JPH0699712B2 - シグナル停止試薬を含有する洗浄組成物、試験キット及びペルオキシダーゼ標識特異的バインディングリガンドについての使用方法 - Google Patents
シグナル停止試薬を含有する洗浄組成物、試験キット及びペルオキシダーゼ標識特異的バインディングリガンドについての使用方法Info
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- JPH0699712B2 JPH0699712B2 JP4268364A JP26836492A JPH0699712B2 JP H0699712 B2 JPH0699712 B2 JP H0699712B2 JP 4268364 A JP4268364 A JP 4268364A JP 26836492 A JP26836492 A JP 26836492A JP H0699712 B2 JPH0699712 B2 JP H0699712B2
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、緩衝化洗浄組成物、診
断試験キット、並びに洗浄組成物及びペルオキシダーゼ
標識特異的バインディング反応体を用いる特異的バイン
ディングリガンドの検出方法に関する。また、シグナル
停止試薬として有用な新規アシルヒドラジン類に関す
る。
断試験キット、並びに洗浄組成物及びペルオキシダーゼ
標識特異的バインディング反応体を用いる特異的バイン
ディングリガンドの検出方法に関する。また、シグナル
停止試薬として有用な新規アシルヒドラジン類に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生物学的流体中に低濃度で存在する生物
学的物質の迅速、正確及び定性的もしくは定量的な検出
に関する研究及び診断方法が、医療分野で必要とされ続
けている。
学的物質の迅速、正確及び定性的もしくは定量的な検出
に関する研究及び診断方法が、医療分野で必要とされ続
けている。
【０００３】リガンド及びレセプター間で生成される複
合体は、各種の既知方法により検出可能である。最も一
般的に用いられる方法は、複合体の成分の一つに既に付
着したか、又は更なる反応を経て複合体の一部となる数
タイプのシグナル発生性部分を使用する。
合体は、各種の既知方法により検出可能である。最も一
般的に用いられる方法は、複合体の成分の一つに既に付
着したか、又は更なる反応を経て複合体の一部となる数
タイプのシグナル発生性部分を使用する。
【０００４】医院もしくは診療所において適度な訓練で
迅速かつ容易に使用できるように設計された診断試験で
は、目的の特異的バインディングリガンド（例えば、感
染剤由来の抗原）が、酵素標識とそれに対応する基質の
反応より得られる比色、蛍光もしくは化学ルミネッセン
スシグナルを用いて検出されることが多い。リガンドが
存在する場合には、速やかにかつ激しくシグナルを生成
する必要がある。
迅速かつ容易に使用できるように設計された診断試験で
は、目的の特異的バインディングリガンド（例えば、感
染剤由来の抗原）が、酵素標識とそれに対応する基質の
反応より得られる比色、蛍光もしくは化学ルミネッセン
スシグナルを用いて検出されることが多い。リガンドが
存在する場合には、速やかにかつ激しくシグナルを生成
する必要がある。
【０００５】しかしながら、また、隣接もしくは周囲の
領域がバックグラウンド対照として使用できるように、
試験デバイスにおける試験区域の限定領域内でシグナル
を生成させることを必要とする。このような場合には、
シグナルの生成は、試験区域とバックグラウンド区域間
に明瞭な差異を提供するために、一定期間後に変調もし
くは停止すべきである。
領域がバックグラウンド対照として使用できるように、
試験デバイスにおける試験区域の限定領域内でシグナル
を生成させることを必要とする。このような場合には、
シグナルの生成は、試験区域とバックグラウンド区域間
に明瞭な差異を提供するために、一定期間後に変調もし
くは停止すべきである。
【０００６】ペルオキシダーゼが特異的バインディング
反応における標識として用いられる場合、アジ化ナトリ
ウムが検出可能なシグナルの生成を停止するのに使用で
きることは周知である。しかしながら、アジ化ナトリウ
ムの使用は、それに伴う問題、すなわち、不完全なシグ
ナル阻害、毒性及びその爆発性を有する。ベンゾヒドロ
キサム酸が、歯垢生成を妨害することは既知である（例
えば、米国特許第３，４２７，３８１号明細書）。
反応における標識として用いられる場合、アジ化ナトリ
ウムが検出可能なシグナルの生成を停止するのに使用で
きることは周知である。しかしながら、アジ化ナトリウ
ムの使用は、それに伴う問題、すなわち、不完全なシグ
ナル阻害、毒性及びその爆発性を有する。ベンゾヒドロ
キサム酸が、歯垢生成を妨害することは既知である（例
えば、米国特許第３，４２７，３８１号明細書）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ストレ
プトコッカスＡについてのサンドウイッチアッセイを初
めとする或る種の非常に迅速な特異的バインディングア
ッセイの開発に際して、ある種の更なる改良が必要であ
ることを、本発明者らは見い出した。詳細には、終点で
「シグナル停止」試薬として酸を添加するのに必要とさ
れる時間がアッセイを望ましくなく長くするので、顧客
の満足感が減少することを本発明者らは見い出した。更
に、「シグナル停止」試薬が添加されない場合には、ア
ッセイが、連続的なシグナル生成により「偽陽性」シグ
ナルを示し続けることを、本発明者らは認めた。
プトコッカスＡについてのサンドウイッチアッセイを初
めとする或る種の非常に迅速な特異的バインディングア
ッセイの開発に際して、ある種の更なる改良が必要であ
ることを、本発明者らは見い出した。詳細には、終点で
「シグナル停止」試薬として酸を添加するのに必要とさ
れる時間がアッセイを望ましくなく長くするので、顧客
の満足感が減少することを本発明者らは見い出した。更
に、「シグナル停止」試薬が添加されない場合には、ア
ッセイが、連続的なシグナル生成により「偽陽性」シグ
ナルを示し続けることを、本発明者らは認めた。
【０００８】更にまた、診療所用に設計されたイムノア
ッセイの高い競争分野では、アッセイ工程及び試薬の数
を減少し、できるだけ操作者のエラー、アッセイ経費及
び浪費を低減する必要がある。可能であれば、アッセイ
の終点での「シグナル停止」試薬の使用を排除すること
が、重要であると考えた。
ッセイの高い競争分野では、アッセイ工程及び試薬の数
を減少し、できるだけ操作者のエラー、アッセイ経費及
び浪費を低減する必要がある。可能であれば、アッセイ
の終点での「シグナル停止」試薬の使用を排除すること
が、重要であると考えた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、下記工程
を含んで成る特異的バインディングリガンドの検出方法
を用いて、アッセイ感度を犠牲にすることなく、前記課
題すべての解決方法を見い出した。 Ａ．特異的バインディングリガンドを、上記リガンドに
特異的である水溶性レセプターと反応させて（上記レセ
プターはペルオキシダーゼで標識されている）、ペルオ
キシダーゼ標識特異的バインディング複合体を生成させ
る工程、 Ｂ．水不溶性特異的バインディング複合体を提供するよ
うに、工程Ａの前に、同時に又は次いで、上記特異的バ
インディングリガンドを不溶化させる工程、 Ｃ．上記複合体を、実質的に、非イオンもしくはアニオ
ン界面活性剤及び少なくとも約０．００１重量パーセン
トの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含んで成る緩衝化組成物で洗浄する工
程、 Ｄ．上記洗浄処理複合体を、上記複合体中のペルオキシ
ダーゼに応じて比色、蛍光もしくは化学ルミネッセンス
シグナルを提供するための組成物と接触させる工程、並
びに Ｅ．上記シグナルを検出する工程。
を含んで成る特異的バインディングリガンドの検出方法
を用いて、アッセイ感度を犠牲にすることなく、前記課
題すべての解決方法を見い出した。 Ａ．特異的バインディングリガンドを、上記リガンドに
特異的である水溶性レセプターと反応させて（上記レセ
プターはペルオキシダーゼで標識されている）、ペルオ
キシダーゼ標識特異的バインディング複合体を生成させ
る工程、 Ｂ．水不溶性特異的バインディング複合体を提供するよ
うに、工程Ａの前に、同時に又は次いで、上記特異的バ
インディングリガンドを不溶化させる工程、 Ｃ．上記複合体を、実質的に、非イオンもしくはアニオ
ン界面活性剤及び少なくとも約０．００１重量パーセン
トの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含んで成る緩衝化組成物で洗浄する工
程、 Ｄ．上記洗浄処理複合体を、上記複合体中のペルオキシ
ダーゼに応じて比色、蛍光もしくは化学ルミネッセンス
シグナルを提供するための組成物と接触させる工程、並
びに Ｅ．上記シグナルを検出する工程。
【００１０】また、本発明は、個別に包装された、
（ａ）非イオンもしくはアニオン界面活性剤及び少なく
とも約０．００１重量パーセントの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含んで成る緩衝化組成物、並びに
（ｂ）水溶性ペルオキシダーゼ標識特異的バインディン
グ種、を含んで成る診断試験キットを提供する。
（ａ）非イオンもしくはアニオン界面活性剤及び少なく
とも約０．００１重量パーセントの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含んで成る緩衝化組成物、並びに
（ｂ）水溶性ペルオキシダーゼ標識特異的バインディン
グ種、を含んで成る診断試験キットを提供する。
【００１１】更に、緩衝化組成物は、実質的に、非イオ
ンもしくはアニオン界面活性剤及び少なくとも約０．０
０１重量パーセントの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩から成る。
ンもしくはアニオン界面活性剤及び少なくとも約０．０
０１重量パーセントの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩から成る。
【００１２】或る種の新規アシルヒドラジンが、本発明
の実施に際して停止試薬として有用である。一般的に
は、これらの化合物は、次式（II）により代表される。
の実施に際して停止試薬として有用である。一般的に
は、これらの化合物は、次式（II）により代表される。
【００１３】
【化２】
【００１４】上式中、ｍは、０〜４の整数であり、Ｒ1
は、カルボキシラート塩、カルバモイルもしくはＮ−置
換カルバモイルであり、Ｒ2 は、アミノ、ニトロ、アル
キル、ヒドロキシ、カルバモイル、Ｎ−置換カルバモイ
ル、カルボキシラート塩、もしくはアルコキシであり、
Ｒ3 は水素であり、そしてＲ4 及びＲ5 は、独立して水
素、アルキルもしくはフェニルである。
は、カルボキシラート塩、カルバモイルもしくはＮ−置
換カルバモイルであり、Ｒ2 は、アミノ、ニトロ、アル
キル、ヒドロキシ、カルバモイル、Ｎ−置換カルバモイ
ル、カルボキシラート塩、もしくはアルコキシであり、
Ｒ3 は水素であり、そしてＲ4 及びＲ5 は、独立して水
素、アルキルもしくはフェニルである。
【００１５】
【具体的な態様】検出可能なシグナルの生成を停止する
ために本発明の実施に際して用いられる化合物類は、次
式（Ｉ）により代表されるヒドロキサム酸類もしくはア
シルヒドラジン類又はそれらの等価塩である。 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ 上式中、Ｒ′は、ヒドロキシもしくはアミノ（第一級、
第二級もしくは第三級）である。Ｒ′がヒドロキシであ
る場合、また、これらの化合物はヒドロキサム酸の形
〔すなわち、Ｒ−Ｃ（＝ＮＯＨ）−ＯＨ〕であることが
でき、そして２種の互変異性体の形で存在できる。
ために本発明の実施に際して用いられる化合物類は、次
式（Ｉ）により代表されるヒドロキサム酸類もしくはア
シルヒドラジン類又はそれらの等価塩である。 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ 上式中、Ｒ′は、ヒドロキシもしくはアミノ（第一級、
第二級もしくは第三級）である。Ｒ′がヒドロキシであ
る場合、また、これらの化合物はヒドロキサム酸の形
〔すなわち、Ｒ−Ｃ（＝ＮＯＨ）−ＯＨ〕であることが
でき、そして２種の互変異性体の形で存在できる。
【００１６】この構造式では、Ｒは、フェニル、ナフチ
ル、トリル、ｏ−，ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニ
ル、ｏ−，ｍ−もしくはｐ−ヒドロキシフェニル、３−
（もしくは６−）アミノ−２−カルバモイルフェニル、
２−カルバモイル−３−（もしくは６−）ニトロフェニ
ル、２−カルボキシ−３−（もしくは６−）ニトロフェ
ニル金属もしくはアンモニウム塩、及び３−（もしくは
６−）アミノ−２−カルボキシフェニル金属もしくはア
ンモニウム塩を包合する芳香核内炭素原子数６〜１０個
の置換もしくは未置換アリールであることができる。Ｒ
がアリールである場合には、フェニル、３−（もしくは
６−）アミノ−２−カルバモイルフェニル又は３−（も
しくは６−）アミノ−２−カルボキシフェニル金属もし
くはアンモニウム塩が好ましく、そしてフェニルが最も
好ましい。金属塩に有用なカチオンとしては、アルカリ
金属カチオンが挙げられる。
ル、トリル、ｏ−，ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニ
ル、ｏ−，ｍ−もしくはｐ−ヒドロキシフェニル、３−
（もしくは６−）アミノ−２−カルバモイルフェニル、
２−カルバモイル−３−（もしくは６−）ニトロフェニ
ル、２−カルボキシ−３−（もしくは６−）ニトロフェ
ニル金属もしくはアンモニウム塩、及び３−（もしくは
６−）アミノ−２−カルボキシフェニル金属もしくはア
ンモニウム塩を包合する芳香核内炭素原子数６〜１０個
の置換もしくは未置換アリールであることができる。Ｒ
がアリールである場合には、フェニル、３−（もしくは
６−）アミノ−２−カルバモイルフェニル又は３−（も
しくは６−）アミノ−２−カルボキシフェニル金属もし
くはアンモニウム塩が好ましく、そしてフェニルが最も
好ましい。金属塩に有用なカチオンとしては、アルカリ
金属カチオンが挙げられる。
【００１７】しかしながら、また、Ｒは、限定されるも
のではないが、メチル、エチル、イソプロピル、ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル、２−メチルペンチル及びヘプ
チルを包含する炭素原子数１〜７個の置換もしくは未置
換アルキル、又はシクロペンチル、シクロヘキシル及び
シクロヘプチルを包含する環内炭素原子数５〜１０個の
置換もしくは未置換シクロアルキルであることができ
る。また、Ｒは、芳香環内原子数５〜１０個（少なくと
もそれらの１つが酸素、硫黄もしくは窒素であり、そし
て残りが炭素原子である）の未置換もしくは置換芳香族
複素環であることができる。また、第一級複素環は、そ
れに縮合した炭素環もしくは複素環を担持できる。有用
な芳香族複素環基としては、ピロリル、ピラゾリル、イ
ミダゾリル、トリアゾリル、テトラアゾリル、チエニ
ル、フリル、チアゾリル、オキサゾリル、ベンゾイミダ
ゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリ
ジル、キノリル、ピリダジニル、ピリミジル、トリアジ
ニル、インドリル及びキノキサリニルが挙げられる。
のではないが、メチル、エチル、イソプロピル、ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル、２−メチルペンチル及びヘプ
チルを包含する炭素原子数１〜７個の置換もしくは未置
換アルキル、又はシクロペンチル、シクロヘキシル及び
シクロヘプチルを包含する環内炭素原子数５〜１０個の
置換もしくは未置換シクロアルキルであることができ
る。また、Ｒは、芳香環内原子数５〜１０個（少なくと
もそれらの１つが酸素、硫黄もしくは窒素であり、そし
て残りが炭素原子である）の未置換もしくは置換芳香族
複素環であることができる。また、第一級複素環は、そ
れに縮合した炭素環もしくは複素環を担持できる。有用
な芳香族複素環基としては、ピロリル、ピラゾリル、イ
ミダゾリル、トリアゾリル、テトラアゾリル、チエニ
ル、フリル、チアゾリル、オキサゾリル、ベンゾイミダ
ゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリ
ジル、キノリル、ピリダジニル、ピリミジル、トリアジ
ニル、インドリル及びキノキサリニルが挙げられる。
【００１８】好ましくは、Ｒがフェニル、炭素原子数１
〜４個の置換もしくは未置換アルキル、環内炭素原子数
５もしくは６個のシクロアルキル又は核炭素及びヘテロ
原子数５もしくは６個の芳香族複素環である。最も好ま
しくは、Ｒがフェニル、３−アミノ−２−カルバモイル
フェニルもしくは３−アミノ−２−カルボキシフェニル
金属もしくはアンモニウム塩である。
〜４個の置換もしくは未置換アルキル、環内炭素原子数
５もしくは６個のシクロアルキル又は核炭素及びヘテロ
原子数５もしくは６個の芳香族複素環である。最も好ま
しくは、Ｒがフェニル、３−アミノ−２−カルバモイル
フェニルもしくは３−アミノ−２−カルボキシフェニル
金属もしくはアンモニウム塩である。
【００１９】本明細書に記載されるすべての酸につい
て、等価塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩及び別の塩が挙げられる。
て、等価塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩及び別の塩が挙げられる。
【００２０】本明細書に記載されるアシルヒドラジン類
は、一般的には無水物、詳細には３−ニトロフタル酸無
水物を初めとするフタル酸無水物とヒドラジン水和物と
の縮合により製造できる。得られた１，４−ジオキソ−
５−ニトロフタラジンは、塩基で加水分解されてアシル
ヒドラジンモノカルボキシラート塩もしくはカルバモイ
ル誘導体を生成できる。次いでこの生成物を、パラジウ
ム−炭の存在下、水素化できる。使用される塩基がアン
モニアである場合、生成物はＮ−〔３−（もしくは６
−）アミノ−２−カルバモイルベンゾイル〕ヒドラジン
を初めとするカルバモイル誘導体である。そうでなけれ
ば、生成物はモノカルボキシラート塩である。
は、一般的には無水物、詳細には３−ニトロフタル酸無
水物を初めとするフタル酸無水物とヒドラジン水和物と
の縮合により製造できる。得られた１，４−ジオキソ−
５−ニトロフタラジンは、塩基で加水分解されてアシル
ヒドラジンモノカルボキシラート塩もしくはカルバモイ
ル誘導体を生成できる。次いでこの生成物を、パラジウ
ム−炭の存在下、水素化できる。使用される塩基がアン
モニアである場合、生成物はＮ−〔３−（もしくは６
−）アミノ−２−カルバモイルベンゾイル〕ヒドラジン
を初めとするカルバモイル誘導体である。そうでなけれ
ば、生成物はモノカルボキシラート塩である。
【００２１】一般的には、特に有用なアシルヒドラジン
類は、次式（II）により定義される。
類は、次式（II）により定義される。
【００２２】
【化３】
【００２３】上式中、ｍは０もしくは１〜４の正の整数
である。好ましくは、ｍが０，１もしくは２であり、最
も好ましくは、ｍが１である。更に、構造式（II）で
は、Ｒ1が以下の基のいずれか１つである：カルボキシ
ラート塩（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはアン
モニウム カルボキシラート）、カルバモイル及びＮ−
置換カルバモイル（例えば、メチル、エチル、プロピ
ル、ｔ−ブチルもしくはフェニルで置換）。
である。好ましくは、ｍが０，１もしくは２であり、最
も好ましくは、ｍが１である。更に、構造式（II）で
は、Ｒ1が以下の基のいずれか１つである：カルボキシ
ラート塩（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはアン
モニウム カルボキシラート）、カルバモイル及びＮ−
置換カルバモイル（例えば、メチル、エチル、プロピ
ル、ｔ−ブチルもしくはフェニルで置換）。
【００２４】Ｒ2 は、アミノ、ニトロ、アルキル（好ま
しくは、炭素原子数１〜６個、例えば、メチル、エチ
ル、イソプロピル及びヘキシル）、置換もしくは未置換
の炭素原子数１〜６個のアルコキシ（例えば、メトキ
シ、エトキシ、イソプロポキシ及びブトキシ）、ヒドロ
キシ、カルバモイル、Ｎ−置換カルバモイル（Ｒ1 につ
いて上記定義のとおり）及びカルボキシラート塩（Ｒ1
について上記定義のとおり）である。Ｒ2 を定義する際
には、アミノは、低級置換もしくは未置換アルキル（炭
素原子数１〜６個、有枝鎖もしくは直鎖、例えば、メチ
ル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル及び
クロロメチル）又は置換もしくは未置換フェニル（例え
ば、キシリル、トリル及びアルコキシフェニル）を初め
とする置換基を担持する第一級、第二級及び第三級アミ
ンを包含することを意味する。
しくは、炭素原子数１〜６個、例えば、メチル、エチ
ル、イソプロピル及びヘキシル）、置換もしくは未置換
の炭素原子数１〜６個のアルコキシ（例えば、メトキ
シ、エトキシ、イソプロポキシ及びブトキシ）、ヒドロ
キシ、カルバモイル、Ｎ−置換カルバモイル（Ｒ1 につ
いて上記定義のとおり）及びカルボキシラート塩（Ｒ1
について上記定義のとおり）である。Ｒ2 を定義する際
には、アミノは、低級置換もしくは未置換アルキル（炭
素原子数１〜６個、有枝鎖もしくは直鎖、例えば、メチ
ル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル及び
クロロメチル）又は置換もしくは未置換フェニル（例え
ば、キシリル、トリル及びアルコキシフェニル）を初め
とする置換基を担持する第一級、第二級及び第三級アミ
ンを包含することを意味する。
【００２５】好ましくは、Ｒ2 がアミノであり、そして
最も好ましくは第一級アミノである。Ｒ3 は水素であ
り、そしてＲ4 及びＲ5 は、独立して水素、置換及び未
置換の炭素原子数１〜６個のアルキル（例えば、メチ
ル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル及び
アミノメチル）並びに置換もしくは未置換フェニル（例
えば、フェニル及びキシリル）である。好ましくは、こ
れらの基は独立して水素もしくは炭素原子数１〜３個の
アルキルであり、そして最も好ましくは、それらが各々
水素である。
最も好ましくは第一級アミノである。Ｒ3 は水素であ
り、そしてＲ4 及びＲ5 は、独立して水素、置換及び未
置換の炭素原子数１〜６個のアルキル（例えば、メチ
ル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル及び
アミノメチル）並びに置換もしくは未置換フェニル（例
えば、フェニル及びキシリル）である。好ましくは、こ
れらの基は独立して水素もしくは炭素原子数１〜３個の
アルキルであり、そして最も好ましくは、それらが各々
水素である。
【００２６】構造式（II）の有用な化合物としては、Ｎ
−〔３−（もしくは６−）アミノ−２−カルボキシベン
ゾイル〕ヒドラジン、ナトリウム塩、Ｎ−〔３−（もし
くは６−）アミノ−２−カルボキシベンゾイル〕ヒドラ
ジン、アンモニウム塩、Ｎ−〔３−（もしくは６−）ア
ミノ−２−カルバモイルベンゾイル〕ヒドラジン、Ｎ−
〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５−又は６
−）ヒドロキシベンゾイル〕ヒドラジン、ナトリウム
塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５−
又は６−）ニトロベンゾイル〕ヒドラジン、カリウム
塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５−
又は６−）メチルベンゾイル〕ヒドラジン、アンモニウ
ム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５
−又は６−）イソプロピルベンゾイル〕ヒドラジン、ナ
トリウム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４
−，５−又は６−）フェニルアミノベンゾイル〕ヒドラ
ジン、ナトリウム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（も
しくは４−，５−又は６−）メトキシベンゾイル〕ヒド
ラジン、ナトリウム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−
（もしくは４−，５−又は６−）エトキシベンゾイル〕
ヒドラジン、アンモニウム塩、Ｎ−（２，４，５−トリ
カルボキシベンゾイル）ヒドラジン、ナトリウム塩、Ｎ
−（２，４，５−トリカルバモイル）ヒドラジン、Ｎ−
〔２−カルバモイル−３−（もしくは４−，５−又は６
−）ヒドロキシベンゾイル〕ヒドラジン、Ｎ−〔２−カ
ルバモイル−３−（もしくは４−，５−又は６−）ニト
ロベンゾイル〕ヒドラジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−
３−（もしくは４−，５−又は６−）メチルベンゾイ
ル〕ヒドラジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もし
くは４−，５−又は６−）イソプロピルベンゾイル〕ヒ
ドラジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もしくは４
−，５−又は６−）フェニルアミノベンゾイル〕ヒドラ
ジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もしくは４−，
５−又は６−）メトキシベンゾイル〕ヒドラジン並びに
Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もしくは４−，５−又
は６−）エトキシベンゾイル〕ヒドラジンが挙げられ
る。
−〔３−（もしくは６−）アミノ−２−カルボキシベン
ゾイル〕ヒドラジン、ナトリウム塩、Ｎ−〔３−（もし
くは６−）アミノ−２−カルボキシベンゾイル〕ヒドラ
ジン、アンモニウム塩、Ｎ−〔３−（もしくは６−）ア
ミノ−２−カルバモイルベンゾイル〕ヒドラジン、Ｎ−
〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５−又は６
−）ヒドロキシベンゾイル〕ヒドラジン、ナトリウム
塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５−
又は６−）ニトロベンゾイル〕ヒドラジン、カリウム
塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５−
又は６−）メチルベンゾイル〕ヒドラジン、アンモニウ
ム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４−，５
−又は６−）イソプロピルベンゾイル〕ヒドラジン、ナ
トリウム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（もしくは４
−，５−又は６−）フェニルアミノベンゾイル〕ヒドラ
ジン、ナトリウム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−（も
しくは４−，５−又は６−）メトキシベンゾイル〕ヒド
ラジン、ナトリウム塩、Ｎ−〔２−カルボキシ−３−
（もしくは４−，５−又は６−）エトキシベンゾイル〕
ヒドラジン、アンモニウム塩、Ｎ−（２，４，５−トリ
カルボキシベンゾイル）ヒドラジン、ナトリウム塩、Ｎ
−（２，４，５−トリカルバモイル）ヒドラジン、Ｎ−
〔２−カルバモイル−３−（もしくは４−，５−又は６
−）ヒドロキシベンゾイル〕ヒドラジン、Ｎ−〔２−カ
ルバモイル−３−（もしくは４−，５−又は６−）ニト
ロベンゾイル〕ヒドラジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−
３−（もしくは４−，５−又は６−）メチルベンゾイ
ル〕ヒドラジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もし
くは４−，５−又は６−）イソプロピルベンゾイル〕ヒ
ドラジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もしくは４
−，５−又は６−）フェニルアミノベンゾイル〕ヒドラ
ジン、Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もしくは４−，
５−又は６−）メトキシベンゾイル〕ヒドラジン並びに
Ｎ−〔２−カルバモイル−３−（もしくは４−，５−又
は６−）エトキシベンゾイル〕ヒドラジンが挙げられ
る。
【００２７】本明細書に記載されるヒドロキサム酸もし
くはアシルヒドラジンは、緩衝化組成物中、総溶液重量
に基づいて少なくとも約０．００１パーセントの濃度で
提供される。酸の量の上限は、シグナルの生成を効果的
に停止するのに必要とされる高さと同程度にできる。一
般的には、化合物の量は、０．００１〜０．０１重量パ
ーセントの範囲内であり、０．００２〜０．００７重量
パーセントの範囲が好ましい。
くはアシルヒドラジンは、緩衝化組成物中、総溶液重量
に基づいて少なくとも約０．００１パーセントの濃度で
提供される。酸の量の上限は、シグナルの生成を効果的
に停止するのに必要とされる高さと同程度にできる。一
般的には、化合物の量は、０．００１〜０．０１重量パ
ーセントの範囲内であり、０．００２〜０．００７重量
パーセントの範囲が好ましい。
【００２８】一般的には、本明細書に記載されたヒドロ
キサム酸もしくはアシルヒドラジンは、１つ以上の適当
な緩衝剤を用いてpH６〜１１に緩衝化される。約６．５
〜約７．５の範囲内のpHが好ましい。
キサム酸もしくはアシルヒドラジンは、１つ以上の適当
な緩衝剤を用いてpH６〜１１に緩衝化される。約６．５
〜約７．５の範囲内のpHが好ましい。
【００２９】本発明の洗浄組成物の第二の必須成分は、
アニオンもしくは非イオン界面活性剤又はどちらかもし
くは両タイプの界面活性剤の混合物である。
アニオンもしくは非イオン界面活性剤又はどちらかもし
くは両タイプの界面活性剤の混合物である。
【００３０】アニオン界面活性剤の有用な群としては、
カルボキシラート塩及びスルホネート塩（例えば、アル
キルベンゼンカルボキシラート類、アルキルベンゼンス
ルホネート類、アルキルスルホネート類、スルホスクシ
ネートエステル塩類、ナフタレンのホルマリン縮合体類
及びアルキルナフタレンスルホネート類）、硫酸エステ
ル塩類（例えば、アルキル硫酸エステル塩類、ポリオキ
シアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩類もしく
はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル硫酸
エステル塩類）並びにリン酸エステル塩類（例えば、ア
ルキルリン酸エステル塩類、ポリオキシアルキレンアル
キルエーテルリン酸エステル塩類もしくはポリオキシア
ルキレンアルキルアリールエーテルリン酸エステル塩
類）が挙げられる。コール酸及びそれらの塩を包含する
別のもの（例えば、デオキシコレート）が、当業者に容
易に明らかであろう。
カルボキシラート塩及びスルホネート塩（例えば、アル
キルベンゼンカルボキシラート類、アルキルベンゼンス
ルホネート類、アルキルスルホネート類、スルホスクシ
ネートエステル塩類、ナフタレンのホルマリン縮合体類
及びアルキルナフタレンスルホネート類）、硫酸エステ
ル塩類（例えば、アルキル硫酸エステル塩類、ポリオキ
シアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩類もしく
はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル硫酸
エステル塩類）並びにリン酸エステル塩類（例えば、ア
ルキルリン酸エステル塩類、ポリオキシアルキレンアル
キルエーテルリン酸エステル塩類もしくはポリオキシア
ルキレンアルキルアリールエーテルリン酸エステル塩
類）が挙げられる。コール酸及びそれらの塩を包含する
別のもの（例えば、デオキシコレート）が、当業者に容
易に明らかであろう。
【００３１】或る有用なアニオン界面活性剤が、次式
（III ）により代表される。 〔Ａ−ＳＯ3+y 〕-(1+y)〔Ｘ+m〕n 上式中、Ａは、少なくとも約１８０の分子量を有する炭
化水素であり、Ｘ+mは、水素もしくは一価又は二価カチ
オンであり、ｍは、１もしくは２であり、ｙは、０もし
くは１であり、そしてｎは、１もしくは２であり、ｍ及
びｎが両方共２であることはないことを条件とする。
（III ）により代表される。 〔Ａ−ＳＯ3+y 〕-(1+y)〔Ｘ+m〕n 上式中、Ａは、少なくとも約１８０の分子量を有する炭
化水素であり、Ｘ+mは、水素もしくは一価又は二価カチ
オンであり、ｍは、１もしくは２であり、ｙは、０もし
くは１であり、そしてｎは、１もしくは２であり、ｍ及
びｎが両方共２であることはないことを条件とする。
【００３２】より詳細には、上記式では、Ａは直鎖、有
枝鎖もしくは環状の炭素原子数１３〜１８個の炭化水素
であり、従って、約１８０〜約２５０の範囲内の分子量
を有する。このような炭化水素基としては、直鎖及び有
枝鎖アルキル（例えば、トリデシル、テトラデシル及び
有枝鎖等価体類）、１つ以上のアルキル置換基を担持す
るシクロアルキル（例えば、直鎖もしくは有枝鎖のＣ7
又は高級アルキル類もしくは複数の低級アルキル類で置
換されたシクロヘキシル）並びに１つ以上のアルキル置
換基を担持する芳香族炭素環（例えば、Ｃ7 もしくは高
級アルキル類で置換されたフェニル）が挙げられる。Ａ
が１６個以上の炭素原子を有する場合には、それはアル
キル環、好ましくはアルキルフェニルである。界面活性
剤がその水への溶解性もしくは分散性を失うほど、炭化
水素が大きくないことが重要である。
枝鎖もしくは環状の炭素原子数１３〜１８個の炭化水素
であり、従って、約１８０〜約２５０の範囲内の分子量
を有する。このような炭化水素基としては、直鎖及び有
枝鎖アルキル（例えば、トリデシル、テトラデシル及び
有枝鎖等価体類）、１つ以上のアルキル置換基を担持す
るシクロアルキル（例えば、直鎖もしくは有枝鎖のＣ7
又は高級アルキル類もしくは複数の低級アルキル類で置
換されたシクロヘキシル）並びに１つ以上のアルキル置
換基を担持する芳香族炭素環（例えば、Ｃ7 もしくは高
級アルキル類で置換されたフェニル）が挙げられる。Ａ
が１６個以上の炭素原子を有する場合には、それはアル
キル環、好ましくはアルキルフェニルである。界面活性
剤がその水への溶解性もしくは分散性を失うほど、炭化
水素が大きくないことが重要である。
【００３３】或る態様では、上式中のＡがアルキルもし
くは１８０〜２５０の分子量を有するアルキル置換フェ
ニルである。アルキルは、７〜１２個の炭素原子を有
し、そして直鎖もしくは有枝鎖である。有用なアルキル
基は、例えば、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−デシ
ル、２，２−ジエチルブチル、２−エチルデシル及びド
デシルである。
くは１８０〜２５０の分子量を有するアルキル置換フェ
ニルである。アルキルは、７〜１２個の炭素原子を有
し、そして直鎖もしくは有枝鎖である。有用なアルキル
基は、例えば、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−デシ
ル、２，２−ジエチルブチル、２−エチルデシル及びド
デシルである。
【００３４】別の態様では、アニオン界面活性剤が、上
式中、Ａが炭素原子数１４〜１６個の直鎖もしくは有枝
鎖アルキル（例えば、テトラデシル、ヘキサデシル、２
−エチルテトラデシル及び２，２−ジメチルテトラデシ
ル）である。また、すべての好ましい態様について、上
記式中、ｍ及びｙが両方共１であり、そしてｎが２であ
る。
式中、Ａが炭素原子数１４〜１６個の直鎖もしくは有枝
鎖アルキル（例えば、テトラデシル、ヘキサデシル、２
−エチルテトラデシル及び２，２−ジメチルテトラデシ
ル）である。また、すべての好ましい態様について、上
記式中、ｍ及びｙが両方共１であり、そしてｎが２であ
る。
【００３５】一般的はに、Ｘ+mが水素もしくは周期表の
ＩＡもしくはIIＡ族由来の一価もしくは二価カチオン、
例えば、アルカリ金属イオン類（例えば、ナトリウム、
カリウム及びルビジウム）並びにアルカリ土類金属イオ
ン類（例えば、マグネシウム、カルシウム及びストロン
チウム）である。しかしながら、また、カチオンは、ア
ンモニウムもしくはトリアルキルもしくはテトラアルキ
ルアンモニウムイオンを初めとする有機カチオン、例え
ばジ及びトリエタノールアミン類より生成されるイオン
類、例えば、ジ及びトリ（２−ヒドロキシエチル）アン
モニウム、及びトリアルキルアミン類、テトラメチルア
ンモニウム及び当業者らに容易に明らかである別のもの
より生成されるイオン類、並びにアリールアンモニウム
カチオン類、例えば、トリメチルフェニルアンモニウム
並びに環状オニウムカチオン類、例えば、１−メチルピ
リジニウム、３−メチルイミダゾリウム及び当業者に容
易に明らかである別のものであってもよい。
ＩＡもしくはIIＡ族由来の一価もしくは二価カチオン、
例えば、アルカリ金属イオン類（例えば、ナトリウム、
カリウム及びルビジウム）並びにアルカリ土類金属イオ
ン類（例えば、マグネシウム、カルシウム及びストロン
チウム）である。しかしながら、また、カチオンは、ア
ンモニウムもしくはトリアルキルもしくはテトラアルキ
ルアンモニウムイオンを初めとする有機カチオン、例え
ばジ及びトリエタノールアミン類より生成されるイオン
類、例えば、ジ及びトリ（２−ヒドロキシエチル）アン
モニウム、及びトリアルキルアミン類、テトラメチルア
ンモニウム及び当業者らに容易に明らかである別のもの
より生成されるイオン類、並びにアリールアンモニウム
カチオン類、例えば、トリメチルフェニルアンモニウム
並びに環状オニウムカチオン類、例えば、１−メチルピ
リジニウム、３−メチルイミダゾリウム及び当業者に容
易に明らかである別のものであってもよい。
【００３６】本発明の好ましい態様では、アニオン界面
活性剤は、炭素原子数６〜１４個のアルキルスルフェー
トアニオン（直鎖もしくは有枝鎖のどちらかであり、例
えば、ヘキシル、オクチル、デシル、２−メチルヘキシ
ル、ドデシル及びテトラデシル）並びにアルカリ金属も
しくはアンモニウムカチオンを含んで成る。
活性剤は、炭素原子数６〜１４個のアルキルスルフェー
トアニオン（直鎖もしくは有枝鎖のどちらかであり、例
えば、ヘキシル、オクチル、デシル、２−メチルヘキシ
ル、ドデシル及びテトラデシル）並びにアルカリ金属も
しくはアンモニウムカチオンを含んで成る。
【００３７】より好ましくは、デシルスルフェートを包
含する炭素原子数８〜１２個を有するスルフェートアニ
オンであり、そしてドデシルスルフェートが最も好まし
い。一般的には、アニオン界面活性剤は、少なくとも
０．００１パーセント（組成物の重量に基づく）の量で
洗浄組成物中に存在する。好ましくは、その量が約０．
５〜約１０重量パーセントである。
含する炭素原子数８〜１２個を有するスルフェートアニ
オンであり、そしてドデシルスルフェートが最も好まし
い。一般的には、アニオン界面活性剤は、少なくとも
０．００１パーセント（組成物の重量に基づく）の量で
洗浄組成物中に存在する。好ましくは、その量が約０．
５〜約１０重量パーセントである。
【００３８】本発明の実施に際して有用な非イオン界面
活性剤の代表的な群は、アルキロールアミド類、ポリオ
キシアルキレンアルキルもしくはアルキルアリールエス
テル類、ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン
ポリオール類、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル
類、ポリオキシアルキレンアルキルアミン類、並びに多
価アルコール型界面活性剤類（例えば、多価アルコール
脂肪酸エステル類）を包含する。
活性剤の代表的な群は、アルキロールアミド類、ポリオ
キシアルキレンアルキルもしくはアルキルアリールエス
テル類、ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン
ポリオール類、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル
類、ポリオキシアルキレンアルキルアミン類、並びに多
価アルコール型界面活性剤類（例えば、多価アルコール
脂肪酸エステル類）を包含する。
【００３９】特に有用な非イオン界面活性剤としては、
アルキルフェノール及びエチレンオキシドの縮合生成物
が挙げられる。好ましいアルキルフェノール類は、フェ
ノール上の直鎖もしくは有枝鎖アルキル基内に１〜２０
個の炭素を有する。オクチルフェノールが最も好まし
い。一般的には、これらの化合物は５〜３５個のエチレ
ンオキシド基を担持する。好ましくは、これらは７〜１
５個のエチレンオキシド基を担持する。
アルキルフェノール及びエチレンオキシドの縮合生成物
が挙げられる。好ましいアルキルフェノール類は、フェ
ノール上の直鎖もしくは有枝鎖アルキル基内に１〜２０
個の炭素を有する。オクチルフェノールが最も好まし
い。一般的には、これらの化合物は５〜３５個のエチレ
ンオキシド基を担持する。好ましくは、これらは７〜１
５個のエチレンオキシド基を担持する。
【００４０】本発明の実施に際して有用な非イオン界面
活性剤の量は、上記アニオン界面活性剤のものと同一も
しくは異なる量であってもよい。好ましくは、量が約
０．５〜約１０重量パーセントである。
活性剤の量は、上記アニオン界面活性剤のものと同一も
しくは異なる量であってもよい。好ましくは、量が約
０．５〜約１０重量パーセントである。
【００４１】本発明の緩衝化組成物は、単に適当な緩衝
剤中、アニオンもしくは非イオン界面活性剤、ヒドロキ
サム酸もしくはアシルヒドラジン及び任意の成分を混合
することにより製造できる。それは、アッセイの際に直
ちに使用でき、又は後に市販もしくは使用するために適
当な容器に（例えば診断試験キットの一部として）保存
してもよい。
剤中、アニオンもしくは非イオン界面活性剤、ヒドロキ
サム酸もしくはアシルヒドラジン及び任意の成分を混合
することにより製造できる。それは、アッセイの際に直
ちに使用でき、又は後に市販もしくは使用するために適
当な容器に（例えば診断試験キットの一部として）保存
してもよい。
【００４２】より好ましくは、本方法が、ホルモン、薬
物、細菌もしくはウイルス抗原又は抗体の検出に役立
つ。最も好ましくは、それが、抽出された微生物の抗原
を検出することによるストレプトコッカスＡの検出に役
立つ。
物、細菌もしくはウイルス抗原又は抗体の検出に役立
つ。最も好ましくは、それが、抽出された微生物の抗原
を検出することによるストレプトコッカスＡの検出に役
立つ。
【００４３】リガンド及びリガンドに特異的な水溶性レ
セプターの複合体は、ペルオキシダーゼ標識特異的バイ
ンディング複合体を提供する。複合体の量をリガンドの
量と相関させるようにこの複合体を正確に測定するため
に、複合体は、複合体化されていない材料及びいずれか
の目的の物質ではない別の物質より分離せねばならな
い。分離は、検出しようとする特異的バインディングリ
ガンドが何らかの方法で不溶化されることを必要とす
る。この不溶化は、リガンドとそれらのペルオキシダー
ゼ標識レセプターの複合体化の前に、同時にもしくは次
いで行うことができる。
セプターの複合体は、ペルオキシダーゼ標識特異的バイ
ンディング複合体を提供する。複合体の量をリガンドの
量と相関させるようにこの複合体を正確に測定するため
に、複合体は、複合体化されていない材料及びいずれか
の目的の物質ではない別の物質より分離せねばならな
い。分離は、検出しようとする特異的バインディングリ
ガンドが何らかの方法で不溶化されることを必要とす
る。この不溶化は、リガンドとそれらのペルオキシダー
ゼ標識レセプターの複合体化の前に、同時にもしくは次
いで行うことができる。
【００４４】例えば、リガンドは、粒状支持体（例え
ば、ポリマーもしくはガラス粒子類）、濾過膜類、セル
ロース系フィルターペーパー類、固形ポリマーもしくは
樹脂コートフィルム類、ガラススライド類、試験官のガ
ラス壁、ガラスもしくはポリマーキュベット類及び通常
の当業者に容易に検出可能な別の支持体類を初めとする
水不溶性支持体に直接バインディングさせることにより
不溶化できる。このようなアッセイは、リガンドが直接
支持体に結合する「直接バインディング」アッセイとし
て当該技術分野で周知であり、そしてレセプターが不溶
化リガンドと複合体を生成するのに用いられる。複合体
の検出は、下記方法を用いて洗浄した後に達成できる。
ば、ポリマーもしくはガラス粒子類）、濾過膜類、セル
ロース系フィルターペーパー類、固形ポリマーもしくは
樹脂コートフィルム類、ガラススライド類、試験官のガ
ラス壁、ガラスもしくはポリマーキュベット類及び通常
の当業者に容易に検出可能な別の支持体類を初めとする
水不溶性支持体に直接バインディングさせることにより
不溶化できる。このようなアッセイは、リガンドが直接
支持体に結合する「直接バインディング」アッセイとし
て当該技術分野で周知であり、そしてレセプターが不溶
化リガンドと複合体を生成するのに用いられる。複合体
の検出は、下記方法を用いて洗浄した後に達成できる。
【００４５】本発明の好ましい態様は、抽出されたリガ
ンド（例えば、抗原）が、２つの抗原決定部位で、２つ
のレセプター分子の一方がペルオキシダーゼで検出可能
に標識され、そしてもう一方が固定化されている（又
は、例えばアビジン−ビオチン複合体化、もしくは別の
特異的バインディング反応を介して固定化されることが
可能である）２つのレセプター分子（例えば、２つの抗
体）と反応するような、イムノメトリックもしくはサン
ドウイッチアッセイである。或るレセプターが固定化さ
れる適当な支持体は、直接バインディングアッセイにつ
いて先に記載したものを包含する。好ましくは、有機体
より生成される粒状キャリアー材料、天然もしくは合成
ポリマー類、ガラス、セラミック類、珪藻土もしくは磁
性粒子類が用いられる。より好ましくはこれらの粒子は
ポリマー製球状形であり、そして０．０１〜１０μｍの
平均粒子サイズ（最長寸法における）を有するが、とは
いえサイズ、構造及び球状の立体構造は臨界的ではな
い。
ンド（例えば、抗原）が、２つの抗原決定部位で、２つ
のレセプター分子の一方がペルオキシダーゼで検出可能
に標識され、そしてもう一方が固定化されている（又
は、例えばアビジン−ビオチン複合体化、もしくは別の
特異的バインディング反応を介して固定化されることが
可能である）２つのレセプター分子（例えば、２つの抗
体）と反応するような、イムノメトリックもしくはサン
ドウイッチアッセイである。或るレセプターが固定化さ
れる適当な支持体は、直接バインディングアッセイにつ
いて先に記載したものを包含する。好ましくは、有機体
より生成される粒状キャリアー材料、天然もしくは合成
ポリマー類、ガラス、セラミック類、珪藻土もしくは磁
性粒子類が用いられる。より好ましくはこれらの粒子は
ポリマー製球状形であり、そして０．０１〜１０μｍの
平均粒子サイズ（最長寸法における）を有するが、とは
いえサイズ、構造及び球状の立体構造は臨界的ではな
い。
【００４６】好ましくは、上記レセプター及びポリマー
粒子より生成される試薬類は、化学的もしくは生物学的
反応に不活性である微孔質濾過膜上に塗布又は堆積され
る。一般的には、それは、形状もしくは機能を失うこと
なくそれに付着されるか又は反応するように、試薬とし
て十分に完全性を有する１つ以上の天然又は合成支持体
で構成される。
粒子より生成される試薬類は、化学的もしくは生物学的
反応に不活性である微孔質濾過膜上に塗布又は堆積され
る。一般的には、それは、形状もしくは機能を失うこと
なくそれに付着されるか又は反応するように、試薬とし
て十分に完全性を有する１つ以上の天然又は合成支持体
で構成される。
【００４７】一般的には、膜は、０．５〜５μｍの最長
寸法における平均細孔サイズを有する。適当なレセプタ
ー分子を有する試薬は、膜の全表面上に亘って又はそれ
らの限定領域で、膜に付着できる。それらは親水性バイ
ンダー類と混合して用いられ、塗膜に更なる完全性を提
供できる。
寸法における平均細孔サイズを有する。適当なレセプタ
ー分子を有する試薬は、膜の全表面上に亘って又はそれ
らの限定領域で、膜に付着できる。それらは親水性バイ
ンダー類と混合して用いられ、塗膜に更なる完全性を提
供できる。
【００４８】膜は、アッセイにおいて手で支えて、それ
らの上にリガンド及びレセプターの複合体化に要する部
位を提供できる。しかしながら、好ましくは膜が使い捨
て試験デバイス又は膜及びそれらを介して流動される流
体を保持するのに適する構成及び構造を有する物に設置
又は取り付けられる。
らの上にリガンド及びレセプターの複合体化に要する部
位を提供できる。しかしながら、好ましくは膜が使い捨
て試験デバイス又は膜及びそれらを介して流動される流
体を保持するのに適する構成及び構造を有する物に設置
又は取り付けられる。
【００４９】一旦リガンド及びレセプターの水不溶性複
合体が生成されると（好ましくは膜上に）、複合体を検
出する前に複合体化されていない材料を取り除くため
に、複合体は本発明の緩衝化組成物で洗浄される。複合
体が、流体排出をうけない支持体上に存在する場合に
は、複合体化されていない物質及び流体はデカンテーシ
ョンで取り除かれるか又は別の方法で取り除くことがで
きる。
合体が生成されると（好ましくは膜上に）、複合体を検
出する前に複合体化されていない材料を取り除くため
に、複合体は本発明の緩衝化組成物で洗浄される。複合
体が、流体排出をうけない支持体上に存在する場合に
は、複合体化されていない物質及び流体はデカンテーシ
ョンで取り除かれるか又は別の方法で取り除くことがで
きる。
【００５０】次いで水不溶性複合体は、数多くの標準試
薬、装置及び方法を用いて検出できる。ペルオキシダー
ゼ標識に関しては、酵素に応じて（１つ以上の反応を介
して）検出可能な比色、蛍光もしくは化学ルミネッセン
スシグナルを提供する各種の既知組成物が存在する。例
えば、或る好ましい態様では、酵素の存在下、１つ以上
の化学反応を介して色素を提供する色素提供性組成物を
利用する。
薬、装置及び方法を用いて検出できる。ペルオキシダー
ゼ標識に関しては、酵素に応じて（１つ以上の反応を介
して）検出可能な比色、蛍光もしくは化学ルミネッセン
スシグナルを提供する各種の既知組成物が存在する。例
えば、或る好ましい態様では、酵素の存在下、１つ以上
の化学反応を介して色素を提供する色素提供性組成物を
利用する。
【００５１】あるいは、ペルオキシダーゼ標識が、ルミ
ノール試薬もしくは同様の試薬を用いて化学ルミネッセ
ンスシグナルを提供するために、１つ以上の反応で使用
できる。
ノール試薬もしくは同様の試薬を用いて化学ルミネッセ
ンスシグナルを提供するために、１つ以上の反応で使用
できる。
【００５２】本発明方法は、いずれか適する時間に亘っ
ていずれか適する温度で実施できるが、多くの場合、一
般的には、それは５分間以内に１５〜３０℃の範囲内の
温度で達成される。より好ましくは、本方法は約３分間
以内に実施され、そして２分間のアッセイが最も好まし
い。
ていずれか適する温度で実施できるが、多くの場合、一
般的には、それは５分間以内に１５〜３０℃の範囲内の
温度で達成される。より好ましくは、本方法は約３分間
以内に実施され、そして２分間のアッセイが最も好まし
い。
【００５３】
【実施例】例についての材料及び方法 ３つの試験ウェル中に組み入れられたＬＯＰＲＯＤＹＮ
Ｅ（商標）ナイロン微孔質濾過膜（平均細孔サイズ５μ
ｍ）を含有するＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）使い捨て試験
デバイスを用いた。膜は、いずれか更なる処理を施すこ
となく用いた。各試験デバイスは３つの試験ウェルを含
んだ。
Ｅ（商標）ナイロン微孔質濾過膜（平均細孔サイズ５μ
ｍ）を含有するＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）使い捨て試験
デバイスを用いた。膜は、いずれか更なる処理を施すこ
となく用いた。各試験デバイスは３つの試験ウェルを含
んだ。
【００５４】色素提供性組成物Ａは、４，５−ビス（４
−メトキシフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４
−ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．
００５％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン
酸ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル、pH．６．８）、過
酸化水素（１０ミリモル）、４′−ヒドロキシアセトア
ニリド（５マイクロモル）及びジエチレントリアミン五
酢酸（１０ピコモル）を含むように製造した。
−メトキシフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４
−ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．
００５％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン
酸ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル、pH．６．８）、過
酸化水素（１０ミリモル）、４′−ヒドロキシアセトア
ニリド（５マイクロモル）及びジエチレントリアミン五
酢酸（１０ピコモル）を含むように製造した。
【００５５】ストレプトコッカスＡのグループＡ炭水化
物抗原に対するアフィニティー精製されたウサギポリク
ローナル抗体を、活性化剤としてｏ−（１Ｈ−ベンゾト
リアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ
メチルウロニウムテトラフルオロボレートもしくは１−
（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロリド
のどちらかを用いて、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−
ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比９７．
６：２．４）の粒子（平均直径１．４μｍ）に共有結合
させた。抗体固定化は、ポリマー粒子の重量と等量のウ
シ血清アルブミンで停止した。
物抗原に対するアフィニティー精製されたウサギポリク
ローナル抗体を、活性化剤としてｏ−（１Ｈ−ベンゾト
リアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ
メチルウロニウムテトラフルオロボレートもしくは１−
（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロリド
のどちらかを用いて、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−
ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比９７．
６：２．４）の粒子（平均直径１．４μｍ）に共有結合
させた。抗体固定化は、ポリマー粒子の重量と等量のウ
シ血清アルブミンで停止した。
【００５６】グリシン緩衝剤（０．１モル、pH８．５）
中、得られた試薬（０．９％）、ポリアクリルアミド
（５％）、ＵＶＩＴＥＸ（商標）蛍光色素（０．０１
％）及びメルチオレート（商標）保存料（０．０１％）
の懸濁液（２μＬ）を、試験デバイスの試験ウェルの１
つ（中央の試験ウェル）の膜上の限定領域上に堆積させ
た。ストレプトコッカスＡ炭水化物（１６pg）を添加し
たが、同様の方法で、試験デバイスの第二試験ウェル
（陽性対照）に堆積させた。
中、得られた試薬（０．９％）、ポリアクリルアミド
（５％）、ＵＶＩＴＥＸ（商標）蛍光色素（０．０１
％）及びメルチオレート（商標）保存料（０．０１％）
の懸濁液（２μＬ）を、試験デバイスの試験ウェルの１
つ（中央の試験ウェル）の膜上の限定領域上に堆積させ
た。ストレプトコッカスＡ炭水化物（１６pg）を添加し
たが、同様の方法で、試験デバイスの第二試験ウェル
（陽性対照）に堆積させた。
【００５７】ウサギガンマグロブリンを、上記と同様の
条件下、同様のポリマー粒子に付着させ、調製し、そし
て試験デバイスの第三試験ウェル（陰性対照）に添加し
た。
条件下、同様のポリマー粒子に付着させ、調製し、そし
て試験デバイスの第三試験ウェル（陰性対照）に添加し
た。
【００５８】ペルオキシダーゼ及び上記と同様のストレ
プトコッカスＡ抗原に特異的な抗体の結合体を調製し
た。３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤
（２．１％、pH７．５）中、スクシニル化カゼイン
（０．５％）、ＴＷＥＥＮ（商標）２０非イオン界面活
性剤（０．２％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド
（０．１５％）及びメルチオレート（商標）（０．０１
％）を含んで成る組成物中に、結合体（８．０mg／Ｌ）
を混合した。
プトコッカスＡ抗原に特異的な抗体の結合体を調製し
た。３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤
（２．１％、pH７．５）中、スクシニル化カゼイン
（０．５％）、ＴＷＥＥＮ（商標）２０非イオン界面活
性剤（０．２％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド
（０．１５％）及びメルチオレート（商標）（０．０１
％）を含んで成る組成物中に、結合体（８．０mg／Ｌ）
を混合した。
【００５９】クエン酸（１８μＬ、０．８モル）、硝酸
ナトリウム（１４５μＬ、７モル）及び３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤（１４５μＬ、１モ
ル）を含むように、試験溶液を調整した。試験溶液Ａは
全く抗原を含まず、一方試験溶液Ｂは、検出しようとす
るリガンドであるストレプトコッカスＡ炭水化物（１
０．２ng／mL、ラムノース単位）を更に含んだ。
ナトリウム（１４５μＬ、７モル）及び３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤（１４５μＬ、１モ
ル）を含むように、試験溶液を調整した。試験溶液Ａは
全く抗原を含まず、一方試験溶液Ｂは、検出しようとす
るリガンドであるストレプトコッカスＡ炭水化物（１
０．２ng／mL、ラムノース単位）を更に含んだ。
【００６０】例１ Ｎ−〔３−（もしくは６−）アミノ
−２−カルボキシルベンゾイル〕ヒドラジン、ナトリウ
ム塩の製造 下記工程の順に、このアシルヒドラジンを製造した。
−２−カルボキシルベンゾイル〕ヒドラジン、ナトリウ
ム塩の製造 下記工程の順に、このアシルヒドラジンを製造した。
【００６１】工程１：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（５０mL、ＤＭＦ）に、３−ニトロフタル酸無水物（２
８ｇ、０．１４５モル）を添加した。１０分間攪拌した
後、得られた溶液を濾過した。次いで濾液を攪拌しそし
て−１０℃まで冷却し、同時にヒドラジンヒドレート
（７mL、０．１４１モル）を添加した。１時間攪拌後、
ゴム状固体が沈澱した。次いで反応混合物を３５℃まで
加熱しそしてエチルアルコール（５０mL）を添加した。
液体をデカンテーションせしめ、残った固形物質を氷酢
酸（１００mL）に添加し、１時間還流しそして室温まで
冷却した。得られた固体を採取しそして乾燥した（収量
及び収率：１２．１ｇ、４０．３％）。プロトンＮＭＲ
及び質量スペクトル分析は、１，４−ジオキソ−５−ニ
トロフタラジンの構造と一致した。
（５０mL、ＤＭＦ）に、３−ニトロフタル酸無水物（２
８ｇ、０．１４５モル）を添加した。１０分間攪拌した
後、得られた溶液を濾過した。次いで濾液を攪拌しそし
て−１０℃まで冷却し、同時にヒドラジンヒドレート
（７mL、０．１４１モル）を添加した。１時間攪拌後、
ゴム状固体が沈澱した。次いで反応混合物を３５℃まで
加熱しそしてエチルアルコール（５０mL）を添加した。
液体をデカンテーションせしめ、残った固形物質を氷酢
酸（１００mL）に添加し、１時間還流しそして室温まで
冷却した。得られた固体を採取しそして乾燥した（収量
及び収率：１２．１ｇ、４０．３％）。プロトンＮＭＲ
及び質量スペクトル分析は、１，４−ジオキソ−５−ニ
トロフタラジンの構造と一致した。
【００６２】工程２：工程１由来の１，４−ジオキソ−
５−ニトロフタラジン（８．５ｇ、０．０４２モル）を
イオン交換水（１２５mL）に添加した。得られた懸濁液
に、イオン交換水中、水酸化ナトリウム（１．６８ｇ、
０．０４２モル）の溶液（２０mL）を添加した。固体の
溶解が完了するまで（約３０分間）反応混合物を攪拌
し、次いでそれを等量のエチルアルコールに注ぎ入れ、
沈澱が完了するまで攪拌した。得られた固体を濾過して
乾燥した（収量及び収率：８ｇ、７０．２％）。プロト
ンＮＭＲ及び質量スペクトル分析は、Ｎ−〔２−カルボ
キシ−３−（もしくは６−）ニトロベンゾイル〕ヒドラ
ジン、ナトリウム塩の構造と一致した。
５−ニトロフタラジン（８．５ｇ、０．０４２モル）を
イオン交換水（１２５mL）に添加した。得られた懸濁液
に、イオン交換水中、水酸化ナトリウム（１．６８ｇ、
０．０４２モル）の溶液（２０mL）を添加した。固体の
溶解が完了するまで（約３０分間）反応混合物を攪拌
し、次いでそれを等量のエチルアルコールに注ぎ入れ、
沈澱が完了するまで攪拌した。得られた固体を濾過して
乾燥した（収量及び収率：８ｇ、７０．２％）。プロト
ンＮＭＲ及び質量スペクトル分析は、Ｎ−〔２−カルボ
キシ−３−（もしくは６−）ニトロベンゾイル〕ヒドラ
ジン、ナトリウム塩の構造と一致した。
【００６３】工程３：工程２で製造したＮ−〔２−カル
ボキシ−３−（もしくは６−）ニトロベンゾイル〕ヒド
ラジン、ナトリウム塩（７．８ｇ、０．０３２モル）を
イオン交換水（１３０mL）に添加した。この溶液に、５
％パラジウムの木炭触媒１ｇを添加した。得られた混合
物を５００psi （約３４．５バール）及び３０℃で３時
間水素化した。反応期間中、水素ガスの反応により圧力
は５０psi （約３．４５バール）に降下した。次いで触
媒を濾過により取り除き、そして反応混合物が乾燥する
まで減圧で濃縮した。得られた個体をエチルアルコール
より再結晶化した（収量及び収率：５．２ｇ、７５．４
％）。プロトンＮＭＲ及び質量スペクトル分析は、Ｎ−
〔３−（もしくは６−）アミノ−２−カルボキシベンゾ
イル〕ヒドラジン、ナトリウム塩の構造と一致した。
ボキシ−３−（もしくは６−）ニトロベンゾイル〕ヒド
ラジン、ナトリウム塩（７．８ｇ、０．０３２モル）を
イオン交換水（１３０mL）に添加した。この溶液に、５
％パラジウムの木炭触媒１ｇを添加した。得られた混合
物を５００psi （約３４．５バール）及び３０℃で３時
間水素化した。反応期間中、水素ガスの反応により圧力
は５０psi （約３．４５バール）に降下した。次いで触
媒を濾過により取り除き、そして反応混合物が乾燥する
まで減圧で濃縮した。得られた個体をエチルアルコール
より再結晶化した（収量及び収率：５．２ｇ、７５．４
％）。プロトンＮＭＲ及び質量スペクトル分析は、Ｎ−
〔３−（もしくは６−）アミノ−２−カルボキシベンゾ
イル〕ヒドラジン、ナトリウム塩の構造と一致した。
【００６４】例２ 緩衝化洗浄組成物 本発明の緩衝化組成物を、リン酸ナトリウム（０．１モ
ル、pH７．２）中、デシル硫酸ナトリウム（１．７
％）、ベンゾヒドロキサム酸（０．００５％）及びチメ
ロサール保存料（０．０１％）を混合することにより製
造した。
ル、pH７．２）中、デシル硫酸ナトリウム（１．７
％）、ベンゾヒドロキサム酸（０．００５％）及びチメ
ロサール保存料（０．０１％）を混合することにより製
造した。
【００６５】例３ 緩衝化組成物を用いたストレプトコ
ッカスＡについてのアッセイ 試験デバイスの膜上に塗布された抗体試薬を含有するそ
れぞれの使い捨て試験デバイスの単一試験ウェルに、試
験溶液Ａ及びＢ（各々２００μＬ）を添加した。膜を介
してその流体を排水せしめた。次いでペルオキシダーゼ
標識抗体組成物（８０μＬ）をすべての試験ウェルに添
加し、膜を介して排水せしめた。
ッカスＡについてのアッセイ 試験デバイスの膜上に塗布された抗体試薬を含有するそ
れぞれの使い捨て試験デバイスの単一試験ウェルに、試
験溶液Ａ及びＢ（各々２００μＬ）を添加した。膜を介
してその流体を排水せしめた。次いでペルオキシダーゼ
標識抗体組成物（８０μＬ）をすべての試験ウェルに添
加し、膜を介して排水せしめた。
【００６６】例２の緩衝化組成物を洗浄溶液として用
い、そして試験ウェルに２回（各回３００μＬ）添加
し、そして膜を介して排水せしめた。幾つかの試験デバ
イスを、ベンゾヒドロキサム酸を省いたことを除いて、
例２の組成物と類似の対照洗浄溶液で同様に処理した。
別の試験デバイスを、リン酸ナトリウム（０．１モル、
pH７．２）中、塩化ナトリウム（０．４モル）、デシル
硫酸ナトリウム（２．４％）、チメロサール（０．０１
％）を含んで成る「高塩」洗浄溶液で処理した。
い、そして試験ウェルに２回（各回３００μＬ）添加
し、そして膜を介して排水せしめた。幾つかの試験デバ
イスを、ベンゾヒドロキサム酸を省いたことを除いて、
例２の組成物と類似の対照洗浄溶液で同様に処理した。
別の試験デバイスを、リン酸ナトリウム（０．１モル、
pH７．２）中、塩化ナトリウム（０．４モル）、デシル
硫酸ナトリウム（２．４％）、チメロサール（０．０１
％）を含んで成る「高塩」洗浄溶液で処理した。
【００６７】洗浄後、ロイコ色素組成物（１００μＬ）
を試験ウェルに添加し、そして流体を排水せしめた。室
温で１分間インキュベーション後、膜上に得られた色素
シグナルを、１０が最高色素濃度を表す０から１０まで
の値を有するカラーチャートと比較して評価した。着色
領域周囲の膜領域を、バックグラウンドシグナル用に評
価した。次いで第１回目の評価後５分間インキュベーシ
ョンし、その後に第２回目として色素シグナルを評価し
た。
を試験ウェルに添加し、そして流体を排水せしめた。室
温で１分間インキュベーション後、膜上に得られた色素
シグナルを、１０が最高色素濃度を表す０から１０まで
の値を有するカラーチャートと比較して評価した。着色
領域周囲の膜領域を、バックグラウンドシグナル用に評
価した。次いで第１回目の評価後５分間インキュベーシ
ョンし、その後に第２回目として色素シグナルを評価し
た。
【００６８】数回の反復アッセイで得られたデータを、
下記第Ｉ表に示す。それらは、対照及び「高塩」洗浄溶
液の使用が、受け入れられない偽陽性のアッセイ結果を
生じること、すなわち、試験溶液Ａ（抗体なし）での色
素シグナルの出現を示している。例２の緩衝化組成物を
用いた場合には、このような偽陽性は得られなかった。
更に、例２の組成物の使用は、別個の「シグナル停止」
試薬及びそれを使用するのに必要とされる時間を省略し
た。本発明に従って実施されたすべてのアッセイのバッ
クグラウンドシグナルは、著しく改良された。色素シグ
ナルの生成を停止するための個別の工程の使用が、この
アッセイで回避される。
下記第Ｉ表に示す。それらは、対照及び「高塩」洗浄溶
液の使用が、受け入れられない偽陽性のアッセイ結果を
生じること、すなわち、試験溶液Ａ（抗体なし）での色
素シグナルの出現を示している。例２の緩衝化組成物を
用いた場合には、このような偽陽性は得られなかった。
更に、例２の組成物の使用は、別個の「シグナル停止」
試薬及びそれを使用するのに必要とされる時間を省略し
た。本発明に従って実施されたすべてのアッセイのバッ
クグラウンドシグナルは、著しく改良された。色素シグ
ナルの生成を停止するための個別の工程の使用が、この
アッセイで回避される。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【発明の効果】本発明は、シグナルが速やかに生成され
そして評価に望ましい時に停止されるような特異的バイ
ンディングリガンドについての非常に迅速なアッセイを
提供する。シグナルの連続的な生成が実質的に低減され
るので、「偽陽性」シグナルが排除される。アッセイに
必要とされる数多くの工程及び試薬が削減され、アッセ
イを簡易化し、経費及びエラーの可能性を低減した。こ
れらの利点は、複合体化されていない物質を特異的バイ
ンディング複合体より分離するのに用いられる洗浄溶液
の一部として特定のヒドロキサム酸もしくはアシルヒド
ラジンを用いることにより達成される。以前は、「シグ
ナル停止」試薬がアッセイの終点で、すなわち、シグナ
ル生成試薬の添加後に使用すべきであると考えられてい
た。本発明者らは、それが容易に洗浄溶液中に添加でき
ることを予期せずに見い出した。明らかに、十分な「シ
グナル停止」試薬が特異的バインディング複合体に残留
するので、それはシグナル生成試薬を添加する時から短
時間後、例えば約３分後に、シグナルの生成を効果的に
停止する。
そして評価に望ましい時に停止されるような特異的バイ
ンディングリガンドについての非常に迅速なアッセイを
提供する。シグナルの連続的な生成が実質的に低減され
るので、「偽陽性」シグナルが排除される。アッセイに
必要とされる数多くの工程及び試薬が削減され、アッセ
イを簡易化し、経費及びエラーの可能性を低減した。こ
れらの利点は、複合体化されていない物質を特異的バイ
ンディング複合体より分離するのに用いられる洗浄溶液
の一部として特定のヒドロキサム酸もしくはアシルヒド
ラジンを用いることにより達成される。以前は、「シグ
ナル停止」試薬がアッセイの終点で、すなわち、シグナ
ル生成試薬の添加後に使用すべきであると考えられてい
た。本発明者らは、それが容易に洗浄溶液中に添加でき
ることを予期せずに見い出した。明らかに、十分な「シ
グナル停止」試薬が特異的バインディング複合体に残留
するので、それはシグナル生成試薬を添加する時から短
時間後、例えば約３分後に、シグナルの生成を効果的に
停止する。
フロントページの続き (72)発明者 ハロルド チェスター ウォーレン，ザ サード アメリカ合衆国，ニューヨーク 14543, ラッシュ，ストニーブルック ロード 390 (72)発明者 トーマス ロバート キッセル アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，ウィロウッド ドライブ 200 (72)発明者 ダグラス ロナルド ジョーンズ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14450, フェアポート，カンタベリー トレイル ６ (56)参考文献 特公 昭45−30000（ＪＰ，Ｂ１) 英国特許1086636（ＧＢ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】 実質的に、非イオンもしくはアニオン界
面活性剤及び少なくとも約０．００１重量パーセントの
次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩から成る緩衝化洗浄組成物。 - 【請求項２】 Ａ．特異的バインディングリガンドを、
上記リガンドに特異的である水溶性レセプターと反応さ
せて（上記レセプターはペルオキシダーゼで標識されて
いる）、ペルオキシダーゼ標識特異的バインディング複
合体を生成させる工程、 Ｂ．水不溶性特異的バインディング複合体を提供するよ
うに、工程Ａの前に、同時に又は次いで、上記特異的バ
インディングリガンドを不溶化させる工程、 Ｃ．上記複合体を、非イオンもしくはアニオン界面活性
剤及び少なくとも約０．００１重量パーセントの次式
（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含んで成る緩衝化組成物で洗浄する工
程、 Ｄ．上記洗浄処理複合体を、上記複合体中のペルオキシ
ダーゼに応じて比色、蛍光もしくは化学ルミネッセンス
シグナルを提供するための組成物と接触させる工程、並
びに Ｅ．上記シグナルを検出する工程、 を含んで成る特異的バインディングリガンドの検出方
法。 - 【請求項３】 個別に包装された、（ａ）非イオンもし
くはアニオン界面活性剤及び少なくとも約０．００１重
量パーセントの次式（Ｉ） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含んで成る緩衝化組成物、並びに （ｂ）水溶性ペルオキシダーゼ標識特異的バインディン
グ種、を含んで成る診断試験キット。
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