JPH074240B2 - 重合体担体の活性化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、有機リガンドを重合体担体に共有結合させる
方法に関する。より詳細には、本発明は、１又はそれ以
上の第一或いは第二アミノ基、或いはスルフヒドリル基
を含有する有機リガンドを重合体ゲルに共有結合させる
新規な方法に関する。

生物学的に活性な材料を簡便な方法で精製する必要性は
長い間重視されてきている。例えば、酵素を精製する為
の初期の方法は、煩雑であり且つ多くの時間を要するも
のであった。最近になって、酵素その他の生物学的に活
性な材料は、次の様な工程によって精製され得ることが
わかった。すなわち、ここではリガンドと呼ぶ酵素その
他の生物学的に活性な材料を固定化し、次に固定化され
たリガンドをそれの存在する混合物から分離するという
ことを含む工程である。リガンドは、必要に応じ、固定
化された状態で使用し得るし、或いは、適当な化学処理
によってその固定化された担体からはずして固定化され
ていない状態でも用いることができる。リガンドを重合
体担体に共有結合させる方法の発見は、酵素学，免疫
学，そして他の様様な生物学的技術を発展させた。

生物学的リガンドの固定化方法のうち最初のものの１つ
に、ヒドロキシル基を含有する重合体を臭化シアン（CN
Br）などの活性化剤で処理する方法があった。活性化さ
れた重合体は、共有結合によって種々の生物学的リガン
ドを直接結合させるに使用し得たのである。ポラス（po
rath）らは、CNBr法を含むいくつかの化学的活性化方法
について記している（ポラス他、イモービライズド・エ
ンザイムズ（Immobilized Enzymes）メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）モスバッ
チ（Mosbach）編，第44巻、19-45頁，アカデミック・プ
レス（Academic Press）、（1976））。ヒドロキシル基
を含有する重合体の活性方法の初期のものの殆どは、不
利な点が生じ易い為に実際的には広く普及しなかった。
とりわけCNBrによる活性化工程には次のような欠点がつ
きものである。すなわち、（１）CNBrで活性化されたヒ
ドロキシル基含有重合体と活性化された重合体と反応す
るリガンドのアミノ基との間に生ずる結合は化学的に不
安定であること、（２）活性化された重合体とリガンド
との反応は、しばしば電荷を導入し、そのことが親和吸
収における反応産物の利用を妨げること、（３）CNBrは
有毒で、▲さい▼涙性を有する有毒な化学物質であるの
で、取扱いの際に特別な配慮を必要とすること、であ
る、。

リガンドをヒドロキシル含有重合体に結合させる為の方
法として、CNBr法以外を捜す努力がされた結果、三塩化
トリアジン、N-ヒドロキシサクミド、1,1′−カルボニ
ルジイミダゾール、及びエポキシ化合物を含む幾つかの
反応物を使用する方法が案出された。エポキシ化合物の
使用については、アクセン（Axen）他Acta Chem.Scand
B29:471-474（1975）に記載されている。エピクロロヒ
ドリン、或いは、1,4−ビス（2,3−エポキシプロポキ
シ）ブタンは、アガロースゲルのヒドロキシル基と反応
して、エポキシドゲルを生成する。このエポキシドゲル
は、チオ硫酸ナトリウムと反応し、チオ硫酸エステルを
生じ、更にそれは、ジチオトレイトールにより還元さ
れ、チオール基を含有する修飾されたアガロースゲルを
生成する。チオールゲルとしばしば呼ばれているこのゲ
ルは、2,2′−ジピリジスルフィドによって、２−ピリ
ジルスルフィドゲルに変換される。そしてこのジスルフ
ィドゲルのカラムにウレアーゼの溶液を通すと、蛋白含
有量が高く、高い触媒作用を有する酵素の結合物が得ら
れる。この方法の一つの欠点は、エポキシ置換重合体が
充分安定でない為に保存がしにくいということである。

更に最近になると、種々の有機スルホン酸塩が、固定化
親和リガンドを調製する上で広く使用され得ることがわ
かった。例えば、ニルソン（Nilsson）他、Eur.J.Bioch
em.,112:397-402（1980）には、p-トルエンスルホニル
クロリドによる幾つかの生物由来分子のアガロースゲル
への結合について記されている。使用された生物由来分
子は、核酸及び酵素を含むものである。

その他の有機ハロゲン化スルホニルの使用や、他のヒド
ロキシル基を持つ支持体の使用については、ニルソン
（Nilsson）他、Biochem.Biophys.Res.Comm.,102:449-4
57（1981）に記載されている。最も活性の高いハロゲン
化スルホニルは、2,2,2-トリフルオロエタンスルホニル
クロリド（トレシルクロリド）であると思われる。この
文献で言及されている他のヒドロキシル基を持つ支持体
は、セルロース、ジオール‐シリカ、グルコファーゼ‐
グラス、及びヒドロキシエチルメタクリレートである。

モスバッチらによる米国特許第4,415,665号は、重合体
物質の反応性に富むスルホン酸塩誘導体を作成し、次に
こうして活性化された重合体物質を生物学的に活性な有
機物質と直接反応させることによって、アミノ、チオー
ル、或いは、芳香ヒドロキシル基を直接、少なくとも一
つのヒドロキシル基を含有する重合体物質に共有結合さ
せる方法を教示している。ハロゲン化スルホニルの使用
は、多くの面で利点を有するものであることは証明され
ているが、更に活性の高い有機ハロゲン化スルホニルを
得ることはコストの面で難しく、又、トレシルクロリド
は、液体である為、取り扱いが簡便ではない。

連続的チオール‐ジスルフィド交換反応を用いた酵素の
精製については、カールソン（Carlsson）他、Acta Che
m.Scand.,B30:180-182（1976）に記載されて居り、そこ
では、アガロース‐2-ピリジルジスルフィドにウレアー
ゼが共有結合されている。この方法は、共有クロマトグ
ラフによるウレアーゼの精製には効果的ではあるが、ア
ガロース‐2-ピリジルスルフィドを取得するのには、不
安定なエポキシド誘導体を利用する工程を組合せなけれ
ばならない。

ムカイヤマらは、種々の２−ピリジル硫化物を取得する
為の反応物として、2-メチル‐2-アルコキシピリジニウ
ム塩の使用を開示している（Chem.Lett.,1159-1162（19
75））。

ホージョーらは、アルコールを1-メチル‐2-フルオロピ
リジニウム塩及びN,N-ジメチルチオカルバミン酸ナトリ
ウムと反応させた後、還元的クリーブによって、種々の
アルコールのそれらに対応するチオールアルコールへの
変換を示すことに成功した。炭水化物やステロイドを含
め、これらの著者によって例示されているアルコール
は、低分子量の単量体のアルコールである（Chem.Let
t.,437-440（1977））。

2-フルオロ‐1-メチルピリジニウムトルエン‐4-スルホ
ネート（FMP）との反応によって活性化された、ヒドロ
キシル含有重合体を利用する重合体を利用する共有クロ
マトグラフのマトリックスを作製する為の便利な方法
が、今や得られた。活性化されたヒドロキシル含有重合
体は、アミノ及びスルフヒドリル基を含有する様々なリ
ガンドとの共有結合を形成するのに用いられ得る。しか
しながら、共有結合されたリガンドは、重合体マトリッ
クスから除去するのが難しい。したがって、リガンドを
望ましい時にいつでも除去可能な様に重合体へ結合させ
ることが望ましい。この方法は、活性化された重合体の
チオールゲルへの変換、すなわち、スルフヒドリル基含
有重合体への変換を含むものである。このチオールゲル
を2,2′‐ジピリジルジスルフィドと反応させ、重合体
の2-ピリジルジスルフィド誘導体を生成し得る。スルフ
ヒドリル基含有リガンドのチオール‐ジスルフィド交換
によって、リガンドは、ジスルフィド結合により重合体
に結合する。ジチオトレイトールのようなチオールでジ
スルフィド結合を還元することにより、リガンドは、い
つでも必要な時に除去されるようになる。

チオールゲルを得る方法として、二つの異なったルート
が可能である。その一つは、ジメチルジチオカルバミン
酸ナトリウムを用いて、活性化重合体をその対応するジ
メチルジチオカルバミル誘導体に変換し、これを還元的
クリーブ（cleave）によって任意のスルフヒドリル置換
重合体（DSゲルと以下呼ぶ）に変換するというルートで
ある。

チオールゲルを得るもう一方のルートは、FMP活性化重
合体をジチオトレイトールで処理して、以下DTTゲルと
して言及するところのチオールゲル，ジチオトレイチル
ゲルを生成する過程を含むものであり、フリーなスルフ
ヒドリル基は、重合体へのチオエーテル結合から４個の
炭素原子で隔っている。

共有クロマトグラフのマトリックスに特にどういった場
合に応用するかによって、DS-ゲルか又はDTTゲルが、理
想的に特定のクロマトグラフの各手順に適したものに使
い分けられ得る。例えば、DTTゲルは、リガンドが大き
な原子団を含んで居り、介在する炭素の４原子鎖によっ
て重合体表面とジスルフィド結合との間にスペースが存
在しなければ、重合体に充分近づいてジスルフィド結合
を攻撃することが容易でない場合に特に適用され得る。

重合体担体は、水溶性でも水不溶性の重合体物質でもよ
く、本発明の方法を遂行する上では担体の選択は決定的
なものではない。重合体としての性質を有し、炭素原子
に結合している、活性化や結合を可能にする少なくとも
一つのヒドロキシル基を含有するものであれば、原則と
してどのタイプの担体でも使用し得る。担体は、個々の
状況に於ける必要に応じ、先ず第一に、結合させるリガ
ンドのタイプ、そして結合産物の用途に応じて選択され
る。担体は、ヒドロキシル基を含有した、天然、半合
成、或いは合成によるものであっても良い。重要な担体
材料は、多糖類及び多糖類を含有する材料であり、例え
ば、セルロース，アガロース，デキストラン及びその架
橋結合物である。合成担体としては、ポリエチレングリ
コール，ポリビニルアルコール，ポリヒドロキシエチル
メチルアクリレート等が例示される。当然のことなが
ら、通常ヒドロキシル基を含有しない担体を使用するこ
とも可能であるが、その場合は、適切な処理をすること
によってそうした基を付与することができる。その一つ
の例がシリカ粒子であり、その表面に炭素原子に結合し
ている少なくとも一つのヒドロキシル基を含有する原子
団が結合されている。

ヒドロキシル含有重合体担体の活性化は、アセトニトリ
ル，アセトン，或いは、テトラヒドロフランの様な極性
の乾燥有機溶媒中において、トリエチルアミンやトリブ
チルアミンなどの第三アミンがわずかに過剰に存在する
状態で行なわれる。FMPは、通常約１〜15分の速さで、
周囲の温度（約22-35℃）及び圧力で、種種の重合体材
料と反応し、2-アルコキシ‐1-メチルピリジニウム塩を
生成し、それが、アフィニティリガンドとして適切な様
々な求核物質のアミノ或いはスルフヒドリル基と直ぐに
反応する。2-クロロ‐1-メチルピリジニウム塩の様な2-
ハロ‐1-メチルピリジニウム塩も使用され得るが、その
大きな反応性から、2-フルオロ‐1-メチルピリジニウム
塩のほうが、より望ましい。

FMPのような活性化剤の反応しなかったものは、希塩酸
（例えば2mM-HCl）の様な希酸で容易に重合体担体より
洗い去ることができ、それによって、活性化ヒドロキシ
ル基に加水分解を起こさせることなく活性化重合体を精
製し、安定化させる。

FMP活性化重合体担体は、2mM HClに４℃で保存すると少
なくとも４ケ月は安定である。活性化した重合体担体
は、薄い無機酸、例えば、2mMリン酸中でも、或いは、
必要ならば乾燥させた形態でも保存が可能である。通
常、1mlのゲルに対し４〜７マイクロモルという活性密
度が得られる。

本発明の生成物を利用する結合（coupling）方法は、上
記したアミノ或いはスルフヒドリル基を含有する有機リ
ガンドに全般的に応用され得る。例えば、第一アミノ，
第二アミノ或いは、スルフヒドリル基は活性化されたヒ
ドロキシル含有重合体への結合に用いられ得る。同様に
そのNa塩の様なスルフヒドリル基を含有する化合物の塩
もこの目的の為に有用である。一般に結合の為に選択さ
れる生成物は、結合反応を円滑に行える様に、良好な求
核物質であるべきである。重合体から、1-メチル‐2-ピ
リドキシ基を置換し得る基ならいかなるものも充分リガ
ンドとして使用され得る。そこで、結果的にリガンド
が、結合に使用され得る官能基を有するのであればリガ
ンドは、あらゆる脂肪族，芳香族，複素環，ヘテロ芳香
族ラジカル又は、それらの組合わせより成るあわゆるラ
ジカルを含んで良い。特に興味深いものは、生物学的に
活性なリガンドであり、例えば、酵素等の蛋白質、抗体
及び抗原、アミノ酸、チオール化合物、コファクタ、ヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、ハプテン及びその他の
多くの生物学的に活性なリガンドであり、特に、例え
ば、アフィニティークロマトグラフィーに使用され得
る、他の物質に生物学的に特異的な親和性を有するもの
が挙げられる。

反応の図式は、第１図に示されている。図中、 というシンボルは、少なくとも一つの‐CH₂-OH基を有す
る重合体担体を表し、TsO^-は、トルエン‐4-スルホネー
トイオンを表し、TEAは、トリエチルアミンを、L-NH
₂は、アミノ基含有リガンドを、L-SHは、スルフヒドリ
ル基含有リガンドを、夫々示す。

結合は、様々な温度及びpHに於いて行ない得、極性有機
溶媒中だけでなく、水性の反応媒体中でも可能である。
反応条件は、活性化の段階でも結合の段階でも決定的な
ものではなく、先ず、反応体の感受性及び実際上の便宜
によって選択される。穏やかな反応条件が望ましい。例
えば、常温及び常圧下で行うのが適切で、水性の反応媒
体の場合、pHは中性付近、例えば、pH8〜９である。担
体のヒドロキシル基への結合の度合は、化学量論上の調
節で実質的にすべての使用し得るヒドロキシル基を使用
する必要があるか、そのどの程度の部分を必要とするか
によって様様である。70〜80％の結合効率が、通常実現
される。

結合反応の後に残った未反応の活性化原子団は、結合の
終った重合体の利用を妨げる可能性があるので、結合の
終った重合体をpH9,0.2Mトリス‐HClに室温で、２時
間、懸濁して除去することができる。エタノールアミン
やメルカプトエタノールの様な他の求核物質もまた、こ
の目的に使用され得る。

チオールゲルの使用を含む本発明の方法を含む望ましい
結合方法については、第４図を参照して詳細に述べられ
る。第４図中には、本発明の方法及びその反応生成物を
利用する全体の関連反応に於ける様々なステップが示さ
れている。

示されている過程の最初の工程は本発明の方法である。
この方法は少なくとも一つの反応性ヒドロキシ基を有す
るヒドロキシル含有重合体（式１）の2-フルオロ‐1-メ
チルピリジニウムトルエン‐4-スルホネート（式２）と
の反応であり、既に上に記した。結果として得られる2-
アルコキシ‐1-メチルピリジニウム塩（式３）は時おり
活性化重合体、或いは、活性化ゲルと称される。1-メチ
ル2-ピリドキシ基は、リガンドによる求核的置換の際に
直ぐに1-メチル‐2-ピリドン（式４）に変換される優良
な離れ易い原子団である為、活性化重合体は直ぐに求核
物質によって攻撃される。

チオールゲルの製造に導く一連の反応では、スルフヒド
リル基が直接重合体の炭素原子に結合しているのである
が、求核的置換によって活性化重合体と反応し、重合体
のジメチルジチオカルバミル誘導体（式６）を生成する
のにジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム（式５）が
用いられる。活性化ゲルのジメチルジチオカルバミン酸
との反応は、N,N-ジメチルフォルムアミド（DMF）等の
有機溶媒中で起きる。使用し得る他の溶媒は、アセトニ
トリル，アセトン，及びテトラヒドロフランを含むもの
である。その反応は、周囲の温度及び圧力下で12〜20時
間行なわれる。

ゲルのジメチルジチオカルバミル誘導体の還元の結果、
ゲルと炭素原子に直接結合しているスルフヒドリル基を
有するチオールゲル（式７）を生成する。還元は、水素
化ホウ素ナトリウム，リチウムアルミニウムヒドリド或
いは、ジチオナイトナトリウム等の標準の還元剤を用い
て、容易に為され得る。反応は、周囲の温度及び圧力
（常温、常圧）下、６から12時間の間に行なわれる。結
果として得られるDS-ゲルは、乾燥ゲル１グラム当り５
〜15マイクロモルのスルフヒドリル基含有を有する。

チオールゲルを生成するもう一つのルートは、活性化ゲ
ル（式３）のジチオトレイトール（式８）との反応を含
み、これによりDTT-ゲル（式９）を生成する。チオール
ゲルは重合体へのチオエーテル結合から４炭素原子鎖に
よって隔てられているスルフヒドリル基を有する。活性
化ゲルとジチオトレイトールとは、重炭酸ナトリウムの
様な塩基或いは、トリエチルアミンやトリブチルアミン
などの第三アミンの存在下で混合することにより容易に
反応する。この反応は、周囲の温度及び圧力で、４〜８
時間で完了する。

結果として得られるDTT-ゲルは、DS-ゲルと同様、共有
クロマトグラフのマトリックスとして使用され得る。し
かしながら、この使用に進む前に、未反応の1-メチルピ
リドキシ活性原子団をDS-ゲル或いはDTT-ゲルから除去
し、共有クロマトグラフの主体であるリガンドとの望ま
しい反応の進行が得られる様にコントロールすることが
重要である。未反応の活性原子団の除去は、トリス‐HC
l、例えば、0.2Mトリス‐HCl（pH9）、エタノールアミ
ン、メルカプトエタノール等の反応性リガンド、或い
は、チオールゲルのスルフヒドリル基とは反応しない他
の適当な反応性リガンドを用いることにより容易に達成
される。

チオールゲルは、所望のリガンドをゲルに結合する役割
を果たすチオール‐ジスルフィド交換反応を行う為に活
性化される。活性化は、チオールゲルを2,2′ピリジル
ジスルフィド（式10）と反応させることにより最も容易
に達成される。反応は、周囲の温度及び圧力の条件で進
行し、１〜３時間で完了する。

活性化されたDS-ゲル（第11式）又は、活性化されたDTT
-ゲル（第12式）は、任意のリガンド（第１図では、フ
リーなスルフヒドリル基を有する酵素として示されてい
るが）と反応し、ゲルと酵素との間にジスルフィド結合
を形成する。DS-ゲルの場合は、ジスルフィド結合が酵
素をゲルの炭素原子に直接結合させている（第14式）
が、一方、DTT-ゲルの場合、酵素は、イオウ原子によっ
てゲルの炭素原子に結合している４炭素原子鎖に、ジス
ルフィド結合している（式15）。いずれの場合でも、2-
チオピリドン（式16）が、活性化されたチオールゲルか
ら置換されている。第14及び15式は、固定化された酵素
を示す。上記の方法に従って、他の多くのリガンドが、
同様に固定化され得ることは、評価されるべきである。
リガンドの活性化チオールゲルとの反応は、周囲の温度
及び圧力の条件下、適当に精製され緩衝液で調整された
リガンドを用いて、容易に行なわれる。反応は2-6時間
で完了する。

固定化された酵素は、システイン，ジチオトレイトー
ル，或いはメルカプトエタノール等の還元剤（式17）で
処理することにより、酵素（式13）を離脱する。周囲の
温度及び圧力の条件によって酵素は容易に離脱する。

実施例１ 2-フルオロ‐1-メチルピリジニウムトルエン‐4-スルホ
ネート（FMP）による架橋結合アガロースの活性化 セファローズ（Sepharose）CL-4Bを、ゲルの容積の20倍
の蒸留水、容積比25:75,50:50,75:25のアセトンと水の
混合物、及び100％アセトン、最後に、ゲルの容積の10
倍のドライアセトンで、順に継続して洗浄した。50g量
の洗浄されたゲルを、1mlのトリエチルアミンの混合し
たドライアセトニトリル50mlに懸濁し、室温で、激しく
撹拌した。ゲル懸濁液に、40mlのドライアセトニトリル
及び1.5mlのドライトリエチルアミンに3gとFMPを溶解さ
せた溶液を5mlに分けて加えた。10分後、ゲルを、ゲル
の10倍容積のアセトンと2mM HClとの混合物を、容積比
で、75:25,50:50,25:75、そして希釈しない2mM HClを用
いて順次洗浄した。

参考例１ N,ε‐2,4-ジニトロフェニル‐L-リシンの活性化ゲルへ
の結合 100mg量のN,ε‐2,4-ジニトロフェニル‐L-リシンを0.2
M NaHCO₃30mlに溶解した。この溶液に実施例１の方法に
従って得たFMP-活性化ゲル5gを加えた。その結果得られ
た懸濁液を室温で15時間、振盪した。次にゲルを懸濁液
から除去し、500mlの0.2M NaHCO₃で洗浄し、100mlの0.1
Mトリス‐HCl、pH8に再び懸濁し、室温で２時間、振盪
した。ゲルを500mlの1M NaCl及び0.15M NaClを含むpH7.
5と0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（PBS）で洗浄した。

参考例２ トブラマイシンの活性化ゲルへの結合 実施例１によって得た、2mMリン酸溶液中で保存したFMP
-活性化ゲルをリン酸から除去し、その20ml量を0.2ミリ
モルのトブラマイシンを含む10mlの0.5M NaHCO₃に加え
た。

ゲル懸濁液を室温で24時間、ゆるやかに振盪した後、50
0mlのリン酸緩衝液食塩水（PBS）で洗浄した。洗浄され
たゲルを15分間、0.1M Tris中に懸濁し、未反応の活性
化ヒドロキシル基を不活性化した。次にゲルをPBS500m
l、1M NaCl含有PBS1000ml、そして最後にPBS500mlで洗
浄した。

重合体担体のヒドロキシル基の活性の度合を測定する為
に1mlのゲルにつき、マイクロモル単位で、活性化の密
度を測定した。1-メチル‐2-ピリドンは、求核物質との
結合の際に活性化ゲルから離脱するので、結合反応が行
なわれている溶液の297nmに於ける吸収（吸光度）によ
って活性化の密度を量的に測定することが可能である。
この波長では、0.2M Tris・HCl、pH9中で、1-メチル‐2
-ピリドンは、5900のモル吸光を有する。活性の密度
は、1mlの活性化ゲルを2mlの0.2M Tris HCl、pH9に懸濁
し、10時間室温で、ゆるやかに振盪することによって測
定され得る。結果として得られるゲル懸濁液の遠心の際
に297nmでの上清の吸収を測定し、既知濃度の1-メチル
‐2-ピリドンの溶液の吸収と比較する。ここに記述した
活性化方法を用い、活性密度40-70micromoles/mlのセフ
ァローズCL-4Bの活性化ゲルが得られた。

本発明の生成物を利用して得られる結合産物は、親和精
製、共有クロマトグラフィー、及び共有結合による生体
分子の可逆的及び不可逆的固定化など、生物学的に活性
な材料等のリガンドを重合体担体に付着させて固定化す
ることが望まれ場合に、様々な応用が可能である。以下
の参考例で、アフィニティークロマトグラフィーに於け
る結合産物の使用について例示する。

参考例３ アフィニティーマトリックスとしてN,ε‐2,4-ジニトロ
フェニル‐L-リシン結合セファローズCL-4Bを用いた、
2,4-ジニトロフェニルウシ血清アルブミンに対するウサ
ギ抗血清の精製 2ml量のウサギ抗‐DNP血清を遠心に対し、小片を除去し
た。その上清を参考例１に従って作製した0.5×20cmカ
ラムのN,ε‐2,4-ジニトロフェニル‐L-リシン結合セフ
ァローズCL-4Bに流した。抗血清を流した後、カラムを
流出物の280nmの吸光度が0.02未満になる迄PBSで充分に
洗浄した。そして、容積で10％のテトラヒドロフランを
含む0.1Mのクリシン‐HCl（pH2.5）を流出液として用い
た。抗体は、グリシン‐HCl緩衝液を流した後３番目の5
ml画分に現れた。この実験の結果を第２図に示す。

参考例４ アフィニティーマトリックスにトブラマイシン結合セフ
ァローズCL-4Bを用いた、ウサギ抗トブラマイシン血清
の親和精製 1ml量のウサギ抗トブラマイシン血清をPBSで10倍に希釈
した。希釈した抗血清を2000rpmで30分間、遠心に付
し、小片を除いた。上清全体を参考例２に記した様に調
製したトブラマイシン結合Sepharose CL-4Bの0.5×20cm
カラムに流した。流出物の280nmでの吸光度が、0.02未
満になる迄、カラムをPBSで洗浄した。抗体を10％テト
ラヒドロフラン含有0.1Mグリシン‐HCl、pH2.5と共に7m
l画分に流出させた。結果を第３図に示す。

上記参考例３及び４に示される通り、本発明の生成物を
利用して得られるリガンド結合重合体担体は、リガンド
結合重合体との間に親和結合（affinity bond）を形成
し得る様々な材料を精製する為の親和吸収材として有用
である。例えば、リガンド結合重合体は、抗体の精製に
使用し得、その場合、アフィニティーマトリックスに吸
収された抗体をマトリックスから、リガンドを漏らすこ
となく流出させることが可能である。リガンド結合マト
リックスはまた、保存中に於けるその安定性でも特徴づ
けられる。例えば、N,ε‐2,4-ジニトロフェニル‐L-リ
ジン結合セファローズCL-4Bは、リン酸緩衝液食塩水
中、４℃で、リガンド結合マトリックスからのリガンド
の漏出なくして、保存される。

上述した様に、本発明の生成物を利用する結合方法の重
要な利点は、結合した物質、すなわち、リガンドが重合
体担体の炭素原子に直接共有結合し、加水分解による分
裂を不可能にする点である。更には、先行技術の結合方
法の幾つかに於いてそうである様に、結合反応の間に付
加的な電荷が導入されることはない。担体材料の交差結
合は、従来可能な結合方法に於いてよくある、また、望
ましくない副作用であるが、本発明の生成物を利用する
結合方法によれば、それを避けることができる。

参考例５ チオールゲルの作製 ジメチルジチオカルバメート法（DS-ゲル） 実施例１の乾燥活性化ゲル1gのサンプルを100mlの乾燥
N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）で洗浄し、1.8gジメ
チルジチオカルバミン酸ナトリウム含有DMF100mlに加え
た。そのゲル懸濁液を室温で16時間、振盪した。そして
100mlのドライDMFで洗浄し、50mlの乾燥DMFに再び懸濁
した。懸濁液に、水素化ホウ素ナトリウムを加えた。懸
濁液を室温で、更に４時間、振盪し、200mlDMF、1000ml
2mM HCl、500ml0.5N NaCl、及び500ml2mM HClで、ゲル
を洗浄した。チオールゲルのスルフヒドリル含量を、ジ
ー・エル・エルマン（G.L.Ellman）,Arch.Biochem.Biop
hys,82:70-77（1959）に記載の通り、5,5′‐ジチオビ
ス（2-ニトロ安息香酸）によって測定した結果、乾燥ゲ
ル1gに対し、９マイクロモルであった。

参考例６ チオールゲルの作製 ジチオレイトール法（DTT-ゲル） 実施例１の乾燥活性化ゲル1gを0.2M NaHCO₃に1Mジチオ
トレイトール（DTT）を溶解し、撹拌した溶液に加え
た。この懸濁液を室温で５時間、振盪した。次にゲルを
500ml0.5M NaHCO₃、500ml蒸留水、及び1000ml2mM HCl
で、洗浄した。スルフヒドリル含量は、1gの乾燥ゲルに
つき、６マイクロモルであった。

参考例７ 活性化チオールゲルの作製 実施例６のDS-ゲル又は参考例６のDTT-ゲルをエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）中の60％アセトン‐40％0.05M
NaHCO₃1mMで洗浄した。洗浄されたゲルは、0.3M2,2′‐
ジピリジルスルフィドと反応させた。

参考例８ ウレアーゼの共有クロマトグラフィーによる精製 1g量の部分精製したタチナタマメウレアーゼを、1mM ED
TA及び5mMジチオトレイトール（DTT）を含む40ml0.1Mト
リス‐HCl、pH7.4に加えた。結果として得られる懸濁液
を４℃で１時間、撹拌し、遠心分離で小片を含む画分を
除去した。5mlの曇った上清を0.5mM EDTAを含む0.05M T
ris-HCl、pH7.4で平衡化したセファーデックス（Sephad
ex）G-50C1×50cmカラムに通した。こうした処理によっ
て存在する全てのジチオトレイトールが除去され、次の
共有クロマトグラフィーの段階での邪魔を防ぐことがで
きる。

DTTを除いた5mlの流出物を参考例７の活性化DS-ゲルの
0.5×20cmカラムに流した。次にカラムを流出物の280nm
での吸光度が0.1未満になる迄、0.5mM EDTAを含む0.05M
トリス‐HCl、pH7.4で洗い、そして、0.05mM EDTA及び
0.05M NaClを含む0.05Mトリス‐HCl、pH7.4で、吸収が
0.02未満になる迄洗浄した。酵素ウレアーゼは、0.05mM
EDTA及び20mMジチオトレイトール（DTT）を含有する0.
05mMトリス‐HClによってカラムから流出した。ウレア
ーゼ活性は、グルタミックデヒドロゲナーゼ連結反応に
より、NADHの340nm吸収の消失率を測定して分析され
た。使用した基質の溶液は、0.05Mトリス‐HCl、pH7.4;
0.5mM EDTA:1mM ADP;1mMアルファ‐ケトグルタレート:5
0mM尿素及び50Uグルタミックデヒドロゲナーゼを含有し
ていた。アッセイは、2mlの基質溶液に５〜10マイクロ
リットルの酵素容積を加えることにより開始される。ウ
レアーゼのカラムへの固定化及びカラムからの流出の結
果を第５図に示す。第５図の実線から、UV吸収物質のほ
とんどが、遅滞無くカラムを通過することがわかる。こ
れらの物質は、最初の11画分に流出していた。高濃度の
NaClを含有する緩衝液を流すと、第15〜20画分に少量の
UV吸収物質が更に流出した。破線は、ウレアーゼ活性を
示し、DTTがカラムに流される迄、ウレアーゼ活性は検
出されなかったことを示す。曲線に示される通り、DTT
が流された後、（第24画分から開始）第29-33画分に強
いUV吸収物質が流出していた。DTTを加えると酵素だけ
でなく、2-チオピリドンを離脱し、それも280nmで強い
吸収を示す。UV吸収物質のほとんど（90％近く）は2-チ
オピリドンで構成されているということは、これらの画
分を0.05Mトリス‐HCl中の0.05mM EDTA2000mlに対して
透析を行ない、それらのUV吸収に於いて、34倍の縮少と
なったことから確実とされた。ウレアーゼ活性は、UV吸
収の増加と同時に増加した。酵素溶液を単独で、活性化
チオールゲルに通した結果、酵素全体の83％が、11倍の
精製率で回収された。精製された酵素は、770単位/mgの
特異的活性を有することがわかった。参考例７の活性化
DTT-ゲルを用いても類似の結果が得られる。

次の参考例では、本発明の生成物を利用して製造した活
性化チオールゲルにジスルフィドブリッヂで結合した共
有結合による生物学的活性物質の可逆的な固定化につい
て例示する。生物学的物質を使用に便利な形態で提供す
る目的であれば、そうした物質の固定化については、そ
の生物学的活性物質の活性に本質的に関わらないスルフ
ヒドリル基を利用してジスルフィド結合を形成すべきで
あることを指摘しなければならない。

参考例９ ベータガラクトシダーゼの可逆的固定化 大腸菌（E.Coli）ベータ‐ガラクトシダーゼ5mgを10ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.4に
溶解させた。その酵素溶液に参考例７の方法に従って作
製した水分を含む活性化DTT-ゲル2.5gを加えた。得られ
た懸濁液を室温で撹拌した。ある間隔をおいて、0.1ml
のゲル懸濁液を取り出して、2500rpmで１分間、遠心分
離に付した。その上清をリン酸緩衝液で50倍に希釈し、
0.25mlの希釈上清について、2mlo-ニトロフェニル‐ベ
ータ‐D-ガラムトピラノシド溶液中、ベータ‐ガラクト
シダーゼのアッセイを行った。室温で４時間インキュベ
ートした後、充分な活性を有するベータ‐ガラクトシダ
ーゼの固定化が全て実現した。その時、0.05Mリン酸
塩、pH7.7中の20mM DTTを固定化された酵素と混合して
サンプルを取り出し、ベータ‐ガラクトシダーゼについ
てアッセイを行なった。第６図に示される通り、ベータ
‐ガラクトシダーゼ活性は、反応８時間で酵素が全て回
収される迄増大した。

本発明に関する上の記述は、説明及び例示を目的として
特に望ましい具体化の記述に向けられたものである。し
かしこの技術の分野に精通する者ならば、本発明の範囲
及び主旨から逸脱することなく、方法や材料について多
くの改良、改変が試され得ることは、明らかであろう。
例えば、他のヒドロキシル含有重合体担体及び他にリガ
ンドが使用されるかもしれない。ここに記された特定の
アフィニティーシステムは、便宜上選択されたものであ
り、限定を意図したものではない。出願人は、特許請求
の範囲が、そういったすべての均等な改良物やバリエー
ションをカバーするものであり、それらは、本発明の真
の範囲及び主旨に含まれることを意図している。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による活性化重合体の製造方法の概略模
式図である。 第２図は、アフィニティーマトリックスとして2,4-DNP-
リシン結合セファローズCL-4Bを用いた2,4-ジニトロフ
ェニルウシ血清アルブミンに対するウサギ抗血清のアフ
ィニティー精製を示す流出曲線である。 第３図は、トブラマイシン結合セファローズCL-4Bをア
フィニティーマトリックスとして用いたウサギ抗トブラ
マイシン血清のアフィニティー精製を出す流出曲線であ
る。 第４図は、本発明の生成物を利用するチオールゲルの種
々の製造ルートを示す概略模式図である。 第５図は共有クロマトグラフィーによるタチナタマメウ
レアーゼの精製中に生じた流出物の色々な画分の吸収を
示す流出曲線である。 第６図は、大腸菌ベータ‐ガラクトシダーゼの2,2′‐
ジチオジピリジル活性化チオール（DTT）ゲルへの固定
化の進行及び、ジチオトレイトール付加による逆反応の
反応曲線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも１つのヒドロキシル基を含有す
   る重合体物質を２−フルオロ−１−メチルピリジニウム
   トルエン−４−スルホネートと反応させ、上記重合体の
   ヒドロキシル基の少なくとも１つが１−メチル−２−ピ
   リドキシ基に転化されている重合体産物を回収すること
   より成る、少なくとも１つのヒドロキシル基を含有する
   重合体物質のヒドロキシル基を活性化する方法。