JPH0227985A - フェノールオキシダーゼ遺伝子（１） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業の利用分野〕 本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）に関す
るものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダーゼ
産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタ
ケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｈｉｒｓｕｔｕｓ　ＩＦＯ４９
１７）　）由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
に関する。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）は種々の生物に導
入することにより、バイオロジカルパルピングやバイオ
ブリーチングや工場廃水の脱色や木材糖化の前処理や臨
床試験用試薬として利用することができるフェノールオ
キシダーゼを生産することができる。

〔従来技術〕

フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。

白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させパルプを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている　（特開昭５０−４６９
０３号）、シかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだ
けでなく、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロ
ースをも分解する能力を有しており、パルプ収率の低下
という問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニ
ン分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかか
るという問題点もあった。

白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産、分
泌するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考
えられており、その遺伝子をクローニングする試みも行
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類催の活性を持っている
ラッカーゼについては、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子の
クローニング（Ｕ、Ａ。

Ｇａｒｍａｎｎ、　Ｋ、Ｌｅｒｃｈ；（１９８８）　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３．８８５−８９６）が報
告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノー
ルオキシダーゼのアミノ酸配列とは異なるものであり、
またノイロスポラ・クラッサのラッカーゼによるリグニ
ン分解についても、まだ報告されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。

自然界におけるリグニンの生分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。

したがって、リグニン分解能力だけを効率的に発現する
新規生物として白色腐朽菌のフェノ−・ルオキシダーゼ
生産能力を付与した生物が考えられ、本発明は、フェノ
ールオキシダーゼ生産能力を付与する為に必要なフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（１）を提供するものである。

（課題を解決するための手段〕 本発明は、次式、 ＾１ａ　Ｉ　１ｅＧｌｙＰｒｏＴｈｒＡｌａＡｓｐＬｅ
ｕＴｈｒＩ　１ｅＳｅｒＡｓｎＡｌａＩＪｌｕＶａ１の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡがイントロンにより分
断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）に関
する。

さらに、本発明は上記フェノールオキシダーゼ遺伝子（
Ｉ）にハイブリッドするＤＮＡであって、天然、合成、
もしくは半合成によって得られるものであり、前記アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡに対して、ヌクレオチドの
置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位
その他の突然変異によって関連づけられており、かつ、
フェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡであり、または該遺伝子がイントロンで
分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）に
関する。

さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）
をベクターＤＮＡに連結した組換えＤＮＡに関する。

さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）
が下記配列のＤＮＡを有するものであるフェノールオキ
シダーゼ遺伝子（１）に関する。

ＧＴＡＴＣＧＴＧＡＧＴＣＴＡＣＡＴＴＣＧＧＴＣＴＧ
ＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＣＡＡＣＣ
ＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧにＧＡに６’ｌ’ｌ；［ｉＴｌ；
ＡＬｉＬ、ＡＬＬ＋ｌｊＬ、Ｌ、ＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧ
ＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＴ
ＣＣＧＣＡＣ以下に本発明の詳細な説明する。

＜ＤＮＡプローブの合成〉 コスミドライブラリーからコロニー・ハイブリダイゼー
ション法を用いてフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）
をクローニングするために必要となるＤＮＡプローブは
、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をもとに
合成する。フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列
は、特開昭６１２８５９８９号、特開昭６２−２２０１
８９号、及び、特開昭６２−２２０１９０号の方法で生
産、精製したフェノールオキシダーゼのＮ末端からのア
ミノ酸配列と精製したフェノールオキシダーゼをＢｒＣ
Ｎ分解（Ｃｏｌｅ、　Ｒ。

Ｄ、：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、旦、３１５
−３１７（１９６７）　）またはトリプシン分解（Ｌｉ
ｎ、Ｌ、−Ｎ、＆　Ｂｒａｎｄｔｓ、Ｊ、Ｆ、：　Ｂｉ
。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２．５５３（１９８３）　）　
Ｌ、分離したポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸配列
をエドマン分゛解法（Ｅｄｍａｎ、　Ｐ、＆　Ｈｅｎ５
ｃｈｅｎ、八、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、２’ｎｄ　ｄｅ、＋Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ＋ｐｐ２３２〜
２７９（１９７５）参照〕によって決定する。

ＤＮＡプローブの合成は、フォスフオシエステル法、フ
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法で行なうことが
できる。

〈染色体ＤＮＡの調製〉 本発明に用いることができる生物は、フェノールオキシ
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９
１７）、カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタ
ケ（ＩＦＯ５７１４））が良い。

白色腐朽菌を生育繁殖させる培地の組成は、主炭素源と
してグルコースを使用するが白色腐朽菌が資化可能な他
の炭素源を使用してもよく、主窒素源としては酵母エキ
ス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽菌が資化可能な
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、
カゼインなどの有機窒素含有物も使用することができる
。その他、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩
、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩や
コーンステイープリカー、ビタミン類、アミノ酸類、核
酸類などの栄養物質、生長促進物質を添加することも可
能である。

前記の培地に白色腐朽菌を接種し、培養する。

培養後、集菌し、液体窒素中で凍結し、乳鉢中で破砕後
、フェノール抽出法により染色体ＤＮＡを抽出、精製し
、コスミドライブラリー構築に使用する染色体ＤＮＡを
得る。

染色体ＤＮＡのフェノール抽出の前にあらかじめプロテ
イナーゼ処理を行なうと高率よく染色体ＤＮＡを抽出す
ることができる。

〈染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーの構築〉コスミ
ドベクターｐＨｃ７９　　（Ｈｏｈｎ、Ｂ、ａｎｄ　Ｃ
ｏ１１ｉｎｓ。

Ｊ、（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１，２９１）を用いて
染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを構築する。コス
ミドベクターｐＨＣ７９は市販のもの〔例えば、ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ）社製５３５８ＳＡ　、ベーリンガー
・マンハイム山之内■社製５６７７９５　）が使用でき
る。

上記染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａｒ　（宝酒造■
社製１０８２Ａ　）で部分分解し、３２〜４６Ｋｂ　（
キロ塩基対）の大きさの染色体ＤＮＡ断片を得る。一方
、コスミドベクターｐＨＣ７９を制限酵素ＢａｍＨＩ（
宝酒造■社製１０１０Ｓ）で完全分解し、脱リン酸処理
し、上記の部分分解した染色体ＤＮＡの断片を加え、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ〔宝酒造■社製２０１１八］によって
ＤＮＡ鎖の結合反応を行なう。

得られた結合反応物を市販のイン・ビトロ・パッケージ
ングキット〔例えば、アマジャム・ジャパン■社製Ｎ、
３３４Ｙ、プロメガ・バイオチック（Ｐｒ。

ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）社製Ｐ３１５１　）を用いて
成熟ファージ粒子中に挿入し、大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ
３３８４９）に感染させ、１μｇの染色体ＤＮＡ当り、
約５０，０００株のＡｐ’　（アンピシリン耐性）株を
得て、染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーとする。

〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）のクローニング
〉 コスミドライブラリーの約１０，０００株の組換え大腸
菌をアンピシリンを含むＬＢ培地（バタトトリプトンＬ
ｏｇ／　ｅ　、バイトイース］・エキス５　ｇ／　ｌ　
、塩化ナトリウム１０ｇ／　１　、寒天１５ｇ／　Ｉ！
、）上にコロニを形成させる。

コロニーを市販のニトロセルロースフィルターまたはナ
イロンフィルター〔例えば、アマジャム・ジャパン■社
製ＲＰＮ、８２Ｃ，東洋濾紙■社製ＡＯ４５ＢＯ８２Ｃ
）にレプリカし、常法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ＋　Ｍ、＆
　Ｄ、Ｓ、Ｈｏｇｎｅｓｓ　　：　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｔ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７２．３９
６１（１９７５）　）により、フィルター上にＤＮＡを
固定する。

フィルター上のＤＮＡと放射性同位元素２ｇｐ（アマジ
ャム・ジャパン■社製ＰＢ１０１６８）でラベル（Ｒｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，（１９６５）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

口、Ｓ、Ａ、５４．１５８〜１６１．参照］した合成り
ＮＡプローブをハイブリダイズさせフェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（Ｉ）を組込んだ大腸菌を選抜し、常法によ
りコスミドを抽出、精製する。

コスミドに組込まれた染色体ＤＮＡ断片の中でフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（１）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするために制■酵素旧ｎａｍ（全
酒造■社製１０６０Ｓ　）またはＥｃｏＲｌ　　（全酒
造■社製１０４０５　）またはＳｍａＩ　（全酒造■社
製１０８５Ａ）で切断し、アガロースゲル電気泳動法で
分子量刑に分離し、フィルターに固定化した染色体ＤＮ
Ａ断片と２Ｐでラベルした合成りＮＡプローブとハイブ
リダイズさせる。合成りＮＡプローブとハイブリダイズ
するＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵｃ１９　（Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ＋Ｃ，Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、
ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８５）　Ｇｅｎｅ
、　３３．１０３＋Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ（１９８３）　
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０１
．２０〜７８゜全酒造■社製３２１９　）にサブクロー
ニングし、制限酵素地図を作成する。

得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）を含むＤ
ＮＡ断片のベクターＤＮＡへの組み込みは以下のように
行なう。ベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切断してベ
クターＤＮＡ断片を調製する。次いでフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（Ｉ）を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
断片の混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する。用いら
れるベクターＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１
８　、ｐＵｃ１９、〔全酒造■社製３０５０，３２１８
，３２１９　：１等があげられる。また制限酵素として
は旧ｎｄｎｌ、ＥｃｏＲＩ　、　　ＰｓｔＩ〔全酒造■
社製１０７３Ｓ）　、Ｂａｗｌ　Ｉ等があげられる。

このようにしてフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）を
ベクターＤＮＡに結合した組換えＤＮＡを得ることがで
きる。

くフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）の塩基配列の決
定〉 プラスミドベクターｐＵｃ１９にサブクローニングした
ＤＮＡ断片は、原理的にＨｅｎ１ｋｏｆｆの方法および
Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎの方法（Ｈｅｎｉｋｏｆ
ｆ、Ｓ、　（１９８４）Ｇｅｎｅ＋　２８＋　３５１〜
３５９　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅ
ｉｒａ。

Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８５）　Ｇｅ
ｎｅ、３３，１０３〜１１９　）でデリーションミュー
タントを作成するが市販のデリーシジン・キット〔全酒
造■社製６０３０　）も使用できる。

デリーションミュータントは、ジデオキシ法（Ｓａｎｇ
ｅｒ、Ｆ、（１９８１）　５ｃｉｅｎｃｅ、ユ１４．１
２０５〜１２１０）により塩基配列を決定する。市販の
シーフェンシング・キット〔全酒造■社製６０１０Ａ、
６０１５Ａ、ニラポン・ジーン■社製３１７−０１１２
１１も使用できる。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）を含むアラゲカワ
ラタケの染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片はプラスミドｐ
ｔｌ（：１９のマルチクローニング部位内のＥｃｏＲ１
部位にサブクローニングした形態で大腸菌ＪＭ１０９　
（ＡＴＣＣ５３３２３）に常法〔例えば、Ｌｅｄｅｒｂ
ｅｒｇ、Ｅ。

Ｍ、＆　Ｃｏｈｅｎ＋Ｓ、Ｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋　１１９＋１０７２〜１０
７４（１９７４）　）により形質転換した。この形質転
換大腸菌０Ｊ−ＰＯＧ−Ｅ　１は工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託し、その寄託番号は、微工研菌”寄第
１００４８号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１００４８）である。

〈組換えＤＮＡ） このようにして得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子
（１）の利用法は、微生物、植物および動物のベクター
ＤＮＡ等に組込んで微生物、植物および動物に導入しフ
ェノールオキシダーゼまたはこの改良タンパク質を著量
生産する新規な生物を作成することを可能ならしめるこ
とにある。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のベクターへの組
込みは通常、試験管内で次のように行なうことができる
。

フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）のＤＮＡ両端を必
要によりエキソヌクレアーゼで処理し、それぞれに必要
なりＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せ
の塩基を複数個重合させる。

その後、これを目的とするベクターに組込む。組込む方
法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要により
適当なリンカ−またはアニーリング可能な組合せの塩基
を複数個重合させる。このように加工した二重鎖ＤＮＡ
とベクターＤＮＡを混合し、Ｔ４リガーゼを用いて接続
させる。

得られた組換えＤＮＡは、ベクターの宿主である微生物
、植物細胞および動物細胞に導入する。

ここで用い得る宿主としては各種のものかあ・す、例え
ばサツカロミセス・セレビシェ等のサツカロミセス属等
の酵母、タバコ、ペチュニア等のナス科植物細胞、Ｂａ
１ｂＩＣ３Ｔ３等の動物培養細胞が好適である。これら
宿主に使用されるベクターを以下に例示する。酵母ベク
ターとしてｐＪＤＢ２１９．　ＹＥρ１３゜ＹＲｐ７．
Ｙｌｐｌ、ｐＹＣ，ｐＴＣ２、植物ベクターとしてＴｉ
プラスミド由来の各種ベクターやカリフラワーモザイク
ウィルス由来の各種ベクター類（バイナリ−型ベクター
をも含む）、動物ベクターとしてＳＶ４０由来ノｐＳＶ
Ｋ　、　ｐ＋　　ｒ−ｎβ−、ｐｓＶｌｆ、１１＋に＋
、　ｐβ２Ｘ、　ｐＳＸβＦなどがある。ただし、Ｔｉ
プラスミド由来の植物−、フタ−の場合は、得られた組
換えＤ　Ｎ　Ａを一旦アグロバクテリウム・ツメファシ
ェンス７３７等に導入し、木組換え微生物を植物細胞に
ＧＯ−ｃｕｌｔｕｒｅすることなどにより感染させるこ
とによって宿主植物に組換えＤＮＡを導入することがで
きる。

なお、本発明において、アミノ酸、ポリペプチドは　Ｉ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢ　Ｎ）で採用され
た方法により略記するものとし、たとえば下記の略号を
用いる。

ｌａ ＾ｒｇ ｓｎ 八ｓｐ ｙｓ ｉｎ ｌｕ ｌｙ ｌｉｓ １ｅ ｅａ ｙｓ ｅｔ ｈｅ Ｐｒ。

ｅｒ ｈｒ ｒｐ ｙｒ ａｌ Ｌ−アラニン し−アルギニツ し−アスパラギン Ｌ−アスパラギン酸 Ｌ−システィン し−グルタミン し−グルタミン酸 グリシン し−ヒスチジン し−イソロイシン Ｌ−ロイシン Ｌ−リジン し−メチオニン し−フェニルアラニン し−プロリン し−セリン し−スレオニン Ｌ−１−リプトファン し−チロシン Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし下
記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌の染色体由来のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（１）のクローニング及び塩基配
列の決定について詳細に説明する。

実施例１ ＜ＤＮＡプローブの合成〉 ＤＮＡプローブの合成は、アミダイト法により、ＤＮＡ
合成機（日本ゼオンＧｅｎｅｔＡ　Ｉｎ　）を用いて行
なった。

３種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７
）。

カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタケ（ＩＰ
Ｏ８７１４））から精製したフェノールオキシダーゼの
Ｎ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で２５段目
まで分析した結果を次に示す。

カワラタケ カイガラタケ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−ＶａｌＡｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ上記配列の１７段目のＰｒ
ｏから２５段目のＶａｌに対応するように、次のＤＮＡ
プローブを合成した。但し■はデオキシイノシン。

また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
（溶出条件、カラム：　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ　ＲＰ（
東洋ソーダ社製）、　溶出液２０％アセトニトリル１０
．１％ＴＦＡから７５％アセトリトリル１０．１％ＴＦ
Ｌへの濃度勾配溶出、室温）〕で分離したポリペプチド
のアミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に
示す。

７ラケカ７ラタケ　　　　Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−＾
５ｎ−Ｐｈｅカワラタケ　　　　　　　Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−＾５ｎ−Ｐｈｅカイガラクケ　　　　　　Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−へ５ｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。

以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをもクロー
ニングすることができる。したがって以下の実施例では
、アラガカワラタケのフェノールオキシダーゼ遺伝子（
１）のクローニング方法について説明スる。

実施例２ 〈染色体ＤＮＡの調製〉 アラゲカワラクケ（ＩＦＯ４９１７）を１１のＹＰＤ培
地（酵母エキス１０ｇ／　Ａ　、ポリペプトン２０ｇ／
　ｆ　、グルコース２０ｇ／　ｌ　）が入った５２容三
角フラスコに植菌し、２７℃、７日間振盪培養した。培
養後、集閑し、液体窒素中で凍結した結果、約２０ｇの
凍結菌体を得た。

１０ｇの凍結菌体を液体窒素下で乳鉢を用いて約１５分
間破砕した。あらかじめ４２°Ｃに保温した緩衝ン＆（
０，１Ｍ　　ＮａＣ１，０，１１１Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ、
　　０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ、　　ｐＨ８）１０ｍＺにプ
ロティナーゼＫ（最終濃度１００μｇ／ｍｆヘーリンガ
ー・マンハイム山之内１６１５１９）を加え、その中に
５ｇの破砕菌体を入れ穏やかに撹拌しながら２時間反応
させた。等量のＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８）飽和フェノールで
染色体ＤＮＡを抽出後、エタノール沈澱を行ない、再び
５ｄのＴＨに溶かし、３７℃、　３０分間ＲＮａｓｅＡ
　　（最終濃度１０Ｑｕｇ／ｍｌ　　宝酒造１１）処理
し、ＲＮＡを除いた。ＣｓＣｌを用いた平衡密度勾配遠
心分離（ベックマン、νＴｉ８００−ター、　１５°Ｃ
，５０ｋｒｐｍ、　１６時間）を行ない、精製した染色
体ＤＮＡを１．５　ｔａｇ得た。

実施例３ 〈染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーの構築〉上述の
精製した染色体ＤＮＡ２５０１Ｉｇに制限酵素５ａｕ３
ＡＩを加え、３７°Ｃで部分分解し、部分分解物から５
〜２５％シ：Ｆ塘密度勾配遠心分離法（ベックマン５Ｗ
４０　Ｔｉローター、１５°Ｃ，２２，５ｋｒｐｍ、　
１６時間）により３２〜４６Ｋｂの染色体ＤＮＡ断片を
約４μｇ得た。

制限酵素ＢａｍＨＩを加え３７°ｃ、１２時間反応させ
て完全分解した後、アルカリフォスファターゼ〔宝酒造
■社製２２５０Ａ、）で３７°Ｃ，３０分間脱リン酸処
理し、フェノール抽出したコスミドベクター１０μｇと
３２〜４６Ｋｂの染色体ＤＮＡ断片１μｇを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを加えて１５°Ｃ，１晩反応させてＤ
ＮＡ鎖の結合反応を行なった。

得られた結合反応物を、アマジャム・ジャパン社製のイ
ン・ビトロ・パッケージングキットを用いてパンケージ
ングを行ない、指示菌ＤＩ１１に感染させた結果、ｌｕ
ｇの染色体ＤＮＡ当り、約５０．０００株のＡｐ’　（
アンピシリン耐性）株を得て、染色体ＤＮＡのコスミド
ライブラリーとした。

実施例４ 〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）のクローニング
） コスミドライブラリーの約５．０００株の組換え大腸菌
をアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｎ／）を含む２０
枚のＬＢ寒天培地上にコロニーを形成させた。

コロニーを２枚のニトロセルロースフィルター（アマジ
ャム・ジャパン■社製）に移し取った。

コロニーを上にして、フィルターを変性溶液（１，５Ｍ
　ＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）に浸した濾紙の上に
置き、７分間放置し、次にフィルターを中和溶液（１，
５ＭＮａＣ１，０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）に浸した濾紙の上
に置き３分間放置後新しく中和溶液に浸した濾紙の上に
置き３分間放置した。フィルターを２　Ｘ５ＳＣ（０，
３Ｍ　ＮａＣ１゜０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム）で
洗浄、風乾後、８０°Ｃで２時間処理し、ＤＮＡをフィ
ルターに固定した。

合成りＮＡプローブ１５ｍｅｒ−ＡとＢ、および２６ｍ
ｅｒ−ＣとＤを放射性同位元素（γ−：＋ｚｐ）ＡＴＰ
（アマジャム・ジャパン■社製）とＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ〔宝酒造■社製２０２１Ａ）を用いてラベル
し、フィルターに固定したＤＮＡとハイブリダイズさせ
た結果、１５ｍｅｒおよび２６ｍｅｒの２種類の合成り
ＮＡプローブとハイブリダイズするクローン、すなわち
フェノールオキシダーゼ遺伝子（１）が組込まれたコス
ミドを持つ大腸菌を得ることができた。

コスミドに組込まれた染色体ＤＮＡ断片の中でフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）が含まれている部分を限定
し、サブクローニングするためにコスミドを制限酵素旧
ｎｄＩ［、またはＥｃｏＲＩまたはＳｒｍａ　Ｔで切断
し、１％のアガロースゲル電気泳動法で分子量−別に分
離し、サザンプロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ
、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８，５０３〜５
１７＋１９．７５によりフィルターに固定化し、ｔｚｐ
でラベルした合成りＮＡプローブ°（２６ｍｅｒ−Ｃ、
Ｄおよび１５＋＋＋ｅｒ−Ａ、Ｂ）と、ハイブリダイズ
させた結果、２６ｍａｒ−ＣＤプローブは、ＨｉｎｄＩ
［Ｉ　５．３Ｋｂ、　ＥｃｏＲＩ　４．６Ｋｂ。

Ｓｍａｌ　１．９ＫｂのＤＮＡ断片にハイブリダイズし
、１５ｍｅｒ−Ａ、Ｂプローブは、旧ｎｄＩ［Ｉ　５．
３Ｋｂ、　ＥｃｏＲＩ　４．６にす、　ＳｍａＩ　２．
４ＫｂのＤＮＡ断片にハイブリダイズした。

それぞれのＤＮＡ断片をｐＵｃ１９にサブクローニング
した後、制限酵素物理地図を作成した（第１図）。

実施例５ くフェノールオキシダーゼ遺伝子（１）の塩基配列〉 プラスミドＩ）ＵＣｌ３にサブクローニングしたＥｃｏ
ＲＩ４．６Ｋｂ、　Ｓｍａｌ　２．４Ｋｂ、　Ｓｍａｌ
　１．９Ｋｂ、　　ｌ１ｉｎｄｌｌ［５，３ＫｂＤＮＡ
断片を宝酒造社製のプリージョンキットを使用し、１０
０〜２００ｂｐおきにデリーションミュータントを作成
し、宝酒造社製のシークエンシングキントを用いて、フ
ェノールオキシダーゼ遺伝子（【）の塩基配列を決定し
、同時にアミノ酸配列も決定した（第２図）。

フェノールオキシダーゼ遺伝子Ｎ）は、ＥｃｏＲＩ４．
６ＫｂＤＮＡ断片内で１０個のイントロンに分断された
形態で染色体ＤＮＡにコードされていることが判明した
。

〔発明の効果〕

本発明により、次の効果がある。

■　フェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列の提供に
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。

■　フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡは
、他の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入でＭｉ換え体を作成する方法、または、
ＤＮＡ断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し
組換え体を作成する方法）で組換えることができ、フエ
ノー−ルオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成
することができる。

■　フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物で著量生産したフェノールオキシダー
ゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、バイオ
ロジカルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収量の低
下がない。

■　フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダ・−
ゼは、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビ
リルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれ
た品質の酵素として利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、染色体ＤＮＡ上のフェノールオキシダーゼ遺
伝子（１）付近の制限酵素切断地図を示す。斜線部分に
フェノールオキシダーゼがコードされている。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ）の全塩
基配列とアミノ酸配列を示す。 第 図 （その ｒ１１ｅ ｈｅＶａＩＶａＩＴｙｒＡｓｐＰｒｏＡｓｎＡｓｐＰｒ
ｏＨｉ、ｓＡｌａＳｅｒＬｅｕＴｙｒＡｓｐＶａｌＡｓ
ｐＡｓｎＡｅＡｓｎＰｈｅ ＡｓｎＡｓｐＧｌｎ 第 図 （その３ ＴＧＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴ
ＣＴＣＡＣＣＴＧＨｉＳＡｌａＰｈ　ｅＡ１ａＶａＩＶ
ａＩＡｒｇＳｅｒＡｌａＧ１３／５ｅｒ−１−ｈｒＶａ
ｌ−１−３／ｒ　ＩＪｋＳｎ第 図 （その４

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡがイントロ
   ンにより分断されてなるフェノールオキシダーゼ遺伝子
   （ I ）。 【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項１記載のＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡ
   配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
   られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
   、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
   オチド配列の逆位その他の突然変異によって関連づけら
   れており、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有する
   ポリペプチドをコードするＤＮＡであり、または該遺伝
   子がイントロンで分断されてなるフェノールオキシダー
   ゼ遺伝子（ I ）。
3. （３）請求項１乃至２のいずれかの項に記載のフェノー
   ルオキシダーゼ遺伝子（ I ）をベクターＤＮＡに結合
   した組換えＤＮＡ。
4. （４）フェノールオキシダーゼ遺伝子（ I ）が下記配
   列のＤＮＡを有するものである請求項１記載のフェノー
   ルオキシダーゼ遺伝子（ I ）。 【遺伝子配列があります】