JPH0746998A

JPH0746998A - ヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体

Info

Publication number: JPH0746998A
Application number: JP6115367A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Tsuchiya; 政幸土屋; Isao Sato; 功佐藤; Yuichi Hirata; 裕一平田
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-05-31
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1995-02-21
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: JP3614183B2

Abstract

(57)【要約】【構成】（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒ
トＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでＬ鎖Ｖ領域、を含んで
成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ
鎖；を含んで成るヒトＩＬ−６に対する再構成された抗
体。【効果】この再構成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由
来し、そしてマウスＣＤＲは抗原性が低いから、本発明
の再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そして
それ故にＩＬ−６による情報伝達を阻害し、ＩＬ−６に
起因する疾患の治療剤として期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
−６（ＩＬ−６）に対するマウスモノクローナル抗体Ｓ
Ｋ２の可変領域（Ｖ領域）とヒト抗体の定常領域（Ｃ領
域）とから成るヒト／マウスキメラ抗体、ヒトライト鎖
（Ｌ鎖）Ｖ領域及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補
性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−６に対するマウスモ
ノクローナル抗体ＳＫ２のＣＤＲにより置き換えられて
いる再構成（ｒｅｓｈｅｐｅｄ）ヒト抗体およびそれら
の抗体を構成するＬ鎖またはＨ鎖に関する。

【０００２】本発明はさらに、上記の抗体特にそのＶ領
域をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前
記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並
びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本
発明はさらに、ヒトＩＬ−６に対するキメラ抗体の製造
方法、及びヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト抗体の製造
方法を提供する。

【０００３】

【従来の技術】インターロイキン−６（ＩＬ−６）は一
連の細胞により生産される多機能サイトカインである。
このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そ
して宿主防御機構において中心的役割を演ずる（Ｋｉｓ
ｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ，７４，１−１０，１９８
９）。このものは広範な組織に作用して、標的細胞の性
質に応じて成長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効
果を発揮する。

【０００４】ＩＬ−６遺伝子の異常発現が種々の疾患、
特に自己免疫疾患、メサンジウム細胞増殖性糸球体腎
炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発病に関与することが示
唆されている（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏ
ｄａｙ，１１，４４３−４４９，１９９０；Ｃｌｅｉ
ｎ，Ｂ．ら、Ｅｕｒ．ＣｙｔｏｋｉｎｅＮｅｔ．１，
１９３−２０１，１９９０）。従って、ＩＬ−６の機能
を阻害する抗体はヒト患者における治療剤として有用で
あることが期待される。

【０００５】現に、形質細胞腫を有する末期患者を治療
するためにヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル
抗体を用いた臨床研究において、形質細胞腫細胞の増殖
のブロック、並びに循環Ｍ蛋白質、血清カルシウム、血
清ＩｇＧ及びＣ−反応性蛋白質の低下が示された（Ｋｌ
ｅｉｎ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ，７８，１１９８−１２０
４，１９９１；Ｋｌｅｉｎ，Ｂら、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１４３，７７４−７７６，１９９２）。

【０００６】マウスのモノクローナル抗体はヒトにおい
て高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があ
り、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの療法
的価値は制限される。さらに、マウス抗体は、予定され
た効果を妨害するのみならず、患者における不都合なア
レルギー応答の危険をもたらす免疫応答を惹起すること
なくして頻回投与することはできない。

【０００７】これらの問題を解決するため、ヒト型化
（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。
マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。
より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクロー
ナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由
来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメ
ラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、
そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に
結合することを期待することができる。

【０００８】さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来す
る蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそ
れ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想
される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性
が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ず
る可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４２２０−４
２２４，１９８９）。

【０００９】マウス抗体をヒト型化するための第二の方
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免
疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領
域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉ
ｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト抗体可変領域
に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体可
変領域を作製する。

【００１０】次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト
抗体定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型
抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと
極く一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲ
は超可変蛋白質配列により構成されている。これらは種
特異的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣ
ＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含
有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずで
ある。

【００１１】再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｃ
ｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３−
３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８；Ｋ
ｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎＥｎｇｎｇ．４，７７３−７８３，１９９１；Ｍａ
ｅｄａ，Ｈ．ら、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄＨｙｂｒｉｄｏｍａ，２，１２４−１３４，１
９９１；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１８１−４１
８５，１９９１；Ｔｅｍｐｅｒｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７１，１９９
１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，１９
９１；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，
１９９２；Ｃｏ．Ｍ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４７，１１４９−１１５４，１９９２；及びＳａｔｏ，
Ｋ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３，１−６，１９９
３を参照のこと。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】前記のごとく、再構成
ヒト抗体は治療目的のために有用であると予想される
が、ヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト抗体は知られてい
ない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法であって任意
の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在しない。
従って、特定の抗原に対して十分に活性がある再構成ヒ
ト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例
えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５
３，８５１−８５６（１９９３））。

【００１３】本発明者らはヒトＩＬ−６に対するマウス
モノクローナル抗体ＳＫ２がｉｎｖｉｖｏ動物実験でＩ
Ｌ−６の機能を強く阻害し、従って、ＩＬ−６関連疾患
に対する治療剤として期待できることを見い出した（Ｓ
ａｉｔｏ，Ｈ．ら、第２１回日本免疫学会総会、学術集
会記録、２１，１１６，１９９１）。従って、本発明
は、ヒトＩＬ−６に対する、免疫原性の低い抗体を提供
しようとするものである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明はヒトＩ
Ｌ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２の再構
成ヒト抗体に関する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体
の作製の過程で有用なヒト／マウスキメラ抗体を提供す
る。本発明はさらに、マウスモノクローナル抗体ＳＫ２
の再構成ヒト抗体並びにキメラ抗体の製造のための遺伝
子工学的方法に関する。

【００１５】具体的には、本発明は、（１）ヒト抗体Ｌ
鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクロー
ナル抗体ＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６に対する
マウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域を含んで
成るＨ鎖；を含んで成る、ヒトＩＬ−６に対するキメラ
抗体、さらには、（１）ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域のフレーム
ワーク領域（ＦＲ）、及び（２）ヒトＩＬ−６に対する
マウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域のＣＤ
Ｒ、を含んで成る、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び（２）ヒトＩＬ
−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２のＨ鎖Ｖ
領域のＣＤＲ、を含んで成る、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域か
ら構成されるヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナ
ル抗体ＳＫ２の再構成ヒト抗体に関する。本発明はま
た、前記種々の抗体を構成するＬ鎖またはＨ鎖のポリペ
プチド、およびそれらをコードするＤＮＡに関する。さ
らに、本発明は、上記ＤＮＡを含んで成る発現ベクター
およびそれら発現ベクターにより形質転換された宿主に
関する。本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−６に対するキ
メラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６に対する再構成
ヒト抗体の製造方法に関する。

【００１６】

【具体的な説明】マウス抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡのクローニングヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領
域をコードするＤＮＡをクローン化するためには、マウ
スモノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを調製した
後、既知の方法により一本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的とするＤＮ
Ａを増幅することで得られる。この全ＲＮＡの供給源と
して、ヒトＩＬ−６に対するモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマを作製することが必要である。この
様なハイブリドーマとして、ＳＫ２を挙げることができ
る。ハイブリドーマＳＫ２の作製方法を参考例１に後記
する。

【００１７】（１）全ＲＮＡの採取本発明において、全ＲＮＡを採取するため、ハイブリド
ーマ細胞を破壊し、グアニジンチオシアネート処理後、
塩化セシウム密度勾配遠心を行った（ｃｈｉｒｇｗｉｎ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４，１９
７９）が、すでに他の蛋白質の遺伝子をクローニングす
る際に用いられた方法、例えばバナジウム複合体等のリ
ボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、
フェノール処理を行う（Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｂｉｒｋｅ
ｎｍｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５１
４３，１９７９）方法を用いることができる。

【００１８】（２）一本鎖ｃＤＮＡの採取上記の如くして得た全ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得るに
は、全ＲＮＡを鋳型にして、その３′末端にあるｐｏｌ
ｙＡ鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆
転写酵素で処理して全ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を合成する（Ｌａｒｒｉｋ，Ｊ．Ｗ．ら、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４，１９８９）
ことができる。また、その時に、ランダムプライマーを
用いてもよい。

【００１９】（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
によるマウス抗体Ｖ領域の増幅次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記ｃ
ＤＮＡからマウス抗体Ｖ領域の特異的増幅を行う。マウ
ス抗体Ｖ領域の増幅には、Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．らＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１に
記載されているプライマーを用いることができる。ハイ
ブリドーマＳＫ２が産生するマウスモノクローナル抗体
ＳＫ２のクローニングに用いるプライマーを決定するに
あたり、Ｈ鎖およびＬ鎖のタイピングをして両鎖の型を
決める必要がある。

【００２０】マウスモノクローナル抗体アイソタイピン
グキット（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）
を用いて、ＳＫ２抗体のタイピングを行った結果、ＳＫ
２抗体はκ型Ｌ鎖およびＣγ１型のＨ鎖を有することが
明らかになった。ＳＫ２のタイピングについて参考例２
に後記する。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
を用いてマウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ
鎖Ｖ領域を増幅するため、配列番号：１〜１１に示す１
１種のオリゴヌクレオチドプライマー（ＭｏｕｓｅＫ
ａｐｐａＶａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：
１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ
ＫａｐｐａＣｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ
５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして
使用する。

【００２１】前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイ
ズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズす
る。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のた
め、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙＶａｒｉ
ａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示すオリゴヌ
クレオチドプライマー（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙＣｏ
ｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマ
ー及び３′−末端プライマーとして使用する。

【００２２】なお、本実施例では５′−末端プライマー
はその５′−末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提
供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プ
ライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断
部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有す
るものを使用している。これらの制限酵素切断部位は可
変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベ
クターにサブクローニングするために用いられる限り、
他の制限酵素切断部位でもよい。

【００２３】次に、マウスモノクローナル抗体の目的と
する可変領域をコードするＤＮＡ断片を得るために、増
幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩで切断した
後、低融点アガロースまたはカラム〔ＰＣＲ産物精製用
キット（ＱＩＡＧＥＮ等）、ＤＮＡ精製用キット（ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮII等）など〕により、分離・精製を行
う。他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクロー
ニングベクターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩに
より切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結
することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とす
る可変領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを
得る。

【００２４】クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意
の常法例えば、シークエネースバージョン２．０（ユ
ナイテッドステイツバイオケミカルコーポレーション社
製）を用いて行うことができる。目的とするＤＮＡのク
ローン化及びその配列決定を実施例１及び２に具体的に
記載する。

【００２５】相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ鎖及びＨ鎖の各対のＶ領域は抗原結合部位を形成す
る。Ｌ鎖及びＨ鎖上の可変領域は共通性のある比較的保
存された４個のフレームワークと３個の超可変又は相補
性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている（Ｋａｂａ
ｔ，Ｅ．Ａ．ら、「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏ
ｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎ
ｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳＤｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈａｎ
ｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ１９８３）。

【００２６】前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の
多くの部分はβ−シート構造をとり、その結果３個のＣ
ＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シ
ート構造の一部分を形成することもある。３個のＣＤＲ
はＦＲによって相互に立体的に非常に近い位置に保持さ
れ、そして対をなす領域の３個のＣＤＲと共に抗原結合
部位の形成に寄与する。

【００２７】これらのＣＤＲ領域は、得られた抗体のＶ
領域のアミノ酸配列と既知抗体のＶ領域の既知アミノ酸
配列とを照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．
ら、「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓ
ｔ」の経験則から見出すことができ、実施例３において
具体的に説明する。

【００２８】キメラ抗体の作製ヒトＩＬ−６に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計す
るに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を
形成することを確かめる必要がある。この目的のため、
キメラ抗体を作製した。さらに実施例１に記載されるモ
ノクローナル抗体ＳＫ２のクローン化されたＤＮＡのヌ
クレオチド配列から推定されるマウス抗ヒトＩＬ−６抗
体のアミノ酸配列を既知のマウス及びヒトの抗体のＶ領
域と比較した。

【００２９】モノクローナル抗体ＳＫ２のマウスＬ鎖及
びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングさ
れれば、これらのマウスＶ領域をヒト抗体定常領域をコ
ードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメ
ラ抗ヒトＩＬ−６抗体が得られる。キメラ抗体を作製す
るための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに
存在するマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類
細胞発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域を
コードする配列に連結することを含んで成る。

【００３０】前記ヒト抗体Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領
域およびヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒト
Ｌ鎖ＣκあるいはＨ鎖Ｃγ１やＣγ４を各々挙げること
ができる。キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベ
クター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごと
き発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及
びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現
ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごと
き発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを
作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細
胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換
された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキ
メラ抗体を製造する（例えばＷＯ９１−１６９２８）。

【００３１】あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及び
ヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクタ
ーに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質
転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又は
イン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産さ
せる。キメラ抗体の作製を実施例４に記載する。

【００３２】マウスＳＫ２κ型Ｌ鎖リーダー領域及びＶ
領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてサブクロ
ーンし、ヒトゲノムＬ鎖Ｃκ鎖領域をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターに連結する。マウスＳＫ２抗体
のγ１型Ｈ鎖リーダー及びＶ領域をコードするｃＤＮＡ
を、ＰＣＲ法を用いてサブクローン化し、ヒトγ−１Ｃ
領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベクター
に連結する。

【００３３】特に設計されたＰＣＲプライマーを用い
て、マウスＳＫ２のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそれ
らの５′−及び３′−末端において適当な塩基配列を導
入して、それらが発現ベクターに容易に挿入されるよう
に、且つそれらが該発現ベクター中で適切に機能するよ
うにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列の導入に
より転写効率を上げるように工夫されている）。次に、
これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得た
マウスＳＫ２のＶ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含
有するＨＥＦ発現ベクター（図１）に挿入した。これら
のベクターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作
された抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安
定な発現のために適当である。

【００３４】マウスＳＫ２抗体中に存在するＶ領域と同
じＶ領域を有するキメラＳＫ２抗体の作製に加えて、キ
メラＳＫ２抗体の第二のバージョン（ＮＴＳ）を作製し
た。キメラＳＫ２抗体ＮＴＳにおいては、Ｈ鎖Ｖ領域中
の位置３０のアミノ酸がアスパラギンからセリンに変え
られている。

【００３５】マウスＨ鎖サブグループＩ（Ｆｉｓｃｈｍ
ａｎｎ，Ｔ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６，１２９１５，１９９１）に属するマウスＨ鎖Ｖ領域
においては、位置３０の最も典型的なアミノ酸はセリン
である（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳＤｅｐｔＨ
ｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓＵ
ＳＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＰｒｉｎｔｉｎｇＯｆｆ
ｉｃｅｓ，１９９１）。

【００３６】マウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域中の位置３
０に非典型的なアミノ酸であるアスパラギンを有するこ
との重要性を評価するため、位置３０を典型的なアミノ
酸であるセリンに変えた。この変更は、ＰＣＲ−変異誘
発法（Ｍ．Ｋａｍｍａｎら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．１５，５４０４，１９８９）を用いてＨ鎖Ｖ領域
をコードするＤＮＡ配列中に必要な変更を行うことによ
り達成された。キメラＳＫ２抗体は、もとのＳＫ２抗体
と同様にＨ鎖Ｖ領域の位置３０にグリコシル化部位を有
するのに対して、変異型キメラＳＫ２抗体ＮＴＳはグリ
コシル化部位を有しない。

【００３７】キメラＳＫ２抗体はヒトＩＬ−６に結合す
る活性を示した。キメラＳＫ２抗体ＮＴＳも同様にヒト
ＩＬ−６に結合する。従って正しいマウスＶ領域がクロ
ーン化されそして配列が決定されていたことが示され
た。また、ＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域のグリコシル化は、Ｓ
Ｋ２抗体の結合活性のためには必要でないことが示され
た。

【００３８】再構成ヒトの抗体の構築マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植さ
れている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモ
ノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い
相同性が存在することが望ましい。従って、マウスＳＫ
２抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、ＰｒｏｔｅｉｎＤ
ａｔａＢａｎｋを用いて構造が解明されているすべて
の既知抗体のＶ領域と比較した。その結果を表１にまと
める。

【００３９】

【表１】

【００４０】マウスＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領
域のサブグループＩ（ＨＳＧＩ）のコンセンサス配列に
最も類似しており、６０．３％の相同性が存在する。マ
ウスＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグルー
プII（ＨＳＧII）のコンセンサス配列に最も類似してお
り、５９．２％の相同性が存在する。

【００４１】ヒト抗体中のＶ領域との比較から、再構成
ヒトＳＫ２抗体Ｖ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域の
ＦＲを選択することが可能である。再構成ヒトＳＫ２抗
体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（ＳＧ
Ｉ）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒ
トＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループ
II（ＳＧII）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのが
よく、さらにサブグループ内で、できるだけ相同性の高
いものを選ぶことが最善であろう（Ｋａｂａｔ，Ｅ．
Ａ．ら、ＵＳＤｅｐ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍ
ａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔ
ＰｒｉｎｔｉｎｇＯｆｆｉｃｅｓ，１９９１）。

【００４２】再構成ヒトＳＫ２抗体Ｖ領域の設計再構成ヒトＳＫ２抗体Ｖ領域の設計における第一段階
は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することで
あった。マウスＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域は、サブグループ
Ｉに属するヒトκ型抗体Ｌ鎖Ｖ領域に最も類似していた
（表１）。マウスＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域は既知ヒト抗
体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブ
グループＩの１構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩに６
３％の類似性を示した。従って、再構成ヒトＳＫ２抗体
Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてＲＥＩのＦＲ
を使用した。

【００４３】再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つの
バージョンを設計した。第一のバージョン（バージョン
「ａ」）においては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡ
ＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２２，２１〜
２５，１９８８）（ＷＯ９２−１９７５９に記載の再構
成ヒトＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」）と同
一であり、そしてマウスＣＤＲはマウスＳＫ２のＬ鎖Ｖ
領域中のＣＤＲと同一とした。第二のバージョン（バー
ジョン「ｂ」）はバージョン「ａ」と比べて、ヒトＦＲ
３中の位置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。

【００４４】すなわちバージョン「ａ」の設計に使用し
た修飾されたＲＥＩのＦＲにおいては位置７１はフェニ
ルアラニンであるのに対し、バージョン「ｂ」において
は、位置７１のフェニルアラニンがマウスＳＫ２抗体Ｌ
鎖Ｖ領域中に見出されるようにチロシンに変えられてい
る。表２は、マウスＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域、ＲＥＩの
ＦＲ及び再構成ＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバー
ジョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。

【００４５】

【表２】注：ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線を付したアミノ酸はヒ
トＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐａｌｍ，Ｗ．ら、Ｈｏｐｐ
ｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，３５６，１６７−１９１，１９７５）とは異なる
アミノ酸の位置を示す。

【００４６】マウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲは
サブグループIIに属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似して
いる（表１）。マウスＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域は既知の
ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較において、ヒトＨ鎖Ｖ領域
のサブグループIIの１構成員であるヒトＨ鎖Ｖ領域ＤＡ
Ｗ（Ｐｒｅｓｓ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１
１７，６４１，１９７０）に非常に類似していた（６
０．８％）。さらには、ＣＤＲのサイズもマウスＳＫ２
抗体とヒト抗体ＤＡＷとの間で非常に類似していた。こ
のため、ヒト抗体ＤＡＷのＦＲを、再構成ヒトＳＫ２抗
体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料として用いた。

【００４７】再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の２種類
のバージョンを設計した。バージョン「ａ」においては
ＦＲはＤＡＷのそれと同じであり、バージョン「ｂ」に
おいてはヒトＦＲ１中の３０位のみが異っている。すな
わち、バージョン「ａ」においては３０位のアミノ酸は
セリンであり、バージョン「ｂ」の３０位のアミノ酸は
アスパラギンである。表３は、マウスＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ
領域、ＤＡＷのＦＲ、並びに再構成ＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領
域のバージョン「ａ」及び「ｂ」のアミノ酸配列を示
す。

【００４８】

【表３】

【００４９】再構成ヒトＳＫ２抗体の作製再構成ヒトＳＫ抗体Ｖ領域の作製を実施例５に具体的に
記載する。本発明の再構成ヒトＳＫ２抗体は、（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗
体ＳＫ２のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、
を含んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗
体ＳＫ２のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、
を含んで成るＨ鎖；から構成される。

【００５０】好ましい態様においては、前記Ｌ鎖Ｖ領域
は配列番号５２又は５３に示されるアミノ酸配列を有
し、前記Ｈ鎖Ｖ領域は配列番号５４又は５５に示される
アミノ酸配列を有する。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒ
トＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えばヒトκＣ領域で
あり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領
域であることができ、例えばヒトγ−１Ｃ領域、ヒトγ
−４Ｃ領域等である。

【００５１】再構成抗体の製造のためには、２種類の発
現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再
構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベク
ター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現
制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製
する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞
のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転
換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して
再構成ヒト抗体を生産せしめる（例えば、ＷＯ９１−１
６９２７）。

【００５２】あるいは、再構成Ｌ鎖をコードするＤＮＡ
及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベ
クターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形
質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビ
ボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗
体を生産せしめる。以上のようにして目的とするキメラ
抗体あるいはヒト型化抗体をコードする遺伝子で形質転
換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体あるい
はヒト型化抗体は、細胞内または細胞外から分離し均一
にまで精製することができる。

【００５３】なお、本発明の目的蛋白質であるキメラ抗
体あるいはヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインＡ
アガロースカラムを用いて行うことができる。また、そ
の他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使
用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各
種クロマトグラフィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜
選択、組合せれば、キメラ抗体あるいはヒト型化抗体は
分離・精製することができる。

【００５４】ヒトＩＬ−６に対する本発明のキメラ抗体
又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例え
ば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類
細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細
胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用するこ
とができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構
成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞
中で発現される。

【００５５】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ
ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが
好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、ＨＣＭＶ−Ｖ_H−ＨＣγ１，ＨＣＭＶ−Ｖ
_L−ＨＣ_K等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの
（図２を参照のこと）（ＷＯ９２−１９７５９）が含ま
れる。

【００５６】また、その他に、本発明のために用いるこ
とのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモー
ターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、ア
デノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など
のウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェー
ン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いれば
よい。例えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合
は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ２７７
１０８（１９７９））、また、ＨＥＦ−１αプロモー
ターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの
方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ，１８，５３２２，１９９０）に従えば容易に実施す
ることができる。

【００５７】複製起原としては、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主
細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター
は選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰ
Ｈ（３′）IIあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキ
ナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝
子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含む
ことができる。

【００５８】

【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１．ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル
抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン化ヒトＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体ＳＫ２
の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン
化した。

【００５９】１．全ＲＮＡの調製ハイブリドーマＳＫ２からの全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４
（１９７９）により記載されている方法に従って調製し
た。すなわち、ハイブリドーマＳＫ２の細胞を２０mlの
４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｆｕｌｋａ）中で完全
にホモジナイズさせた。ホモジネートを遠心管中の５．
３Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃ
ｋｍａｎＳＷ４０ローター中で３１，０００rpm にて２
０℃で２４時間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱さ
せた。

【００６０】ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗
浄し、そして１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含
有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）１５０μ
ｌ中に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を０．５mg／mlとなるように添加
した後、３７℃にて２０分間インキュベートした。混合
物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮ
Ａをエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１
mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）２００μｌに溶解した。

【００６１】２．一本鎖ｃＤＮＡの合成Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，７，９３４（１９８９）により記載されている方法
に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように
して調製した全ＲＮＡの約５μｇを４０mM ＫＣｌ，６
mM ＭｇＣｌ₂、１０mMジチオスレイトール、０．５mM
ｄＡＴＰ，０．５mM ｄＧＴＰ，０．５mM ｄＣＴ
Ｐ，０．５mM ｄＴＴＰ，３５μＭｏｌｉｇｏｄＴ
プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、４８ユニットのＲＡ
Ｖ−２逆転写酵素（ＲＡＶ−２：Ｒｏｕｓａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ２；Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び２
５ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）を含有する５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．３）緩衝液１０μｌに溶解し、そしてこの反応混合
物を３７℃にて６０分間インキュベートしそして次のポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のために直接使用し
た。

【００６２】３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰ
ＣＲ法による増幅ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭｏｄｅｌＰＨＣ−
２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を用い
てＰＣＲ法を行った。（１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅ＰＣＲ法に使用するプライマーは、マウスカッパ型Ｌ鎖
リーダー配列とハイブリダイズする配列番号：１〜１１
に示すＭＫＶ（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａＶａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及びマウス
κ型Ｌ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする配列番号：１２に
示すＭＫＣ（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａＣｏｎｓｔａｎ
ｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を用いた。

【００６３】ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mMＫＣｌ，０．２５mM
ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）、１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、２．５ユニットのＤＮＡ
ポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍ
ｅｒＣｅｔｕｓ社）、０．２５μＭのそれぞれのＭＫ
Ｖプライマー、２．７５μＭのＭＫＣプライマー及び一
本鎖ｃＤＮＡ合成の反応混合物１μｌを含有する。これ
を５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃の初期温度にて
１．５分間そして次に９４℃にて１分間、５０℃にて１
分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この
温度サイクルを２５回反復した後、反応混合物をさらに
７２℃にて１０分間インキュベートした。

【００６４】（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤ
ＮＡの増幅ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２４
に示すＭＨＶ（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙＶａｒｉａｂ
ｌｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示す
ＭＨＣ−Ｇ１（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙＣｏｎｓｔａ
ｎｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を使用した。

【００６５】ｃＤＮＡの増幅は、１μＭのＭＨＶプライ
マーと１μＭのＭＨＣ−Ｇ１プライマーの組合せとして
各々のＭＨＶ１〜１２プライマーについて別々に増幅し
た点を除いて、前記３．（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝
子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を行
った。

【００６６】４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を
低融点アガロース（ＦＭＣＢｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，米国）にて精製し、そして１０mM ＭｇＣｌ ₂ 及び
１５０mM ＮａＣｌを含有する１００mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．６）中で１０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を用いて３７℃にて３時間
消化した。

【００６７】この消化混合物をフェノール及びクロロホ
ルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱により回
収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を１０ユニットの制限酵素
ＸｍａＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社
製）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮ
Ａ断片を、１．５％低融点アガロース（ＦＭＣＢｉ
ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国）を用いるアガロースゲル
電気泳動により分離した。

【００６８】約４５０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せし
め、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び２００mM
ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロ
ホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈
澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。

【００６９】こうして、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域を
コードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウス
Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断
片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端に
ＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａ
Ｉ接着末端を有する。

【００７０】５．連結及び形質転換上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤ
ＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ及びＸｍａＩで消化
することにより調製したｐＵＣ１９ベクター約０．１μ
ｇと、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４），１０mM
ＭｇＣｌ₂ 、１０mMジチオスレイトール、１mMスペルミ
ジン、１mM ＡＴＰ，０．１μｇ／mlのウシ血清アルブ
ミン及び２ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含有する反応混合物
中で、１６℃にて１６時間反応させ連結した。

【００７１】次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌Ｄ
Ｈ５αのコンピテント細胞２００μｌに加え、そしてこ
の細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び
氷上で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）を加え、３７℃にて１
時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃
にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。

【００７２】この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含有する２×ＹＴ培地５ml中で３７℃にて一夜
培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ，１９８９）に従ってプラスミドＤＮＡを調製し
た。

【００７３】こうして得られた、ハイブリドーマＳＫ２
に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝
子を含有するプラスミドをｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_Lと命名
した。上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＳＫ２
に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有
するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩＤＮＡ断片から
作成し、そしてｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_Hと命名した。

【００７４】実施例２．ＤＮＡの塩基配列の決定前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ^TMＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット
（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製，米国）を用
いて決定した。まず、前記のようにして得られたプラス
ミド約３μｇを０．２ＮＮａＯＨにより変性し、配列
決定用プライマーとアニールさせ、そしてキット添付の
処方に従って³⁵Ｓ−ｄＡＴＰより標識した。

【００７５】次に、標識されたＤＮＡを、８Ｍ尿素を含
有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した
後、ゲルを１０％メタノール及び１０％酢酸により固定
し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけるこ
とにより塩基配列を決定した。プラスミドｐＵＣ−ＳＫ
２−Ｖ_Lに含まれるマウスＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域をコ
ードする遺伝子の塩基配列を配列番号２６に示す。ま
た、プラスミドｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_Hに含まれるマウス
ＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列
を配列番号２７に示す。

【００７６】なお、前記プラスミドｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ
_Lを含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＤＨ５α（ｐＵＣ−ＳＫ２Ｖ_L）、およびプラス
ミドｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_Hを含有する大腸菌はＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＵＣ−ＳＫ２Ｖ
_H）として、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城
県つくば市東１丁目１番３号）に、平成５年４月２１日
に、各々ＦＥＲＭＢＰ−４２７０、およびＦＥＲＭＢ
Ｐ−４２６９としてブダペスト条約に基き国際寄託され
た。

【００７７】実施例３．ＣＤＲの決定Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を
有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つ
の超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸
配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、
「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆ
ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ」Ｕ
ＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳ
ｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。

【００７８】この様な事実に基づき、ヒトＩＬ−６に対
するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配
列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列
のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによ
りＣＤＲ領域を表４に示す如く決定した。

【表４】

【００７９】実施例４．クローン化ｃＤＮＡの発現の確
認（キメラＳＫ２抗体の作製）発現ベクターの作製キメラＳＫ２抗体を発現するベクターを作製するため、
それぞれマウスＳＫ２κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードす
るｃＤＮＡクローンｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_L及びｐＵＣ−
ＳＫ２−Ｖ_HをＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ
発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９７５９参照）（図
１を参照のこと）に導入した。

【００８０】Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＳＫ２
Ｋ２Ｂ（配列番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方
プライマーＳＫ２Ｈ１Ｓ（配列番号：３０）は、各々の
Ｖ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイ
ブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋａｚ
ａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７
−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄIII 制限部位を有す
るように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマー
ＳＫ２Ｋ２Ａ（配列番号：２９）及びＨ鎖Ｖ領域のため
の前方プライマー６４ｈｃｈ−Ａ（配列番号：３１）
は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダ
イズし且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部
位を有するように設計した。

【００８１】１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），
５０mM ＫＣｌ，２５０μＭｄＮＴＰｓ，１．５mM
ＭｇＣｌ₂ 、１００pmole ずつの各プライマー、１００
ngの鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_L又はｐＵＣ−Ｓ
Ｋ２−Ｖ_H）、及び５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑ酵素を含
有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油
で覆い、９４℃にて最初の変性の後、９４℃にて１分
間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを
３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベート
した。

【００８２】ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース
ゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで消
化し、そしてｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｈｅ−Ｐ
ｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１
０９）にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、
正しいＤＮＡ配列を有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断
片を切出し、Ｈ鎖Ｖ領域については発現ベクターＨＥＦ
−Ｖ_H−ｇγ１に導入してＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１を
得、Ｌ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ−Ｖ_L−ｇｋに導入し
てＨＥＦ−ＳＫ２ｋ−ｇｋを得た。

【００８３】さらに、Ｈ鎖Ｖ領域に於いて、ほとんどの
抗体のＨ鎖は、位置３０のセリンが保存されているが、
マウスＳＫ２抗体Ｈ鎖においては位置３０がアスパラギ
ンであることから、キメラＳＫ２抗体の抗原結合活性に
対するこの変化の効果を検討するため、ＨＥＦ−ＳＫ２
ｈ−ｇγ１を鋳型として後方プライマーＳＫ２Ｈ１Ｓと
前方プライマーＳＫ２ＨＭ１Ｂ（配列番号：３２）及び
前方プライマー６４ｈｃｈ−Ａと後方プライマー（ＳＫ
２ＨＭ１）（配列番号：３３）の組合せを用いてＰＣＲ
変異誘導法により、位置３０がアスパラギンからセリン
に変るように設計した。

【００８４】変異型Ｈ鎖Ｖ領域は、プライマーＳＫ２Ｈ
１ＳとＳＫ２ＨＭ１Ｂ、又はプライマーＳＫ２ＨＭ１と
６４ｈｃｈ−Ａを用い、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨ
ＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１を用い、前記と同様にしてＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲ増幅の後、２つのＰＣＲ生成物を低
融点アガロースゲルを用いて精製し、第２のＰＣＲのた
めに用いた。

【００８５】１μｇずつの２つの第一ＰＣＲ生成物及び
５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ
混合物を９４℃にて２分間、５０℃にて２分間及び７２
℃にて５分間インキュベートした後、１００pmole ずつ
の外部プライマー（ＳＫ２Ｈ１Ｓ及び６４ｈｃｈ−Ａ）
を加えた。ＰＣＲ混合物を５０μｌの鉱油で覆い、そし
て前記と同じ条件で第二ＰＣＲを行った。４１２bpのＤ
ＮＡ断片を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化
し、そして発現ベクターＨＥＦ−Ｖ_H−ｇγ１に挿入
し、配列決定の後、正しい配列を含むプラスミドＨＥＦ
−ＳＫ２ｈ−ＮＴＳを得た。

【００８６】ＣＯＳ細胞へのトランスフェクションキメラＳＫ２抗体の一過性発現を観察するため、前記発
現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＥＦ−Ｓ
Ｋ２ｋ−ｇｋと、ＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１又はＨＥＦ
−ＳＫ２ｈ−ＮＴＳのいずれかとを、ＧｅｎｅＰｕｌ
ｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポ
レーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。各Ｄ
ＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０⁷ 細胞／mlの
０．８mlのアリコートに加え、１，９００Ｖ、２５μＦ
の容量にてパルスを与えた。

【００８７】室温にて１０分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、ツニカマイシン
（Ｓｉｇｍａ社製）を２μｇ／ml含有するか、又は含有
しない１０％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含
有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）に加えた。７
２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠
心分離により細胞破片を除去し、５倍量の結合緩衝液で
平衡化したプロテインＡアガロースカラム（Ａｆｆｉ−
ＧｅｌＰｒｏｔｅｉｎＡＭＡＰＳIIキット、Ｂｉ
ｏＲａｄ）に適用した。カラムを１５倍量の結合緩衝液
で洗浄し、次に５倍量の溶出緩衝液で溶出した。溶出液
を濃縮し、そしてマイクロコンセントレーター（Ｃｅｎ
ｔｒｉｃｏｎ１００，Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて緩
衝液をＰＢＳに変えた。

【００８８】ＥＬＩＳＡ抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次の様にし
て調製した。９６穴プレートを、ＳＫ２が認識するエピ
トープとは異るヒトＩＬ−６のエピトープを認識するマ
ウスモノクローナル抗体ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｔ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，９５１−
９５６，１９８８）でコートし、ブロッキングの後、組
換えヒトＩＬ−６を添加した。キメラＳＫ２抗体のサン
プルを順次希釈して、各穴に加え、次にアルカリホスフ
ァターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社
製）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質
溶液を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。

【００８９】結合阻害測定のため、ＥＬＩＳＡプレート
を次の様にして調製した。９６穴プレートを、ヒトＩＬ
−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）に対して特異的なマウス
モノクローナル抗体ＭＴ−１８（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２９００−２９０
７，１９８９）によりコートし、ブロッキングの後、可
溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）（Ｙａｓｕｋ
ａｗａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８，６７３
−６７６，１９９０）を加えた。サンプルを順次希釈し
て、ビオチン化ＩＬ−６と共に各穴に加え、次いでアル
カリホスファターゼ結合ストレプタビディンを加えた
後、前記のようにして、４０５nmにおける吸光度を測定
した。

【００９０】抗原結合測定の結果を図４に示し、結合阻
害測定の結果を図５に示す。Ｈ鎖Ｖ領域の３０位がアス
パラギンである。キメラ抗体およびＨ鎖Ｖ領域の３０位
がセリンに変異しているキメラ抗体（ＮＴＳ）は、ツニ
カマイシンによる糖付加阻害の影響を受けることなく、
同様の抗原結合性及び結合阻害活性を示した。従って、
Ｈ鎖Ｖ領域の３０位のアミノ酸の変異及び糖鎖の有無は
抗原結合性に何ら影響を与えないことが明らかになっ
た。

【００９１】ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット
を用いたマウスＳＫ２抗体の糖鎖の分析マウスＳＫ２抗体からＦａｂ断片およびＦｃ断片をＩｍ
ｍｕｎｏＰｕｒｅＦａｂＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて調製し、次にＮ−
グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を用いて脱グリコ
シル化された断片を調製した。

【００９２】これらの断片をＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、そして次にクマシーブリリアン
トブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ
Ｂｌｕｅ，ＢｉｏＲａｄ社製）により染色するか、又は
電気泳動的にニトロセルロースフィルターに移行させ
た。Ｆｄ断片に付加されている糖を分析するため、フィ
ルターをレクチンのパネル（Ｌｅｃｔｉｎ−Ｌｉｎｋ，
Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）にかけた。

【００９３】図３に示すごとく、マウスＳＫ２抗体から
のＦｄ断片はＳＤＳ／ＰＡＧＥにおいて約３４kd及び３
３kdのバンドを示し、この比率は約１：１であった。Ｎ
−グリカナーゼにより脱グリコシル化されたＦｄ断片は
約２９kdの分子量を示し、これはＦｄ断片のアミノ酸組
成から計算した値と一致した。また、３４kdのＦｄ断片
と３３kdのＦｄ断片は種々のレクチンに対して異る反応
性を示した。

【００９４】すなわち３４kdのＦｄはＤａｔｕｒａＳ
ｔｒａｍｏｎｉｕｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＳＡ）
＋、ＲｉｃｉｎｕｓＣｏｍｍｕｎｉｓＡｇｇｌｕｔ
ｉｎｉｎ（ＲＣＡ）＋＋、ＰｈａｓｅｏｌｕｓＶｕｌ
ｇａｒｉｓＥｒｙｔｈｒｏｌｅｃｔｉｎ（ＰＨＡ−
Ｅ）＋＋＋、ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（Ｃｏｎ
Ａ）−、ＷｈｅａｔＧｅｒｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ
（ＷＧＡ）−であるのに対して、３３kdのＦｄはＤＳＡ
−，ＲＣＡ＋，ＰＨＡ−Ｅ＋＋＋，ＣｏｎＡ−，ＷＣＡ
−であった。これらの結果、マウスＳＫ２抗体は、Ｈ鎖
Ｖ領域に少なくとも２つのタイプのＮ型糖鎖を有するこ
とが明らかになった。

【００９５】実施例５．再構成ヒトＳＫ２抗体の作製再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−
グラフティングにより作製した。この方法を図６に模式
的に示す。ヒト抗体ＲＥＩ由来のＦＲを有する再構成ヒ
ト抗体ＳＫ２（バージョン「ａ」）の作製のために８個
のＰＣＲプライマーを使用した。外部プライマーＡ（配
列番号：３４）及びＨ（配列番号：３５）は、ｐＵＣベ
クターのＤＮＡ配列とハイブリダイズするように設計さ
れた。

【００９６】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＢ（配
列番号：３６）、Ｃ（配列番号：３７）及びＤ（配列番
号：３８）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲ−
グラフティングプライマーＥ（配列番号：３９）、Ｆ
（配列番号：４０）及びＧ（配列番号：４１）はアンチ
−センスＤＮＡ配列を有しそしてそれぞれプライマー
Ｂ，Ｃ及びＤの５′−末端のＤＮＡ配列に対する相補的
ＤＮＡ配列（１５〜３５bp）を有する。

【００９７】第一ＰＣＲ段階において４つの反応Ａ−
Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｇ、及びＤ−Ｈを行い、そして各ＰＣ
Ｒ生成物を精製した。第一ＰＣＲからの４つのＰＣＲ生
成物をそれら自体の相補性によりアッセンブリさせた
（ＷＯ９２−１９７５９参照）。次に、外部プライマー
Ａ及びＨを加えて、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域を
コードする全長ＤＮＡを増幅した（第２ＰＣＲ）。前記
ＰＣＲにおいては、ヒト抗体ＲＥＩからのＦＲに基く再
構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコ
ードするプラスミドｐＵＣ−ＲＶＬ−ＰＭ１ａ−４（Ｗ
Ｏ９２−１９７５９）を鋳型として用いた。

【００９８】第一ＰＣＲ段階においては、１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mMＫＣｌ，２５０μＭ
ｄＮＴＰｓ，１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、１００ngの鋳型
ＤＮＡ、１００pmole の各プライマー及び５ｕのＡｍｐ
ｌｉＴａｑを含有する１００μｌのＰＣＲ混合物を用
いた。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆膜した。
最初に９４℃で変性した後、９４℃にて１分間、５０℃
又は５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応サイ
クルを行い、次に７２℃にて１０分間インキュベートし
た。

【００９９】ＰＣＲ生成物Ａ−Ｅ（１８７bp），Ｂ−Ｆ
（８７bp），Ｃ−Ｇ（１５２bp）及びＤ−Ｈ（６５bp）
を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、第二
ＰＣＲでアッセンブリした。第二ＰＣＲにおいては、１
μｇの各第一ＰＣＲの生成物、及び５ｕのＡｍｐｌｉ
Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃に
て２分間、５０℃にて２分間及び７２℃にて２分間で２
サイクルインキュベートし、そして次に１００pmole の
各外部プライマー（Ａ及びＨ）を加えた。ＰＣＲチュー
ブを５０μｌの鉱油で覆い、そして前記と同一の条件で
３０サイクルのＰＣＲを行った。

【０１００】第二ＰＣＲにより生じた３９９bpのＤＮＡ
断片を１．５％低融点アガロースゲルで精製し、Ｂａｍ
ＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、得られたＤＮＡ断片を
ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−Ｖ_L−ｇｋにクローニング
した。ＤＮＡ配列決定の後、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖
Ｖ領域のバージョン「ａ」の正しいアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬ−
ＳＫ２ａと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬ−Ｓ
Ｋ２ａに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基
配列を配列番号：５２に示す。

【０１０１】再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージ
ョン「ｂ」を、ＰＣＲを用いる変異誘発によって作製し
た。変異原プライマーＦＴＹ−１（配列番号：４２）及
びＦＴＹ−２（配列番号：４３）は、７１位のフェニル
アラニンがチロシンに変異するように設計した。プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶ１−ＳＫ２ａを鋳型ＤＮＡとして用い
た。最終ＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で消化し、得られたＤＮＡ断片をＨＥＦ−発現ベ
クターＨＥＦ−Ｖ_L−ｇｋにクローニングしてプラスミ
ドＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂを得た。本プラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸
配列および塩基配列を配列番号：５３に示す。

【０１０２】再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを
次の様にして設計した。ヒト抗体ＤＡＷのＦＲをコード
するＤＮＡ配列をＶ領域（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｕ
ＳＤｅｐｔＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳ
ｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＰｒｉ
ｎｔｉｎｇＯｆｆｉｃｅｓ，１９９１）の「ｃｏｄｏ
ｎｕｓａｇｅ」に基いて設計し、そしてマウスＳＫ２
抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列とつな
げることにより、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバ
ージョン「ａ」をコードする全長ＤＮＡを設計した。

【０１０３】次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′−側
及び３′−側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコン
センサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナ
ー配列を付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるよ
うにした。こうして設計したＤＮＡ配列を６個のオリゴ
ヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌク
レオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴ
ヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析
した。

【０１０４】６個のオリゴヌクレオチド配列を配列番
号：４４〜４９に示す。これらのオリゴヌクレオチドは
９３〜９６塩基の長さを有し、２０〜２４bpのオーバラ
ップ領域を有する。オリゴヌクレオチドの内の３個、す
なわち、ＨＰ１（配列番号：４４）、ＨＰ３（配列番
号：４６）及びＨＰ５（配列番号：４８）はセンスＤＮ
Ａ配列を有し、そして他の３個、すなわち、ＨＰ２（配
列番号：４５）、ＨＰ４（配列番号：４７）及びＨＰ６
（配列番号：４９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有す
る。これら６個のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ法による
アセンブリーの方法を図７に示す。

【０１０５】２pmole ずつの６種のオリゴヌクレオチド
及び５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑを含有する９８μｌのＰ
ＣＲ混合物を、９４℃にて２分間の最初の変性の後、９
４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分
間のから成る３サイクルのインキュベーションを行い、
次に７２℃にて１０分間インキュベートした。５０μmo
leずつのＨＰ１及びＨＰ６を外部プライマーとして添加
した後、ＰＣＲチューブを５０μｌの鉱油で覆い、そし
て９４℃にて１分間の最初の変性の後、９４℃にて１分
間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３０サイ
クルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベ
ートした。

【０１０６】４４８bpのＤＮＡ断片を１．５％低融点ア
ガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍ
ＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥ
Ｆ−Ｖ_H−ｇγ１にクローニングした。ＤＮＡ配列決定
の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａ
と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａに
含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配
列番号：５４に示す。

【０１０７】バージョン「ｂ」を、ＰＣＲ法による変異
誘発を用いて作製した。変異原プライマーＲＳＫ２−Ｓ
ＴＮＡ（配列番号：５０）及びＲＳＫ−ＳＴＮＢ（配列
番号：５１）を、３０位のセリンがアスパラギンに変る
様に設計した。プラスミドＲＶＨ−ＳＫ２ａを鋳型ＤＮ
Ａとして使用した。最終ＰＣＲ生成物を精製し、Ｂａｍ
ＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化し、そして次にＨＥＦ
発現ベクターＨＥＦ−Ｖ_H−ｇγ１にクローニングし、
プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂを得た。本プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂに含まれるＨ鎖Ｖ領域の
アミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５５に示す。

【０１０８】再構成ヒトＳＫ２抗体の各鎖を評価するた
め、まず、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖のための２種類の
発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａ（バージョン
「ａ」）及びＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂ（バージョン
「ｂ」）のいずれかと、キメラＳＫ２抗体Ｈ鎖のための
発現ベクターＨＥＦ−ＳＫ２ｈ−ｇγ１とによりＣＯＳ
細胞を前記のようにして同時トランスフェクションし、
前記のようにして抗体生成物を回収した後、前記のよう
にして抗原結合測定にかけた。

【０１０９】この結果を図８に示す。図８に示すよう
に、陽性対照としてのキメラ抗体（ＣｈＬ／ＣｈＨ）
と、再構成Ｌ鎖バージョン「ａ」とキメラＨ鎖とから成
る抗体（ＲＶＬａ／ＣｈＨ）、と再構成Ｌ鎖バージョン
「ｂ」とキメラＨ鎖とから成る抗体（ＲＶＬｂ／Ｃｈ
Ｈ）との間には抗原結合性に差がなく、７１位における
チロシン残基のフェニルアラニン残基への変化は抗原結
合性に影響を与えないことが示された。

【０１１０】次に、再構成ヒト化ＳＫ２抗体Ｌ鎖の２つ
のバージョンと再構成ヒト化ＳＫ２抗体Ｈ鎖の２つのバ
ージョンとの組合せを評価するため、ＨＥＦ−ＲＶＬ−
ＳＫ２ａとＲＶＨ−ＳＫ２ａ、ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２
ａとＲＶＨ−ＳＫ２ｂ、ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂとＲ
ＶＨ−ＳＫ２ａ、又はＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂとＲＶ
Ｈ−ＳＫ２ｂとによりＣＯＳ細胞を同時トランスフェク
ションし、前記のようにして得られた抗体について抗原
結合測定を行った。その結果を図９に示す。図９から明
らかな通り、再構成ヒトＨ鎖と再構成ヒトＶ鎖とのすべ
ての組合せが、キメラＳＫ２抗体に匹敵する良好な抗原
結合性を示した。

【０１１１】なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶ_L−Ｓ
Ｋ２ｂを含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶ_LＳＫ２ｂ）、および
プラスミドＨＥＦ−ＲＶ_H−ＳＫ２ａを含有する大腸菌
はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α（ＨＥＦ
−ＲＶ_HＳＫ２ａ）として工業技術院生命工学工業技術
研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成５
年４月２１日に、各々ＦＥＲＭＢＰ−４２６７、およ
びＦＥＲＭＢＰ−４２６８としてブダペスト条約に基
き国際寄託された。

【０１１２】これに対して、図１０に示すように、結合
阻害（ＩＬ６とＩＬ−６Ｒと結合を阻害する抗体の能
力）測定においては、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖バージ
ョン「ｂ」（ＲｖＬｂ）と再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖バ
ージョン「ａ」（ＲｖＨａ）との組合せのみが、マウス
モノクローナル抗体ＳＫ２及びキメラＳＫ２抗体に匹敵
する結合阻害活性を示し、この組合せがヒト抗体におけ
る機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。

【０１１３】他方、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖バージョ
ン「ａ」（ＲｖＬａ）と再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖バー
ジョン「ａ」（ＲｖＨａ）との組合せ、及びＲｖＬａと
ＲｖＨｂとの組合せは低い結合阻害活性を示し、Ｌ鎖中
の７１位にフェニルアラニンを有する抗体は良好な抗原
結合活性を示すが機能的抗原結合部位を再形成すること
が示唆された。これらのことからヒト抗体Ｌ鎖のＣＤＲ
１領域に於けるループ構造には、７１位のチロシンは機
能的な抗原結合部位を再構成するのに必須であると言え
る。

【０１１４】参考例１．ハイブリドーマＳＫ２の作製抗−ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマはヒトＩＬ−６で免役したＢＡＬＢ／ｃマウス
の脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｕ１をポリエチレ
ングリコールを用いた常法により融合して作製した。Ｉ
Ｌ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害する活性を指標とした
スクリーニングを行い、結合阻害活性を有する１７種の
クローンを得た。これらのクローンをマウスの腹腔内に
移植し、得られた腹水をプロテインＡアガロースカラム
にかけ、精製マウスモノクローナル抗体を得た。

【０１１５】参考例２．マウスモノクローナル抗体Ｓ
Ｋ２のタイピングハイブリドーマＳＫ２から産生されるマウスモノクロー
ナル抗体ＳＫ２のＬ鎖およびＨ鎖のタイプを調べるため
に、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット
（アマシャムインターナショナルｐｌｃ社製）を用いて
タイピングを行った。その結果、ＳＫ２抗体はκ型軽鎖
およびγ１型重鎖を有することが明らかになった。

【０１１６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40

【０１１７】配列番号：２配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39

【０１１８】配列番号：３配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40

【０１１９】配列番号：４配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43

【０１２０】配列番号：５配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40

【０１２１】配列番号：６配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37

【０１２２】配列番号：７配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41

【０１２３】配列番号：８配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41

【０１２４】配列番号：９配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35

【０１２５】配列番号：１０配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37

【０１２６】配列番号：１１配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38

【０１２７】配列番号：１２配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27

【０１２８】配列番号：１３配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37

【０１２９】配列番号：１４配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36

【０１３０】配列番号：１５配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37

【０１３１】配列番号：１６配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35

【０１３２】配列番号：１７配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40

【０１３３】配列番号：１８配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37

【０１３４】配列番号：１９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36

【０１３５】配列番号：２０配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33

【０１３６】配列番号：２１配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40

【０１３７】配列番号：２２配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37

【０１３８】配列番号：２３配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38

【０１３９】配列番号：２４配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37

【０１４０】配列番号：２５配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28

【０１４１】配列番号：２６配列の長さ：３７９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：マウス直接の起源クローン：ｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_L 特徴：１．．６０ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ６１．．２７９ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ配列

【０１４２】 ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GGG TTG CTG CTG CTG TGG CTT 45 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu -20 -15 -10 ACA GAT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC 90 Thr Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser -5 -1 1 5 10 CTA TCT GTA TCA GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA 135 Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 15 20 25 AGT GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG 180 Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 30 35 40 GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT GCC GCA ACA TAC TTA GCA 225 Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala 45 50 55 GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGC ACA CAG 270 Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln 60 65 70 TAT TCC CTA AAG ATC AAC AGC CTG CAG TCT GAA GAT TTT GGG AGT 315 Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser 75 80 85 TAT TAC TGT CAA CAT TTT TGG GGT ACT CCT CCG TTC GGC TCG GGG 360 Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Pro Phe Gly Ser Gly 90 95 100 ACA AAG TTG GAA ATA AAA C 379 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105

【０１４３】配列番号：２７配列の長さ：４５７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：マウス直接の起源クローン：ｐＵＣ−ＳＫ２−Ｖ_H 特徴：１．．５７ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ５８．．４５７ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ配列

【０１４４】 ATG GGC AGA CTT ACA TTC TCA TTC CTG CTA CTG ATT GTC CCT GCA 45 Met Gly Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala -15 -10 -5 TAT GTC CTG TCC CAG GTT ACT CTG AAA GAG TCT GGC CCT GGG ATA 90 Tyr Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile -1 1 5 10 TTG CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT TCT TTC TCT GGT 135 Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly 15 20 25 TTT TCA CTG AAC ACT TCT GGT ATG ACC GTA GGC TGG ATT CGT CAG 180 Phe Ser Leu Asn Thr Ser Gly Met Thr Val Gly Trp Ile Arg Gln 30 35 40 CCT TCA GGG AAG GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TGG TGG AAT 225 Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn 45 50 55 GAT GAT AAG TAC TAT AAC CCA GCC CTG AAA GGC CGG CTC ACA ATC 270 Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Arg Leu Thr Ile 60 65 70 TCC AAG GAT ACC TCC AAC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC GCC AGT 315 Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser 75 80 85 GTG GTC ACT GCA GAT ACT GCC ACA TAC TAC TGT GCT CGA ATG GAG 360 Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu 90 95 100 GAT TAC GAC GAA GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC 405 Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 105 110 115 ACC GTC TCC TCA G 418 Thr Val Ser Ser 120

【０１４５】配列番号：２８配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CCTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAACT TTGTC 35

【０１４６】配列番号：２９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GATAAGCTTG CCGCCACCAT GAGTGTGCTC ACTCAG 36

【０１４７】配列番号：３０配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GATAAGCTTG CCGCCACCAT GGGCAGACTT ACATTC 36

【０１４８】配列番号：３１配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TGTTGGATCC ACTCACCTGA AGAGACAGTG ACTGAGGTTC 40

【０１４９】配列番号：３２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CAGAAGTGGA CAGTGAAAAA CCAGA 25

【０１５０】配列番号：３３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTTTTCACTG TCCACTTCTG GTATGAC 27

【０１５１】配列番号：３４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AACAGCTATG ACCATGA 17

【０１５２】配列番号：３５配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GAATTCGGAT CCACTCACGT TTGATT 26

【０１５３】配列番号：３６配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GAATATTTAC AGTAATTTAG CATGGTACCA GCAGAAGCC 39

【０１５４】配列番号：３７配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TGCTGATCTA CGCCGCAACA TACTTAGCAG ATGGTGTGCC AAGCA 45

【０１５５】配列番号：３８配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTGGGGTACT CCTCCGTTCT GGCCAAGGGA CCAAGGT 37

【０１５６】配列番号：３９配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTACTGTAAA TATTCTCACT TGCTCTACAG GTGATGGTCA C 41

【０１５７】配列番号：４０配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACCATCTGCT AAGTATGTTG CGTCGTAGAT CAGCAGCTTT GGAGC 45

【０１５８】配列番号：４１配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CGGAGGAGTA CCCCAAAAAT GTTGGCAGTA GTAGGT 36

【０１５９】配列番号：４２配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGTACCGACT ACACCTTCAC CATCAGCAGC C 31

【０１６０】配列番号：４３配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGTGAAGGTG TAGTCGGTAC CGCTACCGCT A 31

【０１６１】配列番号：４４配列の長さ：９５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GATAAGCTTG CCACCATGGA CTGGACCTGG AGGGTCTTCT TCTTGCTGGC 50 TGTAGCTCCA CGTGCTCACT CCCAAGTGAC TCTGAGGGAG TCTGG 95

【０１６２】配列番号：４５配列の長さ：９３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AGTACTTAAT GAGAAGCCAG AGAAGGTGCA GGTGAGTGTC AGAGTCTGTG 50 TAGGTCTCAC AAGGGCAGGT CCAGACTCCC TCAGAGTCAC TTG 93

【０１６３】配列番号：４６配列の長さ：９５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTCTCTGGCT TCTCATTAAG TACTTCTGGT ATGACCGTAG GCTGGATTCG 50 CCAACCTCCT GGAGAGGCAC TGGAGTGGCT GGCACACATT TGGTG 95

【０１６４】配列番号：４７配列の長さ：９６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTGGTTCTTG GATGTGTCTT TGGAGACGGC CAGTCGGCCT TTCAGGGCaG 50 GGTTATAGTA CTTATCATCA TTCCACCAAA TGTGTGCCAG CCACTC 96

【０１６５】配列番号：４８配列の長さ：９８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TCCAAAGACA CATCCAAGAA CCAGGTTGTC CTGTCCATGA ACACCGTGGG 50 TCCCGGGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC AAGAATGGAG GATTACGA 98

【０１６６】配列番号：４９配列の長さ：９４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA CCAGAATCCC TTGGCCCCAG 50 TAGTCCATAG CTTCGTCGTA ATCCTCCATT CTTGCACAGT AATA 94

【０１６７】配列番号：５０配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TTCTCATTAA ATACTTCTGG TATGACCGTA 31

【０１６８】配列番号：５１配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ACCAGAAGTA TTTAATGAGA AGCCAGAGAA G 31

【０１６９】配列番号：５２配列の長さ：３７６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ａ

【０１７０】特徴：ヒトＩＬ−６に対する再構成ヒトＳ
Ｋ２抗体のＬ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコー
ドする遺伝子アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−２３：ＦＲ１アミノ酸２４−３４：ＣＤＲ１アミノ酸３５−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−５６：ＣＤＲ２アミノ酸５７−８８：ＦＲ３アミノ酸８９−９６：ＣＤＲ３アミノ酸９７−１０６：ＦＲ４配列

【０１７１】 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCA AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 15 20 25 GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC GCC GCA ACA TAC TTA GCA GAT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAA CAT TTT TGG GGT ACT CCT CCG TTC GGC CAA GGG ACC 360 Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Pro Phe Gly Gln Gly Thr 90 95 100 AAG GTG GAA ATC AAA C 376 Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１７２】配列番号：５３配列の長さ：３７６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬ−ＳＫ２ｂ

【０１７３】特徴：ヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト化
ＳＫ２抗体のＬ鎖Ｖ領域バージョン（ｂ）及びそれをコ
ードする遺伝子アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−２３：ＦＲ１アミノ酸２４−３４：ＣＤＲ１アミノ酸３５−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−５６：ＣＤＲ２アミノ酸５７−８８：ＦＲ３アミノ酸８９−９６：ＣＤＲ３アミノ酸９７−１０６：ＦＲ４配列

【０１７４】 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA 45 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr -15 -10 -5 GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG 90 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu -1 1 5 10 AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCA AGT 135 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 15 20 25 GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA 180 Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 30 35 40 AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC GCC GCA ACA TAC TTA GCA GAT 225 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp 45 50 55 GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TAC 270 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 60 65 70 ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 315 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 75 80 85 TAC TGC CAA CAT TTT TGG GGT ACT CCT CCG TTC GGC CAA GGG ACC 360 Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Pro Phe Gly Gln Gly Thr 90 95 100 AAG GTG GAA ATC AAA C 376 Lys Val Glu Ile Lys 105

【０１７５】配列番号：５４配列の長さ：４１８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ａ

【０１７６】特徴：ヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト化
ＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコ
ードする遺伝子。アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３７：ＣＤＲ１アミノ酸３８−５１：ＦＲ２アミノ酸５２−６７：ＣＤＲ２アミノ酸６８−９９：ＦＲ３アミノ酸１００−１０９：ＣＤＲ３アミノ酸１１０−１２０：ＦＲ４配列

【０１７７】 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro -15 -10 -5 CGT GCT CAC TCC CAA GTG ACT CTG AGG GAG TCT GGA CCT GCC CTT 90 Arg Ala His Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu -1 1 5 10 GTG AGA CCT ACA CAG ACT CTG ACA CTC ACC TGC ACC TTC TCT GGC 135 Val Arg Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly 15 20 25 TTC TCA TTA AGT ACT TCT GGT ATG ACC GTA GGC TGG ATT CGC CAA 180 Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Thr Val Gly Trp Ile Arg Gln 30 35 40 CCT CCT GGA GAG GCA CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TGG TGG AAT 225 Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn 45 50 55 GAT GAT AAG TAC TAT AAC CCT GCC CTG AAA GGC CGA CTG GCC GTC 270 Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Arg Leu Ala Val 60 65 70 TCC AAA GAC ACA TCC AAG AAC CAG GTT GTC CTG TCC ATG AAC ACC 315 Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Ser Met Asn Thr 75 80 85 GTG GGT CCC GGG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA ATG GAG 360 Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu 90 95 100 GAT TAC GAC GAA GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ATT CTG GTC 405 Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val 105 110 115 ACC GTC TCC TCA G 418 Thr Val Ser Ser 120

【０１７８】配列番号：５５配列の長さ：４１８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨ−ＳＫ２ｂ

【０１７９】特徴：ヒトＩＬ−６に対する再構成ヒト化
ＳＫ２抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン（ｂ）及びそれをコ
ードする遺伝子。アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３７：ＣＤＲ１アミノ酸３８−５１：ＦＲ２アミノ酸５２−６７：ＣＤＲ２アミノ酸６８−９９：ＦＲ３アミノ酸１００−１０９：ＣＤＲ３アミノ酸１１０−１２０：ＦＲ４配列

【０１８０】 ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro -15 -10 -5 CGT GCT CAC TCC CAA GTG ACT CTG AGG GAG TCT GGA CCT GCC CTT 90 Arg Ala His Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu -1 1 5 10 GTG AGA CCT ACA CAG ACT CTG ACA CTC ACC TGC ACC TTC TCT GGC 135 Val Arg Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly 15 20 25 TTC TCA TTA AAT ACT TCT GGT ATG ACC GTA GGC TGG ATT CGC CAA 180 Phe Ser Leu Asn Thr Ser Gly Met Thr Val Gly Trp Ile Arg Gln 30 35 40 CCT CCT GGA GAG GCA CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TGG TGG AAT 225 Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn 45 50 55 GAT GAT AAG TAC TAT AAC CCT GCC CTG AAA GGC CGA CTG GCC GTC 270 Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Arg Leu Ala Val 60 65 70 TCC AAA GAC ACA TCC AAG AAC CAG GTT GTC CTG TCC ATG AAC ACC 315 Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Ser Met Asn Thr 75 80 85 GTG GGT CCC GGG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA ATG GAG 360 Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu 90 95 100 GAT TAC GAC GAA GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ATT CTG GTC 405 Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val 105 110 115 ACC GTC TCC TCA G 418 Thr Val Ser Ser 120

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のために
有用な、ヒトＥＦＩ−αプロモーター／エンハンサーを
含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−Ｖ_L−ｇｋ及びＨＥ
Ｆ−Ｖ_H−ｇγ１を示す。

【図２】図２は、本発明の抗体ペプチドの発現のために
有用な、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモ
ーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示
す。

【図３】図３は、ＳＫ２抗体がグリコシル化されている
ことを示す電気泳動図である。

【図４】図４は、ヒトＩＬ−６に結合する本発明のキメ
ラ抗体の能力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグ
ラフである。

【図５】図５は、ヒトＩＬ−６へのＩＬ−６の結合を阻
害する本発明のキメラ抗体の能力の確認のためのＥＬＩ
ＳＡの結果を示すグラフである。

【図６】図６は、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第
一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイヤグラ
ムである。

【図７】図７は、再構成ヒトＳＫ２抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第
一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイヤグラ
ムである。

【図８】図８は、ヒトＩＬ−６への結合についての、再
構成ヒトＬ鎖＋キメラＨ鎖から成る抗体の能力を示すグ
ラフである。

【図９】図９は、ヒトＩＬ−６への結合についての、本
発明の４種類の再構成ヒトＳＫ２抗体の能力をキメラ抗
体のそれと比較して示すグラフである。

【図１０】図１０は、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を
阻害する本発明の４種類の再構成ヒト化ＳＫ２抗体の能
力を、ＳＫ２キメラ抗体及びマウスモノクローナル抗体
ＳＫ２のそれと比較して示すグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記に定義されるアミノ酸配列： CDR1：Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala CDR2：Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp CDR3：Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Pro またはその一部から成る３個の相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含むＬ鎖可変
領域（Ｖ領域）、並びにヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）か
ら構成されるヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）に
対する抗体のＬ鎖。
【請求項２】前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲがマウス抗体由来
であることを特徴とする請求項１に記載のＬ鎖。
【請求項３】前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：２６に示さ
れるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に
記載のＬ鎖。
【請求項４】前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体由来で
あることを特徴とする請求項１に記載のＬ鎖。
【請求項５】前記Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体ＲＥＩ
由来であることを特徴とする請求項１又は４に記載のＬ
鎖。
【請求項６】前記Ｌ鎖Ｖ領域が下記アミノ酸配列：（ａ）FR１：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys FR２：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr FR３：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys FR４：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys （ｂ）FR１：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys FR２：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr FR３：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys FR４：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys またはその一部から成る４個のＦＲのいずれか１組を含
むことを特徴とする請求項１に記載のＬ鎖。
【請求項７】前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がκＣ領域であるこ
とを特徴とする請求項１に記載のＬ鎖。
【請求項８】下記に定義されるアミノ酸配列： CDR1：Thr Ser Gly Met Thr Val Gly CDR2：His Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn
Pro Ala Leu Lys Gly CDR3：Met Glu Asp Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr またはその一部から成る３個のＣＤＲおよびＦＲを含む
Ｈ鎖Ｖ領域、並びにヒトＬ鎖Ｃ領域から構成されるヒト
ＩＲ−６に対する抗体のＨ鎖。
【請求項９】前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがマウス抗体由来
であることを特徴とする請求項８に記載のＨ鎖。
【請求項１０】前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２７に示
されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項８
に記載のＨ鎖。
【請求項１１】前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体由来
であることを特徴とする請求項８に記載のＨ鎖。
【請求項１２】前記Ｈ鎖Ｖ領域のＦＲがヒト抗体ＤＡ
Ｗ由来であることを特徴とする請求項８に記載のＨ鎖。
【請求項１３】前記Ｈ鎖Ｖ領域が下記のアミノ酸配
列：（ａ）FR１：Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Arg Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser FR２：Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala FR３：Arg Leu Ala Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Ser Met Asn Thr Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg FR４：Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser （ｂ）FR１：Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Arg Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn FR２：Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala FR３：Arg Leu Ala Val Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Ser Met Asn Thr Val Gly Pro Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg FR４：Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser またはその一部から成る４個のＦＲのいずれか１組を含
むことを特徴とする請求項８に記載のＨ鎖。
【請求項１４】前記ヒトＣ領域がγ−１Ｃ領域または
γ−４Ｃ領域であることを特徴とする請求項８に記載の
Ｈ鎖。
【請求項１５】請求項１に記載のＬ鎖および請求項８
に記載のＨ鎖からなるヒトインターロイキン−６に対す
る抗体。
【請求項１６】前記Ｖ領域のＦＲがマウス抗体由来で
あることを特徴とする請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】前記Ｖ領域のＦＲがヒト抗体由来であ
ることを特徴とする請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】請求項１に記載のアミノ酸配列または
その一部からなる３個のＣＤＲおよびＦＲを含むＬ鎖Ｖ
領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域からなるヒトインターロイ
キン−６に対する抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項１９】前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号５２または
５３で示されるヌクレオチド配列であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１８項記載のＤＮＡ。
【請求項２０】請求項８に記載のアミノ酸配列または
その一部からなる３個のＣＤＲおよびＦＲを含むＨ鎖Ｖ
領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域からなるヒトインターロイ
キン−６に対する抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号５４または
５５で示されるヌクレオチド配列であることを特徴とす
る請求項２０に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】請求項１８または１９に記載のＤＮＡ
またはその一部を含む組換えベクター。
【請求項２３】請求項２０または２１に記載のＤＮＡ
またはその一部を含む組換えベクター。
【請求項２４】請求項２２に記載の組換えベクターお
よび請求項２３に記載の組換えベクターにより同時形質
転換された形質転換体。
【請求項２５】請求項２４に記載の形質転換体を培養
し、次いで、産生された目的とする抗体を分離すること
を特徴とする遺伝子組換え技術を使用した、ヒトインタ
ーロイキン−６に対する抗体の製造方法。