JPH0672155B2 - α−ｈＡＮＰ抗血清作製用ポリペプチド - Google Patents

α−ｈＡＮＰ抗血清作製用ポリペプチド

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JPH0672155B2
JPH0672155B2 JP59176953A JP17695384A JPH0672155B2 JP H0672155 B2 JPH0672155 B2 JP H0672155B2 JP 59176953 A JP59176953 A JP 59176953A JP 17695384 A JP17695384 A JP 17695384A JP H0672155 B2 JPH0672155 B2 JP H0672155B2
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Description

【発明の詳細な説明】 イ．発明の目的 産業上の利用分野 本発明は抗原抗体反応にもとづく臨床検査薬の開発ある
いは病態生理学の研究に有用なポリペプチドに関する。
更に詳しくは、本態性高血圧の病因的診断あるいは病理
学的究明に有用なポリペプチドに関する。
従来技術 最近、寒川、松尾らがヒト心房より強力なナトリウム利
尿作用を有するポリペプチド〔α−hrman Atrial Natri
uretic Polypeptide＝α−hANP〕を単離し、その構造を
28個のアミノ酸よりなる下記式と同定した〔Biochem.Bi
ophys.Res.Comm.118,131（1984）〕。
α−hANPの利尿作用は、ラツトを用いた生物試験で現在
降圧利尿剤として繁用されているフロセミド（furosemi
de）の約1,500倍にも達するといわれている。
α−hANP〔以下α−hANP−（１−28）という場合もあ
る〕を短縮したペプチドフラグメント、例えばα−hANP
−（７−28）〔α−hANPのＮ端より数えて７番目から28
番目のアミノ酸で構成されるドコサ（docosa−）ペプチ
ド、以下同様〕、α−hANP−（13−28）、α−hANP−
（18−28）などが市販されているが、その生理作用、抗
原としての機能などについては報告されていない。な
お、α−hANP−（18−28）はそのＮ端のグルタミンが環
化したピロ型であつて、閉環していないＮ端グルタミン
のα−hANP−（18−28）は知られていない。
発明が解決しようとする問題点 従来高血圧症は原因疾患の明らかな高血圧と原因疾患の
明らかでない高血圧に大別されてきた。前者は二次性高
血圧症として分類し、主に腎障害によるもの、内分泌性
疾患、妊娠中毒、大動脈縮窄症、中枢神経障害などに原
因があるものを包括している。他方、後者の病因が明ら
かでない高血圧を本態性高血圧症として分類し、全高血
圧症の80〜90％がこの分類に入れられてきた。
二次性高血圧症の場合は、その原因疾患を治療すること
で高血圧症状を改善することができるが、原因不明の本
態性高血圧症の場合には、対症療法として、例えば降圧
利尿剤、血管拡張剤などを投与することで問題の解決が
なされてきた。しかるに、最近上述のα−hANPが心疾患
あるいは本態性高血圧の病因に関係ある物質の一つであ
ることが示唆され、α−hANPをめぐる本態性高血圧症の
研究が俄かにクローズアツプされてきた。
本発明者らは、α−hANPの容量調節系における病態生理
的意義を探ると共に、心疾患あるいは本態性高血圧症の
病態の把握に有用なα−hANPの特異的測定系を確立する
ために研究を重ねてきた。
ロ．発明の構成 問題点を解決するための手段 本発明は上述のα−hANP測定系確立のために必要な抗血
清作製用のポリペプチドを提供する。より詳しくは、本
発明は下記式Ｉで表わされるポリペプチドおよびその塩
に関する。
Ｈ−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys−Asn−Ser −Phe−Arg−Tyr−OH （Ｉ） 式Ｉにおける構成アミノ酸はすべてＬ−型であり、その
略号は下記のごとくIUPAC（In−ternational Union of
Pure and Applied Chemistry）−IUB（International U
nion of Biochemistry）の命名規約に従つて記載した。
Ala:アラニン Arg:アルギニン Asn:アスパラギン Cys:システイン Gln:グルタミン Gly:グリシン Ile:イソロイシン Leu:ロイシン Phe:フエニルアラニン Sre:セリン Tyr:チロシン 本発明式Ｉで表わされるポリペプチドおよびその塩は、
通常のペプチド合成法に従つて、アミノ酸を１個ずつ縮
合してペプチド鎖を延伸していく合成法、あるいは２個
ないし数個のアミノ酸から成るフラグメントをカツプリ
ングさせる方法あるいはそれらの組合せにより製造する
ことができる。
２個のアミノ酸の縮合、アミノ酸とペプチドの縮合ある
いはペプチドとペプチドの縮合は、通常の縮合法、例え
ばアジド法、混合酸無水物法、DCC（ジシクロヘキシル
カルボジイミド）法、活性エステル法（ｐ−ニトロフエ
ニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ル法、シアノメチルエステル法など）、ウツドワード
（Woodward）試薬Ｋ法、カルボニルジイミダゾール法、
酸化還元法、DCC−HOBt法などに従つて行うことができ
る。これらの縮合反応は溶液法あるいは固相合成法のい
ずれの方法により行つてもよい。固相法によりペプチド
鎖を延伸する場合には、Ｃ末端アミノ酸を不溶性担体に
結合させて行う。不溶性担体としては、Ｃ末端アミノ酸
のカルボキシ基と反応して着脱可能な結合を生じるもの
であればいずれも使用可能であつて、例えばクロロメチ
ル樹脂、ブロモメチル樹脂などのハロメチル樹脂、ヒド
ロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ベンズヒドリル
アミン樹脂、ｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド
化樹脂などが使用できる。
ペプチド合成の常法として、アミノ酸のα位およびω位
の側鎖アミノ基およびカルボキシ基は必要に応じ保護／
脱保護の必要がある。適用可能なアミノ基の保護基とし
ては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚと略称）、
ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｚ（２−C
l））、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（Ｚ（N
O2））、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｚ
（OMe））、ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）、ｔ−アミ
ルオキシカルボニル（Aoc）、イソボルニルオキシカル
ボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−（４−ビ
フエニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Bpoc）、
９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、メチル
スルフオニルエトキシカルボニル（Msc）、トリフルオ
ロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフエニル
スルフエニル（NPS）、ジフエニルホスフイノチオイル
（Ppt）、ジメチルホスフイノチオイル（Mpt）などが例
示できる。
カルボキシ基の保護基としては、例えばベンジルエステ
ル（OBzl）、４−ニトロベンジルエステル（OBzl（N
O2））、ｔ−ブチルエステル（OBuｔ）、４−ピリジル
メチルエステル（OPic）などが例示できる。
本発明ペプチドの合成途上、側鎖にアミノ基およびカル
ボキシル基以外の官能基を有する特定アミノ酸、例えば
アルギニン、システイン、セリンなどは必要に応じて適
当な保護基で保護しておくのが望ましい。例えばアルギ
ニンのグアニジノ基はニトロ、ｐ−トルエンスルホニ
ル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカ
ルボニル、ｐ−メトキシブンゼンスルホニル、４−メト
キシ−2,6−ジメチル−ベンゼンスルホニル（Mds）、1,
3,5−トリメチルフエニルスルホニル（Mts）など、シス
テインのチオール基はベンジル、ｐ−メトキシベンジ
ル、トリフエニルメチル、アセチルアミノメチル、エチ
ルカルバモイル、４−メチルベンジル、2,4,6−トリメ
チルベンジル（Tmb）などで、またセリンの水酸基はベ
ンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル
などで保護するとよい。
以下に本発明ペプチドのアミノ酸12個からなるα−hANP
（17−28）の製造をより具体的に説明する。反応工程式
は以下のように示すことができる。
〔式中X1はＮ末端アミノ酸のアミノ保護基、X2はチオー
ルの保護基、X3はグアニジノ基の保護基、AEは活性エス
テル残基、ＹはＣ末端アミノ酸のカルボキシ保護基をそ
れぞれ表わす。〕 上記工程において、X1はアミノ保護基の好ましいものと
しては、Ｚ−,Z（Cl）,Z（OMe）,Bocなどがある。また
Ｙのカルボキシ保護基としては−OBzl,OBzl（NO2）など
が好ましい。X2のチオール保護基としてはTmbが、X3の
グアニジノ保護基としてはMtsが好ましい。
上記工程において（１）と（２）との反応および（11）
の導入は混合酸無水物法により行う。本発明においては
ペプチド合成に利用される混合酸無水物法が常法どおり
適用可能であるが、例えばアミノとグアニジノを保護し
たアルギニン（２）をクロル炭酸エチルまたはクロル炭
酸イソブチルと反応せしめ対応する無水物とする。無水
物の形成反応は一般に冷却下、好ましくは−15〜−５℃
の温度で約10分程度行う。無水物と（１）との反応はペ
プチド合成反応で常用の溶媒、例えばジメチルホルムア
ミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ヘキサ
メチルリン酸トリアミド（HMPA）、クロロホルム、ジク
ロルメタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エ
チルなど中、冷却下（例えば氷冷）に１〜24時間行う。
（11）から（12）への縮合反応も同様に行うことができ
る。なおヒドラジド（12）は対応するエステルに抱水ヒ
ドラジンを反応させることにより容易に調製しうる。ま
たこのヒドラジドの形成反応は（３），（６），（９）
の調製に際しても同様に利用できる。
活性エステル法にもとづく縮合反応、例えば、（１），
（２），（３）の縮合物と（４）との縮合反応は、活性
エステルとしてｐ−ニトロフエニルエステル、2,4−ジ
ニトロフエニルエステル、2,3,4,5,6−ペンタクロロフ
エニルエステル、2,4,5−トリクロロフエニルエステ
ル、2,3,4,5,6−ペンタフルオロフエニルエステル、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステルあるいはその同族
体などを利用することにより達成できる。反応は一般に
冷却ないし加温の条件、好ましくは−20℃〜40℃の温度
で、前記ペプチド合成に使用可能な溶媒中で行うことが
できる。反応時間は他の条件により異なるが、一般に１
〜24時間である。これらの反応条件は、（５）の縮合反
応および（10）の縮合反応においても同様である。
（３），（６），（９）および（12）の縮合反応はアジ
ド法により行う。各ヒドラジドのアジド化は、酸性溶液
中で亜硝酸ナトリウムを反応させるクルチウス（Curtiu
s）法〔Organic Reactions,第３巻,p.337〕あるいは無
水溶媒中亜硝酸アルキル（例えば亜硝酸イソアミル）を
用いるルーデインガー（Rudinger）法〔Collect.Czech.
Chem.Commun.26,2333（1961）〕に従つて実施すること
ができる。得られたアジドと縮合すべき対応ペプチドと
の反応は一般に低温（−10℃ないし＋10℃）で、中和量
の塩基の存在下に行う。塩基としてはトリエチルアミ
ン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、
ジメチルアニリン、ピリジン、ピコリン、Ｎ−メチルモ
ルホリンなどの有機塩基が好ましい。反応溶媒は上記の
ペプチド合成に使用可能な溶媒から適宜選択して使用す
ればよい。
上記の各反応に先立つて、X1で示されるアミノ保護基は
適宜除去しておく必要がある。例えばベンジルオキシカ
ルボニル系保護基〔Z,Z（2Cl）,Z（NO2）,Z（OMe）〕は
フツ化水素、トリフルオロ酢酸などで処理するかパラジ
ウムによる接触還元で脱離することができる。
また、最終目的物に至るまで保持された他の官能基の保
護基も最終工程で一挙にあるいは段階的に脱離すること
ができる。例えば後記の実施例に示すごとく、AlaのＺ
（OMe）,CysのTmb,ArgのMts,TyrのBzlはジメチルスルフ
イドの存在下フツ化水素を反応せしめることにより脱離
できる。
上記各工程における反応生成物および最終目的物は、ペ
プチドの常套的分離手段、例えば抽出、再結晶、クロマ
トグラフイー（ゲル過、イオン交換、分配、吸着、逆
相）、電気泳動、交流分配などにより単離精製すること
ができる。
なお、式Ｉで示されるペプチドの塩としては、塩酸塩、
臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、
ギ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩な
どの無機もしくは有機の酸付加塩、あるいはナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニ
ウム塩、トリエチルアミン塩などのアンモニウム塩もし
くはアミノ塩などが例示される。
以下に本発明目的化合物の製造法につき実施例により具
体的に説明するが、これらは本発明を限定するものでは
ない。
なお以下の実施例で使用する保護基の略号はそれぞれ下
記の意味を有する。
Ｚ（OMe）:p−メトキシベンジルオキシカルボニル ONp:p−ニトロフエノキシ Bzl:ベンジル Z:ベンジルオキシカルボニル Mts:1,3,5−トリメチルフエニルスルホニル（メジチレ
ンスルホニル） Tmb:2,4,6−トリメチルベンジル 実施例１ α−hANP（17−28）の製造 （１） Ｚ（OMe）−Arg（Mts）−Tys−OBzl Ｚ（OMe）−Arg（Mts）−OH〔シクロヘキシルアミノ塩1
0.0g（16.1mmol）より調製〕とクロル炭酸イソブチルと
から得た混合酸無水物をジメチルホルムアミド（以下DM
Fと略称）20mlにとかし、これを、Ｈ−Tyr−OBzl〔対応
するトルエンスルホン酸塩8.25g（19.3mmol）より調
製〕をDMF50mlにとかした氷冷溶液に加え、氷浴上３時
間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、油状残渣を酢酸エチ
ルにとかして0.5N−塩酸および食塩水で洗浄後、乾燥
し、再び溶媒を留去する。残渣を摩砕して粉末化し、シ
リカゲルのカラム（4.5×25cm）でクロマトして、クロ
ロホルム／メタノール（10:0.5）の溶媒系で溶出する部
分を酢酸エチル／エーテルより再結晶すると、標題化合
物11.5g（収率92％）が得られる。
mp.98−102℃。▲〔α〕20 D▼−3.2゜（ｃ＝0.9,DM
F）。薄層クロマトグラフイー（TLC）〔Kieselgel60F25
4、メルク社、以下同様〕:Rf2＝0.73〔溶媒系：クロム
ホルム／メタノール／酢酸（9:1:0.5）、以下Rf2につき
同様〕;Rf3＝0.28〔溶媒系：クロロホルム／メタノール
（10:0.5）、以下Rf3につき同様〕。
元素分析:C40H47N5O9S1として 計算値（％）:C62.08,H6.12,N9.05。
実験値（％）:C62.19,H6.16,N8.66。
（２） Ｚ（OMe）−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl Ｚ（OMe）−Arg（Mts）−Tyr−OBzl5.0g（6.46mmol）に
トリフルオロ酢酸（TFA、以下同様）／アニソール（10m
l/2.8ml）を加え氷浴上60分間処理し、次いでTFAを減圧
留去する。残渣をｎ−ヘキサンで洗浄し、水酸化カリウ
ム（KOH、以下同様）ペレツト上、減圧下に３時間乾燥
した後、トリエチルアミノ0.9ml（6.46mmol）含有のDMF
に溶解する。この溶液に、Ｚ（OMe）−Ser−Phe−NHNH2
3.34g（7.75mM）より調製したアジドのDMF溶液10ml（ト
リエチルアミン2.59ml（18.6mM）で中和）を氷冷下に加
え、５℃で14時間撹拌した後濃縮する。残渣を上記同様
の抽出操作により精製し、次いでシリカゲルのカラム
（3.5×20cm）でクロマトして、クロロホルム／メタノ
ール（20:0.5）の溶媒系で溶出する部分を酢酸エチル／
エーテルから再結晶すると、標題化合物4.85g（収率76
％）が得られる。mp.98−100℃。▲〔α〕20 D▼−5.1゜
（ｃ＝0.6,DMF）。TLC:Rf1＝0.67〔溶媒系：クロロホル
ム／メタノール／水（8:3:1）、以下Rf1につき同様〕。
元素分析:G52H61N7O12Sとして 計算値（％）:C61.95,H6.10,N9.37。
実験値（％）:C62.03,H6.08,N9.67。
（３） Ｚ（OMe）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr
−OBzl 上記（２）で得た保護テトラペプチドエステル4.50g
（4.46mmol）を上記同様にTFA/アニソール（10ml/2.4m
l）で処理し、これに無水エーテルを加える。生成する
沈殿をエーテル洗浄し、KOHペレツト上減圧下３時間乾
燥した後DMF20mlに溶解する。これにトリエチルアミン
0.62ml（4.46mmol）、Ｚ（OMe）−Asn−ONp2.05g（4.91
mmol）およびＮ−メチルモルホリン（NMM、以下同様）
0.49ml（4.46mmol）を加えて14時間撹拌した後、酢酸で
中和し、溶媒を留去する。残渣をエーテル／水中で摩砕
して粉末とし、これをDMF中エタノールを加えることに
より沈殿せしめ、標題化合物3.95g（収率79％）を得
る。mp.171−173℃。▲〔α〕20 D▼−15.0゜（ｃ＝0.6,
DMF）。TLC:Rf1＝0.63。
元素分析:C56H67N9O14Sとして 計算値（％）:C59.93,H6.02,N11.23。
実験値（％）:C59.79,H6.08,N11.14。
（４） Ｚ（OMe）−Cys（Tmb）−OH Ｈ−Cys（Tmb）−OH5.0g（19.7mM）をトリエチルアミン
6.0ml（43.3mmol）を含有する水25mlにとかし、これに
氷冷下、Ｚ（OMe）−N34.91g（23.7mmol）のテトラヒド
ロフラン（THF、以下同様）溶液25mlを加える。５℃に
て一夜撹拌した後、エーテル洗浄し、その水層を５％ク
エン酸で中和する。生成する沈殿を乾燥して得た粉末を
DMF/エーテルから再結晶し、標題化合物4.59g（収率56
％）を得た。mp.153−158℃。▲〔α〕20 D▼−37.5゜
（ｃ＝0.6,DMF）。TLC:Rf1＝0.56。
元素分析:C22H27NO5Sとして 計算値（％）:C63.29,H6.52,N3.36。
実験値（％）:C63.49,H6.54,N3.41。
（５） Ｚ（OMe）−Cys（Tmb）−ONp Ｚ（OMe）−Cys（Tmb）−OH5.0g（12.0mM）およびｐ−
ニトロフエノール1.83g（13.2mmol）をTHF50mlにとか
し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、以下同
様）2.72g（13.2mmol）を加え、室温で一夜撹拌した後
過する。液を濃縮し、生成物をDMF/2−プロパノー
ルから再結晶して精製すれば、標題化合物3.56g（収率5
5％）が得られる。mp.121℃。▲〔α〕20 D▼−25.5゜
（ｃ＝1.0,DMF）。TLC:Rf5＝0.71〔溶媒系：クロロホル
ム、以下Rf5につき同様〕。
元素分析:C28H30N2O7Sとして 計算値（％）:C62.44,H5.61,N5.20。
実験値（％）:C62.40,H5.61,N5.20。
（６）Ｚ（OMe）−Cys（Tmb）−Asn−Ser−Phe−Arg（M
ts）−Tyr−OBzl Ｚ（OMe）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl2.0
g（1.78mmol）を常法によりTFA/アニソール（4ml/1ml）
で処理し、次いで無水エーテルを加えて粉末状物質を生
成させる。これをKOHペレツト上減圧下に３時間乾燥し
た後、トリエチルアミン0.23ml（1.78mmol）、Ｚ（OM
e）−Cys（Tmb）−ONp1.06g（1.96mmol）、NMM0.20ml
（1.78mM）と共にDMF20mlに溶解する。この溶液を14時
間撹拌した後、酢酸で中和し、溶媒を留去する。残渣を
水中で摩砕し、得られる粉末をDMF−エタノールから沈
殿せしめると、標題化合物2.01g（収率83％）を得る。m
p.200−203℃。▲〔α〕20 D▼−200゜（ｃ＝0.8,DM
F）。TLC:Rf1＝0.51。
元素分析:C69H84N10O15S2として 計算値（％）:C61.04,H6.24,N10.32。
実験値（％）:C60.85,H6.40,N10.03。
（７） Ｚ（OMe）−Leu−Gly−NHNH2 Ｚ（OMe）−Leu−Gly−OMe7.20g（19.7mmol）をメタノ
ール30mlにとかし、これに80％抱水ヒドラジン5.90ml
（98.5mmol）を加え、室温で24時間反応せしめる。溶媒
を留去し、残渣に水−エーテルを加えて結晶化させ、メ
タノール／エーテルから再結晶すると、標題化合物5.97
g（収率83％）が得られる。mp.108−112℃。▲〔α〕20
D▼−6.0゜（ｃ＝0.7,DMF）。
元素分析:C17H26N4O5として 計算値（％）:C55.72,H7.15,N15.29。
実験値（％）:C55.74,H7.15,N15.20。
（８） Ｚ（OMe）−Leu−Gly−Cys（Tmb）−Asn−Ser
−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl Ｚ（OMe）−Cys（Tmb）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−
Tyr−OBzl2.01g（1.48mmol）にTFA/アニソール（4.0ml/
1.0ml）を加え、常法に従つて０℃１時間反応せしめ
る。TFAを留去し、残渣をエーテル中粉末化取して乾
燥、Ｈ−Cys（Tmb）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr
−OBzl・TFAを得る。この粉末をトリエチルアミン0.21m
l含有DMFにとかし、この溶液に、Ｚ（OMe）−Leu−Gly
−NHNH20.65g（1.78mmol）をDMF中亜硝酸イソアミル0.2
8ml（2.14mmmol）/3.2M−HCl−DMF（0.28ml/1.34ml）で
処理して得たアジドの溶液（トリエチルアミン0.59mlで
中和）を氷冷下に加え、５℃で14時間撹拌する。反応液
を濃縮し、水を加えて生じた生成物をDMF/エタノールか
ら再結晶すると、標題化合物2.06g（収率91％）が得ら
れる。mp.210−212℃。▲〔α〕20 D▼−11.4゜（ｃ＝0.
7,DMF）。TLC:Rf1＝0.56。
元素分析:C77H98N12O17S2として 計算値（％）:C60.53,H6.47,H11.00。
実験値（％）:C60.29,H6.69,N10.85。
（９） Ｚ（OMe）−Ser−Gly−OBzl Ｚ（OMe）−Ser−NHNH27.0g（24.7mmol）から常法に従
いDMF10ml中、亜硝酸イソアミル3.94ml/3.2N−HCl−DMF
18.6mlとの反応により調製したアジドの溶液（トリエチ
ルアミン8.26mlで中和）に、Ｈ−Gly−OBzl・トルエン
スルホン酸塩9.51g（29.6mmol）のDMF溶液30ml（トリエ
チルアミン4.11mlで中和）を氷冷下に加え、５℃で14時
間反応する。反応液を濃縮し、油状残渣を酢酸エチルに
溶解し、0.5N塩酸、５％炭酸水素ナトリウムおよび飽和
食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒留去す
る。残渣にエーテルを加えて結晶化し、THF/エーテルよ
り再結晶すれば、標題化合物6.89g（収率67％）を得
る。mp.95−97℃。
▲〔α〕20 D▼＋3.0゜（ｃ＝0.7,DMF）。TLC: Rf1＝0.89,Rf3＝0.33。
元素分析:C21H24N2O7として 計算値（％）:C60.57,H5.81,N6.73。
実験値（％）:C60.67,H5.78,N6.84。
（10） Ｚ（OMe）−Gln−Ser−Gly−OBzl Ｚ（OMe）−Ser−Gly−OBzl5.0g（12.0mmol）を常法に
よりTFA/アニソール（10ml/2.6ml）で処理して脱保護す
る。生成物をDMF20mlに溶解し、トリエチルアミン3.34m
l（24.0mmol）で中和後、Ｚ（OMe）−Gln−ONp5.69g（1
3.2mmol）を加えて14時間撹拌する。この溶液を濃縮
し、生じた固型残渣を10％クエン酸、水で洗浄し、DMF/
メタノールより再結晶すれば、標題化合物5.04g（収率7
7％）が得られる。mp.198−200℃。▲〔α〕20 D▼＋3.9
゜（ｃ＝０）5,DMF）。TLC:Rf1＝0.12。
元素分析:C26H32N4O9として 計算値（％）:C57.34,H5.92,N10.29。
実験値（％）:C57.31,H5.98,N10.43。
（11） Ｚ（OMe）−Ala−Gln−Ser−Gly−OBzl 上記（10）で得たトリペプチド3.0g（5.51mmol）を常法
に従つてTFA/アニソール（6.0ml/1.8ml）で処理脱保護
し、生成物をトリエチルアミン0.77ml（5.51mmol）含有
DMF30mlにとかし、これに氷冷下、Ｚ（OMe）−Ala−OH
1.67g（6.61mmol）およびクロル炭酸イソブチル0.945ml
（7.27mmol）より調製した混合酸無水物の溶液（DMF20m
l）を加え、氷浴上３時間撹拌する。溶媒を留去し、残
渣に水を加えて析出した固型物を取し、DMF/エタノー
ルから再結晶すれば、標題化合物2.72g（収率80％）が
得られる。mp.105−107℃。▲〔α〕20 D▼−3.6゜（ｃ
＝0.8,DMF）。TLC:Rf1＝0.62。
元素分析:C29H37N5O10として 計算値（％）:C56.57,H6.06,N11.38。
実験値（％）:C56.71,H6.10,N11.58。
（12） Ｚ（OMe）−Ala−Gln−Ser−Gly−NHNH2 上記工程（11）で調製した保護テトラペプチドエステル
2.72g（4.42mmol）をDMF30mlにとかし、これに80％ヒド
ラジン−水和物1.3ml（５当量）を加え、室温で24時間
反応せしめる。溶媒を留去し、残渣粉末をエタノールで
洗浄した後、ジメチルスルホキシド（DMSO、以下同様）
−DMF（1:1）／エタノールから再結晶して標題化合物2.
29g（収率96％）を得る。mp.216−218℃。▲〔α〕20 D
▼−19.1゜（ｃ＝0.7,DMSO）。TLC:Rf1＝0.21。6N塩酸
水解物のアミノ酸構成比:Ser0.90,Glu1.02,Gly1.00,Ala
1.02（Gly回収率89％）。
元素分析:C22H33N7O9として 計算値（％）:C48.97,H6.17,N18.17。
実験値（％）:C48.67,H6.38,N18.17。
（13） Ｚ（OMe）−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−C
ys（Tmb）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl
〔Ｚ（OMe）−（hANP17−28）−OBzl〕 Ｚ（OMe）−Leu−Gly−Cys（Tmb）−Asn−Ser−Phe−Af
g（Mts）−Tys−OBzl2.06g（1.35mmol）をTFA/アニソー
ル（4ml/1ml）と０℃60分間反応せしめ、室温でTFAを留
去後、無水エーテルを加えるとＨ−Leu−Gly−Cys（Tm
b）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl・TFAが粉
末沈殿として得られる。これを取してKOHペレツト上
減圧下に３時間乾燥し、次いでトリエチルアミン0.19ml
（1.35mmol）含有DMF10mlに溶解する。
他方、Ｚ（OMe）−Ala−Gln−Ser−Gly−NHNH21.09g
（2.03mmol）をDMF−DMSO（1:1）10mlにとかし、冷却下
に4.0N−HCl/DMF1.22ml（4.87mmol）および亜硝酸イソ
アミル0.32ml（2.44mmol）を順次加えて反応させ、次い
でトリエチルアミン0.68ml（4.87mmol）を加えて中和
し、対応するアジドを生成せしめる。このアジド溶液を
上記のオクタペプチドのDMF溶液に水冷下添加し、５℃
で一夜撹拌する。ニンヒドリン反応陰性を確認した後、
反応液を水50mlで稀釈し、生成する粉末沈殿を取、乾
燥後DMF/90％メタノールより再結晶すれば、標題化合物
2.37g（収率94％）が得られる。mp.242−244℃。▲
〔α〕20 D▼−7.1゜（ｃ＝0.6,DMSO）。TLC:Rf4＝0.85
〔溶媒系:n−ブタノール／ピリジン／酢酸／水（4:1:1:
2）。6N塩酸水解物のアミノ酸構成比:Asp1.03,Ser1.90,
Glu1.21,Gly2.17,Ala1.17,Cys0.66,Leu0.98,Tyr0.97,Ph
e1.00,Arg1.03（Phe回収率97％）。
元素分析:C90H119N17O23S2として 計算値（％）:C57.77,H6.41,N12.73。
実験値（％）:C57.56,H6.48,N12.51。
（14） Ｈ−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys（S
H）−Asn−Ser−Phe−Arg−Tyr−OH 〔α−hANP（17−28）〕 上記（13）工程で得たＺ（OMe）−〔α−hANP（17−2
8）〕−OBzl100mg（53.4μmol）にｍ−クレゾール280μ
（2.67μmol）、硫化ジメチル196μ（2.67μmol）
およびフツ化水素2mlを加え、０℃で１時間処理した
後、０℃でフツ化水素を留去する。残渣にエーテルを加
え、生じる粉末状物質を遠沈分離し、ジチオスレイト−
ル82mg（10当量）を含む水2mlにとかし、３％アンモニ
ア水でpH8に調整した後、アルゴン気流下30分間撹拌す
る。この反応液をセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−25
（フアルマシア社）（1.8×140cm,0.2N酢酸で溶出、各
フラクシヨン7ml）に通して精製し、凍結乾燥すれば標
題化合物23mg（33％収率）を得る。▲〔α〕30 D▼−10.
0゜（ｃ＝0.1,0.2N酢酸）。TLC:Rf4＝0.37。6N塩酸水解
物のアミノ酸構成比:Asp0.98,Ser1.85,Glu1.03,Gly2.0
2,Ala1.09,CySH1.36,Leu0.99,Tyr0.78,Phe1.00,Arg0.97
（Phe回収率92％）。
参考例１ α−hANP（24−28）の製造 上記実施例１の（３）で得られる保護ペンタペプチド、
Ｚ（OMe）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl93m
g（0.0829mmol）にｍ−クレゾール87μ（0.829mmo
l）、ジメチルスルフイド59μ（0.829mmol）およびフ
ツ化水素2mlを加え、０℃で１時間反応せしめた後、０
℃でフツ化水素を留去する。以下実施例１の（14）と同
様に後処理し、α−hANP（24−28）〔Ｈ−Asn−Ser−Ph
e−Arg−Tyr−OH］34mgを得る。
参考例２ Ｈ−Ile−Gly−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys（S
H）−Asn−Ser−Phe−Arg−Tyr−OH［α−hANP−（15−
28］の製造： Ｚ（OMe）−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys（Tm
b）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mts）−Tyr−OBzl500mg（0.
267mmol）をアニソール0.23ml（2.14mmol）およびトリ
フルオロ酢酸2mlと０℃で１時間反応せしめる。室温で
トリフルオロ酢酸を留去し、残渣にエーテルを加えて粉
末化、これを取して乾燥すればＺ（OMe）の脱離した
脱保護体がトリフルオロ酢酸塩（TFA塩）、即ちＨ−Ala
−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys（Tmb）−Asn−Ser−P
he−Arg（Mts）−Tyr−OBzl・TFAとして得られる。
別途に、Ｚ（OMe）−Ile−Gly−NHNH2127mgからら、DMF
5ml、4.0N−HCl/DMF208μ、亜硝酸イソアミル55μ
および116μのトリエチルアミンとの反応により対応
するアジド体を調製する。このアジド体を上記の脱保護
体をDMSO−DMF（1:1）混液10mlにとかした溶液に氷冷下
に加え、撹拌下に一夜放置する。反応混合物に水を加え
て生成する固型物を取乾燥し、更にDMF/メタノールよ
り再沈澱精製すれば、目的のα−hANP−（15−28）保護
体、即ち、Ｚ（OMe）−Ile−Gly−Ala−Gln−Ser−Gly
−Leu−Gly−Cys−（Tmb）−Asn−Ser−Phe−Arg（Mt
s）−Tyr−OBzlが433mg（収率79.4％）得られる。TLC:R
f1＝0.47。6N−HCl水解によるアミノ酸組成比:Asp1.00
（１）、Ser1.83（２）、Gln1.21（１）、Cystein0.60
（１）、Gly3.46（３）、Ala1.24（１）、Ile1.07
（１）、Leu1.20（１）、Tyr0.92（１）、Phe1.00
（１）、Arg0.92（１）［Pheの回収率63％］。
上記のα−hANP−（15−28）保護体100mg（0.049mmol）
をｍ−クレゾール257μ（2.45mmol）中、メチルスル
フイド180μ（2.45mmol）およびフツ化水素約2mlと０
℃で１時間処理する。フツ化水素を減圧下０℃で留去
し、残渣にエーテルを加えて粉末化した後、遠沈分離す
る。生成物をジチオスレイトール（dithiothreitol）75
mgを含む水溶液2mlに溶解し、５％アンモニア水でpH8に
調整してアルゴン気流下30分間撹拌する。これをセフア
デツクスＧ−25（フアルマシア社）のカラム（1.8×110
cm）に通し、0.2N酢酸で溶出（各フラクシヨン6ml）
し、フラクシヨン30〜37を凍結乾燥すれば、標題化合物
α−hANP−（15−28）58mgが得られる。収率80％。TLC:
Rf4＝0.29。
ハ．発明の効果 本発明方法により得られるポリペプチドα−hANP（17−
28）は、以下の実験例に示すごとく、動物に対してα−
hANP（１−28）と同様に抗原性を示すこと、またこのポ
リペプチドを利用して、α−hANPの容量調節系における
病態生理的意義を探査するためのα−hANPに特異的なラ
ジオイムノアツセイ（RIA）が可能であることを確認し
た。
実験例１ α−hANP（17−28）とウシチログロブリンとの結合（複
合体の調製） α−hANP（17−28）をカルボジイミド・カツプリング法
によりウシチログロブリンと結合させた〔吉政ら,J.Cli
n.Invest.69,643（1982）；中尾ら,Biochem,Biophys.Re
s.Commun.117,695（1984）〕。α−hANP（17−28）3mg
とウシチログロブリン25.2mgとを蒸留水2mlにとかし、
これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩30mgおよび蒸留水1mlからな
る溶液を加えた。この混合物を0.1N塩酸でpH5.6に調整
し、室温で20時間撹拌後、５の蒸留水に対して４℃で
３回透析して複合体を得た。
免疫処置 α−hANP（17−28）−チログロブリン複合体100〜200μ
ｇを等容量のフロインド（Freund）完全アジユバンドに
懸濁し、ニツポンシロウサギの肩甲骨間椎骨領域に皮下
注射して免疫した。４週間ごとに追加免疫を行い、各追
加免疫から10〜14日後に採取して抗血清CR3を得た。
ヨード反応 α−hANP（１−28）１μｇを常法どおりクロラミンＴ法
〔Nature,194,495（1962）〕に従い125I21mCiによりヨ
ード化し、その反応液をセプーパツク（Sep−Pak）カー
トリツジ（ウオーターズ社）に通し、50％アセトニトリ
ル/5mMトリフルオロ酢酸混液で溶出し純品を得た。この
125I−標識α−hANPの比放射能は700μCi/μｇであつ
た。
ラジオイムノアツセイ（RIA） ゼラチン0.5％,EDTA−2Na1.0mM,シスチン0.2mM,トリト
ンＸ−1000.1％およびマーシオレート（merthiolate）
0.01％を含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）をRIA用緩
衝液として使用した。α−hANP標準液100μを採り、
抗血清CR3の4,000倍終末稀釈液100μ,125I−α−hANP
（約5,000cpm）100μおよびRIA用緩衝液200μを加
え、４℃で72時間インキユベートした。これに活性炭
（Norit S×Plus）300mg/100mlデキストラン（Dextran
T−70,フアルマシア社）30mg/100mlおよび0.01％マーシ
オレート含有0.05Mリン酸緩衝液1mlから成るデキストラ
ン被覆活性炭懸濁液1mlを加えて４℃15分間放置し、結
合した125I標識α−hANPの結合型を遊離型から遠心分離
し、放射活性を測定した。
結 果 α−hANP−（１−28）の標準曲線とラツトの心房より分
離したα−rANP−（１−28）および合成短鎖ペプチドで
あるα−hANP−（24−28）の交差曲線とを第１図に示し
た。最小検出限界は50pgと感度が高かつた。
第１図から明らかなように、α−hANP−（17−28）より
調製した抗血清CR3は、α−hANP−（１−28）とα−rAN
P−（１−28）を同等に認識し、分子量換算ではα−hAN
P−（24−28）もα−hANP−（１−28）の活性と同等の
交差性を示す。以上の結果は、上述のRIA系がヒトのα
−ANPのみならず、他の動物種のα−ANPの検出にも適用
しうると共に、未だアミノ酸配列の決定されていないα
−ANP様ペプチドの検出にも適用可能であることを示唆
している。
【図面の簡単な説明】
第１図はα−hANP−（１−28） の標準曲線、およびα−rANP−（１−28） とα−hANP−（24−28） の交差曲線を示し、縦軸は抗体（抗血清）と結合してい
る抗原（125I標識α−hANP）（Ｂ）と、遊離している抗
原（Ｆ）の比（B/F）を表わし、横軸はα−ANPの濃度
（pg/tube）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−65058（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−81447（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−163456（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−35155（ＪＰ，Ａ) 「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．］118．Ｐ．131− 139（1984)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： Ｈ−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys−Asn−Ser−P
    he−Arg−Tyr−OH で表わされるポリペプチドおよびその塩。
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