JPH03505276A

JPH03505276A - 再配列された組織プラスミノーゲン活性化因子及びその産生方法

Info

Publication number: JPH03505276A
Application number: JP1502044A
Authority: JP
Inventors: マークランド、ウィリアム; リビングストン、ディビッド・ジェイ
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1988-02-05
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1991-11-21
Also published as: EP0398962A1; WO1989007146A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】再配列された組織プラスミノーゲン活性化因子及びその産生方法本発明の背景本発明は治療用蛋白質を産生ずるために組換えＤＮＡ技術を用いることに関し、特に新規な修飾されたヒト子宮組織プラスミノーゲン活性化因子（＋ｌＰ＾）遺伝子及び前記遺伝子を含有するプラスミド、前記遺伝子及び前記プラスミドによって形質転換された又はトランスフェクシヨンされた（　Ｈｔｎｓｌｃｃｔｅｄ）宿主細胞及びそれから産生されるプラスミノーゲン活性化因子分子を産生ずるために組換えＤＮＡ技術を用いることに関する。

組織プラスミノーゲン活性化因子（ｚＰＡ）は、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒するマルチドメイン型セリンプロテアーゼである。それ自体、　ＩＰＡは治療的価値がある。外から投与したとき、ＩＰＡは血餅の溶解（血栓溶解）に効果を有する。（２人は心筋梗塞の治療に有効であることが臨床試験で証明されてきた。検査された適応症は肺塞栓、強度の静脈血栓症及び脳血栓を含む。

ＦＰＡ分子は５つの別個の構造ドメインを有する。一本鎖ＩＰ＾すなわち酵素原酵素はプラスミンの存在下で活性化され、二重鎖形に切断される。前記重鎮は上記５つのドメインのうちフィブロネクチンの一部分にと相同する「フィンガー」ドメイン、表皮性成長因子と相同する「成長因子」ドメイン、２つの異なる「クリングル（ｋ＋ｉｎｇｌｅ）Ｊ　ドメインの４つの領域を含む。二重鎖ＩＰＡを形成するプラスミン切断はクリングル２のＣ末端（アルギニン２）、で）で起こる。この軽鎖はトリプシン及びキモトリプシンと相同するセリンプロテアーゼドメインを含有している。

ＩＰＡは血餅マトリックスを生成するフィブリンに対する親和性のために血餅に対して比較的に高い特異性を有するプラスミノーゲン活性化因子である。このフィブリン親和性はフィンガー及びクリングル２ドメインとフィブリンとの相互作用によるものと考えられている。クリングル１によるフィブリンに対するより低い親和性についてはよく知られていない。

本発明の１つの面は高フィブリン特異性の、野生型ＩＰＡ分子よりも高度に繊維素溶解現象を達成する＋ｌＰＡを産生ずることである。

本発明の１つの面は、繊維素溶解現象速度を高めるか又はヒト血漿中に存在する内生的な　ＩＰＡ阻害物質による阻害に対する抵抗を高めるために　ＩＰＡドメイン間の間隔を広くするための方法を提供することである。

ヒト黒色腫により分泌される　１°ＰＡはリヒケン（Ｒｉｊｋｓｎ）らにより精製され特徴づけられている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｂｅ＋ｅ、）第２５６巻、７０３５頁　（１９８２年）１゜外生的＋ＰＡの治療的有用性は黒色腫由来物質を用いて論証されている［コーレン（Ｃｏｌｌｅｎ）らによるジャーナル・オブ・クリニカルφインペンション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖ、　）　、第７１巻、　３６８頁（１９１１３年）、コリンガ−（Ｋｏ＋ｉｎｇｅｔ）　　らによるジャーナル・オブ・クリニカル・インペンション、第°６９巻、第５７３頁　（１９８２年）コ。黒色腫由来の　ＩＰＡと正常の子宮組織由来の　ＩＰＡとの相違に関して報告されている［ボール（ＰＯＩＩ＋）　　らによるＦＥＢＳレターズ、第１６８巻、第２９頁（１９８４年）］。

す°ヒケンらによるバイオヘム・パイオフィス・アクタ　（Ｂｉｏｃｂｅｍ、　　Ｂｉｏｐｂ７ｓ、　　Ａｃ１ｚ、　　）　、第　５８０巻、＄　　１４０頁（１９７９年）にはヒト子宮組織からヒト組織プラスミノーゲン活性化因子　（ｕｌＰＡ）の部分的精製について記載されている。

ゴエデル　（Ｇｏｃｄｄｅｌ）らによる欧州特許出願第００９３６１９号に記載されているように、従来、ボウズ　（Ｂａｔｅｓ）　ＩＰＡをコードするｃＤＮＡを産生するのに用いられるｍ１ｌＮＡを癌細胞の１系統から得るために組換えＤＮＡ技術が用いられてきた。本明細書中に参考として完全に組み込まれる、ウェイ　（Ｌｅｔ）　　らに譲渡された係属中の米国特許出願第７１１２、６８６号には、ｉＰＡをコードする　Ｄｌｌ＾配列が記載されており、さらに、哺乳動物細胞による翻訳後処理工程において通常グリコジル化されるアミノ酸をコードする３つの部位の１つ以上のいずれかで［ｌＮＡ配列の部位特定の変異誘発に関して記載されている。生成した、変換されたアミノ酸配列を有する修飾されたｌＩ’Ａ分子は突然変異した部位でグリコジル化を示さない。この研究についてはウェイらによるＤＮＡ、第４巻、第７６頁　（１９８５年）及び欧州特許出願第１７８．１０５号にも又、報告されている。

マウス細胞中で分泌されたｔＰＡの発現用の発現ベクターはその後、レディ　（Ｒｅ　ｄ　ｄマ）らによるジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｂｅ＋ａ、）　、第１００巻、第１５４頁　（１９８６年）に報告されている。バネコニック　（Ｐｔｎｎｅｋｏｅｋ）らによる欧州特許出願第０．２３４．０５１号では再配列されたドメインを有するが変更されていない軽鎖を有する　ＩＰＡ分子について論じられている。ボウズ黒色腫細胞をこの研究のための　ＩＰＡ源として用いた。

しかし、前記出願は、ＩＰＡ変異体の実際の産生を設計するために必要な理解及び手段を供給することは記載されているが所望の＋ｌＰＡを供給するための黒色腫細胞由来のｃＤＮＡを改変する再現可能な予想可能な方法を提供していない。

本発明の他の面は、所望のｍ１ＰＡ類を産生ずるためにｆＰＡ　ｃＤＮＡが所望のように改変されることを予測的に保証する新規な方法を提供することである。

マロッティ°（ＭｓｒｏＮｉ）らによる欧州特許出願第０、２３１．６２４号には、天然ドメインを再配列した又は欠失した他のヒト組織プラスミノーゲン類似体について記載されている。前記出願には、オリゴヌクレオチドを完全に化学的合成することによって特定した　ｔＰＡ　ｃＤＮＡの産生のための複雑で時間がかかる方法が記載されている。

さらにその合成はヒト黒色腫細胞（ボウズ細胞）由来の天然ＩＰＡを基にしている。

本発明の他の面はｕｌＰＡを基礎にした　ＩＰＡ様分子分子いて予想可能なドメインの再配列の、単純でより直接的な方法を提供することである。

本発明の他の面は、あらかじめ決められた位置にある特定の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する　ＩＰＡ様分子分子−ドする特定のｃＤＮＡ配列を供給し、そしてそれから生成する新規な分子を供給することである。

本発明の他の面は、組織プラスミノーゲン活性化因子に関連する生物学的活性を有する新規な分子を産生ずるための新規な方法を提供することである。

本発明の要約本発明の原理及び目的に従って、ドメインの欠失、再配列又は重複により親ＩＰＡ分子から産生されるｍｆＰＡが供給される。そのように改変されたものが野生型又は修飾されていない　ＩＰＡに関連した生物学的活性を有する分子をなお生成するのは驚くべきことである。これらの新規なｍ１ＰＡのいくつかはそれらの繊維素溶解に関して親分子よりすぐれていることはまったく予期しないことであった。

本発明の好ましい方法は少なくとも２つの制限酵素部位を　ＩＰＡ　ｃＤＮＡに導入することを含む。これらの部位は、他の場所にあってもよいが、　ＩＰＡ蛋白質ドメインの境界に相当する、　ＩＰＡ　ｃＤＮＡでの場所に位置するのが理想的である。これらの部位の正確な位置は親ＩＰＡ分子の所望の活性を保持するためには臨界的である。本発明の最も好ましい態様は、別個のｃＤＮＡに１つのＡｖｔ　ＩＩ制限部位、１つのＮｈｅ　Ｉ制限部位、１つのＳｐｅ　Ｉ制限部位、及びＸｂａ　Ｉ制限部位を導入する。生成する好ましいアミノ酸配列は第３表に記載のとおりである。

上記の改変したｃＤＮＡはつぎに第４表に示したようにＩＰＡの欠失又は重複を生じるように有利に操作され得る。

これらの操作は下記に追加的に詳細に記載されてあり、一般に修飾ｃＤＮＡを適切な制限酵素で切断し、生じたｃＤＮＡフラグメントを結合して新規な好ましいｃＤＮＡを形成させることを含む。

最も好ましい態様は、生体中の半減期が延長された分子を得る、例えばヌクレオチド４５１でのアスパラギンのグルタミンへの変換の目的で上記の改変されたものを他の改変されたものと結合されている。

変異体発明の他の好ましい態様は、前記配列の保持及び複製のための親機生物、ＣＯ３細胞、Ｃｌ２７細胞、ＣＩＯ細胞中でのｍｊＰＡの発現のための発現ベクター及びこの発現系から誘導されるｍｆＰＡ蛋白質を含む。

図面の簡単な説明添付図面を見ることによって本発明の原理及び目的をより理解できる。

第１図はＩＰＡ　ｃＤＮＡでのＡｖｔ　ＩＩ、Ｎｈｅ　Ｉ及びＳｐｅ　Ｉ部位の位置を示すものである。

第２図はに、欠失を有するＩＰＡを発現するベクターの構造の概略図である。

第３図はｍｆＰＡの一時的発現のためのＬＫ４４４ＢＨＳベクターを表したものである。

第４図はＣＨＯ細胞でのｍｔＰＡの安定な発現のためのＣＬＨ３ＡＸＳ２ＤＨＦＲベクターを表したものである。

第５図はＣｌ２７細胞でのｍｔＰＡの安定な発現のためのＣＬ）１３ＡＸＢＰＶベクターを表したものである。

第６図はに、に２重複を有するｍ１ＰＡを含有するベクターの構築の概略図である。

第７ａ−１及び７ａ−２図はυ１１再配列ｍｌＰ＾配列を含有するＳＰ、　ＳＮ＾ベクターの構築を示す。

第７ｂ−１及び７ｂ−２図はＵＬＴ再配列１Ｐ＾配列を含有するＳＰ、υＬＴベクターの構築を示す。

「細胞培養」という用語は、細胞が元の植物又は動物の外で成育を続けさせておく、多細胞の植物又は動物のいずれかから誘導された成育細胞の封じ込めをいう。

「宿主細胞」とは、細胞培養において成育でき、ＩＰＡ生物学的特性及び分子の発現を有する分子をコードする遺伝子を含むプラスミド又はベクターでトランスフェクションした又は形質転換した、酵母、細菌及び哺乳動物の細胞を包含した意味での微生物をいう。

「ドメイン」とは特定の機能を備え得るアミノ酸配列の独立した連続部分をいう。ＩＰＡに関しては文献［バンヤイ（ＢａｎＨｉ）　、Ｌ、　　らによるコモン・エボリューショナリー・オリジン・オブ・ザ・フィブリン−パインディング・スッラクチャー・オブ・フィブロネクチン・アンド・ティジュー−タイプ・プラスミノーゲン・アクティベーター（Ｃｏｍｍｏｎ　ｃｖｏｌｕｌｔｏｎｘＢ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｉｂ＋ｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｌ＋ｕｅｆｕ＋ｔｓ　ｏｆ　ｌｉｂ＋ｏｎｅｃｌｉｎ　ｘｎｄ　＋ｉｘｓｕｔ−１７ｐｅｐｌｘｓｍｆｎｏｇｅｎ　＊ｃｌｉｖｘｌｏ＋）、ＦＥＢＳレタース、第１６３巻第１号第３７−４１頁（１９８３年）及びナイ（ＮＹ）、　　Ｔ、　　らによるザ・ストラフチャー・オブ・ザ・ヒユーマン・ティジュー−タイプ・プラスミノーゲン・アクティベーター・ジエーン：フリレーション・オブ・イントロン・アンド・エクソン・ストラクチュラル・ツー・ファンクショナル・アンド・ストラクチュラル・ドメインズ（Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｌ　ｔｈｅ　）Ｉｕｍｔｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ−１７ｐｅ　Ｐｌｓｓｍｉｎｏｌｅｎ＾ｃｌｉｙｔｌｏ＋　Ｇｅｎｅ：　Ｃｏ＋ｒｅｌｘｌｉｏｎ　ｏｊ　ｌ１ｒｏｎ　ｘｎｄ　ＥｒｘｏｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｔｏ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｘｎｄ　５ｌｕｃｌｕｒｓｌ　Ｄｏｍｓｉｎｓ）、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ− ｅオブ・サイエンセス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｌ　ｔｈｅ　Ｎｔｊｉｏ＋ｓｌＡｃｌｄｅｍ７　ｏＩ　Ｓｉｅ’ｎｃｅｓ）］により、ドメイン領域が定義されており、又、第１図に、ドメイン領域の適する位置を記載した。

「下流」という用語は発現の方向にさらに進んだ配列をいう。例えば、コード領域は開始コドンの下流である。

「インタードメイン」という用語はドメイン間に存在する蛋白質のアミノ酸配列をいう。

「維持された」という用語はプラスミドが自律的複製体として又は宿主ゲノムの組み込み部位として存在する、形質転換宿主中のプラスミドの安定な存在をいう。

「微生物」という用語は、放線菌や酵母のような、単細胞の原核生物及び真核生物の両方を含めたものをいう。

「非天然型エンドヌクレアーゼ制限部位」とは、天然ｃＤＮＡに通常存在しない、天然ｃＤＮＡ配列の既存の制限部位で合成されたエンドヌクレアーゼ制限部位をいう。

「オペロン」という用語は、構造遺伝子、調節遺伝子及び調節遺伝子生成物により認識されるＤＮＡ中の制御要素を包含する、遺伝子の発現及び調節の完全なユニットをいう。

「プラスミド」という用語は、自律的に自己複製する染色体外の環状ＤＮＡをいい、発現型及び非発現型の両方を含む。そのような分子の発現を提供する細胞培養物の組換え微生物を発現プラスミドの宿主とすると記載される場合、「発現プラスミド」という用語は染色体外の環状ＤＮＡ及び宿主染色体に組み込まれたＤＮＡの両方を包含する。

「プロモーター」という用語は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合するのに関与する　ＤＮＡ領域をいう。

ｒ　ＤＮＡ配列」という用語は、アデノシン、チミジン、シトシン及びグアノシンから成るヌクレオチド塩基を含む一本鎖又は二重鎖ＤＮＡ分子をいうがさらにゲノムＤＮ＾及びコピーＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）も包含する。

「適した宿主」という用語は、そのゲノムに組み込まれ、発現されるために、形質転換プラスミドと適合し、プラスミドを複製させ、そのゲノム中に組込み、又は発現させることのできる細胞培養物又は微生物をいう。

「上流」という用語は、発現とは反対の方向に進んだ配列を指す。例えば、細菌のプロモーターは転写単位の上流であり、開始コドンはコード領域の上流である。

制限酵素ともいう「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、特定の酵素に特異的な位置又は部位で二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を切断する酵素をいう。例えば、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩはｄｓ　ＤＮＡを５’　ＧＡＡＴＴＣ３’ 　の部位で３’　ＣＴＴＡＡＧ５’ 切断して５’Ｇ　　　及び＾ＡＴＴＣ３’　　フラグメントを生じる。

３’　ＣＴＴＡＡ　　　　　Ｇ５’ 多くのその様な酵素が知られているが、本発明の最も好ましい実施態様は、特定の特徴を有する選択された制限酵素に主として関係する。

プラスミド及びフラグメントを表すのに用いた取決めは、プラスミド及びそれらのフラグメントの従来の表示のものと同意義である。従来の環状形でなく、図面に示した単線形は環状及び線状二重鎖ＤＮＡの両方を表し、開始又は転写は左から右（５′から３゛）に起こる。

ヌクレオチドの番号付は及び特定のアミノ末端形に相当するアミノ酸を第１表に示したが、異なるＮＯ２末端を有するものに関しては番号付けに明らかな修正がなされることが容易に理解されるであろう。

アミノ酸の略号アミノ酸　　　３文字略形　　　１文字符号アスパラギン　　　Ａｓｎ　　　　　　　Ｎアスパラギン酸　　＾ｉｌｌ　　　　　　Ｄアスパラギン又はアスパラギン酸　＾ｓｘ　　　　　　３３システイン　　　　Ｃ７ｓ　　　　　　　Ｃグルタミン　　　　Ｇｌｎ　　　　　　　Ｑグルタミン酸　　　Ｇｌｕ　　　　　　　Ｅグルタミン又はグルタミン酸　　ＧｌｘＺグリシン　　　　　Ｇｌｒ　　　　　　Ｇヒスチジン　　　　Ｈｉｓ　　　　　　Ｈメチオニン　　　　Ｍｅｔ　　　　　　Ｍフェニルアラニン　Ｐｈｃ　　　　　　Ｆプロリン　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　Ｐセリン　　　　　Ｓｅｔ　　　　　　Ｓトレオニン　　　　Ｔｂ＋　　　　　　Ｔトリプトファン　　Ｔ＋ｐ　　　　　　Ｗチロシン　　　　　Ｔｙ＋　　　　　　Ｙバリン　　　　　Ｖ！ｌ　　　　　　Ｖ一般的方法ＤＮＡ調製、制限酵素による切断、制限酵素による分析、ゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの単離、ＤＮＡの沈殿、ＤＮＡフラグメントの連結、細菌の形質転換、細菌コロニーの選択及び成育に関しての方法はマニアチス（Ｍｓｎｉｓ口Ｓ）らによるモレキユラー・クローニング（ｌｌｏｌｅｃｕｌｔｔ　ＣＩｏｎｉＢ　）　　ニラボラトリー・マニュアル［コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉＢＨ為＋ｂｏｒ）　、ニューヨーク、（１９８２年）コ　（本明細書では以降マニアチスと略す。）に詳細が記載されている。緩衝培地における　ｉｎマＨｒｏでのＲＮＡ転写及びウサギ網状赤血球溶解産轡における　ｉｎ　ｗｉｒｅでの蛋白質翻訳の方法は製造業者の使用説明書［プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｌｅｃｈ）］　に詳細が説明されティる。ＤＮＡ配列に決定は一本鎖ＤＮＡ又は変性二重鎖ＤＮＡのいずれかを用い、サンガーのジデオキシ法を用いて行った。

合成オリゴヌクレオチドリンカーバイオラプス社（Ｂｉｏｌｇｂｓ　Ｉｎｃ、）から下記のオリゴヌクレオチドリンカーを入手した。

１、　ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）　　　　　　　８量体（ｌｌｌｅｒ）２．　６（ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧ）　　　、　　　　１０量体３、　ｄ（ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧ）　　　　　＋２を体各リンカ−は制限酵素Ｘ）１０１　（ＣＴＣＧＡＧ）に対する認識配列を含有しており、ＩＰＡ　ｃＤＮＡ及び５Ｐ６５ベクターに固有のものである。これらのリンカ−はリンカ−挿入変異体の生成において及びその後の欠失変異体の生成に用０らヒト子宮　ＩＰＡの完全な長さのｃＤＮＡのクローニングについてはレディ　（Ｒｅ１ｄｒ）らにより記載されている＜　１９８７年）。本質的にｍＲＮ＾はグアニジントリオシアネート法により、続いて、ＣｓＣｌ勾配精製法及びオリゴ−ｄ１アフィニティークロマトグラフィ精製法によってヒ）・子宮組織から得た。逆転写酵素及びフレノウフラグメントを使用して、情報を二重鎖ｃＤＮＡに写し、このｃＤＮＡをｐＢＲ３２２のＰｓ１１部位に導入した。ボウズ黒色腫ＩＰ＾の配列から推定されるオリゴヌクレオチドで　ｔＰＡ　ｃＤＮＡクローンをスクリーニングした。２４５５塩基対のｃＤＮＡを単離し、その配列を決定したところ、刊行物に記載された配列［ペニカ（Ｐｅｎｉｃｉ）　　ら、１９８３年コと一致していることが分かった。

子宮　１１’ＡｃＤＮＡは黒色腫　ＩＰＡといくつかの部位にお０て（主に、クローンの３゛非翻訳領域）（レディら、１９８７年）異なっていた。

ＩＰＡのＡＴＧ開始コドンの近くのクローンの５′末端における５ｌａｎ１部位（ヌクレオチド１６）とＢｇ１１１部位（２０９０）を切断し、ｄＮＴＰ類の存在下でフレノウを用いて埋め、Ｓａｌ　ｌ　リンカ−が溶解されプラントエンドになった。ｃＤＮＡをＳａｌ　ｌ　フラグメントとしてＢＲ３２２に再導入し、ついで、５１１１部位を用いて他のベクター中に再導入した。

リンカ−挿入変異体の生成他の導入された＾マ＋　ＩＩ、Ｎｈ！ｌ及びＳｐｅ　１部位とともに用いられ得るように、Ｓｐｅ　Ｉ　リンカ−を　ＩＰＡ　ｃＤＮＡのＢｇｌ　ｌ１１５）部位に配置した。

Ｂｇｌ　１１１１５）　Ｓｐｅ　ｌ　　（ヌクレオチド　８）変異体の構築のための詳細な方法を下記に示す。

５Ｐ６−ＩＰＡ　１μｇを標準プ１トコルを用いて固有のＢｇ１１１認識部位（ヌクレオチド１１５）においてＢｇｌ　ＩＩで切断された。線状ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ニックトランスレーション緩衝液［ＫＰＯ−（ｐＨＬ５）　４０　ｍＭ、　ＭｇＣｌ□６．６１量Ｍ、メルカプトエタノール１．ＯＬＩＩＭ　５ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ。

ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ２５０μＭ１中に５μのＤＮＡポリラーゼＩ　（フレノウフラグメント）とともに再懸濁した。この工程は５′付着末端をふさぎ「プラントエンドの」線状ＤＮＡを生成した。

室温で１時間インキュベートした後に、６５℃で５分間フレノウの熱不活性化を行った。この混合物にホスホリル化８量体Ｘｈｏ　Ｉ　リンカ−（市販の）　　１００　ｐｍｏｊｅ、連結緩衝液［５０ｍＭ　）リス（ｐＨ７，８）の最終濃度、ＤＴ７２０ｍＭ。

＾ＴＰ　ｌｆｆ１Ｍ及びウシ血清アルブミン５０μｇｍｌ−’］及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２００ｕを添加した。この連結を２２℃で１晩行わせた。

連結したＤＮＡはフェノール：クロロホルム：抽出され、エタノール沈殿されたＩＡＡであった。これを制限酵素緩衝液に再懸濁し、Ｘｈｏ　Ｉで過消化し、１％のアガロースゲルを流して（ｒＩＩｌｌＯｎ）、多重リンカ−及び過剰のリンカ−を再直線状化ＤＮＡから除去した。再直線状化ＤＮＡをアガロースで抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿しちＤＮＡを連結緩衝液及び゛Ｔ４リガーゼ中に再懸濁し、１６℃で１晩結合を行わせた。

再結合されたＤＮＡの小試料を標準プロトコルを用いて大腸菌ＤＨＳ株にトランスフェクションを行いトランスフェクションされた細菌プラスミドをＬＢ寒天ｉｍｐプレート上で培養した。

細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地で成育させ、ＤＮＡを標準方法で小規模に産生させた。プラスミドＤＮＡを制限酵素分析により分析し固有のＢｇｌ　＋１部位の欠失を確認した。

出玉部位特異的変異生成の合成固相ホスフオリトリエステル法により生成した合成オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異生成゛によりヒト子宮　ｔＰＡ　ｃＤＮＡを改変した。

下記のブライマーを合成し前記変異生成に用いた。それらはアンチセンス配列中に存在した。

１、ブライマーＥＧＡＶヌクレオチド２５６−２６１での＾マｒ　１１部位（ＣＣＴ−＾ＧＧ）の導入用５’　ＧＣＡ、ＡＣＴ、ＴＴＴ、ＣＣＴ、１．ＣＡＣ，ＴＧＡ　３“２、　　ブライマーＳＷＳヌクレオチド３７９−３８４でのＳｐｅ　Ｉ部位（ＡＣＴ、　ＡＧＴ）の導入用　５’　ＧＣＡ、ＣＧＴ、ＧＧＣ，ΔＣＴ、ΔＧＴ、ＡＴＣ，ＴＡＴ、ＴＴＣ３ ’３、　　ブライマーＫＮＩヌクレオチド４０９−４４４でのＳｐｅ　１部位（ＡＣＴＡＧＴ）の導入用５’ 　ＣＣＣＣＴＧＴＡＡＣＴＡＣｉＴＧＣＣＣＴＧ　３’４、ブライマーＫＣＩヌクレオチド６１９−６２４でのＮｈｅ　Ｉ　　（ＧＣＴＡＧＣ）導入用５’　ＧＧＧＴＧＣＴＡＩＫＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧ　３’５、ブライマーＫＣＡＩヌクレオチド６１３−６１８でのＮｂｅ　Ｉ　　（ＧＣＴＡＧＣ）の導入用５’ 　ＧＴＧＣＴＦＣＡＧ（ＪＩＣＴＧＡＧＣＴＧＴＡＣ３’６、ブライマーＫＮＢ２ヌクレオチド６７３−６７８でのＮｈｃ　ｌ　　（ＧＣＴＡＧＣ）部位の導入用５’　ＧＣＣＡＣにＧＴＡＧＣＩＡＧＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣ３’ヌクレオチド８７１−８７６でのＡｔ　ｒ　Ｉ　ｌ　（ＣＣＴＡＧＧ）部位の導入用５’　ＧＴＡＣＴＣＣＣＩＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧｉＣ３’８、プライマーＫＣＡ２ヌクレオチド８６２−８６７でのＡｔ　ｒ　Ｉ　Ｉ　（ＣＣＴＡＧＧ）の導入用５’　ＣＧＴＣＡＧＣＣＴ乙ＧＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣ３’９、プライマーＳＷＮヌクレオチド９０＋−９０６でのＮｈｅ　Ｉ　（ＯＣＴＡＧＣ）の導入用ヌクレオチド９４３−９４８でのＳｐｅ　１部位（ＡＣＴＡＧＴ）の導入用５’　ＣＣＣ丁ＣＣＡｃＴ胚ＴＧＣＧＡＡＡＣＴＧ　３’ヌクレオチド＋６９３−１６９８での＾ｖｔ　ｌ！　（ＣＣＴＡＧＧ）の導入用　　５’　ＣＴＧＧＴＣＡＣσ胚ＧＣＡＴＧＴＴＧ　３’上記オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異生成ＭＩ３系オリゴヌクレオチド指定変異生成方法は本質的にはクンケル（Ｋ■ｋｅｌ）　　らによるプロシーディンゲス・オブ・ナショナル：アカデミーメオブ・サイエンセズＵＳＡ　。

第８２巻、第４８８頁（１９８５年）に詳細に記載されている。

ＭＩ３１Ｆ＾３．　ＭＧ＾ベクター（前記係属中の特許出願及びウェイらによる文献に記載されているＡｓｎ　４５１　ｇＩｎ変異体を有する　ＩＰＡ　ｅＤＮＡ　）を含有するファージを大腸菌Ｃ３２３６株（これはｄｕ＋−υｎｌ　　である）中で０．５μｇｍｌウリジンの存在下、培地で成育させた。チミンの代わりにウラシル残基を含有して一本鎖ＤＮＡが生成された。一本鎖ＭＩ３１Ｐ＾、　ＭＧＡが常法により産生された。

ホスホリル化変異オリゴヌクレオチドｌｏｎｇが１ｘｓｓｃ（０，１５ＭのＮ１Ｃｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を含有スる総量２０μ！中で一本鎖ＤＮＡ　１Ｒｇでアニーリングさせた。このアニーリング混合物を７０℃に加熱し、次に水浴で数時間徐々に冷却した。アニーリングされたフラグメントがＤＮＡポリメラーゼとＴ４リガーゼの作用により共有結合した環状ＤＮＡに変換した。アニーリングした混合物は２０ｍＭヘペス（ｐ）１７．８）、２ｍＭのＤＴＴ　、　１ｈ＋ＭのＭｇＣ１，、各５００μｉＪのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、＾ＴＰ　１ｍＭ　、　２．５ユニツトのフレノウ及び２ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼを含有して１００μｉになった。０℃で５分間、室温で５分間、３７℃で２時間そして１６℃で１晩インキユベートを開始した。

上記反応性混合物１０μｌをコンピテントＤＨ，細菌細胞３００μｌに添加し、水中に１時間放置した。細菌を３７℃で５分熱シヨツクさせ、続いて、中位相ＪＭＩＯＩを２００　声１含有する軟寒天（０，６％）３ｍＭで希釈し、ＬＢ寒天プレートに注ぎ、固体化させた。そのプレートを３７℃で１晩インキユベートした。

プレートからニトロセルロースの隆起（１目Ｉ）を取り、８０度で真空下、２時間焼き、６Ｐ″＾ＴＰラベルした変異体オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。変異体ポジティブ単離体をＤＮＡ　：オリゴ２量体の熱変性により測定し、さらに　ＩＭＩＯＩ中でｍｇｗｉ−ｐ＋ｅｐ　Ｒ’ｆ　ＤＮＡ単離に対して大規模に生育させた。Ａｓｎ　４５１１１１１変異体及び新炭異体を含有する　ＩＰＡ　ｃＤＮＡ含有Ｂｔｉ　Ｈｌ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントをさらに制限酵素切断及び連結の常法を用いてＳＮ５ベクター及び／又は哺乳動物細胞発現ベクターに再クローン化した。

この方法の例として、＾マｒ　１１部位がクリングル２ドメインをコードするｃＤＮＡの３′境界に導入された変異体ＫＣＡ２　（Ｒ２５２Ｐ；Ｎ４５１Ｑ）の生成がある。

５５９　　　　５７ＧＡＡＣ，ＣＧＣ，ＡＧＧ、　ＣＴＧ（２５１）　Ｎ　　ＲＲＬ　（２５４）部位特異的オリゴヌクレオチド指定変異生成は＾ｗｒ　Ｉｆ部位（ＣＣＴＡＧＧ）を生じる。

この方法を用いる他の変異体は以下の通りである。

ＥＣ，ＡＶ　　　　　　　　　（Ｖ５１Ｒ：　Ｎ４ＳＩＱ）ＳＷＳ　　　　　　　　　　（Ｒ９２Ｓ；　Ｎ４５１０）ＫＮＩ　　　　　　　　　　（ＩＩＯＩＴ：　Ｎ４５１Ｑ）ＫＣＩ　　　　　　　　　　（Ｃ１７１Ｓ；　Ｎ４５１Ｑ）にＣＡ１（Ｅ１６９Ａ：　Ｆ１７０Ｓ；　Ｎ４５１Ｑ）ＫＮＢ２　　　　　　　　　（Ｓ１１３９Ａ；　Ａ１９０Ｓ；　Ｎ４５１Ｑ）ＫＣ２（Ｔ２５５Ｐ：　Ｈ２５６Ｒ；　Ｎ４５＋Ｑ）ＫＣＡ２　　　　　　　　　（Ｒ２５２Ｐ；　Ｎ４５１Ｑ）ＳＷＮ　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｓ２６５Ａ；　Ｔ２６５Ｓ；　Ｎ４５１０）ＯＭＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ２７９Ｔ；　に２Ｂ０Ｓ；　Ｎ４５１Ｑ）Ｐｅｎ　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｒ５２９Ｐ；　Ｐ５３０Ｒ：　Ｈ４５ＩＱ）（注記：特定の制限酵素部位は変異体ＭＧＳ　（Ｎ４５１Ｑ）が導入され、従って各々がこの変異体を含有する。）ＩＰＡ蛋白質のドメイン構造に関する制限酵素部位の位置は下記の通りである（第１図を参照）。

１１１１　ＩＩ　（１１５）　　５Ｒ（８）−成熟ｔＰ＾蛋白質のＮ末端とフィンガードメインのＮ末端の間ＥＧＡＶ　　　　　　　　　−フィンガードメインのＣ末端と成長因子ドメインのＮ末端の間ＳＷＳ　　　　　　　　　　−成長因子ドメインのＣ末端とクリングル１ドメインのＮ末端の間ＫＮＩ　　　　　　　　　　−クリングル１ドメインのＮ末端ＫＣＩ　　　　　　　　　　−クリングル１ドメインのＣ末端ＫＣＡＩ　　　　　　　　　−クリングル１ドメインのＣ末端ＫＮＢ２　　　　　　　　−　クリングル２ドメインのＮ末端ＫＣ２−クリングル２ドメインのＣ末端ＫＣＡ２　　　　　　　　−　クリングル２ドメインのＣ末端ＳＷＮ　　　　　　　　　　−クリングル２ドメインのＣ末端とプロテアーゼドメインのＮ末端の間ＯＭＴ　　　　　　　　　−プロテアーゼドメインのＮ末端Ｐｅｎ　　　　　　　　　　−プロテアーゼドメインのＣ末端ｆＰＡ　ｃＤＮＡの操作Ａｗｒ　Ｉｆ、　Ｎｈｅ　ｌ　、Ｓｐｅ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉ制限酵素は特定の個々のへキサヌクレオチド配列を認識する。例えば人Ｖ＋　ＩＩ　　　　　　ＣＣＴＡＧＧＮｂｇ　ｌ　　　　　　ＧＣＴＡＧＣ３ｐｃ　ｌ　　　　　　ＡＣＴＡＧＴＸｂｔ　　Ｉ　　　　　　　　　　　　丁Ｃ７ＡＧＡ適した制限酵素により切断されるとき、５′突出部はすべての４部位に共通している。

Ａｗｒ　ＩＩ　　　ＣＣＴＡＧＧ　　−”　　ＣＣＴＡＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＮｂ５　Ｉ　　　ＧＣＴＡＧＣ−”　　Ｇ　　　　ＣＴＡＧＣＣＧＡＴＣＧ　　　　　　　ＣＧＡＴＣＧＳｐｅ　　Ｉ　　　　　　ＡＣＴＡＧ丁　　→　　ＡＣ丁＾ＧＴＴＧＡＴＣＡ　　　　　　ＴＧＡＴＣＡＸｂｔ　　Ｉ　　　　　ＴＣＴＡＧＡ　　　−Ｔ　　　　　　ＣＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴ　　　　　　　ＡＧＡＴＣＴ従って、上記の末端を有するフラグメントは容易に連結され、その他の利益として、異なって切断された部位からの末端が連結されるとき、生じるバイブリド部位は、正しい連結及び／又はフラグメントの配向を分析するどの制限酵素によっても認識されない。

例えば、Ａｗｒ　Ｉｆ　Ｓ’　突出部　　　ＮｈｅｌＳ’　突出部↓ 切断それは回分的特徴を失っているので＾ｘ　ＩＩ又はＮｈｅ　１のいずれによってももはや切断されない。同じことが他の可能な組み合わせにも当てはまる。

ＩＰＡ　ｃＤＮＡの操作は上記の導入された部位を用いて達成され欠失及び重複を生じる。

Ａ）欠失下記の変異体に存在する＾マｒ　ＩＬ　Ｎｈｅ　ｌ及びＳｐｅ　１部位：　ＥＧＡＬ　ＳＷＳ　５ＫＮＩ　５ＫＣＩ　ＳＫＣ＾１、ＫＮＢ２、ＫＣ２、ＫＣＡ２、ＳＷＮ　、　ＯＭＴ及びＰｅｎを用いて、発現蛋白質生成物中のドメインの欠失を生じる　ＩＰＡ　ｃＤＮＡにおける欠失を生じる。

そのような操作の例は、変異体ＫＮＩ及びＫＣＡＩを用いてクリングルｌドメインをコードするｃＤｌｉＡの欠失である。

ＫＮＩ　　　　　　　　　　　　　　　ＫＣＡ１ＧＡＣ−ＣＡＧ−ＧＧＣ−ＡＣＴ−ＡＧＴ−ＴＡＣ−ＡＧＧ　　　　　　　　　　　　ＡＧＣ−ＴｃＡ−ＧＣＴ −ＡＧＣ−丁ＧＣ−ＡＧＣ−`ＣＣ−ＣＣＴａｓｐ　ｇｌｎ　ｇｌｙ　ｔｈｒ　ｓｅｒ　ｔｙｒ　ａｒｇ　　　　　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ａｌａ　ｓｉｒ　ｃｙｓ　ｓｅｒ　ｔｈｒ　ｐｒ０９８　　　□　　　　　１０５　　　　１６７　　　　ｊ　　　　　　１７４Ｓｐｅ　Ｉ切断　　　　　　　　　Ｎｈｅ　Ｉ切断↓　　　　　　　　　　　　　　　　↓ＧＡＣ，ＣＡＧ、ＧＣＣ，ＡＣＴ、ＡＧ　　　　　　　　　　　Ｃ，ＴＧＣ，ＡＧＣ，ＡＣＣ，ＣＣＴ↓ 結合（Ｓｐｅ　ｌ及びＮｈｅ　Ｉで消化されＫＮＩ又はＫＣＡＩを汚染しているものを除去する。） ↓ ＧＡＣ，ＣＡＧ、ＧＧＣ，ＡＣＴ、ＡＧＣ，ＴＧＣ，ＡＧＣ，ＡＣＣ，ＣＣＴａ５ｐ　ｇｉｎ　ｇｌｙ　ｔｈｒ　ｓｅｒ　ｃｙｓ　ｓｅｒ　ｔｈｒ　ｐｒ。

９８　９９　】ｏｏ　　　　　　１７＋　　１７２１７３１７４すなわちＫｌ　ｄｅｌ　　又はｄｅｌ　（１（１１−１７０）　；ＩＩ）ＯＴＳＩ７１；Ｎ４５１ＱＫ１欠失構築の詳細は以下の通りである。プラスミド５Ｐ６ＫＮＩを１μｇをＨｉｎｄ　ＩＩＩ及びＳｐｅ　！で消化させ、プラスミドＳＰ６　ＫＣＡｌをＨｉｎｄ　ＩＩＩ及びＮｈｅ　Ｉで消化させり。生成したＤＮＡフラグメントを分離し、ゲル電気泳動により単離した。ＳＦ３　ＫＮＩからの大フラグメントとＳＦ３　ＫＣＡＩからの小フラグメントを常法で結合し、Ｓｐｅ　Ｉ及びＮｈｅ　Ｉで再消化させ、大腸菌Ｄ）１５株にトランスフェクシヨンさせ、アンピシリンを含有するＬＢ培地プレートで培養した。抵模で産生じ、Ｓｐｅ　Ｉ及びＮｂｅ　Ｉ部位の欠失及び損失を制限酵素分析により分、析した。その工程を概要図的に第２図に示した。

同じ操作を下記の一連の変異体を産生させるのに用いる。

変異体　　　　領　域　　　　　欠失したドメインＮ　ｄｅｌ　　　　ｄｇｌ　　（１７１−１９１１）　；　　　　インタークリングル１７０Ａｓ］９１８４５１ＱＫｌ　ｄｅｌ　　　ｄｅｌ　（ｌＱＩ−１１０）；　　　　クリングル１１００ＴＳ］７１；Ｎ４５］Ｑ）（２ｄｅｌ　　　ｄｅｌ　　（１１１９−２５６）　；　　　　クリングル２１８８ＡＲ２５７；Ｎ４５１ＱＫＮＩ２　ｄｅｌ　　ｄｅｌ　（１０１２５６）　；　　　　クリングル１及び２１００ＴＲ２５７，Ｎ４５１ＱＦ　ｄｅｌ　　　　ｄｅｌ　　（５−５１）　４ＴＲ５２；　　　フィンガー４ＳＩＱＧ　ｄｅｌ　　　ｄｅｌ　（５１−９２）　５０Ｓ９３；　　成長因子ＦＧ　ｄｅｌ　　　ｄｅｌ　（５−９２）　４Ｔ５９３；　　フィンガー及び成長Ｎ４５１Ｑ　　　　　　　　因子プロテ　　＋ｌｅｌ　（２−２６６）；ＩＴＳ２Ｓ７；重鎖アーゼ　Ｎ４５１Ｑ　　　　　　　　　（フィンガー、成長因子、両クリングル）欠失をコードする変異体の構築において、下記のプラスミドが第２．６及び７図のように、適当に制限酵素消化され連結された。

例えば、欠失変異体Ｋｌｄ！ｌの生成において、固有のＳｐｅ　１部位　（ＫＮｌｌが固有Ｎｂｅ　１部位（ＫＣＡＩＩとそれらの通常の付着端で連結した。

プラスミド及び制限酵素Ｎ　ｄｅｌ　　　　　　ＫＣＩ　（Ｎｈｔ　Ｉ）及びＫＮＢ２　（Ｎｂｅ　Ｉ）Ｋｌ　ｄｅｌ　　　　　　ＫＮＩ　（Ｓｐｔ　Ｉ）及びＫＣＡＩ　　（ｌｔｈｅ　Ｉ）Ｋ２　ｄｅｌ　　　　　　ＫＮＢ２　（Ｎｈｔ　１１及びＫＣＡ２　（Ａｖ＋　Ｉｆ）ＫＮＩ２　ｄｅｌ　　　　　ＫＮＩ　（Ｓｐｅ　Ｉ）及びＫＣＡ２　（Ａｗｒ　ＩＩ）Ｆ　ｄｅｌ　　　　　　Ｂｇｌ／Ｓｐｔ　（Ｓｐｅ　Ｉ］及びＥＧＡＶ　（Ａｗｒ　Ｉｆ）Ｇ　ｄｅｌ　　　　　　ＥＧＡＶ　（Ａｖｒ　ＩＩ）及びＳＷＳ　（Ｓｐｅ　りＦＧ　ｄｓｌ　　　　　　Ｂｇｌ／Ｓｐｅ　（Ｓｐｅ　ｌ）及びＳＷＳ　（Ｓａｔ　ｌ）プロテアーゼ　　Ｂ１１／Ｓｐｅ　（Ｓｐｔ　］）及びＳＷＳ　（Ｎｈｅ　Ｉ）重複前記に挙げ、記載したＡｖｒ　ＩＩ、１ｉｋｅ　Ｉ及びＳｐｅ　１部位を用いる第１図に関して、ＤＮＡコードドメインを重複させ、従って蛋白質生成物において同じドメインを重複させることが可能である。そのような重複の例は変異体ＳＷＳ及びＳＩＮを用いて４つのクリングルドメイン（クリングル１及び２の重複）を含有する　ＩＰＡ類似体の生成である。

下記の重複は同様の方法で構築された。アミノ酸配列を第４〜９表及び第１２〜１５表に示した。

重複ドメイン変異体　　　　　□ ２に！　、［２クリングルＩＩＫＩ　、　２に２　　　　　　クリングＪし２２に１．２に２　　　　　クリングル１及び２ＳＩＮ　　　　　　　　　クリングル１及び２２Ｆ　　　　　　　　　　フィンガー２Ｇ　　　　　　　　　成長因子２ＦＧ　　　　　　　　フィンガー及び成長因子２　Ｆｒｅｔ　ＩＣＶ　　　　　プロテアーゼドメイン２　Ｐｒｏｌ　、２ＣＶ　　　　　プロテアーゼドメイン重複をコードする変異体の構築にお（１て、第２．６及び７ａ−１，７ａ−２，７ｂ−１及び７ｂ−２図で示されているように下記のプラスミドは適当番こ制限酵素消化ヒされそして連結された。

重複変異体、２Ｆの生成の例として、導入された固有のＡｖｒ　Ｉｔ　（ＥＧＡＶ）を含有するプラスミドをＪＩ　ＩＩ　（１１５）部位（Ｊｌ／５ｐｔ）で導入されたＳｐｔ　１部位を含有するプラスミドと通常の付着端を介して連結させた。

変異体　　　　エ用詩とカニ乙２二乙」ニエ！し１０医！？＊−２Ｆ　　　　　　　ＥＧＡＶ　（Ａｙｒ　ＩＩ）及びＢｇｌ／Ｓｐｅ　（Ｓｐｅ　１）２Ｇ　　　　　　　ＳＷＳ　（Ｓｐｅ　ｌ）及びＥＧＡＶ　（Ａｗｒ　Ｉ　１）２ＦＧ　　　　　　ＳＷＳ　（Ｓｐｅ　ｌ）及びＢｇｌ／Ｓｐｅ　（Ｓｐｅ　Ｉ）２Ｋ］　］Ｋ２　　　　ＫＣＡＩ　（Ｎｈｔ　Ｉ）及びＫＮＩ　（Ｓｐｃ　Ｉ）１１１２ｊ（２［ＣＡ２　（Ａｗｔ　Ｉｆ）及び１ＮＢ２　（Ｎｂｅ　Ｉ）２目２ｇ２　　　　ＫＣ＾２　（Ａｖｒ　Ｉｆ）及びＫＮＩ　（Ｓｐｅ　Ｉ）Ｓ＋Ｎ　　　　　　ＳＷＮ　（Ｎｈｅ　Ｉ）及びＳＷＳ　（Ｓｐｅ　Ｉ）ＯＭＳ　　　　　　ＯＭＴ　（Ｓｐｅ　Ｉ）及びＳＷＳ　（ａｐｅ　ｌ）２　Ｐｒｏ（ＩＣＶ　　　Ｐｅｎ　（Ａｗｒ　ｉｆ）及びＯＭＴ　（ａｐｔ　ｌ）２　Ｐｒｏｊ　２ＣＶ　　　Ｐｅｎ　（Ａｗｔ　ＩＩ）及びＳＩＮ　（Ｎｂｔ　１）Ｃ）再配列Ａｖｒ　ＩＩ、Ｓｐｓ　ｌ及びＮｈｔ　１部位を個々に又は組み合わせてプラスミド内で用いて、最終生成物が組み換えたドメイン構造を有するように親分予肉のドメイン又はドメインブロックを再配列することが可能であった。

その例として、重鎮及び軽鎖すなわち、蛋白質のアミノ末端半分での軽鎖及び蛋白質のアミノ末端半分での重鎮をコードする　ＤＮＡが入れ代わるように　ｊＰＡ　ｃＤＮＡを再配列することが、可能であった。

最終生成物はａｌｌ再配列変異体を意図したものであった。

同様の方法で再配列されたドメインを用いて他の変異体を産生された。

２０は、クリングル２ドメインが他のクリングル１ドメインに置換されており、２つのクリングル１ドメイン２有しクリングル２を有さない蛋白質を産生ずる　ＩＰＡＰ似体をコードした。

２に２は２つのクリングル２ドメインを含有し、クリングル１ドメインを含有しない　ＩＰ人人類鉢体コードする。

再配列された変異体のアミノ酸配列を第１０．１１及び１６表に示した。

再配列をコードする変異体の構築において、下記のプラスミドは第２．６及び７ａ−１，７ａ−２，７ｂ−１及び７ｂ−２図のように適当に制限酵素消化され、連結された。

例として、υＬＴ変異体を第７ａ−１，７ａ−２，７ｂ−１及び７ｂ−２図のように産生した。

変異体　　　　用いたプラスミド及び制限酵素２ＫＩ　　　　　　ＫＣＡＩ　（Ｎｈｅ　ｌ）、ＫＮＩ　（Ｓｐｅ　Ｉ）、にＣ＾２　（Ａｙ＋　ＩＩ）及びにＮＢ２　（Ｓｐｅ　Ｉ）２に２　　　　　　ＫＣＡＩ　（Ｎｈｅ　Ｉ）　、にＮｌ　（Ｓｐｅ　Ｉ）、ＫＣＡ２　（人！Ｉ　ｉｌｌ　及びＫＮＯ２（Ｓｐｅ　Ｉ）ＵＬＴ　　　　　　Ｂｇｌ／Ｓｐｃ　（Ｓｐｅ　Ｉ）　、Ｓｗｎ　（Ｎｂｅ　Ｉ）及びＰｅｎ　（Ａｙ＋　Ｉ　Ｉ）変異体の確認制限酵素分析、配列決定及び／又はｉｎマｉｌ＋ｏでの転写／翻訳分析によりその変異を確認した。十分な繊維素溶解能を有する変異体がコードされた蛋白質を野生型ＩＰＡに関して酵素図により分析した。

ＭＩ３ＭＰＩ８．　　ＲＡから、制限酵素分析及びゲル電気泳動により、　ＩＰＡ　ｔＤＮＡ配列を含有するＢｊ１１＋旧−）１ｉｎｄｌｌｌフラグメントが単離され、Ｂａｍ　）ＩＩＳＨｉｎｄｌｌｌ切断５Ｐ６５ベクター［プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇ！Ｂｉｏｌｅｃｈ）　］　！：：連結された。

この配向（ＳＰ６Ｐロモーターに隣接のｃＤＮＡの５′末端を用いて）がｉｎマｉｌ＋ｏでのＲＮ人合成及びｉｎマｉｔ＋ｏでの蛋白質合成により変異蛋白質生成物の分析を可能にした。５Ｐ６５．　１ＰＡベクターも又、挿入されたｃＤＮＡ、例えば欠失生成の操作中に用いるあに便利なベクターであった。

ＬＫ４４４ＢｌｌＳ、ＩＰＡ第３図に関して、変異を起こしたｃＤＮＡ分子をＬＫ４４４ＢＩＩＳベクターに再クローン化した。制限酵素切断及びゲル濾過により得られた変異体誘導体５Ｐ５５．　（ＰＡからＢ！ｍ旧、ｆｌｉｎｄｌｌｌフラグメントを単離した。このフラグメントをＢｘｍＨＩ　、　）１ｉ力ｄ１１１切断ベクター、ＬＫ４４４８Ｈ３に連結した。

この変異体がヒトβ−アクチンプロモーターにより推進されたＣＯ３７セルライン中に　ＩＰ八へ似体の一時的発現を第５図に関して、５Ｐ６５．１Ｐ＾、変異誘導体から制限酵素切断及びゲル濾過によりＳ！１１フラグメントを単離した。

このフラグメントをＸｈｏ　Ｉ切断ベクターＣＬＨ３＾ＸＢＰＶに第５図に示されるように連結した。この配′向は、挿入された配列が０１２７細胞中でメタロチオニンプロモーターの推進力下であるように決定され選択された。

ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲｊＰＡ　ｃＤＮＡ又は変異体はＳｉｔ　Ｉで制限酵素消化され、切断されたＸｂｏ　１部位を用いてベクター中に再クローン化された。ＩＰＡ　ｃＤＮＡ又は変異体の配向は発現がメタロチオネインプロモーターにより推進されるようなものである。このＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲベクターはＣＨＯ細胞中でメタトレキセート増幅能を有する　ＩＰＡ又は修飾された　ｆＰへの安定な発現に用いられる。

ＣＯ８細胞のトランスフェクション発現ベク９−　（ＬＫ４４４ＢＩＩＳ）をＣＯ５−７細胞（ＡＴＣＣｊｃＲＬ］６５］）をトランスフェクションするのに用いる、一時的発現系が用いられた。

外来性ＤＮＡの導入後２乃至３日後、分泌された改変ＩＰＡＰ白質の活性を特徴づけるために、ならし培地を分析した。

３　Ｘ　１０’細胞を　ＩＯＣ陣プレート中ＤＭＥＭ　＋　１０％グルタミン中でトランスフェクションの前に１日間成育させた。

ＤＮＡｌ０乃至２０μｇをトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７，５）　２．０ｍｌに添加した。この溶液に２　ｍｇ／　ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（トランスフェクションの直前にＤＥＡＥ−デキストラン５０■士Ｔ　Ｂ　Ｓ　２５　ｍｌを添加して作成）１ｍｌを添加した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳＩで２回洗浄しトランスフェクション溶液を添加した。細胞を３７℃で１５乃至３０分間インキュベートした。次にデキストラン溶液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。この溶液をＤＭＥＭ培°地（無血清）ｌＯｍｌ及びクロロキン（ＩＯｍＭ）　１００μ！で置換した。

この細胞を３７℃で４時間インキュベートした。この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＧＩＴ無血清培地（ｌＱｍｌ）を供給した。

ＤＨＦＲ−ＣＩＯ細胞のトランスフェクションコロンビア大学のロウレンス・チェーシン（ＩｔｖｒｔｎｃｅＣｈａｓｉｎｌからＤＵＫＸ　Ｃｌｌ０細胞を得た。これらの細胞はジヒドロ葉酸レラクターゼが欠失している。この遺伝子はベクターＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲに存在する。細胞をトランスフェクションの前にアルファプラスメディア１０％ＦＢＳ　、　１％グルタミン培地で１００８プレート当たり７　Ｘ　１０’細胞の密度で２４時間培養した。０．５ｍ１）ランスフエクション緩衝液（その組成は、総量５００　ｍｌ当たりＮｔｅｌ　　４　ｇ、　ＫＣＩＱ、１８５　ｇＳＮｔ２　ＨＰＯ４［１，０５ｇｓデキストロース　０．５ｇ及びＨＥＰＥＳ　２．５　ｇＳｐｉｔ　７．５）　０．５　ｍｌ中プラスミドＩＩＮ＾１０Ｇ乃至５０μｇである。２ＭのＣＭＣＩ２　３０９　ｇを上記溶液に添加しその混合物を室温で４５分間平衡にした。その培地をプレートから除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＤＮＡ溶液をその細胞に添加した。その細胞を室温で２０分間インキュベートした。次に培地５　ｍｌを添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を３７℃で３．５分間トランスフェクション緩衝液中１５％のグリセロールでショックを与えた。４８時間後、細胞を１／３の割合に分け、メトトレキサー）０．０２μｍを含有する選択培地を供給した。処理にもかかわらず生存する細胞コロニーがトランスフェクション後１ｏ乃至１４日後出現した。

その後、選択したコロニーを増量のメトトレキサートで公知の方法［例えばミツシェル（Ｍｉｃｈ＊Ｉ）　らによるバイオ・テクノロジー（Ｂｉｏ／丁ｅｃｈｎｏｌｏＢ）第３巻、東５６１頁（１９８５年）］により増幅した。これらの細胞によって産生された改変ＩＰＡ蛋白質を前記の方法［ロウ（ＬＲｖ）らによるバイオ／テクノロジー、第５巻、第９５３頁（１９８７年）及びリンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）の米国特許第４、６５６．１３４号コにより精製した。

Ｃ１２７細胞のトランスフェクションマウスＣ１２７細胞をＤＮＡ標品で譲受人の研究室の研究者により発表された［シーング（Ｈｓｉｕｎｌ）らによるＪ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２巻、第４９７頁（１９８４年）］方法によりトランスフェクションを行った。

改変ＩＰＡ蛋白・質を先に記載した方法［ロウらによるバイオ／テクノロジー、第５巻、第９５３頁（１９８７年）コによりならし培地から精製した。

修飾ＩＰＡのアッセイならし培地中のｍ１ＰＡ蛋白質の定量をアメリカン・ダイアグツステイカ（＾ｍｅｉｃ１ｎ　Ｄｉ！ｇｎｏｓｌｉｃｇ）　　（米国、コネティカット州、グリニッジ）から販売されているエリザキットを用いて行った。被覆及び検知抗体はヤギ抗ヒトＩＰＡＩＩＧである。

活性を、プラスミノーゲン活性比に関する発表された分光測定法アッセイ［ベルハイジエン（Ｖｒｒｈｃｉｊｅ’ｎ）　ラニよるＴｂｒｏｍｂ、　Ｈｘｅｍｏｓ＋ｔｓ、、第４８巻、第２６６頁（１９８２年）］により測定した。アッセイで測定された吸収変化は、ＷＨＯ黒色腫ＩＰＡ基準を参照してユニットに変換された。

ｍｊＰＡ蛋白質の比活性を、蛋白質によるユニットに分けることにより決定し、後者がエリザアッセイにおいて測定されたものである。

本発明のｍｊＰＡは医薬的に許容できる担体物質、例えば生理食塩水と有利に組み合わせられ、経口投与、静脈投与又は心臓の病巣の動脈に注射することができる。投与は一般的に２つの一般に用いられている血餅溶解素酵素、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼで行われているように行われる。

本発明の５ｌＰＡは又、例えば手術後の患者、血餅を生じる最近心筋梗塞を患った患者及び深部静脈血栓を患っている患者のような塞栓症の治療を°必要とするヒト患者の血餅を溶解するために治療的に用いられる。

実施例１ポーラス（ｂａｌｍｓ）注入による血栓の緊急を要する治療のために凍結乾燥したｍ１ＰＡ５乃至１０　ｍｇを生理食塩水と混合し、注射器のチェンバーに入れ、ｍｊＰＡポーラスを患者に静注するのに用いた。

実施例２冠動脈血栓を急速に溶解するたの点滴治療のために、凍結乾燥したｍｆＰＡを約１ｏｏ■／時間、約１時間にわたって静脈に点滴した。その後に約５０■／時間の静脈点滴をさらに約３時間行った。

実施例３冠状動脈の血栓の急速溶解のための点滴治療のために点滴の前に生理食塩巾約１０■のポーラスを静注する他は実施例２のプロトコルに従って行った。

実施例４深部静脈血栓の徐々の溶解の点滴治療のために、生理食塩水に溶解させた、凍結乾燥したｍ１ＰＡを約１５ｍｇ／時間、約１２乃至２４時間にわたって静注点滴を行った。

当業者は、前記の量が単に代表的な物であり、選択した特定のｍｆＰＡの個々の特性に依存して変化するということを容易に認識するであろう。又、本発明の範囲から離脱することなく、本発明の範囲内の示唆に基づいて多くの改変が行われ得、特に限界がないのではないが本発明の＋ＮＰＡは　ｉｎマ自１０でのアッセイ及びｉｎマｉｙｏでの映像適用を含む診断目的に用いられ得ることは明らかである。

第１表ａａ　　　　Ｇ　　　Ｔ　　　ＩＪ　　　Ｓ　　　Ｔ　　　Ａ　　　Ｅ　　　Ｓ　　　Ｇ　　　Ａ　　　Ｅ　　　ＣＴ　　　Ｎ　　　Ｖ　　@Ｎ　　　Ｓ　　　Ｓ　　　Ａ　　　Ｌ　　　　−ａａ　　　Ｎ　　Ｙ　　Ｃ，ＲＮ　　Ｐ　　Ｄ　　ＲＤ　　Ｓ　　Ｋ　　１”Ｊ　　ＣＹ　　Ｖ　　Ｆ　　Ｋ　　Ａ　　Ｇ　　　 −ａａ　　　ＦＧ　　Ｎ　　Ｇ　　Ｓ　　Ａ　　Ｙ　　ＲＧ　　Ｔ　　ＨＳ　　Ｌ　　Ｔ　　Ｅ　　Ｓ　　Ｇ　　Ａ　　Ｓ　　Ｃ−ｃＴＣα；ＴＧＡＣＣＣＧＧＡＣＣＣＧＴｒＴＧＴＡＴＴＭＴＧＡＣにＧＣＣＴＴＡＧにＡＣｒＡＣＣαπＡＣＧにＴＴＣにＧＧａａ　　　ＯＡ　　Ｌ　　Ｇ　　Ｌ　　Ｇ　　Ｋ　　）Ｉ　　Ｎ　　Ｙ　　ＣＲＮ　　Ｐ　　Ｄ　　Ｇ　　Ｄ　　Ａ　　Ｋ　　Ｐ　　　−＾ＣＣＡＣＧＧ’ＴＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＡＣににＧＡＧ（：ＡＣＧａａ　　　Ａ　　Ｄ　　Ｉ　　Ａ　　Ｓ　　）Ｉ　　Ｐ　　ＩＪ　　Ｑ　　Ａ　　Ａ　　工Ｆ　　Ａ　　Ｋ　　ＨＲＲＳ　　Ｐ　　　−ａａ　　　Ｇ　　Ｅ　　ＲＦ　　Ｌ　　ＣＧ　　Ｇ　　Ｘ　　Ｌ　　Ｘ　　Ｓ　　Ｓ　　ＣＩＪ　　Ｘ　　Ｌ　　Ｓ　　Ａ　　Ａ　　　−ａａ　　　ＨＣＦ　　ＯＥ　　ＲＦ　　Ｐ　　Ｐ　　ＨＨＬ　　Ｔ　　Ｖ　　Ｉ　　Ｌ　　Ｇ　　ＲＴ　　Ｙ　　　−ａａ　　ＲＶ　　Ｖ　　Ｐ　　Ｇ　　Ｅ　　Ｅ　　Ｅ　　Ｑ　　Ｋ　　Ｆ　　Ｅ　　Ｖ　　Ｅ　　Ｋ　　−１Ｘ　　Ｖ　　ＨＫ　　−ａａ　　Ｅ　　Ｆ　　Ｄ　　Ｄ　　Ｄ　　Ｔ　　Ｙ　　Ｄ　　Ｎ　　Ｄ　　Ｉ　　Ａ　　Ｌ　　Ｌ　　Ｑ　　Ｌ　　Ｋ　　Ｓ　　Ｄ　　Ｓ　 @− ａａ　　Ｓ　　ＲＣＡ　　Ｑ　　Ｅ　　Ｓ　　Ｓ　　Ｖ　　Ｖ　　ＲＴ　　Ｖ　　ＣＬ　　Ｐ　　？　　Ａ　　Ｄ　　Ｌ　　−ａａ　　　　ＯＬ　　　Ｐ　　　Ｄ　　’Ｊ　　　Ｔ　　　Ｅ　　　ＣＥ　　　Ｌ　　　Ｓ　　　Ｇ　　　Ｙ　　　Ｇ　　　Ｋ　　　）ｌ　@　Ｅ　　　Ａ　　　Ｌ　　　Ｓ　　　　−ａａ　　Ｐ　　Ｆ　　Ｙ　　Ｓ　　Ｅ　　ＲＬ　　Ｋ　　Ｅ　　Ａ　　ＨＶ　　ＲＬ　　Ｙ　　Ｐ　　Ｓ　　Ｓ　　ＲＣ’　　−ａｍ　　　Ｔ　　　Ｓ　　　Ｑ　　　ＩＩＩ　　　Ｌ　　Ｌ　　Ｎ　　　ＲＴ　　Ｖ　　　Ｔ　　　Ｄ　　　Ｎ　　　Ｍ　　　Ｌ　　　ＣＡ@　　Ｇ　　　Ｄ　　　丁　　　− ａｍ　　　　Ｒ５（：（：ＦＯＡＬ−Ｌ　’１ｌ（）ＡＣＱＧＤＳ（：ＧＰ　　　　−ａａ　　Ｌ　　Ｖ　　ＣＬ　　Ｎ　　Ｄ　　Ｇ　　ＲＭ　　Ｔ　　Ｌ　　Ｖ　　Ｇ　　エ　エ　５ＶＧＬＧ　　−ａａ　　Ｃに　　Ｑ　　Ｋ　　Ｄ　　Ｖ　　Ｐ　　Ｇ　　Ｖ　　Ｙ　　Ｔ　　Ｋ　　Ｖ　　Ｔ　　Ｎ　　Ｙ　　Ｌ　　Ｄ　　Ｖ　　Ｚ　　−第２表プロペプチド／シグナル　　　　　　２２　ｔｏ　　１０８　　　−２９　ｔｏ　−１フインガードメイン　　　　　　　　１３３　ｔｏ　　２４６　　　　　９　ｔｏ　　４６成長因子ドメイン　　　　　　　　　２６８　ｔｏ　　３６７　　　　　５４　ｔｏ　　８７クリングル１トｌ　イン３９１　ｔｏ　　６３４　　　　９５　ｔｏ　１７６クリングル２　ドメイン　　　　　　６５５　ｔｏ　　９００　　　　１８３　ｔｏ’２６４第３表（飾文字１のない文字（例えば１））はすべてヌクレオチド配列に関するものであり、飾文字１をつけた文字（例えば１１））はすべてアミノ酸配列に関するものである）ｖ　　　Ｎｈ　　　　　　　ｌ巳ｌＩ鳳匣　　　　　　　　　■旦二丑徂Ｗシｄ　　　　　　　　　　幻ムニ且臣Ｗ没Ｌ　　　　　　　　　　Ｈ虹Ｕ」組Ｗ皿　　　　　　　　　ロｎｓｗ皿に１０７１６８１６９１７０１７１１７２　＋７３１７４１７５１７６広　　　　　　　　　　　双ＳヱＬル１Ｗシ州　　　　　　　　　　　　　　　・Ｔ−Ｎ２５９２６０２６１２６２２６３２６４２６５２６６２６７２６Ｂ　２６９２７０２７１α扛　　　　　　　　　　　　　　　　・　　　　・重　　鎖　　欠　　失Ｆ　Ｄｅｌ　　　　　　　　　　　　　ｄｅｌ（５−５１）Ｈ４ＴＲ５２ＨＮ４５１０Ｇ　Ｄｅｌ　　　　　　　　　　　　ｄｅｌ（５１−９２）；５０５９３；Ｎ４５１０ＦＧ　Ｄｅｌ　　　　　　　　　　　　ｄｅｌ（５−９２）Ｈ４ＴＳ９３：Ｎ４５１０−３　−：２　−１　１　　　　　　　　９３　９４　９５　９６Ｐｒｏｔｅａｓｅ　　　　　　　　　　　ｄｅｌ（２−２２６）；ＩＴＳ２６７ＨＮ４５１Ｑ江Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｄ　　　Ｔｏ−’Ｎ　　　　−Ｔ６６１　　　　　　　　　６７５４］２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６１６ｔ）　　　　Ｔ丁Ｔ、ＧＧＧ、ＡＡＴ、ＧＧに、にＣＴ　　　ＡＧＣ，ＴＡＣ，ＡＧＧ、ＧＧＣ−−−−−ＴＡＣ，ＡＧＣ，ＴＣＡ、ＧＣＴＡＧＧ、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＧＧ、ＧＡＧ１８５１８６１Ｅ１７１８８１８９　１０２１０３１０４１０５　　　　　１６６１６７１６Ｅｌ　１６９ａｒｇ　ｌｅｕ　ｔｈｒ　ｔｒｐ　ｇ＋ｕ瓜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−Ｎ　　　−ｕ　）　　　ＧＡＣ，ＣＡＧ、ＧＧＣ，ＡＣＴ　　ＡＧＣ，ＴＡＣ，ＣＧＴ、ＧＧＣ−−−ＣＴＧ、ＡＡＧ、ＡＡＣ，ＣＣ下ＡＣＧ、ＴＧＣ，ＡＧＣ，ＡＣＣ，ＣＣＴ、ＧＣＣｓｅｒ　ａｙｓ　ｓｅｒ　ｔｈｒ　ｐｒｏ　ａｌａ！４表変異体２ＦＹＤＮＤＩＡＬＬＱＬＫ５ＤＳＳＲＣＡＱＥＳＳＷＲＴＶＣＬＰＰＡＤＬＱＬＰりＷＴＥＣＥＬＳＧＹＧにＨεＡＬＳＰＦＹＳＥｌ’ｌＬＫ■`ＨＢＲＬＹＰ第５表変異体２ＣＩＬ色変異体：　２ＦＧＡＮＬＨＣＩＡＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＬＮＤＧＲ）４ＴＬＶＧＩＩＳＷＧＬＧＣＧＱＫＤＶＰＧＶＹＴＫＶＴＮＹＬＯＷＩＲＤＮＭＲＰ１７表変異体２に１１に２ＭＴＬＶＧＩＩＳＷＧＬＧＣＧＱＫＤＶＰＧＶＹＴＫＶＴＮＹＬＤＷＩＲＤＮＭＲＰ第８表変異体ｌＫ１２に２第９表変異体２に１２に２第１０表ＧＡＲＳＹＱＶＩ　ＣＲＤ　ＥＫＴＱＨＩ　ＹＱＱＨＱＳＨＬ　Ｉ’ｌＰＶ　ＬＲ５Ｎ　Ｉｌｌ　ＶＥＹＣＨＣＮ　５ＧＲＡＱＣ）ｌ　５ＶoＶ）ｌ：ＳＣ５Ｅ　ＰＲＣＦＮ　ＧＧＴＣＱＱＡ　Ｌ　ＹＦＳＤＦＶＣＱＣＰＥＧＦＡＧＫＣＣＥＩ　ＤＴＲＡＴＣＹＥＤＯＧＩ　５ＹＲＧＴＷＳＴＡＥＳＧＡＥＣＴＮＩ−ＩＮＳＳＡＬＡＯｋ：ＰxＳＧＲＲＰＤＡＩ　ＲＬＧＱＦＲＩにＧＧＬＦＡＤＩＡＳＨＰ）ＩＱＡＡＩ　ＦＡＫＨＲＲ５ＰＧＥＲＦＬＣＧＧＩ　ＬＩ　５ＳＣＨＩ　ＬＳＡＡ）ＩｃＦＱＥＲＦＰoＨＨＬＴＶＩ　ＬＧＲＴＹＲＷＰＧＥ　Ｅ　ＥＱＫＦ　ＥＶＥＫＹＩ　ＶＨＫＥＦＤＤＤＴＹＤＮ　Ｄ　ＩＡ　ＬＬＱＬＫＳＤＳ　Ｓ　ＲＣＡＯＥＳ　ＳＷＲＴＶＣＬＰoＡＤ　ＬＱＬＰＤＷＴ　ＥＣＥ　ＬＳＧＹＧ）ＣＨＥＡ　ＬＳ　Ｐ　ＦＹＳ　ＥＲＬＫＥＡＨＢ　ＲＬＹＰＳ　Ｓ　ＲＣＴＳＱＨＬＬＮ　ＲＴＶＴＤＮＭＬＣＡＧＤＴＲ５ＧＧＰpＡＮ　ＬＨＯＡＣＱＧＤＳＧＧＰ　ＬＶＣＬＮＤＧＲＭＴＬＶＧＩ　Ｉ　５１４ＧＬＧＣＣＱＫＤＶＰＧＶＹＴＫＶＴＮＹＬＤＷＩ　ＲＤＮＭＲＰ第１１表ＧへＲＳＹＱＶＩＣＲＤＥに丁ＱＭＩＹＱＱＨＱＳ）ＩＬＲＰＶＬＲ５ＮＲＶＥＹＣＷＣＮＳＧＲＡＯＣ）ＩＳＶＰＶＫＳＣ５ＥＰＲＣＦＮfにＴＣＱＯＡＬＹＦ　Ｓ　ＤＦＶＣＱＣＰ　ＥＧ　ＦＡＧ）ＣＣＣＥ　Ｉ　ＤＴＲＡＴＣＹＥＤＱＧＴＳＹＲＧＴＨＳ　ＬＴＥＳ　ＧＡＳ　ＣＬＰＷＮＳＭ　h　ＬＩ　ＧＫＶＹＴＡＱＮ　Ｐ　ＳＡＯＡＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮＰＤＧＤＡＫＰＨＣＨＶＬＫＮＰＳＣＳＴＰＡＣＳＥＧＮＳＤＣＹＦＧＮＧＳＡＹＲＧＴＨ５ＬＴＥＳＧＡＳＣＬＰＷＮrＭＩＬＩＧＫＶＹＴＡＱＮＰＳＡＱＡＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮ　ＰＤＧＤＡＫＰＷＣＨＶＬＫＮ　ＲＲＬＴｈｌ　ＥＹＣＤＶＰＳ　Ｃ３ＴＣＧＬＲＯＹＳnＰＱＦＲＩ　ＫＧＧＬ　ＦＡＤＩＡＳ）ＩＰＷＱＡＡＩ　ＦＡＫＨＲＲＳＰＧＥＲＦＬＣＧＧＩ　ＬＩ　５ＳＯＩＩ　ＬＳＡＡＨＣＦＱＥＲＦＰＰＨＨＬＴＶｒ　ＬＧＲsＹＲＷＰＧＥ　Ｅ　ＥＱＫＦＥＶＥＫＹＩ　Ｖｌ（ＫＥ　ＦＤＣＩＤＴＹＤＮ　Ｄ　Ｉ　Ａ　ＬＬＱＬＫＳＤＳ　Ｓ　Ｉ’１ＣＡＯＥ　Ｓ　５ＷＲＴＶＣＬＰ　ＰＡＤ　kＯＬＰＤＩ−ＩＴＥＣεＬＳＧＹＧＫＨＥＡＬＳＰＦＹＳ　ＥＲＬＫＥＡ）ｌ　ＢＲＬＹＰＳ　５ＲＣＴＳＱ）ｌ　ＬＬＮ　ＲＴＶＴＤＮＭ　ＬＣＡＧＤＴＲＳ　ＧにＰＱＡＮ　ＬＨＤＡＣＱfＤＳＧＧＰ　ＬＶＣＬＮＤＧＲＭＴ　ＬＶＧＩ　Ｉ蛋ＧＬＧＣＧＱＫＤＶＰＧ’ＶＹＴＫＶＴＮＹＬＤＨＩＲＤＮＭＩ’ＩＰ第１２表（、ＡＲ５ＹＱＶＺ　ＣＩＩＩＤＥＫＴＱＭＩＹＱＱＨＱＳＷＬＲＰＶＬＲ５Ｎ　ＲＶＥＹＣＷＣＮ　５ＧＲＡＱＣＨ５ＶＰＶＫＳ　Ｃ５Ｅo　ＩＩＩＣＦＮ　ＧＧＴＣＱＱＡ　ＬＹＦＳＤＦＶＣＱＣＰＥＧ　ＦＡＧＫＣＣＥ　Ｉ　ＤＴＲＡＴＣＹ　ＥＤＱＧ　Ｉ　５ＹＲＧＴＨ５ＴＡ　ＥＳ　ＧＡ　ＥＣＴＮＷＮ　Ｓ　Ｓ`　ＬＡＱＫＰＹＳＧＲＲＰＤＡ　Ｉ　ＲＬＧＷＳ丁ＡＥＳＧＡＥＣＴＮＷＮＳＳＡＬＡＱＫＰＹＳＧＲＲＰＤＡＩＩ’１Ｌ（ｆＧＮ）ＩＮＹｃＲＮＰＤＲＤＳＫＰＷＣＹＶＦＫＡＧＫＹrＳＥＦＣ５ＴＰＡＣ５ＥＧＮＳＤＣＹＦＧＮＧＳＡＹＲＩＩ；ＴＨ５ＬＴＥＳＣＡＳＣＬＰＨＮＳＭＩ　ＬＩ　ＧＫＶＹＴＡＱＮ　ＰＳＡＱＡＬＧＬＧＫＨＮＹbＲＮＰＤＧＤＡＫＰ１４ＣＨＶＬＫＮ　ＲＲＬＴ只ＥＹＣＤＶＰＳＣ５ＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦ　ＲＩ　ＫＧＧＬＦＡＤＩ　ＡＳＨＰＨＱＭ　ｒ　ＦＡＫＨＲＲ５Ｐf　ＥＲＦ　ＬＣにＧ　Ｉ　ＬＩ　５ＳＣ）ＩＩ　ＬＳＡＡＨＣＦＱＥＲＦＰ　ＰＨＨＬＴＶＩ　ＬＧＲＴＹＲＷＰＧＥ　Ｅ　ＥＱＫＦ　ＥＶＥＫＹＩ　ＶＨＫＥ　ＦＤＤＤＴＹcＮ　Ｄ　ＩＡ　ＬＬＱＬＫＳ　Ｏ５Ｓ　ＲＣＡＯＥＳ　５ＷＲＴＶＣＬＰＰＡＤＬＱＬＰＤ１４ＴＥＣＥＬＳＧＹＧＫＨＥＡ　ＬＳ　Ｐ　ＦＹＳ　ＥＲＬＫＥＡＩ（ＳＲＬＹＰＳＳ　qＣＴＳＱＨＬ　ＬＮ　ＲＴＶＴＤ二匹１１表変異体ＯＨ５第１４表変異体２　Ｐｒｏｔ　１ＣＶ第１Ｓ表変異体２　Ｐｒｏｔ　２　ＣＶＧＧＬＦＡＤＩＡＳ）ｌＰＩＩＩＱＡＡＩＦＡＫ）ｌＲＲ５ＰＧＥＲＦＬＣＧにＩＬｍＳ５ｏ４１ＬＳＭＨＣＦＱＥＲＦＰＰＨＨＬＴＶｒＬfＲＴＹＲＷＰＧＥ第目表ＧＡＲＳＴＳＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲＩＫＧＧＬＦＡＤＩＡＳＨＰ殿ＡＡＩＦＡＫ）ＩＲＲ５ＰＧＥＲＦＬｃＧＩＩＩ；ＩＬＩＳＳＣ１４PＬＳＡＡＨＣＦＱＥＲ第１７表（ｍＩＵ／ｕｇ）ＭＳｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０ＫＮ　１“ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４８５ＫＣＩ“　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５８４ＫＣＡＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５１７ＫＮＢ２“　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４１８ＫＣ２７４５ＫＣＡ２”　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−６１７Ｎｄｅｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｖ、１゜に１ｄｅｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０に２ｃｌｅ　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４００ＫＩＫ２ｄｅｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｖ、１゜２に１．　ＩＫ２”　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０１ＫＩ、　２に２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０２に１．２に２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｖ、１゜ｖ、　　１．は非常に低い活性を表わし、＊は最も好ましい分子を表わすＦｉｇｕｒｅ　１Ｆｉｇｕｒｅ　２Ｆｉｇｕｒｅ　３−　　ＣＯＳ細胞に対する発現ベクター（括弧内の番号はヌクレオチド塩基の位置である）Ｆｉｇｕｒｅ４　＜モＦｉｇｕｒｅ　５０コニ重複領域Ｆｉｇｕｒｅ　７ａ−１ＵＬＴ再配列変異体の生成Ｆｉｇｕｒｅ　７ａ−２Ｆｉｇｕｒｅ　７ｂ−１Ｆｉｇｕｒｅ　７ｂ−２Ｆｉｇｕｒｅ　７ｂ−２Ｆｉｇｕｒｅ　７ｂ−２Ｆｉｇｕｒｅ　７ｂ−ｉ　カラＦ１ｇ”ｅ７ｂ−’力）らａｇＮ−１２ｃｃａ−１国際調査報告ｂｕ＊、、＋ｎ＋〜、１゜ユ、。１１０．ｌａ、　　ＰＣＴ／ＵＳ　　！！９１００４６５国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１　組織プラスミノーゲン活性化因子（ＩＰＡ）に関して生物的活性を有する分子をコードする改変されたＤＮＡ配列を産生する方法であり、前記配列が、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限酵素を用いることによってデオキシリボ核酸の予想できる再配列又は欠失に適合し、ａ）ＩＰＡ生物的活性を有する分子をコードし、変換される配列を与える工程及びｂ）ＡｖｒＩＩ、ＮｂｅＩ、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩから成る群から選ばれる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより切断を受ける制限エンドヌクレアーゼ部位を生じるための少なくとも２つの先在する制限部位で前記配列を変換する工程を含む方法。２　請求項１に記載の方法により産生されたＤＮＡ配列。３　請求項２に記載ののＤＮＡ配列を含む配列により形質転換された又はトランスフェクションされた親細胞。４　前記部位の１つが変換されて、ＡｖｒＩＩ、ＮｂｅＩ、ＳＰｅＩ及びＸｂａＩから成る群から選ばれる酵素に対する切断部位を生じせ、前記の少なくとも２つの部位の第２の部位を変換し、前記酵素群の残りの酵素から選ばれる酵素の切断部位を生じさせる、請求項１に記載の方法。５　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。６　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。７　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。８　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。９　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１０　【配列があります】を含むＤＨＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１１　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１２　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１３　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１４　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１５　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１６　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１７　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１８　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。１９　【配列があります】を含むＤＮＡ配及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２０　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２１　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２２　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２３　【配列があります】含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２４　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２５　【配列があります】を含むＤＮＡ配列及び厳格な条件下で前記配列にハイブリド形成するすべての配列。２６　位置４５１でアスパラギンの代わりにグルタミンによる置換をさらに含む請求項５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載のＤＮＡ配列。２７　請求項５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５に記載の配列を含む配列により形質転換された又はトランスフェクションされた親細胞。２８　請求項２６に記載の配列を含む配列により形質転換された又はトランスフェクションされた親細胞。２９　前記親細胞がＣ１２７である請求項２７に記載の親細胞。３０　前記親細胞がＣ１２７である請求項２８に記載の親細胞。３１　請求項２７に記載の親細胞により産生される分子。３２　請求項２８に記載の親細胞により産生される分子。３３　請求項２９に記載の親細胞により産生される分子。３４　請求項３０に記載の親細胞により産生される分子。