JPH0743378B2 - 可溶性および沈澱性ｈｒｐ―ｅｌｉｓａ用のｔｍｂ試薬 - Google Patents

可溶性および沈澱性ｈｒｐ―ｅｌｉｓａ用のｔｍｂ試薬

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JPH0743378B2
JPH0743378B2 JP2515721A JP51572190A JPH0743378B2 JP H0743378 B2 JPH0743378 B2 JP H0743378B2 JP 2515721 A JP2515721 A JP 2515721A JP 51572190 A JP51572190 A JP 51572190A JP H0743378 B2 JPH0743378 B2 JP H0743378B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般的にはELISAの分野に属するものであ
り、そしてさらに詳しくは、改良された発色性（chromo
genic）の溶液に関する。
酵素標識免疫吸着アッセイ、すなわちELISAは、生物分
子（biomolecules）の定性的および定量的アッセイの両
方に用いられており、よく受け入れられ、そして広く利
用されている方法である。このアッセイの一つの実施態
様では、測定しようとする分子に対する抗体に、酵素を
標識させ、そして次にその酵素に対する発色性の基質と
組み合せて、着色した反応生成物を得る。測定しようと
する分子は、試験管あるいはフィルターメンブランのよ
うな固相に固定する。例えば、J.Immunoassay ２（３
＆４）,187−204（1981）に記述されれているように、
セイヨウワサビペルオキシダーイーゼ（HRP）を化学的
に抗体に結合させ、その複合体と、過酸化尿素のような
発色性の基質、過酸化尿素が酸化されると変色する色原
体、および例えば、0.03Mクエン酸−酢酸あるいは0.1M
クエン酸−リン酸、pH5.0のような適切な緩衝剤を含む
溶液とインキュベートする。着色する生成物の形成は、
定性的に観察し得るか、あるいは分光光度計で吸光度を
定量的に促成し得る。色の形成の速度および程度は抗原
の濃度に比例する。このアッセイには、異なる酵素およ
び発色性の酵素基質を用いる様々な他の方法がある。
現在、HRP用の最も高感度の色原体は、E.S.Bosら（J.Im
munoassay ２（３＆４）,187−204（1981））が初めて
発表した3,3′,5,5′−テトラメチレベンジジン（TMB）
である。他のベンジジン化合物と異なって、この誘導体
は、エイムス試験により測定された通り、変異性ではな
い。水溶液に比較的不溶性であるTMBは、低アルコー
ル、ジエチルエーテルおよび芳香族溶媒に溶解された時
よりも、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（DMF）、
あるいはジメチスルホキシド（DMSO）などのような水に
混和性の（water−miscible）溶媒に先に溶解した時の
方が、最もよく作用する。例えば、Bosら（1981）が述
べたように、TMBは、DMSOに42mMにまで溶解し、そして
0.1M酢酸ナトリウム−クエン酸緩衝液、pH6.0中に希釈
する。この溶液を、複合体を加える直前に、1.3ミリモ
ルの過酸化水素あるいは0.5ミルモルのウレア過酸化水
素と混合し、これによる反応で、溶液は青色に変わる。
酸を添加することによって、反応は停止し、青色から、
標準分光光度計を用いて450nmで測定できる黄色に転換
される。未処理の青色溶液および酸性化した黄色溶液の
両者とも、時間が経つにつれ退色し、記録した吸光度の
みが永久保存できる記録として残る。
HRP複合体のプラスチックあるいは膜に対する非特異的
な結合を減少させてバックグラインドジグナルを減少さ
せることが重要である。このことは一般的に、Antibodi
es. Ａ Laboratory Manual,182−183頁（Cold Spri
ng Harbor,1988）に記述されているように、複合体お
よび基質を加える前に、固相の支持体を炭酸緩衝液（pH
9）あるいはリン酸緩衝液（pH7）のいずれかに溶解した
ウシ血清アルブミン（BSA）あるいはガゼインとインキ
ュベートすることによってなされる。次に、TMB（1mg/m
lのTMB溶液）0.1mlをリン酸緩衝液（9.9ml）に添加し、
反応を測定する。一般的に、濃度が10mM未満のものを、
基質を含有する緩衝液に加える。
TMBの反応生成物は溶液中に沈澱しないため、市販のELI
SAサンプリング装置に使用して「永久保存できる」色の
記録を呈示することができない。しかし、永久保存でき
る記録を呈示するいくつかの試薬が開発されている。例
えば、3,3′−ジアミノベンジドテトラヒドロクロライ
ド（DAB）色原体が赤褐色沈澱物に酸化し、酵素反応の
場所に堆積する。これはイムノブロッティングおよび免
疫組織化学的染色に用いられ得る。しかし、DABは、TMB
より感度が悪く、溶液中で不安定であり、時間が経つに
つれ退色し、そして発がん性である。沈澱物を生ずる市
販のアッセイシステムのもう一つの例は、Kirkegaard＆
Perry Laboratories,Gaithersburg,MD、より市販され
ているTMBを含むシステムである。このシステムはペル
オキシダーゼの基質、およびペルオキシダーゼで標識さ
れた抗体と反応して、ニトロセルロース膜上に青色沈澱
物を生ずる「促進剤」を含有する。
HRP酵素アッセイ用の、高感度で多目的な発色性の基質
システムが必要とされ続けている。さらに、反応容器の
種類に関係なくアッセイの結果の永久保存できる色の記
録を呈示するための、簡易で安定な方法が要求され続け
ている。
本発明の目的は、ELISA方の有用性を高める方法および
組成物を提供することである。この方法では、ポビドン
含有溶媒存在下でTMBを色原体として用い、その結果、
感度が高められ、そしてバックグラウンドが減少する。
本発明の他の目的は、TMBを色原体として用いることに
よって、ELISA法の結果の永久保存できる色の記録を作
成するための方法および組成物を提供することである。
発明の要旨 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン（TMB）の溶解性
を高めるために用いられ、そしてHRPを用いるELISAの結
果の永久保存できる色の記録を作成すための溶媒系が開
発された。この溶媒系では、ポビドンすなわち１−エテ
ニル−２−ピロリジノンポリマーを用いることによっ
て、TMBは非常に少量の溶媒に100mM〜200mMの濃度ま
で、より簡易に溶解し、次にこれを、TMBを沈澱させず
に、さらに水性緩衝液に直接混合し得る。好ましい実施
態様では、TMBが好ましくは0.1％および５％の間のポビ
ドンを含有する有機溶媒中で、適用によって約0.3〜2.0
mMの濃度の範囲で溶解される。HRPのELISA用のこの新規
な溶媒系の利点には、必要とされる高価で有毒な有機溶
媒の量が減少し、感度が増加し、過酸化基質およびTMB
混合後の安定性が高く、そして反応の速度および程度が
増加することが含まれる。
永久保存できる記録を作るために、アルギン酸（AA）、
メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体（MVE/
MAC）、硫酸デキストリン（DS）および／あるいはカラ
ゲナンを、ポビドンを含有および含有しない水性緩衝溶
液に添加すると、反応生成物は着色した沈澱物を形成す
る。好ましい実施態様では、0.1mg/mlおよび10.0mg/ml
の間のポリマーが緩衝液に添加される。
図面の簡単な説明 図１は20分、30分、および40分後の、mIUヒトのコリオ
ゴナドトロピン（hCG）/mlの450nmでの吸光度の比較の
グラフである。第１図Ａは、2.5％ポビドンの存在下、
そして第１図Ｂは、1.25％ポピドンの存在下である。
発明の詳細な説明 1989年11月３日出願の米国特許第07/431,485号に、3,
3′,5,5′−テトラメチルベンジジン（TMB）の溶解性を
高めるために用いられ、そしてHRPを用いるELISAの結果
の永久保存できる色の記録を作成するための溶媒系が開
示された。ポビドンすなわち１−エテニル−２−ピロリ
ジノンポリマーを含有する改善された溶媒系では、TMB
は、非常に少量の溶媒に100〜200mMの濃度まで溶解され
得、次にこれを、TMBを沈澱させずに、さらに水性緩衝
液に直接混合し得る。好ましい実施態様では、TMBは、
好ましくは１％および10％の間のポビドンを含有する有
機溶媒に、適用によって10mMおよび100mMの間の濃度の
範囲で溶解される。HRPのELISA用のこの新規な溶媒系の
利点には、必要とされる高価で有毒な有機溶媒の量が減
少することが含まれる。
永久保存できる記録を作成する溶媒系では、アルギン酸
（AA）、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合
体（MVE/MAC）、硫酸デキストラン（DS）および／ある
いはガラゲナンを、ポピドンを含有および含有しない水
性緩衝溶液に添加すると、反応生成物は着色した沈澱物
を形成する。好ましい実施態様では、0.1mg/mlおよび1
0.0mg/mlの間のポリマーがこの緩衝液に添加される。
ELISA法に用いられる試薬では、ペルオキシダーゼ複合
体と組み合せてTMBを色原体として利用する。好ましい
試薬は、TMBが、DMF、メタノールあるいはDMSOのような
溶媒に、10mM以上の濃度、好ましくは10mMおよび100mM
の間、最も好ましくは20mMおよび40mMの間の濃度に溶解
される。次に、約0.3mMおよび2.0mMの間のTMBの水溶液
を作るように、好ましくは適切なペルオキシダーゼの基
質、例えば１〜10mM過酸化水素あるいはウレア過酸化水
素、および0.1〜3.0重量％のポビドン、好ましくは１〜
2.5重量％、を含有するクエン酸酢酸あるいはクエン酸
リン酸のような水性緩衝液に加えられる。好ましい粘性
を得るのに、分子量24,000および／あるいは40,000のポ
ビドンが用いられる。ペルオキシダーゼ複合体との反応
を、例えば１〜2N硫酸のような酸の添加により停止さ
せ、分光光度計で測定できる黄色を得る。
TMBを最高濃度1mMから2mMまで、有機溶媒に溶解させた
後、HRPの基質および色原体を含有する水性緩衝液と混
合するという従来の方法と対照的に、改善されたポビド
ン溶媒系ははるかに高い濃度までTMBを溶解することが
でき、従ってかなり少量の有機溶媒を水性緩衝液−基椎
−反応混合物に持ち込むだけでよい。
着色した沈澱物が所望である場合、アルギン酸（AA）、
メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体（MVE/
MAC）、硫酸デキストラン（DS）および／あるいはカラ
ゲナン（CA）を水性緩衝−TMB/ポビドン溶液に加える。
これらの化合物はペルオキシダーゼによる酸化生成物の
生成を示す着色した沈澱物を形成する。
沈澱させるポリマーは、下記濃度範囲で用いられ得る。
これらの化合物はポビドンを含有しない有機溶媒にも用
いられ得るし、そしてpHが最低3.0から7.0の範囲である
溶液中に沈澱物を形成する。
本明細書では、例えば3,3′,5,5′−テトラメチルベン
ジジンジヒドロクロライド（Liemら、Anal.Biochem.98,
388−393（1979）に記述されている）のような酸化剤に
さらされると、色の変化を生じる3,3′,5,5′−テトラ
メチルベンジジンあるいはその誘導体がTMBとして表さ
れている。酸化された際、TMBは650nmで最大吸光度を示
す青色を形成する。酸の添加によって、反応は停止し、
色は450nmで最大吸光度を示す黄色に変わる。セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼに用いられるTMB以外の他の色
原体には、クロロ／ナフトール、ジアミノベンジジンテ
トラヒドロクロライド、アミノエチルカルビゾール、お
よびオルトフェニレンジアミンが含まれる。
HRP−抗体複合体およびTMBを含むELISA法に用いられる
試薬は、様々の会社、例えば、Organon Teknika−Capp
el, West Chester,PA、およびICN ImmunoBiological
s,Lisle,ILによって市販されている。Organon Teknika
−Cappelによって市販されているTMBは1.5％溶液であ
り、30〜150mlの作用溶液に希釈する。
本明細書でポビドンと呼ばれる１−エテニル−２−ピロ
リドンポリマーは、約10,000〜700,000の範囲の平均分
子量を有する一連の製品として商業的に生産されてい
る。このポリマーは、過酸化水素およびアンモニアの存
在下でビニルピロリドンモノマーを加熱して調製され
る。これらのポリマーはAldrich Chemical社など多数
の会社により市販されている。
AA、MVE/MACおよびDSは多数の異なる会社により市販さ
れている。CAはFMC Corporation,Philadelphia,PAで市
販されている。
アッセイは通常、標準的な96ウエルのマイクロタイター
プレートを用いて行われる。マイクロタイタープレート
で反応を行う場合、標準的なTMBアッセイと同様、反応
を酸で停止する。沈澱が形成される場合、液体を除去し
て反応を停止する。TMBの着色した沈澱生成物を用いる
他の方法と対照的に、青沈澱物が乾燥状態で暗所に保存
されると数ケ月間にわたり退色しない。
沈澱が形成されるために、AA、MVE/MAC、DSおよびCA試
薬はまた、DNブロッティングおよびタンパク質ブロッテ
ィングにも用いられ得るし、そして組織化学にも用いら
れ得るのであろう。
異なる試薬の最適濃度は、反応チューブあるいは膜の表
面の化学的性質および大きさにある程度依存し得る。例
えば、ニトロセルロース膜とポリカーボネートのような
プラスチックとの表面電荷の相違が、AA、MVE/MAC、DS
あるいはCAの添加で得られる沈澱物の量に影響を及ぼし
得る。
実施例1:ポビドンと他の合成ポリマーとの比較。
一連のポリマーを、ポリプロピレンチューブ中のクエン
酸酢酸緩衝液に添加した。10％PVP、あるいは１％およ
び10％濃度の他のポリマーのどちらかを調製し、約３〜
４時間の間、定期的に混合あるいは強く撹拌した。これ
らの溶液1.0mlに25μｌのTMB溶液（TMB（Aldrich社、m.
w.250）120mgを5mlのDMSOに溶解して、100mMの溶液とな
る）を加えた。
上記の結果は、このクラスのポリマーの中で、ポビドン
だけが水性緩衝液中のTMBの溶解性を高めることを示し
ている。
実施例2:1.25％ポビドンの存在下の吸光度と2.5％ポビ
ドン存在下の吸光度との比較。
1.25％ポビドンあるいは2.5％ポビドンのいずれかを含
有する1.5mMのTMB溶液を用いてELISAを行い、ヒトのコ
リオゴナドトロピン（hCG）、（0,1,1.5,3,5,および10m
lIUhCG/ml）の濃度を測定した。450nmでの吸光度を40分
間にわたり測定した。その結果が第１図Ａ（1.25％ポビ
ドン）および第１図Ｂ（2.5％ポビドン）に示されてい
る。
1.25％ポビドンでは、2.5％ポビドンより高い吸光度が
認められる。1.25％ポビドンでは2.5％ポピドンより反
応速度も速い。その結果として、ポビドンを含有しない
あるいは低濃度ポビドンを含有するTMB反応混合物の吸
光度の経時変化と比べ、2.5％では吸光度の変化が非常
に小さい。この特徴は、大量のアッセイを行う必要があ
る時、および長い時間にわたり吸光度を測定しなければ
ならない時に有利である。
実施例3:ピペット操作の精度を増加するための低濃度ポ
ビドンの有機溶媒への添加。
0.01％のような少量のポビドンの添加では、有機のおよ
び緩衝の有機溶媒の粘性を増やす。それによって、自動
ピペットによる、溶液の計測および移動が行われるアッ
セイの正確さが改良される。
本発明の方法および組成物の変更および変化、感度を増
加するための、およびそれ以外のHRP用のELISAを改良す
る溶液は、本発明の前述の詳細な説明から当業者にとっ
ては明らかである。そのような変更および変化は付随の
請求の範囲の範囲内に含まれる。

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ELISAに用いられる試薬であって、 色原体と組み合わせて、0.1重量％および10重量％の間
    のポビドンを含有する水性緩衝液を含む、 試薬。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の試薬であって、さらに10
    mMおよび100mMの間の濃度の3,3′5,5′−テトラメチル
    ベンジジン（TMB）溶液を含有する、試薬。
  3. 【請求項３】TMBの濃度が0.3mMおよび2.0mMの間となる
    ように、前記TMBが水性緩衝液に加えられる、請求項２
    に記載の試薬。
  4. 【請求項４】前記水性緩衝液がクエン酸酢酸緩衝液であ
    り、そして前記ポビドンが約0.1％および５％の間の濃
    度で存在する、請求項１に記載の試薬。
  5. 【請求項５】請求項１に記載の試薬であって、さらにセ
    イヨウワサビペルオキシダーゼ複合分子を含有する、試
    薬。
  6. 【請求項６】請求項１に記載の試薬であって、さらにア
    ルギン酸、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重
    合体、硫酸デキストラン、カラゲナンおよびそれらの組
    み合せでなる群から選択される化合物を含有する、試
    薬。
  7. 【請求項７】前記化合物が0.1mg/mlおよび1.0mg/mlの間
    の濃度のアルギン酸である、請求項６に記載の試薬。
  8. 【請求項８】前記化合物が0.1mg/mlおよび2.0mg/mlの間
    の濃度のメチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合
    体である、請求項６に記載の試薬。
  9. 【請求項９】前記化合物が0.1mg/mlおよび10.0mg/mlの
    間の濃度の硫酸デキストランである、請求項６に記載の
    試薬。
  10. 【請求項１０】前記化合物が0.3mg/mlおよび1.0mg/mlの
    間の濃度のカラゲナンである、請求項６に記載の試薬。
  11. 【請求項１１】ELISAを改良する方法であって、 アッセイしようとする酵素複合分子用の緩衝剤として、
    0.1重量％および10重量％の間のポビドンを含有する溶
    液を提供する工程を包含する、方法。
  12. 【請求項１２】前記ポビドンが約0.1％および５％の間
    の濃度で存在する、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記緩衝剤が水性緩衝液であり、そして
    前記ポビドンが約１％および５％の間の濃度で存在す
    る、請求項11に記載の方法。
  14. 【請求項１４】請求項11に記載の方法であって、さらに
    10mMおよび100mMの間の濃度のTMB溶液を提供する工程を
    包含する、方法。
  15. 【請求項１５】請求項14に記載の方法であって、さらに
    TMBの濃度が0.3mMおよび2.0mMの間となるように、前記T
    MB溶液を前記水溶液に加える工程を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】請求項11に記載の方法であって、さらに
    水性緩衝液、およびアルギン酸、メチルビニルエーテル
    ・無水マレイン酸共重合体、硫酸デキストラン、カラゲ
    ナンおよびそれらの組み合せでなる群から選択される化
    合物を提供する工程を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】前記化合物がアルギン酸であり、0.1mg/
    mlおよび1.0mg/mlの間の濃度となるように添加される、
    請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記化合物がメチルビニルエーテル・無
    水マレイン酸共重合体であり、0.1mg/mlおよび2.0mg/ml
    の間の濃度となるように添加される、請求項16に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】前記化合物が硫酸デキストランであり、
    0.1mg/mlおよび10.0mg/mlの間の濃度となるように添加
    される、請求項16に記載の方法。
  20. 【請求項２０】請求項11に記載の方法であって、さらに
    前記ポビドン含有緩衝液をマイクロタイタープレートに
    加える工程を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】請求項20に記載の方法であって、前記緩
    衝液にTMB溶液を加える工程;TMBと反応する、前記酵素
    複合分子の基質を加える工程；該緩衝液に前記酵素複合
    分子を加える工程：および該混合物を反応させる工程を
    さらに包含する、方法。
  22. 【請求項２２】請求項21に記載の方法であって、さらに
    前記反応混合物に酸を加えて反応を停止させる工程を包
    含する、方法。
  23. 【請求項２３】請求項16に記載の方法であって、前記ポ
    ビドン含有緩衝液をマイクロタイタープレートに加える
    工程;TMBと反応する、前記酵素複合分子の基質を加える
    工程；該緩衝液にTMB溶液を加える工程；該緩衝液に前
    記酵素複合分子を加える工程；および該混合物を反応さ
    せる工程をさらに包含する、方法。
  24. 【請求項２４】請求項21に記載の方法であって、沈澱が
    形成するまで前記混合物を反応させる工程、および残存
    液体を除去する工程をさらに包含する、方法。
  25. 【請求項２５】酸化剤の存在下で、着色した生成物を形
    成する色原体を用いるアッセイにおいて、着色した沈澱
    物を形成する試薬であって、 酸化剤の存在下で、着色した生成物を形成する色原体、
    ペルオキシダーゼの基質、およびペルオキシダーゼ複合
    分子を含有し、さらに、アルギン酸、メチルビニルエー
    テル・無水マレイン酸共重合体、硫酸デキストラン、カ
    ラゲナンおよびそれらの組み合せでなる群から選択され
    る重合体化合物を含有し、該着色した生成物が、該重合
    体化合物と安定な沈澱物を形成する、水性緩衝液を含
    む、試薬。
  26. 【請求項２６】前記化合物が0.1mg/mlおよび1.0mg/mlの
    間の濃度のアルギン酸である、請求項25に記載の試薬。
  27. 【請求項２７】前記化合物が0.1mg/mlおよび2.0mg/mlの
    間の濃度のメチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重
    合体である、請求項25に記載の試薬。
  28. 【請求項２８】前記化合物が0.1mg/mlおよび2.0mg/mlの
    間の濃度の硫酸デキストランである、請求項25に記載の
    試薬。
  29. 【請求項２９】前記化合物が0.3mg/mlおよび1.0mg/mlの
    間の濃度のカラゲナンである、請求項25に記載の試薬。
  30. 【請求項３０】請求項25に記載の試薬であって、さらに
    ピロリドンモノマーあるいはピロリドンポリマーを含有
    する、試薬。
  31. 【請求項３１】前記ピロリドンポリマーが１％および20
    ％の間の濃度のポビドンであり、そして前記色原体がTM
    Bである、請求項30に記載の試薬。
  32. 【請求項３２】酸化剤の存在下で、着色した生成物を形
    成する色原体を用いるアッセイにおいて、着色した沈澱
    物を形成する方法であって、 酸化剤の存在下で着色した生成物を形成する色原体、ペ
    ルオキダーゼの基質、およびペルオキシダーゼ複合分子
    を含有し、さらに、アルギン酸、メチルビニルエーテル
    ・無水マレイン酸共重合体、硫酸デキストリン、ガラゲ
    ナンおよびそれらの組み合せでなる群から選択される化
    合物を含有し、該着色した生成物が、該重合体化合物と
    安定な沈澱物を形成する、水性緩衝液を提供する工程を
    包含する、方法。
  33. 【請求項３３】前記化合物がアルギン酸であり、0.1mg/
    mlおよび1.0mg/mlの間の濃度となるように添加される、
    請求項32に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記化合物がメチルビニルエーテル・無
    水マレイン酸共重合体であり、0.1mg/mlおよび2.0mg/ml
    の間の濃度となるように添加される、請求項32に記載の
    方法。
  35. 【請求項３５】前記化合物が硫酸デキストランであり、
    0.1mg/mlおよび2.0ml/mlの間の濃度となるように添加さ
    れる、請求項32に記載の方法。
  36. 【請求項３６】請求項32に記載の方法であって、さらに
    前記緩衝液にピロリドンモノマーあるいはピロリドンポ
    リマーを供給する工程を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】請求項36に記載の方法であって、さらに
    TMBを色原体として提供する工程を包含し、前記ピロリ
    ドンポリマーが１％および10％の間の濃度のポビドンで
    ある、方法。
  38. 【請求項３８】請求項32に記載の方法であって、さらに
    TMB、クロロ／ナフトール、ジアミノベンジジンテトラ
    ヒドロクロライド、アミノエチルカルビゾール、および
    オルトフェニレンジアミンでなる群から選択される色原
    体を提供する工程を包含する、方法。
  39. 【請求項３９】請求項38に記載の方法であって、さらに
    セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびセイヨウワサビ
    ペルオキシダーゼの基質を提供する工程を包含する、方
    法。
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