JPS6230A - 悪性腫瘍性貧血治療剤 - Google Patents
悪性腫瘍性貧血治療剤Info
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- JPS6230A JPS6230A JP61022928A JP2292886A JPS6230A JP S6230 A JPS6230 A JP S6230A JP 61022928 A JP61022928 A JP 61022928A JP 2292886 A JP2292886 A JP 2292886A JP S6230 A JPS6230 A JP S6230A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
て含有する悪性腫瘍性貧血治療剤に関する。
エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記することもある）
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を有する体液性造血因子として知られている
。
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を有する体液性造血因子として知られている
。
ヒ）ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが、入手
できる純粋なヒ）ＥＰＯの量に制約があることから、ヒ
トＥＰＯの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。
できる純粋なヒ）ＥＰＯの量に制約があることから、ヒ
トＥＰＯの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。
近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており［例えば、ＭｉｌｌｅｒＡ等；ジャーナ
ル オブ クリニカル インベスティゲーシａン（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）ｆｉ旦巻 １２４８頁（１
９５６）を参照コ、特に重度の貧血は臨床的に患者の治
療上重要な問題となっている。
認められており［例えば、ＭｉｌｌｅｒＡ等；ジャーナ
ル オブ クリニカル インベスティゲーシａン（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）ｆｉ旦巻 １２４８頁（１
９５６）を参照コ、特に重度の貧血は臨床的に患者の治
療上重要な問題となっている。
貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエチン
産生障害、溶血、造血幹細胞異常などが考えられている
が、悪性腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、
網内系鉄プロ・ンク、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管
障害や自己免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療
°による骨髄抑制などの他、慢性炎症等が原因とされて
いる。
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエチン
産生障害、溶血、造血幹細胞異常などが考えられている
が、悪性腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、
網内系鉄プロ・ンク、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管
障害や自己免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療
°による骨髄抑制などの他、慢性炎症等が原因とされて
いる。
一方担癌患者に於ける血中ＥＰＯ値は正常値と同レベル
か低値であると報告されている［例えば、Ｚｕｃｋｅｒ
Ｓ等 ： ジャーナル オブ クリニカルインヘ
スティゲージ＝ｔ７ （Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ
、）１巻 １１３２頁 （１９７４）、 Ｄｏｕｇｌ
ａｓ ＳＷ等；ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） Ａ旦巻
５５頁（１９７５）、ＦｉｒａｔＤ等 ； キャンサー
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、）３Ｊ−巻１３
５５頁 （１９７１）、Ｗａｒｄ ＨＰ等 ； ジャ
ーナルオブ クリニカル インベスティゲーション （
Ｊ、 ＣＩ ｉｎ。
か低値であると報告されている［例えば、Ｚｕｃｋｅｒ
Ｓ等 ： ジャーナル オブ クリニカルインヘ
スティゲージ＝ｔ７ （Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ
、）１巻 １１３２頁 （１９７４）、 Ｄｏｕｇｌ
ａｓ ＳＷ等；ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） Ａ旦巻
５５頁（１９７５）、ＦｉｒａｔＤ等 ； キャンサー
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、）３Ｊ−巻１３
５５頁 （１９７１）、Ｗａｒｄ ＨＰ等 ； ジャ
ーナルオブ クリニカル インベスティゲーション （
Ｊ、 ＣＩ ｉｎ。
Ｉｎｖｅｓｔ、）旦立巻 ３３２頁（１９７１）及び
ＤｅＧｏｗｉｎＲＬ等 ； ジャーナル オブ ラボラ
トリ アンド クリニカルメディシｙ （Ｊ、Ｌａｂ
、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、）ｉｎ巻 ３０３頁（１９７９）
等を参照コ。
ＤｅＧｏｗｉｎＲＬ等 ； ジャーナル オブ ラボラ
トリ アンド クリニカルメディシｙ （Ｊ、Ｌａｂ
、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、）ｉｎ巻 ３０３頁（１９７９）
等を参照コ。
しかしながら、血中ＥＰＯ値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性ｍｓ性貧血はエ
リスロポエチン産生障害よりむしろＥＰＯに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある［Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ等 ； ジ
ャーナル オブ クリニカルインヘスティゲージン（Ｊ
、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５ｉ巻１１３２頁 （１
９７９）を参照］。
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性ｍｓ性貧血はエ
リスロポエチン産生障害よりむしろＥＰＯに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある［Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ等 ； ジ
ャーナル オブ クリニカルインヘスティゲージン（Ｊ
、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５ｉ巻１１３２頁 （１
９７９）を参照］。
従って悪性腫瘍性貧血患者にヒ）ＥＰＯを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。
ヒトＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告され
ているが悪性腫瘍性貧血の治療薬として有効であること
をヒト又は動物に実際に投与することによって実証した
ものはない。
ているが悪性腫瘍性貧血の治療薬として有効であること
をヒト又は動物に実際に投与することによって実証した
ものはない。
本発明者等は人尿中から高純度に精製したヒトＥＰＯお
よびヒ）ＥＰＯをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒトＥＰＯを用いて担癌動物について貧
血治療効果を調べたところ、ヒ）ＥＰＯが顕著な貧血治
療効果を示したことから悪性腫瘍性貧血治療薬として有
効であることを見い出し本発明を完成した。本発明は新
規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るものである。
よびヒ）ＥＰＯをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒトＥＰＯを用いて担癌動物について貧
血治療効果を調べたところ、ヒ）ＥＰＯが顕著な貧血治
療効果を示したことから悪性腫瘍性貧血治療薬として有
効であることを見い出し本発明を完成した。本発明は新
規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るものである。
すなわち本発明はヒトエリスロポエチンを有効成分とし
て含育する悪性腫瘍性貧血治療剤である。
て含育する悪性腫瘍性貧血治療剤である。
本発明に用いられるヒトエリスロポエチンとは、前述の
如き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をつかさどるｙｋ
ｆｆｉ生理活性物質として規定される。
如き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をつかさどるｙｋ
ｆｆｉ生理活性物質として規定される。
ヒトＥＰＯは種々の手段によって得られることが知られ
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿（血清を含む）から抽出する方法［Ｔ、ＭＩＹＡ
ＫＥ等、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー（Ｊ、Ｂ、Ｃ，’）ｇ旦２巻 ６５５８頁（１９７７
）；Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等、ジャーナル オブ ラボラ
トリ−アンドクリニカル メディシ７ （Ｊ、Ｌａｂ
、Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ、）且巻９８７頁（１９８５） ］
ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造する方法［特開昭５
４−５５７９０１、ヒトエリスロポエチン産生能を有す
るヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する方法［特開
昭５７−４０４１１］等の他、ヒト細胞株を細胞融合し
て得られるハイブリドーマを培養して得る方法やヒトＥ
ＰＯのメソセンジ＋−ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取する
ことにより、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作
成し、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、
酵母類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような
、所謂、遺伝子工学的方法によっても得られる。［例え
ば、５ＹＬＶＩＡＬ、 Ｈ，等 ； プロシーディング
オブ ザナシロナル アカデミ−オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ニーニスニー （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ｆｌ上巻 ２７０８頁（
１９８４）を参照］。
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿（血清を含む）から抽出する方法［Ｔ、ＭＩＹＡ
ＫＥ等、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー（Ｊ、Ｂ、Ｃ，’）ｇ旦２巻 ６５５８頁（１９７７
）；Ｊ、Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等、ジャーナル オブ ラボラ
トリ−アンドクリニカル メディシ７ （Ｊ、Ｌａｂ
、Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ、）且巻９８７頁（１９８５） ］
ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造する方法［特開昭５
４−５５７９０１、ヒトエリスロポエチン産生能を有す
るヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する方法［特開
昭５７−４０４１１］等の他、ヒト細胞株を細胞融合し
て得られるハイブリドーマを培養して得る方法やヒトＥ
ＰＯのメソセンジ＋−ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取する
ことにより、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作
成し、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、
酵母類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような
、所謂、遺伝子工学的方法によっても得られる。［例え
ば、５ＹＬＶＩＡＬ、 Ｈ，等 ； プロシーディング
オブ ザナシロナル アカデミ−オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ニーニスニー （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ｆｌ上巻 ２７０８頁（
１９８４）を参照］。
前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げること
ができる。
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げること
ができる。
これらの方法によって得られたヒトＥＰＯは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。
上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒ）ＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によ′
ってさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息
香酸、エタノール、アセトン。
るヒ）ＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によ′
ってさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息
香酸、エタノール、アセトン。
タンニン酸等の宵機溶媒による沈殿法、硫安等による塩
析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフイー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、
等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電気泳動法などが挙
げられ、これらの方法は単独でまたは適宜組合わせて用
いてもよい。
析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフイー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、
等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電気泳動法などが挙
げられ、これらの方法は単独でまたは適宜組合わせて用
いてもよい。
得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン
酸鉄等を挙げることができる。
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン
酸鉄等を挙げることができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトＥＰＯの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常、成人１人当たり０．１〜５０
０μｇ好ましくは５〜１００μｇのヒトエリスロポエチ
ンを含有する製剤を１週間に１〜７回投与することがで
きる。
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常、成人１人当たり０．１〜５０
０μｇ好ましくは５〜１００μｇのヒトエリスロポエチ
ンを含有する製剤を１週間に１〜７回投与することがで
きる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２
つ以上を含有してもよい。
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２
つ以上を含有してもよい。
これらの安定化物質の添加量は、エリスロポエチンの１
重量部にたいして０．１１〜１００００重量部割合で配
合することが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を
混合して使用する場合においてもそれらの総量が上記範
囲以内であればよい。
重量部にたいして０．１１〜１００００重量部割合で配
合することが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を
混合して使用する場合においてもそれらの総量が上記範
囲以内であればよい。
これらの安定化物質は相応する量を適当な濃度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３，０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０ に調整し、
特にｐＨ６〜８に調整するのが好ましい。また本発明の
製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添加しても
よい。
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３，０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０ に調整し、
特にｐＨ６〜８に調整するのが好ましい。また本発明の
製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添加しても
よい。
ＭＩＹＡＫＥ、 Ｔ、 等の方法（Ｊ、 Ｂ、 Ｃ，
皿５５５８（１９７７））に従って再生不良性貧血患者
法から １）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０による脱塩
２）ＤＥＡＥセルロースによるバッチ吸着３）エタノー
ル沈殿４）ＤＥＡＥアガロースカラムクロマトクラフィ
ーを用いて部分精製されたヒ）ＥＰＯを得た。得られた
部分精製ヒ）ＥＰＯを２４％プロパツール（和光純薬社
製）を含む０．１ ％トリフルオロ酢酸（Ａ Ｉ ｄ
ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰ
ＬＣによる精製を行った。ＨＰＬＣａ置は日立８３８−
５０型を用い２８０ ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収に
より検出を行った。
皿５５５８（１９７７））に従って再生不良性貧血患者
法から １）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０による脱塩
２）ＤＥＡＥセルロースによるバッチ吸着３）エタノー
ル沈殿４）ＤＥＡＥアガロースカラムクロマトクラフィ
ーを用いて部分精製されたヒ）ＥＰＯを得た。得られた
部分精製ヒ）ＥＰＯを２４％プロパツール（和光純薬社
製）を含む０．１ ％トリフルオロ酢酸（Ａ Ｉ ｄ
ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰ
ＬＣによる精製を行った。ＨＰＬＣａ置は日立８３８−
５０型を用い２８０ ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収に
より検出を行った。
１ 口マ ラフ −
２４％ｎ−プロパツールを含んだ０．１ ％トリフル
オロ酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（８
ｍｍＸ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を
注入し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出さ
せた。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ １
ｃｏｎ −１００（Ａｍｌｃｏｎ社製商品名）を用いた
限外ろ適法により ０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。
オロ酢酸溶液で予め平衡化したＹＭＣ−Ｃ８カラム（８
ｍｍＸ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を
注入し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出さ
せた。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ １
ｃｏｎ −１００（Ａｍｌｃｏｎ社製商品名）を用いた
限外ろ適法により ０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。
゛ ロマ ラフ −
上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む ０．１
％ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ８０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。分子量２５０００〜３０００
０の位置にＥＰＯ活性ををするピークが得られたので、
この部分を集めて凍結乾燥した。
％ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ８０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。分子量２５０００〜３０００
０の位置にＥＰＯ活性ををするピークが得られたので、
この部分を集めて凍結乾燥した。
比活性は約９Ｘ１０’ｕ／ｍｇであった。
各ステップに於ける比活性を表工に示す。
表ｌ
５ｔｅｐ 比活性＊
（ｕ／ｍｇ）＊アッセイ法 １ｓｃｏｖｅ Ｎ、Ｎ
等［ジャーナル オブセルラー フィジオロジ−（Ｊ、
Ｃｅ ｌ １．Ｐｈ１ｓ ｉｏ １．）■巻 ３０９頁
（１９７４）］の方法に従った。
（ｕ／ｍｇ）＊アッセイ法 １ｓｃｏｖｅ Ｎ、Ｎ
等［ジャーナル オブセルラー フィジオロジ−（Ｊ、
Ｃｅ ｌ １．Ｐｈ１ｓ ｉｏ １．）■巻 ３０９頁
（１９７４）］の方法に従った。
参考例２ に ヒト の１゛１１２月２
７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換のた
めの補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−２８１
８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰＯをコー
ドする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニーズハム
スター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質発現させることに
よってヒトＥＰＯを得た。要約すると以下の如くである
。
７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換のた
めの補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−２８１
８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰＯをコー
ドする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニーズハム
スター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質発現させることに
よってヒトＥＰＯを得た。要約すると以下の如くである
。
ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰｏをコードする遺
伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３クローンからの
ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ＥＰＯをコードする遺
伝子を含む小さなＲ１フラグメントを取り出しプラスミ
ドＲＫＩ−４のＥｃｏＲ１部位へ挿入した。このＥＰＯ
遺伝子を組込んだプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠
損ＣＨＯ細胞に組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を
核酸を欠如したアルファ媒地中で培養することによって
少なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を育する細胞を選択し
た後、段階的にメトトレキサートの濃度を高めてゆくこ
とによってヒトＥＰＯを産生させた。
伝子を組込んだラムダＨＥＰＯＦＬ１３クローンからの
ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ＥＰＯをコードする遺
伝子を含む小さなＲ１フラグメントを取り出しプラスミ
ドＲＫＩ−４のＥｃｏＲ１部位へ挿入した。このＥＰＯ
遺伝子を組込んだプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠
損ＣＨＯ細胞に組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を
核酸を欠如したアルファ媒地中で培養することによって
少なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を育する細胞を選択し
た後、段階的にメトトレキサートの濃度を高めてゆくこ
とによってヒトＥＰＯを産生させた。
最終的な培養上清中のヒ）ＥＰＯの比活性は２０ｕ／ｍ
ｌであった。得られたヒ）ＥＰＯを含む培養液は０．１
％ＢＳＡを含む生理食塩水にて透析した後実験に供した
。
ｌであった。得られたヒ）ＥＰＯを含む培養液は０．１
％ＢＳＡを含む生理食塩水にて透析した後実験に供した
。
６週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫層株の
小片（１〜２ｍｍ角）を移植後、１２〜１６日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数（ＲＢＣ） 、ヘモ
グロビン量（ＨＧＢ）および白血球数（ＷＢＣ）をコー
ルタ−カウンター（東亜医用電子社製）にて測定した。
小片（１〜２ｍｍ角）を移植後、１２〜１６日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数（ＲＢＣ） 、ヘモ
グロビン量（ＨＧＢ）および白血球数（ＷＢＣ）をコー
ルタ−カウンター（東亜医用電子社製）にて測定した。
（表Ｉ）腫瘍株 マウ
ス表工 木１）＜０．０５ ＊＊ｐ＜Ｏ，Ｏｆ 表Ｉに示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。
ス表工 木１）＜０．０５ ＊＊ｐ＜Ｏ，Ｏｆ 表Ｉに示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。
１と同様な方法で６週令の雄性ＢＤＦ ｉ系マウス（日
本チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し８日目に腫瘍
片の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃え
て３群（各群７匹）に分けた。
本チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し８日目に腫瘍
片の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃え
て３群（各群７匹）に分けた。
移植後９日目より各々の群に人尿由来ヒ）ＥＰＯ（１０
■／マウス／日）ＣＨＯ細胞由来ヒトＥＰＯ（１０ｕ／
マウス／日）及び溶媒（０，１ＸＢＳＡ液を含むＲＰＭ
１１６４０培地の透析液０．５ｍｌ／マウス７日）を隔
日に、７回皮下投与した。
■／マウス／日）ＣＨＯ細胞由来ヒトＥＰＯ（１０ｕ／
マウス／日）及び溶媒（０，１ＸＢＳＡ液を含むＲＰＭ
１１６４０培地の透析液０．５ｍｌ／マウス７日）を隔
日に、７回皮下投与した。
移植後１６日目に塩化鉄（Ｆｅ量にして１ｍｇ／マウス
）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
対照群として同系の非担癌マウス（７匹）を用いた。
赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図１９図２に示す。
変化について、それぞれ図１９図２に示す。
° マウスモデル１と同様な
方法で６週令の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス（日本チャ
ールスリバー社製）に腫瘍を移植し２８日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて３群
（各群７匹）に分けた。移植後２８日目より各々の群に
人尿由来ヒ）ＥＰＯ（１０■／マウス）、ＣＨＯ細胞由
来ヒ）ＥＰＯ（１０■／マウス７日）及び溶媒（０，１
％ＢＳＡを含むＲＰＭ１１６４０培地の透析液、０．５
ｍｌ／マウス７日）を隔日に７回皮下投与した。移植後
３６日目に第２塩化鉄（Ｆｅ量１ｍｇ／マウス）を担癌
マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
方法で６週令の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス（日本チャ
ールスリバー社製）に腫瘍を移植し２８日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて３群
（各群７匹）に分けた。移植後２８日目より各々の群に
人尿由来ヒ）ＥＰＯ（１０■／マウス）、ＣＨＯ細胞由
来ヒ）ＥＰＯ（１０■／マウス７日）及び溶媒（０，１
％ＢＳＡを含むＲＰＭ１１６４０培地の透析液、０．５
ｍｌ／マウス７日）を隔日に７回皮下投与した。移植後
３６日目に第２塩化鉄（Ｆｅ量１ｍｇ／マウス）を担癌
マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
対照群として同系の非担癌マウスを用いた。
赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図３９図４に示す。
変化について、それぞれ図３９図４に示す。
図１〜４に示される如く溶媒投与担癌マウス群では、担
癌後の日数の経過と共に貧血の度合いは強まったのに対
し、ヒトＥＰＯ投与担癌マウス群では明らかに貧血が改
善された。
癌後の日数の経過と共に貧血の度合いは強まったのに対
し、ヒトＥＰＯ投与担癌マウス群では明らかに貧血が改
善された。
またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。
明はこれ等に限定されるべきものではない。
実施例１
エリスロポエチン １重量部ヒト
血清アルブミン １００重量部注射用蒸
留水にて全量 ｔｏｏｏｏｏ重量部上記組
成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注し、凍
結乾燥し密封した。
血清アルブミン １００重量部注射用蒸
留水にて全量 ｔｏｏｏｏｏ重量部上記組
成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注し、凍
結乾燥し密封した。
実施例２
実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
実施例３
１００ｍｌ中にマンニトール５ｇ、エリスロポエチン１
ｍｇ＋ ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチルトリ
プトファンナトリウム２．１５４ ｍｇ。
ｍｇ＋ ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチルトリ
プトファンナトリウム２．１５４ ｍｇ。
カプリル酸ナトリウム１．３３ｍｇを含む水溶液を無菌
的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。
的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。
実施例４
ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にエ
リスロポエチン１ｍｇポリエチレングリコール４０００
． ５００ｍｇエチレンオキサイドプロピレンオキサイ
ド共重合体３０ｍｇ塩化ナトリウム８００ｍｇを含む水
溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつアンプルに分注し溶
閉する。
リスロポエチン１ｍｇポリエチレングリコール４０００
． ５００ｍｇエチレンオキサイドプロピレンオキサイ
ド共重合体３０ｍｇ塩化ナトリウム８００ｍｇを含む水
溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつアンプルに分注し溶
閉する。
実施例５
ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中にエリ
スロポエチン０．５ｍｇ１グリＩシフ １ ｇｔソルビ
トール１ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、０、５ｍｌ
ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に０
．１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１ｍ
ｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
スロポエチン０．５ｍｇ１グリＩシフ １ ｇｔソルビ
トール１ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、０、５ｍｌ
ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に０
．１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１ｍ
ｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
実施例６
１００ｍ１中にエリスロポエチン１ ｍ ｇ ＋ ヒト
血清アルブミン５０ ｍ ｇ ＋ マンニトール５００
ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイア
ルに分注し凍結乾燥し密封する。
血清アルブミン５０ ｍ ｇ ＋ マンニトール５００
ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイア
ルに分注し凍結乾燥し密封する。
別に３００ｍ１中にグルコン酸第二鉄３ｇ、ＮａＣｌ２
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、３１ずつアンプ
ルに分注し、溶封する。
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、３１ずつアンプ
ルに分注し、溶封する。
上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。
で）静注する。
図１はＬｅｗｌｓ肺癌担癌マウスの抹梢血赤血球数（Ｒ
ＢＣ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図２はＬｅｗｌｓ肺癌担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン
量（ＨＧＢ）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 図３はＣ３ＭＣ２担癌マウスの抹梢血赤血球数（ＲＢＣ
）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 図４はＣ３ＭＣ２担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン量（
ＨＧＢ）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 すべての図中に於いてｏ−〇は非担癌マウス群△−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームは人尿由来ヒトＥＰＯ投与
担癌マウス群、ローロはＣＨＯ細胞由来ヒ）ＥＰＯ投与
担癌マウス群を示す。 又図中に表示した＊印は、溶媒投与損金マウス群に対す
る有意水準を示しており、＊ｐ＜０．０５＊＊ｐ＜Ｏ，
Ｏｆ ＊＊＊ｐ＜０．００１ を意味する。 才１図 瘤炒壌役め１」欽 第２図 屑６ Ｆ？ ふｌ Ｘえ の １３ ４え一才３
図 烏秒慈欠ｆｒ ’３漿 十４図 ぶ諭 婦 Ａｋ−４し−の １コ （しく、手続補
正書（自発） 昭和６１年４月２５日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿１、事件の表示 昭和６１年特許願第２２９２８号 ２、発明の名称 悪性ａｍ性貧血治療剤 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都北区浮間５丁目５番１号 明細書全文 特許邪 置 （０３）９８７−７１目（大代表）明 細
書 １、発明の名称 悪性腫瘍性貧血治療剤 ２、特許請求の範囲 （１） ヒトエリスロボエチンを有効成分として含有す
る悪性腫瘍性貧血治療剤。 （２） ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の悪性腫瘍
性貧血治療剤。 （３） ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポを宿主
細胞内で形質発現させて得たものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 （４） 宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 〔５） 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞で
あることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の悪性
腫瘍性貧血治療剤。 （６） 宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第３項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 ３、発明の詳細な説明 本発明はヒトエリスロポエチン（以下「ヒトＥＰＯＪと
いう）を有効成分として含有する悪性腫瘍性貧血治療剤
に関する。 本願明細書においてヒトＥＰＯとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯＪという）、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯＪ
という）、ヒト胃癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒ）ＥＰＯ産生能を有するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下ｒＥＰ
ＯＪという）という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨すいに存在する赤芽球系幹細胞に働いて
、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示
す微量生理活性物質をいう。 ヒト尿ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが、ヒ
トＥＰＯの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。 近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており［例えば％ Ｍ ｔ ｌ ｌ ｅ ｒＡ
等；ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲー
ション（Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）３５巻１２４
８頁（１９５１３年）を参照コ、特に重度の貧血は臨床
的に患者の治療上重要な問題となっている。 貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、ＥＰＯ産生障害ζ
溶血、造血幹細胞の異常などが考えられているが、悪性
腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、網内系鉄
ブロック、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管障害や自己
免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療による骨髄
抑制などの他、慢性炎症等が原因とされている。一方担
癌患者に於ける血中ＥＰＯ値は正常値と同レベルか低値
であると報告されている［例えば、Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ
等；ジャーナル オブ クリニカルインベスティゲーシ
ョン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５３巻１１３２
頁（１９７４年）、Ｄｏｕｇｌａｓ ＳＷ等；ブラッ
ド（Ｂｌｏｏｄ）４５巻５５頁（１９７５年）、Ｆｉｒ
ａｔ Ｄ等；キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、）３１巻１３５５頁（１９７１年） Ｎ Ｗａ
ｒ ｄ ＨＰ等；ジャーナル オブ クリニカル
インベスティゲーシａン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ
、）５０巻３３２頁（１９７１年）及びＤｅＧｏｗｉｎ
ＲＬ等；ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド
クリニカル メデイシン（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ１ｉｎ、Ｍｅ
ｄ、）９４巻３０３頁（１９７９年）等を参照コ。 しかしながら、血中ＥＰＯ値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性腫瘍性貧血はエ
リスロボエチン産生障害よりむしろＥＰＯに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある［Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ 等；ジ
ャーナル オブ クリニカル インベスティゲーシコン
（Ｊ。 ＣＩ ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５３巻１１３２頁（１９
７４年）を参照］。 従って悪性腫瘍性貧血患者にヒ）ＥＰＯを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。 ヒト尿ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告さ
れているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒトＥＰＯが悪
性腫瘍性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は
動物に実際に投与することによって実証したものはない
。 本発明者等は高純度に精製したヒト尿ＥＰＯおよびヒト
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒ）ｒＥＰｏを用いて担癌動物に
ついて貧血治療効果を調べたところ、これらのヒトＥＰ
Ｏが顕著な貧血治療効果を示したことから悪性腫瘍性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。 本発明は新規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るもの
である。 すなわち本発明はヒトＥＰＯを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤である。 本発明に用いられるヒトＥＰＯは種々の手段によって得
ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿又は血漿（血清を含む）から抽出す
ることにより得ることができる［Ｔ、ＭＩＹＡＫＥ等、
ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｊ、
Ｂ、Ｃ，）、２５２巻５５５８頁（１９７７年）；Ｊ、
Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等、ジャーナル オブ ラボラトリ−ア
ンド クリニカル メディシン（Ｊ、Ｌａｂ。 Ｃｌ ｉ、ｎ−Ｍｅ ｄ−） 、８８巻９８７頁（１９
６５年） コ 。 またヒトｒＥＰｏは例えばヒトＥＰＯのアミノ酸配列に
対応するメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取し
、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮ八へを作成し、次い
で適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる。［例えば、５
ＹＬＶＩＡＬ、Ｈ，等；プロシーディンゲス オブ ザ
ナショナル アカデミ−オブ ザ ニー ニスｙ−−（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ）８１巻２７０８頁（１９８４年）を参照］。 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げること
ができる。この他、ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造
する方法〔特開昭５４−５５７９０１ 、ヒトＥＰＯ産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法［特開昭５７−４０４１１］ 、ヒト細胞株を細胞
融合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等
によっても製造することができる。 これらの方法によって得られたヒ）ＥＰＯは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。 上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の打機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティー２０マドグラフイー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単
独でまたは適宜組合せて用いてもよい。 得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とかできる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、デキストラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロ
ン酸鉄、オロチン酸鉄等を挙げることができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトＥＰＯの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常９ Ｘ １０’ｕ／ｍｇヒトＥ
ＰＯとして成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ましく
は５〜１００μｇのヒトＥＰＯを含有する製剤を１週間
に１〜７回投与することができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、宵
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２
つ以上を含有してもよい。 これらの安定化物質の添加量は、ヒトＥＰＯの１重量部
にたいして０．１１〜１００００重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。 これらの安定化物質は相応する量を適当な１度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０に調整し、特
にｐＨ８〜８に調整するのが好ましい。 また本発明の製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤
を添加してもよい。 参考例１ ヒト のパ１ ＭＩＹＡＫＥ、Ｔ、等の方法［ジャーナル・オブ バイ
オロジカル ケミストリー （Ｊ、Ｂ。 Ｃ，）５２巻５５５８頁（１９７７年）コに従って再生
不良性貧血患者法から １）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５
０による脱塩 ２ ） Ｄ Ｅ Ａ Ｅ セルｏ −ス
によるバッチ吸着 ３）エタノール沈殿 ４）ＤＥＡＥ
アガロースカラムクロマトグラフィーを用いて部分精製
されたヒト尿ＥＰＯを得た。 ゛ フロ７ グラフ − 得られた部分精製ヒト尿ＥＰＯを２４％プロパツール（
和光純薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａｌ
ｄｒｉｃｈｆ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣに
よる精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立８３８−５０型
を用い２８０ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収により検出
を行った。 ２４％ｎ−プロパツールを含んだ０．１％トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したＭＭＣ−Ｃ８カラム（６ｍｍ
Ｘ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させた
。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ ｉ ｃ
ｏｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ社商品名）社用品名限外ろ
適法により、０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。 。゛ ロマトグラフ − 上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む０．１％
ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。 分子量２５０００〜３００００の位置にＥＰＯ活性を有
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。比活性は約９Ｘ１０”ｕ／ｍｇであった。
−各ステップに於ける比活性
を表Ｉに示す。 表Ｉ ＊アッセイ法 １ｓｃｏｖｅ Ｎ、Ｎ等［ジャーナル
オブ セルラー フィジオ ロジ−（Ｊ、Ｃｅ ｌ １．ｐｈｙＳ ｉｏｌ、）８３巻３０９頁（１９ ７４年）コの方法に従った。 参考例 ２ ヒト の″浩１２月
２７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換の
ための補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−２８
１８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドを
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質
発現させることによってヒトｒヒトＥＰＯを得た。要約
すると以下の如くである。 ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＯＰＥＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
１フラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒ）ＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を存する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆ（ことによってヒ）
ｒＥＰｏを産生させた。 最終的な培養上清中のヒ）ｒＥＰｏの活性は２０ｕ／ｍ
ｌであった。 ＣＨＯ細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒトｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒトｒＥＰＯはＫｒｙｓｔａｌ等の方法［
ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル
メディスン（Ｊ、 Ｌａｂ、ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、）９
７巻１４４頁（１９８１年）コにより６６００ｕ／ｍｌ
の活性を有していた。またこのヒトｒＥＰｏはＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドで
あることが確認された。 得られたヒトｒＥＰｏに０．１％ＢＳＡを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。 ６週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫瘍様の
小片（１〜２ｍｍ角）を移植後、１２〜１６日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数（ＲＢＣ） 、ヘモ
グロビン量（ＨＧＢ）および白血球数（ＷＢＣ）をコー
ルタ−カウンター（東亜医用電子社製）にて測定しな。 （表■）腫瘍株 マウス 表■ 表■に示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。 、 ヒ ト に ゛ −１
と同様な方法で６迎合の雄性ＢＤＦＩ系マウス（日本チ
ャールスリバー社製）に腫瘍を移植し８日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて３群
（各群７匹）に分けた。 移植後９日目より各々の群にヒト尿ＥＰＯ（１０ｕ／マ
ウス／日）、ＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰ。 （１０ｕ／？ウス／日）および溶媒（０，１％ＢＳＡ液
を含むＲＰＭＩ １６４０培地の透析液０゜５ｍｌ／
マウス７日）を隔日にて、７回皮下投与した。 移植後１６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量にして１ｍｇ／マ
ウス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った
。 対照群をして同系の非担癌マウス（７匹）を用いた。 赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図１、図２に示す。 ° 搬移 １と同様な方法で６迎合の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス
（日本チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し２８日目
に腫瘍の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを
揃えて３群（各群７匹）に分けた。移植後２９日目より
各々の群にヒト尿ＥＰＯ（１０ｕ／？ウス）、ＣＨＯ細
胞由来ヒトｒＥＰＯ（１０ｕ／？ウス／日）および溶媒
（０゜１％ＢＳＡ液を含とＲＰＭＩ １８４０培地の
透析液、０．５ｍｌ／マウス７日）を隔日にて７回皮下
投与した。移植後３６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量、１
ｍ ｇ ／マウス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄
補給を行った。 対照群として同系の非担癌マウスを用いた。 赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図３、図４に示す。 図１〜４にしめされる如く溶媒投与担癌マウス群では、
担癌後の日数の経過を共に貧血の度合いは強まったのに
対し、ヒトＥＰｏ投与担癌マウス群では明らかに貧血が
改善された。 またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。 実施例１ 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。 実施・例２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。 実施例３ １００ｍｌ中にマンニトール５ｇ１ヒト尿ＥＰ０１ ｍ
ｇ Ｎ ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチルト
リプトファンナトリウム２．１５４ｍｇ。 カプリル酸ナトリウム１．３３ｍｇを含む水溶液を無菌
的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。 実施例４ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にヒ
ト尿ＥＰ０１ｍｇ１ポリエチレングリコロール４０００
５００ｍｇ１工チレンオキサイドプロビレオンオキサ
イド共重合体３０ ｍ ｇ １塩化ナトリウム８００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍｌずつアンプル
に分注溶閉する。 実施例５ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中にＣＨ
Ｏ細胞由来ヒトｒＥＰＯｏ、５ｍｇ１グリシン１ｇ１ソ
ルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、０．５
ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に
０．１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１
ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。 実施例６ １００ｍ１中にヒト尿ＥＰ０１ｍｇ１ヒト血清アルブミ
ン５００ｍｇ１マンニトール５００ｍｇを含む水溶液を
無菌的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥
し密封する。 別に３００ｍ１中にグリコン酸第二鉄３ｇ、Ｎａｃ１２
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍｌずつアン
プルに分注し、溶封する。 上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。 ４、図面の簡単な説明 図１はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血赤血球数（Ｒ
ＢＣ）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 図２はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血ヘモグロビン
量（ＨＧＢ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図３はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血赤血球数（ＲＢＣ
）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図４はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血ヘモグロビン量（
ＨＧＢ）に友ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 すべての図中に於いてＯ−Ｏは非担癌マウス群Δ−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームはヒト尿ＥＰＯ投与担癌マ
ウス群、ローロはＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰＯ投与担癌
マウス群を示す。
ＢＣ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図２はＬｅｗｌｓ肺癌担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン
量（ＨＧＢ）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 図３はＣ３ＭＣ２担癌マウスの抹梢血赤血球数（ＲＢＣ
）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 図４はＣ３ＭＣ２担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン量（
ＨＧＢ）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 すべての図中に於いてｏ−〇は非担癌マウス群△−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームは人尿由来ヒトＥＰＯ投与
担癌マウス群、ローロはＣＨＯ細胞由来ヒ）ＥＰＯ投与
担癌マウス群を示す。 又図中に表示した＊印は、溶媒投与損金マウス群に対す
る有意水準を示しており、＊ｐ＜０．０５＊＊ｐ＜Ｏ，
Ｏｆ ＊＊＊ｐ＜０．００１ を意味する。 才１図 瘤炒壌役め１」欽 第２図 屑６ Ｆ？ ふｌ Ｘえ の １３ ４え一才３
図 烏秒慈欠ｆｒ ’３漿 十４図 ぶ諭 婦 Ａｋ−４し−の １コ （しく、手続補
正書（自発） 昭和６１年４月２５日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿１、事件の表示 昭和６１年特許願第２２９２８号 ２、発明の名称 悪性ａｍ性貧血治療剤 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都北区浮間５丁目５番１号 明細書全文 特許邪 置 （０３）９８７−７１目（大代表）明 細
書 １、発明の名称 悪性腫瘍性貧血治療剤 ２、特許請求の範囲 （１） ヒトエリスロボエチンを有効成分として含有す
る悪性腫瘍性貧血治療剤。 （２） ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の悪性腫瘍
性貧血治療剤。 （３） ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポを宿主
細胞内で形質発現させて得たものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 （４） 宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 〔５） 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞で
あることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の悪性
腫瘍性貧血治療剤。 （６） 宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第３項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 ３、発明の詳細な説明 本発明はヒトエリスロポエチン（以下「ヒトＥＰＯＪと
いう）を有効成分として含有する悪性腫瘍性貧血治療剤
に関する。 本願明細書においてヒトＥＰＯとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの（以下「ヒト尿ＥＰＯＪという）、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの（以下「ヒトｒＥＰＯＪ
という）、ヒト胃癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒ）ＥＰＯ産生能を有するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン（以下ｒＥＰ
ＯＪという）という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨すいに存在する赤芽球系幹細胞に働いて
、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示
す微量生理活性物質をいう。 ヒト尿ＥＰＯに関する研究は多数報告されているが、ヒ
トＥＰＯの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。 近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており［例えば％ Ｍ ｔ ｌ ｌ ｅ ｒＡ
等；ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲー
ション（Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）３５巻１２４
８頁（１９５１３年）を参照コ、特に重度の貧血は臨床
的に患者の治療上重要な問題となっている。 貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、ＥＰＯ産生障害ζ
溶血、造血幹細胞の異常などが考えられているが、悪性
腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、網内系鉄
ブロック、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管障害や自己
免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療による骨髄
抑制などの他、慢性炎症等が原因とされている。一方担
癌患者に於ける血中ＥＰＯ値は正常値と同レベルか低値
であると報告されている［例えば、Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ
等；ジャーナル オブ クリニカルインベスティゲーシ
ョン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５３巻１１３２
頁（１９７４年）、Ｄｏｕｇｌａｓ ＳＷ等；ブラッ
ド（Ｂｌｏｏｄ）４５巻５５頁（１９７５年）、Ｆｉｒ
ａｔ Ｄ等；キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、）３１巻１３５５頁（１９７１年） Ｎ Ｗａ
ｒ ｄ ＨＰ等；ジャーナル オブ クリニカル
インベスティゲーシａン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ
、）５０巻３３２頁（１９７１年）及びＤｅＧｏｗｉｎ
ＲＬ等；ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド
クリニカル メデイシン（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ１ｉｎ、Ｍｅ
ｄ、）９４巻３０３頁（１９７９年）等を参照コ。 しかしながら、血中ＥＰＯ値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性腫瘍性貧血はエ
リスロボエチン産生障害よりむしろＥＰＯに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある［Ｚｕｃｋｅｒ Ｓ 等；ジ
ャーナル オブ クリニカル インベスティゲーシコン
（Ｊ。 ＣＩ ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）５３巻１１３２頁（１９
７４年）を参照］。 従って悪性腫瘍性貧血患者にヒ）ＥＰＯを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。 ヒト尿ＥＰＯの作用効果に関してはこれまで多数報告さ
れているがヒト尿ＥＰＯをはじめとするヒトＥＰＯが悪
性腫瘍性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は
動物に実際に投与することによって実証したものはない
。 本発明者等は高純度に精製したヒト尿ＥＰＯおよびヒト
ＥＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒ）ｒＥＰｏを用いて担癌動物に
ついて貧血治療効果を調べたところ、これらのヒトＥＰ
Ｏが顕著な貧血治療効果を示したことから悪性腫瘍性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。 本発明は新規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るもの
である。 すなわち本発明はヒトＥＰＯを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤である。 本発明に用いられるヒトＥＰＯは種々の手段によって得
ることができ、例えば、ヒト尿ＥＰＯは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿又は血漿（血清を含む）から抽出す
ることにより得ることができる［Ｔ、ＭＩＹＡＫＥ等、
ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｊ、
Ｂ、Ｃ，）、２５２巻５５５８頁（１９７７年）；Ｊ、
Ｐ、Ｌｅｗｉｎ等、ジャーナル オブ ラボラトリ−ア
ンド クリニカル メディシン（Ｊ、Ｌａｂ。 Ｃｌ ｉ、ｎ−Ｍｅ ｄ−） 、８８巻９８７頁（１９
６５年） コ 。 またヒトｒＥＰｏは例えばヒトＥＰＯのアミノ酸配列に
対応するメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を採取し
、そのｍＲＮＡを利用して組換ＤＮ八へを作成し、次い
で適当な宿主細胞（例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等）で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる。［例えば、５
ＹＬＶＩＡＬ、Ｈ，等；プロシーディンゲス オブ ザ
ナショナル アカデミ−オブ ザ ニー ニスｙ−−（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ）８１巻２７０８頁（１９８４年）を参照］。 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、マウスＣ−１２７細胞などを挙げること
ができる。この他、ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造
する方法〔特開昭５４−５５７９０１ 、ヒトＥＰＯ産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法［特開昭５７−４０４１１］ 、ヒト細胞株を細胞
融合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等
によっても製造することができる。 これらの方法によって得られたヒ）ＥＰＯは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。 上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトＥＰＯは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の打機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティー２０マドグラフイー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単
独でまたは適宜組合せて用いてもよい。 得られたヒトＥＰＯは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトＥＰＯ含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトＥＰＯを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とかできる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンＢ１２製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、デキストラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロ
ン酸鉄、オロチン酸鉄等を挙げることができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトＥＰＯの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常９ Ｘ １０’ｕ／ｍｇヒトＥ
ＰＯとして成人１人当たり０．１〜５００μｇ好ましく
は５〜１００μｇのヒトＥＰＯを含有する製剤を１週間
に１〜７回投与することができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、宵
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１つ又は２
つ以上を含有してもよい。 これらの安定化物質の添加量は、ヒトＥＰＯの１重量部
にたいして０．１１〜１００００重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。 これらの安定化物質は相応する量を適当な１度とｐＨの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は０
．１〜３．０の範囲とし、より好ましくは０．８〜１．
２である。水溶液のｐＨは５．０〜９．０に調整し、特
にｐＨ８〜８に調整するのが好ましい。 また本発明の製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤
を添加してもよい。 参考例１ ヒト のパ１ ＭＩＹＡＫＥ、Ｔ、等の方法［ジャーナル・オブ バイ
オロジカル ケミストリー （Ｊ、Ｂ。 Ｃ，）５２巻５５５８頁（１９７７年）コに従って再生
不良性貧血患者法から １）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５
０による脱塩 ２ ） Ｄ Ｅ Ａ Ｅ セルｏ −ス
によるバッチ吸着 ３）エタノール沈殿 ４）ＤＥＡＥ
アガロースカラムクロマトグラフィーを用いて部分精製
されたヒト尿ＥＰＯを得た。 ゛ フロ７ グラフ − 得られた部分精製ヒト尿ＥＰＯを２４％プロパツール（
和光純薬社製）を含む０．１％トリフルオロ酢酸（Ａｌ
ｄｒｉｃｈｆ社製）溶液に溶解せしめたのちＨＰＬＣに
よる精製を行った。ＨＰＬＣ装置は日立８３８−５０型
を用い２８０ｎｍと２２０ｎｍの紫外部吸収により検出
を行った。 ２４％ｎ−プロパツールを含んだ０．１％トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したＭＭＣ−Ｃ８カラム（６ｍｍ
Ｘ３０ｃｍ山村化学社製）に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、ｎ−プロパツールの濃度を２６％に高めて溶出させた
。ＥＰＯの活性画分を集めた後、Ｃｅｎｔ ｒ ｉ ｃ
ｏｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ社商品名）社用品名限外ろ
適法により、０．１〜０．２ｍｌに濃縮した。 。゛ ロマトグラフ − 上記濃縮試料を２６％ｎ−プロパツールを含む０．１％
ＴＦＡ溶液で予め平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（７，８ｍｍＸ６０ｃｍ東洋曹達社製）に注入し、
前記平衡液で溶出させた。 分子量２５０００〜３００００の位置にＥＰＯ活性を有
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。比活性は約９Ｘ１０”ｕ／ｍｇであった。
−各ステップに於ける比活性
を表Ｉに示す。 表Ｉ ＊アッセイ法 １ｓｃｏｖｅ Ｎ、Ｎ等［ジャーナル
オブ セルラー フィジオ ロジ−（Ｊ、Ｃｅ ｌ １．ｐｈｙＳ ｉｏｌ、）８３巻３０９頁（１９ ７４年）コの方法に従った。 参考例 ２ ヒト の″浩１２月
２７日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換の
ための補助ＤＮＡを含むベクター」（特願昭５９−２８
１８６２）に開示された方法に従って、ヒトＥＰＯのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドを
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で形質
発現させることによってヒトｒヒトＥＰＯを得た。要約
すると以下の如くである。 ヒト胎児肝細胞から得られたヒトＥＰＯのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダＨＥＯＰＥＬ１３
クローンからのＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化させ、ヒトＥ
ＰＯのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなＲ
１フラグメントを取り出しプラスミドＲＫＩ−４のＥｃ
ｏＲ１部位へ挿入した。このヒ）ＥＰＯ遺伝子を組込ん
だプラスミドＲＫＩ−４をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞に
組入れて形質転換させた。ＣＨＯ細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも１つ
のＤＨＦＲ遺伝子を存する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆ（ことによってヒ）
ｒＥＰｏを産生させた。 最終的な培養上清中のヒ）ｒＥＰｏの活性は２０ｕ／ｍ
ｌであった。 ＣＨＯ細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿
ＥＰＯで用いた精製方法に準じてヒトｒＥＰＯを精製し
た。得られたヒトｒＥＰＯはＫｒｙｓｔａｌ等の方法［
ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル
メディスン（Ｊ、 Ｌａｂ、ＣＩ ｉｎ、Ｍｅｄ、）９
７巻１４４頁（１９８１年）コにより６６００ｕ／ｍｌ
の活性を有していた。またこのヒトｒＥＰｏはＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドで
あることが確認された。 得られたヒトｒＥＰｏに０．１％ＢＳＡを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。 ６週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫瘍様の
小片（１〜２ｍｍ角）を移植後、１２〜１６日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数（ＲＢＣ） 、ヘモ
グロビン量（ＨＧＢ）および白血球数（ＷＢＣ）をコー
ルタ−カウンター（東亜医用電子社製）にて測定しな。 （表■）腫瘍株 マウス 表■ 表■に示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。 、 ヒ ト に ゛ −１
と同様な方法で６迎合の雄性ＢＤＦＩ系マウス（日本チ
ャールスリバー社製）に腫瘍を移植し８日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて３群
（各群７匹）に分けた。 移植後９日目より各々の群にヒト尿ＥＰＯ（１０ｕ／マ
ウス／日）、ＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰ。 （１０ｕ／？ウス／日）および溶媒（０，１％ＢＳＡ液
を含むＲＰＭＩ １６４０培地の透析液０゜５ｍｌ／
マウス７日）を隔日にて、７回皮下投与した。 移植後１６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量にして１ｍｇ／マ
ウス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った
。 対照群をして同系の非担癌マウス（７匹）を用いた。 赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図１、図２に示す。 ° 搬移 １と同様な方法で６迎合の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス
（日本チャールスリバー社製）に腫瘍を移植し２８日目
に腫瘍の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを
揃えて３群（各群７匹）に分けた。移植後２９日目より
各々の群にヒト尿ＥＰＯ（１０ｕ／？ウス）、ＣＨＯ細
胞由来ヒトｒＥＰＯ（１０ｕ／？ウス／日）および溶媒
（０゜１％ＢＳＡ液を含とＲＰＭＩ １８４０培地の
透析液、０．５ｍｌ／マウス７日）を隔日にて７回皮下
投与した。移植後３６日目に塩化第２鉄（Ｆｅ量、１
ｍ ｇ ／マウス）を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄
補給を行った。 対照群として同系の非担癌マウスを用いた。 赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン量（ＨＧＢ）の
変化について、それぞれ図３、図４に示す。 図１〜４にしめされる如く溶媒投与担癌マウス群では、
担癌後の日数の経過を共に貧血の度合いは強まったのに
対し、ヒトＥＰｏ投与担癌マウス群では明らかに貧血が
改善された。 またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。 実施例１ 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。 実施・例２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン４０を１００重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。 実施例３ １００ｍｌ中にマンニトール５ｇ１ヒト尿ＥＰ０１ ｍ
ｇ Ｎ ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、アセチルト
リプトファンナトリウム２．１５４ｍｇ。 カプリル酸ナトリウム１．３３ｍｇを含む水溶液を無菌
的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。 実施例４ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液１００ｍ１中にヒ
ト尿ＥＰ０１ｍｇ１ポリエチレングリコロール４０００
５００ｍｇ１工チレンオキサイドプロビレオンオキサ
イド共重合体３０ ｍ ｇ １塩化ナトリウム８００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、１ｍｌずつアンプル
に分注溶閉する。 実施例５ ｐＨ７，０の０．０５Ｍリン酸緩衝液５０ｍ１中にＣＨ
Ｏ細胞由来ヒトｒＥＰＯｏ、５ｍｇ１グリシン１ｇ１ソ
ルビトール１ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、０．５
ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に
０．１％メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、１
ｍｌずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。 実施例６ １００ｍ１中にヒト尿ＥＰ０１ｍｇ１ヒト血清アルブミ
ン５００ｍｇ１マンニトール５００ｍｇを含む水溶液を
無菌的に調整し、１ｍｌずつバイアルに分注し凍結乾燥
し密封する。 別に３００ｍ１中にグリコン酸第二鉄３ｇ、Ｎａｃ１２
．７ｇを含む水溶液を無菌的に調整し、３ｍｌずつアン
プルに分注し、溶封する。 上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。 ４、図面の簡単な説明 図１はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血赤血球数（Ｒ
ＢＣ）に及ぼすヒ）ＥＰＯ投与の影響を示す。 図２はＬｅｗｉｓ肺癌担癌マウスの末梢血ヘモグロビン
量（ＨＧＢ）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図３はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血赤血球数（ＲＢＣ
）に及ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 図４はＣ３ＭＣ２担癌マウスの末梢血ヘモグロビン量（
ＨＧＢ）に友ぼすヒトＥＰＯ投与の影響を示す。 すべての図中に於いてＯ−Ｏは非担癌マウス群Δ−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームはヒト尿ＥＰＯ投与担癌マ
ウス群、ローロはＣＨＯ細胞由来ヒトｒＥＰＯ投与担癌
マウス群を示す。
Claims (6)
- （１）ヒトエリスロポエチンを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤。 - （２）ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の悪性腫瘍性
貧血治療剤。 - （３）ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエチンを
コードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させて得たも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
悪性腫瘍性貧血治療剤。 - （４）宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細胞
株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲第
３項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 - （５）宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の悪性腫
瘍性貧血治療剤。 - （６）宿主細胞がＣＯＳ細胞であることを特徴とする特
許請求の範囲第３項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| JP60-21163 | 1985-02-06 |
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPH0629194B2 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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