JPH0747543B2 - アシアロ糖蛋白抱合薬剤 - Google Patents

アシアロ糖蛋白抱合薬剤

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JPH0747543B2
JPH0747543B2 JP5500805A JP50080593A JPH0747543B2 JP H0747543 B2 JPH0747543 B2 JP H0747543B2 JP 5500805 A JP5500805 A JP 5500805A JP 50080593 A JP50080593 A JP 50080593A JP H0747543 B2 JPH0747543 B2 JP H0747543B2
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gal
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Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は肝に特異に作用する医薬成分などをアシアロ糖
蛋白（ASGP）と結合させて、製造された新規の抱合薬剤
に関するものであり、組換えインターフェロン（INF）
とアシアロ糖蛋白を結合させて製造された新規の抱合イ
ンターフェロン抗ウイルス剤を含む。本発明は特に、ウ
イルス性肝炎を治療することにおいて効果的な新規な抱
合インターフェロンに関するものである。本発明の抱合
インターフェロンは肝炎ウイルスが主に繁殖する肝のみ
にて選択的に分布及び摂取され、Ｂ型及びＣ型肝炎の治
療をするための治療剤としての潜在的有効性を表す。
尚、本発明は抱合薬剤の製造方法、薬剤学的組成物及び
その用途に関するものである。
［背景技術］ 慢性ウイルス性肝炎は世界的に非常にありふれた疾患で
ある。全人口の約５％及び韓国人口の約10％が慢性ウイ
ルス性肝炎に感染していると推算される。尚、慢性ウイ
ルス性肝炎が医学的、社会的に関心を集めている理由は
その疾患が生活、特に生活の質及び生産的な面で有害な
影響を与える為である。慢性肝炎は一般的に肝硬変症に
進行し、更には原発性肝癌を引き起こし、死亡に至るこ
とがある。
即ち、慢性ウイルス性肝炎は肝炎の主要原因であり、致
命率の高い疾患である。従って、効果的な抗ウイルス製
剤の開発が急を要している。しかし、最近まで慢性ウイ
ルス性肝炎に確実な抗ウイルス剤治療法はない。幾つか
の薬剤が慢性ウイルス性肝炎の治療に部分的に有効なも
のとして立証されているが副作用を始め、諸般の問題点
が解決されなければならない実情である。
過去、広く利用されてきた抗ウイルス製剤の中の一つで
あるアデノシンアラビノシド一燐酸（Adenosine arabin
oside monophospate）（Ara−AMP）はDNA重合酵素の活
性度を抑制し、強力な抗ウイルス作用を表すプリン系製
剤である。1980年代始めには慢性Ｂ型肝炎に対するAra
−AMPの治療効果は10乃至17％であると報告されてい
る。しかし、1987年ガラシア（ガルシアG.、スミス C
L.ワイスバーグ JI.ら：慢性Ｂ型肝炎の治療における
ひと白血球インターフェロンと組み合わせたアデニンア
ラビノシド一燐酸：任意の二重盲検プラセボによる試
験、アンナルス・インターナル・メディシン、107:278
−285,1987）等はAra−AMP治療群は対照群に比べて数
等、優れた効果を得ることはできなかったと報告してい
る。尚、Ara−AMPの投与は時々骨髄抑制作用と非可逆的
な神経筋肉系の痛みのような非常に深刻な副作用をひき
おこす。従って、Ara−AMPは現在は慢性Ｂ型ウイルス性
肝炎の治療に使用されていない。
一般的に、動物細胞内で生産される、即ち自然型インタ
ーフェロンは慢性Ｂ型ウイルス性肝炎の治療に効果的な
ものであることが知られている。自然型インターフェロ
ンは糖蛋白質群、即ち、非−蛋白質部分が低分子量の炭
水化物である抱合蛋白質として1957年抗ウイルス活性を
有する物質であることが明らかになった。インターフェ
ロンの抗ウイルス剤及び抗癌剤としての有用性により、
産業界及び学界においてこれらの作用効果、作用メカニ
ズム及び純品の分離方法、大量生産方法等について多く
の研究が進行されている。現在知られているインターフ
ェロンとしては１）白血球においてウイルス感染によっ
て誘導生産され、抗ウイルス作用と自然殺細胞活性化作
用を有するα−インターフェロン、２）繊維芽細胞にお
いてウイルス感染、特に二重鎖RNAウイルス感染により
誘導生産され抗ウイルス作用を有するβ−インターフェ
ロン、及び３）リンパ球において分裂誘発因子又は抗原
による免疫学的刺激により誘導生産されて免疫調節活性
を有するγ−インターフェロンがある。γ−インターフ
ェロンはα−及びβ−インターフェロンに比べて抗癌効
果及び抗ウイルス活性が優れていると報告されている。
今日は遺伝子組換え方法により組換えインターフェロン
の大量生産が可能となって組換えインターフェロンは抗
ウイルス剤及び免疫調節薬剤として広範囲に利用されて
いる。
組換え形インターフェロンの慢性Ｂ型肝炎に対する治療
効果を見れば、慢性Ｂ型肝炎の罹患率が相対的に低い西
欧においては30乃至40％であると報告されているが対照
群の自然緩解率である15乃至25％と比較して見れば組換
えインターフェロンはわずか約10乃至15％の慢性Ｂ型肝
炎患者のみに臨床的効果があるものと判断される。全世
界人口の中、肝炎Ｂ表面抗原保有者は約３億であると推
算され、この中、アジア人が80％を占める。これらアジ
ア人を組換えインターフェロンで治療したとき、治療率
は肝炎ｅ抗原の年間自然消失率である16乃至17％と同程
度の10乃至15％に過ぎない。従って、組換えインターフ
ェロンは韓国人を含むアジア人にはその効果が認められ
ていない。
インターフェロンは慢性Ｂ型肝炎患者の血清内のＢ型肝
炎ウイルス（HBV）を消滅もしくは減少させることがで
きるが、一部慢性肝炎患者等にはHBV DNAが肝細胞内に
持続的に存在していることが知られている。従って、イ
ンターフェロン治療の中断後に再発の可能性が高いと推
測される。
一方、慢性Ｃ型肝炎に対してはインターフェロン容量及
び治療期間により多少の差はあるが、生化学的肝機能検
査によって得た血清アラニンアミノ移転酵素（Alanine
Aminotransferase）値の減少を臨床的治療効果判定の基
準でみる時、組換えインターフェロンの使用により、28
乃至71％まで治療効果があると報告されている。
しかし、組換えインターフェロンによる治療後、約半数
の患者から再び臨床的再発を確認されたので、Ｃ型肝炎
に対する組換えインターフェロンの治療効果は一時的で
あるとしか見られない。従って、現在商品化されている
組換えインターフェロンは一部のＢ型及びＣ型慢性肝炎
患者に単に、一時的な効果のみを提供する。
最近、Ｂ型及びＣ型慢性肝炎患者の数人に投与して一時
的な効果を示している組換え型インターフェロンは、自
然型インターフェロンとは異なり、糖（Sugar）基を有
しないポリペプチッドインターフェロンである。組換え
インターフェロンは投与直後腎臓を経て尿に排出される
ので肝細胞摂取率が自然型インターフェロンよりも劣
り、従って、その効果が非常に制限的なものであると知
られている。実際にＢ型及びＣ型慢性肝炎に対する組換
えインターフェロンの臨床的効果は一部患者にて一時的
にのみ現れ、治療失敗率及び治療中止後の再発率が全て
相当に高いことが確認された。尚、治療効果を高める為
にはインターフェロンを多量投与しなければならない。
しかし、多量を使用すれば必然的に発熱、筋肉痛、及び
関節痛、及び骨髄抑制等の副作用が伴う。
上記の通り、既存の組換えインターフェロンは慢性肝炎
治療剤として高い効能が期待できないので、副作用を最
少にしつつ、高い治療効果を示すことのできる新たな慢
性肝炎治療剤の開発が切実に要求されてきた。
インターフェロンの効果がこのように、一時的に現れる
理由はインターフェロンが血清においてはウイルスDNA
の量を減少させることができたが、肝細胞内のウイルス
に対しては効果的に作用することができず、従って、肝
細胞内でウイルスが持続的に増殖して治療終了後にさら
に悪化することがあるためである。
従って、最も理想的な治療方法は最も効果的な抗ウイル
ス剤を目的とする肝細胞内に直接投入する薬物標的治療
法である。
先行技術においては、肝細胞内に存在するウイルスの増
殖を抑制するために肝細胞のみに特異的に存在する受容
体を通じて抗ウイルス剤を投入する方法等が試みられて
きた。ヒウメン等（バイオケミカル・ファーマコロジ
ー、35:967,1986）は抗ウイルス剤である９−β−Ｄ−
アラビノフラノシル−アデニル−５′−モノホスフェー
ト（ara−AMP）を血清アルブミンにラクトースを結合さ
せて合成した新規の蛋白であるラクトーサミネーティド
血清アルブミン（Ｌ−SA）に結合させたＬ−SA−ara−A
MPを合成させてこの物質が肝内に特異的に高濃度で摂取
され得るということを確認した。しかし、この過程はラ
クトーサミネーティド血清アルブミンの生産過程が非常
に複雑であるのみならず、高過なアルブミンを使用し、
尚、Ｌ−SA−ara−AMPは人体に存在する天然物質でない
合成糖蛋白を使用し、Ｂ型慢性肝炎治療に効果のないこ
とが確認されていたara−AMPを結合させて製造したとい
う点で肝炎治療においては高い効果が期待できなかっ
た。
血液内の血漿蛋白はアルブミンを除いては全てシアル酸
残基で終わる炭水化物鎖を含む糖蛋白である。この血漿
蛋白類は種々の酵素等によってシアル酸残基が離脱する
ことによって循環血液より一連の過程を経て除去され
る。ノイラミン酸分解酵素は哺乳動物血清において糖蛋
白からシアル酸残基を除去する酵素としてのその活性度
を示す。［シェングルント Ａ、CL:シアリダーゼ、ロ
ーゼバーグ Ａ、シェングルント CL（編）：シアル酸
の生物学的役割、ニューヨーク、プレウム、1976］。血
液内を循環し、可溶性である血漿蛋白は一定期間後には
その溶解度や固有の生理的作用を喪失する。このような
作用メカニズムは肝細胞に存在する。即ち、肝細胞より
の糖蛋白除去メカニズムは障害のある肝硬変や肝炎患者
の場合に正常血漿からは検出されない循環アシアロ糖蛋
白がこれらの患者の血漿内に存在するという事実から糖
蛋白の除去は肝の機能に属することがわかる。
実際にアシアロセルロプラスミンを兎に注射した時、ア
シアロセルロプラスミンの半減期は自然のセルロプラス
ミンの55時間と比べて２分と顕著に短い。このような現
象は他の血漿蛋白の場合にも共通に観察される。
即ち、糖蛋白の末端に位置するシアーリル基を除去すれ
ばガラクトース基が露出され、このガラクトース基を肝
細胞膜に存在する受容体に認識され、即時に受容体媒介
性エンドサイトーシス（RME）を経て肝細胞に急速に取
り込まれ、循環血液から無くなる。
モーレル（Morell）とアシュウェル（Aswell）等は1960
年代に、セルロプラスミンのシアリール基をノイラミニ
ダーゼで除去すれば、この血漿蛋白が血漿からより早く
去るのを確認し、この現象が肝細胞に存在するASGP受容
体によって摂取される為であることを明らかにした（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、243:
155,1968）。その後このASGP受容体は肝細胞のみ存在す
ることが明らかになった（Adv.Enzymol.41:99,1974）。
このような肝細胞への特異な摂取は、実験的にトリチウ
ムを付したアシアロセルロプラスミンやアシアロオロソ
ムコイド（orosomucoid）を生体内に注射すれば、同位
元素が肝細胞内のみにて選択的に発見されることによっ
て確認された（シエンベルク IH、モレル AG、ストッ
カート RJ:循環蛋白の肝臓薬、ダビッドソン CS編、
肝臓病における問題点、279−285頁、ニューヨーク、ス
トラットン社、1979）。尚、この受容体は最後糖基がＤ
−ガラクトースもしくはＮ−アセチルカラクトサミン
（Ｎ−acetylgalactosamin）の糖蛋白を特異的に認知
し、摂取することが明らかになった（Ann.Rev.Biochem.
51;531,1982）。肝細胞の細胞膜にはガラクトースで終
わるアシアロ糖蛋白と結合する細胞構造があり、この細
胞構造は最初には肝結合蛋白（HBP）と呼ばれてきた
が、現在はアシアロ糖蛋白受容体と呼ばれている。尚、
種々のアシアロ糖蛋白の中でもアシアロ−α１−酸糖蛋
白であるアシアロオロソムコイド（asialoorosomucoi
d）を注入した時、血清内で最も早く無くなることが観
察されることによってアシアロ−α１−酸糖蛋白が肝細
胞内に特異的に最も良く摂取されることが明らかになっ
た（第１図）（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、245;4397、1970）。
顕著な抗ウイルス効果のある自然型インターフェロンも
炭水化物鎖の端にシアル酸を含んでいる糖蛋白で、静脈
内注射の後、血液内から迅速に除去される。自然産（Na
tive）インターフェロンを酵素処理して末端のシアリル
基を除去してガラクトースで終わるアシアロインターフ
ェロンを作ればセルロプラスミン等の他の糖蛋白の場合
のように自然型インターフェロンに比べて早く循環血液
から除去される。
しかし、グリコシダーゼで処理してインターフェロン分
子より85％以上の炭水化物基を除去して、ポリペプチド
部分のみを残した場合にはインターフェロンの抗ウイル
ス効果は変わらないが、肝細胞内の摂取が減少しても血
液内での半減期が長くなる（ボース Ｓ、ヒックマン
J:循環系におけるインターフェロンの残存量の定量にお
ける炭水化物部分の役割、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、252:8336,1977,第２図）。従っ
て、アシアロインターフェロンも他のアシアロ血漿糖蛋
白等と同様にアシアロ糖蛋白受容体を通じて選択的に肝
細胞内に取り込まれて循環血液より除去される過程を経
ることになることと推定された。
組換えインターフェロンは1980年にバイスマン（Weissm
ann）等が人体の白血球のINF−α2b遺伝子をエシェリキ
ア・コリ内で操作することによって製造された。組換え
インターフェロンは炭水化物鎖を含まず、165個のアミ
ノ酸のみにて構成されているので組換えインターフェロ
ンの肝細胞内への浸透能力は、自然産インターフェロン
をグリコシダーゼで処理して形成されたポリペプチドイ
ンターフェロンと同じく非常に不良である。
従って、本発明の目的は殆ど肝細胞内にて主に増殖する
肝炎ウイルスに対する組換えインターフェロンの抗ウイ
ルス活性を増進するために肝細胞内において特異的に存
在するアシアロ糖蛋白（ASGP）受容体に対して組換えイ
ンターフェロンを標的にさせることである。
本発明の他の目的は肝炎の臨床的、血清学的及び分子生
物学的症状を示す人間を含む哺乳動物に投与し、B,C,及
びＤ型肝炎を含むウイルス性肝炎が治療できるインター
フェロン−抱合体を提供することにある。
本発明の追加的目的は患者の肝細胞に存在する肝炎ウイ
ルスの増殖を抑制するに充分な量の後述する一般式
（１）の抱合インターフェロンを必要とする患者に投与
してウイルス性肝炎を治療する方法を提供する。
本発明の他の目的は肝細胞に存在する肝炎ウイルスの増
殖を抑制するのに有効な量の後述する一般式（１）の抱
合インターフェロン及び薬剤学的に許容される担体、補
助剤又は賦型剤を含むウイルス性肝炎治療用組成物を提
供するものである。
本発明の追加の他の目的はアシアロ糖蛋白（ASGP）と組
換えインターフェロン（INF）を結合させて、患者に非
経口的に投与した時、肝細胞内に特異的に存在するASGP
受容体に結合するインターフェロン−抱合体を生成させ
る新規の抱合抗インターフェロン剤の製造方法を提供す
ることにある。
本発明の利点は組換えインターフェロン単独使用時の副
作用発現度に比べて副作用の発現を減少させたインター
フェロン−抱合体を提供することである。
前述したものは本発明の更に適切な目的中の一部を概略
的に示したものである。これらの目的は本発明の更に適
切な特徴及び適用方法中の一部を単純に例示するための
ものである。その他多数の有益な結果が本発明の他の方
法に適用するか、本発明を記述された内容の範囲内で変
形させることによって得ることができる。従って、本発
明の他の目的及び更に詳細なことは、添付図面とともに
請求の範囲で定義された発明の範囲と発明の要約及び望
ましい具体例とを記述した詳細な説明を参考にして理解
することができる。
［発明の開示］ 一つの観点において、本発明は次の一般式（Ｉ）に示す
新規の抱合薬剤に関するものである。
（Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−Ｒ （Ａ） ［式中、 Ｐ は人体の血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ は人体の血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はそれ以上の整数を示し、 Ｒ は下記で定義したような医薬成分を意味する。］ アシアロ糖蛋白と結合させて上記一般式（Ｉ）の抱合薬
剤を製造するに適合した医薬成分は実質的に肝に特異的
に作用する全ての薬剤である。望ましくは医薬成分はＢ
型及びＣ型慢性ウイルス性肝炎治療用抗ウイルス剤、例
えばインターフェロンナトリウム、アサイクロビル（ac
yclovir sodium）、リバビリン（ribavirin）、ビダラ
ビン（vidarabine;アデノン アラビノサイド）、ジド
ブヂン（zidovudine:AZT）、スラミン（suramin）、ア
ンチ−センスオリゴヌクレオタイド（anti−senseoligi
nucleotide）及びリボザイム（触媒的 RNAs）；抗癌剤
化学療法による毒性を防止する生物学的調節物質、例え
ばメトツレックセイトの毒性を軽減させるカルシウムロ
イコボリン（leucovorin calcium）；診断的肝映像化用
放射線照映剤、例えば、ナトリウム−メグルミンディア
トリゾエイト及びガドリニューム−DTPA;肝細胞保護
剤、例えば、グルタチオン（GSH）及びプロスタグラン
ヂン；及び肝スキャニング用放射性同位元素、例えば99
mTc（テクネチウム）及び131Iである。本発明による一
般式（Ｉ）の抱合薬剤の医薬成分から更に望ましいのは
慢性ウイルス性肝炎の治療に最も効果的なインターフェ
ロン（INF）である。従って、以下においては本発明を
アシアロ糖蛋白とインターフェロンとを結合させて製造
した抱合インターフェロンと関連して具体的に説明す
る。
本発明はウイルス性肝炎に罹病している患者に抗ウイル
ス効果を示し、肝を通じて流れる血液から肝細胞によっ
て選択的に吸収されるように標的化された抱合インター
フェロンに関するものである。本発明による抱合インタ
ーフェロンには下記一般式（Ｉ）の抱合インターフェロ
ンを含む。
（Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−INF （Ｉ） ［式中、 Ｐ は人体血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ は人体の血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はそれ以上の定数を示し、 INF はインターフェロンであり、望ましくはINFは組換
えインターフェロンである。］ インターフェロン（INF）はα−インターフェロン、β
−インターフェロン又はγ−インターフェロンであり、
最も望ましくはα−インターフェロンである。
望ましい人間血清糖蛋白はα（１）−酸糖蛋白（オロソ
ムコイド）、フェツイン、セルロプラスミン、ハプトグ
ロブリン、サイログロブリン、マクログロブリンであ
る。
一般式（Ｉ）のＰ−（Ｓ）ｘ−Gal−残基は望ましくは
アシアロオロソムコイド、アシアロフェツイン、アシア
ロセルロプラスミン、アシアロハプトグロブリン、アシ
アロサイログブリン及びアシアロマクログロブリンから
成る群から選ばれるアシアロ化ひと血清糖蛋白である。
本発明の又他の観点は肝炎治療用薬剤学的組成物であ
る。この組成物はウイルス性肝炎に感染した患者の肝細
胞に存在する肝炎ウイルスの増殖を抑制するに充分な量
の一般式（Ｉ）の抱合インターフェロン及び薬剤学的に
許容する担体、補助剤又は賦型剤を含む。望ましくは薬
剤学的組成物は静脈投与に適合したものである。
本発明の他の観点はウイルス性肝炎に罹病している患者
の肝細胞に存在する肝炎ウイルスの増殖を抑制するのに
充分な量の一般式（Ｉ）の抱合インターフェロンを投与
してウイルス性肝炎に罹病している患者のウイルス性肝
炎を治療する方法である。望ましくは抱合インターフェ
ロンは静脈内投与される。
本発明の又他の観点は一般式（Ｉ）の抱合インターフェ
ロンを製造する方法である。
（Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−INF （Ｉ） ［式中、 Ｐ は人体血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ は人体の血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はそれ以上の定数を示す。］ この方法は糖部分の末端から二番目残基がＤ−ガラクト
ース（Gal）であり、最後の残基がＮ−アセチルノイラ
ミン酸（NANA）又は（シアル酸）であることを特徴とす
る一般式蛋白質−（糖）ｘ−Gal−NANAの糖蛋白を有す
る人体血清を提供する段階を含む。その後人体血清を処
理して人体血清から蛋白質−（糖）ｘ−Gal−NANAを分
離させ、Ｐ−（Ｓ）ｘ−Gal−NANAを回収する。その
後、Ｐ−（Ｓ）ｘ−Gal−NANAをニュラミダーゼで処理
してNANAを除去し、アシアロ糖蛋白（ASGP）であるＰ−
（Ｓ）ｘ−Gal残基を得て、これが脱シアル化された人
体血清糖蛋白質残基である。アシアロ糖蛋白であるＰ−
（Ｓ）ｘ−Galはその後にグルタルアルデヒド（GA）交
差結合方法（レイシュリン M:蛋白およびペプチドの結
合剤としてのグルタルアルデヒドの使用、Methods Enzy
mol 70 159−165,1980）を使用してインターフェロン
と結合させる。その後、一般式Ｐ−（Ｓ）ｘ−Gal−INF
（Ｉ）の抱合インターフェロンを得る。
望ましくは人体血清は人体血清のコーン（Cohn）分画Ｖ
上清液であり、これをDEAE−セファデクス又はCM−セル
ローズクロマトグラフィによって通常な公知の方法で処
理してコーン分画Ｖ上清液から蛋白質−（糖）ｘ−Gal
−NANAを分離させる。
一般式（Ｉ）の抱合インターフェロンを製造する更に具
体的な方法は人体血清のコーン分画Ｖ上清液を提供する
段階を含む。
（Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−INF （Ｉ） ［式中、 Ｐ は人体血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ は人体の血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はその以上の定数を示し、 INF はインターフェロンであり、望ましくはINFは組換
えインターフェロンである。
人体血清のコーン分画Ｖ上清液を処理してそれから蛋白
質−（糖）ｘ−Gal−NANA糖蛋白を分離及び回収させ
て、これをニュラミダーゼで処理して糖蛋白を脱シアル
化させて蛋白質−（糖）ｘ−Gal構造を有するアシアロ
糖蛋白（ASGP）である糖蛋白残基を得る。アシアロ糖蛋
白はグルタルアルデヒド（GA）交差結合方法を使用して
インターフェロンと結合させる。その後、蛋白質−
（糖）ｘ−Gal−INF構造を有する抱合インターフェロン
を回収する。
望ましくは人体血清のコーン分画Ｖ上清液を通常の方法
でDEAE−セファデクス又はCM−セルローズクロマトグラ
フィによって処理してコーンＶ分画から蛋白質−（糖）
ｘ−Gal−NANAのα（１）−酸糖蛋白を分離する。
本発明の更に適切、かつ重要な特徴は以下の発明の詳細
な説明が更に良く理解され得、本技術分野に対する進歩
性が充分に理解できるように上記で要約、記述した。後
述した本発明の追加の特徴は本発明の特許請求範囲の対
象を構成する。当業者は本明細書において記述された概
念及び具体例が本発明の同一の目的を行うために他の構
造物を変形させるか、設計変更するための基礎として利
用できることは当該技術分野の専門家に理解できること
である。尚、このような等価構造物が特許請求範囲に記
述した本発明の意義及び範疇を脱しないことも当該記述
分野の専門家に理解できることである。
［図面の簡単な説明］ 本発明の特徴及び目的の完全な理解をするために添付図
面を関連させて次の詳細な説明を参考にする。
第１図は静脈注射したアシアロ血漿蛋白質等の血漿内残
存率を示すグラフであり、 第２図は静脈内投与後の自然産インターフェロン、ノイ
ラミニダーゼ処理したインターフェロン及びグリコシダ
ーゼ処理したインターフェロンの消失率を示し、 第３図は分離精製したα１−酸糖蛋白とアシアロ糖蛋白
との電気泳動写真であり、 第４図はアシアロ糖蛋白とインターフェロンとの抱合体
合成後行った電気泳動写真であり、 第５図は牛血清アルブミンとアシアロ糖蛋白との肝内摂
取を比較したγカメラ像及び放射能値グラフであり、 第６図はインターフェロンと新規の抱合インターフェロ
ンとの肝内摂取を比較したγカメラ像及び放射能値グラ
フであり、 第７図はインターフェロンと新規の抱合インターフェロ
ンとの投与３時間後生体内生物学的分布図を示すグラフ
であり、 第８図はインターフェロンと新規の抱合インターフェロ
ンとの時間経過による相対的な肝内生物学的分布図を示
すグラフである。
［発明の好ましい実施形態］ 先行技術の組換えインターフェロンに関する上記の問題
点を解決するためにはインターフェロンを肝細胞内に浸
透させなければならない。従って、本発明は組換えイン
ターフェロンを直接肝細胞内に浸透させるために組換え
インターフェロンを肝細胞に選択的に運搬し得る、即
ち、ノイラミニダーゼによって血漿糖蛋白を処理してシ
アル酸残基を除去し、ガラクトース残基を露出させて、
即ち、アシアロ糖蛋白（ASGP）を形成させる。
その後、抗ウイルス剤である組換えインターフェロンを
糖蛋白（ASGP）の露出したガラクトース残基と結合させ
ることによって、この様に結合した薬剤は肝細胞に特異
に存在するASGP受容体に結合することができる。この
際、結合させる抗ウイルス剤としては現在までＢ型及び
Ｃ型慢性肝炎治療に最も効果的であるとして知られた組
換えα−、β−及びγ−INFが含まれる。ここで特に驚
くべき事実はα−、β−、γ−インターフェロンを肝炎
治療に単独に使用する場合にはα−インターフェロンの
みが治療効果であるが本発明によってα−、β−、γ−
インターフェロンをアシアロ糖蛋白（ASGP）と結合させ
ればα−、β−、γ−インターフェロン全て肝炎治療に
効果があるという点である。
尚、本発明の新規の抱合インターフェロンは肝細胞のみ
によって特異的に吸収された後に肝細胞内に長時間残留
するので最適投与容量を減少させることができる。
従って、インターフェロンの頻繁な投与又は多量投与に
よる副作用が一般的に軽減する。抱合インターフェロン
の製造に使用される糖蛋白は特別の制限はないが、第１
図に示すように肝への吸収の早いものであることが明ら
かになったα１−酸糖蛋白、即ち、オロソムコイドやフ
ェツイン、セルロプラスミン、ハプトグロブリン、サイ
ログロプリン及びマクログロブリン等が望ましい。
本発明の抱合インターフェロンは下記のような方法で製
造できる。先ず、人体血清のコーン分画Ｖ上清液から蛋
白質（糖）ｘ−Gal−NANA（NANAはＮ−アセチルノイラ
ミン酸である）構造を有するα１−酸糖蛋白をDEAE−セ
ファデクス又はCM−セルローズクロマトグラフィによっ
て通常の方法で分離した後（ハオ Ｙ−Ｌ、ウイッカー
ハウザー M.:グリコプロテイン、Biochem.Biophys.Act
a 322:99,1973）、ノイラミダーゼによってシアル酸を
除去した蛋白質−（糖）ｘ−Galの構造を有するアシア
ロ糖蛋白（ASGP）を得て、このアシアロ糖蛋白とインタ
ーフェロンとをグルタルアルデヒド交差結合方法を利用
して結合させ、Gal−（糖）ｘ−蛋白−GA−INFの構造を
有する抱合体を合成する。
上記のような本発明の工程を要約すれば次のようであ
る。
上記製造方法において使用される糖蛋白は人体の血漿内
に存在する糖蛋白である。本発明の目的のためには糖蛋
白の糖部分の末端から二番目残基がＤ−ガラクトースで
あり末端残基がＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）
である限り、α１−酸糖蛋白（オロソムコイド）のよう
な如何なる糖蛋白も使用ができ、例えば、フェツイン
（fetuin）、セルロプラスミン（ceruloplasmin）、ハ
プトグロビン（haptoglobin）のような糖蛋白が且つ使
用できる。
オロソムコイド、フェツイン、セルロプラスミン、ヘト
グロビン、チログロブリン及びマクログロブリン糖蛋白
が脱シアル化した場合には各々アシアロオロソムコイ
ド、アシアロフェツイン、アシアロセルロプラスミン、
アシアロヘトグロビン、アシアロサイログロブリン及び
アシアロマクログロブリンと呼ばれ、本発明の抱合イン
ターフェロンに使用できる。これらのアシアロ糖蛋白は
α（１）−酸糖蛋白、即ち、アシアロオロソムコイドの
脱シアル化方法と同一の工程によって製造できる。
しかし、最も望ましいのはα（１）−酸糖蛋白（アシア
ロオロソムコイド）であるが、その理由は第１図に示す
ように、注射後に血漿内に残留するアシアロオロソムコ
イドの比率は血漿1ml当たり約0.18％であるからであ
る。静脈内注射した脱シアル化した血漿蛋白質の残存率
を測定するために体重約200gの雄アルビノラットの尾静
脈に注射（1ml）を投与した。各注射液1mlは次に相応す
る：3 H−アシアロトランスペリン、0.3mg、6.6X106dpm;64 Cu−セルローズプラスミン、0.3mg;3H−アシアログロ
ブリン、 0.3mg、12.6X166dpm;3H−アシアロ−α２−マクログロ
ブリン、 0.19mg、11.2X106dpm;3H−アシアロハプトグロビン、0.
12mg、9.5X106dpm;3H−アシアロセルロプラスミン、0.3
mg、6.7X106dpm;3H−アシアロフェツイン、0.11mg、2X1
06dpm;3 H−アシアロオロソムコイド、0.13mg、14.4X106dpm. 血液の見本は尾静脈から種々の時間間隔にしてヘパリン
処理した試験管に入れて遠心分離した後、血漿放射能を
測定する。動物を殺した後、指示された時間に肝を摘出
し、湿潤組織約20mgの分取量を放射能測定に使用する。
結果は第１図に提示した。
第１図においては血液内にアシアロα１−酸糖蛋白（ア
シアロオロソムコイド）、アシアロフェツイン、アシア
ロセルロプラスミン及びアシアロハプトグロビンを静脈
内注射した後12分後に血液中に残している量の百分率が
各々0.18、0.37、0.6及び1.2であることを図示してい
る。即ち、アシアロα１−酸糖蛋白が血液から最も早く
去るということが分かり、即ちこれが他のものに比べて
最も早い速度で肝細胞に吸収されるということを示して
いる。
本発明の抱合インターフェロンの製造のための第１段階
工程でコーン分画Ｖ上清液はアルブミン製造方法として
知られている通常の方法（コーン E.J.ら、ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミストリー、ソサイェティ、6
8:459,1946）によって人間血清より分離させて得ること
ができる。コーン分画Ｖ上清液からα１−酸糖蛋白を大
規模で分離精製する方法は以下で略述する公知の方法
（ハオ Ｙ−Ｌ、ウイッカーハウザー M.;α１−酸糖
蛋白の大規模調製の簡便法、Biochem.Blophys.Acta.32
2:99,1973）によって行う。
表２ 分離精製されたα１−酸糖蛋白を下記反応図式による脱
シアル化反応に適用させ、アシアロ糖蛋白を得る。
回収したアシアロ糖蛋白は第３図のカラムＣに示すよう
な電気泳動図を示す。第３図においてカラムＡは蛋白質
の分子量標識であり、カラムＢは分離された43kd（kdは
キロダルトンを意味する）の大きさのシアル酸が切断さ
れていないα１−酸糖蛋白の単一バンドであり、カラム
Ｃは1.7kdの大きさのシアル酸残基を切断した約41kdの
アシアロα１−酸糖蛋白の単一バンドである。
脱シアルロ糖蛋白とインターフェロンとの抱合体を製造
する最終工程は最も穏やかな交差結合反応の一つである
グルタルアルデヒド（GA）交差結合方法を利用する。グ
ルタルアルデヒドは４℃乃至40℃にて中性pH（6.0−8.
0）で、広い緩衝領域を有する緩衝液中で露出したアミ
ノ基と結合する。この反応は蛋白質のアミノ基とアルデ
ヒド基との間にシッフ塩基を形成することによって達成
される。この反応において、グルタルアルデヒドは二つ
のアルデヒド基を持っているので次に示すようにこれら
が二つのアミノ基と直接結合するようになる（ポズマン
スキー M.J.および ジュリアノ R.L.:薬物の制御送
達への生物学的検討：クリティカル・レビュー、ファー
マコロジカル・レビューズ 36:277−336,1984）。
グルタルアルデヒド この抱合体はまずヨードゲン（Iodogen）法で抱合体の
インターフェロン部分にて131Iで標識して131I−インタ
ーフェロン−アシアロ糖蛋白抱合体を合成して、これを
電気泳動し、クマシブル−（Coomasie Blue）で染めた
後、自動放射装置を通じて確認することができる（第４
図;B及びＣ）。
第４図で、カラムＣは蛋白質の分子量標識マーカーであ
り、カラムＢで67kdのバンドは抱合体、41kdのバンドは
抱合体合成反応後の未反応のアシアロ糖蛋白を示してい
る。又、カラムＡはカラムＢの電気泳動ゲルを自動放射
記録（autoradiography）したものであり、131I−イン
ターフェロン−アシアロ糖蛋白抱合体に相応する67kdの
バンドを示す。
本発明において、インターフェロンの運搬体として用い
られるアシアロ糖蛋白が肝に特異に吸収されるというこ
とを証明するために次の様な動物実験を実施した。
実験は下記のようにその目的に従って二つに分類し、各
実験で対照群を設定して行った。
アシアロ−α１−酸糖蛋白の組織特異度に対する実験 131I−標識されたアシアロ糖蛋白を家兎に注入して得た
ガンマカメラ映像と時間による放射能値の変化を131I−
牛血清アルブミン（Bovine serum albumin:BSA）から得
た結果と比較した。その結果は第５図に示した通り人体
血清より分離精製されたアシアロ糖蛋白が肝内に特異に
摂取されるということが明らかになった。第５図におい
て上段のガンマカメラ映像は兎を横たえた状態で各臓器
から放出する放射線写真である。この写真から時間の経
過によって兎の臓器に存在するアシアロ糖蛋白の量を比
較確認できる。即ち、131I−牛血清アルブミンに比べて
131I−アシアロ糖蛋白がさらに特異的に肝に摂取され、
かつ更に長時間肝に残留しているのが確認できる。下段
グラフで横軸（Ｘ軸）は時間を、縦軸（Ｙ軸）は各々肝
と心臓内、即ち血中放射能値を示す。第５図の映像から
アシアロ糖蛋白がアルブミンより顕著に特異に肝内に摂
取されているのがわかる。
抱合インターフェロンの肝細胞選択能に対する実験 131I−標識したインターフェロンを家兎に注射した得た
ガンマカメラ映像と時間経過による肝、心臓及び膀胱に
ての放射能値を131I−標識した本発明の抱合インターフ
ェロンの場合と比較した結果を第６図に示した。
第６図のガンマカメラ映像から、インターフェロンは注
射後30分迄は主に肝に残留しているが、腎臓を通じて既
に膀胱へ排出され始め、３時間が経過するとインターフ
ェロンは肝内には殆ど無く、主に膀胱内のみに存在する
ことがわかる。一方、本発明のアシアロ糖蛋白−インタ
ーフェロン抱合体は注射後、30分、２時間及び３時間目
に主な肝内に持続的に残留し、膀胱内への排出は観察さ
れなかった。このような現像は下段の時間による放射能
値の変化とも一致する。即ち、インターフェロンの場合
には最上線の肝内放射能値及び中間線の血中放射能値が
全て注射後、30分内に漸次減少し、一番下線の膀胱内放
射能値が増加することを示しているのに比べてアシアロ
糖蛋白−インターフェロン投与群では肝内放射能値が持
続的に維持され、膀胱の放射能増加は現れなかった。
インターフェロンと新規の抱合インターフェロンとの組
織特異性を比較するためにインターフェロンとアシアロ
糖蛋白−インターフェロン抱合体とを各々家兎に注入
し、３時間後に家兎をと殺して各臓器内の放射能値を測
定し、第７図で示すように兎組織内分布を比較した。
その結果として、肝、腎臓、肺、脾臓、心臓及び甲状線
の６種の臓器に残留する全ての放射能値の合計を100と
するとき、各臓器に残留する放射能値各々の相対的比率
を見れば、アシアロ糖蛋白−インターフェロン抱合体の
肝内残留量は全臓器内残留物の約85％に達し、腎臓、
肺、心臓での残留量は各々只７％、５％、１％であっ
た。これに比べて、インターフェロンの場合には肝内の
残留量が53％に過ぎない反面、腎臓、肺、心臓では相対
的に多い32％、11％、２％を各々示した。
第８図は時間の経過によるインターフェロンと新規の抱
合インターフェロンとの肝内残存量の相対的な比率を示
すグラフである。このグラフよりアシアロ糖蛋白インタ
ーフェロン抱合体の肝内残存率はインターフェロンより
顕著に更に高く、且つ更に長いことがわかる。即ち、注
入後、30分、３時間及び12時間からアシアロ糖蛋白−イ
ンターフェロン抱合体の残存率はインターフェロンより
各々1.5倍、4.3倍及び６倍更に高い。
本発明のインターフェロン抱合体はインターフェロン製
剤に通常使用される補助剤安定化剤、緩衝剤等製薬学的
に許容される担体とともに肝炎治療用注射剤組成物とし
て製造することができる。このような目的に適合した緩
衝剤としては燐酸ナトリウム、燐酸カリウム等が望まし
い。本発明の組成物は尚フェノールのような保存剤、ア
ルブミン、Ｌ−シイテイン塩酸塩、マルトス、塩化ナト
リウム又は塩化カリウムのような安定化剤等を含むこと
ができる。
投与量は患者の年齢及び体重、症状等によって増減でき
るが、大体に本発明のインターフェロン抱合体をインタ
ーフェロン基準によって体表面積m2当たり20〜200万I.
U.を１〜２目に一回ずつ静脈投与する。しかし、その他
既存のインターフェロン投与方法に準じて投与期間や投
与量を調節することができる。
本発明の抱合インターフェロンは肝細胞によって特異に
吸収され、肝内に持続的に残留する。従って、抱合イン
ターフェロンの投与量は通常的なインターフェロン製剤
に比べて顕著に減少させることができる。このように減
少させた投与量によって、対象患者等からインターフェ
ロン自体に基づく発熱、筋肉痛、骨随抑制等のような副
作用が除去できる。従って、本発明の抱合インターフェ
ロンは通常のインターフェロンに比べて人体に対し顕著
に優れた耐性を有する。
薬剤はウイルス性肝炎の臨床的、血清学的及び分子生物
学的症状を表す患者に投与する。HBsAg及びアンチ−HCV
に対する陽性反応は各々慢性Ｂ型及びＣ型肝炎の帳票で
ある。薬剤組成粉は上述したところの通りであり、静脈
内投与の結果は第７図及び第８図で示す。
下記実施例等は本発明を更に詳細に説明するために与え
られたものであり、本発明の範囲がこの実施例等によっ
て何ら制限されるものではない。
下記実施例においてインターフェロンは特別に指定しな
い限り組換えα−インターフェロンである。
アシアロ糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−ガラクトース）の
製造 実施例１ α１−酸糖蛋白よりアシアロ糖蛋白の製造 ｉ）トレシル化支持体（tresylated support）の製造 湿潤状態のセパロース4B（Pharmacia）10gを硝子濾過器
に移した後、これを100mlの30％、60％、80％（v/v）ア
セトン水溶液及び100％無水アセトンで順次に洗滌す
る。洗滌したセファロース4Bゲルを磁石棒で攪拌しなが
ら30mlの無水アセトンと150μｌのトレシルクロリド（t
resyl chloride）（Fulka AG.Buchs、スイス）が入って
いる乾燥したビーカーに入れる。ビーカーを室温で10分
間放置した後、全体の混合物を再び硝子濾過器に移した
後、50m M HCLに溶解したアセトンの70％、50％及び30
％（v/v）溶液で洗滌し、最後に1mM HCLで洗滌する。得
られた生成物を４℃で貯蔵するか、又はアセトンで処理
した後、乾燥させて室温で保管する。このようにして得
た支持体は乾燥ゲル剤1g当たり約450μモルの酵素を支
持することができる。
ii） ノイラミニダーゼとトレシル化支持体の結合 ノイラミニダーゼ（Sigma Chem.）1ml（0.4mg/ml）をNA
PTM−10カラム（ファルマシア）を通過させた後、1.5ml
の0.2M燐酸ナトリウム−0.5MNaCl緩衝液（pH7.0）に溶
解させて（A280＝0.534）、ここに1gの活性化されたト
レシル−セファローズ4Bを加える。混合物を４℃で16時
間ゆるやかに振蕩して1.5mlの0.5Mトリス緩衝液（pH7.
5）を加える。全体の混合物を４℃で５時間放置して、
反応を終了させる。得られたゲルを0.1M燐酸ナトリウム
−0.15M NaCl（pH5.5）で洗滌してノイラミニダーゼ−
セファロース4Bを得て、これを４℃で保管する（A280＝
0.45）（緩衝液中のノイラミニダーゼ収率:OD 0.084/O
D 0.534＝0.064mg/0.4mg＝16％）。
iii）アシアロα１−酸糖蛋白の製造 0.15M NaCl−0.1Mナトリウムアセテート緩衝液（pH5.
5）25mlにα１−酸糖蛋白250mgを溶解させて得た溶液を
同一の緩衝液2mlに200mgのノイラミニダーゼ−セファロ
ース4Bを溶解させた溶液と混合させる。該混合物を37℃
に一晩反応させる。
溶出液を得てチオバルビツル酸分析法（ウォレン L.:
シアル酸のチオバルビツル酸の測定、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー、234:1971−1975（19
59））によって脱シアル化の反応の効率を測定する。即
ち、ノイラミニダーゼ−セファロース4Bで処理されたα
１−酸糖蛋白溶液（10mg/ml）1mlをNAPTM−10カラムで
処理して塩を去した後、溶出液1mlに1N H2SO450μｌを
加えて、混合物を振蕩し80℃で１時間培養した後冷却さ
せることによってノイラミニダーゼ処理後にもシアル酸
基を保有しているα１−酸糖蛋白からシアル酸基を除去
する。試料0.2ml過ヨード酸塩0.1mlを良く混合し、混合
物を20分間放置した後、亜砒酸塩1.0mlを加えて黄褐色
の色調が無くなるまで振蕩する。この溶液にチオルバル
ビツル3mlを加えて５分間沸かし、次いで５分間氷水で
冷却して、この中2mlを取って2mlのシクロヘキサンと混
合する。混合物を３分間遠心分離した後、赤い色上層液
の吸光度を波長549NMで測定する。対照群α１−酸糖蛋
白の吸収率は0.008、試料アシアロ−α１−酸糖蛋白の
吸収率は0.118であるので純粋なシアル酸の吸収率0.110
（0.118−0.008）O.D.である。シアル酸の分子吸光係数
は57000であり、遊離したシアル酸の量（μmol）は次の
方程式から求めることができる。
ここで、Ｖはチオバルビツル酸の量を表し、X1000はml
を14置換するためのものであり、O.D.は吸光度を意味す
る。アシアロ糖蛋白で硫酸により遊離したシアル酸の量
は0.00825μモル（0.075X0.110）である。α１−酸糖蛋
白（1mg/ml）1mlにはシアル酸が0.369μモルが含まれて
いるが、実験に使用されたα１−酸糖蛋白量は2mgであ
ったのでシアル酸の総量は0.738μモル（＝0.369μモル
X2）でありノイラミニダーゼで遊離させたシアル酸の量
は0.7298μモル（＝0.738−0.0082）であるしたがっ
て、アシアル化効率は0.7298/0.732X100＝99％である。
実施例２ α１−酸糖蛋白の代わりにフェツイン（fetuin）、セル
ロプラスミン（ceruloplasmin）、ハプトグロビン（hap
toglobin）、サイログロブリンを使用し、実施例１と同
一方法を利用して各々アシアロフェツイン、アシアロセ
ルロプラスミン、アシアロハプトグロビン又はアシアロ
グロブリンを製造した。
実施例３ アシアロα１−酸糖蛋白と組換えインターフェロンの抱
合体（ガラクトース−（糖）ｘ−蛋白−グルタルアルデ
ヒド−インターフェロン）の製造 抱合体の合成はハーロー（harlow）とレイン（lane）
（1988）の単一工程方法を利用して次の通り行う。131I
−標識されたインターフェロン（150μg/ml）1.0mlをNA
PTM−10カラムを使用して緩衝液0.5M燐酸ナトリウム、p
H7.5を0.1M燐酸ナトリウム、pH6.8に変える。得られた
溶液を小さい磁石棒を入れたテューブに移し、ここに10
0μｌ（0.6mg）のアシアロα１−酸糖蛋白を加える。フ
ード内でチューブの混合溶液を攪拌しながら100μｌの
１％グルタルアルデヒドを約１分間にわたって滴下す
る。全体混合物を室温で３時間培養した後100μｌの1M
エタバノールアミン（pH7.2）を加える。その上混合物
を再び室温で１時間培養し、セファロース12カラムを利
用して、液体クロマトグラフィ（FPLC）で分離し、214n
mで二個の分画を得る。最初に131I−標識されたインタ
ーフェロンの同位元素量は86.1μCiであり、第１の分画
の同位元素量は６μCi、第２の分画は６μCiである。
電気泳動をすれば三つのバンドを得ることが出来る。重
合した抱合体を示す70kd以の濃度が薄くて幅が広いバン
ドと67kdの抱合体バンド、41kdの反応後、残余のアシア
ロ糖蛋白バンドを確認することができる。この電気泳動
後のゲルを自家放射記録して二つのバンド、即ち70kd以
上の重合抱合体の濃くて広いバンドと67kdの抱合体バン
ドを確認することができる。本実験で家兎に使用したア
シアロ糖蛋白と131I−標識されたインターフェロンの抱
合体はFPLCで分離された67kdの最初の分画に該当する。
実施例４ アシアロα１−酸糖蛋白の代わりにアシアロフェツイ
ン、アシアロセルロプラスミン、アシアロハプトグロビ
ン又はアシアログロブリンを使用し、実施例３に記述さ
れた方法で実施して上記アシアロ糖蛋白血漿蛋白質とイ
ンターフェロンとを製造する。
実検例 アシアロα１−酸糖蛋白の組織特異性を確認して本発明
の抱合インターフェロンの肝細胞選択能を比較するため
に次のような動物実験を実施した。
イ．比較実験用試料の製造 フランカー（Franker）及びスペック（Speck）の方法
（バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーシュン、80:849−857）によってインターフェ
ロン、牛血清アルブミン及びアシアロα１−酸糖蛋白を
ヨード化して次のような比活性を持つ放射線ヨード化さ
れた（131I）自然産インターフェロン、牛血清アルブミ
ン及びアシアロα１−酸糖蛋白を製造して動物実験試料
として使用した。
ヨード化されたインターフェロンの比活性:359μCi
/15μｇ＝23.9μCi/μｇ ヨード化された牛血清アルブミンの比活性:400μCi
/30μｇ＝13.3μCi/μｇ ヨード化されたアシアロα１−酸糖蛋白の比活性:1
607μCi/60μｇ＝26.8μCi/μｇ ロ．実験方法及び結果 実験1:アシアロα１−酸糖蛋白の組織特異性実験 体重1.5〜2.0kgの家兎を全身麻酔して耳の静脈を通じて
131I−標識ヨード化牛血清アルブミン又はヨード化アシ
アロα１−酸糖蛋白を投入して映像コンピューターによ
って設定された検討区間を５秒毎にガンマカメラによっ
て撮影できるようにし、各臓器での放射能を測定した。
カメラは高解像コルリメーター（Collimator）が装置さ
れたオハイオニュクリア（Ohio Nuclear TM）410ガンマ
カメラを使用し、写真は５分毎に写して30分間６枚の写
真を得た。その結果、得られた映像写真は第５図の通り
である。第５図の上部パネル（Pannel）の映像写真は
131I−牛血清アルブミンに比べて131I−アシアロα１−
酸糖蛋白が肝に更に特異的に摂取されるのを示してお
り、第５図の下部パネルで上部ラインは肝内の放射能
値、下部ラインは心臓、即ち、血中放射能値を示してい
る。このグラフよりアシアロα１−酸糖蛋白が肝に特異
的に摂取されることが証明できる。
実験2:インターフェロンと本発明の抱合インターフェロ
ンとの肝細胞選択能 比較実験 上記実験１と同様の方法で131I−インターフェロンと
131I−インターフェロン−アシアロα１−酸糖蛋白抱合
体とを家兎の耳静脈に投入して肝内での放射能を比較測
定するために30万カウントずつを30分毎に写して３時間
に６枚の写真を撮影した。その結果、得られた映像写真
は第６図の通りである。第６図のガンマカメラ映像にお
いてインターフェロンは30分迄は主に肝に残留している
が、その後は、腎臓を通じて膀胱へ排泄されていること
がわかる。尚、注射した後３時間後にインターフェロン
は肝内には殆ど存在せず、主に膀胱のみに存在すること
が確認できた。しかし、アシアロα１−酸糖蛋白−イン
ターフェロン抱合体の場合には30分、２時間、３時間が
経過しても肝内に残留しており、膀胱内でのその存在は
観察できなかった。
第６図の下部パネル等を比較して見れば、インターフェ
ロンにおいて最上線である肝内の放射能、中間線である
血中放射能値が30分内に漸次減少を示しながら下段線で
ある膀胱内の放射能値が増加することを示しているが、
アシアロα１−酸糖蛋白抱合体の場合には肝内の放射能
値が持続的に維持されながら膀胱の放射能値の増加は観
察されない。
上記のような実験より本発明のインターフェロン抱合体
は自然インターフェロンに比べて肝内滞留時間が顕著に
長いということが確認できる。
実験3:インターフェロンと本発明の抱合インターフェロ
ンの組織内吸収 分布比較 上記実験２を終えた後、家兎をと殺して肝、腎臓、肺、
脾臓、心臓及び甲状腺を摘出して各臓器に分布している
放射能を測定することによって各臓器に分布しているイ
ンターフェロンの量を計算した。その計算結果を図表で
示すと第７図の通りである。
以上の実験から本発明のインターフェロン抱合体は既存
のインターフェロンに比べて肝浸透力が強く、かつ顕著
に長時間肝内に残留するので、薬効が長時間持続するこ
とがわかる。
組成物例 製剤例１ アシアロオロソムコイド−α−インターフェロン抱合体
……500,000 I.U.＊ 塩化ナトリウム ……8.0 mg 二塩基性燐酸ナトリウム ……1.74mg 一塩基性燐酸カリウム ……0.2 mg 塩化カリウム ……0.2 mg フェノル ……3.3 mg アルブミン（ひと） ……1.0 mg 上記成分等を溶液を形成させるに充分な滅菌蒸留水に溶
解させ、生成された溶液を1mlの滅菌バイアルに充填さ
せて２℃〜10℃で保管する。
＊ インターフェロン活性の国際単位 製剤例２乃至４ 製剤例１において使用されたアシアロオロソムコイド−
α−インターフェロン抱合体代わりにアシアロフェツイ
ン−インターフェロン抱合体500,000I.U.、アシアロセ
ルロプラスミン−インターフェロン抱合体600,000I.U.
又はアシアロハプトグロビン−インターフェロン抱合体
1,000,000I.U.を使用し製剤例１で使用したものと同一
の保存剤、緩衝剤、安定化剤を混合させる。混合物を注
射用滅菌蒸留水に溶解させ、溶液を1ml注射用滅菌バイ
アルに充填させ、製剤例１のように貯蔵する。
製剤例５ アシアロオロソムコイド−β−インターフェロン抱合体
……1,000,000I.U. 塩化ナトリウム ……9.0mg アルブミン（ひと） ……5.0mg フェノル ……3.0mg 上記成分等を溶液の調製に充分な注射用滅菌蒸留水に溶
解させ、生成した溶液を滅菌バイアル（1ml）充填させ
て２℃〜10℃で保管する。
製剤例６ 上記製剤例５でアシアロオロソムコイド−β−インター
フェロン抱合体の代わりにアシアロオロソムコイド−γ
−インターフェロン抱合体500,000I.U.を使用し、同一
の補助剤を混合して、生成された溶液を注射用滅菌バイ
アルに充填させる。
上記製剤例において製造された組成物等は静脈内注射に
適合する。
本発明には前述した内容等だけでなく添付した請求の範
囲に記述されている内容も含まれる。本発明はある程度
具体的に望ましい例について記述したが、望ましい例に
対する本記述内容は単に例示されたものであり、本発明
の意義及び範疇を脱しない構成の範囲を逸脱しない範囲
で、細部においての多数の変形及び部分の組合及び修飾
が可能であることが理解されなければならない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 2/00 8318−4Ｈ 14/555 8318−4Ｈ // Ａ６１Ｋ 31/557 9454−4Ｃ 31/70 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 43/00 ＡＤＵ

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記一般式（Ａ）で示される、式:Gal−
    （Ｓ）ｘ−Ｐのアシアロ糖蛋白とＲをGAを介して結合さ
    せた抱合化合物。 （Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−Ｒ （Ａ） ［式中、 Ｐ はひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ はひと血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基を示し、 GA はグルタルアルデヒド残基を示し、 ｘ は１又はそれ以上の定数を示し、 Ｒ はインターフェロン、ナトリウムアサイクロビル、
    リバビリン、ビダラビン、ジドブヂン、スラミン、アン
    チ−センスオリゴヌクレオレオチド、リボザイム、カル
    シウムロイコボリン、ナトリウム−メグルミンディアト
    リゾエート、ガドリニュム−DTPA、グルタチオン、プロ
    スタグランディン、99mTc及び131Ｉからなる群からえら
    はれる医薬成分である。］
  2. 【請求項２】次の一般式（Ｉ）を有する、請求項１記載
    のアシアロ糖蛋白−抱合化合物。 （Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−INF （Ｉ） ［式中、 Ｐ はひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ はひと血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はそれ以上の定数であり、 INF はインターフェロンを示す。］
  3. 【請求項３】INFがα−インターフェロンである、請求
    項２記載の抱合化合物。
  4. 【請求項４】INFがβ−インターフェロンである、請求
    項２記載の抱合化合物。
  5. 【請求項５】INFがγ−インターフェロンである、請求
    項２記載の抱合化合物。
  6. 【請求項６】Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ（式中、Ｐはひと血清
    糖蛋白のペプチド残基であり、Ｓはひと血清糖蛋白の糖
    残基であり、GalはＤ−ガラクトースである）が脱シア
    ル化されたひと血清糖蛋白の残基である、請求項２記載
    の抱合化合物。
  7. 【請求項７】脱シアル化されたひと血清糖蛋白がアシア
    ロオロソムコイド、アシアロフェツイン、アシアロプラ
    スミン、アシアロハプトグロブリン、アシアログロブリ
    ン及びアシアロクログロブリンからなる群から選ばれ
    る、請求項６記載の抱合化合物。
  8. 【請求項８】INFが組換えインターフェロンである、請
    求項２記載の抱合化合物。
  9. 【請求項９】ウイルス性肝炎患者の肝細胞内に存在する
    肝炎ウイルスの増殖を抑制させるに充分な量の請求項２
    記載の一般式（Ｉ）を有する抱合インターフェロン及び
    製薬学的に許容される担体、補助剤又は賦型剤を含む肝
    炎治療用医薬組成物。
  10. 【請求項１０】静脈内投与に適する、請求項９記載の医
    薬組成物。
  11. 【請求項１１】ウイルス性肝炎患者の肝細胞内に存在す
    る肝炎ウイルスの増殖を抑制させるに充分な量の請求項
    ２記載の一般式（Ｉ）を有する抱合インターフェロンの
    量がインターフェロンを基準にして１または２日に一
    回、体表面積m2当たり20〜200万I.U.である、請求項９
    記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】ひと血清のコーン分画Ｖ上清液を用い； ひと血清のコーン分画Ｖ上清液から一般式蛋白質−
    （糖）ｘ−Gal−NANAの構造を有するα１−酸糖蛋白を
    分離して回収し； α１−酸糖蛋白をノイラミニダーゼで処理することによ
    ってシアル酸を除去し、アシアロ糖蛋白（Gal−（糖）
    ｘ−蛋白質）を得； 得られたアシアロ糖蛋白をグルタルアルデヒド（GA）交
    差結合方法によって、インターフェロンと結合させ； 生成した下記一般式（Ｉ）の構造を有する抱合インター
    フェロンを回収することを特徴とする、一般式（Ｉ）の
    抱合インターフェロンの製造方法。 （Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−INF （Ｉ） ［式中、 Ｐ はひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ はひと血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はそれ以上の定数であり、 INF はインターフェロンを示す］
  13. 【請求項１３】ひと血清のコーン分画Ｖ上清液を通常の
    方法にてDEAE−セファデクス又はCM−セルローズクロマ
    トグラフィーにより処理し、コーン分画Ｖ上清液から一
    般式蛋白質−（糖）ｘ−Gal−NANAの構造を有するα１
    −酸糖蛋白を分離するものである、請求項12記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】α１−酸糖蛋白がオロソムコイドであ
    る、請求項12記載の方法。
  15. 【請求項１５】糖部分の末端から二番目の残基がＤ−ガ
    ラクトース（Gal）であり、末端残基がＮ−アセチルノ
    イラミン酸（NANA）である、一般式蛋白質−（糖）ｘ−
    Gal−NANAの構造を有するひと血清糖蛋白を含むひと血
    清を用い； ひと血清を処理してそれよりひと血清糖蛋白（蛋白質−
    （糖）ｘ−Gal−NANA）を分離させて回収し； 得られた糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−Gal−NANA）をノ
    イラミニダーゼで処理してNANAを除去することによって
    アシアロ糖蛋白（Gal−（糖）ｘ−蛋白質）を得； 生成したアシアロ糖蛋白（蛋白質−（糖）ｘ−Gal）を
    グルタルアルデヒド（GA）交差結合方法によりインター
    フェロンと結合させ； 生成した一般式（Ｉ）の抱合インターフェロンを回収す
    ることを特徴とする一般式（Ｉ）の抱合インターフェロ
    ンの製造方法。 （Gal−（Ｓ）ｘ−Ｐ）−GA−INF （Ｉ） ［式中、 Ｐ はひと血清糖蛋白のペプチド残基であり、 Ｓ はひと血清糖蛋白の糖残基であり、 Gal はガラクトース残基であり、 GA はグルタルアルデヒド残基であり、 ｘ は１又はそれ以上の定数であり、 INF はインターフェロンを示す。］
  16. 【請求項１６】ひと血清がひと血清のコーン分画Ｖ上清
    液であり、これを通常の方法でDEAE−セファデクス又は
    CM−セルローズクロマトグラフィーによって処理し、コ
    ーン分画Ｖ上清液から一般式蛋白質−（糖）ｘ−Gal−N
    ANAの構造を有するひと血清糖蛋白を分離させる、請求
    項15記載の方法。
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