JPH07500971A - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子変異体関連出願に対するクロス・リファ レンス本出願は、米国特許出願第０７／８０８５３７号（１９９１年１２月１６ 日出願）、および現在米国特許第５１４７６４３号となっている米国特許出願第 ０７／７４１１２０号（１９９１年８月５日出願）、ならびに、米国特許出願第 ０７１０７１５０６号（１９８’７年７月９日に出願され、放棄される）、米国 特許出願第０６／８４６６９７号（１９８６年４月１日に出願され、放棄される ）、および米国特許出願第０６／７２５４６８号（１９８５年４月２２日に出願 され、・放棄される）の継続出願である米国特許出願第０７／１８６４９４号（ １９８８年４月２６日に出願され、放棄される）の継続出願であり、現在米国特 許第５０７３４９４号となっている米国特許出願第０７１５２２４８０号（１９ ９０年５月１１日出願）の、米国特許法１２０／１２１の下での継続出願である 。

発明の分野 本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の特別な新規変異体を 目的とするものである。これらの変異体は、下記のような先行する開示により一 般的に包含されてはいるものの、基本的な組織プラスミノーゲン活性化因子の分 子またはセリンプロテアーゼであるトリプシンおよびキモトリプシンのモデルに 関する他の者の先行研究からは予測を許さない活性を表わす、新規な特異的誘導 体である。

本発明における好ましい態様として、組み替えＤＮＡ技術による係る変異体の製 造が企図され、同様に本発明は、係る技術に含まれる関連化合物および手段、即 ち、係る変異体をコードしているＤＮＡ単離物、発現ベクター、トランスフェク トされた宿主細胞およびこれらの各々を製造し使用する方法を包含する。本発明 に係る新規な変異体は、予想外に増強されたフィブリン特異性を有する。

発明の背景 プラスミノーゲン活性化因子は、チモーゲンであるプラスミノーゲンを凸性化し て、フィブリンを含む様々な蛋白を減成するセリンプロテアーゼであるプラスミ ンを生成する（Ａｒｇ５６１−Ｖａ　１５６２における開裂による）。研究され ているプラスミノーゲン活性化因子には、細菌蛋白ストレプトキナーゼ、腎臓そ の他の場所で合成され、最初に尿から抽出された酵素ウロキナーゼ、および、血 管壁に沿って位置する細胞により産生される酵素、組織プラスミノーゲン活性化 因子（ｔ−ＰＡ）　、がある。

これらプラスミノーゲン活性化因子の作用メカニズムはそれぞれ異なっているコ ストレプトキナーゼはプラスミノーゲンまたはプラスミンと複合体を形成してプ ラスミノーゲンを活性化する活性を生み出し、ウロキナーゼはプラスミノーゲン を直接開裂し、モしてｔ−ＰＡは最大のプラスミノーゲン活性化活性を導くため にはフィブリンを必要とする。

ｔ−ＰＡは、一部にはそのフィブリン特異性およびインビボで血餅を溶解する大 きな能力の故に、心筋梗塞および肺動脈塞栓症のような血管疾患の処置において 驚くべき結果を示す、特に重要且つ強力な新しい生物学的薬物として同定され記 載されてきた。

組織プラスミノーゲン活性化因子は、最初に天然の材料から実質上純粋な単離物 として同定され、コレン等（欧州特許出願公開第０４１７６６号（１９８１年１ ２月１６日公開。１９８０年６月１１日の最初の出願に基づく。）によって、必 要なプラスミノーゲン活性化因子の活性が試験された。米国特許第４７５２６０ ３号（１９８８年６月２１日登録）およびリジュケン等、ジャーナル・オブ・バ イオロシカ／ｌ／−ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５６巻７０３ ５頁（１９８１）をも参照されたい。

続いて、譲受人の研究室の研究者等は、組み替えＤＮＡ技術によって、明瞭な環 境で、基礎となるＤＮＡおよび推論されたアミノ酸配列により完全に特性決定さ れ、通常これに付随する蛋白を本質的に含まない、大量の組織プラスミノーゲン 活性化因子を産生じた。この仕事は、科学文献、および１９８２年５月５日の最 初の出願に基づいて１９８３年１１月に公開された欧州特許出願公開第０９３６ １９号に記録されている。１９８８年８月２３日登録の米国特許第４７６６０７ ５号、およびペニカ等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３０１巻２１４頁（１ ９８３）をも参照されたい。上記の特許出願（ＥＰＯ公開第０９３６１９号）は 、例えば基礎となるＤＮＡの位置指定突然変異生成により製造された、アミノ酸 の置換、除去、付加、または置き換えにより様々に修飾された、種々のヒトプラ スミノーゲン活性化因子誘導体の製造を目的とするものである。

ｔ−ＰＡのプロテアーゼ開裂部位の修飾に関するさらなる特許文献については、 例えばＥＰＯ特許第２４１２０９号；１９８６年１１月１２日公開のＥＰ２０１ １５３号；　１９８７年８月１９日公開のＥＰ２３３０１．３号；１９８８年１ ２月７日公開のＥＰ２９３９３６号；および１９８８年１２月７日公開のＥＰ２ ９３９３４号：ならびにＷＯ３８／１０１１．９号を参照されたい。

１９８８年１１月２３日公開のＥＰ２９２００９号（優先権１９８７年５月２２ 日）は、２７４−２７７位に成るアミノ酸置換を有するｔ−ＰＡを含む、ｔ−Ｐ Ａｒ類似体」に言及している。その他の、よりラジカルな類似体が記載されてい る。単一の２７６「類似体」は、イソロイシンがプロリンに置換されている。

野生型ｔ−ＰＡと比較して、フィブリノーゲンにより刺激される（または血漿に より刺激される）活性に対するフィブリンにより刺激される（または血漿血餅に より刺激される）活性の比率が高い、即ち、よりフィブリン（または血漿血餅） 特異的であってその結果、血餅の部位でのみ作用し全身的には作用しない、ｔ− ＰＡ分子を提供することが望まれる。したがって、フィブリン特異的であって、 その結果としての改善された治療的および薬学的特性を表わす、ｔ−ＰＡ分子を 提供することが、本発明の目的である。

血餅の部位でのみ活性であり、且つ他の血餅溶解剤より高レベルで有用な血餅溶 解剤の使用を許容する、処置のための条件を提供することがもう一つの目的であ る。

発明の要約 本出願は、予想外に増強されたフィブリン特異性を表わす、ｔ−ＰＡの新規な変 異体を目的とするものである。本発明に係る個々の特異的変異体は、野生型ｔ− ＰＡのアミノ酸配列の２７６位に相当する位置にイソロイシン以外のアミノ酸を 有するそれである。これらの変異体のうち幾つかは、２７５−２７７位の範囲内 にこれ以外のアミノ酸置換を持っていない。２７６位とは、成熟した野生型ｔ− ＰＡ分子の合計５２７アミノ酸の配列のＮ末端から２７６番目のアミノ酸を意味 する。

これら２７６変異体の幾つかは、既知の２７５／２７６開裂部位における蛋白分 解的開裂に多少抵抗する。

したがって、開裂に対する抵抗性および／またはフィブリン特異性を付与するこ とに関して本明細書中に表わされる態様は、二つの特別な２７５／２７６および ２７７／２７８位の間のアミノ酸を修飾することである。個別的態様は、二つの ２７５／２７６および２７７／２７８位の間のアミノ酸を修飾すること、即ち、 例として、２７６ｔ−ＰＡ変異体、例えばＰ２７６ｔ−ＰＡ、Ｄ２７６ｔ−ＰＡ 。

５２７６ｔ−ＰＡＳＡ２７６ｔ−ＰＡ、Ｈ２７６ｔ−ＰＡ、Ｗ２７６ｔ−ＰＡ。

Ｙ２７６ｔ−ＰＡ等を作るアミノ酸２７６を修飾することである。本明細書中で 目的とされるその他のさらなる２７６変異体は、Ｅ２７５Ｐ２７６ｔ−ＰＡ、Ｐ ２７６１２７７ｔ−ＰＡ、およびＥ２７５Ｐ２７６Ｉ２７７ｔ−ＰＡであり、は ぼ２７０ないしほぼ２７９の領域内、またはその他の部位でのさらなる突然変異 生成が、本発明の文脈から、得られるｔ−ＰＡ分子の開裂され易さにより測定さ れる一つの終点、および／またはフィブリン特異性の増大により測定されるもう 一つの終点に従う。

本発明において、２７６位の変異体が、野生型ｔ−ＰＡに比べ予想外に増強され たフィブリン特異性を表わすことが判明した。このような２７６変異体の成る好 ましいものは、２７５−２７７の範囲内またはより広い２７０−２７９の範囲内 のどの位置にも、これ以外の変異を有していない。

さらに本発明の範囲内に含まれるのは、好ましい組み替えＤＮＡ技術の方法を使 用して本発明に係る変異体を製造するための手段および関連化合物、即ち、係る 変異体をコードしているＤＮＡ単離物、発現ベクター、トランスフェクトされた 宿主細胞およびこれらの各々を製造し使用するための方法である。

さらに別の態様において、本発明は、薬学上許容し得る担体と混合した治療的有 効量の本発明に係る変異体からなる、血管の状態または疾患を処置するための組 成物を目的とする。

さらに、薬学上許容し得る担体と混合した治療的有効量の本発明に係る変異体か らなる、フィブリンの沈着または癒着の形成もしくは再形成を防止するための組 成物が、本発明に包含される。

さらに別の態様において、本発明は、上に記載される適当な組成物の有効量を哺 乳動物に投与することからなる、哺乳動物の血管の状態または疾患を処置する方 法を提供する。

本発明の重要な側面は、よりフィブリン特異的であって、その結果非修飾ｔ−Ｐ Ａよりも選択的に血餅の部位に作用する、ｔ−ＰＡ分子を取得することである。

図面の簡単な説明 図１は、ヒトｔ−ＰＡのＤＮＡの制限地図であり、５°および３′非翻訳領域な らびにブレーｔ−ＰＡをコードしている配列を含んでいる。点を付した領域はｔ −ＰＡの構造遺伝子を表わす。

図２ａ、ｂおよびＣは、５°および３′非翻訳領域を含むｔ−ＰＡのＤＮＡおよ びアミノ酸配列を表わす図である。

図３は、Ｓ−２２５１検定における、野生型ｔ−ＰＡ（活性＝１．　０）と比較 した２７６位におけるｔ−ＰＡ変異体の活性を示す図である。この図において、 数字の前に現われる文字はその番号位置の天然のアミノ酸であり、数字の後に現 われる文字はその位置の変異体のアミノ酸である。ｒＦｎＪは、その検定がフィ ブリンの存在下で行なわれるよう、フィブリノーゲンおよびトロンビンを添加し たことを示す。ｒＦｇＪはフィブリノーゲンのみの添加を示す。ｒＵｎｓｔｉｍ Ｊは、Ｓ−２２５１基質に加えてｔ−ＰＡ変異体およびプラスミノーゲンのみが 存在することを示す。

図４は、フィブリノーゲンの存在下でのプラスミノーゲン活性化の反応速度定数 を示す図である。。プラスミノーゲン活性化に対する反応速度定数に、およびに ３１、の推定値は、無血清培地中、２９３細胞において発現されたｔ−ＰＡ変異 体の試料を用い、フィブリノーゲン（１，１μＭ）の存在下で決定した。

図５は、トロンビンを用いてフィブリノーゲンを凝固させた外は図４と同様の、 フィブリン存在下でのプラスミノーゲン活性化の反応速度定数を示す図である。

詳細な説明 本明細書中使用される、「組織プラスミノーゲン活性化因子」、「ヒト組織プラ スミノーゲン活性化因子」、「ヒトｔ−ＰＡＪ、またはｒｔ−ＰＡＪとは、例え ば組替え細胞培養系により、プロテアーゼ部分を含みその他の点では人間の組織 にとって天然のプラスミノーゲン活性化因子に相当する生物活性型で産生される 、ヒト外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を意味する。配列全体にわ たるアミノ酸の相違によって立証される、天然の対立遺伝子変異が存在し、そし てこれが個体によって異なるということが理解されるであろう。さらに、グリコ ジル化のパターンは、宿主細胞の環境の性質に大きく依存するであろう。

さらに、この語は、配列全体の中に（天然に存在する）対立遺伝子を越える他の アミノ酸の相違を含む「生物学的等価分子」を意図する。これは、故意に導入さ れることもあれば、クローニングの際の過誤等により偶然導かれることもある。

本明細書中使用される「野生型ｔ−ＰＡＪという語は、その内容を説明的に引用 して本明細書の一部とする、米国特許第４７６６０７５号（上記）により報告さ れている、ｃＤＮＡによりコードされているｔ−ＰＡを意味する。このようにコ ードされているｔ−ＰＡは好適には、任意の天然の供給源由来、または２９３も しくは２９４細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞等を包含する任意の組み替 え発現系由来のｔ−ＰＡ分子である。

ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は、様々な他の蛋白、例えばトリプ シン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、プロトロンビン、フィブロネクチン および表皮成長因子において同定されたホモローガスなまたは他の点で類似する 構造に関連して定義された、五つのドメイン（アミノ酸配列のつながり）を含む という事が、現在明らかであるようである。これらのドメインは、ヒト組織プラ スミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列のＮ末端から出発して、１）アミノ酸１ から上方に約４４までを含むとして様々に定義されている、フィンガー領域（Ｆ ）、２）アミノ酸約４５から上方にアミノ＃９１まで伸びているとして様々に定 義されている、成長因子領域（Ｃ）（ＥＧＦとの相同性に基づいている）、３） アミノ酸約９２から約１７３まで伸びているとして定義されている、クリングル １　（Ｋｌ）　、４）アミノ酸約１８０からアミノ酸約２６１まで伸びていると して定義されている、クリングル２　（Ｋ２）　、および５）アミノ酸約２６４ からこの分子のＣ末端まで伸びているとして一般に定義されている、いわゆるセ リンプロテアーゼドメイン（−Ｐ）、と命名されている。これらのドメインは一 般に互いに隣接して位置するか、または短い「リンカ−」領域によって隔てられ ており、成熟型と推定される約１ないし５２７アミノ酸までのアミノ酸配列全体 を形作っている。

ｔ−ＰＡにおける「二本鎖開裂部位」は、少なくとも２７５位にアルギニン残基 を含んでいる。しかしながら、２７５位に隣接する、または数残基以内にある、 例えば約２７９までの様々なアミノ酸もまた、プラスミノーゲン活性化因子をそ の二本鎖型に変換する酵素により認識されるドメインの一部であると信じられて いる。したがって、このドメイン内の２７５位以外でまたは２７５位に加えてア ミノ酸の置換を行なえば、二本鎖型への変換に抵抗する、そして／または野生型 ｔ−ＰＡより高いフィブリン特異性を表わすｔ−ＰＡ変異体が生成するかも知れ ない。

成る特定の態様において、「−末鎖プラスミノーゲン活性化因子突然変異体」ま たは「変異体」は、二本鎖への変換に抵抗するプラスミノーゲン活性化因子であ る。これは、二本鎖活性化部位を規定する領域内での単一のまたは複数のアミノ 酸置換を特徴とする。修飾されると係る活性化部位は酵素により認識されず、故 に、通常ではプラスミノーゲン活性化因子をその二本鎖型に変換する酵素によっ て加水分解されない。

別の態様において、この変異体は予想外の増強されたフィブリン特異性、治療上 の価値の向上を与える性質を表わし、またはこれらは両方の性質を表わす。

本発明に係る変異体を製造するために、基礎となるＤＮＡの突然変異を誘発する ための様々な方法を使用することができる。特に好ましい態様として本明細書に 例示される一つのこのような方法は、まず、突然変異させるべき領域をコードし ている配列を含む天然ｔ−ＰＡ遺伝子のフラグメントを、ファージＭ１３ｍｐ８ （−例として）の複製型に挿入して、Ｍ１３ｍｐ８ＰＡを形成させることを含む 。次いで、この挿入されたｔ−ＰＡ配列に対し相補的であるが置換されるべきア ミノ酸をコードしている１またはそれ以上のヌクレオチドトリブレットを含む合 成オリゴヌクレオチドを、Ｍ１３ｍｐ８ＰＡの一本鎖型とアニーリングして、二 本鎖領域を形成させる。この領域は、残りの相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成 のためのプライマーとしての役割を有する。複製および同定の後、この突然変異 体ｔ−ＰＡ配列をさらに修飾または使用して、突然変異したｔ−ＰＡポリペプチ ドの発現のための真核生物または原核生物ベクターを組み立てることができる。

下記の検定を用いて、フィブリノーゲン（またはフラグメント）の存在下で色素 生成プラスミン基質Ｓ−２２５１を使用するプラスミノーゲンからプラスミンへ の変換の反応速度定数を決定することにより、この変異体の酵素活性を検定する 。

「フィブリン特異性」という表現は、Ｓ−２２５１検定（−末鎖または二本鎖型 のいずれかにおいて）において、野生型ｒｔ−ＰＡよりも、フィブリノーゲン依 存特異活性に対するフィブリン依存特異活性の高い比率を表わす変異体の活性を 意味する。好ましくは、少なくとも１．５の比率が臨床上有利であることが判明 するであろう。

本明細書中使用される「−適性発現系」とは、該変異体をコードしているＤＮＡ 配列を一過性に、即ち安定でないかも知れない方法で発現する、ｔ−ＰＡ変異体 コード化ベクターによってトランスフェクトされた細胞を含む細胞培養を意味す る。このような細胞は、「一過性発現が可能である」と考えられる。

本発明におけるｔ−ＰＡ変異体は、成る特異的性質を表わすよう、本明細書に記 載されるように天然配列を変化させることに加えて、所望により、該分子の天然 配列の他の領域における残基の置換、除去、または挿入を含んでいてよい。これ らは「生物学的に等価な分子」と考えることができる。

例えば、本明細書中の変異体は、好適には、少な（とも、フィンガードメイン、 成長因子ドメイン、および／またはクリングル１ドメインの一部を欠くことがで き、そして／またはアミノ酸１８４および／または１１７を取り巻くグリコジル 化部位のグリコジル化能を欠くことができ、そして、好適には、クリングルｌま たは２の推定リジン結合部位におけるアミノ酸の修飾を含む。

このような変異体の個別的例は、アミノ酸工ないし４４を欠（分子および１８４ 位にアスパラギン酸を有する分子を包含する。アミノ酸１ないし４４を欠く変異 体は、Ｗｏ８９１００１９７号（上記）により詳細に記載されている。

その他の例は、変異体Ｔ１０３Ｎのように、グリコジル化部位がクリングル−１ ドメインに挿入されているものである。さらなる例は、１またはそれ以上のアミ ノ酸置換が９４および９５位または２９３−３０５位になされているもの、およ び４６６−４７０位のアミノ酸が除去されているものである。

上記の全ての変異体は、その修飾が本明細書に記載されている特定の性質のため の基準を尚満足させるならば、所望により分子の他の様々な領域で修飾されてい てよい。係る修飾は、例えば以下の物を包含する：１、クリングル１の修飾、例 えば約９２ないし１７９の除去、および／または、２、クリングル２の修飾、例 えば、約１．７４−２６１の除去または約２０５−２１５、特に２１０−２１３ のアミノ酸の領域における修飾、および／または、３、アミノ酸約２４４−２５ ５．特に２５２またはその部位、および／または、４、アミノ酸約２３３−２４ ２、特に２３６−２３８、および／または、５、アミノ酸１８４のような既知の グリコジル化部位、および／または、６．１９８８年５月２０日出願の同時係属 米国出願第０７／１９６９０９号（この記載は引用して本明細書の一部とする） に記載の、成長因子ドメイン内のグリコジル化。要約すると、ｔ−ＰＡ分子をそ の成長因子ドメイン内、好ましくは６７−６９位でＮ−または〇−結合グリコシ ル化し、ここで６７位のチロシンは、ｔ−ＰＡ分子の半減期を変えるためにアス パラギン残基に置き換えられている。

これらの修飾の多くは、天然ｔ−ＰＡに比較してクリアランス速度およびフィブ リン結合を有意に変えることができる。当業者は、任意の個別的例において所望 とされる各変異体の最適な性質が何かという事を、適当な検定によって決定する 事ができるであろう。

上記のような配列の変化をもたらすために天然分子中の適当なアミノ酸を変化さ せまたは挿入する修飾は、当分野において知られる任意の手段、例えば下記のよ うな、位置指定突然変異生成または関連する蛋白をコードしているＤＮＡ中への 適当な配列のライゲーションによって達成される。

本発明に係るｔ−ＰＡ変異体を即時的に明示する目的のため、数字は、推定の成 熟ｔ−ＰＡの５２７アミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基／位置を意味する事を記 載しておく。米国特許４７６６０７５号に対応するＥＰＡ０９３６１９号を参照 されたい。本明細書中の図２ａ、２ｂおよび２ｃをも参照されたい。アミノ酸の 表記は、アミノ酸の一文字アルファベット、即ち：Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸 　ｌｉｅ　Ｉ　イソロイシンＴｈｒ　Ｔ　スレオニン　Ｌｅｕ　Ｌ　ロインンＳ ｅｒ　Ｓ　セリンＴｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　Ｅ　グルタミン酸　Ｐｈｅ　Ｆ 　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｉｓ　ＨヒスチジンＧｌｙ　Ｇ　 グリシジ　Ｌｙｓ　Ｋ　リジンＡｌａ　Ａ　アラニン　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣ ｙｓ　Ｃラスティン　ＴｒｐＷ　トリプトファンＶａｌ　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　 Ｑ　グルタミンＭｅｔＭ　メチオニン　Ａｓｎ　Ｎ　アスパラギンを使用する。

数字の前に現われる文字はその番号の位置における天然アミノ酸であり、数字の 後に現われる文字はその位！における変異体アミノ酸である。この系によると、 ２７６位におけるプロリン置換は１２７６Ｐと表現されることになる。

Ａ、総論。

本発明に係るｔ−ＰＡ誘導体は、１）メチオニンをその第一アミノ酸としく構造 遺伝子の前にあるＡＴＧ開始シグナルコドンによって存在する）、または、２） メチオニンが細胞内または細胞列で開裂する場合は、その通常の第一アミノ酸を もって、または、３）そのシグナルポリペプチドまたはその常套的シグナルポリ ペプチド以外の複合体化蛋白のいずれかと共に［ここでそのシグナルポリペプチ ドまたは複合体は、細胞内または細胞外環境において特異的に開裂可能である］ 、または、４）非本質的な、余分のポリペプチドを開裂除去する必要無しに、成 熟型で直接発現により、製造される。いずれにせよ、様々な形でこのようにして 製造されたヒト突然変異ｔ−ＰＡは、回収され、種々の血管の状態または疾患、 例えば心筋梗塞、卒中、・肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞および その他の血栓性状態の処置のために好適なｌノベルまで精製される。

「発現ベクター」は、その中に含まれているＤＮＡ配列を発現することのできる ベクターであって、係る配列が、それらの発現をもたらすことのできる他の配列 と機能的に結合し、且つこれらがエピソームまたは染色体ＤＮＡの内在部分とし て宿主生物中で複製され得るベクターを包含する。

「組み替え宿主細胞」とは、組み替えＤＮＡ技術を用いて組み立てられた発現ベ クターによってトランスフェクトされた細胞を意味する。

Ｂ、宿主細胞培養およびベクター。

本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、広範囲の原核生物および真核生 物の宿主細胞に好適に使用される。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４（Ａ ＴＣＣＮｏ、３１４４６）は特に有用である。使用できる他の微生物株は、例え ばＥ、ｃｏｌｉＢおよびＥ、ｃｉｌｉ　Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３ ７）である。熱論これらの例は例示を意図しており、限定的なものではない。

原核生物に加えて、酵母培養のような真核生物もまた使用できる。多細胞生物か ら誘導された細胞の培養が、現在選択される宿主である。原則として、このよう な細胞培養はいずれも使用可能であるが、を動物物由来の細胞が最も興味深く、 これらの細胞の培養中での増殖（組織培養）は、反復可能な手法となっている。

ティシュ−・カルチャー、アカデミツク・プレス、クルースおよびバターソノ編 、（１９７３）を参照されたい。このような有用な宿生セルラインは、ＶＥＲＯ およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞セルライン、 例えばＤＨＰＲ”″　ＣＨＯ−Ｋｌ細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ６１）、Ｗ１３ ８、ＢＨＫ、ＣＯ３−７，２９３およびＭＤＣＫセルラインである。

以下に開示される例は、ｔｒｐプロモーター系を用いる大腸菌の使用、および、 プロモーターとしてＳＶ４０複製起点を含む発現ベクターを用いるＣＨＯ細胞の 使用を述べている。しかしながら、これらに代わる原核生物または真核生物の宿 主細胞培養の使用もまた充分当分野における技術の範囲内にあるであろう。

Ｃ１使用された方法。

１、トランスフェクション。

もし甚だしい細胞壁障壁の無い細胞を宿生細胞として使用するならば、トランス フェクションは、グラハム等、ヴアイロロジ−（Ｖｉ　ｒｏＩｏｇ３’）　、５ ２巻５４６頁（１９７８）に記載のように、燐酸カルシウム沈澱化法によって実 施することができる。しかしながら、核注入またはプロトプラスト融合もまた使 用できる。

実質的な細胞壁構造を含む原核生物細胞を使用するならば、好ましいトランスフ ェクション法は、コーエン等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・ア カデミ−・オン・サイエンシズ−ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃ　ｉ、ＵＳＡ）　、６９巻２１１０頁（１９７２）により記載される塩化カル シウムによる方法である。

２、ベクターの組み立て。

所望のコード化および調節配列を含む適当なベクターの組み立てには、自体既知 の標準的ライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラ グメントを開裂し、調製し、そして必要なプラスミドの作成のために望まれる形 に再うイゲーノヨンする。

３、位置特異的突然変異生成。

本発明に係るｔ−ＰＡ変異体の製造は、好ましくは、より早（製造された該蛋白 の変異体または非変異体をコードしているＤＮＡの位置特異的突然変異生成によ って達成する。位置特異的突然変異生成は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコー ドしている特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに、交差する連結部の両側で 安定な二本鎖を形成させるに充分な大きさおよび配列複雑性を有するプライマー 配列を提供するための、充分な数の隣接するヌクレオチドを使用することによっ て、ｔ−ＰＡ変異体の製造を可能にする。典型的には、長さ約２０ないし２５ヌ クレオチドのプライマーが好ましく、配列の連結部の両側で約５ないし１０の残 基が変えられる。一般に、位置特異的突然変異生成の技術は、アーデルマン等、 ＤＮＡ、２巻１８３頁（１９８３）のような刊行物に例示されるように、当分野 において良く知られており、その記載は引用して本明細書の一部とする。

理解されるように、位置特異的突然変異生成技術は、典型的には、−末鎖および 二本鎖型の両者に存在するファージベクターを使用する。位置指定突然変異生成 に有用な典型的ベクターは、例えばメンング等、サード・クリーブランド・ンン ポジアム・オン・マクロモレキュールズ・アンド・リコンビナント・ＤＮＡ、Ａ 、ウオルトン編、エルセヴイア、アムステルダム（１９８１）（その記載は引用 して本明細書の一部とする）により開示されるような、Ｍ１３ファージのような ベクターを包含する。これらのファージは市販品が容易に入手可能であり、それ らの使用は一般に当業者に良く知られている。これとは別に、−重鎖ファージ複 製起点を含むプラスミドベクター（ヴエイラ等、メソッズ・イン・エンザイモロ シー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１５３巻３頁（１９８７））を用いて一 本鎖ＤＮＡを得ることもてきる。

一般に、本発明に係る位置指定突然変異生成は、まず、適切なｔ−ＰＡをコード しているＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることによって実施 される。所望の突然変異した配列を有するオリゴヌクレオチドブライマーを、一 般には合成によって、例えばフレア等、プロンーディングズ・オン・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７５巻５７６５頁（１９７８）の方法によって製造 する。

次いでこのプライマーを一重鎖ｔ−ＰＡ配列含有ベクターとアニーリングし、Ｅ 。

ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなりＮＡ重合酵素を作用さ せ、突然変異を有する鎖の合成を完成する。このようにして、第一の鎖は元の突 然変異していない配列をコードしており、第二の鎖は所望の突然変異を有してい るヘテロ二本鎖が形成される。次にこのヘテロ二本鎖ベクターを使用してＪＭＩ ０１細胞のような適当な細胞を形質転換し、３２ｐ−標識された突然変異生成プ ライマーからなる放射性プローブとハイブリダイズさせることにより、突然変異 した配列の配置を有する組み替えベクターを含むクローンを選択する。

このようなりローンを選択した後、突然変異したｔ−ＰＡ領領域除去し、を−Ｐ Ａ産生のための適当なベクター、一般には適当な真核生物宿主の形質転換に典型 的に用いられる型の発現ベクター中に入れることができる。本発明の状況におい て、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または２９３（グラハム等、ジ ャーナル・オン・ジェネラル・ヴアイロロジー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）、 ３６巻５９頁（１９７７）により記載のヒト腎臓細胞）は、長時間の安定なｔ− ＰＡ産生菌の製造に好ましい。しかしながら本発明はＣＨＯ産生に限定されるこ とはなく、特に試験目的のため該酵素の一過性の産生のみを所望する場合は、そ の他の多数の細胞型が好適に使用されることがわかっている。例えば、分析目的 のためのｔ−ＰＡ変異体産生のための簡便な系を提供する、２９３細胞を用いる 一過性の系が、下に記載される。

４、開裂／ライゲーション技術。

ｔ−ＰＡをコードしているＤＮＡ配列中に突然変異を起こすもう一つの方法は、 制限酵素による消化によってｔ−ＰＡをコードしているＤＮＡを適当な位置で開 裂させ、適切に開裂したＤＮＡを回収し、所望アミノ酸および平滑端を有するポ リリンカーのようなフランキング領域をコードしているオリゴヌクレオチドを合 成しくまたは、ポリリンカーを使用する代わりに、ｔ−ＰＡＡコードＤＮＡの開 裂にも用いられた制限酵素でこの合成オリゴヌクレオチドを消化し、それにより 粘着末端を作り出す）、そしてこの合成りＮＡをｔ−ＰＡコード化槽構造遺伝子 残りの部分にライゲーションすることを含む。

５、宿生細胞培養およびベクター。

最終的にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）による発現がｔ−ＰＡ産生に は好ましいが、本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、広範囲の真核生 物の宿主において好適に使用される。

無油一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニングおよび本発明において有用なベク ターの組み立てには、原核生物が好ましい。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２ ９４　（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）およびＥ、ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣ ＣＮｏ、２７３２５）が特に有用である。その他の好適な微生物菌株は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＢおよびＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７） のような大腸菌菌株を包含する。これらの例は熱論、限定ではなく例示を意図し ている。

原核細胞は発現にも社用である。前記の菌株、ならびにバチルス・サブティリス のようなバチルス属、およびその他の腸内細菌科、例えばサルモネラ・ティフィ ムリウムまたはセラティア・マルセサラス、および種々のシュードモナス種は、 発現のために有用な宿主の例である。

一般に、その宿主細胞と両立し得る種から誘導された調節配列およびレプリコン を含むプラスミドベクターが、それら宿主と共に使用される。ベクターは、通常 、複製部位、ならびに形質転換された細胞における表現型の選択を可能にするマ ーカー配列を持っている。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種から誘導さ れたプラスミドｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（例えばボリヴアー等、ジ ーン（Ｇｅｎｅ）　、２巻９５頁Ｃ１９７７）を参照されたい）　。ｐＢＲ３２ ２プラスミド、または他の細菌プラスミドまたはファージは、その細菌が自身の 蛋白の発現に使用することのできるプロモーターを含むか、または含むよう修飾 されねばならない。

組み替えＤＮＡの組み立てに最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラク タマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャンク等、ネ イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、’　３７５巻６１５頁（１９７８）：イタクラ等、 サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）　、１９８巻１０５６頁（１９７７）；ゲ’ソ デル等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２８１巻５４４頁（１９７９））お よびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲラデル等、ヌクレイツク・ア ンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、８巻４０５７頁（１９８ ０）；ＥＰＯ出願公開第３６７７６号）、およびアルカリホスファターゼ系を包 含する（さらに、例えばジ−ベンリスト等、セル（Ｃｅ　ｌ　ｌ）　、２０巻２ ６９頁（１９８０）を参照されたい）。

原核生物に加えて、酵母のような真核微生物もまた本発明において好適に使用さ れる。真核微生物の中ではサツカロミセス・セレビシアエ、または通常のパン酵 母が最も一般的に使用されるが、他の数多くの菌株もまた一般的に利用可能であ る。例えば、サツカロミセスにおける発現のためには、プラスミドＹＲｐ７（ス ティンヒコーム等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、２８２巻３９頁（１９７９） ；キングズマン等、ジー：／　（Ｇｅｎｅ）　、７巻１４１頁（１９７９）；ツ エンバー等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、１０巻１５７頁（１９８０））が一般に使 用される。

このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く突然変異酵母株、例 えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７６またはＰＥＰ４−１　（ジョーンズ、ジェネティ クス（Ｇｅｎｅｔ　１ｃｓ）　、８５巻１２頁（１９７７））のための選択マー カーを提供するｔｒｐｌ遺伝子を既に含んでいる。この酵母宿主細胞ゲノムの性 格としてのｔ　ｒｐｌ損傷の存在は、次に、トリブトファン不在下での増殖によ り形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。

酵母ベクターにおける好適なプロモーター配列は、３−ホスホグリセラードキナ ーゼのためのプロモーター（ヒララマン等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２５５巻２０７３頁（１９８ ０））またはその他の解糖系酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３ ＝ホスフアートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスファ−トイツメラーゼ、 ３−ホスホグリセラードムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスファ− トイツメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのため のプロモーター（ヘス等、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　、７巻１４９ 巻（１９６８）；ホランド等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、１７巻４９００頁（１９７８））を包含する。酵母と共存し得るプロモータ ー、複製起点および終止配列を含んでいる任意のプラスミドベクターが適当であ る。

微生物に加えて、多細胞生物から誘導される細胞の培養もまた宿主として使用で きる。原則として、を動物物または無を動物物培養の如何に拘らず、任意のこの ような細胞培養が使用できる。しかしながら、を動物物細胞に対する興味が最も 大であり、近年、培養中のを動物物細胞（組織培養）の増殖が、より普通になっ てきている［ティシュ−・カルチャー、アカデミツク・プレス、クルースおよび バダーリン編（１９７３）］。このような有用な宿生セルラインは、Ｖ　Ｅ　Ｒ ，ＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯセルライン、ならびにＷ２Ｂ５、ＢＨＫ、ＣＯ ３−７，２９３、およびＭＤＣＫセルラインである。係る細胞のための発現ベク ターは通常、（必要ならば）複製起点、発現されるべき遺伝子の正面に位置し必 要なリポソーム結合部位があればそれに沿って位置するプロモーター、ＲＮＡス プライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ−配列を含む。

哺乳動物細胞における使用のためには、発現ベクター上の調節機能がしばしばウ ィルス材料によって提供される。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポ リオーマ、アデノウィルス２、および最も頻繁にはシミアンウィルス４０（ＳＶ ４０）から誘導される。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは共にＳＶ４０ ウィルスの複製起点をも含むフラグメントとして該ウィルスから容易に取得され るため、これらのプロモーターが特に有用である（フィアス等、ネイチャー（Ｎ ａｔｕｒｅ）　、２７３巻１１３頁（１９７８））。さらに、調節配列がその宿 主細胞系と共存し得るならば、所望の遺伝子配列に通常付随する調節配列または プロモーターを利用することもまた可能であり、且つしばしば望ましい。

複製起点は典型的には、ＳＶ４０または他のウィルス源（例えばポリオーマ、ア デノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から誘導されるような外因性の起点を含むベクターを組 み立てることによって、または、宿主細胞の染色体複製メカニズムによって、供 給される。もしそのベクターが宿主細胞の染色体中に統合されるならば、しばし ば後者で充分である。

細胞培養により、満足できる量のヒトｔ−ＰＡが産生される。しかしながら、二 次コード化配列を使用する改良は、産生のレベルをさらに向上させるのに役立つ 。この二次コード化配列は、外部的調節パラメータ、例えばメソトレキサート（ ＭＴＸ）により影響を受けるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含んでお り、したがって、ＭＴＸ濃度の調節によって発現を調節することができる。

好適な宿主細胞は、ウアラウプおよびチェイシン、プロシーディングズ・オブ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７７巻４２１６頁（１９８０）による記載 のように調製され増殖される、ＤＨＦＲ活性を欠＜ＣＨＯセルラインである。

一方、ＭＴＸに対する結合親和性の低いＤＨＦＲ蛋白が調節配列として用いられ るならば、ＤＨＦＲ欠損細胞を使用する必要はない。突然変異体のＤＨＦＲはＭ ＴＸに対して耐性であるため、宿主細胞がそれ自身ＭＴＸ感受性である限り、Ｍ ＴＸ含有培地を選択の手段として使用することができる。ＭＴＸを吸収すること のできる殆どの真核生物細胞は、ＭＴＸに対して感受性であるように見える。

このような有用なセルラインの一つは、ＣＨＯライン、ＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣ ＣＮｏ、ＣＣＬ６１）である。

６　使用可能な典型的クローニングおよび発現法。

宿主細胞として哺乳動物細胞を使用する場合、トランスフェクションは一般に、 グラハムおよびファン・デル・イブ、ヴアイロロジー（Ｖｊｒｏｌｏｇｙ）、５ ２巻５４６頁（１９７８）に記載されるような燐酸カルシウム沈澱法によって実 施する。しかしながら、核注入、電気穿孔、またはプロトプラスト融合のような 、細胞にＤＮＡを導入するその他の方法もまた好適に使用される。

酵母を宿主として使用する場合、トランスフェクションは一般に、ヒネン、ブロ ンーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・Ｕ ＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、７５巻１９２ ９−１９３３頁（１９７８）に教示されるようにポリエチレングリコールを用い て達成する。

実質的な細胞壁構造を含む原核生物細胞を使用する場合、トランスフェクション の好ましい方法は、コーエン等、プロンーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ 、ＳＣ１、ＵＳＡ）　、６９巻２１１０頁（１９７２）に記載のようにカルシウ ムを使用するカルシウム処理、またはより近年は電気穿孔である。

所望のコード化および調節配列を含む好適なベクターの組み立てには、標準的な ライゲーション技術を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメン トを開裂し、組み立て、所望の形に再ライゲーションして、必要なプラスミドを 形作る。

開裂は、適当な緩衝液中での制限酵素（または酵素）による処理によって行なう 。一般に、プラスミドまたはＤＮＡフラグメント約１μｇを、緩衝溶液約２０μ ｍ中の酵素約１単位と共に使用する（個々の制限酵素についての適当な緩衝液お よび基質量は、製造者により明記されている）。３７℃で約１時間のインキュベ ーション時間が適当である。インキュベーションの後、蛋白をフェノールおよび クロロホルムによる抽出によって除去し、核酸をエタノールによる沈澱化によっ て水性画分から回収する。

平滑末端が必要な場合は、調製物をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメン ト（フレノウ）１０単位と共に１５℃で１５分間処理し、フェノール−クロロホ ルム抽出し、エタノール沈澱させることができる。

開裂したフラグメントの大きさによる分離は、ゲラデル等、ヌクレイ・ツク・ア ンス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、８巻４０５７頁（ １９８０）に記載の６％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施する。

ライゲーションのためには、好適には正しい対形成ができるよう末端を整えた所 望の構成成分のほぼ当モル量を、ＤＮＡ０．５μｇにつきＴ４ＤＮＡリガーゼ約 １０単位で処理する（開裂したベクターを構成成分として使用する場合は、細菌 性アルカリホスファターゼで前処理することにより、開裂したベクターの再ライ ゲーションを防ぐことが有用であるかも知れない）。

組み立てられたプラスミド中に正しい配列を確認する分析のためには、このライ ゲーション混合物を典型的にはＥ、ｃｏｌｉＫ１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４ ４６）または他の適当な大腸菌株の形質転換に使用し、うまくできた形質転換体 を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体 由来のプラスミドを調製し、制限地図作成および／またはメリック等、ヌクレイ ・νり・アンス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、９巻３ ０９頁（１９８１）の方法またはマクサム等、メソッズ・オブ・エンザイモロ９ −（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５巻４９９頁（１９８ ０）の方法によるＤＮＡ配列決定によって分析する。

該ＤＮＡを哺乳動物細胞の宿主中に導入し、培地中で安定な形質転換体について 選択した後、およそ２００００−５０００００ｎＭ濃度のＭＴＸＳＤＨＦＲ活性 の競合的阻害剤の存在下で宿主細胞培養を増殖させることにより、ＤＨＦＲ蛋白 コード化配列の増幅を行なう。有効な濃度範囲は熱論、ＤＨＦＲ遺伝子および蛋 白の性質ならびに宿主の特性に高度に依存する。明確に、一般的に定義される上 限および下限は確認することができない。適当な濃度の他の葉酸類似体またはＤ ＨＦＲを阻害する他の化合物を使用することもできる。しかしながら、ＭＴＸ自 身が簡便であり、容易に入手でき、そして有効である。

「プラスミド」は、小文字のｐとこれに続くアルファベットおよび数字の記載に よって表記される。本発明における出発プラスミドは市販品を入手でき、無制限 に一般に入手可能であり、または公表されている方法に従って係る入手し得るプ ラスミドから組み立てることができる。さらに、その他の同等のプラスミドは、 当分野で知られており且つ当業者にとって明らかであろう。

ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの成る位置でのみ作用する酵素を用いたＤＮＡの 酵素的開裂を意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、各々が特異的な部 位は制限部位と呼ばれる。本明細書中で使用される種々の制限酵素は市販品を入 手することができ、酵素の供給者により確立されたそれらの反応条件、補助因子 およびその他の要件が用いられた。方法および試薬は常套的なものである（Ｔ。

マニアティス等、１９８２、モレキュラー・クローニング、１３３−１３４頁） 。

制限消化物からの与えられたＤＮＡフラグメントの「回収」または「分離」とは 、一般的に知られる方法、電気泳動によりポリアクリルアミドゲルまたはアガロ ースゲル上でその消化物を分離することを意味する。例えば、Ｒ，ローン等、１ ９８１、ヌクレイツク・アンス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、）、９巻６１０３−６１１４頁、およびり、ゲラデル等、１９８０、ヌクレ イツク・アンス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）％　８巻 ４０５７頁を参照されたい。

「サザン分析」は、Ｅ、サザン、１９７５、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、９８巻５０３＝５１７頁の方法、お よびＴ、マニアティス等、１９７訳セル（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ）　、１５巻６８７−７ ０１頁に記載のハイブリダイゼーションによって、消化物またはＤＮＡ含有組成 物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標識されたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ フラグメントとのハイブリダイゼーションによって確認する方法である。

「形質転換」または「トランスフェクション」とは、ＤＮＡを生物中に導入し、 その結果そのＤＮＡが染色体外要素または染色体への統合体として複製可能とな ることを意味する。

「ライゲーション」とは、二つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ ル結合が形成される過程を意味する（Ｔ、マニアテイス等、同、４６頁）。

Ｄ、薬用組成物。

本発明に係る化合物は、本発明に係るｔ−ＰＡ生成物を薬学上許容し得る担体媒 質と混合して合する既知の方法に従って製剤化し、薬学上有用な組成物を製造す ることができる。他のヒト蛋白、例えばヒト血清アルブミンを包含する好適な担 体媒質およびそれらの製剤は、例えばレミントンズ・ファーマンニーティカル・ サイエンシズ、１６版、１９８０、マック・パブリッシング・ＣＯｏ、オスロ等 編、に記載されており、その記載は引用して本明細書の一部とする。このような 組成物は典型的には、本発明に係る変異体の有効量、例えば約０．５ないし約５ ｍｇ／ｍｌを、適当量の担体媒質と共に含有させて、宿主への有効な投与に好適 な薬学上許容し得る組成物を製造する。本発明に係るｔ−ＰＡ変異体は、心臓血 管系疾患または同状態に冒されている対象に非経口的に、またはそれが有効な形 で血流に運ばれることを保証する他の方法によって投与することができる。

本発明の実施に用いられる変異体ｔ−ＰＡ生成物の臨床的投与に特によく適合す る組成物は、例えば無菌水溶液、または凍結乾燥蛋白のような無菌水和剤を包含 する。一般に、適当量の薬学上許容し得る塩を、一般にその製剤を等張とするに 充分な量で、さらにその製剤中に含有させることが望ましい。アルギニン塩基お よび燐酸のようなｐＨ調節剤もまた典型的には、適当なｐＨ１一般に５．５ない し７．５を維持するに充分な量で含有させる。さらに、水性製剤の貯蔵寿命また は安定性の改善のために、グリセロールのような物質をさらに含有させるのが望 ましい。このようにして、変異体ｔ−ＰＡ製剤は、非経口投与のために、そして 特に静脈内投与のために適当なものとされる。

本発明に係る薬用組成物の用量および所望の薬物濃度は、意図される個々の用途 に応じて変わり得る。例えば、深部静脈血栓症または末梢血管性疾患の処置にお いては、約００５ないし約０．２ｍｇ／ｋｇといった程度の「ポーラス」用量、 そしてこれに続く、好ましくは約３μｇ／ｍｌといった程度のほぼ一定の血中濃 度を維持するためになされる約０．１ないし約０．２ｍｇ／ｋｇ程度の投与が典 型的には好ましい。

しかしながら、一般的に注入能が利用できない救急医療施設に関連する使用のた めには、そして一般に基礎となる疾患の危機的性格（例えば、塞栓、梗塞）の故 に、一般に、約０．３ｍｇ／ｋｇ程度の静脈内ポーラスといったような幾分大量 の初期用量を供することが望ましいであろう。

例えば、本発明に係るｔ−ＰＡ変異体は、好適には、心臓血管疾患または病態に 冒されている対象に非経口的に投与される。用量および用量率は、他の心臓血管 、血栓溶解剤の臨床研究の際に現在用いられている量と等しいまたはこれより高 いものであってよく、例えば、静脈内または動脈内用量として約１−２ｍｇ／ｋ ｇ体重を心筋梗塞、肺動脈塞栓症等に罹患している人間の患者に１．５ないし１ ２時間投与することができる。本発明に係る変異体は野生型ｔ−ＰＡより副作用 が低いため、高用量が耐容され、より迅速且つより完全な血栓の溶解がもたらさ れる。

適当な用量型の一つの例として、ｔ−ＰＡ５０ｍｇ、アルギニン、燐酸、および ポリソルベート８０を含有するバイアルを、注射用滅菌水５０ｍ１で再構成し、 適当な用量の０．９％塩化ナトリウム注射水と混合する。

本発明に係るｔ−ＰＡ変異体は、さらに、フィブリンの沈着または癒着の形成も しくは再形成の防止に有用である。この用途の一つの態様は、１９８７年１１月 ２５日出願の同時係属米国０７／１２５３１９号に記載されており、その記載は 引用して本明細書の一部とする。一般に、このような処置は、フィブリンまたは 癒着の形成の可能性のある部位に組成物を局所投与することを含み、ここで該組 成物は、治療的有効量のｔ−ＰＡ変異体を、その部位で約３日間なしル２週間の 間連続放出する僅かに可溶な形で含む。典型的には、ｔ−ＰＡ変異体は、外科手 術、感染、外傷、または炎症後の癒着の形成またはフィブリン沈着を防止するに 充分な用量で投与する。典型的には、この量は０．０２ｍｇ／ｇ　（ゲル）ない し２５ｍｇ／ｇ　（ゲル）であり、好ましい量は０．２０ｍｇ／ｇ　（ゲル）な いし約２．５ｍｇ／ｇ　（ゲル）、最も好ましくは０．２５ｍｇ／ｇないし約１ ．０ｍｇ／ｇ　（ゲル）である。

癒着形成の防止のためにｔ−ＰＡが典型的に製剤化される媒質は、この酵素を癒 着が形成されそうな部位に位置させるための半固体の、粘液質の薬用不活性担体 である。このような担体は、長鎖炭化水素または植物油および、飽和および不飽 和脂肪酸グリセリドの混合物または修飾された飽和および不飽和脂肪酸グリセリ ドの混合物からなるロウを包含する。例は、ワセリンまたは半合成グリセリド類 のような半固体媒質、ポリヒドロキシ溶媒、例えばグリセロール、長鎖炭化水素 、生物腐食性ポリマー、またはリポソームを包含する。

以下の実施例は本発明の実施のために現在知られている最良の方法を例示するこ とを意図しているに過ぎず、本発明はそれにより限定されると解してはならない 。

本明細書中の文献および特許出願の引用は全て説明的に引用して本明細書の一部 とするものである。

Ｅ、実施例　本発明に係るｔ−ＰＡ変異体の組み替え産生のための発現ベクター の調製および利用。

１、プラスミドｐＲＫ７−ｔ−ＰＡの組み立て。

プラスミドｐＲＫ７を、ｔ−ＰＡ変異体の生成のためのベクターとして使用した 。ｐＲＫ７は、ＣＩａＩおよびＨ４ｎｄｌ　Ｉ　Ｉの間のポリリンカー領域中の エンドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆転している外はｐＲＫ５　（１９８９年 ３月１５日公開のＥＰ公開Ｎｏ、３０７２４７号）と同一である。制限エンドヌ クレアーゼＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　（ＡＴＧ開始コドンの５゛の４９塩基対を切断 する）および制限エンドヌクレアーゼＢａ　］　Ｉ　（ＴＧＡ停止コドンの下流 ２７６塩基対を切断する）で切断することにより、ｔ−ＰＡ　ＣＤＮＡ　（ペニ カ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０１巻２１４頁（１９８３））を、ベク ターへの挿入のために調製した。このｃＤＮＡを、前もってＨｉｎｄｌｌｌおよ びＳｍａ　Ｉで切断したｐＲＫ７に、標準的ライゲーション法を用いてライゲー ションした（マニアティス等、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ− ・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク 、１９８２）。この組み立て物をｐＲＫ７−ｔ−ＰＡと命名した。

２、発現プラスミドｐＲＫ−ｔ−ＰＡの突然変異生成。

ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの位置指定突然変異生成を、アマーンヤム・コーポレーショ ンから購入したキット（カタログ番号ＲＰＮ１２５３）を用い、ティラー等、ヌ クレイツク・アラス・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）、１３巻８ ７６５頁（１９８５）の方法によって実施した。所望の突然変異体を生成させる ため、所望のアミノ酸置換をコードしている配列のオリゴヌクレオチドを合成し 、プライマーとして使用した。これらのオリゴヌクレオチドは、標準的方法によ り製造した一本鎖ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡとアニーリングした（ヴイエラ等、メソッ ズ・イン−エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、）、１４３巻３頁（１９８７ ））。

３種のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリポアデノシン（ｄＡＴＰ）　、デ オキシリポグアノシン（ｄＧＴＰ）　、およびデオキシリポチミジン（ｄＴＴＰ ）の混合物を、キットの製造者によりそのキット中に供給される、ｄＣＴＰ　（ ａＳ）と呼ばれる修飾チオーデオキシリボシトシンと合し、−重鎖ｐＲＫ７−ｔ −ＰＡに加え、オリゴヌクレオチドをこれとアニーリングした。

この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異を受けた塩基を除いて はｐＲＫ７−ｔ−ＰＡと同一のＤＮＡ鎮が生成した。さらに、この新たなりＮＡ 鎖は、ｄＣＴＰの代わりに制限エンドヌクレアーゼ消化からこれを保護する働き をするｄＣＴＰ　（ａＳ）を含んでいた。適当な制限酵素でヘテロ二本鎖の鋳型 鏑に切れ目を入れた後、この鋳型鎖を、Ｅｘｏ　Ｉ　Ｉ　Ｉヌクレアーゼで突然 変異原性オリゴマーを含む領域を過ぎて消化した。次いで、反応を停止させて一 部だけが一本鎖である分子を取り去る。次いで、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖 分子を、４種の全デオキシリボヌクレオチド三燐酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガ ーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼにより生成させた。

以下のオリゴヌクレオチドを調製し、ｐＲＫ７−ｔ−ＰＡ分子生成のためのプラ イマーとして使用した： 変異体＊　オリゴ数　ｙ烈 Ｉ２７６Ｐ　４３９　ＧＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＧ ＧＩ２７６Ｐ、に２７７Ｉ　４６７　Ｇ＾＾ＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧ ＣＧ＾＾ＡＣＴＧＡＧＧＩ２７６ＰＳＫ２７７＾　４６８　ＧＡＡＧＡＧＣＣＣ ＴＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＩ２７６Ｙ　４７１　ＣＣＣＴＣ ＣＴＴＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＩ２７６＾　４７２．　ＣＣＣＴＣＣ ＴＴＴＧＧＣＧＣＧＡ＾＾ＣＴＧＡＧＧ＊　注二アミノ酸位置番号の左側の文字 はその位置の天然アミノ酸であり、右側の文字は変異体アミノ酸である。図３を 参照されたい。

３、細菌の形質転換およびＤＮＡ調製。

上の方法を用いて生成した変異体ｔ−ＰＡ組み立て物を、コンピテントな細胞の 調製および形質転換のための標準的ＣａＣｌ２法（マニアティス等、上記）を用 いて、大腸菌宿主菌株ＭＭ２９４ｔｏｎＡ中に導入した。ＭＭ２９４ｔｏｎＡ（ これはＴ１ファージに対して耐性である）は、ＴｎｌＯトランスボラスのｔ。

ｎＡ遺伝子への挿入およびこれに続く不正確な切除により製造した。次にこの遺 伝子を、トランスポゾン挿入突然変異生成（タレックナー等、ジャーナル・オブ ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉａｓ、Ｌ　１１６巻１２５− １５９頁（１９７７））を用いて、大腸菌宿主ＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ３１４４ ６）に挿入した。

細菌形質転換体の個々のコロニーを選択し、カルベニンジン１５０μｇ／ｍｌを 含有するＬＢブロス３５ｍ１に飽和するまで増殖させた。キアゲン・Ｉｎｃ。

から購入したキット（カタログ番号４１０２１）を用いてＤＮＡを抽出および精 製した。プラスミドを、配列決定ならびに制限エンドヌクレアーゼ消化およびア ガロースゲル電気泳動によって分析した。

４、ヒト胚腎臓２９３細胞のトランスフェクション（小規模）。

２９３細胞を６ウエル平板に７０％密集となるまで増殖させた。ｔ−ＰＡプラス ミドＤＮＡ突然変異体２．５ｕｇを１５０ｍ１の１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０゜１ ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ　ＣａＣｌ２に溶解した。５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ７，３５）１５０μｌ、２８０ｍＭ　ＮａＣ！、１．５ｍＭ　Ｎａ Ｐｏ、をこれに加え（ポルテックスで撹拌しながら滴下）、２５℃で１０分間沈 澱を生成させた。次に、懸濁した沈澱を、６ウエル平板のそれぞれのウェル中の 細胞に加え、インキュベーター中で４時間落ち着かせた。次いで培地を吸引して 除き、ＰＢＳ中の２０％グリセロール１ｍｌを３０秒間加えた。細胞を、最初３ ｍ１次いで１ｍｌの無血清培地で２回洗浄した。次に、新たな培地３ｍｌを加え 、細胞を５日間インキュベートした。次いで培地を集め、検定した。

−重鎖のｔ−ＰＡが必要な場合、その方法は、細胞の発育相の間、プラスミノー ゲンを涸渇させた血清を使用する外は上記と同様であった。

生物検定。

Ａ、ｔ　−ＰＡ定量。

細胞培養土消中に存在するｔ−ＰＡの量を、野生型ｔ−ＰＡに対して作成したポ リクローナル抗体を用いるＥＬＩ　ＳＡ法によって測定した。

Ｂ、Ｓ−２２５１検定（プラスミノーゲン活性化因子検定）。

この検定はｔ−ＰＡ活性のための間接的検定である。この検定においては　プラ スミノーゲンをｔ−ＰＡの作用によってプラスミンに変換し、プラスミンはＳ− ２２５１基質を開裂させてパラニトロアニリド発色団を放出させる。この発色団 の生成を時間を追って測定する。フィブリン刺激、フィブリノーゲン刺激、およ び非刺激検定の方法は先に詳説されている（ベネット等、ＪＲＣ，２６６巻５１ ９１−５２０１頁（１９９１））。この検定のために、全ての試料は検定前にセ ファロース−プラスミンと共にインキュベートした。プラスミンによる開裂を受 け易い試料はこの工程中に二本鎖に変換された。

上に開示されたオリゴヌクレオチド（オリゴ数４３７．４３９および４６６ない し４７４）を用いて製造された変異体は、Ｓ−２２５１検定にしたがって活性を 試験する時、図３に示される結果を与えた。

このデータから、フィブリンの存在下では全ての変異体が、野生型ｔ−ＰＡと等 しいまたはより大きいプラスミノーゲン活性化因子活性を示すことがわがる。

これに対して、これらの変異体は、フィブリノーゲンの存在下または刺激剤の不 在下では、野生型より低い活性を有していた。これらの結果は、この変異体が野 生型ｔ−ＰＡよりフィブリン特異的であることを示している。

野生型ｔ−ＰＡに比べこれらの変異体のフィブリン特異性が何倍であるかを、フ ィブリノーゲン存在下における変異体の相対活性に対するフィブリン存在下にお けるそれの比を取ることによって決定した。結果を下の第１表に示す。本発明者 等の試験では、Ｓ−２２５１検定における野生型ｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活 性化因子の活性は、フィブリンが使用される時、フィブリノーゲンに比べほぼ６ 倍である（ベネット等、ＪＢＣ，２６６巻５１９１−５２０１頁（１９９１）） 。変異体についての値はその相違を超える。

第１表 Ｄｅｓ　２７５−２７７　１２．３ Ｉ２７６Ｐ、に２７７Ａ　６．５ １２７６Ｐ、に２７７］　７．５ １２７６Ｐ　９．７ ２７５／２７６にＰｒｏ挿入　２．４ Ｉ２７６Ｄ　６．０ １２７６３　１９．７ ！２７６Ａ　５．４ １２７６８　１６．５ １２７６Ｗ　７．１ １２７６Ｙ　７．６ 本発明に係る全てのフィブリン特異性変異体についての触媒定数を図４および５ に示す。全ての変異体を同じセットの中でトランスフェクトし、条件培地の試料 を二重に２回検定した。誤差の棒はこれらの結果の標準偏差を示す。図４に示さ れる結果から、フィブリノーゲンの存在下における全変異体の活性低下は、ｋ３ １の低下に起因することが明らかである。ＫＭに反映される、この刺激剤の存在 下におけるプラスミノーゲンに対する親和性は、これらの突然変異によって変わ らないように見える。図５の結果は、殆どの変異体はフィブリン存在下で野生型 に匹敵するに、およびｋ、１を有することを示している。

１本鎖から２本鎖への変換部位におけるｔ−ＰＡの変異体が、増強されたフィブ リン特異性を持っているという発見は興味深い。２７６位における単一のアミノ 酸置換がこの効果をもたらすことから、残基２７６は明らかに関与している。

さらに、１２７６Ｐの場合がそうであり得るように（この変異体の残基２７５お よび２７６の間のアルギニン−プロリン結合は加水分解に対し、比較的抵抗性で あるに違いない）、恐らくはその開裂かに２７７の後であっても、同じ表現型が 、該分子が一本鎖型を維持しているか否かに拘らず、観察される（ｄｅｓ２７５ −２７７）。本発明者らはさらに、２７５位の単一アミノ酸置換変異体、Ｒ２７ ５Ｅのフィブリン特異性の増大について試験した。血漿による二本鎖変換を受け 得ないこの変異体は、フィブリン特異性増大の徴候を示さなかった。むしろこの 変異体は、フィブリノーゲン存在下で通常より活性が大きいということから、野 生型ｔ−ＰＡよりフィブリン特異性が低かった。

本発明の好ましい態様を記載してきたが、開示される態様に対して種々の修飾を 施すことができるという事、そして係る修飾は本発明の範囲内にあることが意図 されているという事が、当業者には明らかであろう。

ＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧ＾＾＾ＡＣＣＴＣ丁ＧＣＧＡ ＧＧ＾＾ＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡ６ＣＣＧＴＧ＾ＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣ ＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴｒ ＣＴｒＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣ’ｒＣＴ ＡＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣｋＣＣｋＣｋＣＣＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧ ＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＴｒＴ？Ｃ ＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＣＡｆｆＩ’ｒＧＧＡＡＧＴＴ？’ｒＣＡＧＧＡＣＴ ｒＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧ＾τＧＧＧＡＡＧＡ ＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＣＡＣＴＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴ ＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧ　ＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴ　 ＣＡＧＣＴ` 入ＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴ ＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＴＧＴＣＴＣＡＡ ＴＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＧ入ＴＣＴｒＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＧＧＡ ＴＴＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＡＴＡＴｒＴＡＴＡＧＴＣＡＣＡＡ ＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＬ））ｒＧＴＴＧＧ（２ＧＣＡＧＧＣＷ； ＧＣＴＧＧＣＣＣＧＴＣＡＴＧＴＴＣＣＴＣＡＡＡＡＧ　ＣＡＣＣＣＴｒＧ入Ｃ ＧＴＣＡＡＧＴＣＴＣＣＴＩ”ＣＣＣＣＴ’！’ｒＣＣＣＣＡＣs ＣＣＣＴＧＧＣｒＣＴＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴｒＣＣ？！ＴｒＧＴＧＴＡＣＡＧＴ ＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＴＡＪＩＡＴＣＣＴＴ’ｆ’ｒＴＣＴＴｒＡＴＡＡＡＣＴ ＴＴＡＧＡＧＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡ’ＩＴＧＴＡＴＣＡＴ！？ＧＡＡＣＡ ＡＣＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＡＴＩ’ｒＡＴＡＧＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＧＴＴｒＴＴＡＣＴ！ＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴｒＴＴＡＴＡＣ ＴＧＴＡＣＴｒＡＡＴ入入＾ＴＴＣＡＧＡＴＡＴＡＴＴ！ＴｒＣＡＣＡＧ？’ｌ ”ＩＴｒＣＣＦＩＧ．２Ｃ 野生型ｔ−Ｐ＾と比較した活性 Ｆｉｇｕｒｅ　３ ０．００．１０．２０．３０．４０．５０．６０．７０．８０．００．１　０． ２０．３０．４０．５０．６０．７０．８Ｆｉｇｕｒｅ　５Ａ ０．０　０．２　０．４　０．６　０．８　１．ＯＦｉｇｕｒｅ　５Ｂ フロントページの続き （５１）　ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ ／／（Ｃ１２Ｎ　９／６４ Ｃ１２Ｒ１：１９） ８３１４−４Ｃ （７２）発明者　パオニ、ニコラス・エフアメリカ合衆国カリフォルニア９４５ ５６、モラガ、シャイ・ドライブ５１番 Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１５４　ＡＣＢ （７２）発明者　ベネット、ウィリアム・エフアメリカ合衆国カリフォルニア９ ４００３、サン・マテオ、モンテレー・ストリート３４３７番

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．野生型ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位にイソロイシン以外のアミノ酸を 有する、フィブリン特異的なヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ） 変異体。
2. ２．該アミノ酸がプロリンである、請求項１に記載の変異体。
3. ３．ｄｅｓ２７５−２７７ｔ−ＰＡ；２７５／２７６位間のプロリン挿入ｔ−Ｐ Ａ；１２７６Ｄｔ−ＰＡ；１２７６Ｓｔ−ＰＡ；１２７６Ａｔ−ＰＡ１２７６Ｈ ｔ−ＰＡ；１２７６Ｗｔ−ＰＡ；１２７６Ｙｔ−ＰＡ；１２７６Ｐ、Ｋ２７７Ａ ｔ−ＰＡ；１２７６Ｐ、Ｋ２７７１ｔ−ＰＡ；および１２７６Ｐｔ−ＰＡよりな る群から選ばれる、請求項１に記載のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子変異 体。
4. ４．該アミノ酸がアスパラギン酸である、請求項１に記載の変異体。
5. ５．該アミノ酸がセリンである、請求項１に記載の変異体。
6. ６．該アミノ酸がアラニンである、請求項１に記載の変異体。
7. ７．該アミノ酸がヒスチジンである、請求項１に記載の変異体。
8. ８．該アミノ酸がトリプトファンである、請求項１に記載の変異体。
9. ９．該アミノ酸がチロシンである、請求項１に記載の変異体。
10. １０．１２７６Ｓヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。
11. １１．１２７６Ｐヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。
12. １２．請求項１に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
13. １３．請求項１２に記載のＤＮＡを発現することのできる発現ベクター。
14. １４．請求項１３に記載のベクターによりトランスフェクトされた細胞培養。
15. １５．請求項１２に記載のＤＮＡを発現のための鋳型として使用し、コードされ ている変異体を発現生成物として生成させる工程を含む方法。
16. １６．薬学上許容し得る担体と混合した請求項１に記載の変異体の治療的有効量 を含む、血管の状態もしくは疾患を処置し、またはフィブリンの沈着もしくは癒 着の形成もしくは再形成を防止するための組成物。
17. １７．請求項１６に記載の組成物の有効量を投与することからなる、哺乳動物に おいて、血管の状態もしくは疾患を処置し、またはフィブリンの沈着もしくは癒 着の形成もしくは再形成を防止する方法。