JPH07500813A - リポソーム多糖体ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム多糖体ワクチン 本出願は、１９９１年５月１３日付けの米国特許出願第０７７６９９、１４４の 一部継続出願である。

■、　発明の分野 本発明は、リポソーム内に封入した多糖体抗原に対して粘膜の免疫応答を誘発さ せるための方法および組成物に関するものである。

２、　関連技術 集中的な治療管理、強力になってきている抗微生物剤、厳格な予防処置が利用で きるにもかかわらず、多臓器不全（ＭＯ３Ｆ）へ導く感染症は、損傷、出血、火 傷のような免疫抑制現象力（生じた後では、相変わらず後期罹病率および死亡率 の主な原因となっている。出血、外傷、熱傷が生じた日から７日を経過した後の 死亡の６０〜８８％は敗血症が原因である。院内肺炎が損傷後にしばしば起こり 、これはこの背景における多臓器不全、罹病率および死亡率の一因となる。重症 患者の３０〜７０％もが集中治療管理室内で気道感染症を発症している。

分泌免疫グロブリンＡは肺や腸のような粘膜表面にお（する主要な免疫グロブリ ンであり、胃腸管または呼吸器の粘膜で生成された微生物抗原−特異的ｓ１ｇＡ は、これらの表面てまｌこ（ｉこね、らの表面から病原体が宿主に感染するのを 防御する。粘膜関連感染症に対する防御は、粘膜部位における抗原−特異的形質 細胞の数および分泌抗体レベルと大いに関連があるが、血清ＩｇＧ抗体レベルや 膵臓の形質細胞応答とは関連がない。対照的に、ｓｌｇＡは菌血症のような全身 に広がっている感染において宿主を防御する際には重要な役割を担っていない。

肺、バイアー斑、腸固有層（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｌａｍｉｎａ　ｐｒｏｐｒ ｉａ）のような粘膜部位に存在するＴおよびＢ細胞は、通常の粘膜免疫系および 細菌感染に対する防御の決定的な第一線を構成する。全身のＢ細胞と違って、粘 膜のＢ細胞は主としてｓＩｇＡを産生じ、粘膜部位における抗原−特異的抗体応 答は膵臓やリンパ節のような全身のリンパ系器官で生じるものと異なっているこ とが多い。ある粘膜部位、例えば消化器関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）　、から 初めに起こるｓ　Ｉ　ｇＡ応答は、肺、扁桃腺、唾液腺といった他の粘膜関連リ ンパ系部位に広がる。粘膜部位間のｓ１ｇＡ分泌形質細胞のこの移動は、呼吸器 病原体への肺の免疫性を向上させることにねらいを定めた経口および鼻腔的免疫 感作戦略の土台を形成する。特に、この戦略はインフルエンザのようなウィルス 感染症と関連したタンパク質抗原に対するワクチンの開発に用いられ（Ｍｅｓｔ ｅｃｋｙ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　７：２６５．１９８７； 　Ｌｉａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４３：４８４．１９８９；およびＴａｍａｒａ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｖａｃｃｉｎｅ。

７：３１４．１９８９）、その場合、肺表面で最初に起こる感染症に対する増大 した抵抗性が、ウィルス抗原に特異的な肺分泌抗体の増強された産生とＢ細胞応 答を伴うことが見いだされた。

タンパク質抗原に対する膣粘膜の免疫反応を基底線の１００倍以上に増強するこ とが、対象の抗原とアジュバント、例えばコレラトキシン（Ｂｉｓｏｎ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３２：２７３６．１９８４）、グル タルアルデヒド不活化コレラトキシン（Ｌｉａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４１：１４９５．１９８８）　、コレラトキシンのＢサ ブユニット（ＭｃＫｅｎｚｉｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 　１３３：１８１８．１９８４）およびリポソーム製剤中に封入した抗原、の経 口または鼻腔的投与により達成された。しかしながら、細菌の多糖体抗原とアジ ュバントの組合せを用いた経口または鼻腔的免疫感作が成功したという報告はこ れまでなされていない。

コレラトキシン誘導産物のアジュバントとしての作用機序は、細胞表面上のガン グリオシドＧＭＩに対するコレラトキシンＢサブユニットの親和性に集中してい るようだ。コレラトキシンＢサブユニットのこの性質は、提示された抗原への局 在化されその後は一般化された粘膜のＩｇＡ応答に最初に関係した、粘膜関連細 胞の表面への関連抗原の運搬を増強する。不活化コレラトキシンおよびコレラト キシンのＢサブユニットは、有意な毒性を欠くために、ヒト経口ワクチンに適す ることが提唱された。特に、コレラトキシンＢサブユニットはインフルエンザと コレラのタンパク質抗原に対するヒトおよび動物ワクチンの成分として使用して 成功を収めている。リポソームの利点はそれらが無毒性である点にある。さらに 、リポソームは、経口または鼻腔内に投与したとき、粘膜の免疫反応に強力な免 疫増強作用を及ぼすことがいくつかの系において明らかになっている（Ｇｒｅｇ ｏｒｉａｄｉｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ。

１１：８９．１９９０；　ｖａｎ　Ｒｏｏｉｊｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、　Ｇｒｅ ｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｇ、、　Ａ１１ｉｓｏｎ、　Ａ、Ｃ，、Ｐｏ５ｔｅ　Ｇ。

（ｅｄｓ）、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ　９５−１０６．　１９８９ ；　Ｐｉｅｒｃｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４４：４６９．１９８４）。抗原を提示す るためのリポソーム運搬系の強力なアジュバント効果は、少なくとも部分的には 、細胞膜と融合して、直接その内容物を細胞内抗原プロセシング系に運搬するそ の能力のためであると考えられる。

免疫を抑制された宿主は粘膜表面での感染を特に受けやすい。

免疫抑制は、例えば化学療法、損傷、火傷、および出血（特に外傷の後）により 引き起こされる。血液の減少が外傷に続く病態生理学的不安定の中心的要因であ り、感染に対する感受性および死□亡率を増加させることがわかっている。血液 の減少は膵臓、リンパ節、骨髄、胸腺または肺のＴまたはＢ細胞サブセット（す なわち、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤａｌ、Ｉｇ＋またはＢ２２０＋）の絶対数も しくは相対数を変化させないが、出血後にＴおよびＢ細胞機能の広範な変化が記 載されている。出血はサイトカイン（ＩＬ−１，ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５ 、γ−ＩＦＮ）放出の変化（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｒｃ、　 ５ｈｏｃｋ、　２５：３３．１９８８；　Ａｂｒａｈａｍ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：８９９．１９８９）　、 ？イトジエン誘導Ｔ細胞増殖の低下（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：８９９．１９８９）、ＩＬ−２レセプター発現 の低下（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１４２：８９９．１９８９；　５ｔｅｐｈａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、 　Ｓｕｒｇ、、　＋２２：６２．１９８７）、および膵臓（Ａｂｒａｈａｍ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２２：２０８゜１９８９ ）　、腸（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　！ｍｍｕｎｏ１．． １２８：１６５．１９９０）、肺（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４５：３７３４．１９９０）のＢ細胞レパートリ−の 変化を含めて、免疫学的機能の多数の異常をもたらす。

研究（Ｅｓｒｉｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｒｅｖ、　Ｓｕｒｇ、、　３３：４３１ ．１９７６；　５ｔｅｐｈａｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　Ｓｕｒｇ、、　１２２：６２．１９８７）により 、出血後に感染に対する感受性が増加することが明らかになった。困ったことに 、出血のモデルはたとえ採血を行わない場合でも非常に免疫抑制的であり、しか も生じた感染症が臨床土兄られるものと密接な関係がないという２つの理由のた めに、これらの研究結果の解釈は困難である。特に、以前に記載された出血のモ デルは、長時間麻酔した動物への動脈カテーテルの配置を含んでいる。かかる動 物標本は、たとえ採血がなくとも、マイトジェン誘導リンパ球増殖の７０％以上 の低下（Ｓｔｅｐｈａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　Ｓｕｒｇ、、　１２ ２：６２゜１９８７）　、炎症反応（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｒ ｃｈ、　Ｓｕｒｇ、、　１１９：１１５４゜１９８４）　、並びにＩ　Ｌ　−１ （Ａｙａｌａ、　ｅｔ　ａｌ、、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　７０：３３゜１９９ ０）およびＩＬ−２産生（Ｓｔｅｐｈａｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｓｕｒｇ、　Ｆ ｏｒｕｍ。

３７：７３．１９８６）をもたらす。

呼吸器や胃腸管のような粘膜表面の感染と関連した病原体の多くは細菌であり、 その場合、防御免疫のための最も好ましい抗原は多糖体である。ところが、多糖 体の抗原は、全身的に投与する場合でも、一般に弱い免疫原である（Ｓｃｈｒｅ ｉｂｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４６：１８８．１９９１）。宿主が免疫無防備状態のと きはなおさらそうである。多糖体抗原に対する全身的免疫反応の増強は、タンパ ク質キャリアーおよびアジュバントへの力・ツブリングにより、あるいは抗イデ イオタイプの操作により達成された（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４４：１０２３．１９９０）　ｏこれに対して、抗 原に特異的な粘膜免疫反応に及ぼす細菌多糖体による免疫感作の効果に関する情 報はほとんど得られていない。これまでの研究（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｖａｃｃｉｎｅ、印刷中）において、アジュバントとしてのコレラトキシ ンと同時投与した細菌の多糖体抗原レバンまたは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｌ型多糖体を用いた経口免疫感作は、抗原特異的 肺ｓ１ｇＡ抗体価の増加をもたらすことが見いだされた。しかし、肺の形質細胞 応答を高めるためには、大量の抗原（すなわち、１ｍｇ）と毒性アジュバントの 使用が必要であった。

その結果として、細菌感染症に対して粘膜表面を免疫するための効果的で無毒性 の方法の必要性が少なからず存在する。本発明はかかる方法を細菌の多糖体抗原 とリポソームカプセル化担体とを組み合わせることにより提供するものである。

発明の要約 病原性細菌が粘膜感染症において果たす役割並びに現存する免疫感作技術の厳し い治療制限を認識することにより、本発明者らは、より効果的な免疫感作法を開 発しようとして、新規なワクチンを製造し、評価した。これらの努力は、最終的 には、粘膜表面から宿主に感染または侵入する細菌に対して特に有効な、新しい 免疫感作法の開発につながった。

この方法はリポソーム内に封入した細菌の多糖体抗原を含む組成物を利用して開 発された。驚いたことに、これらの組成物およびこの方法により、ワクチンの副 作用を最小限に抑えつつ、カプセル化した細菌多糖体抗原への宿主の抗原−特異 的分泌免疫反応を有意に高めることが可能である。

本発明の方法はここに開示する新規なリポソーム組成物の使用により増強される 。これらの組成物はリポソーム内に封入した細菌の多糖体抗原を含み、さらにア ジュバントを含む。アジュバントは抗原と共に区画化されるか、リポソームの膜 中に挿入されるか、あるいはその両方であり得る。

図面の説明 図１．　３８ｍｇのレバンを含むリポソームで鼻腔内免疫したマウスの肺洗浄液 中の抗しバンｓ１ｇＡ抗体価。１時間後に意識回復を伴う３０％の血液容量の出 血後で、図示した時期にマウスを免疫した。対照（Ｃ）マウスはエーテル麻酔お よび血液を抜き取らない心臓穿刺の３日後に免疫した。試料を希釈しないで試験 したときに終始一貫して最大ＯＤが観察されたので、結果を未希釈洗浄液試料に ついてのＯＤ、、。±ＳＥＭとして示しである（＊対照に対してｐ＜Ｑ、０５） 。

図２．　レバン−特異的肺形質細胞の数に対する意識回復を伴う出血の影響。１ 時間後に意識回復を伴う３０％の血液容量の出血後で、図示した時期にマウスを 免疫した。対照（Ｃ）マウスはエーテル麻酔および血液を抜き取らない心臓穿刺 の３日後に免疫した。結果は肺１組あたりの全形質細胞および■ｇＡ産生レバン 特異的形質細胞の数±ＳＥＭとして示しである（対照に対して＊ｐ＜０．０５お よび＊＊ｐ＜ｏ、０１）。

図３．　５０μｌの空のリポソーム（対照）、２５μｇの緑膿菌ｌ型多糖体を含 むリポソーム（ＰｓＡ）、または２５μｇの緑膿菌１型多糖体と０．２μｇ（１ ０μｇ／ｋｇ）のＩＬ−２を含むリポソーム（ＰｓＡ＋ＩＬ−２）で鼻腔内免疫 した出血マウスの生存率。マウスは３０％の血液容量を出血させた２時間後に免 疫し、そして血液損失の４日後に５ＸＩＯ’　ｃｆｕの緑膿菌フィッシャー−デ ブリン（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｄｅｖｌ　ｉｎ）免疫型１（１５９２１株）を気管内に 接種した。各群は１１匹の動物から成っていた。肺炎誘発の１０日後に、緑膿菌 多糖体とＩＬ−２を含むリポソームで鼻腔内免疫したマウスの死亡率が、空のリ ポソームまたは緑膿菌多糖体を含むがＩＬ−２を含まないリポソームで免疫した 動物群と比較して、有意に低下した（ｐ＜０．００５）。

好ましい態様の詳細な説明 本発明者らは、細菌の多糖体抗原に対する粘膜免疫反応を誘発させるように動物 を免疫感作する組成物および方法を工夫したところ、この成果の達成を目的とし た従来技術と比べて顕著な改良が得られた。本発明は、伝染性生物と粘膜表面と の接触により起こる感染症にかかつているか、その危険性がある動物への投与を 含むものである。

本発明においては、細菌の多糖体抗原をカプセル化するためにリポソームが用い られる。リン脂質を水性媒体中に穏やかに分散させると、それらは膨潤し、水和 し、そして水性媒体の層が脂質二重層と分離している同心円状の多重ラメラニ重 層小胞を自動的に形成する。このような系は通常多重ラメラリポソームまたは多 重ラメラ小胞（ＭＬＶ）と呼ばれ、約１１００ｎから約４μｍの範囲の直径を有 する。ＭＬＶを超音波処理すると、直径か約２０〜約５０ｎｍの範囲の小さい単 ラメラ小胞（ＳＵＶ）か形成され、これはＳＵＶのコアに水溶液を含んでいる。

リポソームの組成は、通常、リン脂質類、特に高相転移温度のリン脂質類の組合 せであり、一般にステロイド類、特にコレステロールとの組合せである。他のリ ン脂質または他の脂質も使用できる。

リポソームの製造に有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えばホスフ ァチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスフ ァチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシド、およびガングリ オシドが含まれる。

特に、脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み かつ飽和されている、ジアシルホスファチジルグリセロールが有用である。代表 的なリン脂質には卯のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコ リン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。

細胞の多糖体抗原を含むリポソームを製造する際には、抗原カプセル化の効率、 抗原の不安定性、得られたリポソーム集団の均質性および大きさ、抗原対脂質の 比、製剤の透過性および不安定性、並びに医薬としての製剤の許容性といった可 変要因を考慮すべきである（Ｓｚｏｋａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒ ｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓａｎｄ　Ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ、９：４６７、　１９８０；　Ｄｅａｍｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ｉｎＬｉｐ ｏｓｏｍｅｓ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ ３．２７；　Ｈｏｐｅ、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、　４０：８９．１９８６）。

本発明は、とりわけ、免疫無防備状態にあるヒトのような動物において免疫反応 を誘発させるのに有用である。“免疫無防備状態”とは、免疫系が正常に機能し ていない動物を指す。動物を免疫無防備状態にさせうる条件の例としては、化学 療法、照射、加齢、そして例えばショック、重症の出血による血液の損失、火傷 などから生じる物理的損傷がある。

多くの生物、特に細菌は感染部位または初期の侵入部位として粘膜の表面を利用 する。本発明においては、リポソームワクチンがこれらの種々の生物の病原作用 を改善するために粘膜表面て免疫反応を誘発させることができる。粘膜免疫系の 種々の成分の相互関係のために、ある粘膜部位で動物にワクチンを接種し、そし て異なる部位で分泌免疫反応を生起させることが可能である。免疫し得るおよび ／または分泌免疫反応を生起し得る組織の例には、気管、胃腸管、泌尿器管、お よび乳腺、唾液腺、涙管のような腺が含まれる。かくして、鼻腔内免疫すること によって胃腸の病原体に対する分泌免疫反応を誘発させることが可能である。ま た、バイアー斑や腸固有層のような胃腸管の免疫化によって気管内で分泌免疫反 応を誘発させることが可能である。

本発明で用いる“免疫原として効果的な量”という用語は、多糖体抗原上に存在 するエピトープと結合しつる抗体を産生ずるように動物を誘発するのに必要な多 糖体抗原の量を意味する。

本発明の方法および組成物は細菌の多糖体抗原の免疫感作を可能にするのに特に 有用である。種々の細菌多糖体抗原の中では、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃ ｔｅｒ）　、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅ ｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ） 　、カンピロバクタ−（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス　（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ）の種または株から誘導されるものが好ましい。

特に、緑膿菌や肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）の株から誘導される細菌多糖体が好ましい。これらの細菌多糖体抗原は単 一の株または血清型から誘導されても、多価、すなわち種々の血清型からの抗原 の集まりであってもよい。多価の細菌多糖体抗原の混合物の使用は、さまざまの 血清型か病因に関係している緑膿菌および肺炎連鎖球菌のような生物にとって特 に有用である。

いろいろな細菌から多糖体抗原を調製する手法は当分野で公知であるか、過度の 実験を行わずに簡単に確かめることができる。

細菌の多糖体抗原を含むリポソーム製剤はアジュバントを含むことも可能である 。アジュバントは特異的免疫反応を非特異的に増強させるべ（使用される物質で ある。通常、アジュバントと抗原は免疫系への提示に先立って混合されるか、ま たは免疫すべき動物の同じ部位に別々に提示される。アジュバントは、厳密では ないが、その組成に基づいていくつかのグループに分けることができる。これら のグループは油アジュバント（例えば、フロイント完全および不完全）、無機塩 （例えば、ＡＩＫ（ＳＯｌ）２、ＡＩＮａ（ＳＯ４）２、ＡＩＮＨ４（ＳＯ４） 、シリカ、ミョウバン、Ａ　Ｉ　（ＤＨ）、、Ｃａａ（ＰＯｔ）２、カオリン、 および炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、およ びある種の天然物質（例えば、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのワックスＤ１コレラトキシンのＢサブユニット、 グルタルアルデヒド処理コレラトキシン、並びにコリネバクテリウム・バルバム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）　、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅ ｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびプルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属のメン バー中に存在する物質）を含む。

リポソーム製剤中に添加し得る他のアジュバントには免疫モジュレータ−とその 他の生物反応改変剤が含まれる。′生物反応改変剤”という用語は、多糖体抗原 への免疫反応を増強するやり方で免疫反応の改変に関与している物質を包含する ものである。生物反応改変剤の例としては、リンホカイン、例えばインターロイ キン、マクロファージ活性化因子、移動阻止因子、コロニー刺激因子およびイン ターフェロンがある。好ましいインターロイキンはｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｂ細胞機 能、例えば増殖、抗体生産、または活性化に対して直接作用を及ぼすものである 。ＩＬ−２とＩＬ−６が特に好適である。他の生物反応改変剤も知られており、 当業者によって容易に確かめることができる。

本発明のリポソーム製剤はリポソームの膜中にアジュバントを含むように改変す ることもできる。好ましい化合物は、Ｃｈａｎｇ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、　２１ ：１６９．１９７８およびＣｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ 　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、　２３：６２．　１９８０　（参照によりこ こに組み入れるものとする）に記載されるリポイドアミンとして特徴づけられる ものである。リポイドアミンの中で特に好ましいものはアブリジン（ａｖｒｉｄ ｉｎｅ）　（ＭＮ−ジオクタデシル−Ｎ’、Ｎ’−２−ヒドロキシメチル−プロ パン−ジアミン）である。アブリジンを含むリポソームは多くの抗原を封入する ことができ、しかもリポソーム膜中のアブリジンの存在はリポソームのアジュバ ント効果を増強し、その結果アブリジン含有リポソーム内の抗原の投与後により 大きな粘膜の免疫反応が達成される。アブリジンと細菌多糖体を含むリポソーム は、多量の抗原をカプセル化し得る大きな単ラメラリポソームをもたらす洗剤透 析法（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　 Ａｃｔａ、７３４：１３７．　１９８３により改良されたもの）により製造する ことができる。また、脱水−再水和変法（Ｋｉｒｂｙ　ａｎｃｌ　Ｇｒｅｇｏｒ ｉａｄｉｓ、　１３ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　２：９７９゜１９８４）のよ うな他のリポソーム製造法も高いカプセル化パーセンテージをもたらす。本発明 により利用されるアジュバントにかかわりなく、アジュバントをリポソーム自体 の内部に存在させる（すなわち、多糖体抗原と共に区画化する）が、リポソーム 小胞の膜中に存在させるか、またはその両方に存在させることが可能である。当 業者はアジュバントを（例えば細菌多糖体抗原と複合体化させて）リポソームの 内部にまたはリポソーム膜の中に保持させる技術について熟知している。

多重免疫感作法を利用する場合、免疫感作の時期について多くの異なる技法が存 在する。本発明のリポソーム製剤は、分泌免疫反応のレベルを高めるために１回 より多く使用することができる。

一般に、動物に投与される多糖体抗原の用量は、年齢、健康状態、性別、患って いる場合はその疾病の程度、そして当業者が調整しうる他の可変要因などの諸要 因に応じて変化するだろう。しかしながら、少なくとも動物が重大な血液の損失 といった損傷のために免疫抑制状態に陥っている場合には、２４〜４８時間以内 、好ましくは２４時間以内に免疫感作を投与することが好適である。

本発明の抗原製剤は１回または複数回投与することができ、１回につき１０ｕｇ ／ｍ１〜１０，０００１１ｇ／ｍｌ、より好ましくは５０μｇ／ｍ１〜５，００ ０ａｇ／ｍｌの抗原、最も好ましくは１回につき１０１ｚｇ／ｍ１〜６００μｇ ／ｒｒ＋ｌの抗原でありうる。一般に、細菌の多糖体抗原に対し最高レベルのｓ ＩｇＡ（分泌免疫応答）を誘発する投与量が好ましい。

インターロイキンのような生物反応改変剤をリポソーム内に抗原とともに含める 場合、該改変剤の投与量は約０．００１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、好 ましくは約０．ＯＬμｇ／ｍ１〜約２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０−　 ０５μｇ／ｍｌ　〜約５０μｇ／ｍｌの範囲で変化しうる。

本発明を一般的に説明してきたが、以下の具体的な実施例を参照することにより 一層完全な理解が得られるだろう。これらの実施例は単に例示するためのもので あり、特に記載しない限り本発明を限定するものではない。

この研究は、リポソーム内に封入した細菌抗原に対する分泌免疫応答を調べるた めに、８〜１２週齢の雄Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ 、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＭＥ）を用いて行った。

リポソームは、多量の抗原をカプセル化し得る大きな単ラメラリポソームをもた らす、Ｐｈ１ｌｉｐｐｏｔ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ。

７３４：１３７．１９８３）らにより改良された洗剤透析法により製造した。

コレステロール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルコリン（各８μ Ｍ）を−緒にし、Ｎ２のもとで乾燥してフィルムとなし、その後さらに６０分間 凍結乾燥機内に置いた。カプセル化すべき細菌多糖体を０．５ｍ］のバッフｙ　 −（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ＧＩＢＣＯ）、　１　 ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，４）中に懸濁し乾燥脂質に加えた。カプセル化効率 をモニターするために、Ｃ１１ラベル化イヌリン（２０μｍ）を懸濁液に加えた 。３０分後、０．２４ｍ１の１Ｍオクチルグルコシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） を脂質と抗原の混合物に加え、強く振とうした。このサンプルを透析チューブ（ 分子量カットオフ３５００）１．：移し、２．４ｇの５Ｍ−２バイオビーズ（Ｂ ｉｏｒａｄ）を含む１００ｍ１のバッファーに対して透析した。

２４時間後、リポソーム調製物をＡ　５　Ｍ　（Ｂｉｏｒａｄ）カラムにかけ、 リポソーム画分（ボイドボリューム中）を集めた。カプセル化効率は、最初の脂 質懸濁液中のＣロカウント数を、最終リポソーム画分中のそれと比較することに より測定した。一般に、およそ４０％（レバンおよび緑膿菌ｌ型）および１０％ （肺炎連鎖球菌３型多糖体（ＰＰＳ３））のカプセル化効率が得られた。単ラメ ラリポソームの平均の大きさは、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｎ５４Ｄ装置を使って動的レ ーザー光散乱により測定して、９９５±８０ｎｍであった。

動物は、Ｏ，１ｍｌのリポソーム懸濁液を鼻孔に適用し、これを吸入させて鼻腔 内免疫した。試験した抗原はアエロバクタ−・レバニクス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅ ｒ　１ｅｖａｎｉｃｕｓ）　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）か らのレバン、緑膿菌からの多糖体１型（３３μｇ）、および肺炎連鎖球菌からの 肺炎球菌多糖体３型（３３μｇ）であった。

肺の洗浄液は、０．　５ｍｌのリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を気管と肺に３回 注入して得られた気管支肺胞洗浄液を集めることにより得た。一般に、およそ０ ．４ｍｌの最終容量が得られた。この洗浄液を遠心して細胞破片を除き、試験に 供するまで一２０°Ｃで貯蔵した。

肺の洗浄液および血清は、ＥＬＩＳＡ法（Ｐｏｒｔｎｏｉ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１８：５７１．１９８８）を用いて細菌の 多糖体抗原に対する抗体の産生について試験した。９６ウエルＥＬＩＳＡプレー ト　（Ｃｏｓｔａｒ、　３５９０．　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）に０．０５ Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８中の抗原（１０ｇｇ／ｍｌ）を−夜コーティングし た。プレートをＰＢＳで洗浄した後、ウェルを１％卵アルブミン含有ＰＢＳて３ ７℃、３０分間飽和させた。ＰＢＳて洗浄後、連続２倍希釈で５０μｌの肝性浄 液または血清をＥＬＩＳＡプレートに移し、プレートを室温で２時間インキュベ ートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を各ウェルに加えた 。さらに１時間インキュベーション後、Ｈ２Ｏ２とオルソフェニルジアミンを含 む色素原で結合抗体を発色させた。２０分後に５０μＩの１０％ＳＤＳを各ウェ ルに加えて反応を止め、４１０ｎｍの補正フィルターを備えたフォトメーター（ ＭＲ６００，ＤｙｎａｔｅｃｈＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｔａｒｒａｎｃｅ、 　ＣＡ）を使って４５０ｎｍでＯＤを測定した。

アエロバクタ−レバニクス　レバン　０．０４６　±０．０１７　０．１−２６ ±０．０２３緑膿菌　Ｊ型　０．２５５±０．０６１　０．６６０＋０．０５１ 肺炎連鎖球菌　ＰＰ５３　０．１２７±０．０４４　０．２９３＋０．１１５表 １のデータから、粘膜免疫系を経てワクチン接種した動物は、リポソーム担体系 を用いて細菌多糖体抗原をカプセル化したワクチンの形態で抗原を提示するとき 、所定の細菌多糖体抗原に特異的なｓｌｇＡを有意な抗体価で産生ずることがわ かる。

リポソームに封入した細菌多糖体抗原による免疫感作の効果を免疫無防備状態の 動物において調べた。免疫無防備状態はネズミ出血モデルＣＡｂｒａｈａｍ、　 ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｊｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：８９９．１９８９）を用い てマウスに誘発させた。簡単に説明すると、マウスをぶた付きのビーカーに入れ た後、マウスにエーテルを吸入させて麻酔した。３０ゲージ針を使って心臓穿刺 を行い、３０％の血液容量（２０ｇのマウスにつき約０．５５ｍ１）を６０秒間 にわたって抜き取った。血液を０．１ｍｌ中に１００Ｕのヘパリンを含むシリン ジに集め、麻酔のかかっていないマウスに眼窩後神経叢注射により再注入するま で１時間３７°Ｃに保持した。この方法を使うと、合併症を起こさずにすべての 出血マウスの意識を回復させることができた。その後、マウスをケージ内で回復 させた。すべての事例においてエーテル麻酔の全期間は２ＩＪＪ未満てあった。

この出血プロトコールによる死亡率はおよそ１２％であり、すべての死が出血後 最初の２４時間の間に起こり、大部分の死は出血後１時間以内に起こった。

この出血モデルにおいて、エーテル麻酔と血液を抜き取らない心臓穿刺はマイト ジェン誘発リンパ球増殖、Ｉ　Ｌ　−２Ｒ発現、ＢまたはＴリンパ球の表現型特 性（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、μ、Ｌｙ−１の発現）、リンフ才力イ ン（ＩＬ〜２、■Ｌ−３、ＩＬ−５、γ−ＩＦＮ）放出、または肺臓、腸、もし くは肺のＢ細胞クローン前駆体の数（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　ｅｆ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

、　１４５：３７３４．１９９０）に何の変化も生じさせない。特に、以前の実 験から、エーテル麻酔および血液を抜き取らない心臓穿刺を行った後のマウスで は、レバンまたは緑膿菌の１型多糖体に特異的な肺のＢ細胞クローン前駆体の数 または頻度に何の変更もないことがわかっていた（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　ｅｔ　 ａｔ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４５：３７３４゜１９９０）。同様に 、この出血方法においては生存マウスに血胸、つまり心臓周囲の空間、肺への出 血、または心臓挫傷の徴候がまったく見られなかった（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４２：８９９゜１９８９）。動物の 選別、免疫感作、およびＥＬＩＳＡ法は実施例１に記載したように行った。

実質内肺リンパ球を以前に記載された通りに単離した（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４４：２１１７．１９９０）　ｏ簡 単に述べると、それぞれの実験に３匹のマウスを使用し、分析のために肺の細胞 を集めた。マウスを頚椎脱臼により犠牲にした後、胸部を開き、右室に３〜５ｍ ｌの冷却（４℃）ＰＢＳを注入して肺血管床をフラッシュ洗浄した。次いで、気 管周囲のリンパ節を避けながら肺を切除し、ＲＰＭｌ　１６４０（ＧＩＢＣＯ） で２回洗った。

肺を細かく刻み、組織片を、２０Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（ＳＩＧＭＡ）および ｌμｇ／ｍｌのＤ　Ｎ　ａ　ｓ　ｅ　（ＳＩＧＭＡ）を含む、５％ＦＣ３（ＧＩ ＢＣＯ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ｌＯｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｇＭ　 ２−ＭＥ　（ＧＩＢＧＯ）、２０ｍＭＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を加えたＲ ＰＭＩ　１６４０（ＧＩＢＣＯ）の中に入れた。３７°Ｃで６０分間インキュベ ーションした後、残っている完全な組織を２１ゲーン針を通過させて分断した。

組織断片と死細胞の大部分をガラスウールカラムを通す迅速濾過により除き、細 胞を遠心により集めた。細胞ペレットを４ｍｌの４０％パーコール（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中に浮遊させ、４ｍｌの８０％ パーコール上に重層した。６００ｇで１５°Ｃ１２０分間遠心した後、界面にあ る細胞を集め、ＲＰＭＩ　１６４０で洗い、カウントした。生存率はトリバンブ ルー排除により測定して常に９８％より高かった。

肺中の全形質細胞およびレバン−特異的形質細胞の検出は、Ｓｅｄｇｗｉｃｋ　 ａｎｄ　Ｈｏ１ｔにより記載された方法（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５７：３０１．１９８３）に類似し た方法を用いて行った。簡単に述べると、９６ウエルの平底ＥＬＩＳＡプレート に、５０μｍ／ウェルの０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ８中のレバ ン（１０ｇｇ／ｍｌ）と４℃で一夜インキユベーションしてコーティングした。

次に、プレートをＰＢＳで洗い、１％ゼラチンを含むＰＢＳで３７℃、１時間ウ ェルを飽和させた。ＰＢＳでさらに洗浄後、グルタミン、２−ＭＥ、ｌｏｍＭ　 ＨＥＰＥＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％ＦＣ３を含む１００ μｍのＲＰＭｌ中の免疫済みのまたは免疫してないマウスからの実質内肺リンパ 球をウェルにまいた。ウェルあたりの細胞数が１０２〜１０６になるように調整 した。

その後、プレートを５％ＣＯ２のもとて３７℃、５時間インキュベートした。プ レートを軽くたたき、続いてＨ２０中の０．０５％トウィーン２０て溶解して細 胞を除いた。０．０５％トゥイーンを含むＰＢＳで洗った後、ビオチンと結合さ せたヤギ抗マウス全ＩｇをＰＢＳ　１％ゼラチン中のウェルに加え、プレートを ４０Ｃで一夜放置した。次いで、４プレートをＰＢＳ、０．０５％トウイーンで 洗い、アルカリホスファターゼと結合させたストレプトアビジンをウェルに加え た。３７°Ｃで１時間インキュベーション後、プレートを洗い、０．７５％アガ ロースを含む２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ 、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）中に希釈した基質、２．３ｍＭの５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリルホスフェート　（Ｓｉｇｍａ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　 ＭＯ）を各ウェルに加えた。

３７℃で１〜２時間インキュベーション後、抗体分泌細胞をカウントし得る青色 の斑点として発色させた。ウェルあたり２０〜４０の斑点をもたらす細胞の希釈 液を用いて、サンプルあたりの抗体特異的Ｂ細胞の総数を定量した。この検定法 の感度および特異性は、Ａｇ抑制試験およびＡｇ特異的ハイブリドーマ細胞系を 含む研究において裏付けられている（Ｋｌｉｎｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４１：８０１．１９８８；　Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８７：３７．１９８６）。

肺炎はバーバード大学（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）のＧｅｒａｌｄ　Ｐｉｅｒ博士 から得られた緑膿菌のフィッシャー−デブリン免疫型１（１，５９２１株）を用 いて誘発させた。トリブチツク大豆寒天プレートに新たに培養した後、細菌をト リブチツク大豆ブロスに移し、１０９ｃｆｕの濃度が達成されるまで３７°Ｃで インキュベートした。細菌を遠心し、冷却ＰＢＳて２回洗い、次いてＰＢＳ中に ５Ｘ１０’、１０ｇ、２×１０９または３Ｘ１０’ｃｆｕ／ｍｌの濃度で再懸濁 した。マウスをベンドパルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で腹腔的麻酔し、垂直に つり下げ、そして口から鋭くない２２ゲージ針を入れて４０μｍの細菌懸濁液を 気管に導入した。マウスをケージに戻し、餌と水に自由に近つりるようにした。

毎日２回死亡を評価した。マウスを７日間観察したが、５日間以後の死亡は見ら れなかった。

抗原特異的肺ｓｒｇＡ抗体価および原形質細胞を調べる実験では、それぞれの実 験条件について２群のマウス（１群３匹のマウスから成る）を試験した。各マウ スからの柿渋浄液てＥＬ　ｒ　ＳＡを行った（それぞれの条件について６つの洗 浄液を試験した）。

ＥＬＩＳＡ斑点検定のために、各群３匹のマウスから肺リンパ球を単離し、集め た。肺１組あたりの抗原特異的形質細胞の数は、ＥＬＩＳＡ斑点検定で測定した １０６肺リンパ球あたりの抗原特異的斑点の数に、肺１組につき単離された細胞 の総数を掛けることにより算出した。

データは各実験群について平均上標準誤差（ＳＥＭ）として表される。２群間の 差異についてのスチューデント式ｔテストにより、あるいは２群より多い実験の 差異を検討するための一方向分散分析を用いることにより、各群の平均値の比較 を行った。生存データはカイ二乗分布およびフィッシャー正確度分析（Ｆｉｓｈ ｅｒ’　５Ｅｘａｃｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）により分析した。０．０５より小さ いｐ値が有意であると見なされた。

Ａ、　鼻腔的免疫感作の結果 ある粘膜表面で生成された分泌抗体応答がその後他の粘膜部位で見られるという 、共通の粘膜免疫系（Ｍｅｓｔｅｃｋｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　７：２６５．１９８７）が存在するために、リ ポソーム内に封入された細菌多糖体抗原レバンの漸増量（１，５，１０および３ ８μｇ）でマウスを鼻腔内免疫した。１週間後動物を犠牲にし、上記のように洗 浄した肺と細菌抗原特異的ｓＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。肺リンパ球 を単離し、肺１組あたりの細菌抗原特異的形質細胞の数をＥＬＩＳＡ斑点検定を 用いて数えた。また、血清も採取して、抗レバン抗体価を測定した。

非免疫マウスと１〜１０ｇｇのリポソームカプセル化レバンで鼻腔内免疫した動 物では、肺リンパ球の中にレバン特異的形質細胞がまったく存在していなかった 。これに対して、３８μｇのレバン含有リポソームで鼻腔内免疫した後では、肺 Ｉ組あたり３３±５個のレバン特異的形質細胞が存在していた。同様に、３８μ ｇのリポソームカプセル化レバンで免疫したマウスにだけレバン特異的ｓＩｇＡ 抗体価の増加が見られた（非免疫マウスではＯＤ２．。＝０．０４６±０．０１ ７に対して０．１２６±０．０２３）。血清の抗レバン抗体価は、非免疫群と比 較して、鼻腔内免疫化マウスのどの群にも変化が見られなかった。

Ｂ、　肺形質細胞応答に対する出血の影響細菌抗原に対する肺分泌抗体応答への 出血により誘発された免疫抑制の影響を調べるために、３０％のマウス血液容量 を取り出し、次いて１時間後に戻した。出血後の所定の時期に３８μｇのレバン を含むリポソームを鼻腔内投与した。免疫感作の１週間後、レバン特異的ｓＩｇ Ａ抗体価と形質細胞数を分析するために柿渋浄液と肺リンパ球を集めた。血清も 免疫感作の１週間後に集めて、抗レバン抗体価を測定した。これらの実験の結果 を図１および２に示す。

出血の３日後に免疫したマウスからの肺洗浄液中の抗しバンＳＩｇＡ抗体価は、 正常または対照動物のものと相違しなかった。

しかし、出血の７日および１４日後に免疫したマウスでは抗しバンｓ１ｇＡ抗体 価が著しく減少していた（図１）。レバン特異的原形質細胞数の減少も出血後意 識を回復させた場合に見られたが、肺洗浄液中の抗しバンｓ１ｇＡ抗体価につい て示されたものとやや異なる動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示した。レバン特異 的形質細胞の数（全体およびＩｇＡ産生の両方）の７０％を越える減少が出血後 １〜７日の間に現れ、出血後１４４日目出血前の値に戻った（図２）。免疫感作 を出血後３日目に行った場合は、実質的にレバン特異的原形質細胞が存在しなか った。

モデルの他の構成要素ではなく出血が原因で、肺形質細胞における抗レバン応答 の変化が生した。エーテル麻酔および血液を抜き取らない心臓穿刺を行った後３ 日目にマウスを免疫した場合（対照）は、肺洗浄液中の抗しバンｓＩｇＡ抗体価 （正常では０Ｄ１６０　＝　０．　１２６±０．０２３に対して対照では０．１ １５±０．００９）もレバン特異的原形質細胞の数（正常では３３±５に対して 対照では３５±７）も変化が生じなかった。正常な非出血マウスと比較して、対 照動物には出血後いずれの時点においても血清抗レバン抗体価の変化が見られな かった。

Ｃ０肺炎生存に対する出血の影響 以前の実験は、細菌多糖体抗原に対する肺分泌抗体および形質細胞応答が出血お よび意識回復を行った後ｌ〜１４日間にわたり減少することを実証した。緑膿菌 の多糖体を含めて細菌多糖体に向けられた抗体は、生物（抗原が単離されている ）による感染に対して防御的である（Ｐｉｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃ ｔ、１ｍｍｕｎｏ１．、２２：９１９゜１９７８；　５ｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６０：１００１．１９８４）。従って、 この結果は、感染に対する肺の抵抗性が出血後のこの時期に低下するかもしれな いことを示唆した。この仮説を確かめるために、次第に増加する数の緑膿菌フィ ッシャー−デブリン免疫型ｌの生物の気管内注入により、実験的な緑膿菌肺炎を 正常マウス、出血マウス、出血後意識を回復させたマウスに発症させた。

未処理マウスまたはエーテル麻酔と血液を抜き取らない心臓穿刺を受けたマウス では、マウス群（ｎ＝６）に２ＸｌＯ’または４ＸｌＯ’個の生物を与えたとき 、死亡が見られなかった。しかし、マウス（ｎ＝６）に８ＸｌＯ’個の生物を気 管内に与えた場合は、死亡率が８３％であり、１２Ｘｌｏ’個の生物を注入した 場合は、死亡率が１００％となった。全マウスが注入後２４〜９６時間の間に死 亡した。緑膿菌の気管内導入後に死亡したマウスの肺の組織学的検査は、急性の 硬化性肺炎に一致した変化を示した。

次に、マウス（ｎ＝１９）から全血液量の３０％を出血させた。

１群の出血マウス（ｎ＝７）では、除いた血液を出血の１時間後に再注入した。

残りのマウス（ｎ＝１２）は意識を回復させないでおいた。エーテル麻酔と血液 を抜き取らない心臓穿刺を受けた対照群（ｎ＝１３）のマウスを含めた。

４日後、２Ｘ１０７個の緑膿菌を各マウスの気管に接種した。

出血および 意識回復　４３５７” ａ　対照に対してｐ＜０．０１ 対照群の動物は感染後−匹も死亡しなかった。これに対して、感染の４日前に出 血させたマウスでは死亡率が６７％であり、出血後意識を回復させたマウスでは ５７％であった（表２）。意識を回復させた出血マウスの死亡率は、出血後意識 を回復させなかった群の死亡率と有意差がなかった。

出血により免疫抑制した動物の生存に対する免疫感作の効果を研究するために別 の実験を行った。この実験では、対照および免疫動物の両方を上記のように出血 させ、意識を回復させた。免疫感作群の９匹の動物に、出血および意識回復の１ 時間後に、リポソーム内に封入した緑膿菌１型多糖体（３３μｇ）を用いてワク チン接種した。両群の動物を、出血および意識回復の９６時間後に、緑膿菌の２ ＸｌＯ’個の生存細胞にさらした。この実験の結果を表３に示す。

非免疫　１３　１３　０　１００ 免疫済み　９　６　３　６７本 本　ｐ＜０．　０５ 表３に示すように、免疫済みの動物は非免疫群の動物と比較して生存率の有意な 増加レベル（３３％）を示した。かくして、１ノポソーム内に封入した細菌多糖 体抗原による鼻腔内免疫感作は、病原体のまたは院内の°感染もしくは集落形成 の危険にさらされている免疫抑制動物の生存を有意に高めることができる。

表２および３に示した実験結果は、出血が、その後意識を回復させた場合でさえ も、肺の抗菌Ｂ細胞機能の顕著な持続性の低下をもたらすことを実証している。

免疫性の細菌多糖体抗原に対する抗体を産生ずる肺形質細胞の数の減少が出血後 １−１４日の間に見られ、また細菌抗原特異的ｓ１ｇＡの抗体価が出血後２週間 以上にわたって減少した。抗レバンｓＩｇＡとレバン特異的形質細胞との出血後 動力学の差異は意外なことではない。分泌された抗体は粘膜の表面に数日間とど まることができるので、抗原特異的抗体の抗体価は形質細胞数の変化をただちに 反映するとは予想されず、むしろ遅れて形質細胞の変化のパターンに従うだろう 。

肺Ｂ細胞機能におけるこれらの異常の有意性は、抗原特異的形質細胞の数が最低 点にある、出血後４日目の時点での緑膿菌肺炎に対する感受性の増加により実証 された。

本発明者らによる以前の研究は、意識回復を伴わない出血が、細菌抗原に対する 抗体の産生をまかされた肺、腸および肺臓の小さな休止Ｂ細胞（クローン前駆体 ）の数およびパーセンテージを著しく減少させることを明らかにした。形質細胞 はＢ細胞クローン前駆体から発生ずるので、クローン前駆体レパートリ−の変化 はしばしば抗原特異的形質細胞数の同様の変化によって反映される。意識回復を 伴わない出血後のこの状況は以前に実証されており、細菌抗原特異的な肺臓およ び腸のクローン前駆体の数の減少がこれらの解剖学上の部位からの抗原特異的形 質細胞の数の同様の減少によって反映されていた（Ａｂｒａｈａｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ、、　１２２：２０８．１９８９；　Ａｂｒａ ｈａｍ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２８：１６５．１９９０）。出血マウスでは、細菌抗原レバンおよび緑膿菌ｌ 型多糖体に対する抗体産生をまかされた肺Ｂ細胞クローン前駆体の数の減少が血 液の損失後３〜１０日の間に起こる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４５：３７３４．１９９０）。本実験では、細菌抗 原特異的な肺形質細胞数およびｓ１ｇＡ産生の出血後減少の時間経過が抗原特異 的Ｂ細胞クローン前駆体で見られたものと非常に類似しており、かくして、出血 により誘発された肺形質細胞数および機能の変化が、小さな休止Ｂ細胞集団の中 の細菌抗原特異的Ｂ細胞クローン前駆体の数および頻度の変化を反映しているこ とを示唆する。

形質細胞区画に入れる細菌抗原特異的クローン前駆体の数の減少は、細菌接種物 への暴露後の宿主防御という見地から制限的であるかもしれない。本実験は、こ のようなメカニズムが血液損失後の感染に対する感受性の高まりの一因となって いることを示唆する。なぜなら、出血後の緑膿菌肺炎からの死亡率の増加が、肺 における細菌多糖体抗原特異的Ｂ細胞クローン前駆体の数の減少および細菌抗原 特異的分泌抗体を産生ずる能力の低下と関連した時期に起こっているからである 。出血の１時間後に意識を回復させた動物は、出血後意識を回復させなかったマ ウスと比べて、緑膿菌肺炎に対して同様の感染性の高まりを示した。従って、こ れらの結果は、免疫反応の異常が急速かつ不可逆的に出血によって誘発され、そ して意識回復がこれらの免疫学的変化を修正するのに限られた効果を有すること を示唆する。

ある粘膜表面から別の粘膜表面へ移動するＢおよびＴ細胞の能力のために、細菌 抗原特異的形質細胞の変化の出血後時間経過が、腸固有層から単離された形質細 胞において以前に（Ａｂｒａｈａｍ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２８：１６５．１９９０） 見られたものと似ていたことは驚くことではない。特に、両方の粘膜部位におい て、細菌抗原特異的形質細胞の数の減少が出血後３〜１４日の間に見られた。

これらの研究から、細菌多糖体抗原レバンをリポソーム製剤として鼻腔内に投与 するとき、肺において細菌抗原特異的抗体の抗体価の増加が達成され得ることは 明らかである。リポソーム内に封入して鼻腔内投与した抗原量３８μｇは、経口 免疫感作によりレバン特異的肺形質細胞数を同数だけ増加させるのに要する量よ りおよそ３０倍少ない量であった。粘膜免疫感作法の場合に予期されるように、 血清抗レバン抗体価の変化は免疫動物において見られなかった。リポソームは無 毒性であり、しかも、この研究で明らかなように、多糖体抗原に対する粘膜免疫 応答を高める際に強力なアジュバントとして作用しうるので、それらは免疫無防 備状態の重症患者の院内感染を防ぐことを目的とした鼻腔内および経口ワクチン 製剤において特に有用であるだろう。

院内肺炎は損傷および他の臨床上の疾患の後でしばしば発生する。本実験は、出 血が、たとえ意識を回復した後でさえも、休止している肺Ｂ細胞機能の変化をも たらし、この粘膜表面での感染に対する感受性の高まりと関連があることを実証 している。面白いことには、細菌抗原特異的肺Ｂ細胞クローン前駆体および形質 細胞の消失は出血後すぐには起こらない。その結果として、形質細胞集団に入っ て細菌抗原特異的抗体を産生ずる能力を有するＢ細胞クローン前駆体のかなりの 数が、出血後の最初の２４時間の間肺になおも存在している。これらの結果は、 出血直後の免疫感作が細菌抗原に向けられた肺ｓ１ｇＡ抗体価を高め、そして出 血または損傷後の肺炎への抵抗性を高めることが可能であることを示唆する。本 実験は、リポソーム内に封入した細菌多糖体による鼻腔的免疫感作が肺の細菌抗 原特異的ｓ１ｇＡ抗体価を高めることを明らかにするとともに、このアプローチ が抗細菌粘膜免疫応答を高め、それによって院内肺炎の発生率、並びにこれらの 気道感染症と関連した罹病率および死亡率を下げることを介して、重症患者にお いて有効でありうることを示唆している。

肺における抗原特異的分泌抗体応答に対する細菌多糖体を含むリポソームへのＩ Ｌ−２のカプセル化の効果は、２５μｇのレバンと漸増量のＩＬ、−２（０〜０ ．２μｇ、すなわち０−１０μｇ／ｋ　ｇ）を含むリポソームでマウスを鼻腔内 免疫することにより研究した。１週間後、動物を犠牲にし、肺を洗浄し、そして 洗浄液中のレバン特異的１ｇ抗体価を上記のようにＥＬＩＳＡで測定した。さら に、肺のリンパ球を単離し、肺１組あたりの全形質細胞数およびレバン特異的形 質細胞数をＥＬＩ　ＳＡ斑点検定（実施例２参照、Ｓｅｄｇｗｉｃｋ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５７：３０１゜１９８ ３）を用いて数えた。血清も集め、抗レバン抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。

表４ ＩＬ−２の存在下でのレバン特異的免疫応答分泌　全体　ＩｇＡ ＩＬ−２″　ＩｇＡ抗体価５　原形質細胞　原形質細胞０．０　０．１７２±０ ．０５７　４．０±０．５　３．６±０．９０．１　０．１５２±０．０２９　 ２．４±１．０　２．４±１．０１．０　０．２９０土０．０２８　９．３±１ ．０　８．３±１．０１０．０　１．０２３±０．１６９　３３３．０±５０． ０　２９６．０±４３．０ａ　μｇ／ｋｇ、それぞれ０．０．００２．０．０２ および０．２０μｇに等表４に示すように、］、０１１ｇ／ｋｇのＩＬ−２を含 むリポソームで免疫したマウスにおいて、肺洗浄液中の抗しバンｓＩｇＡ抗体価 の有意な増加（ｐ＜０．０１）が見られた。さらに、ｌμｇ／ｋｇのＩＬ−２を 含むリポソームで免疫した後のマウスでは、肺抗レバン抗体価のわずかではある が有意な（ｐ＜０．０１）増加が見られた（レバンを含むがＩＬ−２を含まない リポソームで免疫した対照マウスではＯＤ＋ｓｏ　ｏ、ｌ　７２±０．０５７に 対して０．２９０±０．０２９）。少量のＩＬ−２（すなわち、０゜１ａｇ／ｋ ｇ）で免疫したマウスでは、肺の抗しバンｓＩｇＡ抗体価の変化が見られなかっ た。免疫マウスからの肺洗浄液中の抗原特異的ｓ１ｇＡ抗体価の大きな増加とは 対照的に、ＩＬ−２含有リポソームで鼻腔内免疫した後では抗原特異的ＩｇＭま たはＩｇＧ抗体価の変化がまったく起こらなかった。同様に、ＩＬ−２含有リポ ソームで鼻腔内免疫したマウスのいずれの群においても、対照の非免疫マウスと 比べて、血清抗レバン抗体価の有意な変化がなかった。

レバンと１０μｇ／ｋｇのＩＬ−２を含むリポソームによる鼻腔的免疫感作は、 レバンを含むがＩＬ−２を含まないリポソームで免疫した後に存在するレバン特 異的原形質細胞の数と比較して、８０倍以上の該形質細胞の数の増加をもたらし た。レバン特異的原形質細胞の９０％以上がＩｇＡを産生じた。レバン特異的原 形質細胞の数は、ｌμｇ／ｋｇのＩＬ−２を含むリポソームで免疫した動物にお いて約２倍増加した。これより低い用量のＩＬ−２を受け取った動物では、肺洗 浄液中のレバン特異的形質細胞数の変化が見られなかった。

（本頁以下余白） 表５ 形質細胞の頻度に及はすＩＬ−２の影響０、１　２４６０±２５０　２２８０± ２１０ａ　ｕｇ／ｋｇ、それぞれ０．０．００２．０．０２および０．２０μｇ に等しい べての原形質細胞の０．１４％がレノくン特異的であった。これ１こにつき単離 された形質細胞の総数は、レノくンのみを含むリポソ−ム内質細胞たマウスでの ３７１２±３４０から１０μｇ／ｋｇのＩＬ−２を含むリポソームで免疫したマ ウスでの７４０８±６８８へと増加した。注目すべきことは、肺の形質細胞数に 対するリポソームカプセル化ＩＬ−２の増強作用が、肺の形質細胞数に対するＩ Ｌ−２のアジュバント効果とやや異なっているようであり、また抗原特異的形質 細胞数の増加に対するＩＬ−２のアジュバント効果とやや異なっているように思 えることである。１ａｇ／ｋｇのＩＬ−２を含むリポソームによる鼻腔的免疫感 作は、ｌＯμｇ／ｋｇのＩＬ−２をリポソームに保持させたときに見られたもの に匹敵する原形質細胞の総数の増加をもたらした（１０μｇ／ｋｇのＩＬ−２を 含むリポソームでは肺１組あたり７４０８±６８８個の形質細胞に対してｌμｇ ／ｋｇのＩＬ−２を含むリポソームでは肺１組あたり７８８５±６６０個の形質 細胞）。これに対して、肺１組あたりのレバン特異的形質細胞の数は、リポソー ム内に含まれるＩＬ−２の量をｌμｇ／ｋｇからＩＯμｇ／ｋｇに変えたとき、 ９±１から３３３±５０へと３５倍以上増加した。

先の実験は肺における細菌抗原特異的な分泌抗体応答に対するリポソームカプセ ル化ＩＬ−２の強力なアジュバント特性を実証したので、おそらく、リポソーム 内にＩＬ−２を保持させることは、抗原特異的ｓ１ｇＡ抗体価をなおも増強しつ つ、低下した抗原用量の使用を可能にするだろう。この問題を取り扱うために、 ２．５μｇのレバンと０．２μｇのＩＬ−２（すなわち、１０μレバン特異的ｓ １ｇＡ抗体価およびレバン特異的原形質細胞の有意な増加が見られなかった。こ のことは、ＩＬ−２を含めることが免疫性抗原の１０倍減少を補償するのに十分 なほど抗体産生を増強し得ないことを示している。

ＩＬ−２とレバンのリポソームカプセル化に関連した細菌多糖体抗原特異的な分 泌抗体応答の増強が他の細菌多糖体の場合にも達成されるか否かを調べるために 、緑膿菌ｌ型多糖体（２５μｇ）単独または０．　２μｇ（７）ＩＬ−２（すな わち、１０μｇ／ｋｇ）と共に含むリポソームでマウスを鼻腔内免疫した。これ らの実験の結果を表６に示す。

嚢」− 緑膿菌多糖体（Ｐ　Ｓ　Ａ）に対する分泌１ｇＡ応答−０．４６６±０．］、３ ９ ２　２５μｇ　０．５８４±０．０７５３　２５μｇ　０．２μｇ　”　０．９ ４１±０．１６７実施例１に示したように、緑膿菌多糖体のみを含むリポソーム での鼻腔内免疫感作は、空のリポソームで免疫した動物と比べて、肺洗浄液中の 抗原特異的ｓＩｇＡ抗体価を高めた（空のリポソームではＯＤ、、。０．４６６ ６±０．１３９に対して緑膿菌多糖体を含むリポソームでは０．５８４±０．０ ７５）。リポソームにＩＬ−２を添加すると、空のリポソームで免疫した動物ま たは緑膿菌多糖体を含むがＩＬ−２を含まないリポソームで免疫したマウスと比 べて、抗緑膿菌多糖体ｓ１ｇＡ抗体価の有意な増加（ｐ＜０．０１）が見られた 。

ＩＬ−４はＢ細胞の成熟化と抗体産生の誘導に影響を及ぼすことがわかっている ので、Ｉ　Ｌ−１１をカプセル化することによる可能なアジュバント効果につい て研究した。しかし、２５μｇのレバンと０．２μｇ（すなわち、１０μｇ／ｋ ｇ）のＩＬ−４を含むリポソームで鼻腔内に免疫したマウスでは、肺洗浄液中の 抗しバンｓＩｇＡ抗体価の有意な増加が見られなかった（対照では０Ｄｔｓｏ　 Ｏ，ｌ　８３±０．０７５に対してＩＬ−４含有リポソームで免疫したマウスで は０．１４４±０．０８１）。さらに、ＩＬ−４含有リポソームで免疫した動物 においては、レバン特異的肺形質細胞がＥＬＩ　ＳＡ斑点検定で観察されなかっ た。

特定の理論によって拘束されることを望まないが、粘膜部位におけるＴ１〕２細 胞の相対的優勢のために、Ｂ細胞応答を支援できるＩＬ−４の十分なレベルがこ れらの解剖学上の位置にすでに存在し、局所ＩＬ−４レベルの更なる増加は付加 的な効果を何ももたらさないのかもしれない。さらに、ＩＬ−４は、Ｂ細胞応答 の初期段階を刺激することができるが、Ｂ細胞増殖（特にＩＬ−２によって誘導 されるもの）に対して抑制特性をも有するという証拠が存在する。これがｉｎ　 ｖｉｖｏの場合ならば、増大した局所濃度のＩＬ−４が、実際に、抗体産生に対 して抑制的な作用を及はすかもしれない。

先に記載した出血モデルを用いて肺炎を防御するためのＩＬ−２含有リポソーム の効果を評価する別の研究を行った。これらの実験では、マウスから３０％の血 液容量を出血させ、２時間後２５μｇの緑膿菌１型多糖体のみ、または２５μｇ の緑膿菌多糖体と０．２μｇのＩＬ−２、もしくは２５μｇのレバンと０．２μ ｇのＩＬ−２を含むリポソームを鼻腔内に投与した。４日後、動物に緑膿菌を気 管内に感染させた。

非免疫マウスまたはレバンとＩＬ−２を含むリポソームで免疫したマウスては、 緑膿菌肺炎の誘発後の死亡率が１００％であった（図３）。緑膿菌多糖体を含む がＩＬ−２を含まないリポソームで免疫したマウスにおいては、生存の有意な改 善が見られなかった。これに対して、緑膿菌多糖体と１０μｇ／ｋｇのＩＬ＝２ を含むリポソームで鼻腔内免疫したマウスでは、死亡率が４５％に低下した（ｐ ＜Ｏ，ＯＯ５）。組織病理学的検査により、細菌の気管内導入後に死亡した免疫 マウスと非免疫マウスの両方の肺には、グラム陰性杆菌の存在を伴う急性の硬化 性出血性肺炎が発症していた。

ＩＬ−２と緑膿菌多糖体を含むリポソームによるマウスの鼻腔内免疫感作は、１ ００％の非免疫マウスが死亡した肺炎モデルにおいて有意な防御をもたらした。

注目すべきことは、ＩＬ−２と他の生物（アエロバクタ−・レバニクム）から誘 導された細菌多糖体（レバン）を含むリポソームによる免疫感作は緑膿菌肺炎に 対して有効てなかったことである。このことは、リポソームを用いた免疫感作に より達成される防御が肺の免疫反応の非特異的増強によるものではないことを実 証している。本実験で肺炎を起こすために使用した細菌の量、５ＸＩＯ’　ｃｆ ｕは、我々が以前に使用した量（この場合も非免疫動物において１００％の死亡 率が見られた）の２倍以上であった。以前の実験では、リポソームに封入した緑 膿菌多糖体（Ｉ　Ｌ　−２を含まない）が肺炎による死亡を部分的に防御するこ とができた。本実験におけるこの製剤の防御の欠如は、おそらく、肺炎を起こす のに用いた細菌の量が多かったことと、リポソーム内に組み入れた多糖体の量が 少なかった（以前の実験では３３μｇを使用したのに対して２５μｇ）ことによ るのだろう。

その他のインターロイキンの有効性を評価するために、ＩＬ−２およびＩＬ−４ について記載したものと類似した実験を、多糖体抗原と共に組換えヒトＩＬ−６ を用いて実施した。結果を表７に示す。

（本貫以下余白） 表７ レバン特異的免疫反応に対するＩＬ−６の効果肺１組あたりの レバン−特異的形質細胞 レバン−特異的 １．０　１０６　９６　１．８９ ５．０　６１　４１　１．７７ ａ　μｇ／ｍｌ、それぞれ０．０．００２．０．０２および０．１０μｇに等し い それぞれの場合に、雄ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２５μｇのレバンと上記の量のヒ ト組換えＩＬ−６を含む懸濁液５０μｍで鼻腔内免疫した。５日後肺を消化し、 肺のリンパ球を精製し、肺１組あたりのレバン特異的原形質細胞の数を先に記載 したようにＥＬＩＳＡ斑点検定を用いて測定した。ここに示すように、リポソー ムへのＩＬ−６の添加はレバン特異的原形質細胞の数の著しい増加をもたらし、 リポソーム内に保持させたＩＬ−６の強力なアジュバント効果を示している。

データから、抗原特異的な原形質細胞のパーセンテージは、鼻腔的投与用のリポ ソーム内にＩＬ−６を保持させた場合におよそ１５倍上昇することがわかる。レ バン特異的原形質細胞のパーセンテージは、単離した肺すンパ球１０’個あたり のレバン特異的原形質細胞の数を、単離した肺リンパ球１０６個あたりの全特異 性肺形質細胞の数で割ることにより計算した。

本発明を十分に説明してきたので、当業者には、本発明の精神または範囲から逸 脱することなく、多くの変更および修飾をなし得ることが明らがだるう。

（日　党υ ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，ＤＥ、ＤＫ。

ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＷ、ＮＬ、 ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ （７２）発明者　チャン、イーハン アメリカ合衆国　９００７７　カリフォルニア州　ロサンゼルス　（ベルエア） 、ソメラロード　１０２４

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．リポソーム内に含まれる免疫原として効果的な量の多糖体抗原を動物に投与 することから成る、動物において多糖体抗原に対する粘膜免疫応答を誘発させる 方法。
2. ２．動物が免疫無防備状態にある、請求項１記載の方法。
3. ３．免疫無防備状態になってから約４８時間以内に、好ましくは免疫無防備状態 になってから約２４時間以内に投与を行う、請求項２記載の方法。
4. ４．リポソームがアジュバントをさらに含む、請求項１記載の方法。
5. ５．アジュバントがリポソームの膜の中にある、請求項４記載の方法。
6. ６．アジュバントがリポイドアミンである、請求項５記載の方法。
7. ７．リポイドアミンがアブリジンである、請求項６記載の方法。
8. ８．アジュバントがリポソームの内部にある、請求項４記載の方法。
9. ９．アジュバントが生物反応改変剤である、請求項８記載の方法。
10. １０．生物反応改変剤がインターロイキンである、請求項９記載の方法。
11. １１．インターロイキンがＩＬ−２またはＩＬ−６である、請求項１０記載の方 法。
12. １２．アジュバントが多糖体抗原と複合体を形成している、請求項８記載の方法 。
13. １３．多糖体抗原が細菌の多糖体である、請求項１記載の方法。
14. １４．細菌の多糖体が多価である、請求項１３記載の方法。
15. １５．細菌の多糖体がグラム陰性生物から誘導される、請求項１３記載の方法。
16. １６．グラム陰性生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のメンバ ーである、請求項１５記載の方法。
17. １７．前記生物が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）で ある、請求項１６記載の方法。
18. １８．細菌の多糖体がグラム陽性生物から誘導される、請求項１３記載の方法。
19. １９．グラム陽性生物が連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー である、請求項１８記載の方法。
20. ２０．前記生物が肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ）である、請求項１９記載の方法。
21. ２１．リポソームを腸内に投与する、請求項１記載の方法。
22. ２２．腸内投与が鼻腔内または経口である、請求項２１記載の方法。
23. ２３．動物がヒトである、請求項１記載の方法。
24. ２４．リポソーム内に含まれる免疫原として効果的な量の多糖体抗原を含み、さ らに少なくとも１種のアジュバントも存在する、動物において多糖体抗原に対す る粘膜免疫応答を誘発させるのに有用な組成物。
25. ２５．アジュバントがリポソームの膜の中にある、請求項２４記載の組成物。
26. ２６．アジュバントがリポイドアミンである、請求項２５記載の組成物。
27. ２７．リポイドアミンがアブリジンである、請求項２６記載の組成物。
28. ２８．アジュバントがリポソームの内部にある、請求項２４記載の組成物。
29. ２９．アジュバントが生物反応改変剤である、請求項２８記載の方法。
30. ３０．生物反応改変剤がインターロイキンである、請求項２９記載の組成物。
31. ３１．インターロイキンがＩＬ−２またはＩＬ−６である、請求項３０記載の組 成物。
32. ３２．アジュバントが多糖体抗原と複合体を形成している、請求項２８記載の組 成物。
33. ３３．アジュバントがリポソームの膜の中にあり、かつアジュバントがリポソー ムの内部にある、請求項２４記載の組成物。
34. ３４．リポソームの膜の中にあるアジュバントとリポソームの内部にあるアジュ バントが異なっている、請求項３３記載の組成物。
35. ３５．リポソームが単ラメラである、請求項２４記載の組成物。