JPH07501213A

JPH07501213A - マラリア原虫由来のＣＳおよびＨＢｓＡＧ間のハイブリッド蛋白質

Info

Publication number: JPH07501213A
Application number: JP5508957A
Authority: JP
Inventors: ド・ウィルド，ミッシェル; コーエン，ジョゼフ
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）
Priority date: 1991-11-16
Filing date: 1992-11-11
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2022-08-08
Also published as: NZ245114A; PT101052B; KR100251505B1; HK1012405A1; CA2123612C; AU1471797A; CA2123612A1; DE69228698T2; AU712409B2; EP0614465A1; DE69228698D1; GR3029717T3; SG48390A1; JP2007209343A; JP3954643B2; ATE177755T1; EP0614465B1; PT101052A; WO1993010152A1; AU2927892A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マラリア原虫由来のＣ８およびＨＢｓＡＧ間のハイブリッド蛋白質本発明はハイブリッド蛋白質、その医薬における使用、特にマラリア感染症の予防における使用、およびこれを含有するワクチンに関する。

マラリアは、世界の主要な衛生問題のうちの一つであり、毎年２〜４百万人の人がこの病気でなくなっている。この病気の最も急性の形態は、原虫寄生体、熱帯熱マラリア原虫（ＰｌａｓｍｏｄｉｕＩｌｆａｌｃｉｐａｒｕｌｍ）によっておこり、マラリアによる死亡のほとんどはこれが原因である。

熱帯熱マラリア原虫の生活環は複雑で、完結するためにはヒトおよび蚊の２種の宿主を必要とする。人の感染は感染した蚊の唾液中のスポロゾイトの接種により始まる。スポロゾイトは肝臓に移動し、そこで肝細胞を感染させ、赤血球性細胞内段階を経てメロゾイト段階に分化し、赤血球（ＲＢ　Ｃ）に感染して、無性血液段階の周期的複製を開始する。サイクルは、ＲＢＣ中の多数のメロゾイトが有性段階ガメトサイトに分化し、これが蚊により摂取され、中部栄養管の一連の段階を経て発達し、スポロゾイトを産生じ、これが唾液腺に移動することにより完了する。

熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト段階はマラリアワクチンの有効な目標である。スポロゾイトの主要な表面蛋白質は、サーカムスポロゾイト蛋白質（Ｃ３蛋白質）として知られる。この７Ｇ８株由来の蛋白質はクローンし、発現し、配列決定されている［ダーム（Ｄａｍｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２５　（１９８４）ｐ５９３）］。７Ｇ８株由来の蛋白質は、３７回繰り返す４ペプチドＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを含む中央免疫優性繰り返し領域に４個の副繰り返し配列Ａｓｎ−Ｖａ　Ｉ−Ａｓｐ−Ｐｒｏが散在していることを特徴とする。他の菌株においては、主および副繰り返し配列の数およびその相対的位置が変わる。Ｃ８蛋白質の繰り返しのない部分として示される非繰り返しアミノ酸配列からなるＮおよびＣ末端部分がこの中心部分に隣接している。

照射し７こスポロゾイトは、実験的なヒトマラリアに対して著しい保護作用を与える（アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディスン・アンド・ハイジエン（＾ｍ、Ｊ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、［Ｉｙｇ、）　２４＋２９７　４０２．　１９７５）、　しかし、生産が困難なため、照射したスポロゾイトは、ワクチン製造の点から実用的ではない。

サーカムスポロゾイト蛋白質ベースのサブユニットワクチンが提案されている。

これらのうち２種のワクチンは臨床試験が行われている。１つは合成ペプチドで、もう１つは組み換え蛋白質である［バロウ（ｌｌａｌｌｏｕ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）：ｉ　１２７７　（１９８７）およびヘリントン（Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２８：２５７　（１９８７）］。

これらのワクチンは抗スポロゾイト応答を刺激するのに成功している。しかし、応答の大きさは期待はずれで、応答を全く起こさないワクチンもある。更に、その後の注射に関して抗体レベルの「増加」がなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏリンパ球増殖検定の結果から、これらの被験者のＴ細胞のほとんどは、優性繰り返し配列を認識しないことがわかった。それでも、各研究のワクチンは寄生虫血症を発現しなかった。

本発明は、体液性応答だけでなく細胞性免疫応答も産生ずる、マラリアワクチンにおいて使用する新規な改良された抗原を提供する。好ましくは、抗原は免疫優性繰り返し配列に対する中和抗体の産生を誘起する。最も好ましくは、抗原は、ＣＤ４”およびＣＤ８”″細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）型および遅延型過敏性エフェクターＴ細胞媒介免疫応答を誘起し、好ましくはＴヘルパー（ＴＨ）記憶細胞も誘起できるものである。

従って、本発明は、Ｃ８蛋白質の実質的に全てのＣ末端部分、免疫優性領域の４以上のタンデム繰り返し配列、およびＢ型肝炎ウィルス由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むハイブリッド蛋白質を提供する。好ましくは、該ハイブリッド蛋白質は、Ｃ８蛋白質のＣ末端部分と実質的に同じである最低１６０個のアミノ酸を含む配列を含む。Ｃ８蛋白質はＣ末端から最後の１２個のアミノ酸を除いたものであってもよい。

特に、ＨＢｓＡｇのＮ末端と直線的リンカ−によりフレーム中に融合された熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８のアミノ酸２１０〜３９８に実質的に対応する熱帯熱マラリア原虫のＣ８蛋白質の一部を含む蛋白質が提供される。該リンカ−はＨＢｓＡｇ由来のｐｒｅＳ２の一部を含んでもよい。

本発明は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ配列も提供する。

特に好ましい具体例は、ＲＴＳで表わされるハイブリッド蛋白質である。

ＲＴＳのアミノ酸配列を第５図に示す。このハイブリッド蛋白質は、サツカロミセス・セレビシェＴＤＨ３遺伝子配列由来のヌクレオチド１０５９〜１０６１によりコードされるメチオニン残基［ムスティ・エイ・エム（Ｍｕｓｔｉ＾３Ｍ、）ら、ジン（Ｇｅｎｅ）１９８３　２５　１３３　１４３］　；ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング法により得られるヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）由来の３個のアミノ酸：ＭｅｔＡｌａ　Ｐｒｏ：熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株のサーカムスボロゾイト蛋白質（Ｃ８Ｐ）のアミノ酸２１０〜３９８に相当するヌクレオチド１０７１〜１６３７によりコードされる１８９個のアミノ酸（Ｄａｍｅら、前出）。

ハイブリッド遺伝子を構築するために用いられるクローニング法により得られるヌクレオチド１６３８〜１６４０によりコードされるアミノ酸（Ａｒｇ）；ヌクレオチド１６４１〜１６５２によりコードされ、Ｂ型肝炎ウィルス（ａｄｗ血清型）のｐｒｅＳ２蛋白質（９）の４個のカルボキン末端残基に相当する４個のアミノ酸、Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ；ヌクレオチド１６５３〜２３３０によりコードされ、Ｂ型肝炎ウィルス（ａｄｗ血清型）のＳ蛋白質を特定する２２６個のアミノ酸を含む。

別の具体例において、熱帯熱マラリア原虫ＮＦ３４　（モレキュラー・アンド・バイオケミカル・バラサイトロノー（Ｍｏ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ）　、３５　：１８５−１９０．１９８９）由来のＣ８Ｐ遺伝子配列を用いて産生され、熱帯熱マラリア原虫ＮＦ３４由来のＣ８蛋白質の２０７〜３９５領域の実質的に全部を含むＲ７３本で表わされるハイブリッド蛋白質が提供される。

特に、Ｒ７３本は以下のものを含む：ＴＤＨ３遺伝子配列由来のヌクレオチド１０５９〜１０６１によりコードされるメチオニン；ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング法によりえられるヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）由来の３個のアミノ酸：ＭｅｔＡｌａ　Ｐｒｏ；熱帯熱マラリア原虫ＮＦ３４株のサーカムスポロゾイト蛋白質（ＣＳ　Ｐ）のアミノ酸２０７〜３９５に相当するヌクレオチド１０７１〜１６３７によりコードされる１８９個のアミノ酸鎖（モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー、３５：１８５−１９０．１９８９）；ハイブリッド遺伝子を構築するために用いられるクローニング法によりえられるヌクレオチド１６３８〜１６４０によりコードされるアミノ酸（Ｇａｙ）：ヌクレオチド１６４１〜１６５２によりフードされ、Ｂ型肝炎ウィルス（ａｄｗ血清型）ｐｒｅＳ２蛋白質の４個のカルボキシ末端残基に相当する４個のアミノ酸、Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　（ネイチ＋−２８０：８１５−８１９．１９７９）：ヌクレオチド１６５３〜２３３０によりコードされ、Ｂ型肝炎ウィルス（ａｄｗ血清型）のＳ蛋白質を特定する２２６個のアミノ酸鎖（ネイチャー　２８０：８１５−８１９．１９７９）。

Ｒ７３本のアミノ酸配列を第９図に示す。

Ｒ７３本を含有する発現カセットを構築し、これは以下の様な特性を有する：ニス・セレビシェＴＤＨ３遺伝子由来のヌクレオチド１から１０５８まで伸びるプロモーター配列：ヌクレオチド１０５９から始まり、ヌクレオチド２３３０まで伸びるオーブンリーディングフレーム。このオーブンリーディングフレームは、そのすぐ後に翻訳終止コドンＴＡＡ　（ヌクレオチド２３３１〜２３３３）が続く。該オーブンリーディングフレームは、ハイブリッドＲＴＳ＊蛋白質を特定するアミノ酸をコードする。

ニス・セレビシェＡＲＧ３遺伝子由来の塩基対２３３４から３５０４まで伸びる配列中に含まれる転写終止配列。

ヌクレオチド配列を第１０図に示す。

本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、好ましい具体例においては、好ましくは酵母遺伝子由来の転写調節エレメントに隣接し、発現ベクター中に含まれる。

このようなベクターは本発明の別の態様である。好ましいプロモーターは、ニス・セレビシェＴＤＨ３遺伝子由来のプロモーターである（ムスティら、前出）。

本発明はまた、本発明にかかるベクターで形質転換された宿主細胞に関する。

宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよいが、好ましくは、ニス・セレビシェなどの酵母である。このような宿主においては、ハイブリッド蛋白質、例えばＲＴＳは、リポタンパク質粒子として発現される。選択された受容体酵母株は好ましくはすでにそのゲノム中にいくつかの組み込まれたＢ型肝炎Ｓ発現カセットのコピーを有する。得られた株は２種のポリペプチド、ＳおよびＲＴＳ　（または他の本発明のハイブリッド蛋白質）を合成し、リポタンパク質粒子の混合物（たとえば、ＲＴＳ、ＳまたはＲ７３本、Ｓ）中に自発的にコアセンプルされる。

これらの粒子はその表面でハイブリッドのＣ３Ｐ配列を示すのが有利である。これらの混合粒子もまた、本発明に含まれる。有利には、これらの混合粒子中のＲＴＳ　：　ＳまたはＲＴＳ＊：Ｓの比率は１４である。

本発明はまた、適当な希釈剤または担体との混合物中に免疫保護量の本発明の蛋白質または粒子を含むワクチンに関する。

本発明のワクチンにおいて、ハイブリッドの水溶液を直接用いてもよい。あるいは、あらかじめ凍結乾燥した、あるいはしていない蛋白質を公知のアジュバントと混合または吸収させてもよく、このようなアジュバントとしてはミョウバン、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌ　Ａなどのサポニンが挙げられるが、これに限定されるわけではない。

免疫促進物質も選択的にまたは追加的に含まれる。この免疫促進物質の好ましい具体例は、３脱アシル化モノホスホリルリピツドＡ　（３Ｄ−ＭＰＬ）である。

３脱アシル化モノホスホリルリピツドＡはアメリカ合衆国特許第４９１２０９４号およびイギリス特許出願第２２２０２１１号（リビ（Ｒｉｂｉ）　）から公知であり、米国、モンタナ州、ルビ・イムノケム（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）から入手可能である。

本発明の蛋白質もこのようなリポソームの微粒子中に封入されてもよい。

ワクチン調製物は、ニュー・トレンズ・アンド・デベロプメンツ・イン・バクンンズ（Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ポーラ−（Ｖｏｌｌｅｒ）ら編。

ユニバーンティ・パーク・プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ）　、ボルチモ乙　メリーランド州、米国、１９７８）に記載されている。リポソーム中の封入は、例えばフユタートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）　（アメリカ合州国特許第４２３５８７７号）により記載されている。

通常のアジュバントを用いてもよいが、好ましい免疫促進物質は３脱アシル化モノホスホリルリピツドＡ　（３Ｄ−ＭＰＬ）である。

典型的には、３Ｄ−ＭＰＬを用いた場合、抗原および３Ｄ−ＭＰＬはミョウバンを加えるかまたは水中油型乳剤中に処方される。３Ｄ−ＭＰＬはエフェクターＴ細胞応答の刺激物質であるのでこれを混ぜるのが有利である。

従って本発明の好ましい具体例は、本明細書中に記載したように、３Ｄ−ＭＰＬおよび担体と組み合わせたハイブリッド蛋白質、好ましくはＲＴＳまたはＲＴＳ＊を含むワクチンを提供する。典型的には、担体は水中油型乳剤またはミョウバンである。

最も好ましい具体例においては、ハイブリッド蛋白質は本明細書において記載したような粒子または混合粒子である。

各ワクチン用量中の本発明の蛋白質の量は典型的ワクチン中著しい副作用を起こさずに免疫保護応答を誘起できる量に選択される。このような量は、用いた特定の免疫原およびワクチンがアジュバントを含むかどうかにより変わる。一般的に、各用量は１〜１０００μｇ、好ましくは１〜２００μｇ１最も好ましくは１０〜１００μｇの蛋白質を含む。特定のワクチンについて最適な量は、抗体価の観察および他の患者における他の応答を含めた標準的研究により決定できる。初回接種の後、患者は好ましくは約４週間で追加免疫を受け、その後感染の危険がある間は６力月ごとに繰り返し追加免疫を行う。本発明の蛋白質に対する免疫応答はアジュバントおよびまたは免疫促進物質の使用により向上する。

本発明の蛋白質は好ましくは酵母、特にサツカロミセス属に属する酵母中に発現される。

本発明の別の態様は、本発明のハイブリッド蛋白質の調製法を提供することであり、該方法は、該蛋白質をコードするＤＮＡ配列を適当な宿主、好ましくは酵母中で発現し、生成物を回収することからなる。

本発明の蛋白質をサツカロミセス株中で発現することが特に好ましい。ＲＴＳを例えばこのような菌株中で発現した場合、これは自発的にマルチマーリポタンパク質粒子中で集合する。

これらの粒子は免疫原性が高く、強い体液性応答ならびに免疫学的記憶を誘起し、またＣＴＬおよびＤＴＨ型のエフェクターＴ細胞を誘起することができる。

本発明の更に別の態様は、既に記載したように有効量のワクチンを投与することによるマラリア原虫感染症にかかっている患者の治療法である。

ＳおよびＲＴＳポリペプチドの両方を含有する粒子の産生に用いるニス・セレビンエＲＩＴ４３Ｂ３株は、各蛋白質に対して別の発現力セントを有する。Ｓ遺伝子発現カセットは定住Ｔｙレトロトランスポンソンズと相同な直線状組み込みベクターを用いてゲノム中の最低２個の部位で５〜６個のコピー中に組み込まれる。ＲＴＳ遺伝子発現カセットは、Ｓ遺伝子カセットの組み込みに用いたものと同様の直線状組み込みベクターを用いてゲノム中の１または２個の部位で２〜３個のコピー中に組み込まれる。両タイプのカセットからの発現は、酵母ＴＤＨ３遺伝子由来のプロモーターにより行われる。

のと同じであり、１０５８ｂｐのＴＤＨ３プロモーターフラグメント、６８１ｂｐのＳ遺伝子配列、６ｂｐのＥｃｏＲ１リンカ−を含むスペーサーおよびＡｒｇ３転写ターミネータ−を有する１１６５ｂｐのフラグメントからなる。Ｓコーディング配列は、ａｄｗ血清型のウィルスの完全ゲノムクローン（ｐＲＩＴ１０６１６）からのサブクローニングにより得られる。

Ｓ発現カセットの酵母ゲノム中への組み込みに用いられるＴｙベクター、ｐＲＩＴ１３０３４の構造を第２図に示す。このタイプの酵母ゲノム中の発現カセットの組み込み用ベクターの構造および使用は、ジェイコブズ（Ｊａｃｏｂｓ）ら（２）に記載されている。ｐＲＩＴ１３０３４はＳ遺伝子カセット、ＵＲＡ３遺伝子およびｐＵＣＱ上にクローンされたＴｙエレメントのコピー中に挿入されたＣＵＰｌ遺伝子を含有する。ＵＲＡ３遺伝子およびＣＵＰＩ遺伝子は両方とも形質転換された酵母コロニーを、形質転換されていないコロニーがら区別する選択マーカーを提供する。ｐＵＣ９は、ビエイラ＆メッシング（Ｖｉｅｉｒａ　＆　ｌｌｅｓｓｉｎｇ）　（３）に記載されており、ＵＲＡ３フラグメントはｐＦＬ４４由来であり［エフ、ラフロート（Ｆ、　Ｌａｃｒｏｕｔｅ）、ＣＮＲ３，ストラスプール］、ｃＵＰ１フラグメントはｐＣＵＰ５由来であり（ティー・プツト（Ｔ、Ｂｕｔｔ、）　ＳＫＦ　Ｌａｂｓ、フィラデルフィア）、　Ｔｙエレメントはジュニアウス（Ｊｕｎｉａｕｘ）ら（４）がらのものであり、Ｓ遺伝子カセットはｐＲＩＴ１２３５３由来である。ｐＲＩＴ１３０３４のＸｈｏＩエンドヌクレアーゼを用いた消化により、第３図に示す８５００ｂｐの直線状フラグメントが遊離し、これを定住ＴＶエレメントと遊離末端の相同な組み換えによりゲノム中に組み込むことができる。

受容体株ＥＪ　ｃｕｐｌＤ−３６（ｔｒｐｌ、］　ｅｕ２、Ｕｒａ３、ｃｕｐｌ、ｇａ　Ｉ　ＩＤ、ＭＡＴａ）をｐＲＩＴ１３０３４由来の直線状ベクターフラグメントの形質転換による一次導入に用いた。この株は１個の破砕された遺伝子座ｃｕｐｌ、ｃｕｐｌを含む。

直線状Ｘｈｏｌフラグメントで形質転換した後、Ｕｒａ”コロニーを単離し、銅耐性に関してスクリーンする。サザンブロッティング分析で測定すると、より耐性の強い形質転換体が２〜５個のベクターのコピーを組み込んでいた。２個の形質転換体コロニーのコピー、推定３〜４個のコピーを有するＭＳ９および４〜５ｍの組み込み直線ベクターのコピーを有するＭＳ２３が保持されている６Ｍ５２３株を次１：ＥＪ　ｃｕｐｌＤ−７ｂ株（ｔｒｐｌ、Ｕｒａ３、ｃｕｐｌ、ｇａｌｌＤ、ＭＡＴａ）と交雑させ、ハブロイド有子嚢胞子を回収してＭＳ２３−２ａを得る。

この菌株を次にＭＳ９と戻し交雑すると得られたＬｅｕ＼Ｔｒｐ−ハブロイド分離体（ＭＳ５４−２ｃ）は５〜６個の組み込まれた発現カセットを含む。サザンブロッティングによると、ＭＳ５４−２Ｃは１遺伝子座に４〜５個の組み込みベクターのタンデムコピーを有し、更に別の遺伝子座に組み込まれた１個のコピーを有する。発現力セントの５〜６個のコピー全てはカセットフラグメントを遊離するための全酵母細胞ＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌエンドヌクレアーゼでの消化を受けず、Ｓ遺伝子特異性プローブを用いたサザンブロッティングにより予想される３ｋｂのバンドが得られる。この菌株の自発的Ｔｒｐ”復帰変異体、ＭＳ５４− ２ｃｍＴが得られる。実験室受入番号Ｙ１２９５゜実施例３　ＲＴＳ発現カセットの構築ＲＴＳハイブリッド蛋白質の発現力セントを、多段階のクローニング法により構築し、イー・コリ酵母シャトルベクターＹｅｐ１３（６）中にクローンして、プラスミドＹ、ｅ　ｐ１３ＲＴＳ　（第４図）を得る。カセットの構造を第１Ｂ図に示す。全ヌクレオチド配列を直接配列決定（コーディング配列および非翻訳調節配列の一部に関して）または関連する文献を参考にして（プロモーターおよびターミネータ−配列の一部に関して）決定した。ＤＮＡ配列を第５図に示す。これは以下の要素を含有する。

ニス・セレビシェＴＤＨ３遺伝子由来のヌクレオチド１から１０５８まで伸びるプロモーター配列。

ヌクレオチド１０５９て始まり、ヌクレオチド２３３０まで伸びるオープンリーディングフレーム。このオープンリーディングフレームのすぐ後には１訳終止コドンＴＡＡ、（ヌクレオチド２３３１がら２３３３）が続く。オープンリーディングフレームはハイブリッドＲＴＳ蛋白質を特定するアミノ酸をコードする；ニス・セレビシェＡ　ＲＧ　３遺伝子（クラビール（Ｃｒａｂｅｅｌ）ら　ＥＭＢＯＪ。

１９８３　２：２０５−２１２）由来の、２３３４がら３５ｏ４塩基対まで伸びる配列中に含まれる転写停止配列。

ヌクレオチド１０５９から２３３０によりコードされるハイブリッドＲＴＳＩ白質のアミノ酸配列を第５図に示し、これは以下の要素を含む。

ＴＤＨ３遺伝子配列由来の、ヌクレオチド１ｏ５９がら１ｏ６１によりコードされるメチオニン残基。

ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング法により産生されるヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）由来の３個のアミノ酸ＭｅｔＡｈａ　Ｐｒｏ；熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株（８）のサーカムスポロゾイト蛋白質（Ｃ８Ｐ）のアミノ酸２１０〜３９８に相当するヌクレオチド１０７１〜１６３７によりコードされる１８９個のアミノ酸鎮；ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング技法により産生されるヌクレオチド１６３８〜１６４ｏによりコードされるアミノ酸（Ａｒｇ）；ヌクレオチド１６４１から１６５２によりコードされ、Ｂ型肝炎ウィルス（ａｄｗ血清型）ｐｒｅＳ２蛋白質（９）の４個のカルボキン末端残基に相当する４個のアミノ酸Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ：ヌクレオチド１６５３から２３３０によりコート′され、Ｂ型肝炎ウィルス（ａｄｗ血清型）を特定する２２６個のアミノ酸鎖。

実施例Ｊ　ＲＴＳカ七ソ１組み込みベクターｐＲＪＴ１３５３９の構築ＲＴＳカセント組み込みベクターｐＲＩＴ１３５３９の構造を第６図に示す。

ＲＴＳ発現カセットをＴｙベースの組み込みベクターｐＲＩＴ１３１４４上に挿入する。このベクターは、ＬＥＵ２遺伝子がベクターｐＣＶ９　（７）から単離された５ａｉｌ−ＸｈｏｌフラグメントとしてＴＶエレメントの５ａｉｌ部位中に挿入されているｐＲＩＴ１２９２７　（２）の誘導体である。従って、ＲＴＳ発現カセットをｐＲＩＴ１３１４４中に挿入した後、得られたプラスミドｐＲＩＴ１３５３９は発現カセットに加えて、選択マーカーとしてＬＥＵ２遺伝子を含有する（第５図）。ｐＲＩＴ１３５３９をＢｇｌｌｌエンドヌクレアーゼで消化すると、第７図に示す６８００ｂｐの直線状フラグメントが遊離され、これは定住ＴＶエレメントとの遊離末端の相同組換によりゲノム中に組み込むことができる。

ＳおよびＲＴＳ蛋白質の両方を発現する株を得るために、Ｙ１２９５を、Ｌｅｕ “コロニーに関する選択を有する６８００ｂｐの直線状ＢｇｌＩＩフラグメントを用いて形質転換する。種々の割合でゲノム中に存在する両発現カセットのセントを含む数個の組み込み体が得られる。約１．４の割合でＲＴＳおよびＳ蛋白質を発現する選択された形質転換体の一つは公式名称はＲＩＴ４３８３　（実験室受入番号Ｙ１５３０）である。

実施例５ｂ　Ｙ１２９５株の形質転換およびＹ１６３１株の産生（ＲＴＳと）類似の構造を、熱帯熱マラリア原虫ＮＦ３４株（モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　）　３５　：１８５−１９０．１９８９）由来のＣ８Ｐ遺伝子配列を用いて産生ずる。得られた融合蛋白質は、熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株由来のｃｓＰを用いてえられる構造物と区別するためにＲＴＳ木と表わす。

発現力セントの配列を第９図に示す。これは以下のエレメントを含む・ニス・セレヒンエＴＤＨ３遺伝子由来のヌクレオチド１から１０５８まで伸びるプロモーター配列。

ヌクレオチド］０５９で始まり、ヌクレオチド２３３０まで伸びるオーブンリーディングフレーム。このオーブンリーディングフレームのすぐ後には翻訳終止コドンＴＡＡ　（、ヌクレオチド２３３１がら２３３３）・が続く。オーブンリーディングフレームはハイブリッドＲＴＳ＊蛋白質を特定するアミノ酸をコードする。

ニス・セレビシェＡＲＧ３遺伝子由来の、２３３４から３５０４塩基対まで伸びる配列中に含まれる転写終止配列。

ＲＴＳ＊融合蛋融合蛋白−ドするこの発現カセットを、ＲＴＳ構造物に関して既に記載したのと同じ方法を用いて形質転換し、酵母Ｙ１２９５株のゲノム中に形質転換し、組み込む。ＳおよびＲＴＳ＊ＴＳ＊の両方を発現する形質転換されたクローンが得られる。１つのクローンを、約４８　：　ＩＲＴＳ本の割合で２個の蛋白質を発現するように選択する。クローンの実験室受入番号はＹ１６３１である。

細胞を含まないＲＩＴ４３８３から調製した抽出物を種々の抗体を用いたイムノプロットにより分析したＳ蛋白質に対する単クローン性抗体（Ｍａｂ　ＨＢＳＩ）；ＲＴＳ蛋白質（Ｍａｂ１６７）の繰り返し部分に対する単りローン性抗体；ＲＴＳ蛋白質（ウサギ血清Ｎｏ、２０）　の繰り返しのない配列に対するウサギ血清。

酵母Ｒ１７４３８３株において、２個の発現された生成物を単クローン性抗体ＨＢＳＩにより認識する。即ち、Ｓ蛋白質に対応する２４ＫＤ蛋白質および４６ＫＤのＲＴＳハイブリッド蛋白質である。ＲＴＳハイブリッド蛋白質も、Ｃ８Ｐの繰り返し、および非繰り返しエピトープに対する抗体により検出される。これらの結果から明らかに、ＲＩＴ４３８３株が同時に２個のＳおよびＲＴＳ抗原を、ＲＴＳ／Ｓが約１・４の割合で発現することがわかる。

６．２　ＣｓＣ１密度勾配遠心ＲＩＴ４３Ｂ３株中の粒子の形成を、ＣｓＣ１密度勾配遠心により分析する。

粗抽出物（総蛋白質の±１５ｍｇ）を、ｌ（１ｍｌの１．５Ｍ　ＣｓＣ１勾配上分析する（４００００ｒｐｍ、＋３℃、ベックマン５０Ｔｉｏ−ター９６８時間）。

フラクション（０，５ｍ１）を集め、ＨＢｓＡｇ　（ＡＵＳＲＩＡ）に対して特異的な放射免疫検定法、ＲＴＳ特異的ＥＬＩＳＡおよび抗ＨＢｓＡｇ単りローン性抗体を用いたイムノプロットにより分析する。

第８図に示すように、ＥＬＩＳＡＳＲＩＡおよびウェスタンプロットビークは、ｒｈｏ＝１．２１の浮遊密度に対応する勾配の同一フラクション（ｎｏ、１３）で現われ、このことは、ＳおよびＲＴＳモノマーの両方を含む混合粒子がこの株中に形成されたことを示す。

Ｙ１５３０株（ＲＩＴ４３８３）をまず２０ｍ１の滅菌ＹＮＢ　（Ｄｉｆｃｏ）　（デキストロース（０１％）および１．８％（ｗ／ｖ）寒天（Ｄｉｆｃｏ）で補足）をいれたペトリ皿中で３０℃で４８時間成育させる。表面成長株を滅菌ＹＮＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）　（デキストロース（１％）およびグリセロール（１０％）を追加）中に懸濁する。この懸濁液を無菌条件下で２ｍｌのポリプロピレンの栓をした滅菌試験管中に分配しく試験管１本につき１ｍ１）、−７０°Ｃで貯蔵する。

ワーキングシードロットの製造法マスターノード試験管の１本をすばや（解凍し、その内容物を白金耳て前記のように調製したベトリ皿上に取り出す。３０℃で６３時間培養した後、表面成長物の一部を、４００ｍ１の滅菌ＹＮＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）　（デキストロース（２％）を追加）をいれた２Ｌコニカルフラスコに移す。培養物を３０℃で２４時間培養した後、無菌条件下で遠心する（６３００ｘｇで１５分）。ペレットを無菌ＹＮＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）　（デキストロース（１％）およびグリセロール（１０％）を追加）中に再懸濁する。これを無菌条件下で２ｍｌのガラス栓をした滅菌試験管中に分配しく試験管１本につき０．５ｍ１）、　７０℃で貯蔵する。

（ａ）固体培地上の成育バイアル１つ分のワーキングシードロットを素早く解凍し、デキストロース（１％）および１．８％（ｗ／　ｖ　）寒天（Ｄｉｆｃｏ）を追加した滅菌ＹＮＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）を含有するペトリ皿上に分散させる。ペトリ皿を３００℃で４８時間培養する。

（ｂ）接種物の成育ペトリ皿の表面成育物をデキストロース（２％）を追加した滅菌ＹＮＢブロス（Ｄｉｆｃｏ）中に懸濁し、２個のコニカルフラスコ（２Ｌ１フラスコ１個あたり４００ｍ１の液体）中に等分する。フラスコをロータリーシェーカー上で３０℃ で２４時間培養する。

発酵５Ｌの脱イオン水（（ＮＨ４）２Ｓ　０４（４０ｇ）を追加）を入れた発酵槽（総容量２０Ｌ）をそのまま清浄なあらかじめフィルターを通した蒸気を用いて２バ一ルｇの圧力で１２１℃で３０分間滅菌する。室温に冷却した後、発酵槽中の液体の体積を４Ｌに調節し、フィルター滅菌したＨＢ４溶液ＩＬを添加する。発酵は、２個のコニカルフラスコからの接種物（８００ｍｌ）を添加することにより開始する。

発酵は、フィードパッチ技法を用いて行い、これにより培養物を以下の組成の溶液と共に連続して供給する：５ＬのＨＢ４溶液；４Ｌのデキストロース８０％（１２１℃で滅菌）培養密度は３０’ＣおよびｐＨ５（ＮＨ４０Ｈを添加することにより維持する）での好気的成育により増加する。溶解酸素を、気流および撹拌速度を調節して約５０％飽和に維持する。供給物の添加速度は成育速度が最大になり、副生成物のエタノールの形成が最小になるようにあらかじめ決定しておく。

４０〜９０時間後に発酵を停止する。発酵の終わりで、全培養物体積は１０〜１８　Ｌであり、乾燥細胞重量は３０および１００ｇ／Ｌの間である。培養物を迅速に１５〜２５°Ｃに冷却し、酵母細胞を遠心分離によりブロスから回収する。

濃縮した酵母細胞を、再遠心前にリン酸緩衝液（５０ｍＭ）で１度洗浄し、続いてポリエチレンの袋中で一７０℃で貯蔵する。

ＨＢ４培地組成実施例９　ＲＴＳ／Ｓの抽出および精製凍結濃縮酵母細胞（−７０℃）を−夜− ３０℃で解凍し、続いて細胞の入ったポリエチレンの袋を水中（１０〜２０℃）につけることにより５〜１５℃で完全に解凍する。酵母細胞懸濁液を以下の成分を含有する燐酸緩衝溶液（ｐＨ８，０）を用いて調製する。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐ−メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）　、イソプロパツールおよびｔｗｅｅｎ２０゜９．２　細胞破砕細胞を鉛を含まないガラスピーズ（直径ｏ、４９〜０．７０ｍｍ）を含むビーズミル中で破砕する。−２０℃の冷却液を循環させて粉砕室を冷却し、粉砕室出口でのホモジネートの温度が１５℃を越えないようにする。液体流速は６Ｌ／時間、撹拌速度は３０００ｒｐｍである。このプロセスを２回行う。得られたホモジネートのｐＨは６．７〜７，５である。

９．３　ポリエチレングリコール清澄化ポリエチレングリコール４００　（ＰＥＧ４００）を破砕した細胞懸濁液に添加して、最終濃度を１０％にしく１０℃未満で３０分、ｐＨ６，１）、部分的に清澄化された上溝を遠心分離により回収する（７２１Ｂベックマン遠心分離機、ＪＡ１０ローター、１７０００ｇで１時間）。

９４　メタノール清澄化メタノールをｐＨ７でＰＥＧで清澄化した抗原に添加して、５容積のＰＥＧで清澄化した抗原に対してメタノール１容積の割合にする。１７０００ｇで２０分間遠心分離により清澄化された抗原をえる（Ｊ２１Ｂ２１Ｂベツクマン遠心、Ｊ粗抗原を一夜１５％（Ｗ／Ｖ）コロイドシリカ（アエロジル３８ｏ１デグサ）上に４℃で吸着させる。

ペレットを連続して遠心分離し、ＮａＣｌ２．９％（Ｗ／Ｖ）中に再野濁することにより洗浄（３回）後、１％ＴＷＥＥＮ２０を含有する１０ｍＭビロリン酸緩衝液ｐＨ９，５を用いて抗原を脱着させる。

脱着緩衝液体積はメタノールで清澄化した抗原溶液の１／８に相当する。脱着された抗原溶液をＬ８．７０ベックマン超遠心分離ローターＲ１９で、５００００ｇで６０分間超遠心分離によ＃）回収する。

９．６　シアフィルトレージョン精製工程の前に、脱着された抗原を５容積の６Ｍの尿素、５００ｍＭのＮａＣ１，２０ｍＭのＴＲＩ　５−ＨＣ］でｐＨ８，５で超遠心分離することにより洗浄し、蛋白質および脂質汚染物の大部分を除去する。

つぎに緩衝液を同じシステム（Ｉｌｌｔｒａｓｅｔｔｅ、　３００　ｋ　Ｄの公称カットオフのポリスルホン膜を備えたＦｒＬＴＲＯＮ）で５容積の１０ｍＭのＴＲＩ　５−）（ＣＩでｐＨ８，１と交換する。

９．７　ＤＥＡＥ−ＴＳＫ６５０　（Ｍ）上イオン交換クロマトグラフィー清澄化した溶液を１０ｍＭＴＲｌ５緩衝液（ｐＨ８，１）で平衡化したアニＡン交換カラム（ＤＥＡＥ−ＴＳＫ６５０　（Ｍ））にかける。連続して２容積の１０ｍＭ　ＴＲＩ　５−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，１）および４０ｍＭＮａＣ１を追加した３容積の１０ｍＭ　ＴＲｒＳ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，１）で洗浄した後、ｌ容積未満の１５０ｍＭＮａＣｌを含有する１　０ｍＭ　ＴＲＩ　５−ＨＣ］緩衝液（ｐＨ８，１）を用いて抗原を脱着する。抗原を含むフラクションをプールする。

９、　８　Ｂｕｔｙｌ−ＴＳＫ６５０　（Ｍ）上線水性相互作用クロマトグラフィー最終濃度が６５０ｍＭＮａＣｌになるまでＮａＣ］を添加した後、抗原溶液を、２０ｍＭ　ＴＲＩ　５−ＨＣ］緩衝液、６００ｍＭ　ＮａＣ］　（ｐＨ８，１）で平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔ　Ｓ　Ｋ　６５０　（Ｍ）カラムにかける。抗原の大部分は通過するが、不純物はゲルと結合する。

９．９　限外濾過による濃縮ＨＩＣプールを３００ｋＤａの公称カットオフのポリスルホン膜を備えたＵ１ｔｒａｓｅｔｔｅシステム（ＦＩＬＴＲＯＮ）により濃縮する。

９．１０　ＣｓＣ］勾配中での超遠心ＣｓＣ１をＢｕｔｙｌ−ＴＳＫプールに添加して、最終濃度を１．５Ｍにする。

５０．２Ｔｉベツクマンローター中２７００００　ｇＴ６５時間後、抗原を含有するフラクションを集める。

緩衝液を交換し、低分子量の汚染物質を除去するために、抗原溶液を５ＥＰＨＡＣＲＹＬ　５３００　ＨＲカラムにかける。溶出緩衝液は、１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）である。

滅菌濾過１５０および４００１１ｇ　Ｌｏｗｒｙ／ｍ１間に希釈し、ｐＨを６．ＦＨニア１１１ｍした後、精製した抗原を０．２２μｍ滅菌フィルターを通して濾過することにより滅菌する。得られた溶液は、精製されたＲＴＳ／Ｓ粒子を含有する。

ＲＴＳ／Ｓ粒子の抗原性を試験するために、異なるエピトープに対する単クローン性抗体を結合させてＥＬＪＳＡを何回も行った。

用いた単クローン性抗体（ＭｏＡｂｓ）は以下のとおりである。

−ＭｏＡｂ　ＲＩＯ：　−Ｃ３Ｐ領域の繰り返し配列（ＮＡＮＰ）に対して特異的・１ｇＭアイソタイプ −ＭｏＡｂ　ＲＬ１１７：・Ｃ８Ｐ領域の非繰り返し配列に対して特異的−ＭｏＡｂ　ＲＦＩ：　−ＨＢｓＡｇのＳ配列に対して特異的・ＩｇＧアイソタイプＳｐ２／○Ａｇ骨髄種細胞をＣ１２配列の繰り返しおよび非繰り返し領域の両方を含有する完全に純粋でないＲＴＳ様粒子で免疫したＢａ１ｂ／Ｃマウスの牌細胞と融合することによりＭｏＡｂ　ＲＩＯおよびＲＬ１１７を室中で調製する。

３バツチのＲＴＳ／Ｓワクチンを分析する　バッチナンバーは２４Ｍ３１．２４Ｍ３２および２４Ｍ３４である。

１０．２　単クローン性抗体Ｒ１０（非繰り返し）との反応非線り返しＭｏＡｂ　ＲＩＯを「サンドウィッチＪＥＬＩＳＡに用いる。試験するサンプルをあらかじめＭｏＡｂ　ＲＩＯをコートしたマイクロタイタープレート中で培養する。ペルオキシダーゼと結合した同じＭｏＡｂを次に添加する。

３７℃で１時間培養し、洗浄した後、オルトフェニレンジアミンＨ！０２を添加することにより発色する。４９０ｎｍで吸光度を測定し、抗原濃度に対してブロワ３バツチ＋２４Ｍ３１．２４’Ｍ３２および２４Ｍ３４はＭｏＡｂ　ＲＩＯと陽性に、適合して反応するので、ＲＴＳ／Ｓ粒子上に繰り返しエピトープが存在することが確認される。最大結合の５０％に達するのに必要な抗原量はバッチ２４Ｍ３１．２４Ｍ３２および２４Ｍ３４についてそれぞれ５１，２．３８．２および６０．６μｇである。

１０．３　単クローン性抗体ＲＬ１１７（非繰り返し）との反応ＭｏＡｂ　ＲＬ１１７のＲＴＳ、Ｓ粒子との反応性を［サンドウィッチＪＥＬＩＳＡ試験で分析する。ＭｏＡｂ　ＲＬ１１７はペルオキシダーゼと結合し、ＲＴＳ／Ｓ粒子の検出に用いられ、繰り返し領域に関して特異的なＭｏＡｂ　ＲＩＯは粒子の捕獲に用いられる。

簡単に言うと、試験するサンプルをあらかじめＭｏＡｂ　ＲＩＯをコートしたマイクロタイタープレート中で培養する。ペルオキシダーゼと結合したＭ　ｏ　Ａ　ｂＲＬ１１７を次に添加し、３７℃で１時間培養し、洗浄した後、オルトフェニレンジアミンＨ２Ｏ２を添加することにより発色する。４９０ｎｍで吸光度を測定し、抗原濃度に対してプロットする。

結果３バッチ：２４Ｍ３１．２４Ｍ３２および２４Ｍ３４はＭｏＡｂ　ＲＩＯと陽性に、適合して反応するので、同一のＲＴＳ／Ｓ粒子上に繰り返しおよび非繰り返しエピトープが存在することが確認される。最大結合の５０％に達するのに必要な抗原量はバッチ２４Ｍ３１．２４Ｍ３２および２４Ｍ３４についてそれぞれ１６９．２．１１７６および１８１．１μｇである。

１０．４　単クローン性抗体ＲＦＩ　（抗Ｓ）との反応ＲＴＳ／Ｓ粒子中のＳエピトープの存在をペルオキシダーゼと結合したＭｏＡｂ　ＲＦＩを検出に用いて「サンドイッチＪＥＬＩＳＡ試験により示す。ＲＩＯＭｏＡｂはＲＴＳ、Ｓ粒子を捕獲するために、マイクロタイタープレート上に直接用いる。

要約すると、試験するサンプルをあらかじめＭｏＡｂ　ＲＩＯをコートしたマイクロタイタープレート中で培養する。ペルオキシダーゼと結合したＭｏＡｂＲＦＩを次に添加する。３７℃で１時間培養し、洗浄した後、オルトフェニレンジアミンＨ，Ｏ，を添加することにより発色する。４９０ｎｍで吸光度を測定し、抗原濃度に対してプロットする。

精！３バツチ・２４Ｍ３１．２４Ｍ３２および２４Ｍ３４はＭｏＡｂ　ＲＦＩおよびＲＩＯと陽性に反応するので、ＲＴＳ／Ｓ粒子上に繰り返しエピトープが存在することが確認される。最大結合の５０％に達するのに必要な抗原量はバッチ２４Ｍ３１．２４Ｍ３２および２４Ｍ３４についてそれぞれ５２．３．５５．２および１０６．２μｇである。

実施例１１　：　ＲＴＳ／Ｓ粒子のｉｎ　ｖｉｖｏでの免疫原性１１１　免疫原性の研究（ＲＴＳ、Ｓ）粒子の免疫原性に関する試験を、マウスおよびセルコピテカス・イーチオプスサルにおいておこなった。

マウスにおいて、抗Ｃ８Ｐ抗体をＲ３２ｔｅｔ３２抗原を抗繰り返し抗体の検出に用いてＥＬＩ　ＳＡ試験により分析する。Ｒ３２ｔｅｔ、３２はプラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の３２個のアミノ酸部分と融合した３２個のＮＡＮＰ　（主）繰り返し配列からなる。組み換え抗原はエシェリヒア。

コリ中で産生ずる。Ｃ８蛋白質の非繰り返し配列に対する抗体（Ａｂｓ）をＲＬＦ抗原を用いたＥＬＩ　ＳＡ試験により測定する。ＲＬＦ抗原は、インフルエンザウィルスのＮＳＩ蛋白質の初めの８１個のアミノ酸と融合した繰り返し配列を含まない完全Ｃ８蛋白質非翻訳領域からなる。ＲＬＦ抗原をイー　コリ中で産生ずる。マウス血清を１：１００から初めて連続的に希釈し、力価をＥＬＩＳＡ試験（１）において光学密度１．０に対応する希釈度の逆数で表わす。抗Ｃ３Ｐ　Ａｂｓの測定は、各血清に関して行い、力価の等比中項（ＧＭＴ）を計算する。

抗担体応答を分析するために、抗ＨＢｓ抗体力価も測定する（プールした血清のみ）。

マウスの試験において、ＲＴＳＳＳ粒子の免疫原性を評価するために、ＨＢｓＡｇの免疫原性について通常用いられるＢａ１ｂ／Ｃマウス（Ｈ−２ｄハブロタイブ）も用いる。免疫化の腹腔内（ｉ、　ｐ、　）および皮下（ｓ、　ｃ、　）経路を比較し、免疫促進物質３−説アシル化モノホスホリルリピッドＡ　（３Ｄ− ＭＰＬ）の免疫応答に関する効果も試験する。

（ＲＴＳｌＳ）ワクチンの免疫原性も同様にセルコビテカス・イーチオブスサルにおいて試験する。

選択された個々のまたはプールした血清もそのプラスモジウム　ファルシパラムスポロゾイトによる人肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２）のｉｎ　ｖｉｔｒｏの破壊を抑制する能力に関して試験する（ＩＳＩ検定（２））。

１０匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスに、あらかじめＡｌ（ＯＨ）３上に吸着させた各ｌ μｇの３種の（ＲＴＳＳＳ）バッチ（２４Ｍ／３１．２４Ｍ／３２および２４Ｍ／３４）を１力月間隔で２回腹腔内注射する。対照マウスに、ＨＢｓＡｇ（Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ、バッチＥＮＧ６１１Ｂ４）を注射する。３０日目および４５日目に、マウスを採血し、抗体価を各血清について測定する。

血清学的方法。

抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ価を、それぞれコーティング抗原としてＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦを用いたＥＬＴＳＡにより測定する。マイクロブレートを試験する血清サンプル（１’＋１００から初めて２倍連続希釈１２回）とともに培養する。マウスＡｂｓをビオチニル化抗マウス１ｇ１続いてストレブタビジン：ビオチニル化ホースラディツシュペルオキシダーゼコンプレックスおよびオルトフェニレンジアミン／　Ｈ２０！と反応させる。光学密度を４９０ｎｍで測定する。力価を光学密度１．０（最大結合の５０％）に対応する希釈度の逆数として表わす。各グループのマウスに関して、力価の等比中項（ＧＭＴ）を計算する。

抗ＨＢｓ抗体価をＨｏｌｌｉｎｇｅｔの式（３）にしたがって計算し、ｍｌＵ／ｍｌで表わす。

結果抗Ｃ８Ｐ応答。

強い抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ応答が試験した各（ＲＴＳ、Ｓ）バッチに関して観察された。バッチ間の明らかな違いはない。著しい追加抗原刺激の効果は２回目の投与の後観察される。Ｈｂ　ｓ　Ａ　ｇ　（”　Ｅｎｇｅｒｉｘ　 −Ｂ”　）で免疫したマウスをこの実験において負の対照として用いる。

抗ＨＢｓ応答：（ＲＴＳ、Ｓ）バッチはＨＢｓＡｇキャリアー蛋白質に対する抗体を誘起する。

試験はプールした血清のみに関して行った。

衷竺Ｚ・Ｂａ１ｂ／Ｃマウスにおける（ＲＴＳ、Ｓ）粒子の免疫原性に対する免疫促進物質３Ｄ−ＭＰＬの効果本発明者らはマウスにおける（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンの免疫原性に対する免疫促進物質３Ｄ−ＭＰＬの効果を分析した。腹腔内（ｉ、ｐ、）および皮下（Ｓ、　Ｃ，）経路の両方の免疫化を試験した。

免疫化。

１０匹のＢａ１ｂ／ＣマウスのグループにＡＩ（ＯＨ）Ｓ単独、またはＡＩ（ＯＨ）３＋３Ｄ−ＭＰＬ　（５０μｇ／用量）上に吸着させた１μｇの（ＲＴＳ。

Ｓ）（バッチ２４Ｍ／３４）を１力月間隔で２回腹腔内注射する。対照マウスに、１５０ｍＭＮａＣ１を注射する。３０日目および４５日目に、マウスを採血し、抗体価を各血清について測定する。

血清学的方法：血清学的方法は前記の始めの実験においてと同様である。

懸抗Ｃ８Ｐ応答：（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンバッチは強い抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ応答を両処方物において示す。全ての場合において、二回目の免疫化の後に著しい追加抗原刺激の効果が観察された。３Ｄ−ＭＰＬを含有する処方に関して得られたノｊ価は全ての場合において、アルミニウムのみの処方物より高く、第−抗Ｒ３２ｔｅｔ３２応答（ｐ＝０．０２）において統計的に著しい増加が観察された。１５０ｍＭＮａＣｌを注射したマウスのグループをこの実験における負の対照として用いた。

抗ＨＢ応答・腹腔内経路により注射された（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチン両処方物は強い抗ＨＢｓ応答を誘起する。著しい追加抗原投与の効果はいずれかの処方物を用いた２回目の免疫化の後に観察される。

免疫化・１０匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスの群にＡｌ（ＯＨ）３のみ、またはＡ　Ｉ　（ＯＨ）３＋　３Ｄ−ＭＰＬ　（５０μｇ／用量）上に吸着させた１μｇの（ＲＴＳＳＳ）（）く・ソチ２４Ｍ／３４）を１力月間隔で２回皮下注射する。対照マウスに、１５０ｍＭＮａ、ＣＩを注射する。３０日目および４５日目に、マウスを採血し、抗体価を各血清について測定する。

血清学的方法は前記の始めの実験においてと同様である。

墾抗Ｃ８Ｐ応答。

（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンバッチはＲ”３２　ｔ　ｅ　ｔ　３２およびＲＬＦに対して正の応答を両処方物において誘起する。全ての場合において、二回目の免疫化の後に著しい追加抗原刺激の効果が観察された。３Ｄ−ＭＰＬ処方に関して抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ応答（それぞれｐ＝０．１８およびｐ＝２．９）の両方に関して統計的に著しい高い力価が４５日目に観察される。しかし、一般には、力価は腹腔内経路で観察されたものよりも低い。１５０ｍＭ　ＮａＣＩを注射したマウスのグループをこの実験における負の対照として用いた。

抗ＨＢｓ応答：腹腔内経路により注射された（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンの両処方物は良好な抗ＨＢｓ応答を誘起する。著しい追加抗原刺激の効果はいずれかの処方物を用いた２回目の免疫化の後に観察される。抗Ｃ８Ｐ応答に関して観察されたように、抗ＨＢｓ応答は腹腔内経路に比べてこの経路に免疫化によるものは低い。

１１．３　セルコピテカス・イーチオブスにおける免疫原性ＡＩ（ＯＨ）ａ上に吸着した臨床的バッチ２４Ｍ／３２をもちいたセルコピテカス・イーチオブスサルにおける免疫原性を評価した。

方法免疫化；５匹のサルに、ＡＩ（ＯＨ）ｓ　（０，５ｍｇＡｌ＋＋十）上に吸着させた２０ μｇの（ＲＴＳ、Ｓ）粒子を０１２８および８４日目に筋肉内注射する。動物を０１１４．２８．４２．５６．６６および９８日目に採血した。Ｒ３２ｔｅｔ３２、ＲＬＦおよびＨＢｓ抗原に対する抗体を測定した。

血清学的方法。

抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ抗体価を、マイクロプレート上にコートしたＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦ抗体をそれぞれ用いたＥＬＩ　ＳＡにより測定する。プレートをつぎに試験する血清サンプル（１１０から初めて２倍連続希釈１２回）とともに培養する。サル抗体をビオチニル化抗ヒトＩｇ１続いてストレプタビジン・ビオチニル化ホースラディッンユペルオキシダーゼコンプレックスおよびオルトフェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ２により検出する。光学密度を４９０ｎｌで測定する。力価を光学密度１．０（最大結合の５０％）に対応する希釈度の逆数として表わす。各グループに関して、力価の等比中項（ＧＭＴ）を計算する。抗ＨＢｓ抗体価をＨｏｌｌｉｎｇｅｔの式（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９８２）にしたがって計算し、ｍＩＵ／ｍｌで表わす。

結果抗Ｃ９Ｐ応答：（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンはＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦ抗原の両方に対して５匹のさる全てにおいて正の応答を誘起した。著しい追加抗原刺激の効果は２回目の免疫化の１４日後（４２日目）に観察される。次に抗体価が３回目の免疫化までゆっくり減少するのが観察された。力価はサルＪ０３５２の抗ＲＬＦの場合以外は３回目の免疫化の１４日後（９８日）に再び増加した。

３回目の免疫化の後（９８日）得られた抗Ｒ３２ｔｅｔ３２力価はしかし２回目の免疫化後（４２日）に観察されたものよりも高くない。

抗ＲＬＦ応答の場合（サルＪｏ３５３を除（）、３回目の免疫化の後（９８日）、２回目の免疫化後（４２日）のレベルにくらべて力価の増加が観察された。

抗ＨＢ応答。

全てのさるは免疫化の２回目（４２日）および３回目（９８日）の後著しい追加抗原刺激の効果に関する抗ＨＢｓ応答を示した。

（ＲＴＳ、Ｓ）粒子に対して得られた抗体の生物学的活性（ＲＴＳＳＳ）ワクチンにより誘起された抗体の生物学的機能の測定値として、プールしたマウスおよび個々のさる血清をスポロゾイト侵入阻止（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　Ｉｎｖａｔｉｏｎ　（Ｉ　Ｓ　Ｉ　）　）検定により試験した（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅら、１９８４）。この検定は熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる人肝癌細胞系のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの侵入を阻止する抗Ｃ８Ｐ抗体の能力を測定するものでる。

結果この実験の結果を第１表および第２表に示す。■Ｓｒ測定値を免疫前の対照血清の活性を抑制０％とした相対的な抑制（％）で表わす。参考のために、試験した血清の抗Ｒ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦ抗体価も含める。第１表は試験した全てのマウス血清が非常に強いＩＳＩ活性を有することを示す。第２表は全ての５匹のさるは対応する免疫血清に比べて９８日目に非常に強いＩＳＩ活性を有する（ＲＴＳ、Ｓ）粒子は、マウスおよびサルの両方においてＣ８Ｐの繰り返しおよび非繰り返しエピトープに対しておよび、ＨＢｓＡｇキャリアーのＳ蛋白質に対して高い抗体応答を誘起する。

マウスにおける一次抗体応答は３Ｄ−ＭＰＬの存在により向上する。

腹腔内注射の後得られた抗体価は、皮下経路による免疫価の後得られたものよりも高い。

２種の動物において誘記された抗体は、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる培養された人肝癌細胞の侵入を効果的に予防した。

第１表・ＲＴＳ、Ｓで免疫化したＢａ１ｂ／Ｃマウスがらの血清のＩＳＩ活性マウス血清の　Ａ−Ｒ３２ｔｅｔ３２　Ａ−ＲＬＦ　ＩＳＩブール　力価　力価　（％）ブール　ｉ、ｐＡＩ＋３Ｄ−ＭＰＬ　６０６５４４　２４２４０８　１００％４５日ブール　１ｐ。

ミョウバンのみ　８７００５　１６０２８４　９８％４５日ブール　１ｐ。

ＡＩ＋３Ｄ−ＭＰＬ　１５３３３　９９００２　９４に４５日ブール　ｓ、ｃ。

ＡＩ＋３Ｄ−ＭＰＬ　５１０２　２０４５３　８６％４５日負の対照のブール　２０５　２０５　０％第２表：ＲＴＳ、Ｓで免疫化した個々のサルの血清のＩＳＩ活性引例（１）　ハンフォード・エフ、カベシン、ティー、コロ−・ピー（Ｈａｎｆｏｒｄ　Ｎ。

Ｃａｂｅｚｏｎ　Ｔ、　Ｃｏ１ａｕ　Ｂ）ら、「コンストラクション・アンド・キャラクタライゼーション・オン・ア・サツカロミセス・セレビシェ・ストレイン（ＲＩＴ４３７６）エクスブレッシング、ヘパティティスＢサーフェイス・アンチゲン」　（Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｂａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　５ｔｒｓｉｎ　（ＲＩＴ４３７Ｇ）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｂｅｐａｔｉｔｊｓ　 a Ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ″）、Ｐｏｓｔｇｒａｄ　１ｌｌｅｄ　Ｊ　６３．５ｕｐｐ、　２　：　６５−７０゜（２）　ジェイコブズ・イー、ルトガーズ・ティー、ボート・ピー０ａｃｏｂｓ　Ｅ。

Ｒｕｔｇｅｒｓ丁、　Ｖｏｅｔ　Ｐ）ら、「シマルタネアス・シンセシス・アンド・アセンブリ・オン・ベリア入へパティティスＢサーフェイス、プロテインズ・イン・サツカロミセス・セレビシェＪ　（”　ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　Ｖａｒｉｏｕｓ　［１ｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”　）　、　Ｇｅｎｅ　８０°２７９−２９１．１９（３）　ピーラ・ジエイおよびメリック・ジェイ（Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ）、ｒｐＵＣプラスミズ、アンＭ１３ｍｐ−プライブト・システム・フォア・インサーノヨン・ミュータゲネンス　アンド、シーケンシング・ウィズ・ノンセテインク　ユニバーサル・プライマースＪ　（”　Ｔｈｅ　ｐＬｌｃ　ｐｌａｓｍｉｄｓ。

ａｎ　Ｍ１３ｏ＋ｐ７−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｉｎ５ｅｒｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｊｎｇ　ｗｉｔｈ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒｓ”　）　、Ｇｅｎｅ　１９°２５９−２６８．１９８２（４）　ジュニアウクス（Ｊｕｎｉａｕｘ）贋毀Ｊ　１　：１１２５−１１３１．１９８２゜（５）　ヒンネン・エイ、ヒソクス・ンエイビイおよびフィンク・シイアール（ｌ（ｉｎｎｅｎ　Ａ、　Ｈｉｃｋｓ　ＪＢａｎｄ　Ｆｊｎｋ　ＧＲ）、「トランスフォーメーション・オン・イーストＪ　（”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ”）　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ（６）　ブローチ・ジェイアール、ストラザン・ジェイエヌおよびヒックス・ジエイビイ（Ｂｒｏａｃｈ　ＩＲ，５ｔｒａｔｈｅｒｎ　ＪＮ、　ａｎｄ　Ｈｉｃｋｓ　ＪＢ）、「トランスフォーメーション・イン・イースト・デベロプメント・オン・ア・ハイブリッド・クローニング・ベクター・アンド・アイソレーション・オン・ザ・ＣＡＮＩジーンＪ　（”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　ＤｅｖｅｌｏｐＩｌｅｎｔ　ｏｆ　ａ取りｒｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＡＮＩ　Ｇｅｎｅ”）　、　Ｇｅｎｅ８：１２１−１３３．　１９７９（７）　ツァン・エイチ（Ｚｈａｎｇ　Ｈ）ら、「ダブル・ストランデッド・５ＤＮＡシーケンシング・アズ・ア・チョイス・フォア・ＤＮＡシーケンシング」、（”Ｄｏｕｂｌｅ　５ｔｒａｎｄｅｄ　５ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｓ　ａ　Ｃｈｏｉｃｅ　ｆｏｒ　ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”）　Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６　：１２２０．　１９８８（８）　ダーム・ジェイビイ、ウィリアムス・ジェイエル、マツカッチャン、ティーエフ（Ｄａｍｅ　ＪＢ、　ＷｉｌｌｉａＩｌｌｓ　ＪＬ、　ＭｃＣｕｔｃｈａｎ　ＴＦ）ら、「ストラフチャー・オン・ザ・ジーン・エンコーディング・ジ・イムノドミナント・サーフェイス・アンチゲン・オン・ザ・スポロゾイツ・オン・ザ・ヒユーマン・マラリア・パラサイト・プラスモジウム・ファルシバラン」（”５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｉ＋ｕｕｎｏｄｏｍｊｎａｎｔ　ＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＨｕＩＩａｎ　１ｌａｌａｒｉａ　ＰｌａｓｍａｄｉｕＩｘｆａｌｃｉｐａｒｕＬＮ”）　５ｃｉｎｅｎｃｅ　２２５　：　５９３　５９９．　１９８４゜（９）　バレンツェラ・ピー、グレイ・ピー、キロガ・エム（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　Ｐ。

Ｇｒａｙ　Ｐ、　Ｑｕｉｒｏｇａ　Ｍ）ら、「ヌクレオタイド・ノーケンシズ・オン・ザ・ジーン・コーディング・フォア・ザ・メイジャー・プロティン・オン・ヘバティティスＢパイラス・サーフェイス・アンチゲン」（”ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎ”）Ｎａｔｕｒｅ２８０：８１５−８１９．１９７９゜Ｔｙ　ＬＩＲＡ３　ＣＵＰｌ　Ｓ−力ｔ、ｖｌ−ＴｙＲＴＳ発現カセットの横築およびプラスミドＹｅｐ１３におけるクロー二／り人ＡＧＣＴＴＡＣＣλＧτ丁ＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＣτ入ＡＴＧＧＡＣＡＣＭＡＴＴＣＧＡＡＡＴＡＣＴ？ＴＧＡＣＣｃｒＡττＴ丁ｃｃｉｃ、：、ＡｃｃＴＴｃｒεｘｃｃｒ丁ｃａｃｃｃｃＡＡｃｘｃＡｃｃ２ＡＡＧＡＴｒ＝入ＡλＴｒ丁Ｔｃｃ＝ｘτｃＡＣ丁τＧＡＴＧＣＡＡ入丁ＴＣＣＣＡＡＡＧＣ丁入ＡＴＡＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＧτＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＡＴＴτＧＡＣＣＴＣτ丁八ＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＧＣＧＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴ入ＡＧＡＣＣＣＧ ττＧ入ＡＡＡＧλＡＣ丁ＴＡＣＣＴＧλλＭＡＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＴＡＣＴＡＧＣＧＴＴＧＡＡＴＧＴτＡＧＣＧＴＣＡＡＣ入ＡＣＡＡＧ入ＡＧτττλＡＴＧＡＣ（、ＣＧＧ入ＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡττＣＣＴＴＧＡＴＴＡＣＧＴ入ＡＧＧＧλＧττＡＧＡＡτＣ入τ丁τ丁３７０　３９０　、　４１０ＧＡＡＴＡＡＡＡＡλＣ，、ＣＧＣττττ；ＣＡＧｒＴＣＧＡＧτＴＴＡＴＣＡＴＴＡ丁ＣＡＡＴＡＣ丁ＧＣＣＡＴＴτＣ入入ＡＧＡ４３０　、　４５０　４７０ＡＴＡＣＧＴＡＡＡＴλＡＴτＡＡτλＧＴＡＧτＧＡττττＣＣＴｊｌＪｔＣＴＴτＡＴＴＴＡＧ丁Ｃ入λ入入ＡＴＴＡＧこＣ：ττＴＡＡτＴＣＴＧＣτ ＧＴＡＡＣＣＣＧ　Ｔ　ＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧτ’ ｒＡＣＡＣＡＧ品ＴＡτＡＴに℃ＡｒｃｃｒＡｃｃｒｃｒｃｒｃｃｃｒｃＡλＣＡＧττＴＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＡＡ丁ＡＴ入ＡＴＧＧ入ＧＣτ ＣＧＣτＴττ入ＡＧＣＴＧＧこへτＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧへ大ＴｃｃｃｘｃｃＡｃＣλＡＡＡ丁へＴτＧ÷τＴ丁ＣτＴＣＡＣεＴＣτＣτＣＴＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣ丁Ｇ入Ａ入ＡＡＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧτ丁ＣＣＣＴＧＡ入Ａτ丁ＡＴＴＣＣＣＣＴＡＣττＧＡＬ：ＴＡＡＴＡＡＧ丁ＡＴＡＴＡＡＡＧＡＣＧＧＴＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＴＴＣＴＧτ入ＡＡＴＣＴＡ丁ττＣＴＴＡＡＡＣＴτＣＴＴ入ＡＡ丁τＣτＡＣＴＴＴτＡＴＡＧＴＴＡＧＴＣＴτ丁ττ丁τＴＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣＡ１１５０　１ｉＶＯ１１９０１２７０１２９０’　１３１０ ”３３０　１３５０　１３７０１５１０　！５３０　１５５０ｉ８１０　１８３０　１８５０１８７０　−’１８９０　１９１０１９３０　１９５０　’９７０２１７０２１９０２２工０２３５０　２：１７０　２３９０２４１０　２４コ０　２４５０八ＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡτＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡτＧＴＣττ２ＧＳＯ２６７０２６９０ＴＧ八τＴＡＴτＴＴＧＣλＡＴＧＴＣＡＡＴ？、！　τＧＴＴＡＧＴＡＡＡＡＣ丁ＡτＧ丁丁ＡＣＡττＣＣＡＡＡＡＡＡ７丁τＡＡＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＡＴＴＣＣτ丁ＣＧＡＧＴＴＧＴＣＣ入ＡτＴτＣＡＣＣＡＣτ： τＴＡ２Ｅ１３０　２８５０　２８７０ＣτＴＴＡＡＴＴＴτＣＴＣλ７τＣττＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴ、’、τＧこＡ τＣＣＡ７Ｃ丁ＴＴＡＴＣＴτＴＡＧＡこＡＧτＴＣＣＡＣＧＧＴＣＧ？τττ ＴＡＣＣＴＧＣＧＴＡＴＴＴτＧＧＴＴＡＴＴＡＣＣ；１ＧＡＧＣＣτＴＧＴＧＣＡＴＴττＣＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＴ？ＣＡＣＧＧＧ；１ＣＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＧＡＣＣＴＡＡＴＧＴＴＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧ　；ｌＡＣττττＣＣＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＡＴＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧこτＣＴＧＣＡＴＣＧＣＴＡＧＣλ八ＴλＣＡ３３１０　へ　３コ３０　コ３５０コ３７０　３３９０　３４１０Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇａｙ　）ｌｉｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓ■ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＡｓｎＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　工１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＬｙｓＴｉｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＧｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　八ｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｐ工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　ＬｙｓＭｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　八ｓｎ　Ｓｅ：　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙしｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＶａＩ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｃ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＧＬｖ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｌ４１ｕ　Ｌｅｕ　Ｖａ工Ｌしｕ　Ｇ工ｎ　Ａｉａ　Ｇｌｙ　Ｆ’ｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ｘｌｅ　Ｌｅ■ τｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｚ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　丁ｈｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｐ：ｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇτ卯Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　工ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　ＣｙＳＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＭｅこＬｅｕ　Ｐｒｏ　ＶａｌＣｙｓ　Ｐｒｏ　し川　工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｚ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓτｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｆ’ｒｏ　ＡＬａ　Ｇｉｎ　Ｇｉｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙ■ Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｔｈ：　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　５ｅｒＳｅｒ　Ｔ：ｐ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　八ｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ４０５　１１１０　＜１５Ｐｈｅ　ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　工１ｅＴτＴＴＡＡＧＣＴＧ　ＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡ　八ＡＡＡＡＡＡＧＡＡ　ＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴ八丁丁Ｇへ　ＴＴＴＣ丁ＴＣＡＣb ＡＡＣＣＡＴＣＡＧτ　ＴＣＡＴＡＧＧＴＣＣＡＴＴＣτＣＴＴＡＧ　ＣＧＣＡＡＣＴＡＣＡ　ＧＡＧ入八ＣへＧＧＧ　ＧＣＡＣＡＡＡＣＡf ＧＴＣＡＣλＡＴＡＴ　ＧＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡ　Ａ丁ＧＴＡＧＡＴＧへ　入ＭＴＧＣＴＡＡＴ　ＧＣＣ入ＡＣ八Ｇ丁Ｇ入入ＡＴＡＣＡへ入Ａ　丁τＣＴｃτ丁ＴＣＡ　ＡＣＴＧＡＡＴＧＧＴ　ＣＣＣＣＡＴＧＴＡＧ　ＴＧＴＡＡＣＴＴＧＴ　ＧＧ入ＡＡＴＧＧsＡＴττＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＡＴＡＴＧＧ　ＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴ　ＡττＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧ丁ＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴ　ＴＣＡＴＣＣＣＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡ　ＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴ国際調査報告１１．１７ｍＮ−ρＣＴ／ＥＰ　９２１０２５９１１、。、　、、　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２５９１フロントページの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／１９　７２３６−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲ，ＵＳＩ（７２）発明者　コーエン、ジョゼフベルギー国ベー−１３３０リクセンザルト、リュ・デュ・ランスティテユート８９番スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的にマラリア原虫のＣＳ蛋白質の全てのＣ末端部分、ＣＳ蛋白質免疫優性領域の４以上のタンデム縁り返し配列およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢｓＡｇ）由来の表面抗原からなることを特徴とするハイブリッド蛋白質。２．ＨＢｓＡｇのＮ末端と直線リンカーによりフレーム中に融合した熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８ＣＳ蛋白質のアミノ酸２１０〜３９８または熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４ＣＳ蛋白質のアミノ酸２０７〜３９５に実質的に相当する熱帯熱マラリア原虫のＣＳ蛋白質の配列からなることを特徴とするハイブリッド蛋白質。３．ＣＳ蛋白質がＨＢｓＡｇと融合している請求項１または２に記載のハイブリッド蛋白質。４．以下のアミノ酸配列からなるハイブリッド蛋白質：（ａ）Ｎ末端メチオニン残基；（ｂ）ＭｅｔＡｌａＰｒｏ；（ｃ）熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８ＣＳ蛋白質のアミノ酸２１０〜３９８または熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４ＣＳ蛋白質の２０７〜３９５に対応する１８９個のアミノ酸鎖；（ｄ）Ａｒｇ；（ｅ）Ｂ型肝炎ＰｒｅＳ２蛋白質由来のＰｒｏＶａｌＴｈｒＡｓｎ（ｆ）Ｂ型肝炎ウイルスＳ蛋白質を特定する２２６個のアミノ酸鎖。６．ＲＴＳで表わされるハイブリッド蛋白質。７．ＲＴＳ＊で表わされるハイブリッド蛋白質。８．請求項１〜７に記載のハイブリッド蛋白質をコードするＤＮＡ配列。９．前記配列が転写調節エレメントと結合している請求項８に記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。１０．請求項９のベクターで形質転換した宿主。１１．宿主がエス・セレビシエである請求項１０に記載の宿主。１２．加えて、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子で形質転換された請求項１１に記載の宿主。１３．請求項１〜７に記載のハイブリッド蛋白質からなるマルチマーリポ蛋白質粒子。１４．請求項１〜７に記載のハイブリッド蛋白質およびＢ型肝炎表面抗原からなる混合マルチマーリポ蛋白質粒子。１５．ＲＴＳ、またはＲＴＳ＊およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原からなる請求項１４に記載の混合マルチマーリポ蛋白質粒子。１６．ハイブリッド蛋白質の表面抗原に対する割合が１：４である請求項１４または１５に記載の粒子。１７．適当な希釈剤または担体との混合物中、請求項１〜７または請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の免疫保護量の粒子または蛋白質からなるワクチン。１８．加えて、３−脱アシル化モノホスホリルリピッドＡからなる請求項１７記載のワクチン。１９．加えて、ミョウバンからなる請求項１８記載のワクチン。２０．水中油型エマルジョン中に調製された請求項１８記載のワクチン。２１．有効量の請求項１７〜２０のいずれか１つに記載のワクチンを投与することからなる、マラリア原虫感染症に罹病性の患者の治療法。２１．適当な宿主中で蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現し、生成物を回収することからなる請求項１〜７のいずれか１つに記載のハイブリッド蛋白質の生成法。２２．請求項１〜７の蛋白質およびＢ型肝炎表面抗原をコードするＤＮＡ配列をサッカロミセス属の株中に発現することからなる請求項１２〜１５に記載の粒子の生成法。