JPH0746995B2 - フェノールオキシダーゼ遺伝子（１） - Google Patents
フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）Info
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- JPH0746995B2 JPH0746995B2 JP63149102A JP14910288A JPH0746995B2 JP H0746995 B2 JPH0746995 B2 JP H0746995B2 JP 63149102 A JP63149102 A JP 63149102A JP 14910288 A JP14910288 A JP 14910288A JP H0746995 B2 JPH0746995 B2 JP H0746995B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関す
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ（Coriolus hirsutus IFO4917）〕由来のフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関する。
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ（Coriolus hirsutus IFO4917）〕由来のフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関する。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）は種々の生物に導
入することにより、バイオロジカルパルピングやバイオ
ブリーチングや工場廃水の脱色や木材糖化の前処理や臨
床試験用試薬として利用することができるフェノールオ
キシダーゼを生産することができる。
入することにより、バイオロジカルパルピングやバイオ
ブリーチングや工場廃水の脱色や木材糖化の前処理や臨
床試験用試薬として利用することができるフェノールオ
キシダーゼを生産することができる。
フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、ｏ−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一群の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
ール類を酸化し、ｏ−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一群の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させパルプを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている（特開昭50−46903
号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけで
なく、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロース
をも分解する能力を有しており、パルプ収率の低下とい
う問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニン分
解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかると
いう問題点もあった。
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させパルプを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている（特開昭50−46903
号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけで
なく、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロース
をも分解する能力を有しており、パルプ収率の低下とい
う問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニン分
解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかると
いう問題点もあった。
白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産、分
泌するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考
えられており、その遺伝子をクローニングする試みも行
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラッカーゼについては、ノイロスポラ・クラッサ（Neur
ospora crassa）のラッカーゼ遺伝子のクローニング
（U.A.Garmann,K.Lerch;（1988）J.Biol.Chem.263,885-
896）が報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明
のフェノールオキシダーゼのアミノ酸配列とは異なるも
のであり、またノイロスポラ・クラッサのラッカーゼに
よるリグニン分解についても、まだ報告されていない。
泌するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考
えられており、その遺伝子をクローニングする試みも行
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラッカーゼについては、ノイロスポラ・クラッサ（Neur
ospora crassa）のラッカーゼ遺伝子のクローニング
（U.A.Garmann,K.Lerch;（1988）J.Biol.Chem.263,885-
896）が報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明
のフェノールオキシダーゼのアミノ酸配列とは異なるも
のであり、またノイロスポラ・クラッサのラッカーゼに
よるリグニン分解についても、まだ報告されていない。
本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
自然界におけるリグニンの生分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
したがって、リグニン分解能力だけを効率的に発現する
新規生物として白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ生
産能力を付与した生物が考えられ、本発明は、フェノー
ルオキシダーゼ生産能力を付与する為に必要なフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を提供するものである。
新規生物として白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ生
産能力を付与した生物が考えられ、本発明は、フェノー
ルオキシダーゼ生産能力を付与する為に必要なフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を提供するものである。
本発明は、次式、 のアミノ酸配列をコードするDNAがイントロンにより分
断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関
する。
断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関
する。
さらに、本発明は上記フェノールオキシダーゼ遺伝子
（Ｉ）にハイブリッドするDNAであって、天然、合成、
もしくは半合成によって得られるものであり、前記アミ
ノ酸配列をコードするDNAに対して、ヌクレオチドの置
換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位そ
の他の突然変異によって関連づけられており、かつ、フ
ェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNAであり、または該遺伝子がイントロンで分断
されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関す
る。
（Ｉ）にハイブリッドするDNAであって、天然、合成、
もしくは半合成によって得られるものであり、前記アミ
ノ酸配列をコードするDNAに対して、ヌクレオチドの置
換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位そ
の他の突然変異によって関連づけられており、かつ、フ
ェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNAであり、または該遺伝子がイントロンで分断
されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関す
る。
さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
をベクターDNAに連結した組換えDNAに関する。
をベクターDNAに連結した組換えDNAに関する。
さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
が下記配列のDNAを有するものであるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（Ｉ）に関する。
が下記配列のDNAを有するものであるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（Ｉ）に関する。
以下に本発明を詳細に説明する。
〈DNAプローブの合成〉 コスミドライブラリーからコロニー・ハイブリダイゼー
ション法を用いてフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
をクローニングするために必要となるDNAプローブは、
フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をもとに合
成する。フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列
は、特開昭61−285989号、特開昭62−220189号、及び、
特開昭62−220190号の方法で生産、精製したフェノール
オキシダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列と精製したフ
ェノールオキシダーゼをBrCN分解〔Cole,R.D.:Methods
Enzymol.11,315-317（1967）〕またはトリプシン分解
〔Lin,L.-N.＆ Brandts.J.F.:Bio-chemistry22,553（19
83）〕し、分離したポリペプチドのＮ末端からのアミノ
酸配列をエドマン分解法〔Edman,P.＆ Henschen,A.Prot
ein sequence determination,2'nd de.,Springer-Verla
g,Berlin,pp232〜279（1975）参照〕によって決定す
る。
ション法を用いてフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
をクローニングするために必要となるDNAプローブは、
フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をもとに合
成する。フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列
は、特開昭61−285989号、特開昭62−220189号、及び、
特開昭62−220190号の方法で生産、精製したフェノール
オキシダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列と精製したフ
ェノールオキシダーゼをBrCN分解〔Cole,R.D.:Methods
Enzymol.11,315-317（1967）〕またはトリプシン分解
〔Lin,L.-N.＆ Brandts.J.F.:Bio-chemistry22,553（19
83）〕し、分離したポリペプチドのＮ末端からのアミノ
酸配列をエドマン分解法〔Edman,P.＆ Henschen,A.Prot
ein sequence determination,2'nd de.,Springer-Verla
g,Berlin,pp232〜279（1975）参照〕によって決定す
る。
DNAプローブの合成は、フォスフォジエステル法、フォ
スフォトリエステル法、フォスファイト法およびその改
良法のアミダイト法のいずれかの方法で行なうことがで
きる。
スフォトリエステル法、フォスファイト法およびその改
良法のアミダイト法のいずれかの方法で行なうことがで
きる。
〈染色体DNAの調製〉 本発明に用いることができる生物は、フェノールオキシ
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（IFO491
7）、カワラタケ（IFO30340）、カイガラタケ（IFO871
4）〕が良い。
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（IFO491
7）、カワラタケ（IFO30340）、カイガラタケ（IFO871
4）〕が良い。
白色腐朽菌を生育繁殖される培地の組成は、主炭素源と
してグルコースを使用するが白色腐朽菌が質化可能な他
の炭素源を使用してもよく、主窒素源としては酵母エキ
ス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽菌が資化可能な
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、
カゼインなどの有機窒素含有物も使用することができ
る。その他、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム
塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩
やコーンスティープリカー、ビタミン類、アミノ酸類、
核酸類などの栄養物質、生長促進物質を添加することも
可能である。
してグルコースを使用するが白色腐朽菌が質化可能な他
の炭素源を使用してもよく、主窒素源としては酵母エキ
ス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽菌が資化可能な
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、
カゼインなどの有機窒素含有物も使用することができ
る。その他、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム
塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩
やコーンスティープリカー、ビタミン類、アミノ酸類、
核酸類などの栄養物質、生長促進物質を添加することも
可能である。
前記の培地に白色腐朽菌を接種し、培養する。培養後、
集菌し、液体窒素中で凍結し、乳鉢中で破砕後、フェノ
ール抽出法により染色体DNAを抽出、精製し、コスミド
ライブラリー構築に使用する染色体DNAを得る。
集菌し、液体窒素中で凍結し、乳鉢中で破砕後、フェノ
ール抽出法により染色体DNAを抽出、精製し、コスミド
ライブラリー構築に使用する染色体DNAを得る。
染色体DNAのフェノール抽出の前にあらかじめプロテイ
ナーゼ処理を行なうと高率よく染色体DNAを抽出するこ
とができる。
ナーゼ処理を行なうと高率よく染色体DNAを抽出するこ
とができる。
〈染色体DNAのコスミドライブラリーの構築〉 コスミドベクターpHC79〔Hohn,B.and Collins,J.（198
0）Gene11,291〕を用いて染色体DNAのコスミドライブラ
リーを構築する。コスミドベクターpHC79は市販のもの
〔例えば、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー（Bethes
da Research Labo-ratories）社製5358SA,ベーリンガー
・マンハイム山之内（株）社製567795〕が使用できる。
0）Gene11,291〕を用いて染色体DNAのコスミドライブラ
リーを構築する。コスミドベクターpHC79は市販のもの
〔例えば、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー（Bethes
da Research Labo-ratories）社製5358SA,ベーリンガー
・マンハイム山之内（株）社製567795〕が使用できる。
上記染色体DNAを制限酵素Sau3AI〔宝酒造（株）社製108
2A〕で部分分解し、32〜46Kb（キロ塩基対）の大きさの
染色体DNA断片を得る。一方、コスミドベクターpHC79を
制限酵素BamH I〔宝酒造（株）社製1010S〕で完全分解
し、脱リン酸処理し、上記の部分分解した染色体DNAの
断片を加え、T4DNAリガーゼ〔宝酒造（株）社製2011A〕
によってDNA鎖の結合反応を行なう。
2A〕で部分分解し、32〜46Kb（キロ塩基対）の大きさの
染色体DNA断片を得る。一方、コスミドベクターpHC79を
制限酵素BamH I〔宝酒造（株）社製1010S〕で完全分解
し、脱リン酸処理し、上記の部分分解した染色体DNAの
断片を加え、T4DNAリガーゼ〔宝酒造（株）社製2011A〕
によってDNA鎖の結合反応を行なう。
得られた結合反応物を市販のイン・ビトロ・パッケージ
ングキット〔例えば、アマシャム・ジャパン（株）社製
N.334Y,プロメガ・バイオテック（Promega Biotec）社
製P3151〕を用いて成熟ファージ粒子中に挿入し、大腸
菌DH1（ATCC33849）に感染させ、１μｇの染色体DNA当
り、約50,000株のApr（アンピシリン耐性）株を得て、
染色体DNAのコスミドライブラリーとする。
ングキット〔例えば、アマシャム・ジャパン（株）社製
N.334Y,プロメガ・バイオテック（Promega Biotec）社
製P3151〕を用いて成熟ファージ粒子中に挿入し、大腸
菌DH1（ATCC33849）に感染させ、１μｇの染色体DNA当
り、約50,000株のApr（アンピシリン耐性）株を得て、
染色体DNAのコスミドライブラリーとする。
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニン
グ〉 コスミドライブラリーの約10,000株の組換え大腸菌をア
ンピシリンを含むLB培地（バクトトリプトン10g/l,バイ
トイーストエキス5g/l,塩化ナトリウム10g/l,寒天15g/
l）上にコロニーを形成させる。
グ〉 コスミドライブラリーの約10,000株の組換え大腸菌をア
ンピシリンを含むLB培地（バクトトリプトン10g/l,バイ
トイーストエキス5g/l,塩化ナトリウム10g/l,寒天15g/
l）上にコロニーを形成させる。
コロニーを市販のニトロセルロースフィルターまたはナ
イロンフィルター〔例えば、アマシャム・ジャパン
（株）社製RPN.82C,東洋濾紙（株）社製A045B082C〕に
レプリカし、常法〔Grunstein,M.＆D.S.Hogness:Proc.N
atl.Acad.Sci.USA72,3961（1975）〕により、フィルタ
ー上にDNAを固定する。
イロンフィルター〔例えば、アマシャム・ジャパン
（株）社製RPN.82C,東洋濾紙（株）社製A045B082C〕に
レプリカし、常法〔Grunstein,M.＆D.S.Hogness:Proc.N
atl.Acad.Sci.USA72,3961（1975）〕により、フィルタ
ー上にDNAを固定する。
フィルター上のDNAと放射性同位元素32P〔アマシャム・
ジャパン（株）社製PB10168〕でラベル〔Richardson,C.
C（1965）Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.54,158〜161,参
照〕した合成DNAプローブをハイブリダイズさせフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を組込んだ大腸菌を選抜
し、常法によりコスミドを抽出、精製する。
ジャパン（株）社製PB10168〕でラベル〔Richardson,C.
C（1965）Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.54,158〜161,参
照〕した合成DNAプローブをハイブリダイズさせフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を組込んだ大腸菌を選抜
し、常法によりコスミドを抽出、精製する。
コスミドに組込まれた染色体DNA断片の中でフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするために制限酵素Hind III〔宝
酒造（株）社製1060S〕またはEcoR I〔宝酒造（株）社
製1040S〕またはSma I〔宝酒造（株）社製1085A〕で切
断し、アガロースゲル電気泳動法で分子量別に分離し、
フィルターに固定化した染色体DNA断片と32Pでラベルし
た合成DNAプローブとハイブリダイズさせる。合成DNAプ
ローブとハイブリダイズするDNA断片をプラスミドベク
ターpUC19〔Yanisch-Perron,C.Vieira,J.and Messing,
J.（1985）Gene,33,103,Messing,J（1983）Method in E
nzymology,101,20〜78,宝酒造（株）社製3219〕にサブ
クローニングし、制限酵素地図を作成する。
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするために制限酵素Hind III〔宝
酒造（株）社製1060S〕またはEcoR I〔宝酒造（株）社
製1040S〕またはSma I〔宝酒造（株）社製1085A〕で切
断し、アガロースゲル電気泳動法で分子量別に分離し、
フィルターに固定化した染色体DNA断片と32Pでラベルし
た合成DNAプローブとハイブリダイズさせる。合成DNAプ
ローブとハイブリダイズするDNA断片をプラスミドベク
ターpUC19〔Yanisch-Perron,C.Vieira,J.and Messing,
J.（1985）Gene,33,103,Messing,J（1983）Method in E
nzymology,101,20〜78,宝酒造（株）社製3219〕にサブ
クローニングし、制限酵素地図を作成する。
得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を含むDN
A断片のベクターDNAへの組み込みは以下のように行な
う。ベクターDNAを適当な制限酵素で切断してベクターD
NA断片を調製する。次いでフェノールオキシダーゼ遺伝
子（Ｉ）を含むDNA断片とベクターDNA断片の混合物をT4
DNAリガーゼで処理する。用いられるベクターDNAとして
は、pBR322、pUC18、pUC19、〔宝酒造（株）社製3050,3
218,3219〕等があげられる。また制限酵素としてはHind
III、EcoR I、Pst I〔宝酒造（株）社製1073S〕、BamH
I等があげられる。
A断片のベクターDNAへの組み込みは以下のように行な
う。ベクターDNAを適当な制限酵素で切断してベクターD
NA断片を調製する。次いでフェノールオキシダーゼ遺伝
子（Ｉ）を含むDNA断片とベクターDNA断片の混合物をT4
DNAリガーゼで処理する。用いられるベクターDNAとして
は、pBR322、pUC18、pUC19、〔宝酒造（株）社製3050,3
218,3219〕等があげられる。また制限酵素としてはHind
III、EcoR I、Pst I〔宝酒造（株）社製1073S〕、BamH
I等があげられる。
このようにしてフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を
ベクターDNAに結合した組換えDNAを得ることができる。
ベクターDNAに結合した組換えDNAを得ることができる。
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）の塩基配列の決
定〉 プラスミドベクターpUC19にサブクローニングしたDNA断
片は、原理的にHenikoffの方法およびYanisch-Perronの
方法〔Henikoff,S.（1984）Gene,28,351〜359Yanisch-P
erron,C.,Vieira,J.and Messing,J.（1985）Gene,33,10
3〜119〕でデリーションミュータントを作成するが市販
のデリーション・キット〔宝酒造（株）社製6030〕も使
用できる。
定〉 プラスミドベクターpUC19にサブクローニングしたDNA断
片は、原理的にHenikoffの方法およびYanisch-Perronの
方法〔Henikoff,S.（1984）Gene,28,351〜359Yanisch-P
erron,C.,Vieira,J.and Messing,J.（1985）Gene,33,10
3〜119〕でデリーションミュータントを作成するが市販
のデリーション・キット〔宝酒造（株）社製6030〕も使
用できる。
デリーションミュータントは、ジデオキシ法〔Sanger,
F.（1981）Science,214,1205〜1210〕により塩基配列を
決定する。市販のシークエンシング・キット〔宝酒造
（株）社製6010A,6015A,ニッボン・ジーン（株）社製31
7-01121〕も使用できる。
F.（1981）Science,214,1205〜1210〕により塩基配列を
決定する。市販のシークエンシング・キット〔宝酒造
（株）社製6010A,6015A,ニッボン・ジーン（株）社製31
7-01121〕も使用できる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）を含むアラゲカワ
ラタケの染色体DNAのEcoR I断片はプラスミドpUC19のマ
ルチクローニング部位内のEcoR I部位にサブクローニン
グした形態で大腸菌JM109（ATCC53323）に常法〔例え
ば、Lederberg.E.M.＆Cohen,S.N.Journal of Bacteriol
ogy,119,1072〜1074（1974）〕により形質転換した。こ
の形質転換大腸菌0J-P0G-E1は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託し、その寄託番号は、微工研菌寄第1004
8号（FERM P-10048）である。
ラタケの染色体DNAのEcoR I断片はプラスミドpUC19のマ
ルチクローニング部位内のEcoR I部位にサブクローニン
グした形態で大腸菌JM109（ATCC53323）に常法〔例え
ば、Lederberg.E.M.＆Cohen,S.N.Journal of Bacteriol
ogy,119,1072〜1074（1974）〕により形質転換した。こ
の形質転換大腸菌0J-P0G-E1は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託し、その寄託番号は、微工研菌寄第1004
8号（FERM P-10048）である。
〈組換えDNA〉 このようにして得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子
（Ｉ）の利用法は、微生物、植物および動物のベクター
DNA等に組込んで微生物、植物および動物に導入しフェ
ノールオキシダーゼまたはこの改良タンパク質を著量生
産する新規な生物を作成することを可能ならしめること
にある。
（Ｉ）の利用法は、微生物、植物および動物のベクター
DNA等に組込んで微生物、植物および動物に導入しフェ
ノールオキシダーゼまたはこの改良タンパク質を著量生
産する新規な生物を作成することを可能ならしめること
にある。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のベクターへの組
込みは通常、試験管内で次のように行なうことができ
る。
込みは通常、試験管内で次のように行なうことができ
る。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のDNA両端を必要
によりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要な
DNAを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩
基を複数個重合させる。その後、これを目的とするベク
ターに組込む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵
素で切断し、必要により適当なリンカーまたはアニーリ
ング可能な組合わせの塩基を複数個重合させる。このよ
うに加工した二重鎖DNAとベクターDNAを混合し、T4リガ
ーゼを用いて接続させる。
によりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要な
DNAを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩
基を複数個重合させる。その後、これを目的とするベク
ターに組込む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵
素で切断し、必要により適当なリンカーまたはアニーリ
ング可能な組合わせの塩基を複数個重合させる。このよ
うに加工した二重鎖DNAとベクターDNAを混合し、T4リガ
ーゼを用いて接続させる。
得られた組換えDNAは、ベクターの宿主である微生物、
植物、植物細胞および動物細胞に導入する。ここで用い
得る宿主としては各種のものがあり、例えばサッカロミ
セス・セレビシエ等のサッカロミセス属等の酵母、タバ
コ、ペチュニア等のナス科植物細胞、BalbIC3T3等の動
物培養細胞が好適である。これら宿主に使用されるベク
ターを以下に例示する。酵母ベクターとしてpJDB219,YE
p13,YRp7,YIp1,pYC,pTC2、植物ベクターとしてTiプラス
ミド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイクウィル
ス由来の各種ベクター類（バイナリー型ベクターをも含
む）、動物ベクターとしてSV40由来のpSVK+,pI−11β
−，pSVHin＋Ｋ＋,pβ2x,pSXβ＋などがある。ただし、
Tiプラスミド由来の植物ベクターの場合は、得られた組
換えDNAを一旦アグロバクテリウム・ツメフアシエンスT
37等に導入し、本組換え微生物を植物細胞にCO-culture
することなどにより感染させることによって宿主植物に
組換えDNAを導入することができる。
植物、植物細胞および動物細胞に導入する。ここで用い
得る宿主としては各種のものがあり、例えばサッカロミ
セス・セレビシエ等のサッカロミセス属等の酵母、タバ
コ、ペチュニア等のナス科植物細胞、BalbIC3T3等の動
物培養細胞が好適である。これら宿主に使用されるベク
ターを以下に例示する。酵母ベクターとしてpJDB219,YE
p13,YRp7,YIp1,pYC,pTC2、植物ベクターとしてTiプラス
ミド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイクウィル
ス由来の各種ベクター類（バイナリー型ベクターをも含
む）、動物ベクターとしてSV40由来のpSVK+,pI−11β
−，pSVHin＋Ｋ＋,pβ2x,pSXβ＋などがある。ただし、
Tiプラスミド由来の植物ベクターの場合は、得られた組
換えDNAを一旦アグロバクテリウム・ツメフアシエンスT
37等に導入し、本組換え微生物を植物細胞にCO-culture
することなどにより感染させることによって宿主植物に
組換えDNAを導入することができる。
なお、本発明において、アミノ酸、ポリペプチドはIUPA
C-IUB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記
するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
C-IUB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記
するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
Ala Ｌ−アラニン Arg Ｌ−アルギニン Asn Ｌ−アスパラギン Asp Ｌ−アスパラギン酸 Cys Ｌ−システイン Gln Ｌ−グルタミン Glu Ｌ−グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ−ヒスチジン Ile Ｌ−イソロイシン Leu Ｌ−ロイシン Lys Ｌ−リジン Met Ｌ−メチオニン Phe Ｌ−フェニルアラニン Pro Ｌ−プロリン Ser Ｌ−セリン Thr Ｌ−スレオニン Trp Ｌ−トリプトファン Tyr Ｌ−チロシン Val Ｌ−バリン また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌク
レオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし下記
の略号を用いる。
レオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし下記
の略号を用いる。
Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。） Ｃ シトシン（デオキシシチジル酸を示す。） Ｇ グアニン（デオキシグアニル酸を示す。） Ｔ チミン （デオキシチミジル酸を示す。） 〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌の染色体由来のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニング及び塩基配
列の決定について詳細に説明する。
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニング及び塩基配
列の決定について詳細に説明する。
実施例１ 〈DNAプローブの合成〉 DNAプローブの合成は、アミダイト法により、DNA合成機
（日本ゼオンGenetA III）を用いて行なった。
（日本ゼオンGenetA III）を用いて行なった。
３種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ（IFO4917）、カ
ワラタケ（IFO30340）、カイガラタケ（IFO8714）〕か
ら精製したフェノールオキシダーゼのＮ末端からのアミ
ノ酸配列をエドマン分解法で25段目まで分析した結果を
次に示す。
ワラタケ（IFO30340）、カイガラタケ（IFO8714）〕か
ら精製したフェノールオキシダーゼのＮ末端からのアミ
ノ酸配列をエドマン分解法で25段目まで分析した結果を
次に示す。
上記配列の17段目のProから25段目のValに対応するよう
に、次のDNAプローブを合成した。但しＩはデオキシイ
ノシン。
に、次のDNAプローブを合成した。但しＩはデオキシイ
ノシン。
また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをBr
CNで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔（溶
出条件，カラム:Phenyl-5PW RP（東洋ソーダ社製），溶
出液20％アセトニトリル/0.1％TFAから75％アセトリト
リル/0.1％TFLへの濃度勾配溶出，温室）〕で分離した
ポリペプチドのアミノ酸配列をエドマン分解法で分析し
た結果を次に示す。
CNで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔（溶
出条件，カラム:Phenyl-5PW RP（東洋ソーダ社製），溶
出液20％アセトニトリル/0.1％TFAから75％アセトリト
リル/0.1％TFLへの濃度勾配溶出，温室）〕で分離した
ポリペプチドのアミノ酸配列をエドマン分解法で分析し
た結果を次に示す。
アラゲカワラタケ Met-Ala-Phe-Asn-Phe カワラタケ Met-Ala-Phe-Asn-Phe カイガラタケ Met-Ala-Phe-Asn-Phe 上記アミノ酸配列に対応するように次のDNAプローブを
合成した。
合成した。
以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するDNAプローブを用いることにより、いか
なる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをもクローニ
ングすることができる。したがって以下の実施例では、
アラゲカワラタケのフェノールオキシダーゼ遺伝子
（Ｉ）のクローニング方法について説明する。
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するDNAプローブを用いることにより、いか
なる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをもクローニ
ングすることができる。したがって以下の実施例では、
アラゲカワラタケのフェノールオキシダーゼ遺伝子
（Ｉ）のクローニング方法について説明する。
実施例２ 〈染色体DNAの調製〉 アラゲカワラタケ（IFO4917）を１のYPD培地（酵母エ
キス10g/l,ポリペプトン20g/l,グルコース20g/l）が入
った5l容三角フラスコに植菌し、27℃,7日間振盪培養し
た。培養後、集菌し、液体窒素中で凍結した結果、約20
gの凍結菌体を得た。
キス10g/l,ポリペプトン20g/l,グルコース20g/l）が入
った5l容三角フラスコに植菌し、27℃,7日間振盪培養し
た。培養後、集菌し、液体窒素中で凍結した結果、約20
gの凍結菌体を得た。
10gの凍結菌体を液体窒素下で乳鉢を用いて約15分間破
砕した。あらかじめ42℃に保温した緩衝液（0.1M NaCl,
0.1M Tris-HCl,0.1M EDTA,pH8）10mlにプロティナーゼ
Ｋ（最終濃度100μg/mlベーリンガー・マンハイム山之
内161519）を加え、その中に5gの破砕菌体を入れ穏やか
に撹拌しながら２時間反応させた。等量のTE（10mM Tri
s-HC1,1mM EDTA,pH8）飽和フェノールで染色体DNAを抽
出後、エタノール沈澱を行ない、再び5mlのTEに溶か
し、37℃,30分間RNaseA（最終濃度100μg/ml宝酒造
（株））処理し、RNAを除いた。CsC1を用いた平衡密度
勾配遠心分離（ベックマン,VTi80ローター,15℃,50krp
m,16時間）を行ない、精製した染色体DNAを1.5mg得た。
砕した。あらかじめ42℃に保温した緩衝液（0.1M NaCl,
0.1M Tris-HCl,0.1M EDTA,pH8）10mlにプロティナーゼ
Ｋ（最終濃度100μg/mlベーリンガー・マンハイム山之
内161519）を加え、その中に5gの破砕菌体を入れ穏やか
に撹拌しながら２時間反応させた。等量のTE（10mM Tri
s-HC1,1mM EDTA,pH8）飽和フェノールで染色体DNAを抽
出後、エタノール沈澱を行ない、再び5mlのTEに溶か
し、37℃,30分間RNaseA（最終濃度100μg/ml宝酒造
（株））処理し、RNAを除いた。CsC1を用いた平衡密度
勾配遠心分離（ベックマン,VTi80ローター,15℃,50krp
m,16時間）を行ない、精製した染色体DNAを1.5mg得た。
実施例３ 〈染色体DNAのコスミドライブラリーの構築〉 上述の精製した染色体DNA250μｇに制限酵素Sau3AIを加
え、37℃で部分分解し、部分分解物から５〜25％ショ糖
密度勾配遠心分離法（ベックマンSW40Tiローター,15℃,
22.5krpm,16時間）により32〜46Kbの染色体DNA断片を約
４μｇ得た。
え、37℃で部分分解し、部分分解物から５〜25％ショ糖
密度勾配遠心分離法（ベックマンSW40Tiローター,15℃,
22.5krpm,16時間）により32〜46Kbの染色体DNA断片を約
４μｇ得た。
制限酵素BamH Iを加え37℃,12時間反応させて完全分解
した後、アルカリフォスファスターゼ〔宝酒造（株）社
製2250A〕で37℃,30分間脱リン酸処理し、フェノール抽
出したコスミドベクター10μｇと32〜46Kbの染色体DNA
断片１μｇを混合し、T4DNAリガーゼを加えて15℃,1晩
反応させてDNA鎖の結合反応を行なった。
した後、アルカリフォスファスターゼ〔宝酒造（株）社
製2250A〕で37℃,30分間脱リン酸処理し、フェノール抽
出したコスミドベクター10μｇと32〜46Kbの染色体DNA
断片１μｇを混合し、T4DNAリガーゼを加えて15℃,1晩
反応させてDNA鎖の結合反応を行なった。
得られた結合反応物を、アマシャム・ジャパン社製のイ
ン・ビトロ・パッケージングキットを用いてパッケージ
ングを行ない、指示菌DH1に感染させた結果、１μｇの
染色体DNA当り、約50,000株のApr（アンピシリン耐性）
株を得て、染色体DNAのコスミドライブラリーとした。
ン・ビトロ・パッケージングキットを用いてパッケージ
ングを行ない、指示菌DH1に感染させた結果、１μｇの
染色体DNA当り、約50,000株のApr（アンピシリン耐性）
株を得て、染色体DNAのコスミドライブラリーとした。
実施例４ 〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニン
グ〉 コスミドライブラリーの約5,000株の組換え大腸菌をア
ンピシリン（最終濃度50μg/ml）を含む20枚のLB寒天培
地上にコロニーを形成させた。コロニーを２枚のニトロ
セルロースフィルター（アマシャム・ジャパン（株）社
製）に移し取った。コロニーを上にして、フィルターを
変性溶液（1.5M NaCl,0.5M NaOH）に浸した濾紙の上に
置き、７分間放置し、次にフィルターを中和溶液（1.5M
NaCl,0.5M NaOH）に浸した濾紙の上に置き３分間放置
後新しく中和溶液に浸した濾紙の上に置き３分間放置し
た。フィルターを２×SSC（0.3M NaCl,0.03Mクエン酸三
ナトリウム）で洗浄、風乾後、80℃で２時間処理し、DN
Aをフィルターに固定した。
グ〉 コスミドライブラリーの約5,000株の組換え大腸菌をア
ンピシリン（最終濃度50μg/ml）を含む20枚のLB寒天培
地上にコロニーを形成させた。コロニーを２枚のニトロ
セルロースフィルター（アマシャム・ジャパン（株）社
製）に移し取った。コロニーを上にして、フィルターを
変性溶液（1.5M NaCl,0.5M NaOH）に浸した濾紙の上に
置き、７分間放置し、次にフィルターを中和溶液（1.5M
NaCl,0.5M NaOH）に浸した濾紙の上に置き３分間放置
後新しく中和溶液に浸した濾紙の上に置き３分間放置し
た。フィルターを２×SSC（0.3M NaCl,0.03Mクエン酸三
ナトリウム）で洗浄、風乾後、80℃で２時間処理し、DN
Aをフィルターに固定した。
合成DNAプローブ15mer-AとB,および26mer-CとＤを放射
性同位元素〔γ−32P〕ATP（アマシャム・ジャパン
（株）社製）とT4ポリヌクレオチドキナーゼ〔宝酒造
（株）社製2021A〕を用いてラベルし、フィルターに固
定したDNAとハイブリダイズさせた結果、15merおよび26
merの２種類の合成DNAプローブとハイブリダイズするク
ローン、すなわちフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
が組込まれたコスミドを持つ大腸菌を得ることができ
た。
性同位元素〔γ−32P〕ATP（アマシャム・ジャパン
（株）社製）とT4ポリヌクレオチドキナーゼ〔宝酒造
（株）社製2021A〕を用いてラベルし、フィルターに固
定したDNAとハイブリダイズさせた結果、15merおよび26
merの２種類の合成DNAプローブとハイブリダイズするク
ローン、すなわちフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
が組込まれたコスミドを持つ大腸菌を得ることができ
た。
コスミドに組込まれた染色体DNA断片の中でフェノール
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするためにコスミドを制限酵素Hi
nd III、またはEcoR IまたはSma Iで切断し、１％のア
ガロースゲル電気泳動法で分子量別に分離し、サザンブ
ロッティング法（Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,98,503〜
517,1975によりフィルターに固定化し、32Pでラベルし
た合成DNAプローブ（26mer-C,Dおよび15mer-A,B）と、
ハイブリダイズさせた結果、26mer-C,Dプローブは、Hin
d III5.3Kb,EcoR I4.6Kb,Sma I1.9KbのDNA断片にハイブ
リダイズし、15mer-A,Bプローブは、Hind III5.3Kb,Eco
R I4.6Kb,Sma I2.4KbのDNA断片にハイブリダイズした。
オキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするためにコスミドを制限酵素Hi
nd III、またはEcoR IまたはSma Iで切断し、１％のア
ガロースゲル電気泳動法で分子量別に分離し、サザンブ
ロッティング法（Southern,E.M.,J.Mol.Biol.,98,503〜
517,1975によりフィルターに固定化し、32Pでラベルし
た合成DNAプローブ（26mer-C,Dおよび15mer-A,B）と、
ハイブリダイズさせた結果、26mer-C,Dプローブは、Hin
d III5.3Kb,EcoR I4.6Kb,Sma I1.9KbのDNA断片にハイブ
リダイズし、15mer-A,Bプローブは、Hind III5.3Kb,Eco
R I4.6Kb,Sma I2.4KbのDNA断片にハイブリダイズした。
それぞれのDNA断片をpUC19にサブクローニングした後、
制限酵素物理地図を作成した（第１図）。
制限酵素物理地図を作成した（第１図）。
実施例５ 〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）の塩基配列〉 プラスミドpUC19にサブクローニングしたEcoR I4.6Kb,S
ma I2.4Kb,Sma I1.9Kb,Hind III5.3KbDNA断片を宝酒造
社製のデリーションキットを使用し、100〜200bpおきに
デリーションミュータントを作成し、宝酒造社製のシー
クエンシングキットを用いて、フェノールオキシダーゼ
遺伝子（Ｉ）の塩基配列を決定し、同時にアミノ酸配列
も決定した（第２図）。
ma I2.4Kb,Sma I1.9Kb,Hind III5.3KbDNA断片を宝酒造
社製のデリーションキットを使用し、100〜200bpおきに
デリーションミュータントを作成し、宝酒造社製のシー
クエンシングキットを用いて、フェノールオキシダーゼ
遺伝子（Ｉ）の塩基配列を決定し、同時にアミノ酸配列
も決定した（第２図）。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）は、EcoR I4.6KbD
NA断片内で10個のイントロンに分断された形態で染色体
DNAにコードされていることが判明した。
NA断片内で10個のイントロンに分断された形態で染色体
DNAにコードされていることが判明した。
本発明により、次の効果がある。
フェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列の提供によ
りリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役割
が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる。
りリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役割
が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる。
フェノールオキシダーゼをコードしているDNAは、他
の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミド、
ファージ、ウイルスなどのベクターに連結し、形質転換
や形質導入で組換え体を作成する方法、または、DNA断
片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組換え体
を作成する方法）で組換えることができ、フェノールオ
キシダーゼを著量生産する新規な生物を作成することが
できる。
の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミド、
ファージ、ウイルスなどのベクターに連結し、形質転換
や形質導入で組換え体を作成する方法、または、DNA断
片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組換え体
を作成する方法）で組換えることができ、フェノールオ
キシダーゼを著量生産する新規な生物を作成することが
できる。
フェノールオキシダーゼをコードしているDNAを組換
えた新規生物で著量生産したフェノールオキシダーゼは
セルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、バイオロジ
カルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収量の低下が
ない。
えた新規生物で著量生産したフェノールオキシダーゼは
セルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、バイオロジ
カルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収量の低下が
ない。
フェノールオキシダーゼをコードしているDNAを組換
えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼは、
純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリルビ
ン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた品質
の酵素として利用できる。
えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼは、
純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリルビ
ン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた品質
の酵素として利用できる。
第１図は、染色体DNA上のフェノールオキシダーゼ遺伝
子（Ｉ）付近の制限酵素切断地図を示す。斜線部分にフ
ェノールオキシダーゼがコードされている。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）の全塩
基配列とアミノ酸配列を示す。
子（Ｉ）付近の制限酵素切断地図を示す。斜線部分にフ
ェノールオキシダーゼがコードされている。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）の全塩
基配列とアミノ酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (3)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列をコードするDNAがイン
トロンにより分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺
伝子（Ｉ） - 【請求項２】フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が下
記配列のDNA配列を有するものである請求項１記載のフ
ェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ） - 【請求項３】請求項１乃至２のいずれかの項に記載のフ
ェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）をベクターDNAに結
合した組換えDNA
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63149102A JPH0746995B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（１） |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63149102A JPH0746995B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（１） |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH025876A JPH025876A (ja) | 1990-01-10 |
| JPH0746995B2 true JPH0746995B2 (ja) | 1995-05-24 |
Family
ID=15467741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63149102A Expired - Fee Related JPH0746995B2 (ja) | 1988-06-16 | 1988-06-16 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（１） |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0746995B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0671424B2 (ja) * | 1986-03-18 | 1994-09-14 | 新王子製紙株式会社 | リグニン分解酵素およびその製造方法 |
-
1988
- 1988-06-16 JP JP63149102A patent/JPH0746995B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH025876A (ja) | 1990-01-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |