JPH0288595A - 免疫刺激性ペプチド、その製法、及び該ペプチドを含有する薬剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、−飲代■： Ａ−ｘ−Ｌｙｓ−ｙ−Ｂ　　　　　　　　（１）（ｆｃ
だし、 ＡはＨ１次式Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇのトリペプチ
ド又はＧｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ａｌ
ａ　−Ａｒｇのヘキサペプチドであり、 Ｘ及びｙはそれぞれ異なり、アルギニン（Ａｒｇ）又は
グルタミン酸（Ｇｌｕ）残基であり、ＢはＯＨ又はトリ
ペプチドＡｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇであるが、Ａｔ′
ｉ水素で、ｘｔ！Ａｒｇであり、ＢはＯＨとは異なる）
で示されるペプチドに関する。

本発明のペプチドからなるアミノ酸は天然に存在するＬ
配列のものか、Ｄ配列のもののいずれでもよく、両配列
のラセミ混合体でもよい。

本発明による好ましいペプチドＵＡ又はＢのいずれかが
Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　、　ｘがＡｒｇ、そして
ｙがＧｌｕのものである。

本発明による別な好適なペプチドはＡがＧｌｕ　−Ｌｙ
ｓ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　、　ｘ
がＧｌｕ、そしてｙがＡｒｇのものである。好ましいさ
らに別なペプチドはＡ％Ｂが共にＡｒｇ　−Ａｌａ　−
Ａｒｇで、Ｘ及びｙがそれぞれ無関係にＡｒｇ又１ｊＧ
ｌｕのものである。

アミノ酸は好ましくはＬ−形のものから選択するが、Ｄ
−又ＶｉＤＬ−アミノ酸、特にＤ　−Ａｌａ又はＤ−グ
ルタミン酸も対象内にある。

また、本発明は上記ペプチドの製法だけでなく、免疫刺
激剤としての使用にも関する。

本明細書で使用する略号の意味は次の通シである。

Ａ、１ａ二Ｌ−アラニン Ａｒｇ　：　Ｌ−アルギニン Ｂｏｃ　ニブチルオキシカルボニル Ｄ−Ａｌａ：Ｄ−アラニン Ｇｌｕ　：　Ｌ−グルタミン酸 Ｄ−Ｇｌｕ：Ｄ−グルタミン酸 Ｌｙｓ　：　Ｌ−リシン Ｎｇ二Ａｒｇのグアニジン窒素の置換基トリペプチドＡ
ｒｇ　−Ａｌａ　−Ｇｌｕはイタリア特許出願第２００
２７Ａ／８６号（出願１二１９８６年９月４日）により
公知であり、免疫例数活性がち）、Ｔ−細胞成熟性及び
機能性の両者を促進するものである。

ま之、牛の肺臓から抽出され、かつ胸腺から分離したサ
イモポイエチンＩ、ＩＩに対する親和性が高いため最初
はサイモポイエチン■と呼ばれていた、スプレノボイエ
チンの３２−３４７ラグメントに対応するＡｒｇ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｇｌｕ　）リベプチドには、Ｔ　＋　ＩＪンパ
球の成熟及び機能全始めとする免疫刺激性がある（イタ
リア特許出願第２００２６Ａ／８６号（出願１二１９８
６年９月４日）及びＤｉｅｚｅｌ　Ｗ、等のＢｉｏｍｅ
ｄ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　４５、第１３４９頁、
１９８６年）。

同様に、Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕとは末端がＣで６
るアミノ酸残基の点だけで異なるペプチドＡｒｇ　−Ｌ
ｙｓ　−Ａｓｐも同じような挙動を示しくＥＰ−Ａ−０
０６７４２５）、イタリア特許出願第２１５７５Ａ／８
７号（出願日二１９８７年８月４日）に開示されている
Ａｒｇ　−Ｇｌｙ　−Ａｓｐも同じである。

本発明によるペプチドは、免疫刺激剤として有効であり
、また試験管内実験モデルにおいて、ネズミの成熟して
いないＴ−リンパ球の成熟を促進し、かつヒ）Ｔ−リン
パ球の機能を強化することが確認されている。ま之、氷
見ＢＡ［よるペプチドは、５日間、あるいは２または６
週間経口投与ま念は腹腔的投与した場合に、脱毛し念無
胸腺症マウスの免疫機能を回復できるものである。

Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−？　Ａｒｇ　−Ｌｙｓ
　−Ｇｌｕと同様に、本発明によるペプチドは試験管内
模擬胃液に対して安定性を示す。

模ＪＭ冑液に対する安定性が経口投与後の活性に関連が
ある前記２種類のペプチドと同様に、本発明のペプチド
もまた経口及び非経口投与用に免疫刺激活性を示す。

この襲実は、処方通り投与できるため、特に子供や、非
経口投与に耐えることができない患者の治療にｓＫめて
・１利である。

上記に加えて、本発明の化合物は、臨床上−次欠損症及
び二次欠損症に特に有効である特徴を備えている。

免疫刺激化合物の臨床的な用法は、例えばＩｍｍｕｎ、
Ｌｅｔｔ、　　Ｖｏｌ、　　１６、第３６３頁、１９８
７　；ＪＡＭＡ　Ｖｏｌ、２５Ｂ、第３００５頁、　１
９８７　；　　ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　＆　Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　、、Ｅｄｓ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ
　ｋｌ。

＆　Ｍａｌｉｃｋ　Ｊ、　Ｂ、　、Ｈｕｍａｎａ　１９
８７　、第２２７頁、に記載されている。

意図する用法に従って、本発明のペプチドは単独で使用
でき、また薬学上許容できる担体と混合し友適当な製剤
−本発明の目的でもある−の形で使用できる。

例えば、”　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｌｓ　Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａ１８ｃｉｅｎｃｅａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ”
　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、、Ｎ、　Ｙ、、ＵＳＡに
記載されている、公知方法及び賦形剤を用いて製薬化で
きる製剤の例には、経口投与用としては錠剤、カプセル
やシロップなどがあシ、また非経口投与用として許容で
きる液体やインブラント等による滅菌溶液や懸濁液があ
る。好適な単位投与ｆｉｔは、−飲代１のペプチドある
いはその薬学上許容できる塩、例えば酢酸塩、塩酸塩、
トリフルオロ酢酸塩や値酸堰約ｃＬ１〜約５００Ｈｉで
ある。

投与回数は、病態や病状、患者の体厘や性別など幾つか
のファクターに依存するものであるが、薬剤師ならば簡
単に決定できるはずである。一般には、−日に１〜４回
投与する。

ペプチド１は、ペプチド化学でよく知られている方法で
製薬化でき、例えば樹脂合成固体状態で製薬化できる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
氷見Ｅ！Ａはこれらに限定されるものではない。

実施例１：ペプチドの一般的な固相合成法ｔ　　ＢＯＣ
−アミノ酸置換樹脂の製法クロロメチル化ポリスチレン
（１％架橋、２００〜４００メソシユ）をジメチルホル
ムアミド（ＤｈｉＦ　）（樹脂１ｇにつき約８〜１０ｍ
７り中で膨潤してから、ＩＪｏｃ−７ミ／［！１１！（
樹脂１　ｇニツキ１　モル）、次に７ツ化カリウム（樹
脂１ｇにつき２モル）で処理する。少針の溶剤（５〜１
ｏＲ６）’に減圧蒸留してから、混合物を８０〜１００
℃に１６〜１８時間加熱する。冷却しながら、樹脂を醐
過し、ＤＭＦ、　１　：１のＤＭＬ”　：　Ｈ，０、Ｈ
２Ｏ、エタノール、Ｃ１１２Ｃ１２及びメタノールで洗
浄してから、減圧乾燥する。

（重量増加によシ算出した）置換量はα４〜１１．６モ
ル／ｇである。

λ　一般的な合成法 所望順序で末端がＣのＢｏｃ−アミノ酸で置換した樹脂
の適値を室温（２０〜２５℃）で以下の試薬で順次処理
する。

ａ）ＣＨ２Ｃ１２ ｂ）５０％ＣＦ　ａ　ＣＯＯＨ：　ＣＨ２Ｃ１２（ｖ／
ｖ　）ｃ）５０％ＣＦ３ＣＯＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（２５
分）ｄ）　ＣＨ２Ｃｌ２（３倍） ｅ）イングロバノール ｆ）　１０％トリメチルアミン：ＣＨ２Ｃｌ２（ｖ／ｖ
）（２倍）ｇ）　ＣＨ２Ｃｌ□ ｈ）メタノール（２倍） ｉ）　ＣＨ２Ｃｔ　２　（２倍） 各処理の接触時間は処理Ｃ）を除き、３〜５分である。

各処理において樹脂１ｇにつき約１０〜１５ｍ１の溶剤
又は溶剤試薬混合物を使用する。

ｊ）適当に保護された、所望配列の１種のアミノ酸（３
当ｆｔ）のＣＨ２Ｃｌ、溶液と共に上記樹脂を攪拌して
から、これにシンクロへキシルカルボイミド（３当量）
のＣＨ，ＣＩ、溶液を加える。反応時間は少なくとも２
〜４時間であるが、反応は一夜（１６〜１８時間〕継続
してもよい。

ペプチド全結合した樹脂全濾過し、ＣＨＩ０１ｚメタノ
ール及びＣＨ，Ｃ１２で洗浄し、合成が完結したどうか
全ニンヒドリン反応で確認する。合成が不完全な場合に
は、試薬の半蓋を使用して、アミノ酸を再結合する。こ
のサイクルを上記配列の各アミノ酸について繰り返して
、完結させる。

末端がＮのＢＯＣ基を取除いた後、ペプチド結合樹脂？
慎重に洗浄し、減圧乾燥する。

樹脂からペプチドを外すと同時に、アニソール（１０％
ｖ／ｖ　）を含む無水７ノ化水素酸（樹力旨１ｇにつき
約１０ｔｕｌ）を用いて０℃で処理して、保護を外す。

フッ化水素敵全減圧蒸発しｆｃ仮、樹脂を希薄な酢酸水
浴液で洗浄して、粗ペプチドを抽出し、生成物を脂肪親
和性化によって単離する。

五　粗ベプ升ドの精製 例えば、Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｅｐ　５００装置を使用し
て、鎖の炭素原子数が１８のシラン化シリカを用いる逆
相ＨＰＬＣによって粗ペプチドを精製することができる
。トリフルオロ酢酸の１１％水溶液などの適当な緩衝水
溶液で平衡化処理した、５Ｘ３０ωカラムで、粗ペプチ
ド（約２ｇ）’ｔ”多量のアセトニトリルを含む勾配で
溶離処理する。画分全分析用ＨＰＬＣでチエツクし、精
製物を所望純度（〉９５％）で含む生成物を回収し、脂
肪親和性化する。最後に、所望塩形態のイオン交換樹脂
で処理して、生成物全所望塩形態にする。

Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−
Ａｒｇの合成りｏｃ−Ｎ−）シルーＬ−アルギニンを含
む樹脂（５ｇ、置換量：α５〜ｃ１．６モル／ｇ）を出
発原料とし、下記のアミノ酸を添加して、上記の一般的
な方法に従ってペプチドを合成する。

ｔＢｏｃ−Ｌ−アラニン ２、Ｂｏｃ−Ｎ−トンルーアルギニン（ＤＭＦ中）五　
ＢＯＣ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸４、　　Ｂｏ
Ｃ−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン ５、　　Ｂｏｃ　−Ｎｇ−）シルーＬ−アルギニン（Ｄ
ＭＦ中）上記の一般的方法に従って、Ｂｏｃ　−Ｎｇ　
−トシル−Ｌ−アルギニン置換樹脂（６ｇ１置換量：約
１ｌ１５モル／ｇ　）を下記のアミノ酸で順次処理する
。

１、Ｂｏｃ−Ｌ）−アラニン ２、　　ＢｏＣ−Ｎｇ−トシル−Ｌ−アルギニン（ＤＭ
Ｆ中）五Ｂｏｃ−γ−ベノジルーＬ−グルタミン酸４、
　　Ｂｏｃ−ε−２−クロロベンジルオキシカルボニル
−し−リシン ５、　　Ｂｏｃ　−Ｎｇ−トシル−Ｌ−アルギニン（Ｄ
ＭＦ中）Ｂｏｃ−Ｎｇ−ベンジル−Ｌ−グルタミンＭｋ
含有する樹脂（５ｇ、置換量：α５〜（１６モル／ｇ）
を出発原料とし、以下のアミノ酸を加えて、上記の一般
的方法に従ってペプチド全合成する。

１、　　Ｂｏｃ−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
リシン ２、Ｂｏｃ−Ｎｇ−）シルーＬ−アルギニン（ＤＭＥ’
中）Ａ　　ＢＯＣ−Ｎｇ−ベンジル−Ｌ−フルギニン酸
４、Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン ５、Ｂｏｃ−Ｎｇ−トシル−Ｌ−アルギニン（ＤＭＦ中
）Ａｒｇ　−Ｄ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｇｌｕの合成上記の一般的な方法に従って、Ｂ
ｏｃ−γ−ベンジルーＬ−グルタミン酸置換樹脂（６ｇ
１置換控：約ａ、ｓモル／ｇ）ｋ下記のアミノ酸誘導体
で処理する。

１、　　ＢｏＣ−ε−２−クロロベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リシン ２．　　ＢｏＣ−Ｎｇ−）シルーＬ−アルギニン（ＤＭ
Ｆ中）五　Ｂｏｃ−Ｎｇ−ベンジル−Ｌ−アルギニン４
、Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン ５、　　Ｂｏｃ　−Ｎｇ−）シルーＬ−アルギニン（Ｄ
ＭＩｅ甲）Ｂｏｃ−Ｎｇ−）シルーＬ−アルギニ／を含
有する樹脂（５ｇ１置俟童二約α５モル／ｇ）を出発原
料とし、以下のアミノ酸金加えて、上記の一般的方法に
従ってペプチドを合成する。

ｔＢｏｃ−Ｌ−アラニン ｌ　　Ｂｏｃ−Ｎｇ−ト’／に−７にギ＝　ｙ　（ＤＭ
Ｆ中）＆Ｂｏｃ−ｒ−ベンジルーＬ−グルタミン酸４、
　　Ｂｏｃ−ε−２−クロロベンジルオキシカルボニル
−し−リシン ａ　　Ｂｏｃ−Ｎｇ−トシル−Ｌ−アルギニン（ＤＭＦ
中）＆ＢＯＣ−Ｎ−）シルーＬ−アルギニン（ＤＭＦ中
）７、Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン ａ　　Ｂｏｃ　−Ｎ　　−）　シｈ　−フルキ＝　：／
　（ＤＭＦ中〕Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ
　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　　−Ａｒ
ｇ 実施例２：化学的性質 各ペプチドについてのデータを以下に示すが、本発明を
制限するものではない。

分子量：８１５．０ 外観二白色粉宋 アミノ酸分析 上記の一般的な方法に従って、Ｂｏｃ−Ｎ−ベンジル−
Ｌ−アルギニル（置換量二約α６ミリモル／ｇ、２０ｇ
）を下εピのアミノ酸誌導体で処理する。

１、　１３ｏｃ−２−クロロベンジルオキ７カルポニル
Ｌｋ３ｏｃ−ｒ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸Ｌ−グル
タミン酸の代りにＤ−グルタミン酸を使用して、ｊ３ｉ
Ｊ記の手順′に繰返す。同じ方法ケ用いて、下記のペプ
チドに製造する。

−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ｕｌｕ　−Ｌｙｓ　
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−
Ａｌａ　−Ａｒｇアラニン　　　　　　　１．００ リシン　　　　　　　　　１．００ グルタミン酸　　　　　　１．００ ［ＩＬ９７ １．００ １．００ ペプチド言１：ｓａ、ｑ％（±０５％）。

ペプチド純度：　９ａ６２％。

ＨＰＬＣ：下記の方法で分析を行った。

ｍｙ剤　：　Ａ　＝　ＮａＨ２Ｐす４　２５ｍＭ　＋　
Ｎａ０１０４　６０ｍＭ。

ｐＨ２，９、）ｉ３ＰＵ、併用。

Ｂ＝６０％Ｃ１−１３ＣＮ　＋　４０％）ｉ２０゜勾配
：Ａの１００％からＢ″′！、で直線勾配、２０分。

カラム：　Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　ＯＤＳ　５　μｍ
、　４．６ｒｎｍｘ　２５ｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ　）。

流量：　　ＣＬ９罰／分。

波長：２１０ｎｍ０ 保持時間：２１分。

Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−ＧＩＬＬ　−Ａｒｇ　−Ｄ　−Ａ
ｌａ　−Ａｒｇ分子ｉ、ｊ：８１５．０ 外観：白色粉末 ８２６０％ＣＨ３ＣＮ　＋　　４０チＨ，０゜勾配：５
０分でＢが０から２５％まで変化。

カラム：　Ｄｅｌｔａｐａｋ−ＣＩ　８　１５μｍ、　
Ａ９ｍｍＸ３０ｃｒｎ流量：１７４７分。

波長：２１０ｎｍ。

保持時間二２２分。

Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−
Ｇｌｕ分子蓋：ａｌｓ。

外観：白色粉末 アラニン １．００　　　　　　１．０５ リシン １、００　　　　　　１．００ グルタミン酸 １．００ １．０１ アラニン リシン グルタミン酸 １．００　　　　　　１．０１ １．００　　　　　　α９９ ｉ、　ＯＯ１，００ ペプチド言量二６５．９％（±α３チ）。

ペプチド縄反：９９．２係。

ＨＰＬＣ：下ｇ己の方法で分析を行った。

溶離剤：　Ａ　＝　ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ　＋　Ｎａ
ＣｌＯ４７０ｍＭ。

ｐＨＨＯ２Ｈ３ＰＯ４併用。

ペプチド金蓋ニア＆５％（±１１３チ）。

ペプチド純度：９９．８１％。

）１ＰＬｃ　：下記の方法で分析を行った。

溶［１ドＡ　＝　ＮａＨ２ＰＯ２２５ｍＭ　＋　ＮａＣ
ｌＯ４６０ｍＭ。

ｐＨ２，９、Ｈ３Ｐ０．併用。

Ｂ　＝　６０％ＣＨ３ＣＮ　　＋　　４０４Ｈ１０゜勾
配：Ａの１００％からＢまで直線勾配、１慢／分。

カラム：　Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　ＯＤＳ　５μｍ、
　４．６ｔｔｒｔｘｘ２　Ｓｃｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ　）
。

流量：１９ｄ１分。

波長：２１０ｎｍ。

保持時間：２０分。

Ａｒｇ　−Ｄ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｇｌｕ分子ｉ：８１ａＯ 外観：白色粉末 ｐＨＨＯ２Ｈ３Ｐ０．併用。

Ｂ＝６０チＣＨ３ＣＮ　　＋　　４０慢Ｈ，０゜勾配：
３０分でＢが０から２５％まで変化。

カラＡ　：　Ｄｅｌｔａｐａｋ−ｃ　１　Ｂ　　１５４
ｍ、　ｌ？ｍｍＸ　３０ｃｙｙ＋流１１：α７ｔｄ／分
。

波長：２１０ｒ１ｍ。

保持時間：２５分。

Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｕ
−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ分子ｉ１：１１９ａ５ 外観：白色粉末 アラニン １．００　　　　　　　Ｑ、９８ リシン １、００　　　　　　１．　Ｏ２ グルタミン酸　　　　　　　１．００　　　１．　ＯＯ
ペプチ ベプチ ＨＰＬＣ 溶離剤 ド含量：　７４０％（上２゜７％）。

ド純度：９９．１％。

；下記の方法で分析を行った。

：　Ａ　＝　ＮａＨ２ＰＯ２２５ｍＭ　−１−ＮａＣｌ
Ｏ４７０ｍＭ。

アラニン　　　　　　　　２．００　　　２．０１リシ
ン　　　　　　　　　１．００　　　１．０５グルタミ
ン酸　　　　　　　１．００　　　α９９アルギニン　
　　　　　　５．００　　　４．９１ペプチド含量：Ｓ
９．６％（±１２％）。

ペプチド純度二９９．２％。

ＨＰＬＣ：下記の方法で分析を行った＠溶離剤：Ａ　＝
　Ｎ　ａＨ４ＰＯ４２５ｍＭ　＋　Ｎａ　０１０４７０
ｍＭ。

ｐｉｎ　ＯｌＨ，ＰＯ４併用。

Ｂ　＝　６０％ＣＨ３ＣＮ　　＋　　４０％Ｈ，Ｏ０勾
配：２５分でＢが０％から２５％まで変化。

カラム：　Ｄｅｌｔａｐａｋ−Ｃ１ａ　　１５μｍ、　
Ａ９ｗｎＸ３０ｍ流旦：１１７ｄ／分。

波長：２１０ｎｍ０ 保持時間：２６分。

Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ 分子量：４３１．５ 外観：白色粉末 アミノ酸　　　　　　　　計算値 グルタミン酸　　　　　　　１．００ リシン　　　　　　　　　１゜００ アルギニ：、ｙ　　　　　　　　　１．００ペプチド含
シ：７１．２％（±３％）。

ペプチド純度二〉９７％。

Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ 実測値 １．０６ 分子量：４５１．５ ＴＬＣ：ブタノール／　ＡｃＯＨ／Ｈ！０４／２／２几
ｆ＝［Ｌ２ ペプチド含量：ａｔＯ％。

アミノ酸分析 グルタミン酸　　　　　　　１．　ＯＯ１，００リシン
　　　　　　　　　　１．　ＯＯｔ　Ｏ３アルギニン　
　　　　　　　１．Ｏｏ　　　α９６Ａｒｇ−Ａｌ　ａ
−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ分子ｉ１：８１５ アミノ酸分析 アミノ酸　　　　　　　　計算値　　実測値アルギニン
　　　　　　　　五〇〇　　　五１゜アラニン　　　　
　　　　１．００　　　　（Ｌ９０グルタミｙ　ｒＲｌ
、　ＯＯ１，０２ リシン　　　　　　　　　　１．００　　　α９６ベプ
チド含量ニア４．４％。

ペプチド純度：９ａ６％。

ＢＰ−ＴＬＣ：Ｈ，Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ　８０／２
０／１１１几Ｆ＝ＣＬ８Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ分子量：８１５゜ アミノ酸分析 アミノ酸　　　　　　　　計算値　　実測値グルタミン
酸　　　　　　　１．００　　　１．１１リシン　　　
　　　　　　ｔｏｏ　　　　ｔｏ。

アルギニン　　　　　　　五００　　　　Ｏ，９９アラ
ニン　　　　　　　　１．０ロ　　　２．９９ペプチド
含Ｌ！ニア４３％。

ペプチド純度、９５％。

Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ
−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ分子量：　１２２ａ４゜ ＢＰ−ＴＬＣ：Ｈ２０／ＣＨ，ＣＮ／ＴＦＡ　ａｏ／２
ｏ／１ＲＦ＝ｎａアミノ酸分析 グルタミン酸　　　　　　　２．００　　　２．００リ
シン アルギニン ２．８０　　　　　　１．９４ ４．００　　　　　　３．９７ ペプチド含１：８５％。

ペプチド純度二〉９５係。

実施例３：生物学的性質 模擬胃液ＵＳＰＸＸ１（ＨＣ１＋ペプシン）全使用した
試験管内模擬胃液中で、ヘキサペプチドＡｒｇ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ及びＡｒ
ｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌ
ｕは５７℃で３時間安定である。

脱毛マウスからの膵臓細胞におけるＴｈｙｌ、２異なる
ペプチド濃度で１８時間培養した後、先天的な無胸腺症
の脱毛マウスの膵臓細胞を使用した。Ｔｈｙ　１．２遺
伝標識の誘導を螢光顕微鏡によって直接免疫螢光法によ
シ計価した。

以下に示す結果から、ヘキサペプチドＡｒｇ　−Ｌｙｓ
　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ及びＡｒｇ
　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ
は’ｒｈｙ　ｉ　、　２遺伝標識−＋誘導でき。服量−
反応関係が、免疫刺激化合物に％徴的なベル形曲線金示
すことがわかる。

ペプチド濃度 μｇ廁 ０．０００１ Ｑ、００１ （１，０１ へ− ％Ｔｈｙ ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＧＬＵ− ＡＩ（Ｇ−ＡＬＡ−ＡＲＧ 試験１　試験２ １．２＋細胞 ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＡＲＧ− Ａ）ＬＧ−ＬＹＳ−ＧＬＵ 試験１　　試験２ リペプチドＧｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ　；ヘキサペプ
チドＡｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ
　−Ｇｌｕ　、　Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ａｒ
ｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　、　Ａｒｇ　−Ｄ　−Ａｌａ
−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　％Ａｒｇ　
−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ　−Ｄ　−Ａｌａ　−Ａ
ｒｇ　；及びノナペプチドＡｒｇ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ
　−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ
　−ＡｒｇはヒトのＰ）ＬＡ活性化リンパ球のＲＮＡ合
成を刺激できることが理解できる。

試験管内でフィトヘマグルチニンで刺激したα５％フィ
トヘマグルチニンの存在下、異なるペプチド濃度で２４
時間試験管培誉したヒ）　Ｔ　−リンパ球を３１１−ウ
リジン標識によってＲＮＡ合成について分析した。下記
の表に示す結果から、トペプチド濃度 ３Ｈ−ウリジン配合（ｃｐｍ） Ｑ、０００１ Ｑ、００１ へ０１ Ｑ、１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 十 ＋ １６つの値の平均 Ｃ）ＬＬＩ−ＬＹＳ−ＡＲＣ濃度 ５Ｈ−ウリジン配合（ｃｐｍ） （５４５）ｘ肴 （３１１）ｘ″ 対照 ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＡＲ，Ｇ ±ＳＥ Δ俤 ＋　２１７ ＰＨＡで刺敏したヒトＴ−リンパ球におケ、６抗−Ｔ３
単りローン系抗原で活性化したヒトＰＨＡより特異性が
強い賦活剤、即ち抗−Ｔ５単クローン系抗原（ｔｓ６ｎ
ｇ／ｄ）ｋ用いて試験管内で活性化処理し友ヒ）　ＩＪ
ンノく球を１μｇ／−のＧｌｕ−Ｌｙｓ　−Ａｒｇでイ
ンキエベーションし、３Ｈつ１ノジンを配合してＲＮＡ
合成全評価した。

以下の表に示す工うに、この場合もまた、ペプチドは既
に活性化処理した細胞のＲＮＡ合成を強イヒできる。

［１５％ＰＨＡの存在下、異なるペプチド濃度で７２時
間インキュベーションしたヒトリンパ球のＤＮＡ合成（
増殖）について５１−１−チミジン標識にニジ評価を行
った。

以下の表に示す結果から、ペプチドがＤＮＡ合成全刺敵
できることが理解できる。

μｇ／ゴ ＡＲ，Ｇ−ＬＹＳ−（）ＬＵ− Ａ几Ｇ−ＡＬＡ−ＡＲ（）− Ｑ、０００１ Ｑ、Ｏｆ Ｑ、１ ６１６８２　　＋ ６９１６４　　＋ ７６８２１　　＋ ８０９２０　　＋ ７４６４８　　＋ ６２８６５　　＋ ７９Ｂ５ ＋ ＋１６ ＋３０ ＋５２ ＋５１ ＋１７ ”５つの値の平均 ＧＬＵ−ＬＹＳ−Ａ几Ｇ （＜４５６） （ｉ５２） １２Ω 健康状態の良好な有志から得た末梢血液単核性ｍ胞（Ｆ
ＢＭＯ）　ｆ　ＣｏｎＡでインキユベーシヨンして、標
識チミジン吸収として増殖を評価した。

ＰＨＡ活性化処理細胞による試験管内ＩＬ−１μｇのペ
プチド全存在させた状態、あるいは存在させない状態で
ＰＨＡｔ−用いてヒ）　Ｔ　−＋７ンバ球をインキエベ
ーションした。ただし、処理時間はＩＬ−２の場合には
２４時間、ＢＣＧＦの場合には７２時間、そしてガンｉ
インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の場合には５６時間で
ある。

上澄み液を集め、濾過（ｃＬ２μｍ）し、異なる濃度で
新しいＴ−リンパ球に添加することによシ、あるいは長
時間培養で得たＢ−細胞に添加することによりＩＬ−２
又はＢＣＧＦの活性について評価全行った。対応する成
長因子の存在に依存する、該細胞の増殖活性（ｉ７３Ｈ
−チミジン全配合して評価した。

また、ＥＬＩ、ＳＡキット（ＡＭＧＥＮ　）により上澄
み液のガンマインターフェロン活性を評価した。

以下の表に示した結果から、ペプチドによるリンフ才力
イン生産に刺激作用があることが理解できる。

硼　＊ 雪 劇　ゆ 出 ＣｏｎＡ刺激ヒト細胞による試験管内ＩＬ−２生産 健康な有志から得たＰＢＭＣ＝ｉ異なるペプチドで一夜
インキエベーションし、ＥＬＩＳＡ試鋏において３０分
後又は６０分後にプレートを読み取ることによってＩＬ
−２生産について分析を行った。

細胞は、１０ｍＣｇ／鵞のＣｏｎＡで賦活処理した。結
果から、これらペプチドがＩＬ−２生産を促進できるこ
とが理解できる。

ＣｏｎＡ賦活性処理ヒト細胞によるガンマイ２．５　ｍ
ｃｇ／　ｒｔｔｌのＣｏｎＡ及びペプチドを用いて、健
康な有志から得たＰ　ＢＭＣを一夜インキエベーション
した。ＥＬＩＳＡ試験によってガンマインターフェロン
の存在について上澄み液を調べた。

最大濃度で、すべてのペプチドはインターフェロン生産
全促進する。

ミトゲン誘導増殖の体外刺激 （体重２８ｇの）脱毛無胸腺症に１日２　Ｑ　ｍｃｇ／
マウスの投与量で５日間、２週間又は６週間ペプチド全
経口投与又は非経口投与して、ミトゲン誘導増殖の刺激
作用を調べた。最後の処理から２４時間後に試験動物は
絶命した。膵臓細胞による標識チミジン吸収としてＤＮ
Ａ増殖を求めた。使用したミトゲ／はフィトヘマグルチ
ニン（Ｐ）ＩＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）及び
アメリカヤマゴボウミトゲン（ｐｗＭ）である。

以下の表の結果から理解できるように、ペプチドの体内
投与は、ミトゲン誘導増殖を促進できる（体外測定によ
る）。

１０　ｎＣｇ　／　７ウスのペプチドＡＲＧ−ＬＹＳ−
ＧＬＵ−１０ｍｃｇ　／−ｒウスのＡＲＧ−ＬＹＳ−Ｇ
ＬＵ−ＡＲＧ−Ｄ−ＡＲ（）−ＡＬＡ−ＡＲＧを５日間
経口投与した脱毛マウス　　ＡＬＡ−ＡＲＧ　ｉ　５日
間経口投与した脱毛マウスにおにおけるミトゲン誘導増
殖（ｃ、ｐ、ｍ、：平均±８．Ｅ、　）　　　けるＰＷ
Ｍ−誘導増殖（ｃ、ｐ、ｍ、　：平均±８．Ｅ、）ミト
ゲン チ ＨＡ α００ ［１１５ ［１６２ １，２５ ２，５０ ＣｏｎＡ　　　α００ Ｑ、６２ １．２５ ２．５０ ５．００ 対照 ６１４±２３４ １１０９±５１１ ３０４３±５１９ １２３０±１０４ １２１５±１１６ ９５４±１８２ ８３９±６５７ ９０３士　５ ８０５±　９１ ３５９±１４５ １９７±　１７ ２８６±　５０ Δ慢 ペプチド ６３０±　３７９ １５１５±　７８６ ２９６５±　８５０ ３０４７±　７２ ６０６４±２９６２ ５７３８±　９１０ １０９３土 １７５２± ２１５２± １６５７± ９４６士 １０７１士 （１１５＃　　　　８６７±　２９１　３９１４±１０
５５　　＋　　３５１［ＬＳＩ　　　＃　　２８５５土
１２７９７０７６±７７７　＋　　１４ａα６２　　１
　１２４６±５４９２８２１±１４７６　＋　　１２６
１．２５　　　＃　　　６８１±　１６８　６５７±　
１７０−４２．５０　　１　　７２７±　１５０　６５
４±　３Ｏ−１５（ＬＯＯｉ、ｐ、　　１７２８土　５
０１２１０３±３５１−１−２２（Ｌ１５　　１　５３
５２±２９２５９０２８±１６４１＋　　６９（ＬＳＩ
　　　１　５８Ｂ２±１６５４７０２７±１０５９　＋
８１（Ｌ６２　　　　＃　　　２５０１±１５５５　５
９９９±３２０５　　＋　　１４０１．２５　　　ＩＦ
　　２５５４±９２０４１８７±８４２＋７９２．５０
　　　１　　２６０９±１５６１　４２０１±２１１　
　＋　　　６１１０ｍｃｇ／マウスのペプチド？２週間
経口投与し　　１０ｍｃｇ／−ｒウスのペプチドｆｔ６
週間経口投寿し九脱毛マウスにおけるミトゲン置場増殖
（ｃ、ｐ、ｍ・　　た脱毛マウスにおけるミトゲン誘導
増殖（ｃ、ｐ、ｍ。

：平均±Ｓ、Ｅ、　）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　：平均±８．Ｅ、）ＰＨＡ　　α００　４１４０
±１９６　　４６７２±　１１　　＋　　　１ｉＳα５
０　４２０１±５０６　　　６８７６±　　９６３　　
＋　　　６５１７５　４０９８士５０１　　７７４０±
　６３０　　＋　　　８９１．００　４６０７±５５５
　　１９８４２±　　５９４　　＋　　５８５２．００
　４４７０±３４３　５５６５７±　６１９　　＋　　
６９８ＣｏｎＡ　　［１００４２６９±５８７　　５５
２８±　５１４　−　　　ｉ８α５０　４２７２±　７
７　１１ＳＳＳｂ±１７９０６　　＋２５５８１７５　
　ｉ＄８９６±５８４　　７５９５２±　ａａ８９　　
＋　１７９８１．００　４１９４±７０９　　　６８０
５±　　３８９　　＋　　　６２２．００　１５１７±
５６２　　　　７６２±　　２４０　−　　５０ＰＷＭ
　　ｃＬｏｏ　　１３６３±１４２　　２３１９±　２
２０　　＋　　　７０α５０　２０７４±２０６　２２
１１６±　２８１１　　＋　　９６７ａ７５　１９０±
　２８　　２１４４８±　　７１７　　＋　　９７８１
．００　２５５１±８７３　　２１９１９±　２５０６
　　＋　　８５２２．００　１６０２±１０９　　１２
８１６±　　８３９　　＋　　７００ミトゲン　チ　　
　　対照　　（ＪＬＵ−ＬＹＳ−Ａｌの　Δ優（：：ｏ
ｎＡ　　αΩ０　１００１±５８７２６７１±３３１　
　＋　１６７０２５　５５６８±　７１４８２５±８７
７＋３５（１５０２６７０±　　５９　　５５１１　　
±　１ｒＪ５０　　　　＋　　９９１．００　５１０５
±１２３　７３６１±　４０４　　＋１３７２．００　
　　２１２８　　±　１０６　　３１４１　　±　　１
０１　　　　＋　　４８４．００　　　　　８５３１　
　±　　　１６　　　　９５９　　±　　２２１　　　
　＋　　１２）’ＷＭ　　０．００　１２２８上１７５
３７７９±１１４２　　＋２０８α１２５　７７９±　
５０２２６４±　１９８　　＋１９１０．２５　１１０
６±１６７２１２４±　２１１＋９２（１５０２３２２
±　２９９　　２６４６　　±　　１４１　　　　＋　
　１４１．００　１１４６±４７６２６Ｌ６±　６４　
　＋１２８２．００　　８９８±５２５２６０７±　５
８４　　＋１９０１０ｍｃｇ／マウスのペプチドを６週
間経口投与した脱毛マウスにおけるミトゲン誘導増殖（
ｃ、ｐ、ｍ、　：平均±Ｓ、Ｅ、） ミトゲン　優　　　　対照　　０ＬＵ−ＬＹＳ−ＡＲＧ
　　Δ優ＣｏｎＡ　　　Ｏ，００２０１５±１５９　　
２５８５±　４９１　　＋　　２８０．２５　２０８４
±１０１　６４８６±　３８８　＋　２１１α５０　２
３１３±ｆ５７１００９９±５８４　＋　５５７１．０
０　５２８９±１５５１７１９２±　１６９　＋４２５
２．００　　２４９１３±６４７　１０８５０±１４５
９　　＋５５４４．００　　１５２５±１０７　　２４
７２±　９０１　　＋　　６２ＰＷＭ　　（ＬＯＯ１９
５６±１５０　２８５６±　ｉ１５　＋　４８（Ｌ１２
５２４６４±２９７　３４５７±９１４　＋　５９α２
５　　２９９ｉ±　９５　　５９５５±　１９３　　＋
　　３２α５０　　２４５４±５４０　　３５０５±　
５０２　　＋　　４４１．００　　　３１７７　　±　
２９２　　　３２４６　　±　　８６０　　　＋　　　
５２．００　２５０９±５５９　２４５５±４６７−２
本発明のペプチドの致死量は、マウスへの非Ｍ口投与の
場合、５００Ｑｌ／陽以上であった。

代　理　人：弁理士 高野武和賀 実施例４：急性毒性

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）一般式 I ： Ａ−ｘ−Ｌｙｓ−ｙ−Ｂ（ I ） （ただし、 ＡはＨ、次式Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇのトリペプチド又
   はＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇの
   ヘキサペプチドであり、 ｘ及びｙはそれぞれ異なり、アルギニン（Ａｒｇ）又は
   グルタミン酸（Ｇｌｕ）残基であり、 ＢはＯＨ又はトリペプチドＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇであ
   るが、Ａは水素で、ｘはＡｒｇであり、ＢはＯＨとは異
   なる）で示されるペプチド。 （２）アミノ酸がＤ−、Ｌ−又はＤＬ−配列のものであ
   る請求項第１項記載のペプチド。（３）一般式 I で示
   されるペプチドの酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩
   、塩酸塩。 （４）Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒ
   ｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ａ
   ｒｇ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｕ、Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ
   ｌｕ、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
   、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
   Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ及び
   Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇ
   ｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇからなる群から選択する請求項第
   １項又は第２項記載のペプチド。 （５）許容できる担体との混合物の形で請求項第１〜４
   項いずれか１項記載のペプチドを有効成分として含有す
   る免疫刺激活性を示す薬剤組成物。 （６）請求項第１〜４項いずれか１項記載のペプチドを
   使用する、免疫刺激活性を示す、一次又は二次免疫欠損
   症の治療用薬剤の製造方法。 （７）一般式 I ： Ａ−ｘ−Ｌｙｓ−ｙ−Ｂ（ I ） （ただし、 ＡはＨ、次式Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇのトリペプチド又
   はＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇの
   ヘキサペプチドであり、 ｘ及びｙはそれぞれ異なり、アルギニン（Ａｒｇ）又は
   グルタミン酸（Ｇｌｕ）残基であり、 ＢはＯＨ又はトリペプチドＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇであ
   るが、Ａは水素で、ｘはＡｒｇであり、ＢはＯＨとは異
   なる）で示されるペプチドを製造するさいに、 （ａ）Ｂｏｃ−保護カルボキシ末端アミノ酸を適当な樹
   脂に結合し、 （ｂ）所望の順序で他のＢｏｃ−保護アミノ酸と樹脂結
   合カルボキシ末端アミノ酸を反応させ、そして （ｃ）保護基を外し、得られたペプチドを樹脂から外す
   ことからなる、一般式 I のペプチドを製造する方法。