JPH07500840A - 薬物担体としてのヘモグロビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 薬物担体としてのヘモグロビン 関連出願の説明 ロｏｆｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｎａｇａｉ．　０７／１９４，３３８、１９８８年５ 月１０日出願、現在米国特許第５，　０２８，　５８８号、Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ ．　Ｉｎｃ．所有の特許発明は代用血液としての酸素親和性突然変異ヘモグロビ ン、ならびにα、βグロビン非赤芽細胞［ｎｏｎｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　ｃｅｌ’ ｌ］の発現に関する。

ＨｏｆｆｍａｎとＮａｇａｉ．　１９８９年１２月１日出願、米国特許出願第０ ７／４４３；９５０号は、ある種のジシステインが付加されたヘモグロビン突然 変異体について開示する。これは出願第０７／１９４３３８号の一部継続出願で ある。Ｈｏｆｆｍａｎらの、米国特許出願第０７／６７１，　７０７号、１９９ ０年５月１０日出願は、酵母におけるヘモグロビンの発現、αグロビン、βグロ ビンのポリシストロニツク同時発現、生物学に活性な四量体ヘモグロビンのイン ビボ会合［ａｓｓｅｍｂｌｙ］、ジアルファグロビンおよびジベータグロビンの 偽二量体の産生と増大された血管内保持力のある偽四量体ヘモグロビンの会合に おけるそれら偽二量体の使用法について記載している。ＢｏｆｆＩＩＩａｎらの 、１９９１年１１月８日出願の「ヘモグロビン及びその類似体の産生ならびに使 用法」と題する米国特許出願第０７／７８９１７９号、Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ 　Ｎｏ．　ＨＯＦＦＭＡＮ５Ｂ−ＵＳＡは、第０７／６７１７０７号の一部継続 出願であるが、ヘモグロビンのモノシステイン突然変異体ならびに八量体その他 の偽二量体などを利用して構築した多量体ヘモグロビンの産生ならびに使用法に ついて記載している。上記した出願に言及して本明細書中に取り込むものとする 。

発明の背景 発明の分野 本発明は血液中に薬物を制御して放出することに関する。

従来技術 多くの薬剤［ｐｂａｒｉｌａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］は腎臓のクリアランス、ある いは急速な代謝にため血流中にあって比較的短い半減期しかもたない。このこと は特に、約５０．０００〜７０．０００ダルトンとい、う腎臓濾過限界より小さ なポリペプチド型薬剤にについて真実である。最近では多くの製薬会社や研究所 などが人体中における薬効期間を延ばすことを目的に膨大な時間と経費を投入し ている。

患者が薬物をより少な（しか取らないことには非常に多くのメリットかある。例 えば、よりよい服従性［ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ］、人体中濃度の予測可能性、投 与直後の急激な薬物投与から受ける副作用のすくないことなどである。特に予防 薬的に、あるいは長期間に亙って投与されるようなものにあっては、薬物治療は もし少なくて済むものなら、患者にとって容易に受け入れられるものとなる。

非経口投与される薬物治療にとって、あらゆる注射は感染の危険や一種の苦痛を 伴うものである。多くの患者が種々の薬物を継続的または頻繁に注射される必要 があるためだけで入院させられている現状もある。もし薬物投与がこれまでより 少ない回数で済むなら、治療費の一部は不要となろう。

人体からの薬物の急激な消失の問題を克服するため、患者がより長い時間服用効 果を享受することができるように１回に非常に多量の服用量を投与することがあ る。しかしそのような多量の服用量はより明確な有害効果をもたらす場合がある 。

あるいは遅溶出性または難分解性の助剤を薬物に交ぜ混ませることもある。梅毒 感染や連鎖球菌感染の処置に、あるいはリウマチ熱の予防処置として、アンモニ ウムステラード［ａｍｍｏｎｉｕＩｎｓｔｅｒａｔｅｌ中に入れた少量ドーズの ［１ｏｗ−ｄｏｓｅ］ぺ冊シリンを使うことはその１例である。ワクチンの効力 を高めるためにフロインドアジュバントを使うことも１例である。Ｎ−（２−ヒ ドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマーのようなポリマーも候補に挙げ られている（ＳｅｙＩＩｏｕｒら、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ ａｎｃｅｒ。

６３（６）：８５９−６６　（１９９１）））。薬物と担体［ｃａｒｒｉｅｒ］ とのゆるいイオン−イオン結合を薬剤の遅放出に利用することが米国特許第４３ ７４９３２号に記載されている。薬剤のあるもの、例えば避妊剤［ｃｏ。

ｔｒａｃｅｐｔｉｖｅｓ］などは、何カ月、何年というような長期間に亙る非常 に緩慢な放出をさせるため、担体に強固に結合されている。

同期間に毎日ピルを取り続けるよりも患者は楽なのでこのようなものの方か喜ば れる。そのほか遅効性にする手段はインシュリンポンプ［１ｎｓｕｌｉｎ　ｐｕ ｍｐ］である。

臨床医は、主要成分である薬物の排出速度もしくは代謝速度を遅らせるだけの目 的で、別の薬物を同時に投与するまでしてみて長期的投薬の正しいことを確認し ている。人体中の高ドーズ［ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ］のペニシリンその他の類似の 化合物の半減期を延ばすという唯一の目的で、プロベネシトを投与することか、 ここ数十年、淋病その他の疾病の標準的処置であった。

薬効増強を目的に薬学者［ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｓ］が化合物構 造を改変する研究をしてきたように、薬理学者は人体における化合物の滞留（レ ジデンジ−）　［ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ］を増強させるため改変を研究している。

この古い例はよく知られた薬剤のアセチルサリチル酸（アスピリン）で、これは サリチル酸の誘導体より長い半減期をもつ。薬物かある特定の血清タンパク質に もっと容易に結合するように、そしてそれによって人体中で半減期を延ばすよう に、薬物設計することも研究の１法である。しかし薬剤の全部か簡単に改変てき るようなものてはなく、臨床医は単純な薬物改変だけで実現可能なものより高い 滞留時間を達成することを望んでいるのである。

ポリペプチドの薬剤は特別な問題を投げかけている。代謝ならびに腎臓クリアラ ンスという従来の化学的薬物に認められる問題に加えて、種々の体液はカルボキ シ〜およびアミノペプチダーゼは勿論、血清ジペプチジルペブチダーセ■のよう なエントペブチダーセを含有している。これら体液は多くの治療薬ペプチドを急 速に劣化することかできるもので、これらペプチドの多くはフリーペプチド［ｆ ｒｅｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ’］での半減期（ＴＩ／２）は分単位である。肝臓によ る取り込み［ｕｐｔｋｅ　ｂｙ　ｔｂｅ　１ｉｖｅｒ］および親油性［１ｉｐｏ ｐｂｉｌｉｃｉｔｙ］はポリペプチドをその作用部位から除去するように作用す る。（Ｂｒｏｇｅｒら、耽助如μ旧Ｕ【匹可競、５ｕｐｐｌｅｔ＋ｅｎｔ　４： 　８　（１９８５））ポリペプチド薬物を誘導体化［ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ］す れば分解速度を減速することができよう。例えばＮ−アシル化はアミノペプチダ ーゼの作用を阻止し得るものであり、多くのカルボキシ末端の修飾がカルボキシ ペプチダーゼを制限することを目的に提案されてきた。さらにアミノ酸の種々の 類似体を使用すること、異常な側鎖部分のあるものや非ペプチド結合のもの、あ るいはＤ−アミノ酸の類似体か、プロテオリシス（タンパク分解）を抑制するも のとして提案されている。

生命体と両立性の［ｂｉｏｃｏｍｐａｔａｂｌｅコ緩慢放出性［ｓｌ□ｗ　ｒｅ ｌｅａｓｅ］ポリマーを、ある一定期間ペプチド放出させるのに使うことができ る。注射可能なポリ−（Ｄ、Ｌ）乳酸／グリコール酸のコポリマーマイクロスフ ェア（小球）　［ｍ１ｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ］が経口投与の場合の緩慢なポリペ プチド放出に使われている。ポリエチレングリコールおよび多糖のマトリックス も同様な理由で使われている（口１ｌｂｅｒｔ、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏ旦ｙ、　９（１）：　１１−１７　（１９９１）および欧州特許 出願第３８１７１９号）。外科的に埋め込まれたポリ無水物［ｐｏｌｉａｎｈｙ ｄｒｉｄｅｌのディスクまたは「半球体Ｊ　［ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅｓ］が、１ ００日間を超える期間に亙って大きなタンパク質を緩慢に放出させるのに使われ ている。舌下、口内吸収、および粘液による表面デリバリ−［５ｕｒｆａｃｅ　 ｄｅｌｉｖｅｒｙ］のような他の薬物運搬法（ドラッグデリバリ−）も多くの可 能性ある薬剤を使って試みられたが、緩慢放出効果はなお不十分であった。

生物学的に活性なポリペプチドは、欧州特許出願第４１３６２２号及びＲｅｔｔ ｅｎｍａｉｅｒら、Ｇ　ｎｅｃｏｌ、　０ｎｃｏ１．．２７（１）：　３４−４ ３　（１９８７）に記載されているように、開裂不可の［ｎｏｎ−ｃｌｅａｖａ ｂｌｅ］リンカ−を介してアルブミンに化学的に結合することができる。エリス ロボエイチンのような生物学的に活性な物質がアルブミン上に吸収させられたり アルブミンと複合体を作ったりしている（米国特許第４．８７９．２７２号原び 第３．９８０．７６４号）。その他多数のポリペプチドやタンパク質か薬物運搬 系（ドラッグデリバリ−システム）として提案されてきた。例えばフィブロネク チンの一部分（日本特許第３１２３７９９号及び第１２６１３９８号、１９９１ 年５月２７日、１９８９年１０月１８日）、膜タンパク質（ドイツ特許第３９３ ８９５３号）、エラスターゼの組換え部分（Ｗｏｌｆｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ 　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　、　４（３）：　３１３−３１７（１９９１））、（ 複数種の）レクチンの組合せ（欧州特許出願第３３７７９９号）、コラーゲン（ 米国特許第４．２９１．０１３号及び第４．８４９．１４１号）、種々の血清タ ンパク質および血清組成物（米国特許第４８６８１５８号、第４８４３８５６号 第２欄、第３行および第４９１８００８号）、抗体およびそのフラグメント（米 国特許第４．４７４．８９３号。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８５（１１）：　３ ９９０−３９９４　（１９８８）、欧州特許出願第３９６３８７号およびＰＣＴ 出願第９１１０９１３４号）その他の標的タンパク質（欧州特許出願第２３８６ ４５号）がある。

非古典的な［ｎｏｎ−ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ］ペプチドも薬物担体として使わ れている。Ｔｏｏｔｈらはアミド、エステルその他の不安定リンクを使って薬物 運搬性を向上するため、ペプチドに脂肪化合物を結合することによって膜溶解性 ［ｍｅｍｂｒａｎｅ　５ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ］を高めようと試みた。同様な方法 が米国特許第４．４９７．９３２号及び第４゜５４０、５６４号でも使われてい る。偽ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖にある官能基に薬物を付加することが試みら れたこともある（Ｌａｎｇｅｒ、　Ｉｂ１ｄ１．　ｐＨ３）。

炭水化物その他の高分子もタンパク質藁物担体として使われている。（Ｆｕｊｉ ｔａら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ＲｅＩｅａｓｅ、　１ １　（Ｌ３）：　１４９−１５６　（１９９０））薬物は種々の担体と次のよう なさまざまな方法で結び付けられている。例えば吸収、捕捉［ｅｎｔｒａｐｍｅ ｎｔ］、化学的結合、ならびにリポソームまたは小包内でのものがある。ある種 の担体は人体にゆっ（つと吸収され、それによってその担体が分解するにしたが って薬物か放出される。おそらく最も安定（７ているのは担体薬剤に薬物を化学 的に結合するものであろう。しかしその結合があまりに強すぎるときは薬物が自 由な機能を有する形になって放出されることかなくなる。たくさんの結合形［１ ｉｎｋａｇｅ］が採用されている。例えば酸に不安定で光に不安定な架橋［ｂｒ ｉｄｇｅｓ］がある（欧州特許出願第１８５７６２号、第１９１７７２号）。グ ルタチオン、システィン、ホモシスティン、およびγ−グルタミルシスティンの ような還元剤の血清中ての低濃度存在によってジスルフィド結合は血液中でゆっ くりと開裂［ｃｌｅａｖｅｄ］される。

エステル結合およびペプチド結合は酸性状態またはアルカリ性状態で、またはタ ンパク質分解で開裂できるか、これらは全て人体の各所で生起することができる ものである。

しかしタンパク質の多（は血管外空間に１漏れ」る性質があるから、これら薬物 のどれ一つとして血流中に特異的に制限されてはいない。また、運搬系（デリバ リ−システム）からの治療薬の放出は殆ど制御できないことなので、また、付加 の状態はランダムで化学的に均一に限定されているものではないのか殆どである 。しかも担体に接合［ｃｏｎ　ｊｕｇａ　ｔｅ］される薬物量を押し込めること ［ｃｏｎｓｒａｉｎ］は、担体分子に多数の無制御な活性部位があるので、困難 である。このように単分散形成は上記のような担体では不可能である。これらす べてのファクターが目的薬物の放出のされ方を変えているのである。

撮像分野にも同様な問題かある。トレーサー物質を運搬するために種々の担体が 使われているが、血液からの急速なりリアランスかあるため問題となっている。

アルブミンのように比較的長く続く担体（米国特許第４．０４２．６７７号）が 試用されているか、アルブミンは局在特異性がないから、血流から「漏れ」てし まい理想的な撮像からは程遠いものとなる。

発明の概要 本発明はヘモグロビンを薬物担体として利用することに関する。ヘモグロビンは 部位特異的に修飾することかできる内因性［ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ］の高分子量 タンパク質て、組換え技術を使って発現させることができるから、薬物の安定性 を向上させ血管的保持力［１ｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎコ を強化することによって薬物運搬ヲコントロールするのに使うことができるヘモ グロビン様タンパク質をもった特殊な新規の接合体［ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ］を 選択的に設計することができる。しかもヘモグロビン様分子およびリンカ−分子 への接合部位［ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ］を適切に選択することによ って、薬物のインビボ挙動を特別に制御することかてきる。これまて使われてい る種々の薬物担体とは違って、本発明ではあらゆる薬物の担体として、特に血清 タンパク質てはない薬物の担体として、あるいは正常ヒトヘモグロビンのそれよ り短時間の血管的保持力しかない血清タンパク質の薬物の担体として、ヘモグロ ビンを使用することを考察している。ペプチド性薬物［ｐｅｐｔｉｄｅ　ｄｒｕ ｇｓ］は、遊離形て［ｉｎ　ｆｒｅｅ　ｆｏｒＩＩ＋］タンパク質の加水分解に 感受性なのて［５ｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ］、このような運搬に特に優れて いる。この薬物運搬系（ドラッグデリバリ−システム）は血流中における薬物に 安定性および緩慢放出性を提供するものである。

突然変異体ヘモグロビンから普通得られる曲管内半減期は数時間のオーダーであ るから、本発明は薬物運搬維持にとって特に有益で、血清半減期が１時間未満の ペプチド性薬物には特に有益である。しかし本発明はそのような薬物の運搬にだ け限定されるものではなく、特にヘモグロビンの半減期は遅緩ノ１ブトグロビン 結合の突然変異によって引き延ばされるのであるから限定されない。

ヘモグロビンは（赤血球老化の結果として）組織内にてはなく血液中に普通に存 在するので、薬物−ヘモグロビン接合体はタンパク質担体中でよりも血流中での 方がよりよく保持されるであろうと期待される。体内を移動するアルブミンその 他のタンパク質は、薬物の放出速度を変更する原因となると考えられる各臓器ご との著しい環境変化にさらされている。これに対して血液は静脈血液、動脈血液 間の酸素圧差［ｏｘｙｇｅｎ　ｔｅｎｓｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｌを除 けば比較的均一である。また、ある種の薬物は特定の組織に対して他の組織に対 するより毒性である。血液中に薬物を、それかゆっくり放出されるまで集中させ て維持することにより、過去に観察された毒性の問題の多くを回避することかで きよう。また、遊離した組換えヘモグロビンを高い濃度で血液中に得ることかで きるので、低い効力の薬物を投与することが有効となる。

本発明はまた、生物学的に活性な分子を分解から保護することにも関する。立体 的要素、電気的微環境、ヘモグロビンの身体内局在部位［ｐｈｙｓｉｃａｌ　１ ｏｃａｔｉｏｎ］、リンカ−の長さ、標的分子の付加部位などについて考察して ヘモグロビンへの薬物の付加部位を慎重に選択することは、内因性排出［ｅｎｄ ｏｇｅｎｏｕｓ　ｒｅｍ。

ｖａｌ］メカニズムから薬物を保護することを向上させることになる。

本発明はまた、生物学的に活性な化合物と酸素のほぼ同時的な運搬にも関する。

化学療法剤［ｃｈｅｍｏｔｂｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓｌは酸素存在下 での方が効果的である。化学療法で患者を処置後にパーフルオロカーボン［ｐｅ ｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎｓ］を投与することか提案されているが、これは酸 素を剥奪された腫瘍の内部が酸素を得れば化学療法剤の作用を助けるであろうと 期待されているからである。本発明は、酸素を追加的に供給するだけでなく、多 量の酸素を放出するのに使われるもので、薬物か実質的にそれと同時に、例えば 化学療法剤の効果を向上させるものである。

また本発明は、さまざまな組織中を流れる血液を測定するための造影剤を提供す ることも目的とする。

薬物担体としてアルブミンは、いくつかの観点でヘモグロビンより劣っている。

これまで十分に考えられたことがない点の一つは、アルブミンか３４個のシステ ィンをもっており、したがって自然におりたたまれたアルブミン中のこれらシス ティンは１７個のジスルフィド結合に関与していることである。もしアルブミン が遺伝子工学で作られた細胞中に発現され天然源に依存しなくても済むようにな ったら、そのポリペプチドはヒト細胞中で実際されているように必ずしもおりた たまれる必要はなくなるであろう。ジスルフィド結合形成のトポロジー［ｔｏｐ ｏｌｏｇｙ］は分子ごとに異なり、多分散組成となっている。ある分子は不安定 で、接合された薬物を初期に放出するであろう。

アルブミンのシスティンが架橋可能な部位として使われるなら、いくつかは薬物 に架橋し、ほかは別のアルブミンシスティンに架橋するということになろう。こ こでもまた無数の異形［Ｖａｒｉａｎｔｓ］が生起される。あるものは急速に分 解するであろうが、ほかのあるものは薬物をあまりに保護してしまうので、必要 な時に放出しないというようなことが起こるであろう。ロット間の一致がなくな るのである。

各ヘモグロビン四量体には６つのシスティンがある。２つは各βグロビンサブユ ニットに、１つは各αグロビンサブユニットにある。この四量体が変性させられ ない限り、β９３システインだけが試薬に反応し、このシスティンは薬物設計者 が希望するように、架橋部泣きして使うか、あるいはそれをセリン、アラニンま たはトレオニンのような類似のアミノ酸で置き換えることで中和する。アルブミ ンの多数のシスティンが安定性に影響することなく「中和」されることはあまり ないこ吉である。

ヘモグロビンは反応性チオールを僅かながら有しており、その数は部位特異的突 然変異生成［ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ］でコントロールすることができるので、 ヘモグロビンはアルブミンよりすっと有利である。

好ましい実施例の詳細な説明 本発明は薬物のようなリガンドを、場合によってはリンカ−を介して、ヘモグロ ビン様タンパク質に会合［ａｓｓｏｃｉａｔｅ］することによって、運搬及び／ 又は安定化する系に関する。以下に本発明の要素であるリガンド、ヘモグロビン 及びリンカ−につき詳細に述べる。

丈左−イ下 ヘモグロビンに結合する化学物質［ｃｈｅｍｉｃａｌｓ］は構造的にも機能的に も種々多様である。合成薬剤［５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｕｇｓ］、核酸、ポリ マー、その他のタンパク質、特にポリペプチドまたはオリゴペプチドなとを含む 実質的にあらゆる有機化合物か、ヘモグロビンに会合または結合して、安定化、 緩慢放出化、血管系またはヘモグロビンの分解に通常関与している組織（肝臓、 腎臓、肝臓）への局在化［１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ］に貢献している。なお本 明細書で「薬物Ｊ　（ｄｒｕｇ）との用語は例としてのものであって限定的に解 されてはならない。

バイオアクティブ［ｂｉｏａｃｔｉｖｅ］な多数のペプチドをヘモグロビンに結 合するペプチド性薬物として使うことができる。次に挙げたリストは代表的なも のであって可能な薬物をもらさず挙げたものではない。そこに示されたペプチド は、ペプチドの治療薬としての可能性［ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌを示すために試験 された化合物のずっと多大なセットから取られた僅かな例にすぎない。しかし接 合［ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｌに先立ちこれらペプチドの類似体を構築するので あるが、これら類似体はヘモグロビンによる適切なる運搬にとって必要な修飾さ れた付加部位、リンカ−の腕、スペーサーその他のエレメントをもたらすように 構築する。

これらのペプチド、またはこれら以外の同じ分類内から得られる類似のペプチド は、ペプチド化学に通常の知識を有する者であれば容易に合成することができる 。しかし本発明はペプチド型薬物の運搬だけに限定的に解されるへきものではな い。

Ａ、抗血栓剤［ａｎｔｉｔｂｒｏＩ［１ｂｏｔｉｃｓ］１、　ＲＧＤＷまたはそ の類似体。このペプチドは血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体−フィブリノ−ケ ン相互反応によって仲介される血小板凝集［ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｇｇｒｅｇａ ｔｉｏｎｌを阻止する。マウスの抗血栓症アッセイのＩＣ５ｏは１４μＭである 。

２、　Ａｃ−ＲＧＤＹ（Ｍｅ）−ＮＨｚまたはその類似体。この化合物は上記と 同様に１０μＶのＩＣ５ｏて血小板凝集を聞書する。血漿アミノペプチダーゼに 対してＮ−アセチル化により安定化される。

３．　Ｎ−スクシニル−ＹＥＰＩＰＥＥＡ＾−Ｃｈａ−Ｅｎまたはその類似体。

下付きのＤはＤ−アミノ酸で、Ｃｈａはシクロヘキシルアラニンである。

この化合物はヒトα−トロンビンの合成インヒビター（阻害剤）でＩＣ５ｏは２ ９ｎＭである。これはまたマウスの抗凝血剤［ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ］と しても有効である。この化合物は肝臓で除去されるから、ｆｉｂのような大きな 分子に付加し、それから緩慢に放出することは血清の半減期を劇的に延ばすこと ができる。

４、　Ａｃ−ＣＲＧＤ−ペニシラミン：ＮＥＩ２またはその類似体。この化合物 は４μ麓のＩＣ５ｏで冠状動脈内注射によりイヌにおける血栓形成を阻害する。

この化合物はアミン末端システィンを介してヘモグロビンにリンクされる。

Ｂ、抗増殖剤［ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓ］または抗転移剤［ａｎ ｔｉｉ＋ｅｔａｓｔｉｃｓ］ １、　Ｐｒ−ＢＷＡ−ＶｄＡＨ（Ｍｅ）Ｌ−ＯＭｅまたはその類似体。この化合 物はスイス３ｒｄ繊維芽細胞のボンベシンで賦活される突然変異生成のアンタゴ ニストとしてＩＣ６゜値３．３ｎＭである。そのラットにおける半減期は皮下投 与で２．５時間である。この薬物はカストリン放出ペプチドの、また小細胞肺ガ ンにおける作用増殖因子［ａｎ　ａｕｔｏｃｒｉｎｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔ ｏｒ］の、潜在的なアンタゴニストとして開発された。より長い期間での作用が 好ましいのである。

２、　（Ｄ−ｐ−ＣＩ−ｐｈｅ）−ＱＷＡＶＧＨ（β−１ｅｕ）−Ｍ−ＮＯ１２ またはその類似体。

この化合物はガストリン放出ペプチドの結合を抑制することにつきＩＣｓ。が０ ．８ｎＭで、繊維芽細胞によるチミジンの取り込みを抑制することにつき５．２ ｎＭである。同様な類似体は胸腺除去マウス［ａｔｈｙｍｉｃ　ｍ１ｃｅ］に植 付けた腫瘍を小さくするρが認められた。

３、［Ｄ−ｐｈｅ６］−ＱＷＡＶＧＨＬＭ−ＮＯ３及び［Ｄ−ｐｈｅ６］−ＱＷ ＡＶＧＨＬＭ−ＯＭｅまたはそれらの類似体。この化合物はテンジクネズミ細葉 細胞癌［ａｃｉｎｉ］からのボンベシン放出の抑制、ならびにスイス３Ｔ３繊維 芽細胞の増殖の抑制につき、ＩＣ５ｏが２４３と２９ｎＭ、及び２ｎＭと０、１ ６７ｎＭである。Ｎ−プロピルアミドの類似体をラットに１００ｎｉ＋ｏｌ／ｋ ｇ注射した所、ボンベシン刺激による膵臓アミラーゼ放出を６０分間阻害した。

４、ＲＧＤポリマーまたはその類似体。これらの化合物はインビボでの肺腫瘍転 移を阻害する。血液中のペプチド持続性［ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ］を増大する 条件としては、例えば血管的反復注射、薬効［ｅｆｆｉｃａｃｙコの増大かある 。５ａｉｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４９：　ｐ。

３８１５、　（１９８９）。ラミニン配列ＹＩＧＳＲとの同時注射も薬効をさら に増大することができる。ヨウ素化されたペプチドの約９７％が１時間で血液か ら除去［ｃｌｅａｒｅｄ］された。

５、　ＧＲＧＤＳまたはその類似体。この化合物はネズミＢ］、６−ＦＩＯメラ ノーマ細胞の転移を阻止する。Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１：　ｐ、　７８２　（１９８８）。ペプチド（循環半減 期８分）の６マイクロモル（２，９ｓ＋ｇ）は、１４日後に数えたとき転移を９ ０％明止する。

６、［１１ＮＨｚ］−ＦＩＧＳＲ−アミドまたはその類似体。この化合物はマウ スのメラノーマ転移を阻止する。このペプチドは基底膜においてラミニンに結合 する腫瘍細胞ラミニン受容体のアンタゴニストとして設計された。

Ｃ０抗高血圧剤−レニンインヒビター １、　Ｂｏｃ−ＢＰＦＨＬ−ＣＦＩ（ＯＨ）−Ｃ１２−ＶＩｆｌまたはその類似 体。この化合物はヒト血漿レニンの抑制につきインビトロ　ＩＣ５ｏか０．０２ ｎＭである。

Ｄ、ヒト、子ウシまたはヒツジ成長ホルモン放出因子の類似体１、　ＨＷｏＡＷ ＦｏＫ　ＮＯ３またはその類似体。この化合物はニワトリ、子ヒツジ、ウシ、ブ タ、アカゲザルに効力のある成長ホルモンを放出するペプチドである。ブタにお いて、成長ホルモンの基線値は低く、長期に亙って安定している。本発明の薬物 担体化合物なしに単独で投与した所、静脈内、皮下、または鼻内の注射は血漿成 長ホルモンのレベル（約４５〜７５ｎｇ／ｍｌ血漿）をさまざまな時間帯で（概 して約１時間後におさまったが）、急激に増加させた。服用量は３〜３０μｇ／ ｋｇ（血管内注射）ないし２５〜１００μｇ／ｋｇ（皮下注射）または０．５ｍ ｇ／ｋｇ（経口投与）とした。経時的に増加するレベルは、向上した生物学的効 果をもたらすであろう。これと同じペプチドも治療薬としてヒトに使用されるこ とが仮定される。　Ｙｅｌｌｊｎら、　Ｔｂ１ｄ、、ｐ、２１４（１９９０）２ 、ｖ２、　Ａｌ１、Ｌ２７子ウシＧＲＦ　（１〜２９）−ＮＦＩ２　Ｉ２、　Ａ １５、　Ｌ２７−子ウシ。ＲＦ　ｕ−２ｓ＋−ＮＯ３またはその類似体。これら のペプチドは非常に効果が高く、また長期に継続性で（１１〜１６倍）、血漿ジ ペプチジルペプチダーゼ■に耐性の子ラン成長ホルモン放出因子の類似体である 。これらは親ペプチドよりもインビボ、インステアで［ｉｎ　５ｔｅｅｒｓ］よ り活性であるが、これはより長い血漿半減期および向上された内在性効力［１ｎ ｔｒｊｎｓｉｃ　ｐｏｔｅｎｃｙ］によるものと考えられる。

Ｅ、コレシストキニン類似体。例、食欲減退性物質［ａｎｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ ｓ］としての。

１、　ＤＹ（Ｓ０３）ＭＧｌｆＭＤＦ−ＮＯ３またはＤＹ（ＳＯ３）Ｎ１ｅＧＷ Ｎ１ｅＤＦ−Ｎ１３またはその類似体。この化合物は、おそらくＡ型ＣＣＫ受容 体に結合して飽和しようとしている食欲減退効果のあるＣＣＵ−８類似体である 。膵臓、脳幹、幽門型Ａ受容体への結合ＩＣ５ｏは、０．４〜１．４０Ｍである 。ラットモデルにおける食欲減退の服用量しきい値は０゜０５ｎｍｏｌ／ｋｇで ある。これらの類似体のインビボ長期継続性服用は重大な副作用のない減量計画 に効果的に作用するであろう。

２、　Ａｃ　Ｙｏ（ＳＯ３）ＭＧＷＭＤＦ−Ｎｔ１２またはその類似体。フィー ディングアッセイ［ｆｅｅｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ］におけるＥＤｓｏは腹膜内で １ｍｇ／ｋｇである。ＣＣＫ−Ｂ受容体の７００倍選択性がある高親和性アゴニ ストか最後から２番目の位置にＮ−メチルａｓｐを使って開発された。

これを満腹誘導薬物として試験用に上記アンタゴニストの配列と結合させること ができる。

Ｆ、δ選択性またはμ選択性のエンケファリン類似体。例、ポテンシャル鎮痛薬 として。

１．環状ＯｐｐｕｇｎｏＧＦＰｒｎｏ　［ＤＰＤＰＥ］またはその類似体。Ｄ− ＰｅｎはＤ−ペニシラミンである。これはμ受容体よりもδ受容体を選択する環 状エンケファリン類似体である。この選択性は明らかに、モルヒネのような化合 物に特有のマイナスの副作用を回避するものである。Ｎ−末端２，６−シメチル チロシン環状四量体［４１ｅｒｓ］および三量体［５−ｎｅｒｓ］、デルドルフ ィンＩ　（ＹＤＡＦＤＶＶＧ−ＮＦＩ２）、及び効力あるδアゴニストとして環 状ＨＣｏＦＰｅｎｏの代わりとなるＰｈｅ　３も使うことができる。

２、　Ｐｈｅ３または１ｅｕ３−ＤＰＤＰＥまたはそれらの類似体。この化合物 はμに対するδ受容体の選択性をもち、また上記類似体はμ受容体結合に対して は全く不活性である。しかしδ受容体への結合性は減少しているように考えられ る（ラット脳結合実験におけるＥＣ５ｏは１００〜２００ｎＭ）。デルドルフィ ンのより強い効力の類似体を、ＥＣ５０が０．３６ｎＭである；　３ｅｒ’に対 するａｓｐ’の置き換えも含めて、使うことができる。

３、　ＹＡｏＦＥＶＶＧ　（デルドルフィンＢ）またはその類似体。この化合物 は３０００〜４０００倍もμ受容体よりもδ受容体に対する選択性がある。その 作用はそれらをＣ−末端テトラペプチドに局在化するようである。

４、ｙＲＤＦＫ−Ｎｌ（２、デルモフィン類似体、またはそれらの類似体。この ペプチドは１１．０００倍もδ受容体より末梢μ受容体への選択性があり、末梢 に受容体には結合せず、ｐＨ７，４でネット＋２〜＋３電荷があるため血液／脳 隔壁［ｂｌｏｏｄ／ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ］を通過することができないよ うである。このようにこれはモルヒネと殆ど同じ効力で鎮痛を誘導しく尤もそれ ほど効力持続性はないが）、末梢抗侵害剤［ｐｅｒｉｐｂｅｒａｌ　ａｎｔｉｎ ｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ］の機能を立派に果たすものと考えられる。（Ｂｕｒｇｅ ｎｄｅｒら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　１８；　４２（ｈ４　（１９８８））そのような末梢的作用 のため、呼吸機能低下［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ］およ び依存症のような主要な副作用にも襲われないと考えられる。

Ｇ、血管収縮薬 °　１．エピネフリン ２、アンギオテンシン■ ３、神経ペプチドＹ Ｈ０血管拡張薬 １、心房性Ｎａ利尿因子［ａｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏ ｒ］２、アンギオテンシン変換酵素インヒビター３、レニンインヒビター ４、バソアクティブ・インテステイナル・ペプチド５、エンドセリン−１ ■、抗エイズ薬物 現在有効なエイズ薬品の簡単な概観は３ｉｅｎｃｅの２５３．２６２〜３．１９ ９１年に記載されている。

１、　ＨＩＶプロテアーゼインヒビター。ＨＩＶプロテアーゼは、ウィルスのア ッセンブリや複製に必須のタンパク質に、ｇａｇとｇａｇ−ｐｏｌ前駆体タンパ ク質をプロセッシングする過程に関与する。

インヒビターは旧■の細胞ＤＮＡへの組込みを阻止するものと考えられ、初期的 な臨床実験段階にある。本発明の運搬系を使ってこれらインヒビターを長期に亙 りエイズ患者の血液中に緩慢放出させることはエイズの増殖を妨げ、ほかの薬剤 による感染細胞への攻撃を可能にする。薬剤として注射されたヘモグロビン結合 インヒビターにとって何週間というレンジの非常に長い半減期は有利なことであ ろう。

Ｊ、非（ヒト薬物）リカンド 農業分野ではヘモグロビン安定化化合物が治療法として、あるいは疾病予防法と して植物動物の双方に使われている。成長促進剤、殺虫剤、除草剤、食品防腐剤 、局部洗浄剤、獣医用薬剤などが安定剤及び／又は緩慢放出剤としてヘモグロビ ンを採用できる。

ヘモグロビン 効果的な血管内の薬物運搬剤は広範囲の薬物に容易に接合できるもので、複合体 溶液の適当量でその薬物の効果量を供給するのに十分なだけ血液中に溶解し、所 望の臨床効果を達成するのに必要なだけ長期間に亙ってその薬物を運搬できるも のでなければならない。それはまたその適用されるヒトまたは動物に対して非免 疫的［ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ］でなければならない。調剤者［ｆｏｒ Ｉｌｌｌｕｌａｔｏｒｌが薬物を予め決定しである部位に所望時間の放出特性を 保持して結合することかでき、所望の薬物：担体モル比を達成するように、好ま しくほこの運搬剤は制御可能に結合できるものがよい。また、薬物が組織にあま りに早期に運搬されてしまわないように、担体は本質的に血管系から漏れ出るこ とかないものであることが好ましい。さらに運搬剤は薬物の作用部位に酸素を運 ぶことができるように、酸素に可逆的に結合するものであることか場合によって は好ましい。

１実施例では、曲管内薬物運搬剤はヘモグロビンである。ヘモグロビンは酸素を 呼吸面［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｕｒｆａｃｅｓ］で取り込み内部組織に運 ぶ酸素結合タンパク質である。別の実施例では曲管内薬物運搬剤はグロビン、例 えばミオグロビンである。

ヘモグロビンは水性溶媒中に高度に溶解性である。薬物への結合のため、チオー ルのある薬物、あるいはチオール特異性架を特徴とする特許 る。ヘモグロビンは一つの四量体につき二つしか反応性システィンをもっていな いので（β９３で〕、結合される薬物分子数、および結合部位は容易にコントロ ールすることができる。ヘモグロビンは免疫系にも十分耐えることができる。子 ウシヘモグロビンはヒトに問題なく利用されている。データは不完全であるか、 血管系からのヘモグロビン漏出はアルブミンの場合よりも相当に少ないと信じら れる。ヘモグロビンはまた大きなタンパク質なので、インタクト（完全）な四量 体であるが、腎臓［ｒｅｖｉａｌではな（ｒｅｎａ月の濾過を逃れる。一方それ は食作用および類似のメカニズムによって除去されるには小さすぎる。（ヘモグ ロビンは二量体への解離およびハプトグロビンによる結合に一層の耐性をもつよ うに修飾することができる）。最後にヘモグロビンは可逆的に酸素に結合する。

こうした特徴は、各々単独でも組合せても、血管内の薬物運搬剤にとって好まし いものである。

通常の１−ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ］ヘモグロビンの構造はよく知られている 。我々はここてＢｕｎｎ　ａｎｄ　Ｆｏｒｇｅｔ、　ｅｄｓ、　Ｈｅｍｏ　１ｏ ｂｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ、　Ｇａｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ 　Ａｓ　ｅｃｔ’ｓ　（ＩＦ、Ｂ、　５ＡＵＮＤＥＲＳ　ＣＯ，、Ｐｈ１ｌａｄ ｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ：１９８６）、及びＦｅｒｍｉ　ａｎｄ　Ｐｅｒｕｔｚ　 ”Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ａｎｄ　Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ″、ｉｎ　Ｐｈ１ｌｌｉ ｐｓ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓ、　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏ　ｙ　（Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅ ｓｓ：　１９８１）を引用して本明細書の一部として組み込むものとする。

普通の大人のヒト溶血物［ｈｅＩＩｌｏｌｙｓａｔｅ］の約９２％は口ｇｂＡ（ 二つのα鎖と二つのβ鎖でできているのでα２β２と呼ばれている）である、。

α鎖は１４１のアミノ酸でできている。ヘム（フエロプ０トポルフィリン■）グ ループの鉄原子はｈｉｓ　８７（ｒ基部に近い［ｐｒｏｘｉｌｌａｌ］ヒスチジ ン」）のイミダシルに共有結合している。β鎖は１４６残基の長さく図１２）で ヘムはそれに…９２で結合している。

ポリペプチドの一次構造はそのアミノ酸配列および個々のアミノ酸の側鎖にある 何らかの修飾を同定することて決定される。

鎖の局部的屈曲［１ｏｃａｌ　ｂｅｎｄｉｎｇ］はその二次構造である。ヘモグ ロビン分子の三次構造はアミノ酸残基の立体的関係に帰するが、四次構造はサブ ユニット（鎖）が−緒にバックされたそのされ方に帰せられる。ヘモグロビン分 子の三次および四次構造はヘモグロビン結晶のＸ線回折分析によって判定するこ とができ、それによってその分子の原子の三次元位置を計算することができる。

ヘモグロビンは通常、約１８０日という寿命の赤血球中に保持されている。赤血 球が老化して死ぬと、ヘモグロビンを血流中へ放出する。そこでヘモグロビンは α−β二量体に解離する。

これら二量体は腎臓痘過により、あるいはハプトグロビン結合の結果除去される 。こうして産生じた複合体は血清半減期約１０〜３０分で、肝臓のクツパー細胞 にある受容体によって即座に取り込まれ、そこで代謝される。ヘモグロビンはそ の他のメカニズムでも血清から取り除かれる、例えば遊離したヘモグロビンの肝 臓の実質［ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ］細胞による取り込みがある。

本願における「ヘモグロビン」の用語は、関連分子のファミリーを指す。ヘモグ ロビンは（ヒトを含む）あらゆる動物源がら単離することができ、組換え生物（ トランスジェニック動物を含む）または化学合成によって人工的に産生ずること かできる。

特許請求の範囲の目的のために、ここで「ヘモグロビン」または「ヘモグロビン 様タンパク質」とは、一つまたは二つ以上のヘム補欠分子族を有する酸素結合タ ンパク質をいう。好ましくはそれは（ａ）二つのαグロビン様ポリペプチド及び 二つのβグロビン様ポリペプチド、（ｂ）一つのシアルファグロビン様ポリペプ チド及び二つのβグロビン様ポリペプチド、（ｃ）二つのαグロビン様ポリペプ チド及び一つのシベータグロビン様ポリペプチド、（ｄ）一つのシアルファグロ ビン様ポリペプチド及び一つのシベータグロビン様ポリペプチド、（ｅ）一つの 融合α／βグロビン様ポリペプチド及び個別のαグロビン様ポリペプチドとβグ ロビン様ポリペプチド、または（ｆ）二つの融合α／βグロビン様ポリペプチド 、からなる一つまたは二つ以上のへテロ四量体である。一つの四量体のポリペプ チドはもう一つの四量体のポリペプチドに架橋されるか遺伝子的に融合されても よい。ヘモグロビンは、四つ以上のグロビンサブユニットまたはドメインててき ているときは、多量体［ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ］であると言う。ここで［多量体 Ｊ　［ｍｕｌ　ｔｉｆＩｅｒｉｃ］とは、六量体［ｏｃｔａｍｅｒｉｃ］へモグ ロビン（二つのリンクされた四量体［ｔｅｔｒａｍｅｒ］を含み）、その他の亮 次の多量体［ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ］をいう。

ヒトαグロビン様のドメインまたはポリペプチドは生ヒトαグロビンまたは生配 列とは一つまたは二つ以上か置き換えられたり、欠失されたり、挿入されて、違 っているその突然変異体であるが、残りはヒトαグロビンと実質的に相同（後に 定義する）な、ヘムを取り込み［１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ］βグロビンと会合［ ａｓｓｏｃｉａｔｅ］することかできるものである。βグロビン様ドメインよた はポリペプチドは類似体として定義される。ヒトαまたはβグロビンと十分相同 な動物ヘモグロビンまたはその突然変異体のサブユニットは、「ヒトαまたはβ グロビン様ドメインまたはポリペプチド」という言葉に包含される。例えば子ウ シヘモグロビンのサブユニットはこの言葉の範囲内である。α−及びβ−グロビ ン様ポリペプチドは集合的に「グロビン」と呼ばれることもある。便宜上「ポリ ペプチド」の言葉はより長いポリペプチド鎖の単一の鎖［ａ　ｕｎｉｔａｒｙ　 ｃｈａｉｎ］またはドメイン［ａ　ｄｏｍｅｉｎ］をいうものとする。

「遺伝子的融合ヘモグロビンＪ［ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｆｕｓｅｄ　ｂｅｍ ｏｇｌｏｂｉｎ］とは、少なくとも一つの［遺伝子的に融合されたグロビン様ポ リペプチド」（グロビン偽オリゴマー）を有するヘモグロビン様タンパク質て、 グロビン様ポリペプチドは同一または異なる二つまたは三つ以上のグロビン様ド メインからなる。ジアルファグロビン様ポリペプチドとは、第一のα−グロビン 様ポリペプチド（ドメイン）の正常［ｎｏｒｍａｌ］　Ｃ−末端と第二のα−グ ロビン様ポリペプチド（ドメイン）の正常Ｎ−末端との間のペプチド結合でつな がった二つのαグロビン様ポリペプチド配列（ドメイン）を必須の要件として構 成される。これら二つの配列は直接つなげられるか、または一つまたは二つ以上 のアミノ酸のペプチドリンカ−を介してつなげられる。「ペプチド結合」の言葉 は、これら両可能性を包含する。ペプチド結合以外のＮ−末端及びＣ−末端で架 橋（例えばＤＩＤＳにより）されたαグロビン鎖はジアルファグロビンてはない 。シベータグロビン様ポリペプチドは好ましくはβグロビンと一緒におりたたむ ことができ、ヘムを取り込んで機能を有するヘモグロビン様タンパク質を形成す る。

シベータグロビン様ポリペプチドは類似体と定義される。成分ドメインの一つだ けか突然変異しているジアルファまたはシベータグロビン様ポリペプチドは「非 対称的」と呼ばれる。

αグロビン様配列がペプチド結合によってβグロビン様配列につなげられている 「α／βグロビン様偽二量体」を産生ずることも可能である。この「α／βグロ ビン様ポリペプチド」およびシアルファ、シベータグロビン様ポリペプチドは、 集合的に「偽二量体グロビン様ポリペプチド」または「ジグロビン且ｄｉｇｌｏ ｂｉｎｓｌと呼ふ。さらに拡大して、ジアルファ、シベータ、またはα／βグロ ビン様ポリペプチドからなるヘモグロビン様タンパク質も「偽四量体」である。

ジアルファヘモグロビンは二量体に解離しないが、それでも血流からクリヤ［ｃ ｌｅａｒ］される。尤も正常ヘモグロビンの場合より緩慢であるか。

ポリペプチドが実質的にα（またはβ）グロビンに相同であるか否かを判定する には、配列の類似性［５ｅｑｕｅｎｃｅ　５ｉｆｆｌｉｌａｒｉｔｙ］が重要、 しかし非必須的、な判断基準となる。配列類似性は従来のアルゴリズムで判定さ れる。すなわち典型的には最適合致を達成するために僅かな数のギャップの導入 を許容するものである。好ましくは本発明のαグロビン様ポリペプチドまたはド メインは、野生型ヒトαグロビンと少なくとも約７５％の配列同一性をもつ。し かしこれより小さい配列同一性のポリペプチドも、もしそれがたまたま生起し得 る配列同一性より大きなものであって、αグロビンの特徴的な高次構造ならびに 類似する生物学的活性を有するものであるなら、なおαグロビンと「実質的に相 同」と考えることができる。比較してみると、Ａｒｔｅｉ＋ｉａのヘム結合ドメ インは一次配列類似性は２７％以下であるが、それらの保存された残基の周囲お よびほかのヘモグロビンに保存されている残基の周囲のヘム結合ドメインの整列 ［ａｌｉｇｎｉ＋ｅｎｔ］　（すなわち、ヘムの接触及びらせんセグメント同士 の関係の決定に含まれる）は、Ａｒｔｅｍｉａドメインがクラシカルなグロビン ヘリックスＡ〜■を対応するターンにもっており、またその他の種々の保存され たグロビンファミリーの残基をももっていることを示唆しているので、ミオグロ ビンと相同と考えられる。また、セリンプロテアーゼインヒビターには、３０％ という少ない配列類似性しかないペア［ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｍｅｍｂｅｒｓ］の ある相同と認められるタンパク質のファミリーがある。

α鎖およびβ鎖の両方に変化がある１００を優に超すヒトヘモグロビンの突然変 異体が知られている。これら突然変異体の多くのものの酸素結合、その他ヘモグ ロビン特性に及ぼす効果も知られている。ヒトαグロビン、βグロビンは８４カ 所で相違する。さらにグロビン配列上の種間に見られる異形［１ｎｔｅｒｓｐｅ ｃｉｅｓ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ］についても深く研究されている。Ｄｉｃｋｅ ｒｓｏｎ、　Ｈｅ胆鮭典知：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ｅ ｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　即動り腹肛。

ｃｈ、　３　（１９８３）は１９８２年に次のように報告している。６０種の知 られているを椎動物のαグロビンは１４１カ所中２３カ所で同じ残基をもつが、 ６６種のを椎動物のβグロビンは１４６個のアミノ酸の２０個が同一であると。

上記６０種のを椎動物のミオグロビンは、グロビンファミリーに属するが、１５ ３カ所中２７で不変のアミノ酸をもっていた。ここで哺乳類だけについて考察す れば、不変のアミノ酸はαグロビンにつき５０／１４１、βグロビンにつき５１ ／１４６、ミオグロビンにつき７１／１５３である。不変の箇所は分子の活性中 心、つまりヘム凹部およびサブユニット同士の接触部、周りに集中している。可 変アミノ酸のうちのあるものは考察対象の種の小さなフラクションだけがコンセ ンサス配列部分から分岐するものとなっている。

ヒトαグロビンと選択したその他のを椎動物のαグロビンとの間の全体的相違数 は、次の通りである。アカゲサル（４）、ウシ（１７）、カモノハシ（３９）、 ニワトリ（３５）、ヒトセータ（胎児）（６１）、コイ（７１）、サメ（８８） 。無を椎動物グロビンについては分岐は海水ヤツメウナギ（１１３）、軟体動物 （１２４）、県り狙昆（りＩＪ　セラ）（海アカミミズ）（１２４）、及び、Ｃ ｈｉｒｏｎｏｍｕｓ　（キロノマス）（ユスリカ）　（１３１）。βグロビンフ ァミリーについてみると、その他のを椎動物βグロビンからヒトβグロビンか違 う点は、アカゲザル（８）、ヒトεグロビン（１０）、ウシβグロビン（２５） 、ウシβグロビン（３３）、ヒトαグロビン（３９）、ヒトεグロビン（３６） 、カモノハシ（３４）、ニワトリ（４５）、サメ（９６）、海水ヤツメウナギ（ １２３）、軟体動物（１２７）、グリセラ（１２５）、及び、キロノマス（１２ ８）。

これらの相違の多くは誤解を招くおそれがある。というのは可変アミノ酸［ｖａ ｒｉａｂｌｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ］は機能的に同等な１アミノ酸を別のア ミノ酸の「保存的交換Ｊ［ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏ ｎｓ］として発現するにすぎないからである。「保守的交換」とはヘムを取り込 みαグロビンサブユニットとβグロビンサブユニットと関係して、その定義され た内容を維持しつつ可逆的に酸素と結合する四量体（または偽四量体）ヘモグロ ビン様タンパク質を形成する、グロビン様ポリペプチド（またはドメイン）の能 力を改廃しない交換をいう。次に挙げるようなソースがこうした保守的交換（お よび削除と挿入）を同定するのに使われる。

（ａ）官能的ヘモグロビン突然変異体に関するデータ（１００以上の突然変異体 か存在） （ｂ）を椎動物、特に哺乳類、αグロビンおよびβグロビンの配列上の種類［５ ｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ］に関するデータ（ｃ）を椎動物、特に 哺乳類、ミオグロビンの配列上の種類に関するデータ （ｄ）を椎動物と無を椎動物のグロビン間の配列上の種類、または無を椎動物グ ロビンの配列上の種類、に関するデータ（ｅ）ヒトヘモグロビンならびにその他 の酸素結合タンパク質の三次構造に関するデータ、および同構造に及ぼす配列変 化の効果を予測する分子モデルソフトウェア（ｆ）相同タンパク質のファミリー の構成員間に見られるアミノ酸変化の頻度に関するデータ（グロビンファミリー に限定せずに）。例えば５ｃｂｕｌｚ　ａｎｄ　Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、　Ｐｒ１ｎ ｃｉ　ｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎの表１−２参照。

（ａ）〜（ｄ）のデータは同族の［ｃｏｇｎａｔｅ］タンパク質中の変更部位に おける耐性［ｔｏｌｅｒａｂｌｅｌ突然変異を決定するのにきわめて有益であり 、また同分子のその他の類似部位における耐性突然変異を同定するのに有効であ る。カテゴリー（ｆ）のデータによれば、次の交換群［ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｇｒ ｏｕｐｓ］が認められるが、その中でのアミノ酸の置換はしばしば保守的である 。

■　小さな脂肪族の無極性または微弱極性の残基−Ａ１．ａ、　Ｓｅｔ。

Ｔｈｒ　（Ｐｒｏ、　Ｇｌｙ） ■　負荷電した残基およびそれらのアミド−Ａｓｎ、　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ。

Ｇ１口 ■　正電荷の残基−Ｈｌｓ、　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ■　大きな脂肪族の無極性残基 −Ｍｅｔ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ｖａｌ（Ｃｙｓ）■　大きな芳香族残基−Ｐ ｂｅ、　Ｔｙｒ、　Ｔｒｐ３つの残基が括弧で括られているが、これはタンパク 質構造においてそれらには特殊な役割かあるからである。Ｇｌｙは側鎖のない唯 一の残基だからその鎖に対する柔軟性［ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ］を有する。Ｐ ｒｏは鎖をしっかりと制約する普通にみられない幾何学的形を有している。Ｃｙ ｓはタンパク質をして特定のおりたたみに保持するジスルフィド結合に参加する ことかできる。５ｃｈｕｌｚとＳｃｈｉｍｅｒが上記Ｉ、Ｉ［を合併したことに 注意されたい。

またＴｙｒは、水素結合の可能性を有しているから、Ｓｅｔ、　Ｔｈｒなどと一 種の親類関係［ｋｉｎｓｂｉｐ］になっていることにも注意されたい。

一般に（タンパクの）機能は表面の残基における突然変異によってあまり影響を 受けない、少なくともヘム凹部またはサブユニット接触のいずれにも関係しなか ったものは影響されていない。また、フリーのアミノ末端またはカルボキシ末端 は勿論、αヘリックスを接続する「ループ」は、欠失や挿入により大きな耐性を 有している。

ヘモグロビンに結合させた薬物を動物に投与するときは、その動物にとって有意 に抗原とならない［ｎｏｔ　５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ］ヘモグロビンを使うことが好ましい。しかしヘモグロビンの型［ｔｂｅ　ｔｙ ｐｅ　ｏｆ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ］は、そのようなヘモグロビンを動物に使わ ない場合でも適切にその薬剤［ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ］を安定化することか できるのであればそれほど問題でない。また厳密に要求されるものではないが、 そのヘモグロビンは酸素結合能を保持していることか好ましい。

ヘモグロビンは多くの源から容易に調達できる。屠殺場は血液という形で現在、 安い肥料として販売しているが、大量のヘモグロビンを供給する。もし動物の特 定の種あるいは品種か一定の用途に最適のヘモグロビンを提供してくれるもので あるなら、その目的でその特定の生物を生育して必要な血液を得ることかできる 。ヒトの血液銀行は一定の保存期間を経過した人血は捨て去ることが義務付けら れている。これもまた大量のヘモグロビン供給源である。血液からヘモグロビン を分離する技術は周知の通りである。どんな標準的技術でも使用可能である。

動物源から取り出すほかに、所望のヘモグロビンのサブユニットをコードする遺 伝子をクローニングし、適当な発現ヘクターに入れ、そして微生物、動物、ある いは植物、あるいはまた培養した動物や植物の細胞や組織のような有機体に挿入 して得ることもできる。こうした有機体は標準的組換えＤＮＡ技術で産生てきる 。Ｌｉｅｂｈａｂｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　７７；　７０５３−７０５８　（１９８０）　Ｍａｒｏｔｔａら、Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　。

２５２；　５０４０−５０５３　（１９７７）によりヒトαグロビン遺伝子およ びβグロビン遺伝子もクローニングされている。野生型および突然変異α、βグ ロビンの各々を発現させる技術、また機能を有するヘモグロビンにそれらを組込 む［ａｓｓｅＩｏｂｌｙ　ｉｒ＋ｔｏｌ技術ニついては、既述の関連文献中に記 載されている。

ヘモグロビンＡ。は二つのαグロビンサブユニット（β１、β２）と二つのβグ ロビンサブユニット（β１、β２）からなるヘテロ四量体［ｈｅｔｅｒｏｔｅｔ ｒａｍｅｒ］である。αｌとβ２、またはβ１とβ２間に配列上の相違はない。

脱酸素した（「デオキシ」、またはｒｔｅｎｓｅＪの「Ｔ」）状態では、サブユ ニットは四面体を形成する。α１βｌおよびβ２、β２のインターフェイスは酸 素結合している間比較的固定されてはいるか、かなり流動的である。酸素化（「 オキシ」またはｒｒｅｌａｘｅｄＪの「Ｒ」）状態では、サブユニット間の距離 が増える。サブユニットはファンデルワールス力、水素結合、デオキシｔ１ｇｂ では塩橋により非共有結合されている。ヘモグロビンはα１β１およびβ２、β ２の二量体へ解離することか知られている。これらの二量体は腎臓の濾過作用に より血流から除去される。ヘモグロビンの血管的保持［１ｎｔｒａｖａｓｃｕｌ ａｒ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ］は、例えば一つの四量体のサブユニット、または複 数の四量体間のサブユニットの化学的架橋で、改善されている。

これら関連出願に記載されているように、二つの非共有結合で結合したザブユニ ットが二つの酸素結合ドメインをもつ一つの偽二量体ポリペプチドで交換され［ ｒｅｐｌａｃｅｄ］、直接または一つもしくは二つ以上のアミノ酸のリンカ−を 介して結合されることにより、偽四量体ヘモグロビンを産生ずることかできる。

この偽二量体ポリペプチドは適当な融合遺伝子から発現することかできる。こう して二つのαグロビン遺伝子か一つの「ジアルファグロビン」遺伝子へ融合され 、あるいは二つのβグロビン遺伝子が一つの「シヘータグロビン」遺伝子へ融合 され、あるいはαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子とが一つの「αβ」グロビ ン偽二量体遺伝子に融合される。

二つまたはそれ以上のグロビン鎖を融合することの長所は、ＨＯＦＦＭＡＮ　５ Ｂに示されているように、両方の鎖ではなく一つの鎖を選択的に突然変異させる ことができることにある。これは、等モルの薬物とヘモグロビンが最終製品に認 められるように目的とする薬物にただ一つの付加部位しか付与しないことを可能 にする。

別の方法はヘモグロビン分子に無数の付加部位をもたせる方法である。この方法 は結合される薬品の一層多（の量を安定化することができ、またおそらく結合さ れた薬物の放出速度に相違をもたせることができる。

ヘモグロビンはこれまで種々の技術で修飾されている。これら技術のいずれかを 本発明の薬物・ヘモグロビン接合体のヘモグロビン成分の調製に使うことができ る。かかる修飾の例は、米国特許第４．４１２．９８９号、第４．３０１．１４ ４号、第４．６７０．４１７号、第４゜３２１、２５９号、第４．４７３．５６ ３号、第４．７１０．４８８号、第４．６５０．７８６号、第４．３３６．２４ ８号、第４．５９８．０６４号、第４．６００．５３１号及び第４．３７７、５ １２号などに見られる。半合成ヘモグロビンを合成する目的で、個々のグロビン 鎖が修飾形で再調製されている。（Ｌｕｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２０；　５ ５５−５５６　（１９８６）　Ｎａｇａｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２９；　８５ ８−８６０　（１９８７））　グロビン鎖の重合、グリコジル化、ペジレーショ ン［ｐｅｇｙｌａｔｉｏ口］、リポソームまたは細胞膜へのカプセル化のような 他の修飾も考案されている。

糾換えＤＮＡを発現させることによって産生じたヘモグロビンもまた簡単に修飾 することができる。グロビン遺伝子に部位特異的突然変異を起こす標準的技術を 用いることによって、得ようとするグロビン鎖中のアミノ酸を加えたり、欠失し たり、変更したり組合せたりすることができる。（Ｋｒｕｓｅら、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎ凹　ｕｅｓ、６；　３３８−３３９　（１９８８）　Ｚｏｌｌｅｒら、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　＋ＩＩｏｌｏｇｚ、１００；　４６８−５００　（ １９８７）は最近例）。修飾された箇所を目的薬物の付着部位とすることができ る。そしてこれは薬物かヘモグロビン分子に結合されるべき場所ならびに場所数 を変えることになる。目的の薬物がそれ自身−ポリペプチドである場合は、それ を化学的に架橋されたヘモグロビン、またはαサブユニット（ジアルファＨｇｂ ）もしくはβサブユニット（シベータＨｇｂ）を遺伝子的ニ融合した突然変異ヘ モグロビンは、ハプトグロビン結合を抑制するから血管的保持を向上することが できる。おそらくはヘモグロビン四量体の呼吸［ｂｒｅａｔｈｉｎｇ］により、 ジアルファヘモグロビンはなおハプトグロビン結合されているが、その速度は、 血流中に数時間残るシアルファＥ［ｇｂである八〇のそれよりずっと遅い。薬物 運搬をするのにヘモグロビンに対するハプトグロビン結合を嫌うときは、この技 術を使うことができる。

ヘモグロビンまたはそのフラグメントのどれでもヘモグロビン自体の生物学的活 性［ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ］を変更するために修飾すること ができる。米国特許第５．０２８．５８８号は代用血液として酸素低親和性突然 変異体を使用することを開示している。

かかる修飾分子を薬物に結合させて、本発明の薬物・ヘモグロビン接合体を形成 することもできる。

リガンドのヘモグロビンへの結合 リガンドは次の条件を満足するものである。すなわち、ａ）直接、間接に共有結 合できること、ｂ）水素結合、ファンデルワールス力、または疎水性相互作用で 直接、間接に非共有結合できること、Ｃ）ヘモグロビンの三次元ネットワークま たはそのヘモグロビンに関連あるトラップ手段によって物理的にトラップできる こと、以上。対合［ｃｏｕｐｌｉｎｇ］は直接に行われても、あるいは薬物とヘ モグロビンの双方に関連あるリンカ一部分もしくは中間の結合分子によって間接 に行われてもよい。

共有結合による付加：１実施例ではリガンドがヘモグロビンに共有結合で側布さ れる。この付加はヘモグロビンの官能基とりカントの官能基を直接に反応させる か、または同一官能基を有する［ｈｏＩｌｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ］もしくは異 なる官能基を有する［ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ］架橋剤とともにリガ ントとヘモグロビンを同時的または順次的に反応させることによって行う。もし リガンドまたはヘモグロビンか所望の官能基を欠如しているときは、そのリガン ドまたはヘモグロビンをデリビタイゼーション（誘導体化）　［ｄｅｒｉｖｉ　 ｔｉｚａｔｉｏｎｌすることによって行う。

ヘモグロビンの好ましい付加部位としては、ジスルフィド結合を形成することか できるシスティン、および薬物と反応してエステル、ペプチドその他の結合を形 成することができるアスパラギン酸やりシンのようなフリーなカルボン酸または アミン部分［ａｍｉｎｅ　ｍｏｉｅｔｙ］をもつアミノ酸がある。

ジスルフィド結合：付加形成のためにジスルフィド結合を利用することは特に好 ましい。ジスルフィド結合はヘモグロビンのシスティン残基のチオール側の基［ ｔｈｉｏｌ　５ｉｄｅ　ｇｒｏｕｐ］とりガントのチオール基との間に形成する ことができる。ジスルフィド結合の長所は、それが血清に内因性の［ｅｎｄｏｇ ｅｎｏｕｓ］還元剤によって徐々に還元されるから、リガンドされた薬物を血流 中に緩慢に放出することかできることである。ジスルフィド結合形成のための試 薬および条件は当業者によく知られていることである。この目的で置換または挿 入によってシスティンをヘモグロビン中に導入することかできる。

ジスルフィド結合の安定性の調節：薬物運搬または薬品放出速度はヘモグロビン 鎖のどこにリンクされているかにより左右される立体的因子［５ｔｅｒｉｃ　ｆ ａｃｔｏｒ］および電気的因子の双方の影響を受ける。薬品をより緩慢に放出さ せるため、ジスルフィド結合の生化学的還元［ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ］を阻害する ように薬物のチオールをバルキーな（かさのある）化学部分［ｂｕｌｋｙ　ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　ｍ。

１ｅｔｙ］で囲む［ｆｌａｎｋ］ことかできる。例えばペプチド性薬物の場合に は、トリプトファンまたはβナフチルアラニンのようなバルキーな残基の近傍に 架橋可能なシスティンをもたせてもよい。

モノクロナール抗体とりシンＡ鎖間のジスルフィド結合の半減期はマウスで６． ７時間と測定されているＣＴｈｏｒｐｅら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ４８；　６４９６　（１９８８））。しかし硫黄１個の次ニα−メチル置換基［ ５ｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ］がある立体的に阻害されたジスルフィド結合を使うと きは、６．３倍長い半減期が認められた。同じ置換基を本発明にも用いることか できる。

あるいはヘモグロビンシスティンを分岐した箇所の次のグロビン鎖の真ん中の二 つの鎖の間の裂は目［ｃｒｅａｖｅ］に部分的に隠すか、またはアスパラギン酸 とかグルタミン酸のような負荷電の残基によって包囲することによって負荷電の 還元化合物を反発させることかできる。これら技術のすべては還元環境中でジス ルフィド結合の半減期を分子運動学的［ｋｉｏｅｔｉｃａｌｌｙ］に引き延ばす ため使用することができる。ヘモグロビン鎖に付加される一定の薬品およびその 薬品の所望の半減期か、どのような組合せて使用するべきかを決定する。これは 実験反復して容易に得ることかできる。

選択する薬物のほかにも、ヘモグロビン分子に還元剤または酸化剤を架橋させる ことかできる。もし還元剤を架橋するなら、薬物放出の初期の速度は遅いであろ うが、還元剤が放出されてしまえばジスルフィド結合に攻撃することによって薬 物放出速度を加速することになろう。放出されてしまった酸化剤は逆の効果をも たらすであろう。

薬物放出のプロフィル［ｐｒｏｆｉｌｅ］は、同じまたは異なるヘモグロビン分 子にさまざまなアクセラシビリテイ（反応性）　［ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ］の薬物を異なる部位に攻撃させることでも修飾することができる。

ヘモグロビン分子に付加する部位：１実施例では付加部位は、リガンドがそこを より容易に攻撃できるようにヘモグロビン分子の外側にされている。付加された リガンドは向上された半減期をもっており、ヘモグロビンに結合しても活性を維 持する。

に一層長い半減期をもたしめること、を望むときは、そのヘモグロビン公子に対 するアクセラシビリテイが比較的小さい部位を使えばよい。

表面システィン：　システィンをヘモグロビン様タンパク質中に導入するのには 種々の部位を使うことができる。

部位を選択するに当たって必要な基準は（１）突然変異か機能に影響するもので ないこと、（２）側鎖がオキシまたはデオキシ構造て水にアクセッシブルである こと、（３）その部位がたたまれた［ｆｏｌｄｅｄ］タンパク質の表面に存在す ること、　（４）側鎖のスルフヒドリルが分子の内部に向かってよりも表面から 離れるように外方に伸びていること、（５）その部位がＲ−Ｔ遷移［Ｒ−Ｔ　ｔ ｒａｎｓｉｔｉｏｎ］に直接関与しない分子の部分中にあること、（６）その変 化が強固に固定される箇所をもたない分子部分にあること（かかる領域は一般に 判然としないＸ線回折パターンを示す）、（７）その突然変異が局部的二次構造 を破壊するものでないこと、つまりリフォールディング［ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ］ の問題を引き起こすおそれがあるｐｒｏ−”ｃｙｓの突然変異を回避するもので あること、（８）もし可能なら５ｅｒ−Ｃｙｓまたはａｌａ−ｓｃｙｓのような 保守的変化であること、以上である。突然変異は必ずしも上述のこと全てを満足 するものでなくてもよい。例えばＲ−Ｔ遷移（上記５参照）に関与する部位を予 想しても、Ｐ、。（上記１参照）の有利な変化を重視することもある。最も重要 な点はその突然変異が、架橋形成の前後を問わず酸素結合性を改廃するものでな いこと、また、システィンが所望の架橋反応に参加できるだけのアクセラシビリ テイを有することである。

α表面上の候補部位は下記のものを含む。

ｈｉｓ７２．　ａｓｎ　７８．　ａｓｎ６ｇ、　ａｌａ７１．　ｔｈｒ６７、１ ｙｓ７．１ｙｓｌｌ、　ｔｈｒ８゜ａｌａｉ２．　ｔｈｒｌｌＢ、　１７５１ｇ 、　ａｌａ４５．　ｇｌｕｌ１６．　ｇｌｙ１５．　ｈｉｓｌ１２．　ｔｈｒ２ ４゜ｇｌｕ２３．１ｙｓ６０．１ｙｓ５６．　ｈｉｓ５０．　ｇｌｙ５１．　、 ｇｌｕ５３．　ｓ＠ｒ４９．　ａｓｐ４７゜ｇｌｎ５４．　ｈｉｓ４５．　１ｙ ｓ９０．　ａｌａ１１２．　１ｙｓ６１．　ａｌａ１９．　ｈｉｓ２０．　ａｓ ｐ８５゜β面上のβ部位としては下記のものを含む。

ａｓｐ７９．　ｈｉｓ２．　１ａｕ３．　ｔｈｒ４．　ｇｌｕ６．　５ａｒ９． 　ｔｈｒ１２．　ａｌａ１３．　ｇｌｙ１６゜１ｙｓ１７．　ｖａｌ１８．　ａ ｓｎ１９．　ｖａ１２０．　ａｓｐ２１．　ｇｌｕ２２．　１ｙｓ６５．　５ａ ｒ７２゜ａｌａ７６、　ｈｉｓ７７、ａｓｐ７９．　ａｓｎ８０．　ｇｌｙ８コ 、ａｌａ８６．　ｔｈｒ８７．　ｇｌｕ９０゜１ｙｓ９５．　１ｙｓ５９．　ｇ ｌｕ４］、５ａｒ４４．　ａｓｐ４７．　ｓ＠ｒ４９．　ｔｈｒ５０．　ａｌａ ５３゜ａｓｐ５２．　１ｙｓ６１．　ｇｌｕ１２１．　１ｙｓ１２０．　ｔｈｒ １２］、１ｙｓ６６、−ａｓｐ７コ、ａｌａ６２゜ｈｉｓ”°・ｈｉｓ１７　計 ４５個のアミノ酸これらの部位で既に突然変異を示した自然発生的突然変異体は 多数存在する。次の通りである。

残基　領域　突然変異 ５４　Ｅ３　ＧＬＮ−＞ＡＲＧ ７１　Ｅ２ｏ　ＡＬＡ−＞ＧＬＵ ７５　ＥＦ４　ＡＳＰ−＞ＧＬＹ ８１、　Ｆ２　５ＥＲ−＞ＣＹＳ ４７　ＣＥＳ　人ＳＰ−＞ＧＬＹ 表面または近表面でのシスティン突然変異は一般に、ヘモグロビン偽四量体の機 能に重要な影響を与えるようなものではないと考えられている。システィン突然 変異はαヘリックスを有意に不安定化する［ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ］ものとは 考えられておらす、また表面残基はヘモグロビンの酸素結合特性に直接関与しな いと考えられている。はとんどの表面残基はかなりな運動［ｍｏｔｉ。

ｎｌにさらされるのでしっかりと束縛されない。またタンパク質の呼吸運動があ るため、システィンの側鎖は必ずしもジスルフィド結合形成にアクセッシブルな ように溶液中に直接向くようにしなければならないものでもない。

ジスルフィド結合を保護するための突然変異、血清において、ジスルフィド結合 はグルタチオンのような内因性［ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ］チオールによって還元 される。これら反応のメカニズムは実際の還元種のようなチオレートの陰イオン ［ｔｂｅ　ｔｈｉｏｌａｔｅ　ａｎｉｏｎ］に関係している（Ｃｒｅｉｇｈｔｏ ｎ、　Ｔ、Ｅ、　（１９７８）　Ｐｒｏ　、　Ｂｉｏｐｈ　ｓ、二１切ｃ、　Ｂ ｉｏｌ、、３３：２５９−２６０；　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、（１９７ ５）　Ｊ９Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

、９６：７６７；　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、（１９７７）　Ｊ、　Ｍｏ １．　ＢＩｏｌ、、１１３：３１３）。

このように還元速度はジスルフィド結合近傍分子の静電気環境の関数であろう。

ジスルフィドが負の静電気環境中に存在するときは、チオレート陰イオンの反発 があるため、還元速度はより遅くなると予想される。グルタチオンの場合には、 もつと無反応な中間的なプロトン化された分子種［ｔｈｅ　ｕｎｒｅａｃｔｉｖ ｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ　５ｐｉｅｓｌがネットの負電 荷をもち反発されるので、ジスルフィド還元速度を一層遅らせるであろう。

したがって負荷電された表面残基に近い所にあるジアルファまたはジベータヘモ グロビンの表面のまたは表面に近いアミノ酸残基は１−ツのシスティン突然変異 の場所としてよい選択である。そのような２つのシスティン間の最初のジスルフ ィド結合の形成も、システィン周辺の２つのヘモグロビン分子の負電荷間におけ る反発のため、遅いのであるが、その反応はインビトロ形成反応中の高い濃度の 塩または高いｐＨの使用で促進することができる。デオキシ条件下でレドックス 緩衝液中で行なわれれば、その反応は温度上昇につれて促進されるであろう。

亀御員医基ｌ↓近堕突然変異に好ましい部位α５ｅｒ４９　ａｓｐ４７近辺、自 然発生の５ｅｒ４９からａｒｇへの変異は正常酸素親和性を有する。

ａ　ｈｉｓ２０　ｇｌｕ２３近辺、自然発生のｈｉｓ２０からｔｙｒ、　ｇｉｎ 、　ａｒｇへの変異は知られている有害特性を何も もっていない。

α１ｙｓ１６　ｇｌｕｌ１６近辺：自然発生のｌｙｓからｇｌｕへの変異は正常 酸素親和性をもっている。

ａ　ｈｉｓ５０　ｇｌｕ３０近辺：　自然発生のｈｉｓ５０からａＳｐへの変異 は知られている有害特性を何ももっていな い。

βｔｈｒ５０　ａｓｐ５２近辺、　自然発生のｔｂｒ５０から１ｙＳへの変異は 知られている有害特性を何ももっていな い。

β１ｙｓ６５　ａｓｐ２１近辺 βａｓｎ１．９　ａｓｐ２１近辺 凹部［ｃｒｅｖｉｃｅ］システィン突然変異体：クレビス−システィンヘモグロ ビン突然変異体も関心のあるもので、部位特異的突然変異（形成）によって調製 される。得られた突然変異四部システィンは薬物にジスルフィド結合される。凹 部壁は血清還元剤による薬物−ヘモグロビンジスルフィド結合に対しての攻撃を 立体的に［５ｔｅｒｉｃａｌｌｙ］阻魯する。

かかる凹部がヘモグロビンのデオキシ構造に存在する。この構造中では凹部の底 および側部（αＩｅｕ　３４、α４０１ｙｓ、β１３２１ｙｓ、またはα３７　 ｐｒｏのように、いずれもＣＶＳに突然変異させる）の残基の置換が付加部位を デオキシ構造から非常に遅い放出にする。例えばデオキシ構造の表面は、α３４ １ｅｕ−＋ｃｙｓ突然変異がデオキシＡ。中の裂目［ａ　ｃｌｅｆｔ］に深く埋 め込まれたジスルフィドを形成することを暗示している。（αｌｙｓ　１３９が ハプトグロビン結合に関与していることが示唆されるか（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５４．７２６５．１９６９）、それはまた裂目中に僅かながら入 っている。

ヘモグロビンのオキシ構造中の凹部はそれよりずっと浅く、ペプチドまたは薬物 をオキシヘモグロビンに結び付けている［ａｎｃｂｏｒｉｎｇ］ジスルフィド結 合が還元体によりよくアクセッシブルであることを示唆している。このようにデ オキシヘモグロビンの凹部システィンに結合した薬物の放出速度はその構造がデ オキシ状態にある時間割合によってコントロールすることができるもので、ヘモ グロビンのＰ２Ｏの関数となっている。

別の四部はデオキシヘモグロビンの中央部にある穴［ｔｈｅ　ｈｏｌｅｌである 。この穴中の各残基のシスティンへの突然変異は、その突然変異体へのペプチド −または薬物−ジスルフィド結合の還元による放出速度を著しく遅くする。かか る付加部位はここに付加されたペプチドが攻撃を受けたときタンパク質加水分解 から保護され易（するというもう一つの利点をもつ。かかる突然変異の部位とし てはａ　ｌｙｓ　９９、ｔｈｒ　１３４、およびβａｒｇ　１０４、ｈｉｓ　１ ４３、ｌｙｓ　８２、そしてａｓｎ　１３９などがある。これらの突然変異は一 つ以上のペプチドをそのヘモグロビンに付加するために組合わすことかできる。

この穴中には高い正電荷濃度があるから、付加はそのペプチドに一つまたは二つ 以上の負荷電部分を追加することによって安定化させられ得る。Ｎ−またはＣ− 末端Ｃｙｓをもち最初の三つまたは四つのアミノ酸中にかさ高な残基のない線状 ［１ｉｎｅａｒ］ペプチドか、この穴に適合する可能性か最も高いものである。

酸素低親和性突然変異：デオキシコンフォメーションはシスティン突然変異体に 酸素低親和性（高Ｐ　ｓｏ）突然変異を導入することによって安定化することが できる。その結果得られるヘモグロビンの親和性が低ければ低いはと、薬物の放 出速度は遅くなる。このメカニズムは肺の血管系のような高い酸素分圧の組織に おける薬物放出速度をより選択的にてきるようにする。

ヘモグロビンの親和性を減少させる突然変異の候補としては、例えば、Ｐｒｅｓ ｂｙｔｅｒｉａｎ突然変異（純ヘモグロビンのｐｓｏの測定値は３５＋ｎｍ　ｌ ｌ１ｇ）、β６７ｖａｌ−ｉｌｅ（２４，７ｍｍ　ＨｇのＰ　ｓｏ）、ヘモグロ ビンＫａｎｓａｓ　（約２０Ｉ［１ｆｆｌ口ｇ°のＰ　ｓｏ）、ヘモグロビンＪ −Ｃａｉｒｏ（１５ａ＋＋ｏ　Ｈｇ’のＰ　ｓｏ）、ヘモグロビンＴｉｔｕｓｖ ｉｌｌｅ（Ｐ　ｓｏ　＝　１６＋＋＋＋ｎ　Ｆｌｇ”）、ヘモグロビンＢｅｔｈ 　ｌ５ｒａｅｌ（全血＝８８ｍｔｎ　Ｈｇ”のＰ　ｓｏ）かある。これらの突然 変異の組合せも低い酸素親和性の突然変異体を産生ずるものと考えられる。（■ ″の記号が付いている箇所については次を参照せよ。Ｂｕｎｎ　ａｎｄ　Ｆｏｒ ｇｅｔｌＦｌｅｎｏｇｌｏｂｉｎ：　！１ｏｌｅｃｕｌａｒ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ 　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ、　１９８６．　Ｐｈ１ｌａｄｅ ｌｐｈｉａ：　Ｗ、Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ、　ｐ、　６１５） 非常に低い酸素親和性のあるヘモグロビンを形成する別の方法としては、ヘモグ ロビンのＲ状態からＴ状態への遷移に移行するサブユニットインターフェイスを 結ぶジスルフィド結合を挿入することがある。Ｃ１−β２インターフエイスを結 ぶＴ状態において形成されるジスルフィドはそのＴ（デオキシ）状態を安定化し 、こうしてタンパク質のＰ２Ｏを減少させる。かかるジスルフィド結合の１例は 、デオキシ構造を調べて分かったのだか、ａ　９６ｖａ１−＋ｃｙｓおよびβｌ Ｑ１ｇｌｕ−ｃｙｓの突然変異からもたらされる。

ジスルフィド形成のいくつかの幾何学判断基準を満足する他の例か得られた。（ ７，４Å以下のＣα−Ｃα距離、３．３〜４．６人のＣβ−Ｃβ距離、Ｃα２、 Ｃβ２およびＣβ１間の角度とＣα１、Ｃβ１およびＣβ２間の角度は５３〜１ ８０度、であることか下に示されている。　（Ｂａｌａｊｉら、Ｂｉｏｃｂｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｉ＋ｉ＋、１６０．　１０９−１１４．　 １９８９）。これらには次のものがある。β３Ｔｔｒｐ−ｃｙｓおよびα９２ａ ｒｇ−ｃｙｓ：　βａｒｇ４０−”ｃｙｓおよびａ　ａｒｇ９２→ｃｙＳおよび βｈｉｓ９７→ＣＬＩ；およびαｔｈｒ４１−”ａｙｓ、　Ｔ状態の最大安定性 を得るため、これらの突然変異をβおよびαの両ドメイン中に導入させなければ ならない。もしこれらのジスルフィド結合が形成されたら、その構造はデオキシ 構造に固定される。得られるＰ、。はおそらく非常に高いものとなろう（１００ ＋ｎｍ　Ｈｇ以上）。

ハプトグロビン結合を抑制する突然変異：ハプトグロビン結合を阻止する位置に ある分子の表面に存在するジスルフィド結合を形成するシスティンも可能である 。分子ゲラフックスは所望の薬品に結合される組換えヘモグロビンがハプトグロ ビン結合を防止するには、１ｙｓ９０またはａｌａ８２のようなα１ｙｓ１３９ 周りの残基がシスティンへの突然変異にとって都合のよい候補であることを示唆 している。システィンに突然変異されるのに好ましい残基としては、Ｃ１，６， ７４，８５，８９，９３，１１８，１２０〜１２７．１３８〜１４１、およびβ ２．１１〜２５．３１〜４０、そして１３１〜１４６がある。

最初と最後の三領域はβ鎖の表面上もしくは表面近傍にある。

これらのヘモグロビンはハプトグロビン結合の初速度［１ｎｉｔｉａｌｒａｔｅ ］抑制を目的として、薬物運搬のためペプチドを付加することによってハプトグ ロビンの蛍光消光［ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕｅｎｃｈｉｎｇｌを観察し てチェックすることができる（ＨｗａｎｇとＧｒｅｅｒ、　Ｊ、−氾旦Ｌ０μ吐 ２５４．２２６５．　（１９７９））ヘモグロビンとの架橋のためのリガンドの 誘導体化：結合されるべきりガントが自然状態でフリーなスルフヒドリル基もし くは類似の付加部分［ａｔｔａｃｈｌ［Ｉｅｎｔ　Ｉｏｏｉｅｔｙ］をもたない ものであるときは、リガンドはそのような部分に付けられるように修飾される。

安定化されるべき薬物がポリペプチド性薬物の場合を例に述べると、アミノ末端 、カルボキシ末端、またはシスティン内部の付加は固相ペプチド（Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ）合成によって容易に行うことができる。また標的リガントがあまり長 くないときとか担体のヘモグロビンから何らかの方法で分離されていなければな らないときは、適した結合アミノ酸がその付加部位に付けられる。例えばポリプ ロリンリンカ−かヘモグロビンとポリペプチド間のジスルフィド結合の後に設計 することができる。アミノ酸すンカーテイル［１ｉｎｋｅｒ　ｔａｉｌｓ］の付 加は内因性プロテアーゼ分解に対する感受性を減少させてポリペプチド性薬物の 安定性を向上させるであろう。Ｄ−アミノ酸鎖またはポリプロリン鎖のような適 切な「二次リンカ−」が考えられる。

ジスルフィド結合を得るのに好ましい方法は次のような薬物の作用［ｆｕｎｃｔ ｉｏｏ］である。

一つのシスティンのある直鎖状ペプチド性薬物：薬物のＣｙｓとヘモグロビンの Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成する。

一つもシスティンがない直鎖状ペプチド性薬物：例えば下記方法のいずれかを使 って薬物中にシスティンを導入する。（ａ）薬物のＮ−末端またはＣ−末端にＣ ｙｓを付ける（グリシンスペーサーを一つまたは二つ以上使うか使わないで）； 　（ｂ）薬物ペプチド配列の重要でない残基をｃｙｓで交換する；　（Ｃ）Ｃｙ ｓをペプチドの１ｙｓ−ε−ＮＢ２基から離れた分岐として付加する。導入され たＣｙｓをヘモグロビンＣｙｓにジスルフィド結合する。

自然発生的ジスルフィドのある環状ペプチド：次の方法で行うことができる。即 ち（ａ）　Ｎ−またはＣ−末端にｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）を付加するか、あるいは環 中のあまり重要でない残基をＣｙｓと交換する：または（ｂ）還元不能な環を構 築しＮ−末端またはＣ−末端にＣｙＳを入れるか、環中であまり重要でないアミ ノ酸を交換する。この場合には還元可能なジスルフィド（−Ｓ−３−）結合か、 例えば（１）チオエーテル（−３−）、（２）ラクタム（（Ｋ）　−ＮＩＩＣＯ −（Ｄ）　）または（３）メチレン（−（ｃｎｚ）ｍ）構造で交換される。

非ペプチド性薬物・薬物かフリーなチオールを含有しているときは、これはヘモ グロビンシスティンのチオールと反応するであろう。もし反応（７なかったら、 その薬物はフリーなチオールを有するように合成しで修飾されなければならない 。チオール基でヒドリル基を交換することも可能であるし、薬物にチオールのあ る部分を付加することも好ましい。

どんな修飾か薬物に対してなされるにせよ、その修飾されていない薬物の生物学 的作用を保持するように架橋か選択されることか望ましＣ１゜薬物は一旦放出さ れるようになれば活性である限り、ヘモグロビンに結合させられているときも活 性であることが要求されるものではない。

非ジスルフィド結合：インビボ還元剤は担体からペプチドを遊離させる［１ｉｂ ｅｒａｔｅ］ように作用するから、また外因性の［ｅｘ。

ｇｅｎｅｏｕｓ］還元剤は半減期を調節するように同時投与することかできるか ら、ジスルフィド結合か好ましいのであるか、不安定な結合または可逆的会合［ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｌも使うことができる。

直接合成によって得たハロアセチル−ペプチドまたはハロアセチル−化合物でシ スティンをアルキル化することにより、ペプチドおよびその他の有機化合物をヘ モグロビンに付加することができる。二官能的架橋も薬品をヘモグロビン鎖に結 合するのに使うことができる。さらに別の例は酸性またはアルカリ性の環境下で 開裂されるエステル結合に関する。所望の薬品を放出できるようにするため、血 清プロテアーゼのため一定のプロテアーゼ開裂部位をリンカ−として使うことが できる。周囲の微環境は部位特異的な突然変異生成または化学的修飾によって所 望の放出速度を得るように修飾される。

融合タンパク質：　リガンドがポリペプチドまたはオリゴペプチドであるときは 、融合タンパク質の形でリガント−ヘモグロビン接合体［ｃｏｎｊｕｇａｔｅ］ を産生ずることかできる。そこではリガンドはα及び／又はβグロビン鎖中にそ の新しいドメインとして組み込まれる。リガンドはヘリックス間ループ［１ｎｔ ｅｒｂｅｌｉｘ　１００１）］に挿入されるか、グロビンＤ−へり・ンクスのよ うな非必須的構造［ａ　ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ］を 交換するものでもよい。このリガントはグリシンのような一つまたは二つ以上の アミノ酸のペプチドリンカ−でキメラグロビン鎖の残部に付けることもできる。

非共有結合的付加、別の実施例ではリガントとヘモグロビンは非共有結合的に付 加される。付加は、リガンドを分子に相加し、その分子はヘモグロビン中に吸収 されるというように間接的に行われる。例えば薬物を抗ヘモグロビン抗体に結合 しく共有結合または非共有結合的に）、後者を非共有結合的にそのヘモグロビン 分子に結合させることができる。アビジン／ビオチン結合もそれら二つのうちの 一つをヘモグロビンへ、他の一つをリガンドへ結合するために使うことができる 。またその薬物をヘモグロビンに自然に結合するハプトグロビンに結合させるこ ともできる。結合部位のあるハプトグロビンのフラグメントも付加部位として利 用できる。こうした会合［ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ］は薬品使用の場でなされ ず予め行われているのが好ましいが、その場で行うことでもよい。

非共有結合の会合は直接に、例えば水素結合およびヘモグロビンをリガンドに会 合させる疎水力によって、形成してもよい。

例えば部位特異的突然変異生成を使って多数の疎水性アミノ酸を互いに近づけさ せ所望の薬品の疎水部分の付着［ａｔｔａｃｂｍｅｎｔ］を促すようにしてもよ い。ここで相互に近づけるとはアミノ酸か鎖中で近接していることを意味するも のではなく、二次構造、三次構造、または四次構造により分子全体が二つの別々 のアミノ酸を近くに配置している状態を言う。

その他：理想的には動物中の薬剤の半減期は、一定期間作用することを望む薬物 、例えばペプチドＴのようなものにつき、少なくとも数日である。しかし薬物の より短期間での運搬が望まれるときは、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子 のような、ヘモグロビン運搬ベヒクルは別のものを選択するのがよいであろう。

そこで薬物の有効濃度を引き延ばすため各々別々の半減期をもつ二つの異なるタ イプの結合または異なるヘモグロビン担体を使うことが好ましい。これは２回の 投与、二つの異なるヘモグロビン安定剤か、または所望の薬品を付加させるため の部位が複数の非同−なものである１つのヘモグロビン担体の１回の投与を含む 。安定化組成物は一つまたは二つ以上の追加的薬品を包含していてもよい。

組成物およびその用途 本発明は薬物−ヘモグロビン接合体を用いた、種々の疾病の予防処置および治療 のための薬剤掌上の組成物ならびに調合物を提供するものでもある。本発明の組 成物は必要に応じて哺乳類を処置するのに使う従来の固形または液体薬品調合剤 （例えば錠剤、カプセル、注射液または経口投与溶液）中に組み込むことができ る。本発明の薬剤学的調合剤は、有効成分単独または他の活性剤もしくは不活性 剤と組合せられた、本発明の薬物・ヘモグロビン接合体の有効量を含む。例えば 非経口的治療組成物は０．１％〜９０％の薬物−ヘモグロビン接合体を含有する 滅菌等張食塩水溶液としてなる。人に投与される薬剤学的量は、薬物−ヘモグロ ビン接合体の０．００１マイクロモラニ〜１ミリモラーの血液濃度上なるに十分 なものである。個々の服用量中に含まれる実際の成分の単位内容［ｕｎｉｔ　ｃ ｏｎｔｅｎｔ］は、それ自体で有効量をなすものである必要はない。必要な有効 量は複数の錠剤、カプセルなどの投与によって達成することができる。

本発明による調合は薬剤学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、塩、その他の 当業者に知られた物質、などの不活性成分用量［ｄｏｓａｇｅ］次第で違ってく る。

本発明の薬剤学的組成物は経口、エアゾール、皮膚吸収［ｔｒａｎｓｄｅｒｍａ ｌ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ］、粘膜経由吸収、または注射など従来ある手段で供 給される。非経口投与が好ましく、特に静脈内または動脈内投与がよい。

もう一つの好ましい実施例はヘモグロビンを診断用造影剤の担体として使うこと である。この診断薬は放射性造影診断用として放射性であってもよい。合成中に 、あるいは別途後でヘモグロビンに結合させて放射性原子含有の分子（９９“Ｔ ｅ、　５５Ｆｅなど）をヘモグロビンに組み込みことができる。テクネチウム− ９９ｍは、短い半減期と検知容易な信号のため今日よく使われている放射性剤で あるが、本発明にとっても好ましい実施例である。磁気共鳴映像を行うについて は何らかの常磁性エレメントがヘモグロビン担体のラベル標識として有用である 。媒体としての血液の特性があるため、プロトンはラベルとして好ましくない。

もし不十分な造影剤かヘモグロビン担体に付着することがあれば、ジエチレント リアミノペンタ酢酸のようなキレート化剤をＮＭＲ応答造影剤をヘモグロビンに 化学結合するのに使うことができ子をヘモグロビン鎖中に、それの合成中に直接 組み込むか、ま゛たは適当な薬品をヘモグロビンに結合することができる。　本 発明の造影剤はどんな組織の視覚化でも、例えば腫瘍、血管開通、動的な心筋あ るいは脳スキャニングの静電気的映像化に使うことができる。過去に使われたこ とがある担体とは異なりへモグロビンは血流中に自然に保持されるから、鮮明な 映像をもたらすことができる。

具体的な実施例について上記したことは第三者が現時点で公知の知識を用いて容 易に改変しあるいは直接採用してさまざまに応用することができるから、かかる 採用および改変は本発明の要旨から離れることなく開示された本発明の実施例と 均等なものであると解釈されるべきである。またここに用いた用語は発明を説明 するためのものであって発明の範囲を制限するためのものではないことも了解さ れたい。

本願中に記載の引例文献ならびに特許および出願はここに組み込むものとする。

例１ アンギオテンシン■は自然発生の短命な（３〜４分）、しかし強力な血管収縮ペ プチドである。このペプチドの治療適用はそのインビボ短半減期のためこれまで 開発されたことはない。尤もこのペプチドの臨床使用は現在の治療法より有意な 長所があるのである。例えば一般に使われている血管収縮薬のエピネフリンは全 身血圧および心拍数の双方に作用するので、マイナスの副作用を誘発することが ある。しかしアンギオテンシン■はヴエーサルトーン（血管前）［ｖａｓａｌ　 ’ｔｏｎｅ］にしか作用せず、したがって心拍増加の付加的な負担をかけずに血 圧だけを増やさなければならないような事情のときに利用することできる。

アンギオテンシン■は直鎖状のオクタペプチド（ＤＲＶＹＩＦＩＰＦ−Ｃ００− ）である。最初の関心はヘモグロビンの運搬にとっても適している適切な効果が ある類似体の合成であった。標準的ｂｏｃ−ペンシル工程を使い、Ｃ４逆相クロ マトグラフィで精製して、八つの異なるペプチドが合成された。Ｎ−末端、Ｃ〜 末端またはペプチドの本体［ｂｏｄｙ］につきさまざまな修飾が施されシスティ ン残基の付加が及ぼす薬効上の効果を判定しようと試みられた。

選択した類似体の中にはアミノ末端がＮ−アセチルンステインを付加（チオール 結合するため）することで修飾し、続いてグリシンを（生の薬物部分により柔軟 な結合を与えるため）付加した。

さらに、アンギオテンシン■の二次受容体によるクリアランスを避けるためＡｒ ｇ２−Ｌｙｓの突然変異を生の薬物部分に生起させた。用量反応（ドーズ・レス ポンス）曲線がラットで各類似体につき集められた。選択した類似体は血管収縮 効果につき１０倍だけしか減少を示さず、したがって将来使用ができる。

Ｈｏｆｆｍａｎら、１０８８１０９１７９に記載の既知の偽四量体ヘモグロビン 突然変異体（αＤ７５Ｃ）　５ＧＥ１．１が発現され当業者に知られている技術 で精製された。５ＧＥ１．１はジアルファグロビン（正常αグロビンにグリシン で付加されたｄｅｓ−ｖａｌ−αグロビン）と、Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ　（ β１０８　Ａｓｎ　−Ｌｙｓ）突然変異のある二つのβグロビンからなる。突然 変異０７５Ｃ（つまり表面アスパラギン酸のシスティンへの）は目的のペプチド とのジスルフィド結合を形成することができた。その突然変異の周りの領域は電 気的に中性で、立体的に開放領域であり、したがって比較的内因性の血清還元剤 による攻撃に敏感であろう。一つのアンギオテンシン■分子が各ヘモグロビン分 子に結合［ｃｏｕｐｌｅ］され（１ペプチド性薬物：１偽四量体）、半減期デー タをラットにつき集めた。ヘモグロビン−類似体接合体はフリーの類似体より有 意に向上した半減期をもっていた（ラットで測定した場合、類似体＋接合体の全 身運搬時間は約６０分：フリーのアンギオテンシン■類似体では１．２５分）。

さらに、類似体−接合体反応（例えば、血圧のベースラインレベルまでの戻り） の消滅［ｄｅｃａｙ］後に還元剤ジチオスライドールを投与すると、血圧上昇お よびさらに引き延ばされた放出が認められた。これはペプチド−ヘモグロビンジ スルフィド結合の還元［ｒｅｄｕｃｔｉｏｎＪが担体からの薬物の放出メカニズ ムであることを示唆している。すべてのデータは速成耐性［ｔａｃｈｙ例２ 上記と同じ実験セットで、別のヘモグロビン突然変異体につき行った。ここで選 択したヘモグロビンは別の表面α鎖突然変異体、αＬｙｓ　１６　Ｃｙｓである 。例１に記載のヘモグロビン突然変異体とは違ってシスティンに交換されるリジ ンはオキシ構造のカルボキシレート［ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ］から３．５６人 離れて位置し、デオキシ構造では３．８人離れて位置していて、Ｃｙｓを負電荷 環境下にした。このヘモグロビン−類似体接合体の半減期は、上記例１のものが ６０分であったのに対し、２００分であった。しがち大量のジチオスライドール を投与しても有意に向上した、っまり引き延ばされた運搬とならなかった。した がって類似体きヘモグロビンα鎖間のジスルフィド結合の局部における電荷環境 は内因性血清還元剤の攻撃を抑制したものと考えられる。

例３ 心房性Ｎａ利尿因子［ａｒｔｒｉａｌ　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ ］（ＡＮＦ）の環状類似体を調製して、システィンに交換したヘモグロビンに接 合した。ラットＡＮＦは配列のある２８量体［２８ｍｅｒ］ペプチドホルモンで ある。心房拡張のときの増加に応答して心臓中の心房細胞によりＡＮＦが放出さ れる。そのＮａ利尿効果および利尿効果［ｄｉｕｒｅｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ］に より血液中の電解質バランスを統制し、平滑筋を弛緩させる。カスクラチャー［ ｃａｓｃｌａｔｕｒｅｌでは、これは血管の弛緩および血圧上昇につながる。フ リーＡＮＦの血清半減期は１〜２分であるから、心房ペプチダーゼによって腎臓 細管の不活性フラグメント中へ、またクリアランス受容体との結合によって、ホ ルモンの開裂［ｃｒｅａｖａｇｅ］で調節される［ｍｅｄｉａｔｅ］。フリー類 似体も同様な血清半減期をもつ。

野生型ＡＮＦ　（ｗｔＡＮＦ）のアミノ酸配列およびその類似体（ＡＮＦ’　） の配列は次の通りである。

野生型ＡＮＦ　−８ＬＲＲＳＳＣ−ＦＧＧＲＩＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲ Ｙ類似体ＡＮＦ’　Ｃ−−−−５ＳＫＧＦＧＧｌ？ＩＤＲＩ−−−−−−−Ｄ− Ｆｌ？−アミド野生型ＡＮＦの太字Ｃのシスティンはジスルフィド結合でリンク されている。ＡＮＦ’のアンダーラインされた（Ｋ）のリジンと（Ｄ）のアスパ ラギン酸はラクタム（−Ｎ）ＩＣ（＝０）−）結合でリンクされている。ＡＮＦ ’のシスティンはＮ−アセチル基とニトロピリジンスルフェニル基をもつように 修飾されている。野生型ＡＮＦから取り除かれた残基はその活性に必須のもので はなく、その除去は合成を簡素化する。Ｎ−末端システィンはもちろんヘモグロ ビンとの架橋に用いられる。ラクタム環はもとのジスルフィド結合を置き換えた が、これは架橋や放出には関与しない。挿入されたグリシンはプロテアーゼ耐性 を増すためである。

類似体ＡＮＦ’の調製は示されたアミノ酸配列の固相合成から始まった。システ ィンは既に付加されているＮＰｙｓ基で付加された。

システィンチオールはｂｏｃで保護され、セリンヒドロキシルは一〇−ベンジル で、リジンのεアミノ基はＦＭＯＣで、アルギニンはｔＯｓ（トルエンスルホニ ル）で、一番目のアスパラギン酸は、シクロメチルエステルで、第二のアスパラ ギン酸はフルオレニルメチルエステルで、各々保護された。Ｌｙｓ−４とＡＳｐ −１４を選択的に脱保護するのにはピリジンを使った。その側鎖を、ＨＢＴＵ　 （２−（１トベンゾトリアゾル−１−ｙｌ）−１，１，３，３−テトラメチルウ ロニウムヘクサフルオロホスフエート）およびＤＭＦに溶かしたヒドロキシベン ゾトリアゾールを３回加えて環化した。Ｎ末端ｂｏｃ基を除去するにはトリフル オロ酢酸を使い、システィンを無水酢酸でＮ−アセチル化した［Ｎ−ａｃｅｔｙ ｌａｔｅｄ］。ペプチドを口Ｆでリジンから切断した。なお、このＨＦはＮＰｙ ｓを除き全ての保護基を除去した。

当該類似体をＣ−４逆相ｔｌＰＬｃで精製し、２：１のペプチド＝Ｈｂ中のＤ＆ ％Ｃ突然変異体に付加し、ＧＦＣで本件接合体を単離した。

ＡＮＦ類似体を５ＧＥ１．１のＤ７５Ｃ突然変異体にジスルフィド結合し、接合 体（１１９ｏｇのＤ７５Ｃ突然変異体と、２．９＋ｎｇのＡＮＦ類似体、　Ｈｇ ｂの１モル当たり０．７８モルのＡＮＦ類似体）をオス２５０ｇラットに投与す ると（徐脈を予防するためアトロビンの継続的注入をしながら）、最初に明確に なったのは約３０分後であったが、平均全身血圧は約１００分間に亙って徐々に 降下した（最大減少量＝３２■口ｇ）。

、、、、、、Ａ、、１．、Ｎ＠ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０９７１３フロントページ の続き Ｒ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＡ、　ＵＳ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．生理学的条件下で治療法的に活性ある形で薬物を放出することができる、ア ルブミン以外の、ヘモグロビン様タンパク質との薬物の接合体。
2. ２．薬物がヘモグロビン様タンパク質に共有結合している請求項１の接合体。
3. ３．薬物がヘモグロビン様タンパク質のシステイン残基に直接または間接に共有 結合している請求項２の接合体。
4. ４．薬物がヘモグロビン様タンパク質のシステイン残基にジスルフィドを介して 結合している請求項３の接合体。
5. ５．システイン残基が正常ヒトαまたはβグロビンの非システイン残基の突然変 異である請求項３の接合体。
6. ６．システイン残基がヘモグロビン様タンパク質の表面にオキシまたはデオキシ の両方の形で存在する請求項３の接合体。
7. ７．システイン残基がヘモグロビン様タンパク質の凹部にオキシまたはデオキシ のいずれかの形で存在する請求項３の接合体。
8. ８．ヘモグロビン様タンパク質が正常ヒトヘモグロビンに比べてその酸素親和性 を変更するように突然変異されている請求項１の接合体。
9. ９．ヘモグロビン様タンパク質が正常ヒトヘモグロビンよりもその血管内保持を 増大するように突然変異されている請求項１の接合体。
10. １０．ヘモグロビン様タンパク質がハプトグロビン結合を阻害するように突然変 異されている請求項９の接合体。
11. １１．システイン残基が、血漿に内因性の還元剤の接近を立体的または静電気的 に抑制し、それによってジスルフィド結合の還元が抑制される、ヘモグロビン様 タンパク質の領域中に存在する請求項４の接合体。
12. １２．ヘモグロビン様タンパク質が二つまたは三つ以上のグロビン様ドメインを 有する偽オリゴマーであって、その偽オリゴマーが薬物が架橋される一つの追加 的に架橋可能なシステインを供給するように非対称的に突然変異された、請求項 １の接合体。
13. １３．薬物が自然発生的な血清タンパク質でも、その保存的な突然変異体でもな い請求項１の接合体。
14. １４．フリー形の薬物がヘモグロビン様タンパク質の半減期よりも実質的に短い 血管内半減期をもつ請求項１の接合体。
15. １５．薬物がペプチド性薬物である請求項１の接合体。
16. １６．薬物がシステイン残基に架橋するのに適したチオール基を供給するように 誘導されている請求項１５の接合体。
17. １７．薬物が環状ペプチド性薬物である請求項１５の接合体。
18. １８．薬物がジスルフィド結合の安定性を向上させるように修飾されている請求 項１６の接合体。
19. １９．薬物が血管収縮薬または血管拡張剤である請求項１の接合体。
20. ２０．薬物がアンギオテンシンＩＩまたはその活性な架橋可能な誘導体である請 求項１の接合体。
21. ２１．薬物が心房性Ｎａ利尿因子またはその活性な架橋可能な誘導体である請求 項１の接合体。
22. ２２．疾病処置のための組成物またはヒトもしくは動物の体調のための組成物の 製造に請求項１〜２１に記載のいずれかの接合体を使用する方法。