JPH074234B2 - 植物の組織培養方法および培養装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物の組織培養方法および、培養装置に関す
る。更に詳しくは従来法に比べて高い組織培養物濃度の
もとに効率よく培養する方法、および、該方法を実施す
るための培養装置に関する。

〔従来の技術〕

従来の植物の組織培養方法としては、回分培養法と連続
培養法が知られている。

（１） 回分培養 回分培養での組織培養物（培養細胞など）の収量は培地
の栄養基質（培地成分）濃度に依存しているので、従来
回分培養でよく使用されるリンスマイヤーとスクーグの
培地、ホワイトの培地やニツチ＆ニツチの培地では培養
中に栄養基質が消費されてしまい、組織培養物濃度を高
くして培養することはできない。また、組織培養物濃度
を高める方法として、培地の栄養基質濃度を従来よりも
高めて、培養する方法も考えられるが、栄養基質濃度を
あまり高くすると組織培養物の壊死などの栄養基質濃度
阻害が起きるため栄養基質濃度を高めて組織培養物の生
産性を高めるこの方法には限界があるため、培養槽の単
位容積当たりの組織培養物の収量は低く培養の効率は悪
い。

（２） 連続培養 従来の連続培養の方法としては組織培養物といつしよに
培養液を培養槽外へ排出して、培地を更新して培養する
方法が知られている〔例えば「醗酵工学」第61巻117〜1
28頁（1983年）〕。しかし、この方法は送入される培地
と等量の培養液を組織培養物といつしよに槽外へ排出す
る方法であるため、培養液に対する組織培養物の濃度は
新鮮重量で表わして通常100g/未満であり、組織培養
物濃度をこれよりも高くして培養することが出来ない。
従つて該方法では培養槽の単位容積当たりの組織培養物
の収量は低く、培養の効率は悪い。

〔発明が解決しようとする問題点〕

かかる背景のものに本発明者等は、液体培地を用いる従
来の培養方法を改良して組織培養物を効率よく生産する
方法、すなわち、培養槽の単位容積当たりの組織培養物
の収量が高く、従来法に比べて効率良く培養できる高密
度培養の方法について検討した。

〔問題点を解決するための手段〕

その結果、下記方法を採用すれば前記目的を達成できる
ことを見出し本発明を完成するに到つた。すなわち、本
発明の第１の発明によれば、液体培地を用いて植物を組
織培養するに当たつて、培養中の培養槽における組織培
養物の濃度が組織培養物の新鮮重量で表わして100〜500
〔g/〕の範囲にあるように、少なくともある期間、培
地の栄養基質濃度を所定の濃度に調整した液体培地を培
養槽に連続的または非連続的に供給する一方、培養槽の
他方より、全排出物中の組織培養物の平均濃度が槽内の
組織培養物の濃度より低くなるように、 １）少なくともある時期、培養液のみを連続的又は非連
続的に抜き出し、かつ ２）少なくともある期間、培養混合物（培養液＋組織培
養物）を培養槽の排出口より連続的または非連続的に抜
き出すことにより、培養槽中の培養液を更新しながら連
続的に培養を行うことを特徴とする植物の組織培養方
法、が提供される。

又、本発明の第２の発明によれば、培養液導入口及び２
個以上の培養液排出口を備えた通気式培養装置であっ
て、少なくとも１個の培養液排出口には組織培養物の排
出を妨げるフィルターが設けられており、少なくとも１
個の培養液排出口には組織培養物の排出を妨げるフィル
ターが設けられていないことを特徴とする培養装置、が
提供される。

〔植物組織培養方法〕

本発明の植物の組織培養方法が適用される植物としては
特に限定されず、従来の組織培養が適用できる植物であ
れば、本発明の方法を該植物に適用することは原理的に
可能である。このような植物として、具体的にはキンポ
ウゲ科植物のオウレン、ケジ科植物のケシ、マメ科植物
のカンゾウ、セリ科植物のニンジン、ミシマサイコ、タ
デ科植物のダイオウ、キヨウチクトウ科植物のインドジ
ヤボク、ニチニチソウ、ナス科植物のタバコ、ムラサキ
科植物のムラサキ、シソ科植物のシソ、ハツカ、アカネ
科植物のコーヒー、ゴマノハグサ科植物のジキタリスな
どを挙げることが出来る。

本発明では前記植物の組織（細胞、器官を含む）を液体
培地を用いて、培養が行われるが、この場合の液体培地
としては、従来から知られている植物の組織培養に使用
されている培地が使用できる。該培地として具体的には
無機成分、炭素源および植物ホルモンを必須成分とし、
これにビタミン類を添加し、更に必要に応じてアミノ酸
類を添加した培地である。該培地の無機成分としては、
窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリ
ブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素を含む無機塩
を挙げることができ、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナ
トリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム、リン酸１水素カリウム、リ
ン酸２水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネ
シウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫
酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、酸化モ
リブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コ
バルト等の化合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、シヨ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コール等を例示できる。

該培地の植物ホルモンとしては、インドール酢酸（IA
A）、ナフタレン酢酸（NAA）、Ｐ−クロロフエノキシイ
ソ酪酸および2,4−ジクロロフエノキシ酢酸（2,4−Ｄ）
等のオーキシン類およびカイネチン、ゼアチンおよびペ
ンシルジルアデニン等のサイトカイニン類を例示でき
る。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンB₁）、ピリドキシン（ビタミンB₆）、ピリドキサ
ール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン
酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
B₂）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システイン、チロシン、およびリジ
ンなどを例示できる。

本発明で使用される液体培地は、通常は、前記無機成分
を約0.1μＭないし約100mM、前記炭素源を約1g/ない
し約100g/、前記植物ホルモンを通常は0.01μＭない
し1000μＭ、好ましくは１μＭないし100μＭの範囲含
有し、前記ビタミン類を約0.1mg/ないし約150mg/お
よび前記アミノ酸類を０ないし約1000mg/含ませて使
用されることが望ましい。

このような各成分を含む培地として具体的には、従来か
ら知られている植物の組織培養に用いられている培地、
例えばムラシゲ・スクーグ（′62）〔Murashige ＆ Sko
og〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（MR−1965）
〔Linsmaier ＆ Skoog〕の培地、ホワイト（'63）〔Whi
te〕の培地、ガンボルグ（Gamborg）のＢ−５倍地、三
井のＭ−９培地等に前記した炭素源および植物ホルモン
（Ａ）を添加し、更に必要に応じて前記したビタミン
類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示できる
が、本発明ではこの中でも特にリンスマイヤー・スクー
グ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製される培
地が好ましい。なお、上記した従来公知の培地の組成に
関しては、例えば、竹内、中島、小谷著の「新植物組織
培養」P386〜P391、朝倉書店、1979年に記載されてい
る。

本発明では前記液体培地を用いて前記植物を組織培養す
る場合、本発明を特徴づける以下の条件のもとに培養が
実施される。以下該条件について詳述する。

（１） 本発明に係る植物組織培養方法においては、組
織培養の期間中は培養槽中の組織培養物濃度が液体培地
に対して100〜500〔g/〕、好ましくは200〜400〔g/
〕の範囲にあるようにして培養が行われる。培養期間
中には組織が増殖してその量を増すので、本発明では必
要に応じて培養期間中に組織培養物を適宜の量培養槽外
へ適宜方法によつて取り出すことによつて、培養槽中の
組織培養物濃度を前記範囲内に維持する方法を行つても
差し支えない。なお、この場合の組織培養物の重量は湿
つた（wet）状態で測定された新鮮重量である。ここに
新鮮重量とは通常以下の方法によつて求められる組織培
養物の重量である。すなわち、組織培養物を濾布をひい
たヌツチエにとり、水洗ポンプなどで５分間濾過を行
い、組織培養物外の培養液を除いたときの組織培養物の
重量である。このようにして求められる組織培養物の新
鮮重量物は植物によつても異なるが通常含水率が80〜95
wt％である。

また組織培養物とは植物の組織片や細胞を培養したもの
であつて、該組織片としては茎頂、茎、葉、花、種子、
根などの組織片を例示でき、組織片から誘導されるカル
スや、培養細胞も含まれる。そして組織培養物を更に組
織培養の原料として用いることができる。本発明では培
養中の組織培養物濃度を100g/未満にした場合には、
培養槽の単位容積あたりの組織培養物の収量が低く、従
つて培養の効率が従来方と同様に低いので好ましくな
い。また、組織培養物濃度を500〔g/〕を越えて、高
くした場合には、スリラー濃度が高くなり培養液の撹
拌、混合が不充分となるため、効率良く酸素供給を行う
ことが困難となり、培養中に組織培養物の壊死などが起
こって、組織培養物の正常な増殖と生育が困難となりや
すい。また、酵素の供給を充分にしようとして撹拌を激
しくすると組織培養物の破滅、損傷が起きるなどして培
養が困難となる。このように組織培養物濃度を500〔g/
〕を越えて高くした場合には、培養にとつて好ましく
ないことが起きる。そこで、組織培養物濃度は100〜500
〔g/〕の範囲にあるようにして培養が行われる。

本発明では培養中の組織培養物濃度は前記範囲になるよ
うに保たれて培養が行われるわけであるが、この場合、
該条件を満足させるために、組織培養物の増殖によつて
培養槽内の組織培養物濃度が前記濃度範囲を越えないよ
うに適用量の組織培養物を適宜抜き出す操作を行うこと
が出来ることは前述したとおりである。もつとも、培養
期間中に組織培養物が増殖して、濃度が高くなつても、
組織培養濃度が前記濃度範囲を越えない場合には、組織
培養物を培養槽外へ取り出す操作は必ずしも行う必要は
ない。また本発明では組織培養の開始初期から培養槽中
における組織培養物の濃度を必ずしも100〜500〔g/〕
の範囲にする必要はなく、例えば培養槽に仕込む植物の
組織片あるいは培養細胞の液体培地に対する濃度を100
〔g/〕未満としてこれを培養槽に仕込んで組織培養を
行つてもよい。この場合には培養中に細胞が増殖して組
織培養物の濃度が100〜500〔g/〕に高められるので本
発明の方法に係わる組織培養を行うことができる。本発
明では組織培養は回分法あるいは連続法のいずれの方法
によつても行うことができる。

（２） 本発明では先の（１）で示した条件を満足する
ように、すなわち組織培養物の濃度が100〜500〔g/〕
の範囲にあるように、少なくともある期間、培地の栄養
基質濃度を所定の濃度に調整した液体培地を培養槽に連
続的又は非連続的に供給する一方、培養槽の他方より培
養液のみ或いは培養液のみと培養混合物の両者を、全排
出物中の組織培養物の平均濃度が槽内の組織培養物の濃
度よりも低くなるようにして、連続的または非連続的に
抜き出して、培養槽中の培養液を更新させながら組織培
養が行われる。培養液の更新は連続的であつても非連続
的であつてもよい。

ここで栄養基質とは、前述した本発明で使用する液体培
地の培地成分であつて、前記した無機成分、炭素源、植
物ホルモン、ビタミン類およびアミノ酸類である。

また栄養基質濃度が所定の濃度に調整された培養液と
は、前述したように無機成分を約0.1μＭ〜約100mM、炭
素源を約１〜約100g/、植物ホルモンを約0.01〜1000
μＭ、好ましくは１〜100μＭ、ビタミン類を約0.1〜約
150mg/、アミノ酸類を０ないし約1000mg/の濃度範
囲に調製した液体培地である。本発明では培養槽に供給
される培地成分の濃度を前記範囲になるように調整した
液体培地については、通常は新鮮な液体培地を用いるこ
とが好ましいが、培養槽から抜き出された培地の栄養基
質濃度を調製してからこれを再度循環使用する方法を行
つても差し支えない。循環使用する場合には培養液中の
細胞の代謝によつて生じる老廃物を適宜除去する処理を
行うことが好ましい。

本発明では培養液を更新させながら組織培養を行うに当
たつては、培養槽中に培養液の量をＶ〔〕、培養槽に
供給する液体培地の量をＦ〔/day〕として、F/V〔day
^-1〕で定義される培地更新率と組織培養物の比増殖速度
μ〔day^-1〕の関係がμ≦F/V＜20μの範囲にあるように
して植物の組織培養を行うことが好ましい。ここで比増
殖速度μ〔day^-1〕とは以下の方法によつて定義される
量である。

組織培養物を槽外へ排出させない場合、培養のある時期
toの組織培養物量をXoとし、ｔ時間（日）後の組織培養
物量をxtとした場合、比増殖速度μは次式で定義され
る。

また組織培養物量をXoと維持して増殖した組織培養物を
槽外に排出した場合、ｔ時間（日）後槽外に排出さてた
組織培養物量をYtとすると比増食速度μは次で定義され
る。

そしてμのもつその物理的意味は〔time^-1〕の次元をも
ち、μの値が大きいほど組織培養物の増殖が速いことに
なる。

本発明では比増殖速度μの値は植物の組織培養物による
が通常0.02〜0.4〔day^-1〕、好ましくは0.05〜0.2〔day
^-1〕の範囲にあるようにして組織培養が行われる。本発
明においては、培他の栄養基質の濃度が所定の濃度に調
整された液体培地を培養槽に連続的または非連続的に供
給する際供給量Ｆ〔/day〕はμ≦F/V＜20μの式を満
足するようにして決めることが好ましいことは前述した
とおりである。本発明では培地更新率F/Vの値としては
通常0.02〜８〔day^-1〕、好ましくは0.05〜４〔day^-1〕
の範囲にある。

本発明では培値槽の他方より培養液を連続的または非連
続的に抜き出す場合、培養中の培養槽における組織培養
物の濃度を前記した100〜500〔g/〕の範囲にあるよう
にするために、少なくともある期間培養液のみを排出す
る。ここで、少なくともある期間培養液のみ或いは培養
液のみと培養混合物の両者を、全排出物中の組織培養物
の平均濃度が槽内の組織培養物の濃度よりも低くなるよ
うにして排出するは、通常は組織培養物を含まない培養
液のみを抜き出し、必要に応じて適宜量の培養混合物を
培養液と共に抜き出しても差し支えないということを意
味する。培養液のみを抜き出しながら組織培養を行う場
合には、後述する本発明に係わるフイルターを装着した
培養液の排出管機構を有する培養槽を用いて行うことが
できる。

本発明では培地更新率（F/V）が比増殖速度μよりも小
さなF/V＜μの場合には、組織培養物濃度が高くなりす
ぎてしまい、組織培養物の最適濃度を維持できなくなる
などの理由から培養槽から培養液だけを取り出すよりも
適宜量の培養細胞も含めて取り出すことが好ましく、例
えば培養槽に設けられた排出管より組織培養物を含む培
養液を取り出すと共に、培地の栄養基質濃度が前記所定
濃度に調製された液体培地を培養槽に送入して培養槽に
おける組織培養物の濃度を前記範囲内にして培養するこ
ともできる。

本発明では培地更新率（F/V）が比増殖速度μより極端
に大きい20μ≦F/Vの場合には、組織培養物の黒化、壊
死などの悪影響が通常おこり易い。そこで本発明では培
地更新率（F/V）をμ≦F/V＜20μの範囲で制御すること
によつて組織培養を行うことが特に好ましい。

本発明においては、培養槽の他方より連続的又は非連続
的に抜き出される培養液の量としては、通常は前述した
培養槽に供給される培養量Ｆ〔/day〕に相応する量で
あるが、必ずしもこの量に限定されることは無く、例え
ば前記したF/V＜μの条件で培養している場合には必要
に応じて培地の抜き出し量をＦ〔/day〕よりも適宜量
増しても差支えない。

〔本発明の組織培養方法による効果〕

従来採用されている植物の組織培養においても培養液を
更新しながら培養する連続培養法が知られているが、こ
の場合には前述したように培養液だけでなく組織培養物
も同時に培養槽外に抜き出される方法であるため本発明
の方法のように高い濃度で組織培養物を培養することは
できない。これに対して本発明では培養の期間中は培養
混合物中の培養液のみを培養槽外へ抜き出せるように工
夫した後述の培養液排出管機構を有する培養装置を用い
ることによつて前記した高密度の組織培養方法が可能と
なつた。

一般に植物の組織培養で、高い濃度の組織培養物を培養
しようとする場合には、組織培養物の濃度が高いため組
織培養物によつて消費される基質（培地成分）の消費速
度は速くなるので、通常の基質濃度の培養液を用いた場
合には、基質がすぐなくなり組織培養物を充分に生育さ
せることは困難である。そこで通常よりも高い基質濃度
の培養液を用いて培養する方法も考えられるが、該濃度
を高くし過ぎると組織培養物の壊死や成長の異常が起こ
るなど、支障をきたすのでその濃度に自ずから限界があ
る。本発明はかかる点を認識した上で、従来試みられる
ことのなかつた高密度による組織培養の方法を提案した
ものであり、前記した本発明の組織培養の方法によれ
ば、組織培養物の濃度を従来法に比べて高うした培養を
行つても、培養液を更新させているので、組織培養物の
生育が弱まつたり、あるいは細胞外へ排出させる老廃物
によつて細胞の生育が阻害されることもないので細胞を
充分に生育させて従来に比べて効率良く組織培養をする
ことが可能となる。

〔培養の装置〕

前記した本発明の植物の組織培養方法は、例えば、以下
に詳述する本発明に係わる培養装置を用いて実施するこ
とが好ましい、該培養装置は、培養液導入口及び２個以
上の培養液排出口を備えた通気式培養装置であって、少
なくとも１個の培養液排出口には組織培養物の排出を妨
げるフィルターが設けられており、少なくとも１個の培
養液排出口には組織培養物の排出を妨げるフィルターが
設けられていないことを特徴とする培養装置である。

本発明の培養装置について第１図に例示した培養装置を
用いて説明する。本発明では、培養液を取り出す排出管
において、培養槽内側に位置して、培養液と接触してい
る部分の開口部３にはフイルターが装着されており、こ
れにより、培養混合物のうち組織培養物を含まない培養
液が該排出管を介して培養槽外へ排出することができる
ようなつている。該フイルターとして、具体的には金属
材質あるいは合成樹脂材質の網あるとは合成繊維又は天
然繊維を加工して得られる細孔を有する布状のものなど
を例示できる。ここで網目の大きさあるいは細孔の大き
さについては組織培養物が通過できずに培養液のみ通過
するものであれば任意である。フイルターとして網など
を使用する場合にはこれを２枚以上必要に応じて重ねれ
用いても差し支えない。フイルターを装着した排出管の
開口部３の培養槽内部における位置については、開口部
が培養液に接する位置であれば特にどの位置に設けなけ
ればならないということはないが、培養液の更新を効果
的に行う必要があるので、供給される培地導入口２から
できるだけ離れた位置が望ましい。

本発明では前記したフイルターを装着した開口部２を有
する排出管には、この部分から培養液を抜き出せるだけ
でなく、該開口部とつながつている排出管の他方より加
圧流体を送入することによつてこの開口部より流体を噴
出させて、フイルターが細胞によつて目づまりを起こす
のを防止できるような機構が施されていると好都合であ
る。この場合について第１図をもとに更に説明する。培
養液は開口部３より３を経由して培養液出口４に排出さ
れる。一方、培養細胞によつて開口部３のフイルター部
分が目づまりするのを防止するために、あるいは既に目
づまりした細胞を除去する方法として加圧流体送入口８
より加圧流体を適宜量導入して開口部３より噴出させて
この外力によつて目づまりを起こしている細胞の除去と
目づまり防止を行う。この場合加圧流体の噴出操作は開
口部３を介しての培養液の抜き出しと同時に行つても良
いし、あるいはこの培養液の抜き出しと加圧流体の噴出
操作を適宜間隔をおいて交互に行うことができる。

本発明では開口部３より噴出させる加圧流体としては、
培養に悪い影響を及ぼさないものであればどのようなも
のでも良いが、通常は空気等の酸素含ガス、チツ素ガス
等の加圧ガスあるいは加圧した液体培地を用いることが
できる。加圧流体の噴出量および圧力としては適宜であ
つて開口部３のフイルターの目づまりを防止できる量で
あれば良く、加圧流体は前述した如く連続的あるいは間
欠的に開口部３より噴出させることができる。

本発明の植物の組織培養において使用される培養装置は
前述したフイルターを装着した開口部３を備えた排出管
の他に、培地導入管１、培養中あるいは、培養終了後に
培養混合物（培養液＋組織培養物）を抜き出すめの排出
管７を有している。その他として、本発明で用いられる
培養装置には必要に応じて従来の培養装置が採用してい
る酸素含有ガス（例えば空気など）を液体培地中に通気
する通気管５あるいは撹拌装置を有していても良い。撹
拌装置として、例えば本出願人が特願昭59−103938号で
提案した培養物に剪断力等の細胞を損傷するような外力
がほとんどかからない新規なジヤイロ様の施回運動を行
う培養槽あるいは、特開昭58−134989号で提案した回転
円筒型培養装置を用いてもよい。

〔発明の効果〕

本発明の植物の組織培養方法によれば、培養槽の単位容
積あたりの組織培養物の収量を従来法に比べて高くする
ことができるので、組織培養を工業的規模で実施する場
合、従来に比べて経済的に効率良く、組織培養物を生産
することが可能となる。また、本発明の培養装置を用い
れば高密度培養を効率良く実施することが出来る。

実施例 １ オウレン（Coptis japonica）の培養細胞をリンスマイ
ヤーとスクーグの培地で本発明による培養装置を用いて
培養した。培養装置は図１のような10の通気撹拌型培
養槽で培養液の取り出し口に細孔約0.4mm、濾過面積約1
0cm²のナイロンメツシユを装置し、細胞を含まない培養
液のみを培養槽外へ排出できるようにして培養を行つ
た。培養は25℃で２週間続け、その間、培養細胞は培養
槽外へ排出せずに槽内へ蓄積させた。

またこのときの培養液の一日当たりの培地更新率F/Vの
値は培養槽から排出される培養液の糖濃度が0.5％とな
るように培養細胞の増殖に応じて0.3〜1.0〔day^-1〕の
範囲で制御した。２週間の培養で培養槽の培養液量の５
倍量のリンスマイヤーとスクーグの培地を供給した。培
養後の細胞濃度およびベルベリン収量を表１に示した。
２週間で細胞は約6.6倍に生育し、最終的に395g/の細
胞濃度となつた。

比較例 １ 実施例１で供給した栄養分の全量を含む培地、すなわ
ち、リンスマイヤーとスクーグの培地の６倍濃度の培地
で培養を開始し、培養期間（２週間）の培地を一切更新
せずに培養を行つた。培地成分が高い濃度に存在するた
めに栄養基質濃度阻害によつて細胞のほとんどが壊死し
た。培養終了後の細胞濃度およびベルベリン収量を表１
に示した。

比較例 ２ 実施例１と同じ濃度（１倍濃度）のリンスマイヤー・ス
クーグの培地を用いて培養を開始し、次々リンスマイヤ
ー・スクーグの培地の20倍の濃縮培地を実施例１と同じ
ように培養槽中にある培養液の糖濃度が0.5％となるよ
うに20倍の濃縮培地を適宜量培養槽して供給し、かつ培
養液を排出せずして培養を２週間行つた。培養後の細胞
濃度およびベルベリン収量を表１に示した。

実施例 ２ オウレン（Coptis japonica）の培養細胞をリンスマイ
ヤーとスクーグの培地で、本発明による培養装置を用い
て培養した。培養装置は実施例１と同じ培養槽を用い
た。リンスマイヤーとスクーグの培地を１日あたり培養
槽内の培養液の70％が更新されるように供給し（培地更
新率0.7day^-1）、培養槽内の培養液量が一定となるよう
に培養液排出管４で細胞を含まない培養液を排出した。
また培養液中の細胞濃度が350g/（新鮮重量）を越す
場合、培養混合物の排出管７から細胞を培養液とともに
槽外へ排出し、細胞濃度が350g/となるように細胞濃
度を制御しながら連続培養を行つた。その結果、細胞の
比増殖速度μは0.12〔day^-1〕に達し、１日あたりの細
胞生産量は42g/（新鮮重量）となつた。

比較例 ３ リンスマイヤーとスクーグの培地を１日あたり培養液70
％が更新される量で供給し、それと同様の培養混合物を
排出管７を用いて排出しながら培養を行い本発明による
培養液だけを別途抜き出す操作を行わなかつた。

その結果、２週間の培養で培養槽内の細胞がほとんど流
出し、培養続行不能となつた。

比較例 ４ 従来から知られている連続培養を行つた。すなわち、リ
ンス・マイヤーとスクーグの培地を培養槽内へ供給し、
同量の培養液を細胞とともに槽外へ排出しながら培養を
行つた。その結果培地の更新率が0.1〔day^-1〕以下のと
きに定常状態となり、その中でも培地更新率0.1〔da
y^-1〕の場合に最高の細胞収量となつた。その時の比増
殖速度μは0.1〔day^-1〕で細胞濃度は65g/（新鮮重）
となり１日の細胞収量は6.5g/（新鮮重）となり、１
日当たりの細胞収量は実施例２の場合の15％程度と低か
つた。

実施例 ３〜５ キンポウゲ科以外の植物細胞として、ムラサキ科植物の
ムラカシ（Lithospemun）、キヨウチクトウ科植物のニ
チニチソウ（Lochnera）とナス科植物のタバコ（Nicoti
ana）、それぞれの培養細胞を用いて実施例２と同一の
方法で培養を行つた結果を表３に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の高密度による組織培養を行うに当たつ
て用いられる培養装置の一例を示した図である。 １……培地導入管 ２……培地導入口 ３……培養液のみを排出させるフイルターを装着した開
口部 ４……培養液排出管 ５……酸素含有ガス通気管 ６……撹拌羽根 ７……培養混合物（組織培養物＋培養液）排出管 ８……加圧流体送入口 a,b,c,d,e……バルブ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液体培地を用いて植物を組織培養するに当
   たって、培養中の培養槽における組織培養物の濃度が組
   織培養物の新鮮重量で表して100〜500〔g/〕の範囲に
   あるように、少なくともある期間、培地の栄養基質濃度
   を所定の濃度に調整した液体培地を培養槽に連続的また
   は非連続的に供給する一方、培養槽の他方より、全排出
   物中の組織培養物の平均濃度が槽内の組織培養物の濃度
   より低くなるように、 １）少なくともある時期、培養液のみを連続的又は非連
   続的に抜き出し、かつ ２）少なくともある期間、培養混合物（培養液＋組織培
   養物）を培養槽の排出口より連続的または非連続的に抜
   き出すことにより、培養槽中の培養液を更新しながら連
   続的に培養を行うことを特徴とする植物の組織培養方法
2. 【請求項２】培養液を更新するに当たって、培養槽中に
   ある培養液の量をＶ〔〕、培養槽に供給する液体培地
   の量をＦ〔/day〕として、F/V〔day^-1〕で定義される
   培地更新率と組織培養物の比増殖速度μ〔day^-1〕の関
   係が、μ≦F/V＜20μの範囲にあるようにして植物の組
   織培養を行うことを特徴とする特許請求の範囲第（１）
   項記載の方法。
3. 【請求項３】培養液導入口及び２個以上の培養液排出口
   を備えた通気式培養装置であって、少なくとも１個の培
   養液排出口には組織培養物の排出を妨げるフィルターが
   設けられており、少なくとも１個の培養液排出口には組
   織培養物の排出を妨げるフィルターが設けられていない
   ことを特徴とする培養装置。
4. 【請求項４】設置の排出口に装置外部からの加圧流体送
   入管が連結されていることを特徴とする特許請求の範囲
   第（３）項記載の培養装置。