JPH074276B2 - 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマー - Google Patents
複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマーInfo
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- JPH074276B2 JPH074276B2 JP3511770A JP51177091A JPH074276B2 JP H074276 B2 JPH074276 B2 JP H074276B2 JP 3511770 A JP3511770 A JP 3511770A JP 51177091 A JP51177091 A JP 51177091A JP H074276 B2 JPH074276 B2 JP H074276B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、1990年６月15日に出願された小生の係属中の
先願第7/538,957号の部分継続出願である。
先願第7/538,957号の部分継続出願である。
発明が属する分野 本発明は、生体由来試料中に微量に存在する感染因子を
検出するための核酸プローブアッセイ法に関する。
検出するための核酸プローブアッセイ法に関する。
本発明の背景 ライム病は、ダニ媒介スピロヘータBgorrelia burgdor
feriがひき起こす臨床患者の一群である。それは、北米
および欧州で最も普通の節足動物媒介疾患である。この
感染症独特の病形としては、慢性遊走性紅斑、慢性萎縮
性先端皮膚炎、リンパ球性背髄神経根炎およびライム関
節炎がある。この疾患の第２期および第３期には、重篤
な神経系または心臓への迷入が観察される。臨床提示の
多様性と周知の通りこの疾患が他の神経障害、リウマチ
性障害に似ていることとが、正確な診断を困難にしてい
る。ライム病の臨床および病因の面からの総説について
は、Steereら、N.Engl.J.Med.308:733およびDuray,Rev.
Infect.Dis.112:S1487を参照されたい。ライム病の極め
て重篤な臨床経過にもかかわらず、診断と適切な治療を
早期に実施できれば、ライム病は抗生物質療法に極めて
よく反応する。しかし、早期診断は、感染後の最初の何
日間あるいは何週間のうちに信頼すべき鑑別診断を可能
にする試験法がないために、できないことである。現在
用いられている診断用試験はいずれも血清学的なもの
で、間接免疫蛍光法（IFA）、酵素結合免疫吸着剤検定
（ELISA）およひ免疫ブロッティングを包含する。この
ような免疫学的試験は、所期疾患の患者の約50〜60％し
か、感染後の最初の３〜６週間の間にIFAやELISAによっ
て測定可能で診断に役立つ値を持たないので、信頼でき
ないものである。
feriがひき起こす臨床患者の一群である。それは、北米
および欧州で最も普通の節足動物媒介疾患である。この
感染症独特の病形としては、慢性遊走性紅斑、慢性萎縮
性先端皮膚炎、リンパ球性背髄神経根炎およびライム関
節炎がある。この疾患の第２期および第３期には、重篤
な神経系または心臓への迷入が観察される。臨床提示の
多様性と周知の通りこの疾患が他の神経障害、リウマチ
性障害に似ていることとが、正確な診断を困難にしてい
る。ライム病の臨床および病因の面からの総説について
は、Steereら、N.Engl.J.Med.308:733およびDuray,Rev.
Infect.Dis.112:S1487を参照されたい。ライム病の極め
て重篤な臨床経過にもかかわらず、診断と適切な治療を
早期に実施できれば、ライム病は抗生物質療法に極めて
よく反応する。しかし、早期診断は、感染後の最初の何
日間あるいは何週間のうちに信頼すべき鑑別診断を可能
にする試験法がないために、できないことである。現在
用いられている診断用試験はいずれも血清学的なもの
で、間接免疫蛍光法（IFA）、酵素結合免疫吸着剤検定
（ELISA）およひ免疫ブロッティングを包含する。この
ような免疫学的試験は、所期疾患の患者の約50〜60％し
か、感染後の最初の３〜６週間の間にIFAやELISAによっ
て測定可能で診断に役立つ値を持たないので、信頼でき
ないものである。
その上、T.pallidumが惹起する梅毒およびBorrelia he
rmsiiが惹起する回帰熱の患者で、IFAおよびELISAでの
偽陽性反応が報告されている。B.burgdorferiの血清依
拠アッセイで偽陽性が多いのは、病原性スピロヘータ間
で遺伝的相互関係が高度な結果、主要構造決定基の血清
学的交差反応性が生じることに帰しうる。たとえば、Ma
gnarelliら、J.Infect.Dis.,156:183（1987）参照。
rmsiiが惹起する回帰熱の患者で、IFAおよびELISAでの
偽陽性反応が報告されている。B.burgdorferiの血清依
拠アッセイで偽陽性が多いのは、病原性スピロヘータ間
で遺伝的相互関係が高度な結果、主要構造決定基の血清
学的交差反応性が生じることに帰しうる。たとえば、Ma
gnarelliら、J.Infect.Dis.,156:183（1987）参照。
血清学的アッセイに代るものとして、核酸プローブが極
めて特定された標的配列に結合するという性質に基いた
試験がある。ライム病では、微生物自体が感染中極めて
少数存在するだけであるので、まず標的核酸配列を増幅
して、シグナル発生分子を結合させたプローブが十分な
数だけハイブリダイズして、検出可能なシグナルを発生
するようにすることが必要である。かかるプローブ依存
アアセイ法の戦略は、検出しようとする微生物種のつい
て標的配列が特異性をもち、標的配列の認識がその種の
あらゆるメンバー株に及ぶということにある。
めて特定された標的配列に結合するという性質に基いた
試験がある。ライム病では、微生物自体が感染中極めて
少数存在するだけであるので、まず標的核酸配列を増幅
して、シグナル発生分子を結合させたプローブが十分な
数だけハイブリダイズして、検出可能なシグナルを発生
するようにすることが必要である。かかるプローブ依存
アアセイ法の戦略は、検出しようとする微生物種のつい
て標的配列が特異性をもち、標的配列の認識がその種の
あらゆるメンバー株に及ぶということにある。
B.burgdorferiの核酸プローブアッセイは、この微生物
とそれに密接に関連する種、とくに回帰熱の諸変種であ
るB.hermsii、B.parkeri、B.turicatrae、B.hispanica
およびB.recurrentisとを弁別できなければならない。
種々のBorreliaについてのDNAの相同性の検討により、H
yde ＆ Johnson,Zbl.Bakt.Hyg.A,263:119（1988）に
おいて報告されているように、種々の程度の相同性が示
され、B.hermsiiが58〜63％という最大の相同性を示
す。北米の３つの種、B.hermsii、B.turicataeおよびB.
parkeriは77〜100％の相同性を共有するが、欧州と北米
の諸株の比較により、実質的な種内変動が示されてい
る。
とそれに密接に関連する種、とくに回帰熱の諸変種であ
るB.hermsii、B.parkeri、B.turicatrae、B.hispanica
およびB.recurrentisとを弁別できなければならない。
種々のBorreliaについてのDNAの相同性の検討により、H
yde ＆ Johnson,Zbl.Bakt.Hyg.A,263:119（1988）に
おいて報告されているように、種々の程度の相同性が示
され、B.hermsiiが58〜63％という最大の相同性を示
す。北米の３つの種、B.hermsii、B.turicataeおよびB.
parkeriは77〜100％の相同性を共有するが、欧州と北米
の諸株の比較により、実質的な種内変動が示されてい
る。
核酸プローブアッセイによるB.burgdorferiの検出に当
っては、OspAおよびOspB表面蛋白抗原に対するプローブ
が注目されてきた。Nielsonら、Mol.Cel.Probes,4:73
（1990）は、増幅された145塩基対のOspAセグメントを
成功裏にプローブ探査して、スピロヘータ５抗凝固剤に
相当するB.burgdorferi DNAわずか50fgを検出したこと
を報告している。プローブは、B.hermsii、T.pallidu
m、T.denticolaあるいはS.aureusとの交差反応性が認め
られなかったことから、B.burgdorferiに対し特異的で
あることが見出された。しかし、Persingら、J.Clin.Mi
cro.,28:566（1990）は、多数の真正なB.burgdorferi分
離株のOspA領域をプローブ探査し、それらのプローブが
分離株の全てを断定的に同定できるわけではないことを
見出した。この結果の分子レベルでの根拠は、B.burgdo
rferiが株によっては大きく異なるOspA蛋白を有した
り、OspA蛋白を全くもたず、代りに、より小さいpCとい
う蛋白を持つという知見であった。それゆえ、現在のと
ころ、B.burgdorferiに対する決定的なアッセイ法はな
い。
っては、OspAおよびOspB表面蛋白抗原に対するプローブ
が注目されてきた。Nielsonら、Mol.Cel.Probes,4:73
（1990）は、増幅された145塩基対のOspAセグメントを
成功裏にプローブ探査して、スピロヘータ５抗凝固剤に
相当するB.burgdorferi DNAわずか50fgを検出したこと
を報告している。プローブは、B.hermsii、T.pallidu
m、T.denticolaあるいはS.aureusとの交差反応性が認め
られなかったことから、B.burgdorferiに対し特異的で
あることが見出された。しかし、Persingら、J.Clin.Mi
cro.,28:566（1990）は、多数の真正なB.burgdorferi分
離株のOspA領域をプローブ探査し、それらのプローブが
分離株の全てを断定的に同定できるわけではないことを
見出した。この結果の分子レベルでの根拠は、B.burgdo
rferiが株によっては大きく異なるOspA蛋白を有した
り、OspA蛋白を全くもたず、代りに、より小さいpCとい
う蛋白を持つという知見であった。それゆえ、現在のと
ころ、B.burgdorferiに対する決定的なアッセイ法はな
い。
より最近の研究は、B.burgdorferiが１群より多くの微
生物を包含しているかもしれないことを示している。Po
sticら、Res.Microbiol.,141:465（1990）は、種々の出
所からの13株をDNA/DNAハイブリダイゼーションによっ
て分析し、４株からなる亜群を９参照株から区別できる
ことを見出した。Rosaら、J.Clin.Microbiol.,29:524
（1991）も、ゲノムの未知部分からのB.Burgdorferi特
異性標的配列を用いてのDNA増幅パターンにより、B.bur
gdorferiの２亜群を識別できることを見出した。これら
２グループの結果の間には大きな矛盾があって、これら
の系が満足できるほどに特異性のある診断上の価値をも
っていないかもしれないことを示している点を注記して
おくべきであろう。
生物を包含しているかもしれないことを示している。Po
sticら、Res.Microbiol.,141:465（1990）は、種々の出
所からの13株をDNA/DNAハイブリダイゼーションによっ
て分析し、４株からなる亜群を９参照株から区別できる
ことを見出した。Rosaら、J.Clin.Microbiol.,29:524
（1991）も、ゲノムの未知部分からのB.Burgdorferi特
異性標的配列を用いてのDNA増幅パターンにより、B.bur
gdorferiの２亜群を識別できることを見出した。これら
２グループの結果の間には大きな矛盾があって、これら
の系が満足できるほどに特異性のある診断上の価値をも
っていないかもしれないことを示している点を注記して
おくべきであろう。
発明の要約 B.burgdorferiおよびB.hermsiiからの、高保存性フラジ
ェリン遺伝子をコードするDNA配列を比較すると、短い
欠失を含めて、50〜70％の食い違い（ミスマッチ）塩基
を含む相対的に非相同性の小さい領域が明らかになる。
この領域から選んだプライマーは、B.burgdorferiに特
異的なプライマー間配列の増幅を指示することが見出さ
れた。このプライマー間領域のために構築されたプロー
ブは、B.burgdorferiを特異的に同定する。
ェリン遺伝子をコードするDNA配列を比較すると、短い
欠失を含めて、50〜70％の食い違い（ミスマッチ）塩基
を含む相対的に非相同性の小さい領域が明らかになる。
この領域から選んだプライマーは、B.burgdorferiに特
異的なプライマー間配列の増幅を指示することが見出さ
れた。このプライマー間領域のために構築されたプロー
ブは、B.burgdorferiを特異的に同定する。
本発明によれば、かかるプライマーおよびプローブを用
いて生体由来試料中のB.burgdorferiを特異的に検出す
るためのバイオアッセイ法は、 該試料から核酸画分を抽出し、 鞭毛の開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のフ
ランキング（隣りの）配列に対して相補鎖特異性プライ
マー対を加え、 それらプライマーを相補鎖配列とハイブリダイズさせ、 核酸増幅技法によって該半保存領域を増幅させ、 増幅された半保存領域を、プライマー間配列から構築さ
れたシグナル発生プローブとハイブリダイズさせ、 ハイブリダイズされたプローブが発生するシグナルを検
出すること からなる。
いて生体由来試料中のB.burgdorferiを特異的に検出す
るためのバイオアッセイ法は、 該試料から核酸画分を抽出し、 鞭毛の開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のフ
ランキング（隣りの）配列に対して相補鎖特異性プライ
マー対を加え、 それらプライマーを相補鎖配列とハイブリダイズさせ、 核酸増幅技法によって該半保存領域を増幅させ、 増幅された半保存領域を、プライマー間配列から構築さ
れたシグナル発生プローブとハイブリダイズさせ、 ハイブリダイズされたプローブが発生するシグナルを検
出すること からなる。
本発明の他の一面では、鞭毛の開放型読み枠領域におい
てB.burgdorferiに特異的であるオリゴヌクレオチドプ
ライマー対を選ぶが、第一のかかるプライマーは、鞭毛
の開放型読み枠の390番〜770番ヌクレオチドからの約８
〜32個の連続した塩基の配列からなり、第二のかかるオ
リゴヌクレオチドプライマーは、第一のプライマーの
５′末端から少なくとも50ヌクレオチドの間隔を置いて
相補鎖上にあり、B.hermsiiの対応する配列との相同性
が70％以下である８〜32個の実質的に連続した塩基を含
む配列からなる。
てB.burgdorferiに特異的であるオリゴヌクレオチドプ
ライマー対を選ぶが、第一のかかるプライマーは、鞭毛
の開放型読み枠の390番〜770番ヌクレオチドからの約８
〜32個の連続した塩基の配列からなり、第二のかかるオ
リゴヌクレオチドプライマーは、第一のプライマーの
５′末端から少なくとも50ヌクレオチドの間隔を置いて
相補鎖上にあり、B.hermsiiの対応する配列との相同性
が70％以下である８〜32個の実質的に連続した塩基を含
む配列からなる。
本発明のさらに別の一面は、フラジェリン遺伝子の開放
型読み枠の非相同領域から増幅された核酸を特異的に検
出するためのプローブの選択を含む。これらのプローブ
は、B.burgdorferiの鞭毛の開放型読み枠の配列に対し
ては実質的に相同であるが、B.hermsiiの対応する配列
に対しては約70％した相同でないシグナル発生性オリゴ
ヌクレオチドトレーサーからなる。トレーサーに結合さ
れるシグナル発生手段は、放射性標識、蛍光標識または
ビオチニル化標識であってよい。
型読み枠の非相同領域から増幅された核酸を特異的に検
出するためのプローブの選択を含む。これらのプローブ
は、B.burgdorferiの鞭毛の開放型読み枠の配列に対し
ては実質的に相同であるが、B.hermsiiの対応する配列
に対しては約70％した相同でないシグナル発生性オリゴ
ヌクレオチドトレーサーからなる。トレーサーに結合さ
れるシグナル発生手段は、放射性標識、蛍光標識または
ビオチニル化標識であってよい。
配列 CTC TGG TGA GGG AGC TCA AAC TGC TCA
GGC TGC ACC GGT TCA AGA GGG Ｔのオリゴヌ
クレオチドを含むプローブを用いて、プライマー間配列
の増幅を行っておいて多数のB.burgdorferi株のスクリ
ーニングを行った。このプローブはいくつかの増幅され
た核酸を検出したが、他のものは検出しなかった。従っ
て、本発明のさらに別の一面は、これらのプライマー間
領域の配列を、B.burgdorferiの亜群を検出するための
標的として利用することである。B.burgdorferiフラジ
ェリン遺伝子の開放型読み枠の、517番ヌクレオチドか
ら742番ヌクレオチドに至る高可変領域の一変異配列
は、531、549、552、612、613、684、693位でのグアノ
シン、539、591、603、622、639、651、666位でのアデ
ノシン、540、573、630、696位でのチミジンおよび735
位でのシトシンによる塩基置換を含む。B.burgdorferi
フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、517番ヌクレオ
チドから724番ヌクレオチドに至る高可変領域の他の一
変異配列は、531、595、612、649および663位でのグア
ノシン、539、552、651、666、670および688位でのアデ
ノシン、540、571、594、630および696位でのチミジン
ならびに644および726位でのシトシンによる塩基置換を
含む。最後に、標的配列の一部に対して相補性のプロー
ブの１セットは、CTC TGG TGT GGG AGC TCA AAC
TGC TCA GGC TGC ACC GGT TCA AGA GGG T,C
TC TGG TGA AGG AGC TCA GGC TGC TCA GAC T
GC ACC TGT TCA AGA AGGおよびTGC TGG GGG AG
C TCA AGC TGC TCA GGC TGC ACC TGT TCA AG
A GGG TGCからなる群から選ばれた選ばれた配列をも
つオリゴヌクレオチドプローブと該プローブに結合され
たシグナル手段とからなるB.burgdorferi亜群検出用オ
リゴヌクレオチドトレーサーを包含する。
GGC TGC ACC GGT TCA AGA GGG Ｔのオリゴヌ
クレオチドを含むプローブを用いて、プライマー間配列
の増幅を行っておいて多数のB.burgdorferi株のスクリ
ーニングを行った。このプローブはいくつかの増幅され
た核酸を検出したが、他のものは検出しなかった。従っ
て、本発明のさらに別の一面は、これらのプライマー間
領域の配列を、B.burgdorferiの亜群を検出するための
標的として利用することである。B.burgdorferiフラジ
ェリン遺伝子の開放型読み枠の、517番ヌクレオチドか
ら742番ヌクレオチドに至る高可変領域の一変異配列
は、531、549、552、612、613、684、693位でのグアノ
シン、539、591、603、622、639、651、666位でのアデ
ノシン、540、573、630、696位でのチミジンおよび735
位でのシトシンによる塩基置換を含む。B.burgdorferi
フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、517番ヌクレオ
チドから724番ヌクレオチドに至る高可変領域の他の一
変異配列は、531、595、612、649および663位でのグア
ノシン、539、552、651、666、670および688位でのアデ
ノシン、540、571、594、630および696位でのチミジン
ならびに644および726位でのシトシンによる塩基置換を
含む。最後に、標的配列の一部に対して相補性のプロー
ブの１セットは、CTC TGG TGT GGG AGC TCA AAC
TGC TCA GGC TGC ACC GGT TCA AGA GGG T,C
TC TGG TGA AGG AGC TCA GGC TGC TCA GAC T
GC ACC TGT TCA AGA AGGおよびTGC TGG GGG AG
C TCA AGC TGC TCA GGC TGC ACC TGT TCA AG
A GGG TGCからなる群から選ばれた選ばれた配列をも
つオリゴヌクレオチドプローブと該プローブに結合され
たシグナル手段とからなるB.burgdorferi亜群検出用オ
リゴヌクレオチドトレーサーを包含する。
好ましい実施様の詳細な説明 B.burgdorferiの増幅された標的配列に対するプローブ
依存アッセイ法を開発しようとする従来の試みでは、Os
pAおよびPspB遺伝子から発現される主要表面抗原蛋白が
選択された。全ての真正なB.burgdorferi株がこれらの
抗原をコードしているわけではないことが判明している
ので、異なる配列を選択しなければならないことは明ら
かである。
依存アッセイ法を開発しようとする従来の試みでは、Os
pAおよびPspB遺伝子から発現される主要表面抗原蛋白が
選択された。全ての真正なB.burgdorferi株がこれらの
抗原をコードしているわけではないことが判明している
ので、異なる配列を選択しなければならないことは明ら
かである。
スピロヘータでは、内鞭毛は、単一のサブユニットから
なるアッセイブリーにより構成されている。Wilskeら、
Zbl.Bakt.Hyg.A263:92（1986）は、B.burgdorferiのフ
ラジェリン蛋白質に対して単離されたモノクローナル抗
体がB.hermsii、B.duttoni、B.turicataeおよびB.parke
riとも反応することを報告した。その単一サブユニット
構造、抗原相同性の証拠および同一分子内での構造上お
よび生理学上の制約のため、フラジェリン遺伝子は高度
に保存されえて、それゆえ、プローブ依拠アッセイにお
ける標的として、種の各メンバーを同定しそうに思われ
る。しかし、同じ抗血清に対する数種の種の交差反応
は、これらの遺伝子が同じ属内の諸種の間で高度に保存
されうることも示唆している。
なるアッセイブリーにより構成されている。Wilskeら、
Zbl.Bakt.Hyg.A263:92（1986）は、B.burgdorferiのフ
ラジェリン蛋白質に対して単離されたモノクローナル抗
体がB.hermsii、B.duttoni、B.turicataeおよびB.parke
riとも反応することを報告した。その単一サブユニット
構造、抗原相同性の証拠および同一分子内での構造上お
よび生理学上の制約のため、フラジェリン遺伝子は高度
に保存されえて、それゆえ、プローブ依拠アッセイにお
ける標的として、種の各メンバーを同定しそうに思われ
る。しかし、同じ抗血清に対する数種の種の交差反応
は、これらの遺伝子が同じ属内の諸種の間で高度に保存
されうることも示唆している。
事実、B.burgdorferiに最も密接に関連する種であるB.h
ermsiiについてのフラジェリン遺伝子の単離および配列
決定は、B.burgdorferiと相同性の大きい領域を明らか
にした。しかし、思いがけないことに、フラジェリン遺
伝子の開放型読み枠内に、相対的に非相同の配列を含む
およそ480塩基対の領域もあった。本発明では相対的に
非相同のこれら配列が、B.burgdorferiの増幅、検出に
おいては特異的であるが、他の密接に関連した種は識別
するところのプライマーおよびプローブを構築するため
の基礎を与えてくれる。
ermsiiについてのフラジェリン遺伝子の単離および配列
決定は、B.burgdorferiと相同性の大きい領域を明らか
にした。しかし、思いがけないことに、フラジェリン遺
伝子の開放型読み枠内に、相対的に非相同の配列を含む
およそ480塩基対の領域もあった。本発明では相対的に
非相同のこれら配列が、B.burgdorferiの増幅、検出に
おいては特異的であるが、他の密接に関連した種は識別
するところのプライマーおよびプローブを構築するため
の基礎を与えてくれる。
第１図は、B.burgdorferiおよびB.hermsiiからのフラジ
ェリン遺伝子のヌクレオチド配列の相同性の比較を示
す。ヌクレオチドの整列には、Nuc.Acids Res.,12:126
（1988）に引用されている通り、UWGCGT分析プログラム
BESTFITの助けを借りた。B.burgdorferiの配列をB.herm
siiの配列の上方に位置させてある。この比較から、非
相同性の領域がおよそ390位および712位のヌクレオチド
によってはさまれていることがわかる。約475位のヌク
レオチドから約770位のヌクレオチドまでの領域が、そ
れがB.hermsiiの配列における少なくとも２つの小さい
欠失を含んでいるため、プライマーおよびプローブの構
築に好ましい。
ェリン遺伝子のヌクレオチド配列の相同性の比較を示
す。ヌクレオチドの整列には、Nuc.Acids Res.,12:126
（1988）に引用されている通り、UWGCGT分析プログラム
BESTFITの助けを借りた。B.burgdorferiの配列をB.herm
siiの配列の上方に位置させてある。この比較から、非
相同性の領域がおよそ390位および712位のヌクレオチド
によってはさまれていることがわかる。約475位のヌク
レオチドから約770位のヌクレオチドまでの領域が、そ
れがB.hermsiiの配列における少なくとも２つの小さい
欠失を含んでいるため、プライマーおよびプローブの構
築に好ましい。
プライマー配列の選択に当たっては、好ましくは約８〜
32ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを利用するのが望
ましい。８個未満のヌクレオチドを使用すると、特異性
が低下し、結合親和性が減少する。約32個より多いヌク
レオチドを使用しても、プライマー機能や特異性が増す
ことにはならず、顕著なミスマッチ領域での結合の確率
が増すかもしれない。しかし、６または７個のあるいは
32個より多くのヌクレオチドからなるプライマーを使用
できる配列が非相同領域内にあるであろうし、それら
は、好ましい配列長の均等物であると考えるべきであ
る。
32ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを利用するのが望
ましい。８個未満のヌクレオチドを使用すると、特異性
が低下し、結合親和性が減少する。約32個より多いヌク
レオチドを使用しても、プライマー機能や特異性が増す
ことにはならず、顕著なミスマッチ領域での結合の確率
が増すかもしれない。しかし、６または７個のあるいは
32個より多くのヌクレオチドからなるプライマーを使用
できる配列が非相同領域内にあるであろうし、それら
は、好ましい配列長の均等物であると考えるべきであ
る。
プライマー選択における戦略は、B.hermsiiの対応する
配列に対して最大限非相同の、B.burgdorferi本来の短
い配列を同定することである。増幅反応では、プライマ
ーはB.burgdorferiの鋳型とのみアニールし、B.hermsii
のDNAとはアニールしないので、シグナル発生プローブ
とハイブリダイズされうる諸配列の特異的増幅は起こら
ない。さらに、プライマーは、向かい合った鎖上で標的
領域の隣にくるよう選択する。この標的領域は、それが
ハイブリダイズするプローブと少なくとも同じ長さであ
るべきで、好ましくは約50ヌクレオチドの長さであるべ
きである。かくして、鞭毛遺伝子の開放型読み枠の390
〜712番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８〜32
塩基を含む配列からなる群から選ばれた第一のオリゴヌ
クレオチドと、第一のプライマーの５′末端から約50ヌ
クレオチドの間隔を置いて相補鎖上にある配列であっ
て、B.hermsiiの対応する配列の70％以上の相同性しか
もたない実質的に連続した８〜32塩基を含む配列からな
る群より選ばれた第二のオリゴヌクレオチドとからなる
プライマー対を選択する。
配列に対して最大限非相同の、B.burgdorferi本来の短
い配列を同定することである。増幅反応では、プライマ
ーはB.burgdorferiの鋳型とのみアニールし、B.hermsii
のDNAとはアニールしないので、シグナル発生プローブ
とハイブリダイズされうる諸配列の特異的増幅は起こら
ない。さらに、プライマーは、向かい合った鎖上で標的
領域の隣にくるよう選択する。この標的領域は、それが
ハイブリダイズするプローブと少なくとも同じ長さであ
るべきで、好ましくは約50ヌクレオチドの長さであるべ
きである。かくして、鞭毛遺伝子の開放型読み枠の390
〜712番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８〜32
塩基を含む配列からなる群から選ばれた第一のオリゴヌ
クレオチドと、第一のプライマーの５′末端から約50ヌ
クレオチドの間隔を置いて相補鎖上にある配列であっ
て、B.hermsiiの対応する配列の70％以上の相同性しか
もたない実質的に連続した８〜32塩基を含む配列からな
る群より選ばれた第二のオリゴヌクレオチドとからなる
プライマー対を選択する。
選んだプライマーは、相補鎖上での鎖伸長のために変性
核酸鋳型上の開始点として利用する。核酸の増幅は、米
国特許第4,683,195号および同第4,683,202号（Mullis）
中に記載されている通りの複製連鎖反応（PCR）を用い
て行うのが便利である。この方法では、標的DNAが変性
され、プライマーが、それぞれの向かい合った鎖の上の
増幅されるべき標的領域に隣る相補配列とハイブリダイ
ズされる。ヌクレオチド三リン酸類と共にDNAポリメラ
ーゼを加えると、プライマーから新しいDNAが合成され
る。反応が完了すると、DNAを再び変性し、さらにポリ
メラーゼを加えると、次のラウンドのDNA合成が起こ
る。これを何回も繰り返すことにより、５〜6logオーダ
ーの高度の増幅を達成できる。ハイブリダイゼーション
および重合はできるだけ厳格な条件組合せのものとで、
すなわち、プライマーの結合に、正確な配列への一層高
い忠実度が求められる高昇温度下で、行うことが望まし
い。好ましい温度は65℃で、これには、米国特許第4,88
9,819号（Gelfandら）に記載のものなどの耐熱性ポリメ
ラーゼの使用が必要である。
核酸鋳型上の開始点として利用する。核酸の増幅は、米
国特許第4,683,195号および同第4,683,202号（Mullis）
中に記載されている通りの複製連鎖反応（PCR）を用い
て行うのが便利である。この方法では、標的DNAが変性
され、プライマーが、それぞれの向かい合った鎖の上の
増幅されるべき標的領域に隣る相補配列とハイブリダイ
ズされる。ヌクレオチド三リン酸類と共にDNAポリメラ
ーゼを加えると、プライマーから新しいDNAが合成され
る。反応が完了すると、DNAを再び変性し、さらにポリ
メラーゼを加えると、次のラウンドのDNA合成が起こ
る。これを何回も繰り返すことにより、５〜6logオーダ
ーの高度の増幅を達成できる。ハイブリダイゼーション
および重合はできるだけ厳格な条件組合せのものとで、
すなわち、プライマーの結合に、正確な配列への一層高
い忠実度が求められる高昇温度下で、行うことが望まし
い。好ましい温度は65℃で、これには、米国特許第4,88
9,819号（Gelfandら）に記載のものなどの耐熱性ポリメ
ラーゼの使用が必要である。
当業者に既知の他の核酸増幅プロトコールをPCRに替え
てもよい。3SRと呼ばれるかかる一方法は、逆転写酵素
を利用してRNA/DNAハイブリッドをつくり出し、これよ
り、T7または他の適当な転写プロモーターを含有する二
重DNA構造を製出する。DNA依存性RNAポリメラーゼを系
に加え、標的配列に特異的な転写物を多数合成させる。
これらの増幅された転写物をつぎに適当なシグナル発生
性オリゴヌクレオチドでプローブ探査し、特定の標的を
検出する。3SRあるいはTASと呼ばれる関連した増幅法の
ためのプライマーを構築するに当っては、プロモーター
配列がプライマーの５′末端に結合されなければならな
い。配列TAATACGACTCACTATAGGGAをもつT7プロモーター
が好ましい。
てもよい。3SRと呼ばれるかかる一方法は、逆転写酵素
を利用してRNA/DNAハイブリッドをつくり出し、これよ
り、T7または他の適当な転写プロモーターを含有する二
重DNA構造を製出する。DNA依存性RNAポリメラーゼを系
に加え、標的配列に特異的な転写物を多数合成させる。
これらの増幅された転写物をつぎに適当なシグナル発生
性オリゴヌクレオチドでプローブ探査し、特定の標的を
検出する。3SRあるいはTASと呼ばれる関連した増幅法の
ためのプライマーを構築するに当っては、プロモーター
配列がプライマーの５′末端に結合されなければならな
い。配列TAATACGACTCACTATAGGGAをもつT7プロモーター
が好ましい。
プローブ配列は、非相同性開放型読み枠領域内の任意の
プライマー間配列から選択すればよい。最良のプローブ
は、ミスマッチ極大の配列を組入れているものである。
この領域では、約585番の塩基から約650番の塩基までの
配列が、欠失を含む領域にかかっていて、全体としてお
よそ50％のミスマッチ率をもつので、とくに有効であ
る。この好ましい実施態様で、１つまたは２つのプライ
マーよりもむしろプローブをこの領域から選択するの
は、高度ミスマッチのプローブは増幅が低レベルの標的
とは有意にハイブリダイズせず、その結果実質的に定量
的アッセイが行えるという観察に基いている。
プライマー間配列から選択すればよい。最良のプローブ
は、ミスマッチ極大の配列を組入れているものである。
この領域では、約585番の塩基から約650番の塩基までの
配列が、欠失を含む領域にかかっていて、全体としてお
よそ50％のミスマッチ率をもつので、とくに有効であ
る。この好ましい実施態様で、１つまたは２つのプライ
マーよりもむしろプローブをこの領域から選択するの
は、高度ミスマッチのプローブは増幅が低レベルの標的
とは有意にハイブリダイズせず、その結果実質的に定量
的アッセイが行えるという観察に基いている。
プローブの長さは、数ないし数百塩基対という、可能性
として広い範囲にわたって変えうる。しかし、プローブ
の特異性とその安定性との間でバランスをとらなければ
ならない。相対的に短いプローブ、とくに高度非相同性
領域から選ばれたものは、相対的に長いものよりは特異
性がより高いが、ハイブリダイゼーションの厳格さが良
好となる温度で不安定な蛍光がある。長いプローブは、
より多数のミスマッチを許容しうるために、一般に特異
性が低い。好ましいプローブは、相対的非相同の領域か
ら選ばれたもので、GC含量が比較的高く、約35〜55ヌク
レオチド長である。
として広い範囲にわたって変えうる。しかし、プローブ
の特異性とその安定性との間でバランスをとらなければ
ならない。相対的に短いプローブ、とくに高度非相同性
領域から選ばれたものは、相対的に長いものよりは特異
性がより高いが、ハイブリダイゼーションの厳格さが良
好となる温度で不安定な蛍光がある。長いプローブは、
より多数のミスマッチを許容しうるために、一般に特異
性が低い。好ましいプローブは、相対的非相同の領域か
ら選ばれたもので、GC含量が比較的高く、約35〜55ヌク
レオチド長である。
フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、ミスマッチおよ
び非相同性が最高度の、594〜642位ヌクレオチドに囲ま
れた領域から選ばれたオリゴヌクレオチド、すなわちCT
C TGG TGA GGG AGC TCA AAC TGC TCA GGC TG
C ACC GGT TCA AGA GGG Ｔを用いて、32P結合プ
ローブを構築した。多数のB.burgdorferiと推定される
菌株を、上記プライマーがアニールするフラジェリン遺
伝子内部位間にわたる標的領域（プライマー間増幅領
域）をまず増幅させることにより、スクリーニングし
た。
び非相同性が最高度の、594〜642位ヌクレオチドに囲ま
れた領域から選ばれたオリゴヌクレオチド、すなわちCT
C TGG TGA GGG AGC TCA AAC TGC TCA GGC TG
C ACC GGT TCA AGA GGG Ｔを用いて、32P結合プ
ローブを構築した。多数のB.burgdorferiと推定される
菌株を、上記プライマーがアニールするフラジェリン遺
伝子内部位間にわたる標的領域（プライマー間増幅領
域）をまず増幅させることにより、スクリーニングし
た。
増幅された核酸類をつぎに、サザンブロットアッセイで
上記プローブを用いて探査した。驚くべきことに、真正
なB.burgdorferi株のなかに、プローブとのハイブリダ
イゼーションを示すものと、示さないものとがあった。
増幅された配列の配列分析を行った。それらの配列を第
６図に示す。
上記プローブを用いて探査した。驚くべきことに、真正
なB.burgdorferi株のなかに、プローブとのハイブリダ
イゼーションを示すものと、示さないものとがあった。
増幅された配列の配列分析を行った。それらの配列を第
６図に示す。
これらの配列は、いくつかの位置のミスマッチ塩基を含
んでいる。最小５個のミスマッチ塩基を含む１領域を選
ぶことにより、プライマー間領域をまず増幅し、つぎに
増幅されたプローブを特定配列のプローブで探査すると
ころのアッセイ法においてB.burgdorferiの３つの亜群
を区別できる３種のプローブを得た。３種のプローブの
配列は次の通りである：プローブ1:CTC TGG TGA GGG
AGC TCA AAC TGC TCA GGC TGC ACC GGT TCA
AGA GGG T,プローブ2:CTC TGG TGA AGG AGC T
CA GGC TGC TCA GAC TGC ACC TGT TCA AGA A
GG,プローブ3:TGC TGG TGA GGG AGC TCA AGC TG
C TCA GGC TGC ACC TGT TCA AGA GGG TGC。
んでいる。最小５個のミスマッチ塩基を含む１領域を選
ぶことにより、プライマー間領域をまず増幅し、つぎに
増幅されたプローブを特定配列のプローブで探査すると
ころのアッセイ法においてB.burgdorferiの３つの亜群
を区別できる３種のプローブを得た。３種のプローブの
配列は次の通りである：プローブ1:CTC TGG TGA GGG
AGC TCA AAC TGC TCA GGC TGC ACC GGT TCA
AGA GGG T,プローブ2:CTC TGG TGA AGG AGC T
CA GGC TGC TCA GAC TGC ACC TGT TCA AGA A
GG,プローブ3:TGC TGG TGA GGG AGC TCA AGC TG
C TCA GGC TGC ACC TGT TCA AGA GGG TGC。
第１表は、上記の対応するプローブの各々によって特異
的に検出されるB.burgdorferi株の個々の亜群を示す。
第２表は、３亜群プローブの配列を示す。
的に検出されるB.burgdorferi株の個々の亜群を示す。
第２表は、３亜群プローブの配列を示す。
出願人（発明者）らは、上記特定の諸配列が、フラジェ
リン遺伝子の実質的に対応する各領域についてミスマッ
チ塩基の度合が極大となって、得られるアッセイが厳格
なものとなるため、とくに好ましいことを見出してい
る。しかし、アッセイの特異性を悪影響を与えないよう
な僅かな、重要でない塩基置換を行ってもよいことは明
らかであろう。かかる微細な配列変更は、本明細書で開
示した配列と均等であると、出願人らは考える。
リン遺伝子の実質的に対応する各領域についてミスマッ
チ塩基の度合が極大となって、得られるアッセイが厳格
なものとなるため、とくに好ましいことを見出してい
る。しかし、アッセイの特異性を悪影響を与えないよう
な僅かな、重要でない塩基置換を行ってもよいことは明
らかであろう。かかる微細な配列変更は、本明細書で開
示した配列と均等であると、出願人らは考える。
これらプローブを、分子として、シグナル発生手段と組
合せると、それらが結合する標的配列にタグ（標識）を
付けることのできる、すなわち直接的にあるいは間接的
にシグナルを発しうるオリゴヌクレオチドトレーサーと
なる。かかるトレーサーは、放射性分子あるいは酵素に
結合されたプローブであってもよく、それが便利であ
る。トレーサーが標的にハイブリダイズすると、その二
重鎖デュープレックスは、慣用の分離手法によってハイ
ブリダイズしていないトレーサーから分離でき、結合放
射能の量はシンチレーションカウンターまたはガンマー
カウンターで測定できる。ハイブリダイズした酵素結合
トレーサーの分離にも、同様の慣用の分離手法を用いう
る。酵素結合デュープレックスが分離されると、比色用
または蛍光測定用の基質を加え、慣用の機器によってシ
グナルを検出する。当業者に既知の他のシグナル発生系
としては、McCapraら、Chemiluminescence and Biolu
minescence,Plenum Press,N.Y.（1973）に記載されて
いるごとき、アクリジニウムエステル類またはジオキセ
タン類を用いる化学発光法、蛍光アッセイなどの蛍光標
識（タグ）あるいはビオチン結合プローブが挙げられ
る。
合せると、それらが結合する標的配列にタグ（標識）を
付けることのできる、すなわち直接的にあるいは間接的
にシグナルを発しうるオリゴヌクレオチドトレーサーと
なる。かかるトレーサーは、放射性分子あるいは酵素に
結合されたプローブであってもよく、それが便利であ
る。トレーサーが標的にハイブリダイズすると、その二
重鎖デュープレックスは、慣用の分離手法によってハイ
ブリダイズしていないトレーサーから分離でき、結合放
射能の量はシンチレーションカウンターまたはガンマー
カウンターで測定できる。ハイブリダイズした酵素結合
トレーサーの分離にも、同様の慣用の分離手法を用いう
る。酵素結合デュープレックスが分離されると、比色用
または蛍光測定用の基質を加え、慣用の機器によってシ
グナルを検出する。当業者に既知の他のシグナル発生系
としては、McCapraら、Chemiluminescence and Biolu
minescence,Plenum Press,N.Y.（1973）に記載されて
いるごとき、アクリジニウムエステル類またはジオキセ
タン類を用いる化学発光法、蛍光アッセイなどの蛍光標
識（タグ）あるいはビオチン結合プローブが挙げられ
る。
とくに興味があるのは、フルオレセイン標識プローブが
その標的にハイブリダイズしたときの偏光の増加を測定
する蛍光偏光法（FP）の応用である。この検出系の重要
性は、未結合のトレーサーをまず分離することなく、ト
レーサーが標的にアニールすると直ちに検出を行えるこ
とである。この検出法は、後記の実施例２により詳細に
記載されている。
その標的にハイブリダイズしたときの偏光の増加を測定
する蛍光偏光法（FP）の応用である。この検出系の重要
性は、未結合のトレーサーをまず分離することなく、ト
レーサーが標的にアニールすると直ちに検出を行えるこ
とである。この検出法は、後記の実施例２により詳細に
記載されている。
本発明のプライマーおよびプローブを使用して、生体由
来試料中のB.burgdorferiの診断検出法を都合よく構成
する。かかるバイオアッセイ法では、適切な配列の精
製、クローニングされた遺伝子断片を採用してもよい
が、最良のプライマーおよびプライマー源は慣用のオリ
ゴヌクレオチド合成法によるものである。関心の持たれ
る生体由来試料としては、ライム病症候群に関係あると
された皮膚パンチバイオプシー検体、血液および血液画
分、脳背髄液、身体組織画分がある。パンチバイオプシ
ー試料のための諸手法はBergerら、J.Am.Acad.Dermato
l.,13:444（1986）に記載されている。血液からのスピ
ロヘータの分離は、Benachら、N.Eng.J.Med.,308:740
（1983）に記載されている。脳背髄液からのスピロヘー
タの分離は、Karlsonら、J.Clin.Microbiol.,28:473（1
990）に記載されている。他の組織からの分離も文献に
記載されている。
来試料中のB.burgdorferiの診断検出法を都合よく構成
する。かかるバイオアッセイ法では、適切な配列の精
製、クローニングされた遺伝子断片を採用してもよい
が、最良のプライマーおよびプライマー源は慣用のオリ
ゴヌクレオチド合成法によるものである。関心の持たれ
る生体由来試料としては、ライム病症候群に関係あると
された皮膚パンチバイオプシー検体、血液および血液画
分、脳背髄液、身体組織画分がある。パンチバイオプシ
ー試料のための諸手法はBergerら、J.Am.Acad.Dermato
l.,13:444（1986）に記載されている。血液からのスピ
ロヘータの分離は、Benachら、N.Eng.J.Med.,308:740
（1983）に記載されている。脳背髄液からのスピロヘー
タの分離は、Karlsonら、J.Clin.Microbiol.,28:473（1
990）に記載されている。他の組織からの分離も文献に
記載されている。
トレーサーハイブリダイゼーションに先立つ増幅段階を
実施するためには、核酸を抽出して、それらを利用でき
るようにすることが必要である。生体由来試料から核酸
を得るための抽出法は当該技術分野で周知であり、本発
明のバイオアッセイの実施に当っては常法と考えられ
る。たとえば、Keller ＆ Manak,DNA Probes,第２章
“Sample Preparation"が、オリジナル文献の引用を含
めて、多くの標準的方法を極めて詳細に提示している。
さらに変性によって核酸を標準することも通常のもの
で、pHまたは塩濃度の操作あるいは加熱によって行いう
る。
実施するためには、核酸を抽出して、それらを利用でき
るようにすることが必要である。生体由来試料から核酸
を得るための抽出法は当該技術分野で周知であり、本発
明のバイオアッセイの実施に当っては常法と考えられ
る。たとえば、Keller ＆ Manak,DNA Probes,第２章
“Sample Preparation"が、オリジナル文献の引用を含
めて、多くの標準的方法を極めて詳細に提示している。
さらに変性によって核酸を標準することも通常のもの
で、pHまたは塩濃度の操作あるいは加熱によって行いう
る。
鋳型配列とハイブリダイズすると、ポリメラーゼ媒介鎖
伸張の基質として働くところのプライマーは、変性の前
または後に反応混合物に加えてよく、再生条件へシフト
させるとき、アニールされる。つぎにポリメラーゼを加
え、順次鎖伸張サイクルを起こさせる。PCRでは、DNAta
qポリメラーゼが好ましい。3SRでは、逆転写酵素がまず
RNA/DNAハイブリッドを作り出し、これが、RNAseH消化
およびDNAtaqポリメラーゼによる再重合を行うとき、DN
A依存生ポリメラーゼにより反復的に転写される。増幅
されプローブ探査された核酸の検出法は既に記載した。
伸張の基質として働くところのプライマーは、変性の前
または後に反応混合物に加えてよく、再生条件へシフト
させるとき、アニールされる。つぎにポリメラーゼを加
え、順次鎖伸張サイクルを起こさせる。PCRでは、DNAta
qポリメラーゼが好ましい。3SRでは、逆転写酵素がまず
RNA/DNAハイブリッドを作り出し、これが、RNAseH消化
およびDNAtaqポリメラーゼによる再重合を行うとき、DN
A依存生ポリメラーゼにより反復的に転写される。増幅
されプローブ探査された核酸の検出法は既に記載した。
ハイブリダイズされた放射活性トレーサーを検出すると
くに有力な方法は、核酸増幅の生成物をアガロース電気
泳動に付し、Pall Biodyne Ｂなどのナイロン膜の核
酸バンドを移行させ、続いてシグナル発生プローブとハ
イブリダイズさせるもので、標準的サザンブロットアッ
セイにおけるものである〔Southern,J.Mol.Biol.,98:50
3（1975）〕。特異的ハイブリダイゼーションの領域を
つぎに、プロローブ探査された核酸のオートラジオグラ
フィーによって可視化する。
くに有力な方法は、核酸増幅の生成物をアガロース電気
泳動に付し、Pall Biodyne Ｂなどのナイロン膜の核
酸バンドを移行させ、続いてシグナル発生プローブとハ
イブリダイズさせるもので、標準的サザンブロットアッ
セイにおけるものである〔Southern,J.Mol.Biol.,98:50
3（1975）〕。特異的ハイブリダイゼーションの領域を
つぎに、プロローブ探査された核酸のオートラジオグラ
フィーによって可視化する。
かくして、本発明のバイオアッセイでは、B.burgdorfer
i核酸と疑われる配列を含有する生体由来試料から核酸
を抽出し、鞭毛の開放型読み枠をコードする核酸の半保
存領域のフランキング（隣りの）配列に対して相補鎖特
異生をもつプライマー対の存在下に変性して、プライマ
ーを相補鎖配列にハイブリダイズさせ、核酸増幅技法に
よって該半保存領域を増幅し、増幅された半保存領域
を、B.burgdorferiの鞭毛遺伝子の開放型読み枠の一配
列と実質的に相同であるが、B.hermsiiの対応する配列
とは最大70％しか相同ではない配列を有するオリゴヌク
レオチドトレーサーとハイブリダイズさせ、該トレーサ
ーのシグナル発生手段を発するシグナルを検出する。
i核酸と疑われる配列を含有する生体由来試料から核酸
を抽出し、鞭毛の開放型読み枠をコードする核酸の半保
存領域のフランキング（隣りの）配列に対して相補鎖特
異生をもつプライマー対の存在下に変性して、プライマ
ーを相補鎖配列にハイブリダイズさせ、核酸増幅技法に
よって該半保存領域を増幅し、増幅された半保存領域
を、B.burgdorferiの鞭毛遺伝子の開放型読み枠の一配
列と実質的に相同であるが、B.hermsiiの対応する配列
とは最大70％しか相同ではない配列を有するオリゴヌク
レオチドトレーサーとハイブリダイズさせ、該トレーサ
ーのシグナル発生手段を発するシグナルを検出する。
本発明のその他の利点は、以下の実施例から明らかにな
るであろう。
るであろう。
実施例１ B.hermsiiおよびB.burgdorferiは、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクションから、それぞれ受入れ番号ATCC35
209およびATCC35210のものを入手した。細菌を増殖さ
せ、回収し、常法によってDNAを抽出した。染色体DNAを
制限酵素Sau3Aを用いて部分消化し、断片をアガロース
のゲル電気泳動により特性決定した。９〜23bpの適当な
大きさの断片の付着端を、dGTPおよびdATPの存在下に部
分的に埋め（フィルインし）た。この材料をつぎにその
まま、制限酵素XhoIで消化しかつdTTPおよびdCTPで部分
的にフィルインしたラムダGEM11ベクターに、クローン
化した。
ルチャーコレクションから、それぞれ受入れ番号ATCC35
209およびATCC35210のものを入手した。細菌を増殖さ
せ、回収し、常法によってDNAを抽出した。染色体DNAを
制限酵素Sau3Aを用いて部分消化し、断片をアガロース
のゲル電気泳動により特性決定した。９〜23bpの適当な
大きさの断片の付着端を、dGTPおよびdATPの存在下に部
分的に埋め（フィルインし）た。この材料をつぎにその
まま、制限酵素XhoIで消化しかつdTTPおよびdCTPで部分
的にフィルインしたラムダGEM11ベクターに、クローン
化した。
つぎに、ラムダライブラリーを、E.coli LE392を宿主
として平板培養した。プレートから、Pall BiodyneB膜
を用いてプラークを拾い上げ、サザンブロット分析にお
ける通り、ハイブリダイゼーションによってスクリーニ
ングした。Gassmanら、Nuc.Acids Res.,17:3590（198
9）が報告している通りのB.burgdorferiの既知の配列か
らランダムに調製した合成プライマーを用いて、B.burg
dorferiおよびB.hermsiiから導いた鋳型を増幅させた。
一例では、B.burgdorferiからの300bp断片を生じさせる
のに用いた一プライマー対が、予期しないことに、B.hr
emsiiの増幅に用いたときには、300bpのかすかなバンド
を生じた。このかすかなバンドは、フラジェリン遺伝子
内の、その他の点ではB.burgdorferiとは比較的非相同
の領域がわずかに増幅されたことを証明した。この断片
をプローブとして用いると、遺伝子のこの部分を含むラ
ムダクローンを同定することができた。これらのクロー
ンから制限地図を作成し、構築物の配列を決定して、第
１図に示す非相同配列の正しい配列が得られた。
として平板培養した。プレートから、Pall BiodyneB膜
を用いてプラークを拾い上げ、サザンブロット分析にお
ける通り、ハイブリダイゼーションによってスクリーニ
ングした。Gassmanら、Nuc.Acids Res.,17:3590（198
9）が報告している通りのB.burgdorferiの既知の配列か
らランダムに調製した合成プライマーを用いて、B.burg
dorferiおよびB.hermsiiから導いた鋳型を増幅させた。
一例では、B.burgdorferiからの300bp断片を生じさせる
のに用いた一プライマー対が、予期しないことに、B.hr
emsiiの増幅に用いたときには、300bpのかすかなバンド
を生じた。このかすかなバンドは、フラジェリン遺伝子
内の、その他の点ではB.burgdorferiとは比較的非相同
の領域がわずかに増幅されたことを証明した。この断片
をプローブとして用いると、遺伝子のこの部分を含むラ
ムダクローンを同定することができた。これらのクロー
ンから制限地図を作成し、構築物の配列を決定して、第
１図に示す非相同配列の正しい配列が得られた。
代表的な一実験で、第１図に示したプライマーを用い
て、30サイクルのPCRによってプライマー間領域の増幅
を行った。つぎに増幅生成物を次の通り分析した：アガ
ロースゲルで電気泳動し、続いてサザンブロット分析を
行った。第２図において、左のパネルは、アガロースゲ
ル電気泳動のパターンを示す。中央下方に一緒に見られ
る２つのバンドは、OspA遺伝子の増幅を利用する増幅試
験では陰性であった１菌株を含むB.burgdorferiの独立
した２株の増幅生成物に対応している。各々の場合に、
分子の大きさが、標的とした正しい領域の増幅に対して
予期される大きさに相当していることが明らかである。
対照は全て陰性である。対照についてゲルの他のセグメ
ントで見られる小さいバンドが非特異性増幅を表わして
いることを確認するために、第２図の右のパネルに示し
たように、ゲルをサザンブロット分析に付した。移行さ
せた核酸を、第１図に示した配列を含むトレーサーによ
って探査した。結果は、このアッセイの特異性を確認し
ている。
て、30サイクルのPCRによってプライマー間領域の増幅
を行った。つぎに増幅生成物を次の通り分析した：アガ
ロースゲルで電気泳動し、続いてサザンブロット分析を
行った。第２図において、左のパネルは、アガロースゲ
ル電気泳動のパターンを示す。中央下方に一緒に見られ
る２つのバンドは、OspA遺伝子の増幅を利用する増幅試
験では陰性であった１菌株を含むB.burgdorferiの独立
した２株の増幅生成物に対応している。各々の場合に、
分子の大きさが、標的とした正しい領域の増幅に対して
予期される大きさに相当していることが明らかである。
対照は全て陰性である。対照についてゲルの他のセグメ
ントで見られる小さいバンドが非特異性増幅を表わして
いることを確認するために、第２図の右のパネルに示し
たように、ゲルをサザンブロット分析に付した。移行さ
せた核酸を、第１図に示した配列を含むトレーサーによ
って探査した。結果は、このアッセイの特異性を確認し
ている。
第二の実験は、増幅されたB.burgdorferiおよび対照DNA
を、５′GAGCTCCCTCACCAGAGAAADなる配列をもち、５′
末端にフルオレセインを結合させたプローブとのハイブ
リダイゼーションによる均質アッセイにおいて蛍光偏光
法により分析した。プローブ混合物は、SSPE緩衝液〔Sa
mbrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory（198
9）〕1.4ml、3.2M Tris−HCl ７μ、プローブ結合
物250fmolおよびホルムアミド200μを含有していた。
別の試験管で、PCRにより増幅された材料の試料の0.1M
NaOH中、55℃で15分間変性した。つぎに試料をプロー
ブ混合物に加え、蛍光偏光計を用いて72分間にわたり蛍
光偏光の読みを記録した。
を、５′GAGCTCCCTCACCAGAGAAADなる配列をもち、５′
末端にフルオレセインを結合させたプローブとのハイブ
リダイゼーションによる均質アッセイにおいて蛍光偏光
法により分析した。プローブ混合物は、SSPE緩衝液〔Sa
mbrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory（198
9）〕1.4ml、3.2M Tris−HCl ７μ、プローブ結合
物250fmolおよびホルムアミド200μを含有していた。
別の試験管で、PCRにより増幅された材料の試料の0.1M
NaOH中、55℃で15分間変性した。つぎに試料をプロー
ブ混合物に加え、蛍光偏光計を用いて72分間にわたり蛍
光偏光の読みを記録した。
結果を第３図にグラフで示したが、それらは、B.burgdo
rferi試料（それぞれATCC＃35210およびATCC＃35211と
呼ぶ）について特異偏光が定性的に検出されることを示
している。対照は陰性である（ATCC＃35209、B.hermsi
i;ATCC＃43381、B.coriacae）。第４図は72分後の値と
実質的に時間ゼロのときの値とのMP（ミリ偏光単位）の
差を棒グラフで示しているが、FPが、均質フォーマット
において、増幅された標的配列を特異的に同定できるこ
とが明らかである。
rferi試料（それぞれATCC＃35210およびATCC＃35211と
呼ぶ）について特異偏光が定性的に検出されることを示
している。対照は陰性である（ATCC＃35209、B.hermsi
i;ATCC＃43381、B.coriacae）。第４図は72分後の値と
実質的に時間ゼロのときの値とのMP（ミリ偏光単位）の
差を棒グラフで示しているが、FPが、均質フォーマット
において、増幅された標的配列を特異的に同定できるこ
とが明らかである。
実施例２ 第１表に列挙した一連のB.burgdorferi株からDNAを抽出
した。複製連鎖反応（PCR）を、実施例１に述べたプラ
イマーを用いて、上記の通りに行った。第１表に示した
B.burgdorferiの亜群１をB31と名付ける。亜群２をP/B
i、亜群３をP/St0と呼ぶ。上記の配列をもつプローブ１
〜３は、それぞれ亜群B31、P/St0およびP/Biに特異的で
ある。
した。複製連鎖反応（PCR）を、実施例１に述べたプラ
イマーを用いて、上記の通りに行った。第１表に示した
B.burgdorferiの亜群１をB31と名付ける。亜群２をP/B
i、亜群３をP/St0と呼ぶ。上記の配列をもつプローブ１
〜３は、それぞれ亜群B31、P/St0およびP/Biに特異的で
ある。
実施例１で述べた方法に従って、ハイブリダイゼーショ
ンを行い、ハイブリダイゼーション生成物をゲル電気泳
動により分析した。第５図Ａ図は、各々の増幅され電気
泳動された試料に対応するバンドを示している。ゲルの
バンドをつぎに膜上へサザンブロットし、32P標識プロ
ーブ１〜３を用いて探査した。膜を２×SSC緩衝液中で3
0分間２回、続いて0.2×SSC緩衝液中で30分間２回洗浄
した。洗浄温度は67.3℃（B31群プローブ）、68.3℃（P
/St0群プローブ）、65.8℃（P/Bi群プローブ）であっ
た。サザンブロット法のそれ以上の詳細は、Picken,Bio
Technique,9:412（1990）に述べられている。第5B、Ｃ
およびＤ図に示した結果は、各プローブが、第１表に示
したB.burgdorferiの対応する亜群に対して完全な特異
性をもつことを示している。
ンを行い、ハイブリダイゼーション生成物をゲル電気泳
動により分析した。第５図Ａ図は、各々の増幅され電気
泳動された試料に対応するバンドを示している。ゲルの
バンドをつぎに膜上へサザンブロットし、32P標識プロ
ーブ１〜３を用いて探査した。膜を２×SSC緩衝液中で3
0分間２回、続いて0.2×SSC緩衝液中で30分間２回洗浄
した。洗浄温度は67.3℃（B31群プローブ）、68.3℃（P
/St0群プローブ）、65.8℃（P/Bi群プローブ）であっ
た。サザンブロット法のそれ以上の詳細は、Picken,Bio
Technique,9:412（1990）に述べられている。第5B、Ｃ
およびＤ図に示した結果は、各プローブが、第１表に示
したB.burgdorferiの対応する亜群に対して完全な特異
性をもつことを示している。
実施例３ さらに一連の実験において、B.burgdorferiについて記
載したものに相当する位置でB.hermsiiの一配列に隣る
相補鎖特異性プライマー対を用いて、１群のBorreliaか
らDNAを増幅させた。第一のオリゴヌクレオチドプライ
マーは、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の390〜770
番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８〜32塩基を
含む配列よりなる群から選んだ。第二のオリゴヌクレオ
チドプライマーは、第一のプライマーの５′末端から約
35〜55ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖上にあり、B.
burgdorferiの対応する配列とは70％以下の相同性しか
もたない約８〜32ヌクレオチドを含む配列よりなる群か
ら選んだ。
載したものに相当する位置でB.hermsiiの一配列に隣る
相補鎖特異性プライマー対を用いて、１群のBorreliaか
らDNAを増幅させた。第一のオリゴヌクレオチドプライ
マーは、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の390〜770
番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８〜32塩基を
含む配列よりなる群から選んだ。第二のオリゴヌクレオ
チドプライマーは、第一のプライマーの５′末端から約
35〜55ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖上にあり、B.
burgdorferiの対応する配列とは70％以下の相同性しか
もたない約８〜32ヌクレオチドを含む配列よりなる群か
ら選んだ。
これらの実験に用いたプライマーを第９図に示す。
これらのプライマーは、B.parkeriおよびB.turicataeに
加えて、試験した全てのB.hermsii株を増幅させた。B.p
arkeriおよびB.turicataeの増幅されたDNAの配列を血清
したところ、これらの微生物については、B.hermsiiと
比較して、プライマー間配列に差が認められた。これら
の差を第７図に示す。第７図で太字で示した配列を選ん
でプローブを構築した。ゲル電気泳動後、増幅されたバ
ンドを膜に移し、このプローブを用いてサザンブロッテ
ィングを行った。全ての操作は前記両実施例に示した通
りであったが、B.hermsiiプローブの場合の洗浄温度は5
7.7℃、B.parkeri/ruricataeプローブ（第７図に、B.he
rmsii（HS1）の太字で示されており、これらの株（park
およびtri）がHS1と異なるヌクレオチドの位置では太字
で置換してある）の場合の洗浄温度は62.0℃であった。
加えて、試験した全てのB.hermsii株を増幅させた。B.p
arkeriおよびB.turicataeの増幅されたDNAの配列を血清
したところ、これらの微生物については、B.hermsiiと
比較して、プライマー間配列に差が認められた。これら
の差を第７図に示す。第７図で太字で示した配列を選ん
でプローブを構築した。ゲル電気泳動後、増幅されたバ
ンドを膜に移し、このプローブを用いてサザンブロッテ
ィングを行った。全ての操作は前記両実施例に示した通
りであったが、B.hermsiiプローブの場合の洗浄温度は5
7.7℃、B.parkeri/ruricataeプローブ（第７図に、B.he
rmsii（HS1）の太字で示されており、これらの株（park
およびtri）がHS1と異なるヌクレオチドの位置では太字
で置換してある）の場合の洗浄温度は62.0℃であった。
このプローブの配列は、本質的に、606〜633番ヌクレオ
チドからのコア配列を含んでいるが、ハイブリッド形成
を安定化するために、あるいは洗浄操作の厳格さを調整
するために、各末端に塩基を府下してもよい。かくし
て、好ましいプローブは、32Pなどのシグナル発生手段
に結合された配列TGC AGG TGA AGG CGC TCA GGC
TGC Ｔ CCA GTG CAA GAG ATAのオリゴヌクレオ
チドを包含する。
チドからのコア配列を含んでいるが、ハイブリッド形成
を安定化するために、あるいは洗浄操作の厳格さを調整
するために、各末端に塩基を府下してもよい。かくし
て、好ましいプローブは、32Pなどのシグナル発生手段
に結合された配列TGC AGG TGA AGG CGC TCA GGC
TGC Ｔ CCA GTG CAA GAG ATAのオリゴヌクレオ
チドを包含する。
第７図で太字で示したB.hermsiiのヌクレオチド配列を
用いるとき、B.hermsiiの鑑別同定が可能であった。第
８図に示したサザンブロット分析は、このプローブの高
い特異性を確証している。このことは、回帰熱を惹起す
るB.hermsiiをライム病の原因因子から、また動物疾患
を惹起するBorrelia菌から、区別できるという点で、臨
床上重要である。
用いるとき、B.hermsiiの鑑別同定が可能であった。第
８図に示したサザンブロット分析は、このプローブの高
い特異性を確証している。このことは、回帰熱を惹起す
るB.hermsiiをライム病の原因因子から、また動物疾患
を惹起するBorrelia菌から、区別できるという点で、臨
床上重要である。
第５図の説明の索引 Borrelia burgdorferi 1.＊B31〔ATCC ＃35210〕 2. IRS〔ATCC ＃35211〕 3. 毒性 MM1 4. 毒性 MMT1 5. 毒性 I.pacificus 6. N40 7. Son 328 8. DN127 9. ミネソタマウス 10. Lake 339 11. フランス 20001 12. CD16 13. VS215 14. NE56 15. Millbrook 25015 16. P/St0 17. P/Gu 18. P/Bi 19. ドイツマダニ分離株 20. 123塩基対はしご形分子量マーカー 21. G2 22. VS3 23. VS185 Borrrlia hermsii 24. HS1〔ATCC ＃35209〕 25. Frogner 26. YOR−１ 27. CON−１ 28. MAN−１ 29. B.parkeri 30. B.turicatae 31. B.crocidurae 32. B.anserina 33. B.coriaceae 34. Treponema pallidum 35. Treponema pectinovorum 36. Treponema phapedenis 37. Leptospira interogans SV.icterohemorrhagiae 38. Leptospira inadei SV.lyme 39. 蒸留水対照 40. 123塩基対分子量マーカー ＊ ゲルレーン番号 第８図の説明 第８図は、B.hermsiiのフラジェリン遺伝子から誘導し
た配列を用いて、15種の異なるBorrelia株および他の５
株のスピロヘータから増幅を行った結果を示す。ゲルの
写真8A〜8Dの各々における左から右へ向かっての菌株の
順序は上記／下記に列挙されている。
た配列を用いて、15種の異なるBorrelia株および他の５
株のスピロヘータから増幅を行った結果を示す。ゲルの
写真8A〜8Dの各々における左から右へ向かっての菌株の
順序は上記／下記に列挙されている。
8A。B.hermsiiプライマー対を用いて増幅後の18菌株か
らのPCR生成物のアガロースゲル。B.hermsii、B.parker
i、B.turicatae、B.crocidurae、B.anserinaおよびB.co
riaceaeの場合にのみ、増幅が見られる。
らのPCR生成物のアガロースゲル。B.hermsii、B.parker
i、B.turicatae、B.crocidurae、B.anserinaおよびB.co
riaceaeの場合にのみ、増幅が見られる。
8B.B.hermsiiのフラジェリン遺伝子配列から誘導したオ
リゴヌクレオチドプローブで探査後の、第8A図に示した
ゲルのサザンブロット。
リゴヌクレオチドプローブで探査後の、第8A図に示した
ゲルのサザンブロット。
8C。8Bで用いた、ただし２つの冗長分を含むオリゴヌク
レオチドプローブで探査後の、第8A図に示したゲルのサ
ザンブロット。
レオチドプローブで探査後の、第8A図に示したゲルのサ
ザンブロット。
8D。B.JparkeriおよびB.turicataeのフラジェリン遺伝
子配列から誘導したオリゴヌクレオチドプローブで探査
後の、第8A図に示したゲルのサザンブロット。
子配列から誘導したオリゴヌクレオチドプローブで探査
後の、第8A図に示したゲルのサザンブロット。
第８図の説明の索引 1.＊B.burgdorferi B31 2. B.burgdoferi P/St0 3. B.burgdoferi P/Bi 4. B.hermsii HS1 5. B.hermsii Frogner 6. B.hermsii YOR−１ 7. B.hermsii CON−１ 8. B.hermsii MAN−１ 9. B.parkeri 10. B.turicatae 11. B.crocidurae 12. B.anserina 13. B.coriaceae 14. B.pallidum 15. T.phagedenis 16. T.denticola 17. L.interogans SV.icterohemorrhagiae 18. L.inadei SV.lyme 19. 蒸留水対照 20. 123塩基対分子量マーカー ＊ ゲルレーン番号
Claims (7)
- 【請求項１】核酸増幅技法により増幅されるべきB.burg
dorferiの一配列に隣接するところの相補鎖特異性プラ
イマー対であって、 フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の390番〜770番ヌク
レオチドからの約８〜32個の実質的に連続した塩基を含
む諸配列よりなる群から選ばれた第一のオリゴヌクレオ
チドおよび 該第一のプライマーの５′末端から約35〜55ヌクレオチ
ドの間隔を置いて相補鎖上にあり、B.hermsiiの対応す
る配列との相同性が70％以下である約８〜32個の実質的
に連続した塩基を含む諸配列よりなる群からなる第二の
オリゴヌクレオチド からなる該プライマー対。 - 【請求項２】B.burgdorferiのフラジェリン遺伝子の開
放型読み枠の配列に対して実質的に相同であるが、B.he
rmsiiの対応する配列に対しては相同性が70％以下であ
るオリゴヌクレオチドプローブ配列および 該プローブに結合したシグナル手段 よりなるB.burgdorferiターゲット配列検出用オリゴヌ
クレオチドトレーサー。 - 【請求項３】生体由来試料中のB.burgdorferiを検出す
るためのバイオアッセイ法であって、 核酸画分を抽出し、 フラジェリンの開放型読み枠をコードする核酸の半保存
領域のフランキング配列に対して相補鎖特異性のプライ
マー対の存在下に核酸類を変性し、 該プライマー対を該相補鎖配列にハイブリダイズさせ、 核酸増幅技法によってプライマー間配列を増幅させ、 増幅されたプライマー間配列を、B.burgdorferiのフラ
ジェリンの開放型読み枠の対応配列に実質的に相同であ
るが、B.hermsiiの対応配列に対しては約70％以下の相
同性しかもたない配列をもつプローブとこれに結合され
たシグナル発生手段とからなるオリゴヌクレオチドトレ
ーサーとハイブリダイズさせ、 該ハイブリダイズされたトレーサーに結合されている該
シグナル発生手段が発するシグナルを検出すること を特徴とする前記バイオアッセイ法。 - 【請求項４】B.burgdorferiの核酸配列を検出するため
の実質的な均質アッセイ法であって、 鞭毛開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のフラ
ンキング配列に対して相補鎖特異性のプライマー対の存
在下に核酸配列を変性し、 該プライマーを該相補配列にハイブリダイズさせ、 核酸増幅技法によってプライマー間配列を増幅し、 増幅されたプライマー間配列を、B.burgdorferiのフラ
ジェリンの開放型読み枠の対応配列に実質的に相同であ
るが、B.hermsiiの相当する配列とは約70％以下の相同
性しかもたない配列を有するプローブとこれに結合され
た蛍光標識とからなるオリゴヌクレオチドトレーサーと
ハイブリダイズさせ、 蛍光偏光の増加を測定すること を特徴とする前記アッセイ法。 - 【請求項５】CTC TGG TGA GGG AGC TCA AAC TGC
TCA GGC TGC ACC GGT TCA AGA GGG T,CTC T
GG TGA AGG AGC TCA GGC TGC TCA GAC TGC A
CC TGT TCA AGA AGGおよびTGC TGG TGA GGG AG
C TCA AGC TGC TCA GGC TGC ACC TGT TCA AG
A GGG Ｔからなる群より選ばれた配列をもつオリゴヌ
クレオチドプローブと 該プローブに結合されたシグナル手段とからなる、B.bu
rgdorferi亜群検出用オリゴヌクレオチドトレーサー。 - 【請求項６】核酸増幅技法によって増幅されるべきB.he
rmsiiの一配列に隣接するところの相補鎖特異性プライ
マー対であって、 フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の390番〜770番ヌク
レオチドからの約８〜32個の実質的に連続した塩基を含
む諸配列よりなる群から選ばれた第一のオリゴヌクレオ
チドおよび 該第一のプライマーの５′末端から約35〜55ヌクレオチ
ドの間隔を置いて相補鎖にあり、B.burgdorferiの対応
する配列との相同性が70％以下である約８〜32個の実質
的に連続した塩基を含む諸配列よりなる群から選ばれた
第二のオリゴヌクレオチド からなる該プライマー対。 - 【請求項７】B.hermsiiフラジェリン遺伝子の開放型読
み枠の606番ヌクレオチドから633番ヌクレオチドにわた
るコア配列を有するオリゴヌクレオチドプローブと シグナル発生手段と からなる、B.hermsiiの特異的検出のためのオリゴヌク
レオチドトレーサー。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53895790A | 1990-06-15 | 1990-06-15 | |
| US69118891A | 1991-04-25 | 1991-04-25 | |
| US691,188 | 1991-04-25 | ||
| US538,957 | 1991-04-25 | ||
| PCT/US1991/004190 WO1991019814A2 (en) | 1990-06-15 | 1991-06-12 | Dna probes and primers for detection of b. burgdorferi using the polymerase chain reaction |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6180705A Division JP2657628B2 (ja) | 1990-06-15 | 1994-07-08 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリの亜群を検出するためのｄｎａ変異配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05501652A JPH05501652A (ja) | 1993-04-02 |
| JPH074276B2 true JPH074276B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=27065973
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3511770A Expired - Lifetime JPH074276B2 (ja) | 1990-06-15 | 1991-06-12 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマー |
| JP6180705A Expired - Lifetime JP2657628B2 (ja) | 1990-06-15 | 1994-07-08 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリの亜群を検出するためのｄｎａ変異配列 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6180705A Expired - Lifetime JP2657628B2 (ja) | 1990-06-15 | 1994-07-08 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリの亜群を検出するためのｄｎａ変異配列 |
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| JP (2) | JPH074276B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1993003184A1 (en) * | 1991-08-09 | 1993-02-18 | Mccann Associates, Inc. | Method for detecting lyme disease and composition |
| US5932220A (en) * | 1995-05-08 | 1999-08-03 | Board Of Regents University Of Texas System | Diagnostic tests for a new spirochete, Borrelia lonestari sp. nov. |
| WO2003029450A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-10 | Københavns Universitet | Nucleic acid sequences encoding lysk from different borrelia strains and uses thereof |
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