JPH02299599A - 診断キット、プライマー組成物および核酸の複製または検出のためのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、プライマー組成物および診断試験キットな
らびに試験検体における標的核酸の複製または検出への
それらの使用に関する。この発明は、各種の医療および
調査研究、法医学上の捜査ならびに遺伝子疾患または感
染症の検出のような診断法において使用することができ
る。

〔従来の技術〕

研究者が試験試料中に極めて少量存在する各種の疾患、
生物体または遺伝子の特徴を検出するについて核酸プロ
ーブ法の価値を見い出したように、その方法は近年急速
に発展してきた。プローブの使用は相補性の概念に基礎
を置いている。例えば、ＤＮＡは二本鎖であＤ、これら
の鎖は相補的ヌクレオチド（また、ヌクレオチド対とし
ても知られている）間の水素結合によって相互に結合し
ている。

ＤＮＡ複合体は、一般に安定であるが、水素結合が崩壊
する条件によって分離（または変性）することができる
。遊離した一重鎖はヌクレオチドの相補的配列を有する
別の鎖とのみ再会合しうる。

このハイブリッド化の進行は溶液中または固体支持体上
で起こりうる。ＲＮＡは通常一本領である。

これもまた、相補的なヌクレオチド配列を有する他の鎮
またはその一部とハイブリッド化しろる。

標的生物体または細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの標的核酸
配列は、鎮全体のほんの小さな部分をなすにすぎないの
で、殆どの既知標識プローブを使用してその存在を検出
することは非常に困難である。この課題を解決するため
にプローブの感度の改良や核酸合成を包含する多くの研
究が行われてきた。

当該技術分野の重要な進歩は、米国特許第４、６８３．
２０２号明細書に記載される方法である。この方法に関
してそれ程詳細ではないが、それはプライマーが重合試
薬（例えば、ポリメラーゼ）および４種のヌクレオシド
三リン酸の存在下で核酸鋳型にハイブリッド化され、次
いでエクステンション生成物がそれらのプライマーから
形成される増幅技法である。これらの生成物は変性され
そして存在する核酸の数と量を増幅する循環反応におけ
る鋳型として使用され、それに続くそれらの検出を助け
る。マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）の増幅方法は、少量の標的
核酸配列から多量の検出可能な物質を生成するのに必要
なだけ何度も繰り返えされうる。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許第４．６８３．２０２号の方法では、増幅され
る標的核酸の各鎮について２種のプライマーが使用され
ている。増幅に関する最良のケースでは、増幅せしめら
れる核酸配列が、少なくとも標的配列の３′末端近傍で
プライマーと完全に相補的である。従って、効果的な増
幅にとって鎮当たり１種のプライマーが必要とされるに
すぎない。マリスの特許からは、少なくとも３′末端に
おいて標的配列が完全に知られていない場合、完全に相
補的である少なくとも１種のプライマーを有する目的で
可能なすべてのコドンの変種を有するプライマーのコレ
クションを使用できることが知られている。このような
プライマーは、増幅される鎖の末端と１００％の「相同
性」を有するといわれている。

この方法は、ときには目的の増幅工程が達成されるかも
知れないが、別の例では能率的でないかまたは有効でな
いかも知れない。成行き任せのプライマーコレクション
の調製は、不経済でありかつ競合性の無伸長プライマー
類の使用をもたらす。

さらに、標的ヌクレオチド配列の不安定さが大きい場合
には、必要とされるプライマーコレクションは膨大にな
る。

標的配列とプライマーとの間のミスマツチは、特に標的
配列が完全に同定されえない場合には全く避けることが
できない。レトロウィルス由来のプロウィルスＤＮＡの
検出のようなその他の例では、標的核酸は高度に可変性
であＤ、完全な同一性が持続されえない。ＨＩＶ−１で
は、ゲノムにおける配列の多様性が生存可能なウィルス
を作出する。

塩基の置換は、無傷のゲノム上でランダムにそしてそこ
かしこで頻繁に起こることが知られている。

従って、単離物は各種の核酸配列を有するプロウィルス
ＤＮＡをもつであろう。

このようなミスマツチは、プライマーによる増幅効率を
相当低下させるであろう。言い換えれば、ミスマツチは
、プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）の動力学やプライマ
ーエクステンションが変化してしまうので増幅工程の減
退をもたらす。最悪の場合には、標的にプライマーが付
着するのに失敗するので全く増幅が起こらないか、また
はそれが付着する場合でもエクステンション生成物の形
成は阻止（すなわち、「不発」プライマー）されるであ
ろう。

たとえ標的配列とその配列に対する既知のプライマーと
の間でミスマツチの恐れがあろうとも核酸配列を増幅す
るための有効な手段を人手することが望まれるであろう
。

〔課題を解決するだめの手段〕

前述の課題は、所定の標的核酸の増幅または複製に有用
なプライマー組成物の使用によって解決される。この組
成物は、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に少なくとも実
質的に相補的である第一オリゴヌクレオチドプライマー
、ならびに （ｂ）（ｉ）前記第一の特異的核酸配列の一部のみを含
むか、 （ｉｉ）前記第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、
または （ｉｉｉ）　　１以上のヌクレオチド塩基によって前記
第一の特異的核酸配列から離れているが、追加のプライ
マーがその第一の特異的核酸配列に相補的なプライマー
エクステンション生成物を形成しうるかいずれかの標的
核酸の核酸配列に少なくとも実質的に相補的である追加
のオリゴヌクレオチドプライマー少なくとも１種、の水
性混合物を含んでなる。

この発明はまた、（ａ）前記第一プライマー、および（
ｂ）前記のような追加のプライマー少なくとも１種を含
んでなる所定の標的核酸の増幅または複製に有用な診断
試験キットも提供する。

さらにまた、Ａ、複製のための所定の標的核酸を含有す
る被検体を調製する工程、 Ｂ、その調製された被検体を前記プライマー組成物と接
触させてそのプライマーと標的核酸とのハイブリッド化
した生成混合物を形成する工程、ならびに Ｃ９そのハイブリッド化した生成物少なくとも１種の第
一プライマーエクステンション生成物を形（月） 成し、次いでその第一プライマーエクステンション生成
物をプライムしそして伸長する工程、を含んでなる所定
の標的核酸の複製方法を提供する。

さらに、Ａ、標的核酸を含有することが予測される被検
体を前記プライマー組成物と接触させてそのプライマー
と標的核酸のハイブリッド化した生成混合物を形成する
工程、 Ｂ、前記ハイブリッド化した生成物少なくとも１種の第
一プライマーエクステンション生成物を形成し、その第
一プライマーエクステンション生成物をプライムして伸
長し、次いでその第一プライマーエクステンション生成
物を増幅する工程、Ｃ０こうして得られたプライマーエ
クステンション生成物を分離し、次いでそれらを検出可
能なオリゴヌクレオチドプローブと接触させて検出可能
な相補的生成物を形成する工程、ならびにＤ、被検体に
おける標的核酸の存在の指標として前記検出可能な相補
的生成物を測定する工程、を含んでなる所定の標的核酸
の検出方法を提供する。

以下、この発明をより具体的に説明する。

この発明は、試験検体における１種以上の標的核酸中に
存在する１種以上の特異的な核酸配列の複製、増幅また
は検出に向けられる。このような試料としては、細胞ま
たはウィルス体、毛髪、体液または検出されうる遺伝子
ＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する他の物質を挙げること
ができる。検出の主要な目的が事実上診断にあるとはい
え、この発明はクローニングＤＮＡもしくはメツセンジ
ャーＲＮＡの能力の改良または化学合成で得られる核酸
混合物から目的の配列を多量に得る目的にも使用するこ
とができる。

この発明は、含まれる反応工程の数に比例して指数的量
で少なくとも１種の特異的核酸配列を生成するための連
鎖反応と組み合わされた場合に特に有用である。この生
成物は、使用される特異的なプライマーの末端に対応す
る末端を有する個々の二つに相補的に結合した核酸（核
酸ｄｕｐｌｅｘ）であるであろう。精製されているかま
たはされていないどのような核酸源も提供される出発原
料としく１３） て利用することができ、それは検出の目標とされる特異
的核酸配列を含むかま′たは含むことが予測される。必
要によＤ、核酸混合物を使用することができる。複製せ
しめる配列は断片または完全な核酸であることができ乞
。さらに、１種の核酸配列より多くを、特殊な１セツト
のプライマーの使用によって同時に増幅することができ
、そして増幅せしめる各配列についてプローブで標識す
ることができる。これらの配列は、同一または相違する
核酸であってよい。

核酸は、プラスミド、いずれかの起源（例えば、酵母、
ウィルス、植物および高等動物、ヒト）に由来する天然
のＤＮＡまたはＲＮＡを含む各種起源から得ることがで
きる。それは血液、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）　、組
織物質または既知方法を使用する当該技術分野で既知の
他の起源を含む各種組織から抽出されうる。この発明は
、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ウィルスＤＮＡまたは細
菌もしくはウィルス感染細胞に見い出されるＤＮＡもし
くはＲＮＡのようなウィルスまたはすべての生物体網胞
に見い出される核酸配列の検出に有用である。

就中、この発明はＩＩＩＶ−Ｉまたは他のレトロウィル
スによって感染された細胞に由来するウィルスＤＮＡの
検出に有用である。

本明細書で使用される場合、検出されるためのプライマ
ー、プローブまたはオリゴマー断片に関連する「オリゴ
ヌクレオチド」の語は、２個以上好ましくは３個以上の
デオキシリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドから
なる分子をいう。正確なサイズは限定的でないが、その
オリゴヌクレオチドの主な用途または機能を含む多くの
因子に依存する。オリゴヌクレオチドは、合成的または
当該技術分野で既知の他の方法によって得ることができ
る。

「プライマー」の語は、核酸鎖に相補的なプライマーエ
クステンション生成物の合成が誘導される条件下に置か
れた場合に合成の開始点として作用しうる天然または合
成的に生成されるオリゴヌクレオチドをいう。このよう
な条件には、ヌクレオチド（例えば、４種の標準的なデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸）およびＤＮＡポリメ
ラーゼのような重合用試薬、ならびに適当な温度および
ｐＨの存在が包含される。

この発明の組成物は、標的核酸の第一の核酸配列に実質
的に相補的である第一オリゴヌクレオチドプライマーを
有する。「実質的に相補的」とけ、プライマーが標的核
酸の第一の核酸配列とハイブリッドする核酸配列中の対
応する塩基とマツチするのに十分な数の塩基がプライマ
ー上に存在することを意味する。しかしながら、すべて
の塩基対がマツチしうることを意味しない。事実上、こ
の発明は、プライマーエクステンションを起こしうろこ
とが望まれる前記第一プライマーの特に、３′末端また
はその近傍において１以上のミスマツチが存在する場合
に生ずる課題を解決することが意図されている。この発
明はまた、全くミスマツチが存在しない場合にも十分に
適用できることが理解されている。このようなミスマツ
チがどこで起こりうるかは必ずしも予測できない。

この発明の実施に際し、使用されるプライマー類（第一
および追加のプライマーの両者）のいずれかは、−重鎮
領域に隣接する核酸が標識された二本鎖を含むことがで
きる。この−重鎮領域は、それとともにハイブリッド化
するた必の鋳型鎮に十分に相補的である核酸配列を含む
。プライマーの二本鎖領域または尾部は、検出可能なシ
グナルを生じうるか、あるいはエクステンション生成物
を捕捉もしくは固定するのに利用しうる検出可能な成分
で標識することができる。

別の好ましい態様では、プライマーが完全に一本鎖であ
る。好ましくは、プライマーが一本鎖オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドである。各プライマーの正確なサイズは
、考慮されている使用、標的配列の複雑さ、反応温度お
よびプライマー起源により大きく変りうる。一般に、こ
の発明で使用されるプライマーは、１５〜５０個のヌク
レオチド、好ましくは２０〜３０個のヌクレオチドを有
するであろう。

この発明で使用されるプライマー類は、増幅せしめる各
特異的配列のそれぞれの鎖に対して「実質的」に相補的
となるように選ばれる。このことは、それらがそれらの
個々の鎖とハイブリッドして目的のハイブリッド化生成
物を形成するのに十分相補的であらねばならないことを
意味する。理想的な状況下では、標的核酸に対して的確
な相補性を有するであろう。しかしながら、多くの状況
下では的確な相補性は可能でないかおそらく不可能であ
Ｄ、そしてそのプライマーが不十分なハイブリッド化を
引き起こすか、またはたとえプライムされたとしても、
エクステンション生成物の形成において非常に能率が悪
い（すなわち、エクステンション中のプライマーへの第
一の塩基が付着する速度が遅い）かもしくは全く起こら
ないか、のいずれかを引き起こしうる１以上のミスマツ
チが存在する可能性がある。

この発明で利用できるプライマーは、数多くの供給源か
ら入手できるか、あるいは既知の技法および装置、例え
ば、八ＢＩ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ１３　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可）または
Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８６００Ｓｅｒ　ｉｅｓもしくは
３３ＱＱ　５ｅｒｉｅｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍ
ｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、より
入手可）およびこれらの使用についての既知の方法を使
用して調製することができる。生物学的起源から単離さ
れた天然由来のプライマー類（例えば、制限エンドヌク
レアーゼ消化物）もまた使用可能である。

この発明の実施には、前述の第一プライマーを含むプラ
イマー組成物および１種以上の追加のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの使用を必要とする。

これらの追加のプライマーは、特定の第一プライマーに
対する核酸に関連する核酸配列と実質的に相補的である
。言い換えれば、第一プライマーは第一の配列に相補的
である。４種の追加のプライマーが存在する場合には、
それらは一定の態様（後述する）に関連する４種の追加
の核酸配列に対して実質的に相補的である。

これらの追加のプライマーは、前述のように誘導または
調製することができ、所期の目的について適当なサイズ
を有する。いくつかの態様（より詳細については後述す
る）では、プライマーのサイズを、特に第一プライマー
に関して設計してもよい。

追加のプライマーが相補的である核酸配列は、１以上の
次の関係において第一プライマーの核酸配列と関連付け
られる： ｉ）第一の特異的核酸配列の一部のみを含むか、ｉｉ）
その第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、あるいは １ｉｉ）１以上のヌクレオチド塩基によって前記第一の
特異的核酸配列から離れているが、追加のプライマーが
その第一の特異的核酸配列に相補的なプライマーエクス
テンションを形成しうる。

また、この発明の実施に際して前記（ｉ）〜（ｉｉｉ　
）の各カテゴリーの１以上を含む多様な追加のプライマ
ーも使用することができる。

第一プライマーに対する追加のプライマーのこれらの関
係は、第１〜６図を参照することによってよく理解する
ことができる。これらの全ての図面において、核酸は不
定の長さを有する水平の直線（ヌクレオチドについて）
で簡単に示され、垂直線によって反復核酸主鎖から伸び
る個々の塩基（２０ン が示される。このような垂直線は、個々の塩基または塩
基対（二本鎖もしくはプライムされた一本鎖が示される
場合）を示すことができる。プライマーは、３′末端か
らのプライマーエクステンションの方向を表す破線矢印
で簡単に示されている。

まず最初に、第１図は、米国特許第４．６８３．２０２
号明細書により詳細に記載されている既知の増幅工程を
非常に単純化した略図的に図示したものであることに注
意しなければならない。一般に、この方法では、各鎖に
対して、迅速かつ効率的な増幅を得るのに、目的の核酸
配列に実質的に相補的である１種のプライマーが必要で
あるにすぎない。

第２〜６図は、この発明の数種の態様を略図的に図示す
る。別の態様も可能であＤ、そしてこの発明の範囲内に
包含されることを理解しなければならない。さらに、図
示された標的核酸配列とプライマーは、相当短く示して
いるが、それらは単に例示であって、それらがいずれか
適当な長さのヌクレオチド塩基であってもよい。

第２図は、前述のカテゴ！Ｊ−（ｉ）の態様を図示して
おＤ、ここでは追加のプライマー類が第一の核酸配列の
一部とのみ相補的である。この例では、追加のプライマ
ー類が第一プライマーと同様にそれらの５′末端近傍に
同一の塩基配列を有するが、相互の間で２つの塩基によ
る長さが相異する。この塩基の変動はこの略図において
任意である。それらは、１個、３個または他の数の塩基
によっておそらく変りうるであろう。各プライマーの５
′末端における塩基は、この態様において同一である。

好ましい態様では、これらのプライマーが前記第一の配
列の範囲内に完全に入る核酸配列に相補的である。

第３図は、前述のカテゴ！Ｊ−（ｉ）のもう一つの態様
を図示しておＤ、ここでは追加のプライマー類が第一プ
ライマーと同一の長さを有するが、それらは第一の核酸
配列の一部と相補的であるにすぎない。さらに、それら
は少なくとも１個の塩基で第一プライマーと重複する。

図示された追加のプライマー類は、３個の塩基によって
それぞれ他のものから移動されているように示されてい
るが、第一プライマーと少なくとも１個の塩基の重複が
存在する限りいくらか別の数の塩基よってそれらが同様
に移動していてもよい。好ましい態様では、単一の塩基
によって移動される配列と各追加のプライマーが相補的
である。

第４図では、前述のカテゴ！Ｊ−（ｉｉ）の態様を図示
しておＤ、ここでは追加のプライマーが第一プライマー
に関する配列に「直接隣接する」核酸配列と相補的であ
る。その略図に記載されるように、この意味は、追加の
プライマーの３′末端が第一プライマーの５′末端と相
補的な塩基から一塩基離れた標的配列の塩基と相補的な
−の塩基を有する。それらの全てが３′末端で同一塩基
を有する限り１を越える追加のプライマーを使用するこ
とができる（図示していない）。

第５図は、前述のカテゴ！Ｊ−（ｉｉｉ）に入るさらな
る態様を図示している。これらの１以上の追加のプライ
マーは、１以上の塩基が前記第一配列から除去された核
酸配列と相補的である。しかし、たとえ数個の塩基が除
去されている場合であっても、これらの追加のプライマ
ーの少なくとも１つは、未だ第一の核酸配列に相補的な
プライマーエクスンション生成物を形成しろる。一般に
、このことは少なくとも１つの追加のプライマーが第一
７’ライマーの核酸配列から５０キロダルトン未満離れ
た核酸配列に相補的でありうることを意味する。これら
の追加のプライマーの選択は、予期されたミスマツチ上
でエクステンション生成物を形成しろるものを見い出す
ために幾つかの日常実験が必要であるかも知れない。し
かしながら、このような実験は当業者の範囲内で周知で
あろう。第５図における二重破断線は、追加のプライマ
ーが具体的に示された３個の塩基より多く離れているこ
とを示す。

第６図では、前述の３つのカテゴＩＪ−（ｉ）〜（ｉｉ
ｉ　）全てに由来する追加のプライマーを利用する態様
が図示されている。追加のプライマーのあるものは第一
の配列の一部に重複する核酸配列に相補的であＤ、図示
されたプライマーの一つは「隣接」配列を有し、そして
さらにもう一つは３つの塩基で離れた配列を有する。追
加のプライマーの他の混合物は、本明細書の教示によっ
て設計しそして使用することができる。

この発明の好ましい組成物は、第２図または第３図に図
示されるようなもののいずれかである。

この発明の組成物および方法において、第一プライマー
および追加のプライマーそれぞれの濃度は、０．００１
〜９９．９９９モル％で変動しろる。組成物におけるこ
れらのプライマーの正確な濃度は、それらのプライマー
の具体的な関係に依存する。例えば、第２図に示される
組成物では、最も短いプライマーは最大濃度で存在せし
めることが好ましい。従って、より大きなプライマーが
エクステンション生成物を効率的に形成する場合であっ
ても、より短いプライマーが後の増幅サイクルにとって
利用できるであろうし、こうすることでこの方法の能率
は一層改良される。一般に、他の態様では、前記プライ
マー類が等しい濃度で存在する。

この発明の組成物は、所定の核酸の複製にとって有用で
ある。このような手順の最初の工程は、複製のための標
的核酸を含有する被検体を調製するものである。通常、
このことは被検体から適当な方法によって不要なタンパ
ク質および細胞物質を除去することを意味する。Ｌａｕ
ｒｅらによってＴｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　５３８〜５４
０ページ（１９８８年９月３日）やＧｒｏｓｓ−Ｂｅｌ
ｌａｎｄらによってＢｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　
３６゜３２ページ（１９７３）に記載されるものを含む
多様な方法が当該技術分野で既知である。

被検体が調製されたならば、プライマーのハイブリッド
化生成物と標的核酸との混合物が形成されるような条件
下でそれがこの発明の組成物と接触される。このような
条件は、米国特許第４．６８３．２０２号明細書に記載
されるような増幅のために通常使用されるものである。

次に、プライマーエクステンション生成物が少なくとも
１つのハイブリッド化した生成物によって形成され、次
いで追加のプライミングおよびエクステンション生成物
の形成がなされる。変性（すなわち、相補的生成物の分
離）後、複製された標的核酸が反応混合物から標準的な
方法および装置を使用して単離されうる。

好ましい態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（下記に詳述
する〉を使用して標的核酸のさらなる増幅を含む。標的
核酸の複製は、遺伝子もしくは遺伝子断片の調製または
ゲノムＤＮＡの配列決定にとって有用であるかも知れな
い。

この発明はまた、２つの相補鎖を有する特異的核酸の検
出にとっても有用である。目的の核酸配列の殆どはほぼ
二本鎖（例えば、ＤＮＡに見られるもの）である。しか
しながら、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸配列は、それが
逆転写酵素を用いて二本鎖配列に転換された後に容易に
検出されうる。

特異的核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核酸
を使用して生成される。その酸が２つの鎖を含む場合に
は、別々の工程としてかまたはプライマーエクステンシ
ョン生成物の形成と同時にそれらの鎮を分離することが
必要である。変性は、従来技術文献に記載されるような
いずれか適当な物理的、化学的または酵素的手段を使用
して行うことができる。適当な温度まで加熱することが
好ましい手段である。

分離された鎖が使用にとって利用可能になれば、追加の
核酸の鎖の合成は、一般にｐＨ７〜９に緩衝化された水
性溶液中で、この発明のプライマー組成物を使用して実
施することができる。相補的なりＮＡ鎖に対するプライ
マーもまた含めることもできる。好ましくは、過剰モル
濃度のプライマーが緩衝液に加えられ、具体的量は従来
技術文献（例えば、米国特許第４．６８３．２０２号明
細書）で教示されている。デオキシリボヌクレオシド三
リン酸類ｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰもまた適当な量で前記合成混合物に添加され、
得られた溶液は９０〜１００℃で１０分未満、好ましく
は１〜４分間加熱される。この加熱後、溶液は、好まし
くは室温まで冷却され、次いでプライマーエクステンシ
ョン生成物の形成も誘導する（または触媒する）のに適
する試薬が導入される。当該技術分野でこの誘導試薬は
、重合試薬として一般に知られている。

これらの生成物を形成するた緬の反応は、既知の条件（
一般に、室温からもはや重合が起こらなくなるまでの温
度）下で行われる。

重合試薬は、酵素〔例えば、Ｂ、コリー（Ｂ、ｃｏｌｉ
）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４［ＩＮＡポリメラーゼ、
Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、逆転写酵素および当該技術
分野で既知の他の酵素〕を包含するプライマーエクステ
ンション生成物の合成を行うように作用しうるいずれか
の化合物または試薬の組み合わせであることができる。

特に有用な酵素は、クローン化または天然起源の熱安定
性酵素、例えば各種のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細
菌種から得られるものである。

他の重合試薬は米国特許第４．６８３．２０２号明細書
に記載されている。

好ましい熱安定性酵素は、ヨーロッパ特許公開第２５８
０１７号公報に記載されるようなサーマス・アクアティ
クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤ
ＮＡポリメラーゼである。他の有用な酵素は、Ｒｏｓｓ
　ｉらによって５ｙｓｔ、Ａｐｐ１９Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、　？（２−３）、　３３７〜３４１ページ、１９８
６に記載されている。多くの有用なポリメラーゼは市販
されている。一般に、エクステンション生成物の合成は
各プライマーの３′末端で開始され、合成が停止される
まで鋳型に沿って５′から３′の方向に進められるであ
ろう。

幾つかの重合試薬（例えば、逆転写酵素）は、鋳型に沿
って３′から５′の方向に進める場合もある。

新に合成された鎖とそれらの個々のプライマーを含んで
なる新に形成されたプライマーエクステンション生成物
は、この方法の次の工程で使用される最初の標的鎮を有
する二本鎖分子を形成する。

次に、前述のようにこれらの鎖を変性することにより分
離して一本鎖分子を提供し、前述のようにこれによって
新な核酸を合成する。場合によって追加の試薬が増幅工
程の進行を持続するために必要であるかも知れない。こ
の工程後、殆どのエクステンション生成物はプライマー
類によって結合された特異的核酸配列（すなわち、相補
的生成物）から成るであろう。

鎖の分離とエクステンション生成物合成工程は、必要に
よってしばしば繰り返えされて、使用、例えば検出に必
要な目的量の特異的核酸を生成することができる。一般
的に、一連の工程は最低１度は繰り返えされ、好ましく
は最低１０〜５０回繰り返えされる。

第一の核酸またはそれらの混合物に由来する１より多く
の特異的核酸を生成することが望まれる場合には、前述
の一般的方法において適当な数組のプライマーが使用さ
れる。

少なくとも１個のプライマーエクステンション生成物が
生じた後、この発明の方法のいずれかの時点でその生成
物は検出可能に標識されたプローブ（後述）とハイブリ
ッド化されうる。プローブとエクステンション生成物の
この接触は、この方法の期間中のいずれか適当な時期に
起こりうる。

一般的に、目的の核酸配列の所定量が生じたならば、最
終的な時期にこれらのプライマーエクステンション生成
物が分離され、第一プライマーエクステンション生成物
（すなわち、この発明のプライマー組成物を使用して形
成されるもの）が、検出の目的で標識されそして生成物
を形成するようにそれらに相補的である。オリゴヌクレ
オチドと接触される。このプローブは、標的核酸配列と
相補的である核酸配列である。これらのプローブはいず
れか適当な長さの核酸であることができるが、好ましく
は、それらは１５〜４０個の核酸を有する。それらは、
いずれか適当な（直接的にかまたは間接的に）検出可能
な物質で（通常、５′末端において）標識される。標識
を付着し、そしてプローブを調製する方法は、例えばＡ
ｇｒａｗａｌらによってＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅｓ、、　　１４．６２２７〜４５ページ（１９８６）
やプライマーに特異的にバインドするリガンドを付着す
る前記引例に記載されるような従来技術で周知である。

利用可能な標識としては、放射線同位体、電子稠密体、
発色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよび他の磁
性粒子、化学発光成分ならびに酵素（このものが好まし
い）が挙げられる。有用な酵素としては、グルコースオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ
ホスファクーゼおよび当該技術分野で既知の他の酵素が
挙げられる。このような酵素に対する基質や色素生成組
成物は周知である。

特に好ましい態様では、標識がベルオキシダーゼであＤ
、アッセイのある時点で過酸化水素と適当な色素生成組
成物が加えられて検出可能な色素を提供する。例えば有
用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジジンや
その誘導体、ならびに米国特許第４．０８９．７４７号
明細書に記載されるトリアリールイミダゾールロイコ染
料のようなロイコ染料またはペルオキシダーゼと過酸化
水素の存在下で反応して色素を供給する他の化合物が挙
げられる。特に有用な色素生成組成物は、特開平１−１
００４５３号公報に記載されている。

相補的生成物中に存在するプローブの存在の検出は、適
切かつ既知の検出装置および手順を使用して達成するこ
とができる。特定のプローブは検出装置を使用すること
なく目視できる。適当な容器中で実施することもこの方
法にとって有用である。最も簡単な容器は、試験管、フ
ラスコまたはビーカーであるがより精巧な容器はこの方
法を行うための自動化手順を促進するように形造られて
いる。例えば、方法を実施する間一定の温度特性を提供
するように構成されたキュベツトは、１９８９年１０月
２４日付で公開された特開平１−２６６８５８号公報に
記載され特許請求されている。他の有用な容器は、この
発明の方法の自動化または一回使用を目的に適当に作製
することができる。

相補的生成物中のプローブを検出するためには、反応媒
体中の他の物質から相補的生成物を分離することがしば
しば重要になる。これは、この方法で複製されるプライ
マーエクステンション生成物およびそれにプローブが付
着したものを試薬混合物から除去するようにプライマー
上に捕捉する手段を含む各種方法のいずれかによって行
われる。

プライマーは適当な方法で不溶性材料に付着することが
できるか、あるいはそれらが捕捉されるように設計する
ことができる（すなわち、この方法のある時点で捕捉手
段と反応する）。

有用な捕捉手段の１つは、不溶性材料に適当な方法で結
合されている受容体分子（例えば、アビジン、抗原体ま
たは糖）に特異的にパインディングしうるプライマーに
付着した特異的パインディングリガンド（例えば、ビオ
チン、抗体またはしく３４） クチン）を有するプライマーを使用する。得られる不溶
化複合生成物は、未複合物質から濾過、遠心または適当
な分離技術によって分離することができる。

特に有用な分離手段は、ポリアミド膜のような微孔質濾
過膜であ。それらは、未被覆であるかまたは界面活性剤
もしくは分析手順を促進する他の物質で予備被覆されて
いてもよい。

これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するのに適す
る容器と共に分離支持体として使用することができる。

しかしながら、好ましくは、前述したように試験装置の
一部としてそれらが固定される。米国特許第３．８２５
．４１０号、同３．８８８．６２９号、同３．９７０．
４２９号および同４．４４６．２３２号明細書に記載さ
れるものを含む各種の試験装置が当該技術分野で知られ
ている。特に有用な装置は、１９８８年９月１８日付で
出願した特願昭６３−２３４６９２号明細書に記載され
ている。

微量滴定板、試験管、ビーカー、ビーズ、フィルム、メ
ンプラン・フィルター、濾紙、ゲル、磁性粒子またはガ
ラスウールを包含するいずれかの有用な固体支持体を検
出のための生成物分離に使用することができる。それは
、ガラス、セラミックス、金属、天然または合成ポリマ
ー、セルロース材、濾過材および当業者に容易に明らか
となる他の材料を包含する数多（の材料で作製すること
ができる。特に有用な固体支持体材料は、一般に平均し
て０．１〜ｌＱｇｎの粒子サイズを有するポリマー粒子
である。有用なモノマー類、それらの製造方法および受
容体分子の取り付けを包含する前記の好ましいポリマー
粒子についてのより詳細は、１９８９年３月１日付で公
開された特開昭６４−５４２５８号公報に示されている
。

本明細書に記載される方法を使用して、感染症、遺伝子
疾患またはガンのような細胞性疾患に付随する特異的核
酸の検出または特性決定に供することができる。それは
また、法医学捜査およびＤＮＡ類別化に使用されるかも
知れない。この発明の目的とする遺伝子疾患としては、
錐状赤血球貧血、嚢胞性線維症、α−サラセミア、β−
サラセミアおよび当業者に容易に明らかとなる他の疾患
のような、いずれかの生物体に由来するヒトのゲノムＤ
ＮＡの特異的な欠損または変異が挙げられる。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の存在はこの発明によって検
出できる。各種感染症は、生物体（それが酵母、細菌ま
たはウィルスであるかどうかにかかわらず）を特性付け
る少量の特異的なりＮＡ配列を有する細胞の存在によっ
て診断することができる。このような検出されうる細菌
としては、限定されるものでないが、サルモネラ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
）、ゴノｏ−ｘ　（Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、シゲラ（Ｓ
ｈｉｇｅｌｌａ）およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ
）が挙げられる。検出可能なウィルスとしては、限定さ
れるものでないが、ヘルペス、サイトメガロウィルス、
エプスタイン−バールウィルス、肝炎ウィルスならびに
ＨＴＬＶ−１および旧Ｖ−１のようなレトロウィルスが
挙げられる。原生動物寄生体、酵母およびカビもまた検
出可能である。他の検出可能な種は、当業者にとって容
易に明らかであろう。この発明は、ウィルスＤＮＡの存
在を検出することによって試験試料中の旧Ｖ−Ｉのよう
なレトロウィルスの検出にとって特に有用である。

この発明の診断試験キットは概括的に前述してきた。キ
ットの主要な構成要素には、前述される第一オリゴヌク
レオチドプライマーおよび１種以上の追加のプライマー
が含まれる。このキットは、目的の各核酸配列に対する
一組のプライマー類を含んでもよい。

好ましくは、このキットはまた、ＤＮＡポリメラーゼ（
例えば、サーマス・アクアティクス由来のポリメラーゼ
）のようなプライマーの重合用試薬、４種のデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、
　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、検出可能なプローブ、プ
ローブが酵素または前述のような不溶性支持体で標識さ
れる場合には色素生成組成物を独立した容器に通常それ
ぞれ入れられる。

このキットの構成要素は、適当な形態で梱包され、多数
の任意の構成要素、例えば、ピペット、キュベツト、説
明書、緩衝剤、洗液、希釈剤ならびに、この発明の実施
に際して利用できる他の試薬、材料および備品を含むこ
とができる。これらの追加の構成要素は当該技術分野で
周知である。

〔実施例〕

以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するための
ものであって、この発明をいずれかの方法に限定するこ
とを意味しない。

例２で使用されるＤＮＡポリメラーゼは市販されていた
。それは、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍａｓ
　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたものであって、
２．５単位／Ｉの活性を有していた。ここで、１４１位
は、７４℃にて３０分以内で１０ミリモル濃度のｄＮＴ
Ｐがプライマーエクステンション生成物に取り込まれる
ために必要とされる量を表す。

電気泳動に使用される「移動相緩衝剤Ｊ　　（ｐＨ８）
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（８９ミ
リモル濃度）、ホウ酸（８９ミリモル濃度）およびエチ
レンジアミン四酢酸（２ミリモル濃度）からなる。

試料調製 ＨＩＶ−１ウイルスを保有する恐れのある患者から採取
した全血試料（１００ｐ１）を水性デキストラン溶液（
２５０μ！、２４．０００の分子量を有するデキストラ
ン３重量％）を含有する試験管に加え、この試験管を反
転させることによって混合した。室温で５分後、上澄を
別の試験管に移し、１００℃で５分間加熱した。次に、
この混合物を数秒間遠心し、増幅に使用する目的で用意
した別の試験管へ上澄を移した。この方法は、同時係属
中の特許出願明細書（１９８９年４月１７日付の米国特
許出願第３３９．．４３７号および１９８９年９月１７
日付の部分継続出願第４０６．２２２号明細書に対応）
で詳細に記載されるように標的ウィルスＤＮＡを抽出し
た。

例１　　）ｌｒｖ−ｒ　ＤＮＡ検出のためのプライマー
組成物例２で使用する目的でこの発明の２種のプライマ
ー組成物を下記のように調製した。これらの組成物は各
５個のプライマーの２セツトからなっていた。

各５個のプライマーの２セツトを標的ＤＮＡの２つの釦
用として調製した。これらの相同性プライマーセットは
、Ａ、Ａ１．Ａ２．Ａ３およびＡ４、ならびにＢ、Ｂ、
、Ｂ２．Ｂ３およびＢ、として下記に特定される。Ａプ
ライマーとＢプライマーの配列は、ＬａｕｒｅらのＴ１
１ｅ　１ａｎｃｅｔ　（前述）から入手した。当該技術
分野で標準とされているように、個々のヌクレオチド塩
基は略号で特定した。すなワチ、アデニン（Ａ）、チミ
ン（Ｔ）　、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）であ
る。これらのプライマーは次のヌクレオチド配列を有し
ていたニブライマーＡ　（＋）　、２５塩基： ５’　　−ＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡＡＴ
ＡＣＣ八Ｃ−３′追加のプライマー（＋）： Ａ＋、２へ塩基： ５　’　−ＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡＡＴ
ＡＣＣＡ−，３’Ａ２．２３塩基； ５　’　−ＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡＡＴ
ＡＣＣ−３’Ａ３．２２塩基： ５’　　−ＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴ八ＧＧ八ＡＴ
ＡＣ−３’へ４１へ Ａ４．２１塩基： ５’　　−ＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＡ八Ｔ
Ａ−３’プライマーＢ（−）、へ６塩基： ５　’−ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＧ
ＴＡＴＴＣ−３’追加のプライマー（−）： Ｂ＋、２５塩基： ５　’　−ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴ
ＧＴＡＴＴ−３’Ｂ２．２４塩基： ５’−ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡＡ八ＴＣＡＴＣＣＡＴＧへ
ＡＴ、−３’Ｂ３．２３塩基： ５、’　　−ＣＣＴ八ＣへＴへＣ八八へへＣＡＴＣＣＡ
ＴＧＴＡ−３’Ｂ４．２２塩基： ５’　　−ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＡ八ＡＴＣＡＴＣＣＡへ
ＧＴ−３’これらのプライマー類は、以下の方法を使用
して調製した； 自動合成方法 ジイソプロピルホスホラミシト　（ＡｍｅｒｉｃａｎＢ
ｉｏｎｅｔｉｃｓ由来）を、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏ
ｓｅａｒｃｈ由来のＢｉｏｓｅａｒｃｈ　８７００　Ｄ
ＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して核酸誘導化調
整多孔質ガラス支持体に連続的に縮合させた。

この手順は、ジクロロメタン中ジクロロ酢酸を使用する
脱トリメチル化、活性プロトン供与体として５−メチル
チオテトラゾールを使用する縮合および酢酸無水物とテ
トラヒドロフラン中Ｎ−メチルイミダゾール／ピリジン
によるキャッピングを含ませた。周期は約６分であった
。各段階における収率は９８％を越え、これらは脱トリ
チル化中に放出されるジメトキシトリチルアルコールの
収集と分光学的な試験によって測定された。

オリゴヌクレオチドの脱保護および精製工程カラムから
固体支持体を取り出し、６〜１８時間５５℃で濃水酸化
アンモニウム２ｍｌにさらした。次に、支持体を濾去し
、溶液上に窒素を流すことによってアンモニア溶液を１
７！になるまで蒸発させた。

試料（０，１モル濃度のトリエチルアミンアセテート緩
衝液、ｐｆ１６．９中）を、ＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　ＡＢ）を通過させ、次いでＢｉｏｓｅ
ａｒｃｈ製品文献に記載されるような標準的なトリチル
・オン（ｔｒｉｔｙｌ　ｏｎ）　／　）リチル・オフ（
ｔｒｉｔｙｌ　ｏｆｆ）法によりＰＰＰ−１カラム（Ｈ
ａｍｉｌｔｏｎ　Ｃｏ、）を用いるＩｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃで
さらに精製するか、または脱トリチル化機直接使用した
。トリチル基の脱離は、２０〜２５℃で１時間１００ミ
ルモル濃度の酢酸で処理し、引き続きトリエチルアミン
で中和しそして２度目のＨＡＰ−１０カラムの通過によ
って達成した。

オリゴヌクレオチド類の特性決定 塩基組成は、蛇素ホスホジェステラーゼを使用してオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドをヌクレオチド成分まで消
化し、次いで逆相ＨＰＬＣカラムと移動相アセトニトリ
ル／酢酸アンモニウムを使用して誘導されたヌクレオチ
ド類を分離し定量することによって決定した。

例２　：　ＨＩＶ−ＨＭ的ＤＮＡの検出この発明は、標
的旧Ｖ−ＩウィルスＤＮＡの増幅および検出において例
１のプライマー組成物を使用して例証された。この発明
は、単にプライマーＡとＢを使用する同一標的を検出す
るための試みと比較された。

以下の試験増幅溶液（１００ｉ）を調製したニドリス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝剤（ｐＨ８，
１０ミリモル濃度）と塩化マグネシウム（１０ミリモル
濃度）とを含有する緩衝液を、前述したプライマー組成
物（十＄よび−）（プライマーＡ、Ａ、、Ａ２およびＡ
３の各１０％とプライマーＡ、の６０％、ならびに前記
Ｂプライマー組成物を同様に有する、１００ピコモル濃
度）およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ、
各１５００ピコモル濃度）と共に混合した。次に、標的
ＤＮＡ（０，１ピコモル濃度）を添加し、引き続きＤＮ
Ａポリメラーゼ（２，５単位）を加えた。

試験と対照（単にプライマーＡとＢだけ）溶液をそれぞ
れ微量遠心管に入れ、下記のような３０回の連続的サイ
クルでポリメラーゼ連鎖反応を実施した： １分かけて９４℃に加熱、 ３０秒間牟持続、 ８０秒かけて５０℃まで温度を低下、 ３０秒間持続、 ４５秒かけて７０℃まで温度を上昇、そして１分間持続
した。

アリコート（５７’）を抜き取Ｄ、４％アガロースゲル
〔３％ＮｕＳｉｅｖｅ（商品名）および１％ＳｅａＫｅ
ｍ（商品名）　、ＦＭＣＢｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓから
入手可〕にかけた。このゲルは、エチジウムプロミド水
溶液（１０ｍｇ／　ｄ）　４　ｕｌで予め染色されてい
た。前記「移動相緩衝剤Ｊ　（６００μりはエチジウム
プロミド２４Ｉを含んでいた。このゲルを１時間１６０
ボルト／　ｃｍで電気泳動し、次いで写真をとりそして
得られたバンドを可視化した。

この発明のプライマー組成物を含有する試験混合物はゲ
ル中に非常によく見えるバンドを与えた。

対照混合物（プライマーＡとＢのみを含有）はゲル中に
観察できるバンドを全く示さなかった。

〔発明の効果〕

この発明は、試験検体中に非常に少量存在する核酸配列
を迅速、かつ正確に複製、増幅または検出するための手
段を提供する。さらに、これらの方法は、実施者がプラ
イムしたいと考える標的配列とプライマーとの間の相補
性にミスマツチが存在する場合でさえも実施することが
できる。このことは、レトロウィルスのように単離から
単離までに変化するゲノム配列を検出する上で相当効率
のよい方法となるであろう。

これらの利点は、プライマーの３′末端またはその近傍
において標的配列とのミスマツチを有するかまたは有さ
ないかも知れない第一プライマーを含むプライマー組成
物を使用することによって達成される。ミスマツチが存
在しない場合には、プライミングとその後の工程は効率
よ〈実施される。しかしながら、１以上のミスマツチが
存在する場合でも第一プライマーは未だその配列をプラ
イムしうるが、ミスマツチが起こる場所によってはエク
ステンション生成物の形成が遅くなるかまたは完全に阻
止されるかも知れない。この発明は、少なくとも１つは
所期のエクステンション生成物を適切にプライムしそし
て提供しろる追加のプライマー１種以上を組成物中に含
めることによって前記課題を解決する。これらの追加の
プライマーは、第一プライマーに比るといろいろな数の
ヌクレオチドを含みうるが、以下により詳細に記載され
るように第一プライマーとなお特有な態様で関連付られ
ている。この発明のプライマー組成物におけるプライマ
ーのセットは、本明細書において「相同性」プライマー
のセットとして特定されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は標的核酸に向けられる常法のプライミングと増
幅技法を示す略図であＤ、 第２図〜第６図は標的核酸に向けられるプライマーセッ
トを使用するこの発明の具体的な態様を示す略図である
。 （４８〉 ↓プライマーの添加 ↓ポリメラーゼの添加 壷プローブの添加 核酸の検出 ３″　　　　　　　　　　　　　　　５１４−−−　°
口］■１０］］　第一プライマー特異的核酸配列　　　
ＦＩＧ、　２ 特異的核酸配列 ＦＩＧ、　３ 特異的核酸配列 ＦＩＧ、　４ 特異的核酸配列 ＦＩＧ、　５ ３゛５゛　　　　　　　　　　第一プライマー−−１０
］ ＦＩＧ、　６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、所定の標的核酸の増幅または複製に有用なプライマ
   ー組成物であって、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に少なくとも実
   質的に相補的である第一オリゴヌクレオチドプライマー
   、ならびに （ｂ）（ｉ）前記第一の特異的核酸配列の一部のみを含
   むか、 （ｉｉ）前記第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、
   または （ｉｉｉ）１以上のヌクレオチド塩基によって前記第一
   の特異的核酸配列から離れているが、追加のプライマー
   がその第一の特異的核酸配列に相補的なプライマーエク
   ステンション生成物を形成しうるかいずれかの標的核酸
   の核酸配列に少なくとも実質的に相補的である追加のオ
   リゴヌクレオチドプライマー少なくとも１種、の水性混
   合物を含んでなる組成物。 ２、所定の標的核酸の増幅または複製に有用な診断試験
   キットであって、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に少なくとも実
   質的に相補的である第一オリゴヌクレオチドプライマー
   、ならびに （ｂ）（ｉ）前記第一の特異的核酸配列の一部のみを含
   むか、 （ｉｉ）前記第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、
   または （ｉｉｉ）１以上のヌクレオチド塩基によって前記第一
   の特異的核酸配列から離れているが、追加のプライマー
   がその第一の特異的核酸配列に相補的なプライマーエク
   ステンション生成物を形成しうるかいずれかの標的核酸
   の核酸配列に少なくとも実質的に相補的である追加のオ
   リゴヌクレオチドプライマー少なくとも１種、を含んで
   なるキット。 ３、所定の標的核酸の複製方法であって、 Ａ、複製のための所定の標的核酸を含有する被検体を調
   製する工程、ならびに Ｂ、（ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に実質的に
   相補的である第一オリゴヌクレオチドプライマー、 （ｂ）（ｉ）前記第一の特異的核酸配列の一部のみを含
   むか、 （ｉｉ）前記第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、
   または （ｉｉｉ）１以上のヌクレオチド塩基によって前記第一
   の特異的核酸配列から離れているが、追加のプライマー
   がその第一の特異的核酸配列に相補的なプライマーエク
   ステンション生成物を形成しうるかいずれかの標的核酸
   の核酸配列に少なくとも実質的に相補的である追加のオ
   リゴヌクレオチドプライマー少なくとも１種の水性混合
   物、を含むプライマー組成物と前記調製被検体とを接触
   させて前記プライマーと標的核酸とのハイブリッド化し
   た生成混合物を形成する工程、および Ｃ、ハイブリッド化した生成物少なくとも１種の第一プ
   ライマーエクステンション生成物を形成し、次いで第一
   プライマーエクステンション生成物をプライムして伸長
   する工程、 を含んでなる方法。 ４、所定の標的核酸の検出方法であって、 Ａ、標的核酸を含有することが予測される被検体を、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に実質的に相補
   的である第一オリゴヌクレオチドプライマー、および （ｂ）（ｉ）前記第一の特異的核酸配列の一部のみを含
   むか、 （ｉｉ）前記第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、
   または （ｉｉｉ）１以上のヌクレオチド塩基によって前記第一
   の特異的核酸配列から離れているが、追加のプライマー
   がその第一の特異的核酸配列に相補的なプライマーエク
   ステンション生成物を形成しうるかいずれかの標的核酸
   の核酸配列に少なくとも実質的に相補的である追加のオ
   リゴヌクレオチドプライマー少なくとも１種の水性混合
   物、を含むプライマー組成物と接触させる工程、 Ｂ、ハイブリッド化した生成物少なくとも１種の第一プ
   ライマーエクステンション生成物を形成し、次いで第一
   プライマーエクステンション生成物をプライムして伸長
   し、さらにその第一プライマーエクステンション生成物
   を増幅する工程、Ｃ、こうして得られたプライマーエク
   ステンション生成物を分離し、次いでそれらを検出可能
   なプローブと接触させて検出可能な相補的生成物を形成
   する工程、ならびに Ｄ、被検体における標的核酸の存在の指標として前記検
   出可能な相補的生成物を測定する工程、を含んでなる方
   法。