または
R₅O基である。なおここにR₃COOHはカルボン酸化合物、R
₄NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を意味す
る。

前記のR₃CO基は、多くの場合において、具体的には、ア
ミノ基の保護基であるか、あるいはカルボン酸系医薬化
合物由来のアシル基であり、例えばアミノ保護基として
はtert−ブトキシカルボニル基の如きアルコキシカルボ
ニル基あるいはｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル
基の如きアラルキルオキシカルボニル基であり、あるい
は更にそのR₃CO基に対応するR₃COOHがカルボン酸型の医
薬化合物、例えばメトトレキサートとなるものであるこ
ともできる。

R₅O基はカルボニル基の保護基としての低級アルコキシ
基、例えばtert−ブチルオキシ基あるいはアラルキルオ
キシ基例えばベンジルオキシ基を挙げることができる。
あるいは、また、R₅O基は、アルコール型の医薬化合物R
₅OHのアルコール性水酸基からＨを除いた残基であるこ
とができる。

R₄NH基は、カルボキシル基を保護するアミド型の保護
基、例えばメチルイミノ基の如き低級アルキルイミノ基
であることができる。あるいは、またR₄NH基に対応する
R₄NH₂がアミノ化合物型の医薬化合物、例えばダウノル
ビシンまたはトリプロリジンを表わすことができる。

ＱはＨまたはOH基を表す。ここにＱがＸをなすＮ−ペプ
チド鎖のＮ末端側アミノ酸に連結する場合があり、この
ときはＱはＨであり、反対にＱがＨをなすＮ−ペプチド
鎖のＣ末端側アミノ酸に連結する場合もあり、このとき
はＱはOH基である。

更に、式（Ｉ）においてＸは１〜10個の同一または異な
るアミノ酸を含むペプチド鎖（但しアミノ酸１個の場合
も、本明細書ではペプチドに包含して意味する）を意味
するが、このペプチド鎖はアミノ酸のみから構成される
場合のペプチド鎖はもちろん、鎖中の一部にアミノ酸以
外の化合物を含む場合のペプチド鎖も包含して意味して
おり、後者の場合には例えばコハク酸のごとき二塩基性
酸、特に二塩基性カルボン酸がペプチド鎖中の中間又は
末端のアミノ酸に連結し、その結果全体として同一また
は異なるアミノ酸を含むペプチド鎖を構成してもよい。

更に、式（Ｉ）によるＮ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン誘導体は、これの塩、特に該誘導体のカルボキシ
メチル基のアルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカ
リウム塩あるいはアンモニウム塩等であることを含む。

なお、第１の本発明による式（Ｉ）の誘導体化合物にお
いて、ペプチド鎖Ｘを構成するアミノ酸の数は薬物放出
や抗原性を考慮し、通常は１〜４個、殊に３〜４個が好
ましい。XPにおけるペプチド鎖Ｘが１〜４個のアミノ酸
のみから構成されるペプチド鎖であり、そのＮ末端側ア
ミノ酸にＰが結合する場合のXPの例を示せば以下のごと
くである。このような場合のＸ中のペプチド結合はキト
サン側より−NHCO−である。

Ｐ−Phe−Phe−Gly− Ｐ−Gly−Phe−Gly−Gly− Ｐ−Phe−Gly−Phe−Gly− Ｐ−Gly−Phe−Gly−Phe− Ｐ−Gly−Gly−Gly− Ｐ−Ala−Gly−Gly−Gly− またXPにおけるペプチド鎖Ｘが二塩基酸を含み、かつ１
〜４個のアミノ酸をふくむペプチド鎖であり、そのＣ末
端側アミノ酸にＰが結合する場合のXPの例を示せば次の
ごとくであり、このような場合のＸ中のペプチド結合は
キトサン側より−CONH−である。なお配列中Sucはコハ
ク酸残基を示す。

−Suc−Ala−Ala−Ala−Ｐ −Suc−Ala−Ala−Val−Ala−Ｐ また、本発明で利用できるペプチド鎖Ｘについてのアミ
ノ酸配列の別の例には、下記のものがある。

（ｉ） Ｈ−Gly−Gly−Gly−Val−Ala−OH, −Gly−Gly−Gly−Leu−Ala−， −Gly−Gly−Phe−Leu−Gly−， −Gly−Gly−Phe−Tyr−Ala−， −Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−， （ii） −Gly−Gly−Gly−Phe−Leu−Gly−， −Gly−Gly−Gly−Gly−Leu−Ala−， −Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−， （iii） −Gly−Gly−Gly−Gly−Phe−Leu−Gly−， −（Gly）_７−，−（Gly）_５−Leu−Ala−， （iv） −（Gly）_５−Phe−Leu−Gly−， −（Gly）_６−， （ｖ） −（Gly）_９−， （vi） −（Gly）₁₀− なお、本発明で利用できる医薬化合物の残基（Ｐ−）を
誘導する母体の化合物の例には、下記のものがある。

メトトレキサート、レポドパ、ブメタニド、フロセミ
ド、ジノプロスト、ダウノルビシン、ドキソルビシン、
マイトマイシン−Ｃ、トリプロリジン及びアクリフラビ
ン等。

更に、第１の本発明による式（Ｉ）の物質はカルボキシ
メチル化度、分子量（ゲル濾過法）、a/（ａ＋ｂ）値お
よびP/Xのモル比によって特定される。

カルボキシメチル化度は、本発明においてコロイド滴定
またはアルカリ滴定により求められる。コロイド滴定で
は下記文献３）が参照される。

３）沖増 哲、農芸化学雑誌、32,303−308（1958） 本発明の式（Ｉ）の化合物の分子量は、本発明において
デキストランを標準物質とするゲル濾過法により求めら
れる。後記実施例においてはTSK−gel G4000PW_XLをカラ
ムとして使用し、溶出液:0.1M NaCl、流速:0.8ml/min、
カラム温度:40℃、検出：示差屈折計で測定した。

a/（ａ＋ｂ）値はいわばペプチド化度とも称すべき値で
あり、ここでａは−XP置換された糖単位の数a₁と−XQ置
換された糖単位の数a₂との合計を表し、ｂはアセチル置
換されている糖単位の数を表す。式（Ｉ）で示される物
質の糖単位はすべて−XP置換されているか、−XQ置換さ
れているか、またはアセチル置換されているかのいづれ
かであるので、ａ＋ｂは分子中の糖単位の合計の総数を
示す。

なおa/（ａ＋ｂ）は次式（１）によって求められる。

ここでＡは式（Ｉ）におけるＰの含量（重量％）、M_mは
Ｐの分子量、M_sはＮ−アセチルカルボキシメチルキトサ
ンの糖単位の平均分子量、Ｃは式（Ｉ）においてa₂＝０
であるときのＸの含量（重量％）を表す。なおＣは次式
（２）によって算出される。

Ｃ＝Ｂ（100−Ａ）×10^-2 （２） ここでＢは式（Ｉ）においてa₁＝０であるときのＸの含
量（重量％）を表し、例えばペプチド化した後、Ｐを導
入する前にあるいは式（Ｉ）の物質からＰを脱離せしめ
てから、それぞれペプチド含量を測定して求めることが
できる。ＢはＸ中のアミノ酸に特性吸収があればこれを
利用して吸光度測定法により直接に求めることができ
る。しかしＸ中のアミノ酸に特性吸収がないときはＢは
次式（３）によって求めてもよい。

ここでＤは式（Ｉ）においてa₂＝０であるときのXPの含
量（重量％）を表し、Ｐに特性吸収があればこれを利用
して吸光度測定法により求めることができる。またｒは
次式（４）によって求められる値を示す。

ｒ＝M_PX/M_X （４） ここで、M_PXおよびM_XはそれぞれXPおよびＸの分子量を
あらわす。

次にP/Xのモル比はペプチドに対するＰ化度（またはＰ
置換度）とも称すべき値、すなわちa₁/（a₁＋a₂）であ
り、次式（５）によってそのモル比を求めることができ
る。

第１の本発明による式（Ｉ）で示される物質は、前記の
如く算定されるカルボキシメチル化度、分子量（ゲル濾
過法）、a/（ａ＋ｂ）値およびP/X値がそれぞれ0.5〜1.
2、3,000〜300,000、0.01〜１および0.1〜１の各範囲に
あるものである。

なお本明細書において、前記の式（Ｉ）の記載は、式
（Ｉ）で示される物質の分子において−XP置換された糖
単位（すなわちグルコサミン糖単位）がa₁個、−XQ置換
された糖単位がa₂個、−COCH₃置換された糖単位がｂ個
だけそれぞれ存在していることを示すに止まっており、
同一種類の糖単位がそれぞれの個数だけ連続して結合し
ているとか、あるいはこれら３種類の糖単位が式（Ｉ）
に記載の配列順序で結合しているとかいうことを意味し
ない。

更に、第１の本発明による式（Ｉ）の化合物におけるそ
れのＮ−アセチル基の一部が欠除している部分的Ｎ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン誘導体も新規な物質で
あり、そして後述される有用性を有する。従って、第２
の本発明によると、式（II） によって示される部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチル
キトサン誘導体が提供される。式（II）においてR₁、
R₂、Ｘは式（Ｉ）におけると同一の意味を表すが、ここ
でＰは式（Ｉ）におけるより意味が多少とも拡大されて
おり、Ｈ、OH基、R₃CO基、R₄NH基またはR₅O基を表す。
ＰがＸをなすペプチド鎖のＮ末端側アミノ酸に連結する
場合があり、このときはＰはＨまたはR₃CO基であり、Ｐ
がＸをなすペプチド鎖のＣ末端側アミノ酸に連結する場
合もあり、このときのＰはOH基、R₄NH基またはR₅O基で
ある。ａ、b₁、b₂は正の整数を表す。

また式（II）の物質は式（Ｉ）におけると同一の方法に
よって求められるカルボキシメチル化度、分子量（ゲル
濾過法）、a/（ａ＋ｂ）値およびP/Xモル比によって特
定される。ただし、式（II）では、a/（ａ＋ｂ）値にお
けるｂは式（Ｉ）で示される物質におけるｂとは意味が
多少異なり、アセチル置換されている糖単位の数b₁と２
位アミノ基が置換されずに遊離のままである糖単位の数
b₂との合計を表す。式（II）で示される物質における特
性値は式（Ｉ）で示される物質におけるそれらと同一で
ある。

なお、本明細書での上記の式（II）の記載は、式（II）
で示される物質の分子において−XP置換された糖単位が
ａ個、−COCH₃置換された糖単位がb₁個、２位アミノ基
が置換されずに遊離のままである糖単位がb₂個だけそれ
ぞれ存在していることを示すに止まっており、同一種類
の糖単位がそれぞれの個数だけ連続して結合していると
か、あるいはこれら３種類の糖単位が式（II）の記載の
配列順序で結合しているとかいうことを意味しない。

式（II）で示される物質は式（Ｉ）で示される物質を製
造するための合成中間体であり、従って式（Ｉ）で示さ
れる物質とは産業上の利用分野が同一であり、かつ構成
の主要部が同一である。

例えば、上記の式（II）の化合物において、Ｐが医薬化
合物に由来する残基R₃CO基、またはR₄NH基またはR₅O基
を示す場合の式（II）の化合物は、これのアミノ基を無
水酢酸、あるいはアセチルクロリドの如き他の適当なア
セチル化剤で適当な溶剤、例えばピリジン中でアセチル
化すれば、医薬化合物の結合している場合の複合体の形
の式（Ｉ）の本発明化合物を与える。また、式（II）の
化合物において、Ｐが保護基である場合の式（II）の化
合物から保護基を脱離した後に、若しくはＰがＨまたは
OH基である場合の式（II）の化合物に対して、医薬化合
物としてのR₃COOH、R₄NH₂またはR₅OHを結合させ、次い
で上記と同様に残余のアミノ基をアセチル化すると、式
（Ｉ）の本発明化合物を生成することが可能である。

発明を実施するための最良の形態 次に第１の本発明による式（Ｉ）の化合物の製造につい
て述べると、その概略は以下のごとくであるが、本発明
はこれに限定されない。

本発明物質の原料であるカルボキシメチルキチンは、カ
ニ、エビ等の甲殻類や昆虫の外皮、菌類の細胞壁等に広
く存在するキチン（β−1,4−ポリ−Ｎ−アセチルグル
コサミン）にアルカリ存在下、モノクロル酢酸を反応さ
せて容易に調製できる。その反応条件を変えることによ
り、カルボキシメチル化度の異なるカルボキシメチルキ
チンが得られるが、市販品の利用も可能である。

次にカルボキシメチルキチンを低分子化するが、この低
分子化にあたり、例えば市販のカルボキシメチルキチン
に卵白リゾチームを作用させ、その反応条件を制御する
ことにより、得られるカルボキシメチルキチンの分子量
を調節することができる。その反応条件は、用いるカル
ボキシメチルキチンのカルボキシメチル化度（ds:糖残
基当りのカルボキシメチル化度）によっても異なり、例
えば、ds＝1.0の場合、分子量が約１×10⁵に低減された
低分子化カルボキシメチルキチンは、分子量が１×10⁶
程度のカルボキシメチルキチンに、その約1/400量の卵
白リゾチームをpH6.0、37℃で約２時間作用させること
により得られる。

更に低分子化カルボキシメチルキチンの脱Ｎ−アセチル
化を行うが、これはアルカリ処理により達成される。低
分子化カルボキシメチルキチンを例えば、1N NaOHに溶
解後、100℃で数時間〜数十時間、好ましくは３〜８時
間加熱還流することにより、Ｎ−アセチル基の一部を除
去し、部分的にＮ−アセチル基が残っているカルボキシ
メチルキトサンが得られる。これを部分的Ｎ−アセチル
カルボキシメチルキトサンと呼ぶ。

次に部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサンを、
例えばジメチルホルムアミドと0.5％NaHCO₃水溶液の混
合溶媒に溶解後、その溶液に対して、ペプチド鎖の末端
アミノ酸のアミノ基に保護基を導入した本発明に係るペ
プチド〔以下単に保護ペプチドと呼ぶ；式「HO−Ｘ−保
護基」で表示できる〕のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（保護ペプチドの活性エステル）を加えて反応
させることにより、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサンの遊離アミノ基に保護ペプチドを結合させ
る。保護ペプチドの活性エステルの加える量を変えるこ
とにより、保護ペプチドの結合量の異なる「部分的Ｎ−
アセチルカルボキシメチルキトサン−保護ペプチド」複
合体が得られる。保護ペプチドの活性エステルの大過剰
を反応させれば、遊離アミノ基が殆ど存在しない複合体
を得ることも可能である。なお保護ペプチドの活性エス
テルは、保護ペプチドをペプチド合成の常法により例え
ば、ジメチルホルムアミドに溶解後、これにＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドとN,N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを加えて反応させることにより得ることができ
る。

上記のように、保護ペプチドの活性エステルとの結合反
応に用いる部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサ
ンの濃度は0.1〜５％（重量％）が適当であり、多糖の
糖残基と保護ペプチドの活性エステルのモル比は、20:1
〜1:10が適当である。また、保護ペプチド巾のアミノ酸
の数は、１〜10の範囲である。

なお上記において保護基の代わりに薬物を使用し、薬物
を導入した本発明に係るペプチド〔式HO−Ｘ−Ｐ（但し
Ｐは医薬化合物由来のR₃CO基、R₄NH基又はR₅O基）で表
示できる〕のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
加えれば、「部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−ペプチド−薬物」複合体が得られる。

また上記のようにして得られた複合体から、それぞれ保
護基あるいは薬物残基（Ｐ）を脱離せしめれば「部分的
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−ペプチド」複
合体が得られる。

式（II）で示される本発明物質は、上記のようにして得
られる「部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
−保護ペプチド」複合体、「部分的Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−ペプチド−薬物」複合体および
「部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−ペプ
チド」複合体という３種の物質を包含する。

式（II）で示される本発明物質は、これを飽和NaHCO₃水
溶液に溶解後、無水酢酸又は他の適当なアセチル化剤、
例えば塩化アセチルを反応させて式（II）の複合体物質
中に残存する遊離アミノ基をアセチル化することによ
り、対応する式（Ｉ）で示される本発明物質を得る。た
だしここで得られる物質は式（Ｉ）においてａ＝a₁、a₂
＝０またはａ＝a₂、a₁＝０である場合の物質であり、例
えば上記の３種の物質に夫々に対応してそれぞれ「Ｎ−
アセチルカルボキシメチルキトサン−保護ペプチド」複
合体、「Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−ペプ
チド−薬物」複合体および「Ｎ−アセチルカルボキシメ
チルキトサン−ペプチド」複合体を得ることができる
が、前二者はａ＝a₁、a₂＝０に対応する物質であり、後
一者はａ＝a₂、a₁＝０に対応する物質である。また前二
者から後一者への変換は通常は酸処理によって行うこと
ができる。例えば「Ｎ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−保護ペプチド」複合体を弱酸処理、例えば、0.5N
HCl中、30℃で16時間処理することにより、「Ｎ−アセ
チルカルボキシメチルキトサン−ペプチド」複合体を得
ることができる。

次にこの「Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−ペ
プチド」複合体を、例えば１％NaHCO₃水溶液に溶解後、
カルボン酸型の医薬化合物、すなわちカルボキシル基を
有する薬物のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（活性エステル）を前記複合体中のペプチド鎖のＮ末端
に反応させることにより「Ｎ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサン−ペプチド−薬物」複合体を得ることができ
る。ただしここで得られる物質は、必ずしも式（Ｉ）に
おいてａ＝a₁、a₂＝０である場合の物質に限定されるも
のではなく、実際にはａ＝a₁＋a₂、a₂≠０である場合の
物質として示される。すなわちここで薬物として例えば
メトトレキサート（MTX）を選択すれば「Ｎ−アセチル
カルボキシメチルキトサン−ペプチＮ−MTX」複合体が
得られるが、通常は該複合体におけるMTX含量はペプチ
ド含量より小さくなる。

従って、第３の本発明によると、式（III） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
基を表わす〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（２）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
に次式 PX−OH （IV） 〔式中、ここでＰはＨ、OH基、R₃CO基、R₄NH基またはR₅
O基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ酸を含む
ペプチド鎖を意味する。なおR₃COOHはカルボン酸化合
物、R₄NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を
意味する。〕 で示される化合物を反応せしめることを特徴とする、式
（II） 〔式中、R₁、R₂、Ｐ、Ｘは（III）式における前記と同
じ意味を示す。ａ、b₁、b₂は正の整数を示す。〕によっ
て示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしｂ＝b₁＋b₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
誘導体の製法が提供される。

また、第４の本発明によると、式（II′） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
基、P₁はＨまたはOH基、もしくはR₃′CO基、R₄′NH基ま
たはR₅′Ｏ基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ
酸を含むペプチド鎖を意味する。なおR₃′COOHはカルボ
ン酸化合物、R₄′NH₂はアミノ化合物、R₅′OHはアルコ
ール化合物を意味する。ａ、b₁、b₂は正の整数を示
す。〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしｂ＝b₁＋b₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
誘導体をアセチル化し、P₁基がＨまたはOH基以外のとき
は、さらにP₁基を脱離せしめ、最後に次式 Ｐ−Ｈ またはＰ−OH （Ｖ） 〔式中、ＰはR₃CO基、R₄NH基またはR₅O基を表す。〕で
示される化合物を反応せしめることを特徴とする、式
（Ｉ） 〔式中、R₁、R₂、Ｐ、Ｘは前記と同じ意味を示し、Ｑは
ＨまたはOH基を意味する。a₁、a₂は０または正の整数を
示すが、共に０となる場合を除く。ｂは正の整数を示
す。〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体
の製法が提供される。

更に、本発明者は、第１の本発明に係る式（Ｉ）のＮ−
アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体の性質を一層
改善する研究を進めた。その結果、式（Ｉ）の誘導体の
構成糖であるＮ−アセチルカルボキシメチルグルコサミ
ン単位のうちの複数個を、ポリエチレングリコール鎖を
含む基（以下、単にPEGと略記することがある）を２−
アミノ基上に置換基として有するカルボキシメチルグル
コサミン単位、詳しくは次式（Ａ） 〔式中、R₁及びR₂は前記の意味をもち、PEGは次式（V
I）、（VII）、（VIII）又は（IX）：− −CO−CH₂CH₂−CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VII） −CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VIII） −CO−CH₂−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （IX） で示される基を表わし、ｎはポリエチレングリコール鎖
の平均重合度を示す〕で表されるカルボキシメチルグル
コサミンのポリエチレングリコール置換単位の複数個と
取り代えることによって、次式（Ｘ） 〔式中、R₁、R₂、Ｐ、Ｑ、Ｘは夫々に前記の式（Ｉ）に
おけると同じ意味をもち、PEGは上記の意味をもち、a₁
およびa₂は夫々に０または正の整数を示すが、共に０と
なる場合がなく、ｂおよびｃは夫々に正の整数を示
す。〕で示されて且つ下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ＋ｃ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体
を新規な物質として合成することに成功した。しかも、
この新規な式（Ｘ）で示されるＮ−アセチルカルボキシ
メチルキトサン誘導体が式（Ｉ）のＮ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン誘導体それ自体に比べると増強され
た水溶液をもち且つ薬物の運搬用の担体として利用で
き、生体内に投与した後に血中に長時間滞留できること
を見い出した。

更にまた、本発明者らは、式（Ｉ）の誘導体の構成糖で
あるＮ−アセチルカルボキシメチルグルコサミン単位の
うちの複数個を、次式（Ｂ） 〔式中、R₁は前記と同じく水素またはカルボキシメチル
基を表わす〕で示されるポリオール単位の複数個と取り
代えることによって、次式（XI） 〔式中、R₁、R₂、Ｐ、Ｑ、Ｘは夫々に前記の式（Ｉ）に
おけると同じ意味をもち、a₁およびa₂は夫々に０または
正の整数を示すが、共に０となる場合がなく、ｂおよび
ｃは夫々に正の整数を示す〕で示されて且つ下記の特性
値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ＋ｃ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体
を新規な物質として合成することに成功した。しかも、
新規な式（XI）で示されるＮ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサン誘導体が式（Ｉ）のＮ−アセチルカルボキシ
メチルキトサン誘導体それ自体に比べると増強された水
溶性をもち且つ薬物の運搬用の担体として利用でき、生
体内に投与した後に血中に長時間滞留できることを見い
出した。

従って、第５の本発明においては、式（Ｘ）又は式（X
I） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
基、ＰはR₂CO基、R₄NH基またはR₅O基、ＱはＨまたはOH
基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ酸を含むペ
プチド鎖を意味する。なおR₃COOHはカルボン酸合物、R₄
NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を意味す
る。a₁、a₂は０または正の整数を示すが、共に０となる
場合を除く。ｂおよびｃは正の整数を示す。

また式（Ｘ）中で−PEGは下記の式（VI）、（VII）、
（VIII）又は（IX） −CO−CH₂CH₂−CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VII） −CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VIII） −CO−CH₂−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （IX） の基を表わし、ｎはポリエチレングリコール鎖の平均重
合度を示す〕によって示され且つ下記の特性値（１）〜
（４）： （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ＋ｃ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体
が提供されるものである。

第５の本発明による式（Ｘ）の誘導体は式（Ｉ）におい
て一部の糖単位が下記の式（Ａ）の糖単位によって取代
えられたＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体
であり、また第５の本発明による式（XI）の誘導体は同
様に下記の式（Ｂ）のポリオール単位によって取代えら
れたＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体であ
る。後記の実施例17〜21は式（Ｘ）の化合物の例を、ま
た実施例22〜23は式（XI）の化合物の例を示す。

式（Ａ）の糖誘導体はカルボキシメチルグルコサミン単
位の２−アミノ基がPEGによって置換された糖単位であ
り、ここでPEGとは具体的にはポリエチレングリコール
鎖を含む下記の式（VI）〜（IX）の基を表わす。

−CO−CH₂CH₂−CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VII） −CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VIII） −CO−CH₂−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （IX） 上記式（VI）〜式（IX）に示す基に存在するポリエチレ
ングリコール鎖は種々の分子量をもつものであることが
できるが、一般に入手しやすい点で好ましいポリエチレ
ングリコール鎖は平均分子量が約5000のものであり、従
って、式（VI）〜式（IX）の基におけるポリエチレング
リコール鎖の好ましい平均重合度ｎは約100〜120である
が、本発明はこれに限定されない。また式（Ｘ）の誘導
体の中のポリエチレングリコール含量はNMR法を用いて
鎖中のメチレンプロトンに基づくピーク面積の測定から
求めることができ、この含量は大きいほど好ましく、例
えば１％（重量）以上であればよいが、本発明において
特に限定はない。

他方、第５の本発明による式（XI）の誘導体における式
（Ｂ）のポリオール単位はカルボキシメチルグルコサミ
ン単位の２位炭素と３位炭素の間の結合が酸化によって
開裂されて、その開裂後に還元によりポリアルコールの
形に転化している点において化学構造上の特徴がある。

なお、第５の本発明の式（Ｘ）及び式（XI）の誘導体に
おけるa/（ａ＋ｂ＋ｃ）値は式（Ｉ）におけるa/（ａ＋
ｂ）値に対応して定義されるペプチド化度であり、従っ
てその求め方は前出の式（１）をそのまま用いて行えば
よく、実際上は式（２）〜（５）を準用しながら式
（Ｉ）におけると全く同じ要領によって算出する。その
値の範囲もまた式（Ｉ）におけると同一である。同様に
カルボキシメチル化度、分子量（ゲル濾過法）の範囲に
ついても式（Ｉ）におけると同一である。

第５の本発明による式（Ｘ）の物質の製造は、式（II）
によって表される「部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサン−保護ペプチド」複合体を原料として用意し
て以下のごどくに処理することによって行う。まず、こ
の式（II）の複合体中のＮ−アセチル化してない遊離カ
ルボキシメチルグルコサミン単位に対しPEG活性誘導体
を反応せしめてその遊離の２−アミノ基に式（VI）〜
（IX）のPEG基を置換基として導入し、更に残余の遊離
のカルボキシメチルグルコサミン単位はＮ−アセチル化
し、次に複合体中の保護ペプチド部分から保護基を脱離
して脱保護し、そのペプチド部分の末端へ薬物の反応活
性誘導体を反応せしめて、ペプチド末端に薬物（Ｐ）を
結合する。

以上の反応工程においてＮ−アセチル化後の諸中間体お
よび最終物は式（Ｘ）によって示される。

上記のPEG活性誘導体とは、例えば２−Ｏ−モノメトキ
シポリエチレングリコール−3,5−ジクロロ−ｓ−トリ
アジン又はメトキシポリオキシエチレンカルボン酸の活
性エステル（例えばＮ−サクシンイミドエステル）であ
りうる。

第５の本発明による式（XI）の物質の製造は、式（Ｘ）
の物質の製造と同様に式（II）によって表される「部分
的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−保護ペプチ
ド」複合体を原料として用意するが、その後に下記の如
き処理することによって行う。まずこの原料複合体中の
アセチル化していない遊離カルボキシメチルグルコサミ
ン単位に対し、例えば過ヨウ素酸を作用させて酸化によ
って環の開裂を行い、更に開裂で生じたアルデヒドを例
えば水素化ホウ素ナトリウムによって還元してポリオー
ルの形に転化し、次に複合体中の保護ペプチドから保護
基を脱離して脱保護し、そのペプチド部分の末端へ薬物
の反応活性誘導体を反応せしめて、ペプチド末端に薬物
（Ｐ）を結合する。以上の反応工程においてポリオール
への転化後の諸中間体および最終物は式（XI）によって
示される。

第５の本発明による式（Ｘ）および式（XI）の物質は水
溶性が高く、従って第５の本発明によっては水溶性の改
善された薬物運搬担体および薬物運搬体が提供される。
後記の実験例４によれば、例えば式（Ｘ）の物質は血中
滞留性に優れ、また薬物として制癌剤を担持した場合に
癌選択性が向上している。

本発明による式（Ｉ）の誘導体並びに式（Ｘ）および式
（XI）の誘導体は下記の通り有利な性質を有する。

すなわち、後記実験例によって示されるごとく、本発明
による式（Ｉ）および式（Ｘ）の誘導体は静脈注射によ
る投与後で臓器に到達するまでの時間内において血中で
安定であり、すなわち、これらの本発明物質の必要な血
中濃度を持続できるのであり、他方、生体内で徐々に酵
素分解を受けるので本物質のＮ−アセチルカルボキシメ
チルキトサン部分が長時間にわたりの体内に残留する懸
念はない。また更に式（Ｉ）の本発明誘導体並びに式
（Ｘ）および式（XI）の本発明誘導体が生体内で臓器指
向の傾向をもつことも観察することができる。

なお、ここで式（Ｉ）並びに式（Ｘ）および式（XI）の
本発明化合物が標的臓器に指向する傾向をもつとは、該
化合物は、本発明の手段を加えなかった場合に比べて、
ある特定の標的臓器での該化合物の濃度において増加の
傾向を示すことを意味するに止まっており、該特定臓器
のみに選択的に集中することまで意味するものではな
い。

以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的に
説明する。

第１〜第４の本発明は実施例１〜16によって例示され、
第５の本発明は実施例17〜23によって例示される。

なお各実施例においてゲル濾過はいづれも次の条件で行
なった。すなわちカラム:TSK−gel G4000PW_XL、溶出液:
0.1M NaCl、流速:0.8ml/min、カラム温度:40℃、試料の
注入量：約75μｇ 実施例１ 市販（フナコシ薬品株式会社）のカルボキシメチルキチ
ン（カルボキシメチル化度：糖残基当り1.0）の5.0gをp
H6.0の0.05M酢酸緩衝液（500ml）に溶解後、卵白リゾチ
ーム（12.5mg）を加え、37℃で２時間反応させた。反応
液をエタノール（２）中に加えて析出した沈殿物を集
め、真空乾燥して、4.25gの低分子化カルボキシメチル
キチンを得た。この物質（3.9g）を1N NaOH水溶液（390
ml）に溶解後、100℃で６時間加熱還流した。反応液のp
Hを８に調整した後、遠心分離して得られる上清をメタ
ノール（1.9）中に加えて析出した沈殿物を集め、真
空乾燥して、式（III）の物質の一例としての1.91gの部
分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン（以下、単
に多糖と言うこともある）を得た。この多糖物質の分子
量は、デキストランを標準物質としたゲル濾過法（G400
0PW_XLカラム）で約１×10⁵であった。

上記の多糖物質（200mg）を0.5％、NaHCO₃水溶液（20m
l）に溶解後、ジメチルホルムアミド（17.5ml）を加え
て均一な多糖溶液とした。他方、tert−ブトキシカルボ
ニル基（Boc）で保護されたペプチド、Ｎ−Boc−Phe−P
he−Gly−OH（94mg）を1.5mlのジメチルホルムアミドに
溶解後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（23mg）と、N,
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（37mg）を加
え、４℃で24時間反応させて活性エステルとした。この
反応液の全量を上記の多糖溶液に加え、４℃で16時間反
応させた。反応液をエタノール（160ml）中に加えて析
出した沈殿物を集め、真空乾燥して、200mgの部分的Ｎ
−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe
−Boc複合体〔式（II）の誘導体の一例である〕を得
た。

本複合体（150mg）を飽和NaHCO₃水溶液（15ml）に溶解
後、無水酢酸（0.6ml）を加えて、室温で17時間Ｎ−ア
セチル化反応を行った。反応液を中和後、エタノール
（80ml）中に加えて析出した沈殿物を集め、真空乾燥し
て、154mgのＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン−G
ly−Phe−Phe−Boc複合体〔式（Ｉ）の誘導体の一例で
ある〕を得た。本複合体の紫外部吸収スペクトルとゲル
濾過溶出パターンを各々、添付図面の第１図と第２図に
示す。本複合体のＮ−Bocペプチド含量は、紫外部（258
nm）の吸光度分析から、14.1％（重量％）であった。

本複合体（130mg）を0.5N HCl（13ml）に溶解後、30℃
で17時間反応させてBocの脱離のための脱保護処理し
た。反応液を中和後、エタノール（70ml）中に加えて析
出した沈殿物を集め、真空乾燥して、121mgのＮ−アセ
チルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Ｈ複
合体〔式（Ｉ）の誘導体の別例である〕を得た。本複合
体の紫外部吸収スペクトルとゲル濾過溶出パターンを各
々、添付図面の第３図と第４図に示す。本複合体のペプ
チド含量は、紫外部（258nm）の吸光度分析から、11.3
％（重量％）であった。

カルボン酸型の医薬化合物としての182mgのメトトレキ
サート（MTX）をジメチルホルムアミド（4ml）に溶解
後、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（82mg）
を加え、４℃で17時間反応させ、その反応液にＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド（46mg）とピリジン（63μ）を
加え、室温で５時間反応させてMTXの活性エステルを調
製した。他方、上記のＮ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（50mg）を0.5％NaHO
H₃水溶液（10ml）に溶解後、上記のMTXの活性エステル
を含む反応液の0.5mlを加えて、４℃で15時間反応させ
て該複合体のペプチド鎖のＮ末端へMTXを結合させた。
得られた反応液をエタノール（40ml）中に加えて析出し
た沈殿物を集め、真空乾燥して、53mgのＮ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−MTX複合体
〔式（Ｉ）の複合体の更に別の一例である〕を黄色粉末
として得た。本複合体の紫外・可視部吸収スペクトルと
ゲル濾過溶出パターンを各々、添付図面の第５図と第６
図に示す。本複合体のMTX含量は、紫外部（307nm）の吸
光度分析から、11.5％（重量％）であった。また、本複
合体におけるP/Xのモル比、すなわち具体的にはMTX/ペ
プチド（モル比）は、前出の計算式の（５）式に従っ
て、0.93と算出された。

また、本複合体について、式（Ｉ）におけるa/（ａ＋
ｂ）値は、前出の計算式の（１）式に従って、0.09と概
算された。

実施例２ 実施例１で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（100mg）を１％NaHCO₃水溶液（10ml）に溶解
後、ジメチルホルムアミド（6ml）を加えて均一な多糖
溶液とした。ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基
（pMZ）で保護されたペプチドpMZ−Gly−Gly−Gly−OH
（141mg）を4mlのジメチルホルムアミドに溶解後、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（46mg）とN,N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（74mg）を加え、室温で３時間
反応させて活性エステルとした。この活性エステルを含
む反応液の全量を上記の多糖溶液に加え、10mlのジメチ
ルホルムアミドを追加した後、４℃で23時間反応させ
た。反応液に5mlの水を加えた後、遠心分離した得られ
る上清をエタノール（150ml）中に加えて析出した沈殿
物を集め、真空乾燥して、120mgの部分的Ｎ−アセチル
カルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−pMZ複合体
〔式（II）の誘導体の一例である〕を得た。

この複合体（100mg）を実施例１に準じて、無水酢酸で
Ｎ−アセチル化を行い、Ｎ−アセチルカルボキシメチル
キトサン−Gly−Gly−Gly−pMZ複合体（97mg）を得た。
本複合体の紫外部吸収スペクトルとゲル濾過溶出パター
ンを各々、第７図と第８図に示す。本複合体のpMZ−ペ
プチド含量は、紫外部（272nm）の吸光度分析から、20.
1％（重量％）であった。

本複合体（89mg）を実施例１に準じて酸処理により保護
基pMZの脱離を行って、78mgのＮ−アセチルカルボキシ
メチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ｈ複合体を得た。こ
の複合体の紫外部吸収スペクトルを第９図に示す。本複
合体のペプチド含量（Ｂ）は、（３）式に従って、11.3
％と算出された。

本複合体（50mg）を１％NaHCO₃水溶液（5ml）に溶解
後、その溶液に実施例１と同様にして作成したMTXの活
性エステル溶液（1ml）を加え、４℃で21時間反応させ
た。反応液をエタノール（25ml）中に加えて析出した沈
殿物を集め、真空乾燥して、式（Ｉ）の複合体の一例と
して、52mgのＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン−
Gly−Gly−Gly−MTX複合体を黄色粉末として得た。本複
合体の紫外・可視部吸収スペクトルとゲル濾過溶出パタ
ーンを各々、第10図と第11図に示す。本複合体のMTX含
量は、紫外部（307nm）の吸光度分析から、21.4％（重
量％）であった。また、本複合体におけるP/Xモル比、
すなわち具体的にはMTX/ペプチド（モル比）は、（５）
式に従って、1.0と算出された本複合体について、式
（Ｉ）におけるa/（ａ＋ｂ）値は、（１）式に従って、
0.2と算出された。

実施例３ 実施例１と同様に、カルボキシメチルキチン（カルボキ
シメチル化度：糖残基当り1.0）の5.0gに卵白リゾチー
ムを作用させて得られた低分子化カルボキシメチルキチ
ン（4.28g）の4.1gをアルカリ処理して、分子量が約１
×10⁵の部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
（2.22g）を得た。

本物質（200mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Gly−Phe−Gly−Gly−OH（90mg）の活性エステルを作
用させ、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
−Gly−Gly−Phe−Gly−Boc複合体（210mg）を得た後、
この200mgをＮ−アセチル化して、Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Gly−Gly−Phe−Gly−Boc複合体
（190mg）を得た。本複合体のＮ−Boc−ペプチド含量
は、紫外部（258mn）の吸光度分析から、9.8％（重量
％）であった。

実施例１と同様の方法で、この複合体（160mg）を脱保
護のため酸処理して、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン−Gly−Gly−Phe−Gly−Ｈ複合体（144mg、ペプ
チド含量:7.6％）を得た。

この120mgにMTX（55mg）の活性エステルを作用させて、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Ph
e−Gly−MTX複合体（127mg、MTX含量:9.5％）を得た。
本複合体のMTX/ペプチド（モル比）と式（Ｉ）における
a/（ａ＋ｂ）は、各々、（５）式と（１）式から、1.
0、0.07と算出された。

実施例４ 実施例３で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（200mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Gly−Phe−Gly−Phe−OH（105mg）の活性エステルを
作用させ、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサ
ン−Phe−Gly−Phe−Gly−Boc複合体（199mg）を得た。

この188mgをＮ−アセチル化して、Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Phe−Gly−Phe−Gly−Boc複合体
（191mg）を得た。本複合体のＮ−Boc−ペプチド含量
は、紫外部（258nm）の吸光度分析から、4.9％（重量
％）であった。実施例１と同様の方法で、この複合体
（160mg）を酸処理により脱保護して、Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−Phe−Gly−Phe−Gly−Ｈ複合
体（150mg、ペプチド含量:4.0％）を得た後、この50mg
にMTX（23mg）の活性エステルを作用させて、Ｎ−アセ
チルカルボキシメチルキトサン−Phe−Gly−Phe−Gly−
MTX複合体（46mg、MTX含量:4.5％）を得た。本複合体の
MTX/ペプチド（モル比）と式（Ｉ）におけるa/（ａ＋
ｂ）値は、各々、各（５）式と（１）式から1.1、0.03
と算出された。

実施例５ 実施例３で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（100mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Phe−Gly−Phe−Gly−OH（54mg）の活性エステルを作
用させ、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
−Gly−Phe−Gly−Phe−Boc複合体（109mg）を得た。

この90mgをＮ−アセチル化して、Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−Gly−Phe−Gly−Phe−Boc複合体（8
5mg）を得た。本複合体のＮ−Boc−ペプチド含量は、紫
外部（258nm）の吸光度分析から、12.7％（重量％）で
あった。実施例１と同様の方法で、この複合体（72mg）
を酸処理により脱保護して、Ｎ−アセチルカルボキシメ
チルキトサン−Gly−Phe−Gly−Phe−Ｈ複合体（63mg、
ペプチド含量:10.4％）を得た。

この50mgにMTX（23mg）の活性エステルを作用させて、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Gl
y−Phe−MTX複合体（49mg、MTX含量:9.4％）を得た。本
複合体のMTX/ペプチド（モル比）と式（Ｉ）におけるa/
（ａ＋ｂ）は、各々、（５）式と（１）式から0.94、0.
07と算出された。

実施例６ 実施例３で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（200mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Ala−Gly−Gly−Gly−OH（180mg）の活性エステルを
作用させ、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサ
ン−Gly−Gly−Gly−Ala−Boc複合体（218mg）を得た
後、この150mgをＮ−アセチル化して、Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ala−Boc複
合体（143mg）を得た。実施例１と同様の方法で、この
複合体（130mg）を酸処理して、Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ala−Ｈ複合体（12
0mg）を得た。

この50mgにMTX（46mg）の活性エステルを作用させて、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gl
y−Ala−MTX複合体（55mg、MTX含量:21.5％）を得た。
本複合体の紫外・可視部吸収スペクトルとゲル濾過溶出
パターンを各々、第12図、第13図に示す。

実施例７ カルボキシメチルキチン（カルボキシメチル化度：糖残
基当り0.7）を用いて、実施例１に準じて調製した、分
子量が約１×10⁵の部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサン（45mg）を、0.1Mほう酸緩衝液（pH8.0）（2
ml）に溶かして多糖の溶液を作る。他方Ｎ−スクシニル
−Ala−Ala−Ala−ｐ−ニトロアニリド（45mg）をジメ
チルホルムアミド（2ml）に溶解後、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド（12mg）、N,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（41mg）を加え、室温で１時間、その後４℃
で18時間反応させてニトロアニリド成分と結合されたペ
プチドの活性エステルを調製した。この反応液の溶媒を
減圧留去し、残渣をイソプロパノールで洗った後、ジメ
チルホルムアミド（0.8ml）に溶かした。これを上記の
多糖溶液に加え、室温にて40時間反応させた。反応液に
エタノールを加えて、析出した沈殿物を集め、真空乾燥
して、46mgの部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Suc−Ala−Ala−Ala−ｐ−ニトロアニリド複合体
を得た。

さらに本複合体（26mg）を取り、飽和NaHCO₃水溶液3m
l）に溶解後、無水酢酸（0.14ml）を加えて、４℃で24
時間反応させてＮ−アセチル化した。反応液を外液を水
として透析した後、エタノール中に加えて、析出した沈
殿物を真空乾燥し、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Suc−Ala−Ala−Ala−ｐ−ニトロアニリド複合体
（25mg）を得た。本複合体の紫外部吸収スペクトルとゲ
ル濾過溶出パターンを各々、第14図と第15図に示す。本
複合体の−Suc−Ala−Ala−Ala−ｐ−ニトロアニリド含
量は、315nmの吸光度分析から、3.9％（重量％）であっ
た。

実施例８ 実施例７と同様の方法で、部分的Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン（45mg）にＮ−スクシニル−Ala−Ala
−Val−Ala−ｐ−ニトロアニリド（55mg）の活性エステ
ルを作用させ、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン−Suc−Ala−Ala−Val−Ala−ｐ−ニトロアニリ
ド複合体（44mg）を得た。

さらに、この30mgを用いて、実施例７と同様の方法でＮ
−アセチル化を行ない、Ｎ−アセチルカルボキシメチル
キトサン−Suc−Ala−Ala−Val−Ala−ｐ−ニトロアニ
リド複合体（22mg）を得た。本複合体の−Suc−Ala−Al
a−Val−Ala−ｐ−ニトロアニリド含量は、315nmの吸光
度から、4.5％（重量％）であった。

実施例９ 実施例１で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（50mg）を0.25％NaHCO₃水溶液（7ml）に溶解
後、ジメチルホルムアミド（6ml）を加えて均一な多糖
の溶液とした。別に、保護基Bocで保護されたフェニル
アラニンＮ−Boc−Phe−OH（265mg）を3mlのジメチルホ
ルムアミドに溶解後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（115mg）とN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（190mg）を加え、４℃で20時間反応させて活性エステ
ルとした。この活性エステルを含む反応液の1mlを上記
の多糖溶液に加え、室温で20時間反応させた。反応液を
エタノール（35ml）中に加えて析出した沈殿物を集め、
真空乾燥して51mgの部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサン−Phe−Boc複合体を得た。本複合体のＮ−Bo
c−フェニルアラニン（Phe−Boc）含量は紫外部（258n
m）の吸光度測定から14.4％（重量％）であった。

実施例10 実施例３に示した低分子化カルボキシメチルキチン（4.
1g）をアルカリ処理して得た反応液をpH8.5に調整し
た。その後、その反応液を遠心分離して得られる上清を
4.4倍量のメタノール中に加え、析出した沈殿物と上清
に分離した。この上清にエタノール（300ml）を加えて
析出した沈殿物を集め、真空乾燥して、分子量が約２×
10⁴の部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
（0.54g）を得た。

本物質（100mg）に、実施例１と同様の方法で、保護ペ
プチドＮ−Boc−Phe−Gly−Phe−Gly−OH（217mg）を作
用させ、次いで無水酢酸でＮ−アセチル化して、Ｎ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Gly−Phe
−Boc複合体（98mg、Ｎ−Boc−ペプチド含量:28％）を
得た。この複合体（80mg）を実施例１と同様の方法で酸
処理により脱保護して、Ｎ−アセチルカルボキシメチル
キトサン−Gly−Phe−Gly−Phe−Ｈ複合体（46mg、ペプ
チド含量:24％）を得た。

この複合体の35mgにメトトレキサート（MTX）（69mg）
の活性エステルを実施例１と同様に作用させて、Ｎ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Gly−Phe
−MTX複合体（35mg、MTX含量:19％）を得た。本複合体
のMTX/ペプチド（モル比）と式（Ｉ）におけるa/（ａ＋
ｂ）は、各々、前出の計算式の（５）式と（１）式から
0.92、0.19と算出された。

実施例11 実施例10に示した、分子量が約２×10⁴の部分的Ｎ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン（50mg）を水（1.25m
l）−ジメチルスルホキシド（1.25ml）−ジメチルホル
ムアミド（8ml）の混液に溶解後、実施例１と同様の方
法で、Ｎ−Succinyl−Gly−Phe−Gly−Lys（ε−Ｎ−Bo
c）−Ｏ−tBu（169mg）の活性エステルを作用させて部
分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Suc−Gly
−Phe−Gly−Lys（ε−Ｎ−Boc）−Ｏ−tBu複合体を得
た。次いでＮ−アセチル化と酸処理による脱保護を行な
い、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Suc−Gly
−Phe−Gly−Lys−Ｈ複合体（47mg）を得た。

この複合体（35mg）に、メトトレキサート（MTX）（23m
g）の活性エステルを作用させて、Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Suc−Gly−Phe−Gly−Lys−MTX複
合体（29mg、MTX含量:1.5％）を得た。本複合体の紫外
・可視部吸収スペクトルとゲル濾過溶出パターンを各
々、第20図、第21図に示す。

実施例12 実施例１と同様の方法で、カルボキシメチルキチン（カ
ルボキシメチル化度：糖残基当たり0.7）5.0gに卵白リ
ゾチーム25mgを作用させて低分子化カルボキシメチルキ
チン（4.37g）を得た。この3.7gをアルカリ処理により
部分的に脱アセチル化して、分子量約１×10⁵（デキス
トラン標準）の部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（2.58g）を得た。

この部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン（30
0mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc−Phe−Gly
−OH（141mg）の活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル）を作用させて、部分的Ｎ−アセチル
カルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体
（340mg）を得た。この300mgを無水酢酸でＮ−アセチル
化して、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly
−Phe−Phe−Boc複合体（298mg、Ｎ−Boc−ペプチド含
量:12.0％）得た。

この複合体（100mg）を、実施例１と同様の方法で、酸
処理により脱保護（Boc基の脱離）し、Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（8
9mg）を得た。

この複合体（75mg）を１％ NaHCO₃水溶液（7.5ml）に溶
解し、メトトレキサート（MTX）（75mg）の活性エステ
ルを加えて、４℃で24時間反応して複合体のペプチドの
Ｎ末端へMTXを結合させた。反応液をエタノール（40m
l）中に加えて析出した沈殿物を集め、真空乾燥して、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Ph
e−MTX複合体（75mg、MTX含量:10.1重量％）を黄色粉末
として得た。本複合体の紫外・可視部吸収スペクトルと
ゲル濾過溶出パターンを各々、第22図、第23図に示す。

実施例13 カルボキシメチルキチン（カルボキシメチル化度:0.7）
2.0gをpH6.0の0.05M酢酸緩衝液（200ml）に溶解し、卵
白リゾチーム（2.5mg）を加えて、37℃で１時間30分反
応して低分子化させ、更に実施例１と同様に1N NaOHで
処理して、分子量約３×10⁵（デキストラン標準）の部
分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン（1.72g）
を得た。本物質（150mg）を0.5％ NaHCO₃水溶液（15m
l）に溶解し、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc−Ala
−Gly−Gly−Gly−OH（135mg）の活性エステルを作用さ
せて部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gl
y−Gly−Gly−Ala−Boc複合体（150mg）を得た。その14
0mgを無水酢酸でＮ−アセチル化して、Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ala−Boc複
合体（154mg）を得た。更に、その130mgを酸処理により
Boc基を脱保護し、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Gly−Gly−Gly−Ala−Ｈ複合体（106mg）を得
た。この複合体（95mg）を１％NaHCO₃水溶液（4.8ml）
に溶解し、MTX（86mg）の活性エステルを作用させて、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gl
y−Ala−MTX複合体（88mg、MTX含量:13.7％）を得た。

実施例14 実施例12で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（150mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Gly−Gly−Gly−OH（109mg）の活性エステルを作用さ
せて、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−
Gly−Gly−Gly−Boc複合体（167mg）を得た。この150mg
を無水酢酸でＮ−アセチル化して、Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Boc複合体（153m
g）を得た。更に、その130mgを酸処理によりBoc基を脱
離して、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly
−Gly−Gly−Ｈ複合体（110mg）を得た。この100mgにMT
X（90mg）の活性エステルを作用させて、Ｎ−アセチル
カルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−MTX複合体
（111mg、MTX含量:17.4重量％）を得た。

実施例15 実施例12で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（150mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Ala−Gly−Gly−Gly−OH（135mg）の活性エステルを
作用させて、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Gly−Gly−Gly−Ala−Boc複合体（162mg）を得
た。この150mgを無水酢酸でＮ−アセチル化して、Ｎ−
アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−A
la−Boc複合体（157mg）を得た。更に、その130mgを酸
処理によりBoc基を脱離して、Ｎ−アセチルカルボキシ
メチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ala−Ｈ複合体（114m
g）を得た。この100mgにMTX（90mg）の活性エステルを
作用させて、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−
Gly−Gly−Gly−Ala−MTX複合体（111mg、MTX含量:17.4
重量％）を得た。

実施例16 実施例12で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン（200mg）に、実施例１と同様の方法で、Ｎ−Boc
−Gly−Phe−Gly−Gly−OH（87mg）の活性エステルを作
用させて、部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサ
ン−Gly−Gly−Phe−Gly−Boc複合体（206mg）を得た。
この100mgを無水酢酸でＮ−アセチル化して、Ｎ−アセ
チルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Phe−Gly−
Boc複合体（92mg、Ｎ−Boc−ペプチド含量:7.4％）を得
た。更に、その80mgを酸処理によりBoc基を脱離して、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Ph
e−Gly−Ｈ複合体（71mg）を得た。この50mgにMTX（45m
g）の活性エステルを作用させて、Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Gly−Gly−Phe−Gly−MTX複合体
（50mg、MTX含量:7.0％）を得た。

実施例17 実施例12で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体（カルボキシメチル
化度:0.7、Ｎ−Boc−ペプチド含量:13.2％）の50mgを0.
1％ NaHCO₃水溶液（2.5ml）に溶解し、２−Ｏ−モノメ
トキシポリエチレングリコール−3,5−ジクロロ−ｓ−
トリアジン（分子量5000、シグマ社製）（以下、PEG₁と
略記）（80mg）を加えて、０℃で４時間反応した。生成
された部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−
PEG₁−Gly−Phe−Phe−Boc複合体を含む反応液に水（2.
5ml）、炭酸水素ナトリウム（500mg）、無水酢酸（200
μ）を加え、４℃で18時間反応してＮ−アセチル化し
た。反応液を水に対して透析し、透析内液を3mlに濃縮
し、アセトン（90ml）を加えて析出した沈殿物を集め、
塩化メチレンで洗浄し、真空乾燥して、Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−Boc複
合体（72mg、PEG含量:37％）を得た。

この複合体（60mg）を0.5N HCl（3.5ml）に溶解し、30
℃で16時間反応してBoc基を脱離し、反応液をエタノー
ル−エーテル（1:2）の混合溶媒（60ml）中に加えて析
出した沈殿物を集め、塩化メチレンで洗浄し、真空乾燥
して、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−
Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（44mg、PEG含量:26％）を得
た。本複合体のゲル濾過溶出パターンを第24図に示す。
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−P
he−Phe−Ｈ複合体（35mg）を１％ NaHCO₃水溶液（1.75
ml）に溶解し、MTX（16mg）の活性エステルを加え、４
℃で18時間反応した。反応液を水に対して透析し、透析
内液を3mlに濃縮し、アセトン（60ml）を加えて析出し
た沈殿物を集め、塩化メチレンで洗浄し、真空乾燥し
て、式（Ｘ）の誘導体の一例として、Ｎ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−MTX複合
体（29mg、PEG含量:21％、MTX含量:7.9％）を黄色粉末
として得た。本複合体の紫外・可視吸収スペクトルとゲ
ル濾過溶出パターンを各々第25図、第26図に示す。

実施例18 実施例12で得た部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体（カルボキシメチル
化度:0.7、Ｎ−Boc−ペプチド含量:13.2％）の50mgを0.
1％ NaHCO₃水溶液（2.5ml）に溶解し、実施例17で用い
たPEG₁（12mg）を加えて、実施例17と同様の方法で、Ｎ
−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe
−Phe−Boc複合体（49mg、PEG含量:8.0％）を得、この4
0mgを用い、Boc基を脱保護して、Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（3
3mg）を得た。Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
−PEG₁−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（21mg）を１％ NaHC
O₃水溶液（1.1ml）に溶解し、MTX（9.5mg）の活性エス
テルを加えて、４℃で18時間反応した。反応液をエタノ
ール（11ml）中に加えて析出した沈殿物を集め、塩化メ
チレンで洗浄し、真空乾燥して、Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−MTX複合体
（17mg、PEG含量:6.1％、MTX含量:8.5％）を得た。

実施例19 実施例12に準じて合成した部分的Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体（カルボ
キシメチル化度:0.7、Ｎ−Boc−ペプチド含量:14.8％）
の50mgを0.1％ NaHCO₃水溶液（5ml）に溶解し、PEG₁（2
00mg）を加えて、実施例17と同様の方法で、Ｎ−アセチ
ルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−B
oc複合体（100mg、PEG含量:58％）を得た。この90mgを
用いて、そのBoc基を脱離して、Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（6
7mg、PEG含量:45％）を得た。Ｎ−アセチルカルボキシ
メチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体（50m
g）を用いて、実施例17と同様にしてMTXの活性エステル
と反応させて、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
−PEG₁−Gly−Phe−Phe−MTX複合体（42mg、PEG含量:43
％、MTX含量:6.3％）を得た。

実施例20 実施例16に準じて合成した部分的Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−Gly−Gly−Phe−Gly−Boc複合体
（カルボキシメチル化度:0.7、Ｎ−Boc−ペプチド含量:
7.9％）の25mgを0.1％ NaHCO₃水溶液（1.25ml）に溶解
し、PEG₁（50mg）を加えて、実施例17と同様の方法で、
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−G
ly−Phe−Gly−Boc複合体（42mg、PEG含量:42％）を得
た。この30mgを用いて、そのBoc基を脱離して、Ｎ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Gly−Ph
e−Gly−Ｈ複合体（20mg）を得た。Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Gly−Phe−Gly−Ｈ複
合体（15mg）を用いて、実施例17と同様にしてMTXの活
性エステルと反応させ、Ｎ−アセチルカルボキシメチル
キトサン−PEG₁−Gly−Gly−Phe−Gly−MTX複合体（11m
g、PEG含量:27％、MTX含量:6.1％）を得た。

実施例21 実施例12に準じて合成した部分的Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体（カルボ
キシメチル化度:0.7、Ｎ−Boc−ペプチド含量:14.8％）
の100mgを0.5％ NaHCO₃水溶液（10ml）に溶解し、ジメ
チルホルムアミド（8.5ml）を加えて均一な溶液とし
た。この溶液に、メトキシポリオキシエチレンカルボン
酸（分子量:5000、シグマ社製）（以下、PEG_COと略記）
の100mgの活性エステルを加えて、４℃で18時間反応さ
せて前記の複合体の糖単位のＮ−アセチル化されていな
いアミノ基へPEG_COを結合させた。反応液を水に対して
透析し、透析内液（27ml）に炭酸水素ナトリウム（3.6
g）、無水酢酸（2.1ml）を加えて、４℃で20時間反応し
て部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG
_CO−Gly−Phe−Phe−Boc複合体をＮ−アセチル化した。
反応液を水に対して透析し、透析内液を6mlに濃縮し、
アセトン（120ml）を加えて析出した沈殿物を集め、塩
化メチレンで洗浄し、真空乾燥して、Ｎ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−PEG_CO−Gly−Phe−Phe−Boc複
合体（109mg、PEG含量:9.0％）を得た。この50mgを用
い、酸処理によりそれのBoc基を脱離して、Ｎ−アセチ
ルカルボキシメチルキトサン−PEG_CO−Gly−Phe−Phe−
Ｈ複合体（35mg、PEG含量:4.7％）を得た。Ｎ−アセチ
ルカルボキシメチルキトサン−PEG_CO−Gly−Phe−Phe−
Ｈ複合体（25mg）を用いて、実施例18と同様にして、MT
Xの活性エステルを反応させ、Ｎ−アセチルカルボキシ
メチルキトサン−PEG_CO−Gly−Phe−Phe−MTX複合体（2
5mg、PEG含量:4.5％、MTX含量:9.1％）を得た。

実施例22 実施例１と同様の方法で調製した部分的Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン（300mg）に、実施例１と同様
の方法でＮ−Boc−Gly−Gly−Gly−OH（289mg）の活性
エステルを作用させて部分的Ｎ−アセチルカルボキシメ
チルキトサン−Gly−Gly−Gly−Boc複合体（334mg）を
得た。

この125mgを水（12ml）に溶解し、3.3％メタ過ヨウ素酸
ナトリウム水溶液（5ml）を加えて、遮光下、室温で４
時間反応させた。この反応液を水に対して透析後、透析
内液を約12mlまで濃縮し、水素化ホウ素ナトリウム（30
mg）を加えて、一晩反応させた。この反応液のpHを4.5
に下げた後、8.0に上げ、次いでエタノール（60ml）中
に加えて析出した沈殿物を集め、真空乾燥して、一部の
ピラノース環が開環してポリオール化したＮ−アセチル
カルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Boc複合体
（77mg）を得た。

この複合体（60mg）を実施例１と同様の方法で酸処理し
て、Boc基を脱離させ、ポリオール化Ｎ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ｈ複合体（46m
g）を得た。この複合体（35mg）にMTX（46mg）の活性エ
ステルを作用させて、ポリオール化Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−MTX複合体（42m
g、MTX含量:29％）を得た。本複合体の紫外・可視部吸
収スペクトルとゲル濾過溶出パターンを各々、第27図、
第28図に示す。

実施例23 実施例１と同様の方法で調製した部分的Ｎ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン（250mg）に、実施例１と同様
の方法でＮ−Boc−Gly−Phe−Phe−Gly−OH（527mg）の
活性エステルを作用させて部分的Ｎ−アセチルカルボキ
シメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Gly−Boc複合体（3
27mg）を得た。この複合体（200mg）を実施例22と同様
の方法で、過ヨウ素酸で酸化し、次いで還元して、ポリ
オール化Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly
−Phe−Phe−Gly−Boc複合体（113mg、Ｎ−Boc−ペプチ
ド含量:28％）を得た。

この複合体（60mg）を実施例１と同様の方法で酸処理し
て、Boc基を脱離し、ポリオール化Ｎ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Gly−Ｈ複合体
（36mg、ペプチド含量:24％）を得た。この30mgにMTX
（55mg）の活性エステルを作用させて、ポリオール化Ｎ
−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe
−Gly−MTX複合体（22mg、MTX含量:19％）を得た。本複
合体のMTX/ペプチド（モル比）と式（XI）におけるa/
（ａ＋ｂ＋ｃ）は、各々、前出の計算式の（５）式と
（１）式から0.93、0.19と算出された。

以下に記載する実験例１〜４によって本発明の式
（Ｉ）、式（Ｘ）および式（XI）の誘導体の諸性質を試
験した。

実験例１ 〔試料と方法〕 実施例１で得られたＮ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Gly−Phe−Phe−MTX複合体と実施例２で得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gl
y−MTX複合体を夫々に生理食塩水に溶解して、400μg/m
lの試料溶液２種を準備した。マウス数匹より採取した
血液を遠心分離して得られた血漿（190μ）に上記の
各試料溶液（10μ）を加え、37℃で反応させた。経時
的に反応液を取り、除蛋白した後、ゲル濾過法（カラ
ム:TSK−gel G4000PW_XL、溶出液:0.1M NaCl、流速:0.8m
l/min、カラム温度:40℃、検出:307nmにおける紫外部吸
収）で分析することにより、複合体として存在している
MTXの血漿中での残存％を求めた。

〔結 果〕

結果を第16図に示す。第16図は式（Ｉ）で表わされる複
合体として存在しているMTXの血漿中での残存パーセン
トの経時変化を示すグラフである。図中で●印線はＮ−
アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−M
TX複合体、□印線はＮ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Gly−Gly−Gly−MTX複合体についての結果を示
す。

第16図より、上記２種のいずれの複合体も血液中で殆ど
分解を受けず、安定であることが認められる。

実験例２ 〔試料と方法〕 実施例１で得られたＮ−アセチルカルボキシメチルキト
サン−Gly−Phe−Phe−MTX複合体（1mg）と実施例２で
得られたＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly
−Gly−Gly−MTX複合体（1mg）を夫々に卵白リゾチーム
（10μｇ）の存在下および非存在下で0.1M酢酸緩衝液
（pH6.0、1ml）中37℃で反応させ、１、３、６および23
時間後の反応液を実験例１記載と同じゲル濾過法により
分析することにより、Ｎ−アセチルカルボキシメチルキ
トサンが分解を受けて複合体が低分子化する結果として
の溶出時間（ゲル濾過における）の延長を求めた。

〔結 果〕

結果を第17図に示す。第17図は反応時間とその反応時間
での反応液においてピークの溶出が現われる溶出時間と
の関係を示すグラフである。図中で○印線および●印線
はＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−
Phe−MTX複合体についてリゾチームが存在しない場合お
よびリゾチームが存在する場合におけるそれぞれの結果
を示し、また□印線および■印線はＮ−アセチルカルボ
キシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−MTX複合体につい
てリゾチームが存在しない場合およびリゾチームが存在
する場合におけるそれぞれの結果を示す。

第17図より、リゾチームの作用により上記の複合体のＮ
−アセチルカルボキシメチルキトサン部分が分解を受
け、その結果、いずれの複合体も低分子化することが認
められるので、複合体が長時間にわたり体内に残留する
ことは起らないことが期待される。

実験例３ 〔試 料〕 MTX部分が³Hラベルしている実施例２のＮ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−MTX複合体を
検体試料の化合物とした。別にH³ラベルした実施例１の
工程途中で得られた部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチ
ルキトサンを対照試料として用意した。

〔方 法〕

ICR系の雄性マウスにsarcoma180を皮下に植え込み、10
日後の担癌マウスを実験に用いた。試料を生理食塩水に
溶解し、各３群匹のマウスを用い、尾静脈より20mg/kg
を投与した。投与後15分、30分、１時間、２時間、６時
間および24時間に大腿動脈および静脈を切断し、血液を
採取した。血液を遠心分離して得られた血清と癌組織の
放射活性を燃焼法により測定し、血清と癌組織中での試
料化合物濃度を求めた。

〔結 果〕

結果を第18図、第19図に示す。第18図は試料化合物の血
清中濃度を経時変化を示すグラフであり、第19図は癌組
織での試料化合物の濃度の経時変化を示すグラフであ
る。共に図中の□印線は対照試料についての結果を、●
印線は上記の検体試料についての結果を表す。

第18図により、上記検体試料はペプチド鎖を介してMTX
を多糖体（Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン）に
結合した複合体であり、従ってこのような複合体は血中
消失が速いと予想されるにもかかわらず、実際には結合
させる以前の単なる多糖体すなわちＮ−アセチルカルボ
キシメチルキトサンとそれ自体と比較しても上記の複合
体の形の検体試料化合物の血中滞留性は同程度またはそ
れ以上に増加していることが認められる。また第19図よ
り、上記検体試料は上記の単なる多糖体と比較してみる
とペプチド鎖を具有することにより癌組織に集合しやす
い性質を新たに獲得していることが認められる。従っ
て、式（Ｉ）の本発明物質において適切なペプチド鎖
（−Ｘ−）を選択することにより式（Ｉ）の本発明物質
に臓器指向の傾向を具備させることができる。

実験例４ 本実験例では、式（Ｘ）の本発明物質の数例を試料とし
て用いて、下記の実験を行った。

すなわち、MTX部分が³Hラベルしている実施例18、実施
例17、実施例19の最終生成物としての複合体（それぞれ
の複合体のポリエチレングリコール（PEG）含量が６
％、21％、43％）を検体１、検体２、検体３のためのラ
ベル化合物として用意した。別に、PEGを欠除された形
の但しMTX部分を³Hラベルした複合体を対照のためのラ
ベル化合物として用意した。検体１、検体２、検体３の
複合体及び対照の複合体の全てにおいて、複合体のカル
ボキシメチルグルコサミン単位の２−アミノ基に結合さ
れたペプチド鎖はいずれもGly−Phe−Pheであり、検体
１、検体２、検体３におけるPEGはいずれも実施例17に
記載されたPEG₁（分子量5000）である。

（試験方法） ウィスター系の雌性ラットに癌細胞ウォーカー256を鼠
径部皮下に移植し、移植６日後の担癌ラットを実験に用
いた。試料投与液は³Hラベルした複合体を、対応する非
放射性の複合体を溶解した生理食塩水溶液で適宜希釈し
て用意し、複合体として10mg/kgの投与量となるように
１群３匹のラットの頚静脈内に試料を投与した。

エーテル麻酔下に頚静脈より経時的（30分、１時間、２
時間、４時間および６時間）に採血を行い血漿を分離し
た。投与後24時間にエ一テル麻酔下に採血を行い、放血
死させた。組織および臓器を採取し、全体あるいは一部
を秤量後、放射能を測定した。

なお、採取された測定組織中の放射能は、コンバストコ
ーンに採取したサンプルを乾燥後、自動試料燃焼装置
（ASC−113、ALOKA）にて燃焼させた後、シンチレータ
ー（AQUASOL−2,NEN）を加えて、液体シンチレーション
カウンター（LSC−3600,ALOKA）にて測定し、外部標準
線源法により補正した。

（試験結果） 試験結果を添付図面の第29図、第30図および後記の表１
に示す。第29図は投与後24時間までの各試料についての
血漿中濃度の経時変化を示すグラフであり、第30図は各
試料について投与量に対する組織中濃度の体内分布を示
すグラフであり、表１は各試料について第29図に基ずい
て求めたAUC値および各試料についての投与量に対する
腫瘍中濃度を示す表である。

第29図より示されるごとく、PEGの導入量が多い程複合
体の血中滞留性は優れており、これを表１のAUC値によ
って示すと、対照に対して検体１（PEG導入量６％）は
約1.3倍、検体２（PEG導入量21％）および検体３（PEG
導入量43％）は約３倍にも増大していることが判る。

また第30図より示されるごとく、腫瘍組織以外の臓器で
はPEG導入量による顕著な差は認められないのに対し、
腫瘍組織ではPEG導入量によって腫瘍中濃度が着実に高
くなっているのが認められ、具体的には表１の腫瘍中濃
度の値によって示されるごとくである。すなわちＮ−ア
セチルカルボキシメチルキトサン誘導体においてPEGが
導入された場合には、癌組織を認識する傾向が現われる
ようになり、従って制癌剤の必要投与量を少量化するこ
とができ、その結果、他の臓器への好ましくない影響を
低減することが可能となる。

図面の簡単な説明 添付図面について、 第１図：本発明の実施例１で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体の紫
外部吸収スペクトル（濃度:1900μg/ml、溶媒:30％EtO
H）を示す。

第２図：本発明の実施例１で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Boc複合体のゲ
ル濾過溶出パターン（検出:258nmにおける紫外部吸収）
を示す。

第３図：本発明の実施例１で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体の紫
外部吸収スペクトル（濃度:1900μg/ml、溶媒:30％EtO
H）を示す。

第４図：本発明の実施例１で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−Ｈ複合体のゲ
ル濾過溶出パターン（検出:258nmにおける紫外部吸収）
を示す。

第５図：本発明の実施例１で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Ph
e−MTX複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度:100
μg/ml、溶液:0.1％NaHCO₃）を示す。

第６図：本発明の実施例１で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Ph
e−MTX複合体のゲル濾過溶出パターン（検出:307nmにお
ける紫外部吸収）を示す。

第７図：本発明の実施例２で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−pMZ複合体の紫
外部吸収スペクトル（濃度:500μg/ml、溶媒：水）を示
す。

第８図：本発明の実施例２で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−pMZ複合体のゲ
ル濾過溶出パターン（検出:272nmにおける紫外部吸収）
を示す。

第９図：本発明の実施例２で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ｈ複合体の紫
外部吸収スペクトル（濃度:1000μg/ml、溶媒：水）を
示す。

第10図：本発明の実施例２で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gl
y−MTX複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度:48
μg/ml、溶媒:0.1％NaHCO₃）を示す。

第11図：本発明の実施例２で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gl
y−MTX複合体のゲル濾過溶出パターン（検出:307nmにお
ける紫外部吸収）を示す。

第12図：本発明の実施例６で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ala−MTX複合
体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度:50μg/ml、溶
媒:0.1％NaHCO₃）を示す。

第13図：本発明の実施例６で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−Ala−MTX複合
体のゲル濾過溶出パターン（検出:307nmにおける紫外部
吸収）を示す。

第14図：本発明の実施例７で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Suc−Ala−Al
a−Ala−ｐ−ニトロアニリド複合体の紫外部吸収スペク
トル（濃度:500μg/ml、溶媒：水）を示す。

第15図：本発明の実施例７で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−Suc−Ala−Al
a−Ala−ｐ−ニトロアニリドのゲル濾過溶出パターン
（検出:315nmにおける紫外部吸収）を示す。

第16図：本発明による実験例１において測定されて、キ
トサンとの複合体として存在している医薬化合物メトト
レキサート（MTX）の血漿中での残存パーセントの経時
変化（in vitro）を示すグラフである。

第17図：本発明による実験例２において測定されて、本
発明の複合体を酢酸緩衝液で分解させる反応に当って、
反応時間とその反応時間での反応液においてピークの溶
出が現われる溶出時間との関係を示すグラフを示す。

第18図：本発明による実験例３で測定されて、試料化合
物の血清中濃度の経時変化（in vivo）を示すグラフで
ある。

第19図：本発明による実験例３で測定されて、試料化合
物の癌組織での濃度の経時変化を示すグラフである。

第20図：本発明の実施例11で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Suc−Gly−Phe−Gly−Lys−MTX
複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度:490μg/m
l、溶媒:0.1％NaHCO₃）を示す。

第21図：本発明の実施例11で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Suc−Gly−Phe−Gly−Lys−MTX
複合体のゲル濾過溶出パターン（検出:307nmにおける紫
外部吸収）を示す。

第22図：本発明の実施例12で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−MTX複合体（カ
ルボキシメチル化度:0.7）の紫外・可視部吸収スペクト
ル（濃度:100μg/ml、溶媒:0.1％NaHCO₃）を示す。

第23図：本発明の実施例12で得られたＮ−アセチルカル
ボキシメチルキトサン−Gly−Phe−Phe−MTX複合体（カ
ルボキシメチル化度:0.7）のゲル濾過溶出パターン（検
出:307nmにおける紫外部吸収）を示す。

第24図：本発明の実施例17で生成されたＮ−アセチルカ
ルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−Phe−Phe−Ｈ複
合体のゲル濾過溶出パターン（検出:258nmにおける紫外
部吸収）を示す。

第25図：本発明の実施例17で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−P
he−Phe−MTX複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃
度:100μg/ml、溶媒:0.1％NaHCO₃）を示す。

第26図：本発明の実施例17で最終生成物として得られた
Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン−PEG₁−Gly−P
he−Phe−MTX複合体のゲル濾過溶出パターン（検出:307
nmにおける紫外部吸収）を示す。

第27図：本発明の実施例22で得られたポリオール化Ｎ−
アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−M
TX複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度:40μg/m
l、溶媒:0.1％NaHCO₃）を示す。

第28図：本発明の実施例22で得られたポリオール化Ｎ−
アセチルカルボキシメチルキトサン−Gly−Gly−Gly−M
TX複合体のゲル濾過溶出パターン（検出:307nmにおける
紫外部吸収）を示す。

第29図：本発明の実験例４で測定されて、投与後24時間
までの各試料についての血漿中濃度の経時変化を示すグ
ラフである。

第30図：各試料について投与量に対する組織中濃度の体
内分布を示すグラフである。

産業上の利用可能性 本発明による新規なＮ−アセチルカルボキシメチルキト
サン誘導体は医薬化合物の生体内ターゲティングを目標
としており、医薬化合物の血液中での安定性、臓器への
標的指向性並びに体内での被代謝性を高める点で医薬化
合物のための多糖型高分子担体として有用である。ま
た、本発明により医薬化合物と結合した複合体の形とし
ての新規なＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導
体は、臓器への標的指向性及びその他の有利な性質を有
し、医薬として有用である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式（Ｉ） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
   基、ＰはR₃CO基、R₄NH基またはR₅O基、ＱはＨまたはOH
   基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ酸を含むペ
   プチド鎖を意味する。なおR₃COOHはカルボン酸化合物、
   R₄NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を意味
   する。a₁、a₂は０または正の整数を示すが、共に０とな
   る場合を除く。ｂは正の整数を示す。〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導
   体。
2. 【請求項２】XPにおけるＸが１〜４個の同一または異な
   るアミノ酸からなるペプチド鎖であり、そのＮ末端側ア
   ミノ酸にＰが結合する請求の範囲１記載のＮ−アセチル
   カルボキシメチルキトサン誘導体。
3. 【請求項３】XPが下記のいづれかである請求の範囲２記
   載のＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体。 Ｐ−Phe−Phe−Gly− Ｐ−Gly−Phe−Gly−Gly− Ｐ−Phe−Gly−Phe−Gly− Ｐ−Gly−Phe−Gly−Phe− Ｐ−Gly−Gly−Gly− Ｐ−Ala−Gly−Gly−Gly−
4. 【請求項４】XPにおけるＸが、二塩基性酸を含み、かつ
   １〜４個の同一または異なるアミノ酸からなるペプチド
   鎖であり、そのＣ末端側アミノ酸にＰが結合する請求の
   範囲第１記載のＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン
   誘導体。
5. 【請求項５】XPが下記のいづれかである請求の範囲４記
   載のＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体。 −Suc−Ala−Ala−Ala−Ｐ −Suc−Ala−Ala−Val−Ala−Ｐ （Sucはコハク酸残基を示す）
6. 【請求項６】R₃CO基とR₅O基が保護基である請求の範囲
   １〜５のいづれかの項に記載のＮ−アセチルカルボキシ
   メチルキトサン誘導体。
7. 【請求項７】R₃CO基がtert−ブトキシカルボニル基また
   はｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基であり、ま
   たR₅O基がtert−ブチルオキシ基である請求の範囲６記
   載のＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体。
8. 【請求項８】R₃COOHがメトトレキサートである請求の範
   囲１〜５のいづれかの項に記載のＮ−アセチルカルボキ
   シメチルキトサン誘導体。
9. 【請求項９】式（II） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
   基、ここでＰはＨ、OH基、R₃CO基、R₄NH基またはR₅O
   基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ酸を含むペ
   プチド鎖を意味する。なおR₃COOHはカルボン酸化合物、
   R₄NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を意味
   する。ａ、b₁、b₂は０または正の整数を示す。〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしｂ＝b₁＋b₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
   誘導体。
10. 【請求項１０】式（III） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
    基を表わす〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（２）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
    に次式 PX−OH （IV） 〔式中、ここでＰはＨ、OH基、R₃CO基、R₄NH基またはR₅
    O基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ酸を含む
    ペプチド鎖を意味する。なおR₃COOHはカルボン酸化合
    物、R₄NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を
    意味する。〕 で示される化合物を反応せしめることを特徴とする、式
    （II） 〔式中、R₁、R₂、Ｐ、Ｘは（III）式における前記と同
    じ意味を示す。ａ、b₁、b₂は正の整数を示す。〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしｂ＝b₁＋b₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
    誘導体の製法。
11. 【請求項１１】式（II′） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
    基、P₁はＨまたはOH基、もしくはR₃′CO基、R₄′NH基ま
    たはR₅′Ｏ基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ
    酸を含むペプチド鎖を意味する。なおR₃′COOHはカルボ
    ン酸化合物、R₄′NH₂はアミノ化合物、R₅′OHはアルコ
    ール化合物を意味する。ａ、b₁、b₂は正の整数を示
    す。〕によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：
    − （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしｂ＝b₁＋b₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有する部分的Ｎ−アセチルカルボキシメチルキトサン
    誘導体をアセチル化し、P₁基がＨまたはOH基以外のとき
    は、さらにP₁基を脱離せしめ、最後に次式 Ｐ−Ｈ または Ｐ−OH （Ｖ） 〔式中、ＰはR₃CO基、R₄NH基またはR₅O基を表す。〕 で示される化合物を反応せしめることを特徴とする、式
    （Ｉ） 〔式中、R₁、R₂、Ｐ、Ｘは前記と同じ意味を示し、Ｑは
    ＨまたはOH基を意味する。a₁、a₂は０または正の整数を
    示すが、共に０となる場合を除く。ｂは正の整数を示
    す。〕 によって示され、下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導体
    の製法。
12. 【請求項１２】式（Ｘ）又は式（XI） 〔式中、R₁およびR₂は夫々にＨまたはカルボキシメチル
    基、ＰはR₃CO基、R₄NH基またはR₅O基、ＱはＨまたはOH
    基、Ｘは１〜10個の同一または異なるアミノ酸を含むペ
    プチド鎖を意味する。なおR₃COOHはカルボン酸化合物、
    R₄NH₂はアミノ化合物、R₅OHはアルコール化合物を意味
    する。a₁、a₂は０または正の整数を示すが、共に０とな
    る場合を除く。ｂおよびｃは正の整数を示す。 また式中、−PEGは下記の式（VI），（VII），（VIII）
    又は（IX） −CO−CH₂CH₂−CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VII） −CO−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （VIII） −CO−CH₂−Ｏ−（CH₂CH₂O）_ｎ−CH₃ （IX） の基を表わし、ｎはポリエチレングリコール鎖の平均重
    合度を示す〕 によって示され且つ下記の特性値（１）〜（４）：− （１）カルボキシメチル化度:0.5〜1.2 （２）分子量（ゲル濾過法）:3,000〜300,000 （３）a/（ａ＋ｂ＋ｃ）:0.01〜１ （ただしａ＝a₁＋a₂） （４）P/X（モル比）:0.1〜１ を有するＮ−アセチルカルボキシメチルキトサン誘導
    体。