JPH0743387B2 - 直接ビリルビンの定量法 - Google Patents
直接ビリルビンの定量法Info
- Publication number
- JPH0743387B2 JPH0743387B2 JP26476786A JP26476786A JPH0743387B2 JP H0743387 B2 JPH0743387 B2 JP H0743387B2 JP 26476786 A JP26476786 A JP 26476786A JP 26476786 A JP26476786 A JP 26476786A JP H0743387 B2 JPH0743387 B2 JP H0743387B2
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- Japan
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- bilirubin
- thiourea
- derivative
- quantifying
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体体液試料、特に血液または尿中の直接ビ
リルビンを定量する方法に関する。
リルビンを定量する方法に関する。
ビリルビンは、胆汁中に最も多く存在する色素であり、
血清中には正常人の場合、約1mg/dl以下存在するが、病
的状態、例えば黄疸疾患等では20mg/dlにも達する場合
がある。従つて、その定量は、黄疸疾患の診断等に有用
である。
血清中には正常人の場合、約1mg/dl以下存在するが、病
的状態、例えば黄疸疾患等では20mg/dlにも達する場合
がある。従つて、その定量は、黄疸疾患の診断等に有用
である。
ビリルビンは血清中においてグルクロン酸、硫酸などと
結合した直接ビリルビン及びアルブミンと結合した間接
ビリルビンとして存在する。臨床検査においては、ビリ
ルビン代謝異常を黄疸の発生機序により更に詳細に診断
するために総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリル
ビン各々の定量が必要となる。
結合した直接ビリルビン及びアルブミンと結合した間接
ビリルビンとして存在する。臨床検査においては、ビリ
ルビン代謝異常を黄疸の発生機序により更に詳細に診断
するために総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリル
ビン各々の定量が必要となる。
ビリルビンの定量法としては、ビリルビンとジアゾ試薬
が反応して生ずるアゾビリルビンの色素を比色定量する
方法〔実践臨床化学；北村元仕編著,10ビリルビン（197
4年）〕などの化学的方法、酵素法等が知られている。
また最近、銅イオンや金属錯体がビリルビンを酸化する
ことが見い出され、この反応を利用して総ビリルビンを
定量する方法が報告されている（特開昭59−160764
号）。
が反応して生ずるアゾビリルビンの色素を比色定量する
方法〔実践臨床化学；北村元仕編著,10ビリルビン（197
4年）〕などの化学的方法、酵素法等が知られている。
また最近、銅イオンや金属錯体がビリルビンを酸化する
ことが見い出され、この反応を利用して総ビリルビンを
定量する方法が報告されている（特開昭59−160764
号）。
しかしながら、最も一般的に実施されている従来のジア
ゾ試薬を用いる定量法においては、ジアゾ試薬自体が不
安定で調製後の使用期間が短かい。定量操作が極めて繁
雑である等の問題点があつた。また、銅イオンでビリル
ビンを酸化する方法においては、直接ビリルビン、間接
ビリルビンの判別は不可能であるという問題があつた。
さらに酵素法においては、選択性、酵素の至適pHからか
なり離れたpHで測定していることから安定性、多量使用
によるコスト高等の問題があつた。
ゾ試薬を用いる定量法においては、ジアゾ試薬自体が不
安定で調製後の使用期間が短かい。定量操作が極めて繁
雑である等の問題点があつた。また、銅イオンでビリル
ビンを酸化する方法においては、直接ビリルビン、間接
ビリルビンの判別は不可能であるという問題があつた。
さらに酵素法においては、選択性、酵素の至適pHからか
なり離れたpHで測定していることから安定性、多量使用
によるコスト高等の問題があつた。
かかる実状に鑑み、本発明者らは、簡便かつ正確なビリ
ルビン、特に直接ビリルビンの定量法を開発すべく鋭意
研究した結果、銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘
導体を被検液に加えると、直接ビリルビンが選択的に酸
化され、容易に定量できることを見い出し、本発明を完
成した。
ルビン、特に直接ビリルビンの定量法を開発すべく鋭意
研究した結果、銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘
導体を被検液に加えると、直接ビリルビンが選択的に酸
化され、容易に定量できることを見い出し、本発明を完
成した。
すなわち、本発明は被検液に銅イオン及びチオ尿素もし
くはその誘導体を作用せしめ、それによる被検液中のビ
リルビンの変化を光学的に測定することを特徴とする直
接ビリルビンの定量法を提供するものである。
くはその誘導体を作用せしめ、それによる被検液中のビ
リルビンの変化を光学的に測定することを特徴とする直
接ビリルビンの定量法を提供するものである。
本発明方法において、銅イオンは、Cu2+をいい、例えば
硫酸銅、塩化第二銅、酢酸第二銅、リン酸第二銅などの
銅塩を銅イオン生成化合物として供給するのが好まし
い。
硫酸銅、塩化第二銅、酢酸第二銅、リン酸第二銅などの
銅塩を銅イオン生成化合物として供給するのが好まし
い。
チオ尿素もしくはその誘導体としては、次の一般式
（Ｉ） （式中、R1、R2、R3およびR4は各々水素原子又は有機基
を示す） で表わされる化合物、特にチオ尿素（R1＝R2＝R3＝R4＝
Ｈ）又は、R1〜R4がアミノ基もしくはイミノ基でない有
機基を有するチオ尿素誘導体が好ましい。特にチオ尿
素、Ｎ−メチルチオ尿素、1,3−ジメチルチオ尿素又は
アリルチオ尿素が好ましい。
（Ｉ） （式中、R1、R2、R3およびR4は各々水素原子又は有機基
を示す） で表わされる化合物、特にチオ尿素（R1＝R2＝R3＝R4＝
Ｈ）又は、R1〜R4がアミノ基もしくはイミノ基でない有
機基を有するチオ尿素誘導体が好ましい。特にチオ尿
素、Ｎ−メチルチオ尿素、1,3−ジメチルチオ尿素又は
アリルチオ尿素が好ましい。
本発明方法を実施するには、予め被検液の450nm付近に
おける吸収を測定しておき、該被検液に上記銅塩および
チオ尿素もしくはその誘導体を添加し、被検液中の直接
ビリルビンと銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘導
体との反応終了後反応液の450nm付近における吸収を測
定し、反応前後の吸収の差から直接ビリルビン濃度を求
めることにより行なわれる。
おける吸収を測定しておき、該被検液に上記銅塩および
チオ尿素もしくはその誘導体を添加し、被検液中の直接
ビリルビンと銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘導
体との反応終了後反応液の450nm付近における吸収を測
定し、反応前後の吸収の差から直接ビリルビン濃度を求
めることにより行なわれる。
本発明は、銅イオンとチオ尿素もしくはその誘導体が錯
体と形成し、この錯体が直接ビリルビンを選択的に酸化
する作用を示すことに基づくものである。従つて、反応
液中において銅塩を銅イオンとして存在せしめるため、
反応液のpHは酸性側、特に６以下であることが好まし
い。pHを調整するためには、チオ尿素もしくはその誘導
体を緩衝液に加えておいたものを添加するのが好適であ
る。またこの緩衝液中には、界面活性剤、酸等をさらに
添加することもできる。
体と形成し、この錯体が直接ビリルビンを選択的に酸化
する作用を示すことに基づくものである。従つて、反応
液中において銅塩を銅イオンとして存在せしめるため、
反応液のpHは酸性側、特に６以下であることが好まし
い。pHを調整するためには、チオ尿素もしくはその誘導
体を緩衝液に加えておいたものを添加するのが好適であ
る。またこの緩衝液中には、界面活性剤、酸等をさらに
添加することもできる。
銅塩およびチオ尿素もしくはその誘導体の添加順序は、
特に限定されない。チオ尿素もしくはその誘導体−銅塩
の順序で添加する場合には、例えばチオ尿素もしくはそ
の誘導体を緩衝液溶液を試薬１、銅塩水溶液を試薬２と
して予め準備しておくこともできる。この場合、定量は
試薬１を添加した後の被検液の吸光度と試薬２を添加し
た後のそれとを比較することにより行われる。
特に限定されない。チオ尿素もしくはその誘導体−銅塩
の順序で添加する場合には、例えばチオ尿素もしくはそ
の誘導体を緩衝液溶液を試薬１、銅塩水溶液を試薬２と
して予め準備しておくこともできる。この場合、定量は
試薬１を添加した後の被検液の吸光度と試薬２を添加し
た後のそれとを比較することにより行われる。
銅塩の添加量は、銅イオンの反応液中における終濃度と
して0.05〜100mM、特に0.25〜5mMが好ましい。チオ尿素
もしくはその誘導体の添加量は、終濃度として1.5mM〜3
M、特に7.5〜150mMが好ましい。
して0.05〜100mM、特に0.25〜5mMが好ましい。チオ尿素
もしくはその誘導体の添加量は、終濃度として1.5mM〜3
M、特に7.5〜150mMが好ましい。
また、本発明方法は、検体の光学的変化を経時的に、か
つ定量的に測定することのできる自動分析装置、例えば
日立705型、日立7050型、日立736型、東芝TBA−80S、東
芝TBA−480等に適用することもできる。
つ定量的に測定することのできる自動分析装置、例えば
日立705型、日立7050型、日立736型、東芝TBA−80S、東
芝TBA−480等に適用することもできる。
本発明方法は、従来のビリルビン測定法に比較し、極め
て簡単で試薬の安定性がよく、しかも安価な試薬を用い
た測定法である。また、直接ビリルビン及び間接ビリル
ビンの両者を含有する検体、例えば血清を直接本発明方
法に付すのみで直接ビリルビンのみを測定することがで
き、臨床検査上有用である。
て簡単で試薬の安定性がよく、しかも安価な試薬を用い
た測定法である。また、直接ビリルビン及び間接ビリル
ビンの両者を含有する検体、例えば血清を直接本発明方
法に付すのみで直接ビリルビンのみを測定することがで
き、臨床検査上有用である。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１ 以下に示す試薬１および２を調製した。
試薬1: 0.1Mクエン酸3Na−乳酸pH3.6 １％酢酸 0.3％界面活性剤 50mMチオ尿素 試薬2: 7.5mM硫酸銅 試薬１ 2.5mlに検体0.1mlを加え、その後450nmで検体
ブランクを最終液量補正をして測定する。つづいて試薬
２ 0.5mlを加え、37℃に加温し、再び450nmの吸収を測
定する。試薬２添加前後の吸収の減少度によりビリルビ
ン濃度を測定する。なお、以上の操作は自動分析装置
（東芝TBA−480）で行つた。検体としてジタウロビリル
ビン（直接ビリルビン）を用いた場合の450nmにおける
吸収の経時変化を図１に示す。また検体として間接ビリ
ルビンを用いた場合の結果を図２に示す。
ブランクを最終液量補正をして測定する。つづいて試薬
２ 0.5mlを加え、37℃に加温し、再び450nmの吸収を測
定する。試薬２添加前後の吸収の減少度によりビリルビ
ン濃度を測定する。なお、以上の操作は自動分析装置
（東芝TBA−480）で行つた。検体としてジタウロビリル
ビン（直接ビリルビン）を用いた場合の450nmにおける
吸収の経時変化を図１に示す。また検体として間接ビリ
ルビンを用いた場合の結果を図２に示す。
その結果、本発明方法によれば間接ビリルビンをほとん
ど変化させず（液量変化による変化のみ）、直接ビリル
ビンを選択的に測定できることがわかる。
ど変化させず（液量変化による変化のみ）、直接ビリル
ビンを選択的に測定できることがわかる。
実施例２ 検体としてジタウロビリルビンと間接ビリルビンを1:1
の割合で含有する保存血清を用いる以外は、実施例１と
同様にしてビリルビン測定を行い、検体を0.9％NaCl水
溶液で希釈して、希釈率と吸収（444nm/548nm）の変化
との関係を検討した。その結果、図３に示す如く、ほぼ
原点回帰の良好な直線性を示し、本発明方法が臨床検査
手段として優れていることがわかる。
の割合で含有する保存血清を用いる以外は、実施例１と
同様にしてビリルビン測定を行い、検体を0.9％NaCl水
溶液で希釈して、希釈率と吸収（444nm/548nm）の変化
との関係を検討した。その結果、図３に示す如く、ほぼ
原点回帰の良好な直線性を示し、本発明方法が臨床検査
手段として優れていることがわかる。
実施例３ 検体として保存血清50検体を用い、本発明方法（実施例
１記載）、アルカリアゾブルー法（ビリルビンキツト
Ｋ、日本商事（株））酵素法（ネスコートＤ−BL−VE、
日本商事（株））によつて直接ビリルビン濃度を定量
し、これらの測定法間における相関性を検討した。その
結果、図４および５に示す如く、本発明方法は、従来の
アルカリアゾブルー法および酵素法いずれの方法とも良
好な相関関係を示した。
１記載）、アルカリアゾブルー法（ビリルビンキツト
Ｋ、日本商事（株））酵素法（ネスコートＤ−BL−VE、
日本商事（株））によつて直接ビリルビン濃度を定量
し、これらの測定法間における相関性を検討した。その
結果、図４および５に示す如く、本発明方法は、従来の
アルカリアゾブルー法および酵素法いずれの方法とも良
好な相関関係を示した。
図１はジタウロビリルビン、図２は間接ビリルビンをそ
れぞれ検体として用いた場合の本発明方法における、吸
収（444nm/548nm）の経時変化を示す図面である。 図３は、実施例２における444nm/548nmの吸収変化と検
体の希釈率との関係を示す図面である。 図４は本発明方法とアルカリアゾブルー法との相関関係
を、図５は本発明方法と酵素法との相関関係を示す図面
である。
れぞれ検体として用いた場合の本発明方法における、吸
収（444nm/548nm）の経時変化を示す図面である。 図３は、実施例２における444nm/548nmの吸収変化と検
体の希釈率との関係を示す図面である。 図４は本発明方法とアルカリアゾブルー法との相関関係
を、図５は本発明方法と酵素法との相関関係を示す図面
である。
Claims (4)
- 【請求項１】被検液に銅イオン及びチオ尿素もしくはそ
の誘導体を作用せしめ、それによる被検液中のビリルビ
ンの変化を光学的に測定することを特徴とする直接ビリ
ルビンの定量法。 - 【請求項２】銅イオン生成化合物が硫酸銅、塩化第二
銅、酢酸第二銅またはリン酸第二銅である特許請求の範
囲第１項記載の直接ビリルビンの定量法。 - 【請求項３】チオ尿素もしくはその誘導体が次の一般式
（Ｉ） （式中、R1、R2、R3およびR4は、各々水素原子又は有機
基を示す） で表わされる化合物である特許請求の範囲第１項記載の
直接ビリルビンの定量法。 - 【請求項４】銅イオン及びチオ尿素もしくはその誘導体
とビリルビンとの反応が、pH6以下の条件で行われるも
のである特許請求の範囲第１項記載の直接ビリルビンの
定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26476786A JPH0743387B2 (ja) | 1986-11-06 | 1986-11-06 | 直接ビリルビンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26476786A JPH0743387B2 (ja) | 1986-11-06 | 1986-11-06 | 直接ビリルビンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63118662A JPS63118662A (ja) | 1988-05-23 |
| JPH0743387B2 true JPH0743387B2 (ja) | 1995-05-15 |
Family
ID=17407902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26476786A Expired - Lifetime JPH0743387B2 (ja) | 1986-11-06 | 1986-11-06 | 直接ビリルビンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0743387B2 (ja) |
-
1986
- 1986-11-06 JP JP26476786A patent/JPH0743387B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63118662A (ja) | 1988-05-23 |
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