JPH07501221A - 脂肪アシルーＣｏＡ：脂肪アルコールＯ−アシルトランスフェラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８、Ｎ子植物のろうシンターゼからなる原核生物細胞。

こで前記ろうシンターゼエンコーディング配列は前記細胞の中で機能的な調節要 素のコントロール下にあり、 前記成長を前記ろうシンターゼエンコーディング配列の発現を引き起２０、前記 宿主細胞が原核生物である請求の範囲１９の方法。

２１、前記宿主細胞が種子植物の胚細胞である請求の範囲１９の方法。

２２、前記種子植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である請求の範囲２１の方 法。

２３　前肥ろうシンターゼエンコーディング配列が種子植物からのものである請 求の範囲１９の方法。

こて前肥ろうシンターゼエンコーディング配列は前記宿主細胞の中で機前記成長 を前記ろうシンターゼ配列の発現を引き起こす条件下に実施２５、異種組み換え 構成体からの脂肪アシルリダクターゼエンコーディング配列の発現の結果として 、前記ろうシンターゼの前記脂肪アルコール基質が前記宿主細胞の中で生産され る、請求の範囲２４の方法。

２６、前記宿主細胞が植物細胞である、請求の範囲２４または２５の方法。

２７　前記植物細胞が種子植物の胚細胞である、請求の範囲２６の方法。

２８、ｆｆ１ｌ記種子植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である請求の範囲２ ７の方法。

２９、請求の範囲２４または２５の方法により生産されたろうエステルからなる 宿主細胞。

３０、前記宿主細胞が植物細胞である、請求の範囲２９の宿主細胞。

３１、前記植物細胞がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子の胚細胞である、請 求の範囲３０の宿主細胞。

３２、前記種子細胞の内部の脂質貯蔵組織がろうエステルからなるブラシカ（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ）の種子細胞。

３３　前肥ろうエステルが長鎖ろうエステルである、請求の範囲３２のブランカ （Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子細胞。

明細書 脂肪アンルーＣ’ｏ　Ａ・脂肪アルコールＯ−アシルトランスフェラーゼこの出 願は、１９９１年１１月２０日提出の米国特許出願第０７７７９６．２５６号の 一部継続出願および１９９２年８月２１日提出の米国特許出願第０７／９３３， ４１１号の一部継続出願である。

技術分野 本発明は、酵素、このような酵素を精製しかつ得るための方法、それに関係する アミノ酸および核酸の配列、および遺伝子操作の用途におけるこのような組成物 の使用に関する。　゛植物の遺伝子操作技術の発展により、種々の植物種を形質 転換しそして再生して、新規なかつ望ましい特性を有する植物を得ることができ る。

このような遺伝子操作技術について興味ある１つの領域は、植物組織において価 値ある生産物の生産である。このような用途は、所望の生産物を生産する植物を 発生する形質転換の事象において使用するための種々のＤＮＡ構成体および核酸 配列の使用を必要とする。例えば、植物の機能的プロモーターは遺伝子配列の適 当な発現のために要求され、このような発現は全植物または選択した植物組織の 中である。さらに、形質転換された植物材料を同定するために選択的マーカー配 列がしばしば使用される。このような植物のプロモーターおよび選抜可能なマー カーは、新規な植物を得るとき有用な価値ある道具を提供する。

このような遺伝子操作技術を包含する望ましい目標は、ろうエステルの便利な源 を有する作物植物を提供する能力である。ろうエステルは種々の工業的応用、例 えば、製剤、化粧品、洗浄剤、プラスチックおよび潤滑油において要求される。

このような生産物、ことに長鎖ろうエステルは従来マツコラクジラ、絶滅の危機 にさらされた種、あるいはより最近、砂漠の低木、ホホバから利用可能であった 。これらの源のいずれもろうエステルの便利な供給を提供しない。このような化 合物の信頼性ある源を得るために、生産物の成長、収穫および抽出により容易に 操作される作物植物の形質転換は望ましい。

しかしながら、このような形質転換された植物を得るために、所望のろうエステ ル生産物の生合成に要求される遺伝子をまず得な（ではならない。ろうエステル は少なくとも２つの酵素σ活性、脂肪アシルリダクターゼおよび脂肪アシル：脂 肪アルコールアシルトランスフェラーゼ、またはろうシンターゼの作用から生ず る。このような酵素を使用する予備的研究および脂肪アシルリダクターゼタンパ ク質の広範な分析および精製は、これらのタンパク質が膜に関連することを示し たが、ろうの生合成における脂肪アシル：脂肪アルコールの結合反応に要求され る酵素はよく特徴づけられてきていない。こうして、酵素活性をエンコードする 遺伝子配列を得ることができるように、この酵素のそれ以上の研究および究極的 には、精製が要求される。

したがって、ろうシンターゼタンパク質を得ることができそしてアミノ酸配列を 決定できるおよび／またはろうシンターゼに対して特異的な抗体を得ることがで きる精製のプロトコルを案出することが望ましい。

この方法において、ライブラリーのスクリーニング、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）または免疫学的技術を使用して、ろうシンターゼタンパク質を発現するク ローンを同定ことができる。この方法において得られたクローンを分析し、こう してろうシンターゼ活性に相当する核酸配列を同定する。次いで、ろうシンター ゼの核酸配列を、宿主細胞の中のろうエステルの生産のために、トランスジェニ ック宿主細胞に対して固有であるか、あるいは組み換え技術により供給された脂 肪アシルリダクターゼタンパク質と組み合わせて使用ことができる。

関係する文献 発育するホホバ胚からの細胞不含ホモジネートは、アシル−ＣｏＡ脂肪脂肪アル コールアトルトランスフェラーゼ活性することが報告された。

この活性は分画遠心法から形成した浮遊ろうパッドに関連した（Ｐｏｌｌａｒｄ ら（１９７９）前掲：Ｗｕら（１９８１）前掲）。

脂肪アシル−８ＣｏＡトランスフエラーゼ活性を有するエウグレナ・グラシリス （Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの多酵素複合体の可溶化は、Ｗｊｌ ｄｎｅｒおよびＨａｌｌｉｃｋ（Ｔｈｅ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｃｏｎｓｏｒｔ ｉｕｍ　Ｆｉｆｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、１９９０年４月２２〜２ ４日、のアブスツラクト、ニューメキシコ州ラスクルーセス）により報告された 。

ホホバのアンルーＣｏＡ　：アルコールトランスフエラーゼタンパク質の１０倍 の精製は、Ｐｕ５ｈｎｉｋら（Ｔｈｅ　ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｏｎｓｏｒｔｊｕ ｍ　Ｆｉｆｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ。

１９８９年２月７日、のアブスツラクト、カリフォルニア州リバーサイド）によ り報告された。

図面の簡単な説明 第１図。ｃＤＮＡ配列から決定された、ホホバ脂肪アシルリダクターゼの核酸配 列および翻訳されたアミノ酸配列は第１図に記載されている。

第２図。ホホバろうシンターゼのｃＤＮＡクローンの核酸配列および翻訳された アミノ酸配列が記載されている。

発明の要約 本発明によれば、部分的に精製された脂肪アシル−ＣｏＡ：脂肪アルコールＯ− アシルトランスフエラーゼタンパク質が提供され、ここで前記タンパク質は脂肪 アルコールおよび脂肪アシル基質からのろうエステルの形成において活性である 。この脂肪アシル−ＣｏＡ：脂肪アルコールＯ−アシルトランスフヱラーゼは、 また、ここにおいて「ろうシンターゼ」と呼ぶ。本発明のろうシンターゼは、種 々の脂肪アシルおよび脂肪アルコールの基質、例えば、アシル−ＣｏＡおよびア シルＡＣＰとともに活性であることができる。これらの基質０炭素鎖の長さは変 化することができるが、所定のろうシンターゼは特定の鎖長さを有するアシルお よびアルコール基質よりも好ましさを示すことができるか、あるいは炭素鎖の長 さに関して広い範囲を有するアシルおよびアルコール基質とともに活性であるこ とができる。

一般に、本発明のろうシンターゼは少な（とも１２〜２４炭素の鎖長を有するア シルおよびアルコール基質に対する活性を有し、前記炭素鎖の長さは式ｒｃ＊ｘ Ｊ　（ここでＸは６〜１２の数である）により表されるが、他のアシルまたはア ルコール基質を試験しそしてさらに活性を発見することができる。さらに、本発 明のろうシンターゼタンパク質が得られると、さらに詳細に後述するするように それ以上の操作が今や可能である。これらの操作は他の関係するろうシンターゼ の生産または発見に導く。

こうして、第１の面において、本発明はろうシンターゼの酵素活性を示すタンパ ク質の調製物に関し、そして種子植物のタンパク質調製物により例示される。こ のような調製物はホホバ胚を分画してミクロソームの膜調製物を生成し、この膜 調製物からろうシンターゼタンパク質を可溶化し、そしてクロマトグラフィーの 手順によりさらに精製することによって生産される。ホホバろうシンターゼは広 い範囲のアシルおよびアルコール基質を受容することがここにおいて示され、前 記アシルおよびアルコール基質は飽和または不飽和であることができる（炭素の 間に１または２以上の二重結合を含有する）。ホホバろうシンターゼ酵素の活性 は酵素の命名法１９８４においてＥ、Ｃ，２，３，１，７５として与えられ、推 奨される名称「長鎖アルコール脂肪−アシルトランスフェラーゼ」を有する。

これらの手順により、はぼ５７ｋＤの見掛けの分子量を有するろうシンターゼタ ンパク質を含有する部分的に精製されたタンパク質調製物が得られる。こうして 、種子植物源からの精製によりろうシンターゼタンパク質を得る方法、ならびに これらのろうシンターゼタンパク質のアミノ酸配列を得る方法が提供される。

さらに、他の生物からのろうシンターゼタンパク質はここに記載する方法により 提供される。例えば、アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のろう シンターゼの部分的に精製された調製物が得られ、ここでシンターゼ活性はほぼ ４５ｋＤのペプチドのバンドに関連することが発見される。同様に、エウグレナ ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ）からのろうシンターゼタンパ ク質の調製物が提供され、ここで４１ｋＤのペプチドが本質的に活性に関連する 。

本発明の異なる面において、本発明のろうシンターゼに関連する核酸配列が考慮 される。これらの配列を同定しそして本発明のろうシンターゼタンパク質のアミ ノ酸配列から得ることができる方法を記載する。他のろうシンターゼ配列の単離 のための、ならびにろうシンターゼの核酸配列の転写および／または宿主細胞の 中のろうシンターゼタンパク質の発現のための組み換え構成体における、構造遺 伝子配列の使用を記載する。ろうシンターゼタンパク質に関連する他の核酸配列 の使用、例えば、５′および３°非解読領域の使用を、また、考慮する。

本発明のなお異なる面において、センスおよびアンチセンスのろうシンターゼ配 列をコードする組み換え構成体を含有する細胞を考慮する。

とくに、ホホバろうシンターゼの好ましいアルコール基質を含有する細胞、例え ば、ブランカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の胚の中の細胞を考慮する。

さらに、本発明の組み換え構成体からの発現の結果として、本発明のろうシンタ ーゼタンパク質を含有する細胞を考慮し、そして宿主細胞の中でろうシンターゼ を生産する方法が提供され゛る。したがって、宿主細胞の中のそのタンパク質の 発現の結果として回収されるろうシンターゼタンパク質を、また、本発明におい て考慮する。

さらに、本発明のろうシンターゼは、ろうシンターゼの脂肪アシルおよび脂肪ア ルコール基質を含有するこのような宿主細胞の中のろうエステルの生産において 用途を見いだすことができる。このような宿主細胞は自然に存在するか、あるい は脂肪アシルリダクターゼをエンコードする核酸構成体で形質転換することによ って得ることができる。脂肪アシルリダクターゼ、または「リダクターゼ」は、 脂肪アシル基の対応するアルコールへの還元を触媒するとき活性である。同時係 属米国特許出願第０７／６５９．９７５号および第０７／７６７．２５１号（こ れらをここに引用によって加える）はこのようなりダクターゼタンパク質に関す る。この情報は、また、公開されたＰＣＰ特許出願ＷＯ９２／１４８１６号の中 で記載されている。さらに、リダクターゼタンパク質の望ましい源でもあるろう シンターゼタンパク質の他の源をここに記載する。

本発明のこの面において、ここに記載するホホバろうシンターゼの好ましいアル コール基質を含有する植物細胞をことに考慮する。このようなアルコール基質を 有する植物を提供する方法を考慮し、ここで脂肪アシルリダクタ−せの核酸配列 をエンコードする組み換え核酸構成体で前記細胞を形質転換する。こうして、ろ うシンターゼにより利用されるアルコール基質を有意な量で通常含有しない植物 宿主を、アルコールを生産するように、リダクターゼ構成体で形質転換すること ができる。この方法において、宿主細胞の中に存在する脂肪アシル基は、また、 ろうエステルの合成においてろうシンターゼにより利用される脂肪アルコール基 質源を提供するであろう。ろうシンターゼおよびリダクターゼタンパク質の特異 性に依存して、この方法において、種々の望ましいろうエステル生産物を生産す る植物細胞を得ることができる。このような生産物は、脂肪アルコール基および 脂肪アシル基の鎖長および飽和度に依存して異なる性質を有するであろう。こう して、ここにおける方法に従い生産されるろうエステル生産物を宿主細胞から回 収ことかでき、そして、また、本発明において考慮する。

発明の詳細な説明 本発明の脂肪アンルーＣｏＡ　：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼは、 脂肪アルコールを脂肪アシル基によりエステル化してろうエステルを生産する反 応を触媒するとき活性である、アミノ酸、例えば、タンパク質、ポリペプチドま たはペプチドの断片の任意の配列を含む。本発明のアシル−ＣｏＡ：アルコール アシルトランスフェラーゼを、また、以後「ろうシンターゼ」と呼ぶ。

典型的にはアシル−ＣｏＡ・アルコールアシルトランスフェラーゼと呼ぶが、本 発明のろうシンターゼは種々のアシル基質、例えば、脂肪アノルーＣｏＡおよび 脂肪アンルーＡＣＰ分子に対する活性を示す。さらに、ろうシンターゼが作用す るアシルおよびアルコールの両者の基質は変化すう炭素鎖の長さおよび飽和度を 有することができるが、ろうシンターゼはある種の分子に対して優先的な活性を 示すことができる。

多数の異なる生物はアシルおよびアルコール基質からろうエステルを生産し、そ して本発明のろうシンターゼタンパク質の望ましい源である。

例えば、植物は表皮またはクチクラのろうを生産しくＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ（ １９８０）Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　（Ｓｔｕ ｍｆ、Ｐ、Ｋ　およびＣｏｎｎ５Ｅ、Ｅ、編）Ｖｏｗ。

４、ｐ、５７１−６４５）、そして砂漠の低木、ホホバは種子貯蔵ろうを生産す る（Ｏｈｌｒｏｇｇｅら（Ｌｉｐｉｄｓ　（１９７８）１３：２０３−２１０） 。ろうシンターゼの合成は、ま゛た、細菌の種々の種、例えば、アンネトバクタ ー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（Ｆｉｘｔｅｒら（１９８５）Ｊ、Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３２：３１４７−３１５７）およびマイクロコツカス（ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｌｌｏｙｄ（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ　５２ ：２９−３７）において、そして単細胞生物、エウグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）（ ＫｈａｎおよびＫｏｌａｔ　ｔｕｋｕｄｙ　（１９７５）Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、１７０：４００−４０８）により観察された。さらに、 ろうの生産およびろうシンターゼ活性はウシ属の動物のマイボーム腺（Ｋｏｌａ ｔｔｕｋｕｄｙら（１９８６）Ｊ、Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、２７・４０４−４１１ Ｌ鳥類の尾腺、および種々の昆虫および海の生物からのミクロソームの調製物に おいて報告されてきている。結局、種々の性質を有する多数の異なるろうエステ ルは本発明のろうの合成により生産することができ、そして酵素の活性および生 産されるろうエステルのタイプは入手可能な基質または問題の特定のろうシンタ ーゼの基質特異性に依存することがある。

エステル化反応において使用するためのろうシンターゼタンパク質の信頓性ある 源を得るために、ろうシンターゼに関連する核酸配列を単離し、こうしてこれら の配列をろうシンターゼ酵素の生産のために宿主細胞の中にクローニングするこ とができるようにすることが望ましい。例えば、ろうシンターゼタンパク質をエ ンコードする核酸配列を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）の中の発現のためにベクターの 中にクローニングして、ろうシンターゼタンパク質の準備された源を提供するこ とができる。そのように生産されたろうシンターゼタンパク質は、また、種々の 源から、ことに植物から関係するろうシンターゼタンパク質の同定および精製の ために、ろうシンターゼタンパク質に対する抗体をレイズするために使用できる 。さらに、ろうシンターゼタンパク質のそれ以上の研究は、その触媒の性質を特 性決定しかつ改良するために、あるいはその脂肪アルコールまたは脂肪アシルの 基質の特異性を変更するために、部位特異的突然変異誘発反応に導くことができ る。変更された特異性を有するろうシンターゼは、他のＦＡＳ酵素と関連する用 途を見いださすことができる。

本発明の以前において、ろうシンターゼタンパク質のアミノ酸配列は知られてい ない。こうして、ろうシンターゼに関連するナンセンスを得るために、まず入手 可能な源からタンパク質を精製し、そして少なくとも部分的なアミノ酸配列を決 定し、こうしてろうシンターゼの核酸配列の単離のために有用である適当なプロ ーブを調製できるようにすることが必要であった。

砂漠の低木、シンモンドンア・チネンシス（Ｓ　ｉｍｍｏｎｄ　ｓ　ｉ　ａｃｈ ｉｎｅｎｓｉｓ）（ホホバ）が、候補のろうシンターゼタンパク質の源として同 定された。初期の研究において、ホホバろうシンターゼは内在性膜タンパク質で ありそして性質が疎水性であることが明らかにされた。一般に、膜関連タンパク 質は、可溶性するとき、すなわち、それらが通常機能する膜の環境から分離され るとき、酵素活性を損失する傾向があるので、精製することが困難である。内在 性膜タンパク質を可溶化するために使用されてきている技術は、適当な数の画分 性質に洗浄剤または有機溶媒を添加することを含む。次いで、所望のタンパク質 が特定の酵素アッセイにより測定できる機能的活性をまだ保持すると仮定すると 、他の普通の精製技術、例えば、沈澱、イオン交換、ゲル濾過およびアフィニテ ィークロマトグラフィーを利用することができる。

典型的には、可溶化された膜タンパク質を得るための第１工程として、ろうシン ターゼ活性を含むミクロソームの原調製物が望ましい。標準のミクロソームの原 調製物は細胞不含ホモジネート（ＣＦＨ）の分画遠心法を利用して、全細胞、核 および可溶性タンパク質を含まない数両分を生成する。（参照、ＭＯｏｒ！ら（ １９８７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ１Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ＋Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｐｐ、３７−７２、ＦｉｎａｌａｙおよびＥｖａｎｓ、編 。）脂肪種子では、初期の遠心工程は典型的にはベレット、上澄み液および浮遊 する脂肪パッドを生成し、次いで上澄み液をさらに遠心することによってミクロ ソームの膜を回収することができる。

あるプロトコルは同時係属米国特許出願第０７／６５９．９７５号、１９９１年 ２月２２日提出に記載されており、ここでホホバの膜の画分は脂肪アシルリダク ターゼに関連する酵素活性のすぐれた回収率で得られ、他の酵素がホホバの中の ろうエステルの形成に関係した。この方法は、また、後述する実施例に詳細に記 載されているように、ろうシンターゼ活性を有する膜画分を提供する。他の手順 は当業者に知られており、そして同様な原調製物を得るために利用することがで きる。さらに、このような調製物の中のろうシンターゼ活性についてアッセイす る方法は実施例１に記載されている。

それ以上の酵素の特性決定および精製は、その固有の脂質の２層の膜の環境から 分離されるが、実質的な量の測定可能なシンターゼ酵素活性を保持する、可溶化 されたろうシンターゼタンパク質を得ることである。

脂質の２層からの内在性膜タンパク質の除去は典型的には水溶液の中で両親媒性 洗浄剤を使用して達成されるが、有機溶媒がわずかの場合においてまた使用され てきている。多数の異なる洗浄剤および膜タンパク質の可溶化法は当業者に知ら れており、そしてまたＮｕｇｅｂａｕｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 （１９９０）１８２：２３９−２５３）およびＨｊｅｌｍｉｌａｎｄ（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

（１９９０）１８２：２５３−２６４）により概観されている。

しばしば、膜タンパク質の可溶化に使用される洗浄剤は、所望のタンパク質の酵 素活性を阻害することが発見された。い（つかの洗浄剤、例えば、ＣＨＡＰＳ　 （３−［（３−コラミドプロピル）−ツメチル−アンモニオ］−１−プロパンス ルホネート）（これは同時係属米国特許出願第０７／６５９．９７５号の中に示 されている）をホホバろうシンターゼの可溶化について試験して、ホホバからの 脂肪アシルリダクターゼの精製において有用であることが発見された。すべては ろうシンターゼの酵素活性を阻害することが発見された。ＣＨＡＰＳによる強い 阻害はＣＭＣより上の濃度において観察されたが、リン脂質、例えば、Ｌ−ホス ファチノルコリンの添加、および０．７５％から０．　３％への、すなわち、Ｃ ＭＣ以下のＣＨＡＰＳ濃度の調節は、ろうシンターゼ活性の一部分の再構成を生 ずる。ろうシンターゼ活性の再構成の主要な要件は洗浄剤の除去または希釈の間 のリン脂質の存在であり、こうしてろうシンターゼタンパク質はリン脂質のベヒ クルの中に組み込まれる。これは、リン脂質の添加を必要としない、ホホバのリ ダクターゼ活性の再構成について開発されたプロトコルと異なる。こうして、リ ン脂質がろうシンターゼ調製物、例えば、ミクロソームの膜画分からの調製物の 中に存在する場合、活性は単に洗浄剤を除去または希釈することによって検出す ることができる。しかしながら、さらに精製されたろうシンターゼ調製物におい て、リン脂質を添加して活性を検出しなくてはならない。高度にレベル、すなわ ち、はぼ２％（Ｖ／Ｖ）のリン脂質を使用する場合、ろうシンターゼ活性は可溶 化に使用した洗浄剤の簡単な希釈により回復することができる。可溶化された調 製物の中のろうシンターゼ活性を再構成しかつアッセイする方法は、実施例１に 記載されている。

洗浄剤ＣＨＡＰＳを利用するホホバろうシンターゼ活性を可溶化するプロトコル は、実施例４に記載されている。ミクロソームの原調製物からのろうシンターゼ 活性のほぼ１５％の収率が得られる。同様に、他のメヒンバによる明らかなろう ／ンターゼの阻害の可逆性の研究を実施して、ホホバまたは他の候補のろうシン ターゼの可溶化のために有用な洗浄剤を同定することができる。ミクロソームの 原調製物から可溶化されるろうシンターゼ活性の百分率は小さいので、可溶性さ れた形態で得られるろうシンターゼの百分率を増加する技術を開発することがで きる。

しかしながら、記載する方法により得られる可溶化されたろうシンターゼの比率 は、後述するようにろうシンターゼのそれ以上の精製、特性決定および配列決定 を可能とするために十分である。

可溶化されたろうシンターゼタンパク質が得られると、基質の特異性、コファク ターの要件および可能な活性阻害因子に関して酵素を特性決定するための他の実 験をここで実施することができることを理解できる。

例えば、本発明のホホバろうシンターゼは、アノルーＡＣＰおよびアシル−Ｃｏ Ａ分子を包含する広い範囲のアシル基質を有することが発見された。さらに、ア シルおよび脂肪アルコールの基質は炭素鎖の長さに関し広いサイズの範囲を有す ることができる。例えば、Ｃ１２〜Ｃ２４の炭素鎖の長さを有する基質を使用し て活性を試験し、そしてすべては酵素により利用されることが示された。さらに 、変化する程度の不飽和を有する脂肪アシルおよび脂肪アルコールで活性が示さ れた。

本発明のろうシンターゼのそれ以上の特性決定のために非常に有用であることが 証明された手順は、ろうシンターゼタンパク質を特異的に標識化することである 。例えば、ろうシンターゼ活性を有する膜調製物を放射線標識化バルミトイル− ＣｏＡ、すなわち、ろうシンターゼ酵素の基質とインキュベーションすることが できることが発見され、こうしてほぼ５７ｋＤの見掛けの分子量の放射線標識化 ペプチドのバンドはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）！ｌｉよび 引き続くオートラジオグラフィーにより検出される。さらに、可溶化されたろう シンターゼタンパク質は、もはや酵素活性を示さず、同様に標識化して、それ以 上の精製工程によりろうシンターゼタンパク質を追跡するための便利な方法を提 供することができる。これらの標識化手順の詳細は実施例２に記載されている。

こうして、本発明のろうシンターゼ活性からなる調製物は、他の技術、例えば、 ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）および引き続く染色、ま たはパルミｌ−イル−ＣｏＡを使用する放射線標識化および引き続＜ＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥおよび引き続くオートラジオグラフィーにかけることができる。この方法 において、はぼ５７ｋＤのタンパク質がこれらの調製の中に存在すること、およ びこのタンパク質の染色強度はろうシンターゼ活性のレベルに対応することが評 価される。バルミトイル−ＣｏＡの放射線標識化を実施するとき、ＳＤＳ　ＰＡ ＧＥおよびオートラジオグラフィーは標識化されたバンドがろうシンターゼ活性 をもって足跡を残すことを確証する。５７ｋＤのペプチドのバンドがサイ特表千 ７−５０１２２１　（６） ズ排除、アフィニティーおよび反応性染料のクロマトグラフィーからの両分の中 においてろうシンターゼ活性をもって５７ｋＤのペプチドのバンドが足跡を残す こととを評価する実験は、以下の実施例に記載されている。

さらに、クロマトグラフィーの技術を使用して植物ろうシンターゼの濃縮された 調製物を得ることができる。１つのこのような精製工程は、固定化された反応性 染料マトリックス、例えば、本発明において使用したチバクロン・ブルー（Ｃｉ ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ）Ｆ３ＧＡ　（ブルーＡ）のクロマトグラフィーを包含 する。ホホバろうシンターゼ活性は、はぼ０．４Ｍ　ＮａＣｌを含有する緩衝液 中で負荷するとき、このようなカラムに結合するが、他のタンパク質のほぼ８５ ％より大が引き続く洗浄において通過するか、あるいは除去される。同時係属米 国特許出願第０７／７６７．２５１号に記載されているように、リダクターゼ活 性は、また、このような条件下にブルーＡのカラムに結合される。ここにおいて 、ブルーＡのカラムに負荷されたろうシンターゼ活性のほぼ２０％を溶離により 回収できることが示された。このろうシンターゼ活性の小さい部分を１．０Ｍ　 ＮａＣｌの緩衝液の洗浄で溶離され、この緩衝液はこのカラムから回収されるリ ダクターゼ活性の大部分をまた含有する。回収されたろうシンターゼ活性の大部 分は１．’５Ｍ　ＮａＣ１を使用する溶離により得られ、この洗浄液はまた小さ い比率のりシンターゼ活性を含有する。こうして、回収可能なろうシンターゼ活 性の大部分はりダクターゼタンパク質の大部分から分離されるが、５７ｋＤのろ うシンターゼ以外の！ＩＩ製物の中に存在する主要なタンパク質は５６および５ ４ｋＤのりダクターゼタンパク質である。

ブルーＡのクロマトグラフィー後のろうシンターゼタンパク質の研究において、 ろうシンターゼタンパク質がこのカラム上で凝集することがあることが示される 。例えば、スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２（ファーマンア）上でろうシン ターゼ活性を有するブルーＡの両分のサイズ排除クロマトグラフィーは、このカ ラムのボイド画分の中のろうシンターゼ活性の主要な溶離（排除限界はぼ５Ｘ１ ０’ダルトン）を生じ、ろうシンターゼが凝集した形態であることを示す。重要 なことには、ろうシンターゼ活性の小さい両分（約５％）が保持された両分にお いて検出され、そしてこのピーク活性のサイズはタンパク質標準との比較により 約５５ｋＤであると推定される。これは５７ｋＤの標識化バンドがろうシンター ゼであるという追加の証拠を提供しそして、また、ろうシンターゼ活性が単一の ポリペプチドにより提供されることを証明する。

このような標識化および精製の技術を使用すると、ホホバろう／ンターゼタンパ ク質を実質的に精製されたタンパク質の調製物として回収することができ、そし てアミノ酸配列を得ることができる。同様に、ろうシンターゼ酵素の脂肪アルコ ール基質の疎水性の性質のために、他のろうシンターゼはそれらの固有の細胞に おいて膜に関連することがまた予測され、こうしてホホバろうシンターゼについ てここに記載する精製技術は、また、他のろうシンターゼタンパク質の精製され た調製物の回収において有用であることができる。

例えば、エウグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉＳ）は脂肪 アンルーＣｏＡリダクターゼおよび脂肪アンルーＣｏＡアルコールトランスアシ ラーゼ、またはろうシンターゼの酵素的作用によりろうを生産する。典型的には 、２４〜３２の炭素鎖の長さの範囲を有するろうはこの生物において検出される 。ホホバについて前述したように、エウグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）ろうシンター ゼ酵素をＣＨＡＰＳ／ＮａＣ１溶液により可溶化することができ、そして部分的 に精製されたろうシンターゼ調製物はブルーＡのクロマトグラフィーにより得ら れる。この方法において、ろうシンターゼ活性に関連する４１ｋＤのペプチドバ ンドが同定される。

アンネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種は、また、ろうエステル組 成物を生産することが知られているが、膜はよく定められない。ここに記載する ように、脂肪アシル−ＣｏＡアルコールトランスアノラーゼ、またはろうシンタ ーゼ活性はアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種において検出さ れる。ろうシンターゼ活性をＣＨＡＰＳ／ＮａＣ１の中で可溶化し、ブルーＡの カラムのクロマトグラフィーにより濃縮し、そしてサイズ排除クロマトグラフィ ーのような技術を使用してさらに精製することができる。これらの方法により、 ろうシンターゼ活性に関連するほぼ４５ｋＤのペプチドのバンドが部分的に精製 された調製物で得られる。

これらのろうシンターゼタンパク質の疎水性の性質は精製に対する挑戦を表すが 、実質的に精製されたタンパク質は種々の方法を使用して達成することができる 。例えば、連続的溶離の電気泳動法を利用する調製用電気泳動装置を使用して、 ブルーＡのカラムから得られる５７ｋＤのシンターゼタンパク質を精製すること ができる。この方法において、液体溶液の中に実質的に純粋な形態でろうシンタ ーゼタンパク質を含有するゲル画分を同定することができる。次いで、ろうシン ターゼタンパク質の試料を、必要に応じて、透析し、そして濃縮してアミノ酸の 配列決定技術のために便利なタンパク質源を得ることができる。

あるいは、ポリアクリルアミドゲルを展開し、そしてタンパク質を膜の支持体、 例えば、ニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオライド（ｐＶＤＦ）に 移すことができる。次いで、ろうシンターゼが他のタンパク質を実質的にを含有 しないように、ろうシンターゼタンパク質を含をするこれらの膜の切片を得るこ とができる。次いでろうシンタ−ゼタンパク質を膜から取り出し、そしてアミノ 酸配列が決定されるようにさらに操作することができる。本発明のろうシンター ゼタンパク質がニトロセルロースの膜への転移に劣るので、ＰＶＤＦは配列決定 のために好ましい。

こうして、ろうシンターゼのアミノ酸配列は、全タンパク質がらＮ−末端のアミ ノ酸領域を配列決定するか、あるいは化学的臭化シアンを使用する消化により所 望のタンパク質の断片を調製するか、あるいはプロテアーゼを使用する酵素的カ ッサバ潜在ウィルスにより決定される。有用であることができるプロテアーゼの 例は、トリプシンおよびエンドブロティナーゼＩｙｓＣ，ｇｌｕｃ、ＡｓｐＮお よびａｒｇＣを包含する。

次いで、この方法において得られたろうシンターゼタンパク質ＷＱこの分野にお いて知られている方法により精製し、そして配列決定することができる。次いで これらのペプチド配列をゲル単離技術、例えば、ＰｃＲ法およびｃＤＮＡおよび ゲノムのライブラリーのクローニングにおいて使用することができる。

ろうシンターゼの同一性を確証するための他の実験、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）の中のタンパク質の発現は、また、望ましいことがある。次いで、ろうシ ンターゼを脂肪アシルおよび脂肪アルコール基質にこのような細胞の中で作用さ ゼてろうエステルを生産させ、これらのろうエステルは種々の分析法により検出 することができる。宿主細胞がろうシンターゼのアルコール基質を含有しない場 合、活性は細胞抽出物をアッセイすることによって評価することができる。ある いは、ろうシンターゼタンパク質はろうシンターゼの核酸配列および商業的に入 手可能な翻訳キットを使用してｊｎ　ｖｉｔｒ□で調製することができる。ミク ロソームの膜調製物をｉｎ　ｖｉｔｒ＋）の翻訳試料に添加することは、膜の挿 入が作用に対して重要である場合、活性なろうシンターゼタンバク質を得るため に必要であることがある。他の試験は免疫学的アッセイを包含し、これにより候 補のタンパク質に対して特異的な抗体が調製され、そしてタンパク質調製物の中 のろうシンターゼ活性を阻害することが発見された。

こうして、ろうシンターゼ活性に関連するタンパク質について決定されたアミノ 酸配列を使用して核酸配列を単離して、ろうシンターゼタンパク質の同一性を確 証しかつ配列の転写および／または原核生物または真核生物の宿主細胞の中のタ ンパク質の発現を提供するすることが望ましい。

ろうシンターゼは膜結合タンパク質であるので、植物細胞の中で候補のタンパク 質を発現して活性を評価することが−望ましいことがある。エレクトロボレイン ヨンまたは一時的発現のための植物組織の衝撃はこの目的に有用であることがあ る。究極的には、この酵素により認識される基質を生産する植物の中の安定な植 物の発現は望ましい。ろうシンターゼ配列を使用する形質転換のためにターゲツ ティングした植物がこの酵素の脂肪アルコールおよび脂肪アシルのエステルの基 質を含有しない場合、植物抽出物を調製し、そしてこの抽出物にろうシンターゼ の基質を添加することによってろうシンターゼ活性についてアッセイすることが できる。ろうシンターゼ配列を使用して植物宿主を形質転換するための構成体お よび方法を、いっそう詳細に後述する。

本発明の核酸はゲノムまたはｃＤＮＡであることができ、そしてｃＤＮＡまたは ゲノムのライブラリーから単離するか、あるいは単離された植物ＤＮＡから直接 に単離することができる。いったんタンパク質が精製されおよび／またはそのタ ンパク質のアミノ酸配列が得られたとき、遺伝子配列を得る方法は当業者に知ら れている。

例えば、抗体を単離されたタンパク質に対して杯生させ、そして発現ライブラリ ーをスクリーニングすることができ、こうして植物のろうシンターゼタンパク質 またはその抗原性断片を生産しているクローンを同定することがモきる。あるい は、オリゴヌクレオチドをアミノ酸配列から合成し、そして核酸配列の単離にお いて使用することができる。オリゴヌクレオチドは核酸断片を発生するＰＣＨに おいて有用であり、次いでこの核酸断片を使用してｃＤＮＡまたはゲノムのライ ブラリーをスクリーニングすることができる。異なるアプローチにおいて、オリ ゴヌクレオチドを直接使用してノザンプロットまたはサザンブａントを分析して 、有用なプローブおよびこれらのオリゴヌクレオチドを使用してＣＤＮＡまたは ゲノムのライブラリーをスクリーニングできるハイブリダイゼーション条件を同 定することができる。　一本発明のろうシンターゼの核酸配列は、ホホバろうシ ンターゼタンパク質に相当する配列、ならびにホホバのタンパク質または核酸配 列から得ることができる配列を包含する。「に相当する」とは、核酸配列、ＤＮ ＡまたはＲＮＡを意味し、そしてホホバろうシンターゼタンパク質をエンコード する核酸配列またはその一部分、ホホバの胚の中のろうシンターゼの転写または 転写および翻訳（発現）を指令する前記エンコーディング配列に対して５′また は３′に見いだされる調節配列、ｃＤＮＡの中に存在しないイントロン配列、な らびに小胞体の中への挿入のために要求されることがあるが、成熟ろうシンター ゼ酵素の中に見いだされない前駆体の任意のリーダーまたはノグナルペプチドを エンコードする配列を包含する。

ホホバの配列またはタンパク質から「得ることができる」配列とは、ホホバろう シンターゼのアミノ酸配列から合成することができるか、あるいは異なる生物の 中で同定されることができ、そしてプローブとしてホホバろうシンターゼの核酸 配列を使用するか、あるいはホホバろうシンターゼタンパク質に対して調製され た抗体を使用して単離することができる所望のろうシンターゼタンパク質に関連 する核酸配列を意図する。

この方法において、これらの他のろうシンターゼの配列を同様に使用して、追加 の源からのろうシンターゼタンパク質に関連する核酸配列を単離することができ ることを理解できる。

核酸配列の単離のために、当業者によく知られているプラスミドまたはウィルス のベクターおよび技術を使用してｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーを調製す ることができる。所望の配列についてスクリーニングするために使用できる有用 な核酸のハイブリダイゼーションおよび免疫学的方法は、また、当業者によく知 られており、そして、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、　ＣＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９ ）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コール１乙 スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）に記載されている。

典型的には、核酸のプローブの使用から得ることができる配列は、標的配列と問 題のろうシンターゼ酵素をエンコードする所定の配列との間の６０〜７０％の配 列の同一性を示すであろう。しかしながら、５０〜６０％程度に少ない配列の同 一性をもつ長い配列をまた得ることができる。核酸のプローブは核酸配列の長い 断片であることができるか、あるいはまたより短いオリゴヌクレオチドのプロー ブであることができる。

より長い核酸断片をプローブとして使用するとき（約１００より大きい）、より 低いストリンノエンンイでスクリーニングして、プローブとして使用する配列か らの２０〜５０％の偏り（すなわち、５０〜８ｏの配列の相同性）を有する標的 試料から配列を得ることができる。オリゴヌクレオチドのプローブはろうシンタ ーゼ酵素をエンコードするする全体の核酸配列よりかなり短いが、少なくとも約 １０、好ましくは少なくとも約１５、より好ま］パは少なくとも約２０ヌクレオ チドであるべきである。より長い領域と反対により短い領域をを使用するとき、 より高い程度の配列の同一性が望ましい。こうして、相同的遺伝子を検出するた めのオリゴヌクレオチドのプローブをデザインするためにアミノ酸配列の同一性 が高い、酵素の活性を同定することが望ましいことがある。

所定の配列とのハイブリダイゼーションにより関係する遺伝子を単離できるかど うかを決定するために、配列を標識化して、典型的には放射性を使用して、検出 を可能とするが、他の方法を利用することができる。

標識化プローブをハイブリダイゼーション溶液に添加し、所望の核酸、ノザンプ ロットまたはサザンプロット（所望の源を相同性についてスクリーニングするた めに）を含有するフィルター゛、あるいはスクリーニングすべきｃＤＮＡまたは ゲノムのクローンを含有するフィルターとインキュベーションとインキュベーシ ョンする。ハイブリダイゼーションまたは洗浄の条件を変化させて、問題のプロ ーブに対するプローブのハイブリダイゼーションを最適化することができる。よ り低い温度およびより高い塩濃度はより離れて関係する配列のハイブリダイゼー ションを可能とする（低いストリンジエンシイ）。バックグラウンドのハイブリ ダイゼーションが低いストリンジエンシイの条件下に問題である場合、温度をハ イブリダイゼーションまたは洗浄工程において上昇させることができ、および／ または塩含量を低下させて特定のハイブリダイゼーションする配列の検出を改良 することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は、Ｂｅ１ｔｚら （Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ　（１９８３）１００：２６６ −２８５）に記載されているように、プローブの推定された溶融温度に基づいて 調節することができる。

有用なプローブおよび適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は前述した ように同定されると、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーを標識化配列および 最適化された条件を使用してスクリーニングする。

ライブラリーをまず固体の寒天培地上にプレートし、そしてＤＮＡを適当な膜、 通常二１０セルロースまたはナイロンのフィルター上にリフトする。次いで、こ れらのフィルターを標識化プローブとハイブリダイゼーションさせ、そして前述 したように洗浄して関係する配列を含有するクローンを同定する。

免疫学的スクリーニングのために、ウサギまたはマウス（または他の適当な小さ い動物）に精製したタンパク質を注射することによって、ホホバろうシンターゼ に対する抗体を調製する。抗体を調製する方法は当業者によく知られており、そ して抗体の生産において特殊化されている会社も利用可能である。モノクローナ ル抗体ま”たはポリクローナル抗体を生産できるが、典型的にはポリクローナル 抗体は遺伝子の単離のためにいっそう有用である。

所望の植物種をスクリーニングするために、ウェスタン分析を実施して、ホホバ ろうシンターゼに対する抗体と交差反応する、関係するタンパク質が所望の植物 種の粗製の抽出物の中に存在することを決定する。

これは、ニトロセルロースを使用して、植物の抽出物のタンパク質を膜上に固定 化し、電気泳動を実施し、そして抗体とインキュベーションすることによって達 成される。ナイロンフィルター上の抗体／タンパク質複合体を検出するための多 数の異なる系が入手可能であり、これらは抗体および第２抗体／酵素の接合体系 の放射線標識化を包含する。入手可能な系のいくつかは、０ｂｅｒｆｅｌｄｅｒ 　（Ｆｏｃｕｓ　（１９８９）ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ、１１：１−５）に記載されている。初期の実験が関係するタンパク質の 検出に失敗した　。

場合、他の検出系およびブロッキング剤を利用することができる。交差反応性が 観察されるとき、所望の植物種を表す発現ライブラリーをスクリーニングするこ とによって、関係するタンパク質をエンコードする遺伝子を単離することができ る。発現ライブラリーは種々の商業的に入手可能なベクター、例えば、ラムダｇ ｔｌｌの中で、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（前掲）に記載されているように実施する ことができる。

ＤＮＡのハイブリダイゼーションまたは免疫学的スクリーニング技術を使用して 前述したように同定されたクローンを次いで精製し、そしてＤＮＡをことが知ら れているを使用して単離しそして分析する。この方法において、クローンは関係 するろうシンターゼタンパク質をエンコードすることが評価される。ホホバろう シンターゼを使用したのと同一の方法で「新しい」ろうシンターゼの使用により 他のろうシンターゼを得ることができる。

当業者は認識するように、本発明のろうシンターゼの核酸配列は部位特異的突然 変異またはＰＣＨの標準の技術を使用して修飾することができるか、あるいは配 列の修飾は合成核酸配列の生産において達成することができる。これらの修飾さ れた配列は、また、本発明のろうシンターゼの核酸配列と考えられる。例えば、 コドンにおけるゆらぎ位置を核酸配列が同一のアミノ酸配列をエンコードするよ うに変化させることができるか、あるいはコドンを保存的アミノ酸の置換が生ず るように変更することができる。いずれの場合においても、ペプチドまたはタン パク質は所望の酵素活性を維持し、こうして本発明の一部分と考えられる。

本発明のろうシンターゼ酵素の核酸配列は、ゲノムのＤＮＡ％ｃＤＮＡ、ｍＲＮ Ａから誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡの配列であるか、あるいは全体または一部 分が合成されていることができる。遺伝子の配列は、例えば、適当な源からゲノ ムのＤＮＡを単離し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して問題の 配列を増幅およびクローニングすることによって、クローニングすることができ る。あるいは、遺伝子の配列は、完全にまたは部分的に、ことに植物が好ましい 配列を提供しようとする場合において、合成することができる。こうして、所望 の構造遺伝子のすべてまたは一部分（ろうシンターゼタンパク質をエンコードす る遺伝子の部分）は選択した宿主が好むコドンを使用して合成できる。

宿主が好むコドンは、例えば、所望の植物種の中で発現されたタンパク質におい て最も頻繁に使用されているコドンから決定することができる。

ろうシンターゼタンパク質に関連する核酸配列は多数の用途を見いだす。例えば 、プローブとして使用することができるか、あるいは宿主細胞の中のろうシンタ ーゼタンパク質の発現を提供する組み換え構成体を調製することができる。意図 する用途に依存して、構成体は全体のろうシンターゼまたはその一部分をエンコ ードする配列を含有することができる。例えば、ろうシンターゼの重要な領域、 例えば、活性部位を同定できる。こうして、所望のろうシンターゼ活性について 必要なアミノ酸をエンコードするろうシンターゼ配列の部分のみを含有する他の 構成体を調製することができる。

本発明のろうシンターゼ配列の発現のために有用である系は、原核生物細胞、例 えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、酵母菌細胞、および植物細胞を包含し、雄管ま たは非雄管の植物細胞は所望の宿主である。この方法において、ろうシンターゼ タンパク質は、他の研究、例えば、ろうシンターゼタンパク質の反応特性への特 定の突然変異の効果を分析するためのエンコーディング配列の部位特異的突然変 異誘発を可能とするために、ろうシンターゼタンパク質を生産することができる 。

本発明のろうシンターゼをエンコードするＤＮＡ配列を、種々の方法で外来ＤＮ Ａ配列と組み合わせることができる。「外来Ｊ　ＤＮＡ配列とは、ろうシンター ゼ配列に接合して自然に見いだされないＤＮＡ配列、例えば、ろうシンターゼ配 列に接合して自然に見いだされない同一生物からのＤＮＡ配列を意味する。ろう シンターゼエンコーディング配列を利用するセンスおよびアンチセンスの両者の 構成体が考えられ、ここでセンス配列は宿主細胞の中のろうシンターゼの発現の ために使用することができ、そしてアンチセンス配列は標的生物により自然に生 産される相同的ろうシンターゼタンパク質の内因性レベルを減少するために使用 できる。さらに、本発明のろうシンターゼの遺伝子配列はろうシンターゼに通常 関連する配列のすべてまたは一部分、例えば、調節または膜ターゲツティング配 列と組み合わせて外来宿主細胞の中で使用できる。

その成分の部分において、ろうシンターゼをエンコードするＤＮＡ配列は、転写 の５′→３′の方向において、宿主細胞の中で転写および翻訳を促進することが できる翻訳開始コントロール領域、ろうシンターゼをエンコードする核酸配列お よび転写終結領域を有する組み換え構成体において組み合わされる。宿主に依存 して、調節領域は変化し、そしてウィルス、プラスミドまたは染色体の遺伝子な どからの領域を含むことができる。原核または真核の微生物、とくに単細胞の宿 主の中の発現のために、広範な種類の構成的または調節可能なプロモーターを使 用することができる。微生物の中の発現は植物酵素の準備された源を提供するこ とができる。記載されてきている転写開始領域の中には、細菌および酵母菌の宿 主、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ）　、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓＬ サツカロミセス・セｌ／ビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）、トリプトファンＥなどからの領域がある。

大部分について、組み換え構成体は植物の中で機能的な調節領域を含み、このよ うな調節領域はろうシンターゼ遺伝子を発現させて機能的なろうシンターゼタン パク質を生産させる。植物のろうシンターゼをコードするオーブンリーディング フレームまたはその機能的断片はその５゜末端において転写開始領域、例えば、 ろうシンターゼの構造遺伝子に対して５′上流に自然に見いだされる野生型配列 に接合されるであろう。

構造遺伝子の広範な種類の構成的または調節可能な、例えば、誘導可能な発現を 提供する、天然の植物遺伝子からの多数の他のプロモーター領域は入手可能であ る。

天然の植物遺伝子からの配列に加えて、他の配列は植物の中の構成的遺伝子の発 現、例えば、癌腫ｆｆｌ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）遺伝子に関連する調節 領域、例えば、ノバリンンンターゼ（Ｎｏｓ）、マンノビンシンターゼ（Ｍａｓ ）、またはオクトピンシンターゼ（Ｏｃｓ）の遺伝子に関連する領域を提供する ことができる。また、ウィルス遺伝子の発現をコントロールする領域、例えば、 カリフラワーのモザイク病ウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ領域は有 用である。用語構成的は、ここにおいて使用するとき、遺伝子がすべての細胞の 型において同一レベルで発現されることを必ずしも示さないが、遺伝子が広い範 囲の細胞の型において発現されるが、存在量の多少の変動をしばしば検出可能で あることを示す。他の有用な転写開始領域はある種の組織において、あるいはあ る種の成長条件、例えば、ナビン、種子または葉のＡＣＰＳＲＵＢ　Ｉ　ＳＣＯ の小さいサブユニットなどから条件下に転写を優先的に提供する。

ろうシンターゼタンパク質の発現を植物宿主において望む態様において、完全な 植物のろうシンターゼの遺伝子のすべてまたは一部分の使用が望ましいことがあ る、すなわち、構造遺伝子配列と一緒に５′非コーデイング領域（プロモーター ）および３°下流の非解読領域を使用することができる。異なるプロモーター、 例えば、問題の植物宿主に固有のプロモーターまたは修飾されたプロモーター、 すなわち、１つの遺伝子源から誘導された転写開始領域および異なる遺伝子源か ら誘導された翻訳開始領域を有するプロモーターまたは増強されたプロモーター 、例えば、二重３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターを望む場合、標準の技術を使用し て配列を一緒に接合することができる。

植物においてろうシンターゼの発現を提供するＤＮＡ構成体は広範な種類の植物 生命、とくにろうシンターゼ酵素の脂肪アンルへＣｏ八基質を生産する植物、例 えば、ブランカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）とともに使用することができる。問題の他 の植物は、望ましくは脂肪アノル基質、例えば、中程度または長い鎖の脂肪アシ ル分子を生産し、そして菜種（Ｃａｎｏｌａ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）、ヒマワリ 、ベニバナ、ワタ、クツエア（Ｃｕｐｈｅａ）、ダイズ、ナンキンマメ、ココナ ツおよびギネアアブラヤノ、およびトウモロコノを包含するが、これらに限定さ れない。

ろうシンターゼ酵素の脂肪アシル基質に関すると、ホホバ以外の種子植物は大量 の脂肪アルコールを生産することは知られていないが、少量のこの基質はろうシ ンターゼ酵素にとって利用可能である。したがって、本発明のろうシンターゼの 構成体と組み合わせて、宿主細胞の中に存在する脂肪アシル分子から脂肪アルコ ールを生産する能力を標的宿主細胞に与えることが望ましい。例えば、植物の脂 肪アシルリダクターゼおよび植物細胞の中でリダクターゼ酵素の発現を提供する 方法は、同時係属米国特許出願第０７／７６７．２５１号に記載されている。ホ ホバリダクターゼの核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列は第１図に記載され ている。こうして、ろうシンターゼおよびリダクターゼの両者のタンパク質を宿 主植物細胞に提供することによって、ろうエステルを脂肪アルコールおよび脂肪 アシルの基質から生産することができる。

ホホバリダクターゼに加えて、他の生物からのりダクターゼ酵素は本発明のろう シンターゼと組み合わせて有用であろう。リダクターゼ酵素の他の潜在的な源は 、エウグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ ｅｒ）、マイクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ある種の昆虫および海 の生物、ろうエステルを含有することが知られている特殊化された哺乳動物また は鳥類の組織、例えば、ウソ属の動物のマイボーム腺または鳥類の尾腺を包含す る。他の潜在的源は、脂肪アルコールあるいは、ろうシンターゼが存在する場合 、ろうエステルを生産するそれらの能力により同定できる。

ろうシンターゼおよびリダクターゼの配列は同一の形質転換の事象の間に得るこ とができるか、あるいは一方はろうシンターゼ構成体を有しそして他方はりダク ターゼ構成体を有する、２つの異なるトランスジェニック植物の系統を種々の構 成体を使用して形質転換により生産することができる。次いで、これらの植物を 、既知の植物品種改良技術を使用して交雑して、ろうエステル生産物の生産のた めのろうシンターゼおよびリダクターゼを含有する植物を得ることができる。

ろうエステルの生産に導く応用のために、種子成熟の間に調節声れた遺伝子から 得られる５゛上流の非コーディング領域、ことに植物の肝組織の中で優先的に発 現されるもの、例えば、ＡＣＰから誘導される領域およびナビン調節は望ましい 。種子組織の中で優先的な発現を提供する。

すなわち、他の植物部分の中で検出不可能である転写開始領域は、他の植物部分 における遺伝子生産物の崩壊的または悪い効率を最小にするために、ろうエステ ルの生産のために望ましいと考えられる。さらに、このような植物の種子を収穫 しそしてこれらの種子の脂質の貯蔵物を回収してろうエステルの準備された源を 得ることができる。こうして、ここに記載したように、ろうシンターゼ構成体を 使用する形質転換が存在しないと、種子脂質の貯蔵物としてろうエステルを生産 することが知られていない脂肪種子植物の中で、新規な種子生産物を生産するこ とができる。

このような「種子特異的プロモーター」は、米国特許出願第０７／１４７．７８ １号、１９８８年１月２５日出願（現在米国特許出願第０７１５４２．８３４号 、１９８１年８月８出願）、および米国特許出願第０７／４９４．７２２号、１ ９９０年３月１６出願、発明の名称「初期の種子発育において優先的に発現され る新規な配列およびそれ関係する方法」　（これらの同時係属米国特許出願のす べてをここに引用によって加える）の教示に従い、生産しそして使用することが できる。

調節転写停止領域を本発明の組み換え構成体の中に同様によく設けることができ る。転写停止領域は、植物のろうシンターゼをエンコードするＤＮＡ配列または 異なる遺伝子源から誘導される便利な転写停止領域、ことに自然に転写開始領域 に関連する転写停止領域により得ることができる。転写停止領域は、その停止領 域が誘導される構造遺伝子に対して３′の少な（とも約Ｑ、５ｋｂ、好ましくは 約１〜３ｋｂの配列を含有するであろう。

宿主細胞の中にＤＮＡ発現構成体を導入する方法に依存して、他のＤＮＡ配列を 必要とすることがある。重要なことには、本発明は双子葉および単子葉の種に同 様に適用可能であり、そして新しいおよび／または改良された形質転換および再 生の技術に容易に適用可能である。

組み換え構成体を開発するとき、通常、細菌の宿主、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）の中で複製することができる便利なりローニングベクターの中に、構成体 の種々の成分またはそれらの断片を挿入する。文献に記載されてきている多数の ベクターが存在する。各クローニング後、プラスミドを単離し、そしてそれ以上 の操作、例えば、制限、新しい断片の挿入、結合、欠失、挿入、リセクションな どにかけて、所望の配列の成分を調整することができる。いったん構成体が完成 すると、次いでそれを宿主細胞の形質転換の方法に従いさらに操作するために適 当なベクターの中に移すことができる。

通常、宿主の中の発現のために必要な調節領域を有しかつ形質転換細胞の選択を 提供する構造遺伝子を、組み換え構成体の中に含める。この遺伝子は、細胞障害 性因子、例えば、抗生物質、重金属、毒素などに対する耐性、両栄養性宿主にプ ロトトロピーを提供する相補性、ウィルスの免疫性などを提供することができる 。同様に、色の変化により同定可能な化合物、例えば、ＧＵＳまたはルミネセン スを生成する酵素、例えば、ルンフェラーゼをエンコードする遺伝子は有用であ る。異なる宿主種の数に依存して、発現構成体またはその成分を導入し、１また は２以上のマーカーを使用することができ、ここで選択のために異なる条件を異 なる宿主について使用する。

ろうシンターゼ配列の転写を提供する配列に加えて、本発明のＤＮＡ構成体を、 また、追加の１または２以上の遺伝子の発現のために提供することができ、その タンパク質生産物はろうシンターゼと組み合わせて作用して価値ある最終生産物 を生産することができる。例えば、前述したように、ろうエステルを形質転換さ れた宿主の中で生産することができるように、ろうシンターゼおよび脂肪アシル リダクターゼを発現させるＤＮＡ構成体は、本発明において考えられる。さらに 、変化する炭素鎖の長さおよび飽和度を有する異なるろうエステルの生産は望ま しく、そして変化する鎖長の脂肪アルコールまたは脂肪アシルの基質を有する宿 主植物を形質転換することによって得ることができる。このような植物は、例え ば、公開された国際特許出願ＰＣＴ　ＷＯ９１／１６４２１号に記載されている 方法により得ることができ、前記特許出願は種々のチオエステラーゼ遺伝子およ びこのような遺伝子を使用して、形質転換された植物の中で変化する鎖長を有す る脂肪アシル基質を生産する方法を記載している。

さらに、脂肪種子植物宿主の中のろうエステルの生産を最適化するために、この ような植物の種子の中で通常生産されるトリアシルグリセリドの生産を減少する ことが好ましいことがある。これを達成する１つの方法は、このプロセスに対し て重要な遺伝子をアンチセンスとすることであるが、ろうエステルの生産につい ては不必要である。このような遺伝子の標的は、シアツルグリセロールのアシル トランスフェラーゼ、およびトリアシルグリセロールの合成を触媒する他の酵素 を包含する。さらに、ろうエステルを栄養源として分解するために使用できる、 例えば、ホホバまたは他のろうエステル生産性生物から単離することができる酵 素をもつ脂肪種子植物を得ることが望ましいことがある。この方法において、種 子植物宿主の中のろうエステルの最大の生産を達成できる。

ここに記載する方法において生産されるろうエステルは、ホホバからのろう抽出 技術を使用するか、あるいは種々の脂肪種子作物から油虫産物を得るために使用 される種々の生産方法により収穫することができる。

こうして得られるろうは、製剤、化粧品、洗浄剤、プラスチック、および潤滑油 を包含する、多数の工業的使用に使用される。用途はろうエステル成分の鎖長お よび飽和度に依存して変化する。例えば、炭素鎖の各々の中に二重結合を有する 長鎖ろうは室温において液体であるが、飽和炭素鎖成分を有するろうは、ことに 飽和炭素鎖がより長い炭素鎖である場合、室温において固体である。

形質転換の方法は本発明にとって重要ではない、植物の形質転換の種々の方法は 現在利用可能である。より新しい方法を作物の形質転換に利用可能であるので、 それらを以後直接適用することができる。例えば、癌腫菌（Ａｇｒｏｂ’ａｃｔ ｅｒｉｕｍ）の感染を自然に受け易い多数の植物は、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ）仲介形質転換の３成分または２成分から成るベクターを介して首尾 よく形質転換することができる。宿主植物細胞に核酸配列を転移させるとき有用 な他の配列は、植物病原性ウィルスまたは植物輸送可能な要素から誘導すること ができる。

さらに、種々の単子葉および双子葉の植物種の形質転換を可能とするマイクロイ ンノエクノヨン、ＤＮＡ粒子衝撃、エレクトロポレインヨンの技術が開発された 。

癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を植物の形質転換のために使用するとき 、一方または両方の末端がＴ−ＤＮＡにより境界された所望の核酸配列、とくに 左または右の境界領域、よりとくに少なくとも右の境界領域を有することが望ま しいであろう。これらの境界領域は、また、他の形質転換法を使用するとき、有 用であろう。

癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはりゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ ｓ）の配列を植物の形質転換のために利用する場合、宿主の中に存在するＴｉ− またはＲｉ−プラスミド上のＴ−ＤＮＡとの相同的組み換えのために癌腫菌（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主の中に導入することができるベクターを使用で きる。組み換えのためのＴｉ−またはＲｉ−を含有するＴ−ＤＮＡをアーム化す る（主層の形成を引き起こすことができる）か、あるいはンスアーム（ｄ　ｉ　 ｓ　ａ　ｒｍ）化する（主層の形成を引き起こすことができない）ことができ、 後者は植物宿主細胞へのＤＮＡの転移のために必要なトランスフェクション因子 をエンコードするｖｉｒ遺伝子の機能的補体が形質転換された癌腫菌（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中に存在するかぎり許容できる。アーム化癌腫菌（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を使用すると、正常の植物細胞（それらのい（つか は所望の核酸配列を含有する）と、腫瘍形成遺伝子の存在のために主層を形成す ることができる植物細胞との混合物を生成することができる。所望の核酸配列を 含有するが、腫瘍遺伝子を欠如する細胞を混合物から選抜し、こうして正常のト ランスジェニック植物を得ることができる。

癌１！Ｉｔ！Ｉ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を宿主植物細胞の形質転換のた めのベヒクルとして使用する好ましい方法において、Ｔ−ＤＮＡ境界領域により 境界された発現または転写の構成体を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）および癌腫菌（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中で複製することができる広い宿主範囲のベクタ ーの中に挿入し、文献に記載されて０る広し１宿主範囲のベクターが存在する。

ｐＲＫ２またはその誘導体が普通に使用される。参照、例えば、Ｄｉｔｔａら（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　（１９８０ ）　７７：７３４７−７３５１）および欧州特許出願公開（ＥＰＡ）第０　１２ ０　５１５号（これらの開示をここに引用によって加える）。あるいは、別々の 複製配列を含有するベクターの中に植物の中で発現すべき配列を挿入することが でき、前記複製配列の１つは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中で、そして他のもの： ′１癌１１１１１（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中でベクターを安定イヒす る。

参照、例えば、ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ　（Ｐｌａｎｔ　Ｍ ｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９９０）１４：２６９−２７６）ここでｐＲ４ＨＲＩ　（ Ｊｏｕｒｎｉｎら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、（１９８５）２０１　：　３ ７０−３７４）複製起点を利用し、そして宿主癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ）細胞において植物の発現ベクターの安定性を増加する。

癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中で複製すること力吃できる、前述の ようなベクターを利用することは好ましい。この方法１こおＬλで、プラスミド の組み換えは必要ではなく、そして宿主癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｖｉｒ領域は植物宿主細胞へのＴ−ＤＮＡ境界配夕１１特表千７−５０１２２１ 　（１１） の転移を必要とする。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ｉｔ胞の形質転換のために 、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換法を使用することができる 。１つのこのような方法は、例えば、Ｒａｄｋｅら（Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇ ｅｎｅｔ、（１９８８）７５：６８５−６９４）により記載されている。

さらに、 本発明をここで一般に記載したが、以下の実施例を参照すると本発明はいっそう よく理解されるであろう。これらの実施例は例示のみを目的としそして、特記し ない限り、本発明を限定しない。

衷塵男 実施例１−　ろうシンターゼのアッセイミクロソームの膜調製物または可溶化さ れたタンパク質調製物の中のろうシンターゼ活性についてアッセイする方法を記 載する。

Ａ、放射線標識化材料 ろうシンターゼのアッセイにおいて一般に使用される基質［１−”Ｃ］バルミト イル−ＣｏＡを、アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（イリノイ州アーリントン ハイツ）から購入した。他の鎖長基質を合成して、鎖長規格研究を実施した。長 鎖［１−”Ｃ］脂肪アシル（比活性５ｌ−５６Ｃｉ／ｍｏ＋）、すなわち、１１ −シス−エイコセン酸、１３−シス−トコセン酸および１５−シス−エイコセン 酸を、カリウム［＋４０］ンアニドを対応するアルコールメシレートと反応させ 、次いでアルコールニトリルを塩基で遊離脂肪酸に加水分解することによって調 製する。

遊離脂肪アシルをエーテル性ジアゾメタンでそれらのメチルエステルに変換し、 そして調製用硝酸銀薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により精製した。脂肪酸 メチルエステルを遊離脂肪酸に加水分解し戻す。放射化学的精製を３つのＴＬＣ 法により評価する：通常の相シリカＴＬＣ。

硝酸銀ＴＬＣ，およびＣ１８逆相ＴＬＣ０これらの３つの方法により測定された 放射化学的純度は９２〜９８％であった。長鎖［１−１４ＣｌアノルーＣｏＡを 、対応する［１−１４ＣＩ遊離脂肪酸から、ＹｏｕｎｇおよびＬｙｎｅｎ　（Ｊ 、’　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９６９）２４４　：３７７）の方法により、１ ０Ｃ４／ｍｏｌの比活性に調製する。［１−”Ｃ〕ヘキサデカナールを、［１− １４Ｃｌヘキサデカン−１−オールの重りルム酸塩の酸化により、Ｐｌｅｔｃｈ ｅｒおよびＴａ　ｔ　ｅ　（Ｔｅ　ｔ、　Ｌｅｔ　ｔ、（１９７８）１６０１− １６０２）の方法の微小規模の修飾（こより調製する。生成物を調製用シリカＴ ＬＣにより精製し、そして使用するまでヘキサン溶液として一７０℃で貯蔵する 。

４０ｕＭ（１）［１−１４Ｃ］　７ンルーＣｏＡ　（通常）（ルミトイルーＣｏ Ａ。

比活性５．１〜５．６Ｃｉ／ｍｏｌ）および２００μＭのオレイルアルフ−ル ペーノヨンすることによって、ミクロソームの膜調製物の中でろうシンターゼ活 性を測定する。インキュベーション混合物は、また、２０％Ｗ／Ｖグリセロール 、１ｍＭ　ＤＴＴ，０．５Ｍ　ＮａＣＩを含有し、そして２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 　（４−　［２−ヒドロキシエチル〕ー１ーピベラノンエタンースルホン酸）で 緩衝化する。ＨＥＰＥＳを、ここでおよび以後言及するように、ｐＨ７．５に調 節したＩＭの原溶液力）ら添加する。

基質混合物をガラスのバイアルの中で調製物し、使用直前１ニオレイルアルコー ルを添加し、そして試料に添加する。インキュベーションを３０℃において１時 間実施する。アッセイ管を氷上に配置し、そして直ちに０．２５ｍｌのイソプロ パツール　酢酸（４：１　ｖ／ｖ）を添加することによって、このアッセイを停 止する。非標識ろうエステル（Ｏｌｍｇ）およびオレイルアルコール（０．１ｍ ｇ）をキヤＩＪアーとじて添加する。４ｍｌのへキサン／イソプロパツール（３ ：２　ｖ／ｖ）を停止したアッセイに添加する。試料を渦形成し、２ｍｌの水性 硫酸ナトリウム溶液（６．６に　Ｖ　／　Ｖ　）を添加し、そして試料を再び渦 形成す可溶化されたろうシンターゼ活性をアッセイするために、タンパク賀の再 構成を必要とする。再構成は、リン脂質（シグマ　Ｐ−３６４４、約４０％Ｌー ホスファチジルコリン）を０．７５％ＣＨＡＰＳ可溶化試料を２．５ｍｇ／ｍｌ の濃度で添加し、次いで洗浄剤をＣＭＣ以下の０８３％にフィルターすることに よって達成される。活性の再構成は、リン脂質のベヒクルの中へのろうシンター ゼの組み込みに基づいて再開される。認識されるように、再構成後に検出される ろうシンターゼ活性の量は多数の因子により影響を受けることがある（例えば、 リン脂質／タンパク質の比およびろうシンターゼタンパク質の物理的状態（例え ば、凝集または分散した）。

Ｄ．アッセイ生産物の分析 ミクロソームの膜調製物のろうシンターゼ活性または可溶化されたろうシンター ゼ活性の生産物の分析のために、２つのプロトコルが開発された。一方のプロト コル（「広範なアッセイ」と下に記載する）はいっそう時間を消費するが、より 高度に定量的な結果を生ずる。他方のプロトコル（「迅速なアッセイ」」と下に 記載する）は、また、ろうシンターゼ活性の測定を提供するが、より速く、より 便利であり、そして定量的に劣る。

１、広範なアッセイ、硫酸ナトリウムを添加しそして試料を渦形成した後、上部 の有機相を除去し、そして下の水性相を４ｍｌのヘキサン／イソプロパツール（ ７：２　ｖ／ｖ）で洗浄する。有機相をプールし、そして窒素雰囲気下に蒸発乾 固する。脂質残留物を小さい体積のヘキサンの中に再呼濁させ、そしてアリコー トを液体ノンチレーンヨンカウンターにより放射能についてアッセイする。試料 の残部を標識化したクラスのＴＬＣ分析のために使用することができ、これによ り生産された合計のろうの測定値を得ることができる。

脂質のクラスの分析のために、試料をシリカのＴＬＣプレートに適用し、そして このプレートをヘキサン／ノエチルエーテル／酢酸（８０：２０　：　１　ｖ／ ｖ／ｖ）の中で展開する。原点における脂質のクラス、主としてろうエステル、 遊離脂肪酸、脂肪アルコール、および極性の脂質の間の放射能の分布を、ＡＭＢ ＩＳ放射線分析画像形成システム（ＡＭＢＩＳ　システム・インコーホレーテッ ド、カリフォルニア州すンディエゴ）を使用して測定する。必要に応じて、個々 の脂質クラスをそれ以上の分析のためにＴＬＣプレートから回収することができ る。メタノールの中で展開したＣ１８プレートを使用する逆相ＴＬＣ系は、また 、分析に使用された。

２、迅速なアッセイ：硫酸ナトリウムを添加しそして試料を渦形成した後、既知 の百分率の有機相を除去し、そして液体シンチレーノヨンカウンターにより計数 した。この計算を使用して有機相の中の合計の計数を推定する。次いで有機相の 他の部分を取り出し、窒素雰囲気下に乾燥し、ヘキサン中に再溶解し、そしてＴ ＬＣ上にスポツティングし、そして詳細したアッセイについて記載したように展 開しそして走査する。この方法において、水の中に組み込まれた合計の計数の百 分率を決定する。

実施例２−　ろうシンターゼタンパク質の放射線標識化放射線標識化［１−”Ｃ ］バルミトイル−ＣｏＡ　（アマーソヤム）を、ろうノンターゼ調製物、可溶化 されたまたはミクロソームの膜の画分に、５μｍの標識／４０μｍのタンパク質 試料の比で添加する。さらに処理する前に、試料を室温において少なくとも１５ 分間インキュベーションする。ＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析のために、試料をＳＤＳ試 料緩衝液で直接処理し、そして電気泳動のためにゲル上に負荷する。

特表千７−５０１２２１　（１２） 実施例３−　ろうシンターゼ活性を特性決定する他の研究Ａ９種子の発育および ろうシンターゼ活性のプロフィル胚の発育をカリフォルニア州ディビスにおいて ５つの植物について２回夏にわたって追跡した。胚の新鮮な乾燥重量は、約８０ 日から約１３０日にかなり定常速度で増加することが発見された。脂質の抽出に おいて、胚の新鮮な重量が約３００．ｍｇ（約８０日）に到達するとき、脂質重 量／乾燥重量の比は５０％の最大レベルに到達する。

ろうシンターゼ活性を実施例１に記載するように発育する胚において測定した。

ホホバ種子の胚は１または２以上の阻害因子源であることが決定されたので、種 子の外殻を除去した後、貯蔵のために胚を液体窒素の中で一７０℃において凍結 した。

細胞不含ホモジネートまたは膜の画分において測定されたろうシンターゼ活性に ついての発育のプロフィルは活性の大きい誘発を示し、この活性は開花期後はぼ １１０〜１１５日にピークとなる。こうして、開花期後約９０〜１１０日の間、 すなわち、ろうシンターゼ活性が高く、脂質の堆積が最大のレベルに到達してい す、そして種子外殻は容易に除去されるない期間の間に、酵素学的研究のために 胚を収穫した。ろうシンターゼ活性の増加の最高速度は開花期後８０〜９０日の 間に見られる。

こうして、ろうシンターゼタンパク質のシンターゼの割合が最大と推定されると き、ｃＤＮＡライブラリーの構成のための胚を開花期後約８０〜９０日に収穫し た。相応して、ろうシンターゼをエンコードするｍＲＮＡのレベルはこの段階に おいて最大であると推定されるであろう。

Ｂ、基質の特異性 変化する炭素鎖の長さおよび不飽和度を有するアンルーＣｏＡおよびアルコール の基質を、ろうシンターゼ活性を存するミクロソームの膜の画分に添加して、ホ ホバろうシンターゼにより認識される基質の範囲を決定した。ろうシンターゼ活 性を実施例１に記載するように測定し、アンルの特異性は８０μＭのアルコール 基質および１００μＭの放射線標識化オレイルアルコールを使用して測定した。

アルコールの特異性は１００μＭのアルコールおよび４０μＭの放射線標識化エ イコセノイルーＣｏＡを使用して測定した。これらの実験の結果を下表いを示す 。

表１ ホホバろうシンターゼのアシルおよびアルコール基質の特異性基質　ろうシンタ ーゼ活性 （ｐｍｏ　Ｉ／分） 上の結果が証明するように、ホホバろうシンターゼは広い範囲の脂肪アノルーＣ ｏＡおよび脂肪アルコール基質を利用する。

さらに、バルミトイル−ＣｏＡ、バルミトイル−ＡＣＰおよびＮ−アセチル−８ −パルミトイルノステアミンをアシル基質として使用して、種々のアシル−チオ エステル基質に対するろうシンターゼ活性を同様に試験した。最大の活性はアル コール基質を使用して観察された。有意な活性（アンルーＣｏＡを使用したそれ の約１０％）は、Ｎ−アセチル−５−パルミトイルンステアミンを使用して検出 可能であった。

種々のスルフヒドリル剤をろうシンターゼ活性へのそれらの作用についてスクリ ーニングした。有機水銀化合物は活性を強く阻害することが示された。ヨードア セトアミドおよびＮ−エチルマレアミドは効果が非常に少なかった。パラ−ヒド ロキシ水銀ベンゾエートにより阻害が観察されたが、この阻害はＤＴＴの引き続 く添加により逆転することができた。これらの結果が証明するように、バラヒド ロキシ水銀ベンゾエートによる阻害は必須のスルフヒドリル基のブロッキングを 含む。

Ｄ、サイズ排除クロマトグラフィー カラム（１，５ｃｍｘ４６ｃｍ）にセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）−２０ ０（、ファーマシア）、サイジングの範囲・５，０００〜２５ｏ、ｏｏｏダルト ン）を詰め、そして０．５ＭのＮａＣｌを含有するカラム緩衝液（２５ｍＭ　Ｈ ＥＰＥＳ、２０％グリセロール、０．７５％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で 平衡化する。ブルーＡのカラムからの単一の１．５Ｍ　ＮａＣｌの溶離からのほ ぼ２ｍｌのプールした濃縮物（実施例４Ｃ参照）を負荷し、そして０．５ｍｌ／ 分でカラムを展開する。溶離された画分を、実施例１に記載する再構成のプロト コルに従い、ろうシンターゼ活性についてアッセイした。ろうシンターゼ活性は 、ボイド画分で開始しそして展開の残部を通じて減少する広いピークとして出現 する。ろうシンターゼ活性を有する両分の一部分を１−目Ｃ１６：０−ＣｏＡ　 （０，０１７８μＭ）で室温において１５分間処理する。

ＳＤＳを２％に添加し、そして試料をＳＤＳ　ＰＡＧＥゲルに負荷する。

電気泳動後、ゲルをプロプロット（Ｐｒｏｂ’１ｏｔｔ）（アプライド・パイオ システムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；カリフォルニア州フォ スターンティー）にプロットし、そして乾燥したプロット膜をオートラジオグラ フィーにより分析した。あるいは、プロットを放射能について自動化走査システ ム（ＡＭＢ　Ｉ　Ｓ　；カリフォルニア州すンディエゴ）を使用して走査するこ とができる。この方法において、５７ｋＤの放射線標識化バンドは分析した画分 の中でろうシンターゼ活性をもって足跡を残すことが観察される。

さらに、ろうシンターゼ活性に関連するタンパク質を第２サイズの排除マトリッ クスのクロマトグラフィーにより特性決定する。ろうシンターゼ活性を含有する シル−Ａのクロマトグラフィーからの１０×濃縮１゜５Ｍ　ＮａＣ１溶離の画分 （１００μ＋）（１，０Ｍ　ＮａＣｌ溶離工程後）を、スバロース１２　ＨＲＩ Ｏ／３０カラム（ファーマシア、ニュージャーシイ州ピッツバーグ）のクロマト グラフィーにかけ、そして分子量標準（分子量ＧＦ−ＴＯおよび分子量ＧＦ−１ ０００；シグマ）で目盛り定めしたカラムの急速タンパク質液体クロマトグラフ ィー（ＦＰＬＣ）により分析した。回収されたろうシンターゼ活性のほとんど５ ３％がボイド画分の中に見いだされるが、容易に検出可能な活性は目盛り定め曲 線に従い約５５ｋｄにおいて溶離されることが発見された。これらのデータが示 すように、活性な天然のろうシンターゼタンパク質の最小のサイズは標識化バン ドの５７ｋＤのサイズに非常に類似し、こうしてろうシンターゼ活性が単一のポ リペプチドにより提供されるという証拠が得られる。ボイド画分において観察さ れたろうシンターゼ活性の小部分は、多分酵素の凝集した形態である。

Ｅ　バルミトイル−ＣｏＡのアガロースクロマトグラフィーカラム（１，ＯＸ３ ｃｍ）に１６：０−ＣｏＡアガロース（ノブ？Ｐ５２９７）を詰め、そして０． ２Ｍ　ＮａＣ１を含有するカラム緩衝液（参照、実施例１、Ｄ）で平衡化した。

ブルーＡのカラムｎｏ１．５ＭＮａＣ１からのプールした濃縮物のほぼ４ｍｌを 融解し、そして０゜２ＭＮａＣ１の中で平衡化したＰＤ−１０（ファーマンア） 脱塩カラムに前記濃縮物を通過させることによって、塩濃度を低下させた。塩が 減少した試料（５ｍｌ）を、１６：ＯＣｏＡアガロースカラム上に、０．１５ｍ １／分の流速で負荷する。カラムを０．５Ｍ　ＮａＣｌのカラム緩衝液で洗浄し 、次いで１．５Ｍ　ＮａＣｌのカラム緩衝液で洗浄する。多少のろうシンターゼ 活性はカラムを通して流れるが、あるいは０．５Ｍ　ＮａＣｌにより除去される が、回収された活性の大部分（負荷した活性の２１％）は１．５Ｍ　ＮａＣｌの 溶離されたピークの中に回収された。

ろうシンターゼ活性を示す両分の一部分を実施例２に記載するように［＋４Ｃ］ バルミトイル−ＣｏＡで放射線標識化し、モしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル の電気泳動により分析した（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）２２ ７：６８０　６８５）、再び、はぼ５７ｋＤの放射線標識化タンパク質バンドが 、ろうシンターゼ活性をもりて足跡を残すことが観察される。

実施例４−　ホホバろうシンターゼの精製　−ろうシンターゼ活性を有するホホ バ膜調製物の単離、ろうシンターゼ活性の可溶化およびろうシンターゼタンパク 質のそれ以上の精製のために使用できる方法を記載する。

Ａ、ミクロソームの膜調製物 胚の水分（４５〜７０％）により推定して、花成後はぼ９０〜１１０にホホバの 胚を収穫した。外側の外皮および種子の外殻を除去し、そして子葉を将来の使用 のために液体窒素の中で凍結し、そして−７０℃において貯蔵した。初期のタン パク質の調製のために、凍結した胚を鋼の乳鉢と乳棒で液体窒素の温度において 粉砕することによって粉末にする。

典型的な実験において、７０ｇの胚を処理する。

この粉末を、２８０ｍ１の溶液／７０ｇの胚の比で、次の高い塩の溶液に添加す る：３ＭＮａＣｌ、０６３Ｍ　スクロース、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　Ｄ ＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤、０．７μｇ／ｍｌ　レウペブチン、０５μｇ ７ｍｌ　ペプスタチンおよび１７ｇｇ／ｍＩ　ＰＭＳＦ０粉末状胚を緩ｉ！Ｆｒ 液の中に組織ホモジナイザー（ケネマチカ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ）スイス国、 ＰＴ１０／３５）でほぼ３０秒間分散し、次いでミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔ ｈ）（カルビオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州うジョラ）の ３層を通して濾過することによって、細胞不含ホモジネート（ＣＦＨ）を形成す る。濾液を１００．’ＯＯＯＸｇで１時間遠心する。

生ずる試料は、ペレット、上澄み液および浮遊脂肪のパッドから成る。

脂肪のバンドを除去し、そして上澄み液の画分を集め、そしてｉＭ　Ｎａｃｌ、 １００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　ＤＴＴおよび０．　５Ｍ　ＥＤＴＡを含有す る溶液に対して一夜透析する（緩衝化溶液を３回交換する）。透析物を２００． ０００ｘｇで１．５時間遠心してペレット、ＤＰ２を生ずる。このペレットを２ ５ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび１０％グリセロールの中にもとのＣＦＨの体積の１／ ２０で９濁させて、ミクロソームの膜調製物を生成する。

活性を実施例１に記載するようにアッセイする。ろうシンターゼ活性の回収率は 細胞不含ホモジネートの中のもとの活性の３４％である。この調製物の中のろう シンターゼ活性は、−７０℃において貯蔵するとき、安定である。

Ｂ、ろうシンターゼタンパク質の可溶化ＣＨＡＰＳ　（３−［（３−コラミドプ ロピル）−ジメチルーアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）およびＮａＣ ｌをミクロソームの膜調製物に添加して、それぞれ、２％および０．５Ｍの最終 濃度を生成する。試料を氷上でほぼ１時間インキュベーションし、次いで２５ｍ ＭＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール、０．５Ｍ　ＮａＣｌで希釈してＣＨＡＰＳ 濃度を０７５％に低下させる。次いで試料を２００．ＯＯＯＸｇで１時間遠心し 、そして上澄み液を回収し、そして実施例１に記載するようにろうシンターゼ活 性についてアッセイする。典型的には、ミクロソームの膜調製物からのろうシン ターゼ活性の１１％が上澄み液の画９の中に回収される。可溶化されたろうシン ターゼ活性は、−７０℃において貯蔵するとき、安定である。

ＣブルーへのカラムのクロマトグラフィーブルーＡ（チバクロン・ブルーＦ３Ｇ Ａ；アミコン・ディビジョン（Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、Ｗ、Ｒ，Ｇ ｒａｃｅ　＆　Ｃｏ。

）を含有するほぼ３０ｍ１のベッド体積をもつカラム（２，５層８ｃｍ）を調製 し、そしてこのカラムを０．４Ｍ　ＮａＣｌを含有するカラム緩衝液（２５ｍＭ 　ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール、０，７５％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ ）と平衡化する。可溶化されたろうシンターゼ調製物を、カラム緩衝液（２５ｍ Ｍ　ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール、領　７５％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ）の添加により０．　４Ｍ　Ｎａｃｌに希釈し、そしてブルーＡのカラムに負 荷する。

カラムを通して流れる緩衝液の中にタンパク質を検出する（２８０ｎｍにおける 吸収により測定する）ことができな（なるまで、このカラムを０．５Ｍ　ＮａＣ ｌを含有するカラム緩衝液で洗浄する。ろうシンターゼ活性の９４％はカラムに 結合するが、他のタンパク質の８３％より大は通過する。典型的には、負荷した ろうシンターゼ活性のほぼ２０％は溶離により回収される。回収された活性の一 部分（１７％）を１．０Ｍ　ＮａＣ１のカラム緩衝液の洗浄液で溶出するが、回 収された活性のほぼ７５％は広いピークとして１．５Ｍ　ＮａＣｌのカラム緩衝 液を使用する１５０ｍ１の洗浄液の中に溶出する。１．５Ｍの洗浄液の５ｍｌの 両分を集め、そして実施例１に記載するようにろうシンターゼ活性についてアッ セイする。ろうシンターゼ活性を含有する両分をプールし、そしてアミコン撹拌 セルユニットおよびＹＭ３０膜を使用して１０倍に濃縮する。濃縮したろうシン ターゼ調製物を一７０℃において貯蔵する。

Ｄ、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析 活性ブルーＡのカラムの両分からの試料をＳＤＳ　ＰＡＧＥ試料緩衝液（１×緩 衝液＝２％ＳＤＳ、３０ｍＭ　ＤＴＴ、０００１％ブロモフェノールブルー）の 中に希釈し、そしてＮ０ＶＥＸ　（カリフォルニア州すンディエゴ）からの１２ ％トリス／グリシンの前辺て流延したゲル上の電気泳動により分析する。ゲルを １５０ｖの一定電圧においてほぼ１．５時間展開する。タンパク質を銀染色によ り検出する（Ｂ　Ｉ　ｕｍら、Ｅｌ　ｅｃ　ｔ　ｒｏｐｈ’ｏｒｅｓ　ｉｓ　（ １９８７）　８　：　９３−９９）　。　ゲルの注意した検査はほぼ５７ｋＤの １つを含む、いくつかのポリペプチドのみを明らかにし、種々の画分の中のそれ らの染色強度はそれらの画分の中で検出されるろうシンターゼ活性の量と相関関 係をもたせることができる。さらに、放射線標識化［１−１４０］　、（ルミト イルーＣｏＡをＳＤＳ　ＰＡ、ＧＥ分析の前にタンパク質調製物に添加する場合 、ゲルのオートラジオグラフィーは５７ｋＤの標識化バンドがこれらの画分にお いてろうノンターゼ活性をもって足跡を残すことを明らかにする。他のタンパク 質をまた調製物の中に存在し、これらのタシノくり質は同時係属米国特許出願第 ０７／７６７．２５１号に記載されている５６および５４ｋＤのりダクターゼタ ンパク質を包含する。

Ｅ　連続的相の溶離 ろうシンターゼタンパク質を、アミノ酸の配列決定のために、５ＤＳＰ　Ａ、　 Ｇ　Ｅ装置、４９１型ブレブ・セル（Ｐｒｅｐ　Ｃｅ１１）（／くイオ・ラド・ ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、カ リフォルニア州すッチモンド）により製造業者のインストラクションに従い単離 する。ブルーＡのカラムの１．５Ｍ　ＮａＣ＋の溶離からのろうシンターゼ活性 の一部分（１５ｍｌ）をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０　（アミコン ・ディビジコン、Ｗ、　Ｒ。

Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、；マサチュセツツ州ベベリー）の中で１０倍に濃縮し、 そしてファーマシアＰＤ−１０脱塩カラムでカラム緩衝液で脱塩する。試料を２ ％ＳＤＳおよび少量のブロモフェノールブルーの追跡用色素で処理し、そしてブ レブ・セル装置の中で２０ｍ１の１２％アクリルアミドの展開ゲル上で５ｍｌの ４％のアクリルアミドの積み重ねゲル上の負荷する。試料をＬＯＷで電気泳動さ せ、そしてタンノ（り質力くゲ特表千７−５０１２２１　（１４） ルから溶出するとき、それをブレプ・セルにより連続的に集める。次いで、溶出 したタンパク質を分画コレクターにより７゜５〜ｌＱｍｌの画分で集める。問題 の区域における各画分の１ｍｌ　（ろうシンターゼタンパク質の推定された５７ ｋＤのサイズに基づく）をセントリコン３０の中で４０μｌに濃縮し、そして２ にＳＤＳで処理する。試料を１２％アクリルアミドのミニ−ゲル（ＮＯｖｅＸ） 上で展開し、そして銀で染色する。ろうシンターゼの回収のために最適化するた めに連続的相溶離に対する種々の変更は有用であることがある。このような変更 は、ゲルのゲル体積の中のアクリルアミドの百分率の調節、およびゲルに適用さ れるろうシンターゼの量に対する調節を包含する。例えば、より大きい量のろう シンターゼタンパク質を単離するために、ブルーＡのカラムの両分をより大きい 体積の２０〜５５ｍ１のアクリルアミドゲルに、はぼ１ｍｇのタンパク質／２０ ｍ１のゲルの濃度で適用することができる。次いで、バンドの分離を増加するた めに、このようなゲルから溶離されたタンパク質の両分を１０〜１５％の勾配の アクリルアミドゲルに適用することができる。

各両分のタンパク質含量を視的に評価し、モしてろうシンターゼタンパク質を含 有する両分をプールし、そしてアミノ酸の配列決定のために濃縮する。集められ たろうシンターゼ酵素の量を最大するために、５６ｋＤのりダクターゼタンパク 質のバンドをまた含有する両分をプールした調製物の中に含める。リダクターゼ タンパク質の配列は知られているので（第１図参照）、アミノ酸の配列決定技術 の適用前において、プールした調製物の中のろうシンターゼタンパク質のそれ以 上の精製は不必要である（実施例５参照）。

Ｇ、膜へのタンパク質のプロッティングあるいは、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ、インモビ ロン（Ｉｍｍｏｂ　ｉ　ｌ　ｏｎ）−Ｐ（ミリポア（Ｍｉ　］　］　１ｐｏｒｅ ）；マサチュセツツ州ベッドフォード）またはプロプロット（ＰｒｏＢｌｏｔｔ ）（アプライド・バイオンステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） ：力１ノフオルニア州フォスター・ンテイー）後、ろうンンターゼタンノ做質を ＰＶＤＦ膜への転移によりアミノ酸の配列決定のためにさらに単離すること力く できる。ニトロセルロースへの転移も有用であること力（ある力（、初期の研究 はニトロセルロースの膜への劣った転移を示し、その原因１まこのタンパク質の 疎水性の性質のためである可能性が強ＬＸ、、ＰＶＤＦ膜、例えＩｆ。

プロプロットおよびインモビロンーＰは、使用すべきアミノ酸の配Ｊ１１決定技 術に依存して、異なる方法において優先的用途を見しＸだす。例えｌｆ。

プロプロットへの転移はＮ−末端の配列決定法のために有用であり、そして臭化 シアンの消化からのペプチドの発生のために１まインモビロンーＰが好ましい。

１、ニトロセルロースへのプロッティング：タン／くり質をニトロセルロースへ エレクトロプロッティングするとき、プロ・リティック゛時間１ま緩衝液、例え ば、５〜２０％メタノール中の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ　グリノン中で 典型的には１〜５時間である。エレクトロプロッティング後、膜を１％（Ｖ　／ 　Ｖ　）アミノ酸中の０．１％（Ｗ／Ｖ）ポンセアウ（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓの中 で２分間染色し、そして２〜３回交換の０゜１％（Ｖ　／　Ｖ　）酢酸の中で各 交換につし１て２分間脱染する。次（〜で、これらの膜をヒートシールしたプラ スチ・ノクノくツクの中で湿潤状態で一２０℃において貯蔵する。時間が許す場 合、プロ・ソトを凍結しなＬ）で、後述するように、消化のために直ちに使用し て、アミノ酸配夕１１の決定のためのペプチドをつくる。

２、ＰＶＤＦへのプロッティング・タンパク質をインモビロンＰＰＶＤＦにエレ クトロブロッティングするとき、ブロッティング時間１ま緩衝液、例えば、一般 に２０％（ｖ　／　ｖ　）メタノール中の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１９２ｍＭ　グ リノン中で約１〜２時間である。ＰＶＤＦへのエレクトロブロッティング後、膜 を５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．１％（ｗ／ｖ） クーマツンーブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）の中で染色し、そして２ 〜３回交換の５０％（Ｖ　／　Ｖ　）メタノール７１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸の中で 各交換について２分間脱染する。次いでＰＶＤＦ膜を３０分間空気乾燥し、次い でヒートシールしたプラスチ；ツクバッグの中で湿−状態で一２０℃において貯 蔵する。ＰＶＤＦ膜、例えば、プロプロットにプロッティングしたタンパク質を 直接使用して完全なタンパク質のＮ−末端配列を決定することができる。プロプ ロットへのタンパク質のエレクトロブロッティングのためのプロトコルは、実施 例５Ａにおいて後述する。

実施例５−　アミノ酸配列の決定 この実施例において、ろうシンターゼ活性に関連する植物タンパク質のアミノ酸 配列の決定法を記載する。

Ａ、タンパク質の臭化シアンの切断およびペプチドの分離臭化シアンの切断を、 問題のタンパク質について、プロメガ・インコーホレーテッド（Ｐｒｏｍｅｇａ 、Ｉｎｃ、）（ウイスコンノン州マディソン）からのプローブーデザイン・ペプ チド分離システム技術マニュアル（Ｐｒｏｂｅ−Ｄｅｓｉｇｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ 　５ｅｐａｒａｔｉ。

ｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ）に記載されている方法 を使用して実施する。ろうシンターゼタンパク質を、精製した液体試料中の入手 できない場合、前述したようにＰＶＤＦ膜にプロッティングする。精製したろう シンターゼタンパク質またはＰＶＤＦプロットからのろうシンターゼのバンドを ７０％（Ｖｌ／Ｖ）ギ酸中の臭化シアンの溶液の中に入れ、そして室温において 一夜インキュベーションする。

このインキュベーンコン後、臭化シアン溶液を取り出し、プールし、そして連続 的窒素の流れ下にリアクチ−パブ・エバポレイター（Ｒｅａｃｔ＋−Ｖａｐ　Ｅ ｖａｐｏｒａｔｏｒ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード ）を使用して乾燥する。ペプチドの溶離溶媒、例えば、７０％（ｖ　／　ｖ　） イソプロパツール、０．２％（ｖ／ｖ）ｔ−リフルオロ酢酸、０．１ｍＭリジン および０．１ｍＭチオグリコール酸を使用して、ＰＶＤＦからの臭化シアンのペ プチドの追加の溶離を実施して完全な除去を保証することができる。次いで溶離 溶媒を取り出し、そして乾燥した臭化シアン溶液を含をする管に添加し、そして 前述したように乾燥する。この溶離の手順を新鮮な溶離溶媒を使用して反復する ことができる。次いで５０μｌのＨＰＬＣ等級の水を乾燥したペプチドに添加し 、そして水をスピード−バク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）（サバント・インコーホレ ーテッド（Ｓａｖａｎｔ、夏ｎｃ、）、ニューヨーク州ファミングデイル）の中 で蒸発により除去する。

臭化シアンの切断により発生したペプチドを、Ｓｃｈａｇｇｅｒおよびｖｏｎ　 Ｊａｇｏｗ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８７）１６６・３６８−３７９ ）により記載されているものに類似するＴｒｊｓ／トリンン（Ｔｒｉｃｉｎｅ） ＳＤＳ　ＰＡＧＥ系を使用して分離する。

ゲルを１２５〜１５０ポルトにおいてほぼ１時間あるいは追跡用色素がゲルの下 部のへりから流れ出始めるまで展開する。ゲルを転移の前に転移緩衝液（１２５ ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、５０ｍＭグリシン、１０％（ｖ　／　ｖ　）メタノール） の中で１５〜３０分間ソーキングする。ゲルをプロプロット配列決定用膜（アプ ライド・バイオシステムス、カリフォルニア州フォスター・シティ−）に５０ボ ルトの一定電圧においてブロッティングする。膜をクーマノノーブルー（５０％ （Ｖ　／　Ｖ　）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中の０１％）で染色し、そ して５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中で３Ｘ２分間脱染す る。膜を３０〜４５分間空気乾燥した後、−２０℃において貯蔵する。

プロプロットに結合したペプチドを、ポリブレン被覆したガラス繊維のフィルタ ーを添加しないで、タンパク質配列決定装置のカートリッジに直接負荷する。ア プライド・バイオシステムスにより供給される、わずかに変更した反応サイクル 、ＢＬＯＴ−１、を使用してペプチドを配列決定する。また、溶液Ｓ３（塩化ブ チル）を８１および５２（ｎ−へブタンおよび酢酸エチル）の５０：５０ｆｉ合 物で置換する。プロプロットにプロットした試料を配列決定するときにはいつで も、これらの２つの変更を使用する。

Ｂ、プロテアーゼの消化およびペプチドの分離液体溶液の中に提供された精製し たろうシンターゼタンパク質またはニトロセルロースにプロットしたろうシンタ ーゼタンパク質を消化して、配列決定のためのペプチドを得ることができる。使 用する方法は、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら（ＰＮＡＳ　（１９８７）８４　：６９７ ０）の方法である。

ニトロセルロース提供されたタンパク質について、ろうシンターゼタンパク質、 およびまた対照として使用する等しい量のブランクのニトロセルロースをニトロ セルロースの膜から切り出し、モしてＨＰＬＣ等級の水で数回洗浄してポンセア ウＳを除去する。この洗浄後、１．　０ｍｌの０５％酢酸中の０．　５％ポリビ ニルピロリドン（ＰＶＰ−４０，アルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウィスコン ンン州ミクウォーキー）を膜の片に添加し、そしてこの混合物を３７℃において ３０分間インキユベーソヨンする。ＰＶＰ−４０を完全に除去するために、ニト ロセルロース片を多数の体積のＨＰＬＣ等級の水（８Ｘ５ｍｌ）で洗浄し、分光 光度計で２１４ｎｍにおける吸収を検査する。また、ＰＶＰ−４０処理および洗 浄後までバンドを小片に切断しない場合、ＰＶＰ−４０はいっそう容易に除去さ れる。

次いで、溶液中のまたはニトロセルロース片上のペプチドを適当な消化緩衝液、 例えば、トリブノン消化緩衝液、１００ｍＭ重炭酸ナトリウムｐＨ８，２、また はエンドブロティナーゼｇｌｕｃ緩衝液、２５ｍＭ炭酸アンモニウム／１ｍＭ　 ＥＤＴＡ、ｐＨ７，８の中に懸濁させる。

アセトニトリルを消化混合物に５〜１０％（ｖ　／　ｖ　）の濃度に添加する。

プロテアーゼを消化緩衝液の中に希釈し、そして消化混合物に、典型的には１　 ：　１０　（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ／タンパク質の比で添加する。

消化物を１８〜２４時間インキュベーションする。例えば、トリプシン消化物を ３７℃においてインキュベーションし、そしてエンドプロテイナーゼｇｌｕｃ消 化物を室温においてインキュベーションする。同様に、他の方法、例えば、Ｉｙ ｓＣおよびａｓｐＮを使用してろうシンターゼタンパク質を消化することができ る。個々の消化緩衝液の条件は異なるが、消化、ペプチドの分離、精製および配 列決定のためのプロトコルは、トリプシンおよびｇｌｕｃを使用する消化につい て記載したものと実質的に同一である。

一夜のインキュベーンジン後、１０μｌの１０％（Ｖ／Ｖ））リフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）または１μｍの１００％ＴＦＡの添加により、消化反応を停止させる。

タンパク質がニトロセルロース上に得られたとき、ニトロセルロース片を１〜５ ０μｍの体積の５〜１０％のアセトニトリルを含む消化緩衝液で洗浄し、そして これらの体積をスピード−バクの中で１００μｌより少ない体積に濃縮する。

消化から生ずるペプチドを、アプライド・バイオシステムス（カリフォルニア州 フォスター・ンティー）１３０型高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の 中に設置されたＶｙｄａｃ逆相Ｃ１８カラム（２，１ｍｍｘｌｏｏｍｍ）で分離 する。ペプチドの溶離に使用する移動相はは次の通りである・緩衝液Ａ・０．１ ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２，２、ｌｌ衝液Ｂ：０．１ｍＭリン酸ナトリウム 中の７０％アセトニトリル、ｐ）（２，，２，２時間かけて１０−５５％緩衝液 Ｂ、５分かけて５５〜７５％緩衝液Ｂ、および１５分かけて７５％緩衝液無勾配 の３段階の勾配を５０μｌ／分の流速で使用する。ペプチドを２１４ｎｍにおい て検出し、手により集め、次いで一２０℃において貯蔵する。

ろうシンターゼタンパク質の疎水性の性質のために、酵素消化緩衝液の中の消化 物の添加は有用であろう。例えば、ホホバろうノンターゼを含有する前述の連続 的相溶離手順からの画分を、セントリコン３０の中で１００ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ ／１．０％ＣＨＡＰＳ中で１１０μ！の最終体積に濃縮する。５μｌの１００ｍ Ｍ　ＮａＨＣＯｓ／１．０ＭＣＨＡＰＳ中の２μｇのトリプシンをタンパク質溶 液に添加し、そしてこの混合物を３７℃において一夜インキユベーソジンし、そ してトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）の添加により消化を停止させる。試料をわ ずかに遠心しそして、前述したように、ペプチドをＶｙｄａｃＣ１８カラムで分 離し、そして溶離する。この手順において、ＣＨＡＰＳはアプライド・バイオン ステム２４０〜５３％緩衝液Ｂにおいて溶出し、そしてこの領域においてペプチ ドのピークを不明瞭にする。

−次の分離が複雑なペプチドのパターンを生ずる場合、例えば、過剰のペプチド を使用するか、あるいは汚染物質（例えば、ホホバのリダクターゼタンパク１Ｊ ｆ）が存在する場合、同一カラムを使用するが、異なる勾配系を使用して、ペプ チドのピークをさらにクロマトグラフィーにかけることができる。上のホホバろ うシンターゼの調製物について、６０分間Ｏ〜４０％緩衝液８１３５分間４０〜 ７５％Ｂおよび１０分間７５〜１００％Ｂの勾配を使用して、親水性ピークを分 離する。４０分間０〜４０％緩衝液Ｂ１６０分間４Ｏ−８０ＸＢおよび１ｏ分間 ８０−１００％Ｂの勾配を使用して、疎水性ピークを分離する。これらの分離に ついて、緩衝液Ａはアセトニトリル中の０．　１％ＴＦＡであり、そして緩衝液 Ｂは０．１％ＴＦＡである。

Ｃタンパク質およびペプチドのＮ−末端の配列決定アプライド・バイオンステム ス４４７Ａパルスト−液相タンパク質配列決定装置によりエドマン分解法により 配列を実施する：配列決定装置により生成されたフェニルチオヒダントイン（Ｐ ＴＨ）アミノ酸を、オンラインのアプライド・バイオシステニス１２０Ａ型ＰＴ Ｈ分析装置により分析する。アンプル・マノントツンユ（Ａｐｐｌｅ　Ｍａｃｉ ｎｔｏｓｈ）のためのアプライド・パイオンステムス６１０Ａ型分析システムを 使用しかつまたぺ・不ルソン・インコーホレーテッド（ＰＥ　ＮＥＬＳＯＮ、Ｉ ｎｃ、）（カリ７１ｔルニア州クーパチノ）からのＡＣＣＥＳＳ＊ＣＨＲＯＭソ フトウェアを使用するディノタル・ミクロパックス（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｍｉｃｒ ｖａｘ）で、データを集めそして貯蔵する。

Ｐ　Ｔ　Ｈ分析装置からインプットを受け取るチャート・レコーダーから配列の データを読み、そして６１０Ａ型ソフトウエアから得られる定量的データを使用 して確証する。すべての配列のデータはデータ分析システムの助けにより２人の オペレーターが独立に読む。

ＨＰＬＣのピークとして得られたペプチドの試料について、配列決定装置におい て３回のブレーサイクルにかけられたポリブレン被覆ガラス繊維のフィルター（ アプライド・パイオンステムス、カリフォルニア州フォスター・シティ−）に試 料を負荷する。還元されかつアルキル化されたペプチドについて、各配列決定装 置のサイクルからＰＴＨ−アミノ酸生成物の材料の一部分を液体ノンチレーンヨ ンカウンター中で計数する。インモビリンーＰにエレクトロブロッティングした タンパク質の試料について、問題のバンドを切り出し、次いでポリブレン被覆ガ ラス繊維のフィルターの上に配置し、前述したようにブレーサイクルにかけ、そ して反応カートリッツを製造業者のインストラクションに従いアセンブリングす る。プロブロットにエレクトロブロッティングされたタンノ（り質の試料につい て、ガラス繊維のフィルターは不必要である。

少量の試料（５〜３０ｐｍｏｌ）からタンパク質の配列を得るために、Ｒｉｖｉ ｅｒｅ　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８９）１８３：２９０）により記 載されている４７７Ａ逆サイクルおよびＴｅｍｐｓｔおよび１２０Ａ分析装置。

前述したようにトリプシン消化により得られたホホバろうシンターゼのタンパク 質のアミノ酸配列を、下表２に示す。

ホホバろうシンターゼのトリプシンのペプチドのアミノ酸配列５Ｑ１１１４　Ｅ Ｔｌ’ＷＥＳＶＴＫＫＳＱ１０８４　ＶＰＸＥＰＳ［ ろうシンターゼタンパク質のアミノ酸配列を１文字のコードを使用して表す。ｒ ＸＪはアミノ酸を同定することができなかった位置を表し、そして下の大文字で 表すアミノ酸はより低い信頼度で同定された残基を表す。

実施例６−　追加のろうシンターゼの精製性の生物からろうシンターゼの部分的 に精製された調製物を得るためのホホバろうシンターゼの可溶化および精製の方 法の適応を記載する。

Ａ　アンネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）アンネトバクター・カル コアセチフス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）株Ｂ Ｄ４１３　（ＡＴＣＣ＃３３３０５）をＥＣＬＢ　（大腸ＩＩ　（Ｅ、ｃｏ　Ｉ 　ｉ）ルリアブロス）上で成長させ、対数成長期の間に集め、そして次の成分を 含有する緩衝液の中で洗浄する；Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，５、Ｏ，ＬＭ　ＮａＣｌ 、１ｍＭＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤。洗浄した細胞を新鮮な緩衝液の中に 再懸濁させ、そしてフレンチ（Ｆ　ｒ　ｅ　ｎ　ｃ　ｈ）圧力セルを通過させる ことによって（約１６．０ＯＯｐｓｉで２回の通過）破壊する。破壊しない細胞 を５０００ｘｇにおいて１０分間遠心することによって除去し、そして１００． ０００Ｘｇにおいて１時間遠心することによって膜を集める。膜のベレットを貯 蔵緩衝液（２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，５，１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロール ）の中でホモジナイゼイションする。実施例１Ｂにおいてホホバの酵素について 記載したアッセイ条件を使用し、基質として［１−１４Ｃ］バルミトイル−Ｃｏ Ａおよび１８・１アルコールを使用して、これらの膜の中のろうシンターゼ活性 を検出する。

実施例４Ｂにおいてホホバの酵素について記載したように、膜を２％ＣＨＡＰＳ と０．５Ｍ　ＮａＣ１の存在下にインキュベージジンすることによって、ろうシ ンターゼ活性を可溶化する。２００．０００ｇにおいて１時間遠心した後、上澄 み液の画分の中のろうシンターゼ活性の検出により、およびサイズ排除クロマト グラフィー（すなわち、活性は対称のピークとして保持された画分でカラムから 溶出する）により、活性の可溶化は証明される。可溶化された酵素の活性は、Ｃ ＨＡＰＳ濃度を約０３％（すなわち、そのＣＭＣ以下）に単に希釈することによ って、検出される。リン脂質のベヒクルの中への酵素の組み込みは、可溶化され た活性の検出には不必要である。

精製のために、可溶化されたアノネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ　ｔ　ｅ 　ｒ）のろうを、ホホバのアンル〜ＣｏＡリダクターゼについて記載したものに 類似するクロマトグラフィーの精製法にかける。可溶性のタンパク質！ｌｌ製物 を低い塩の条件（０７５％ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、２５ｍＭ　Ｈｅｐ ｅｓを含有するカラム緩衝液、ｐＨ７，５、中の１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）下にブ ルーＡのアガロースカラムに負荷し、そしてカラム緩衝液中の１．０Ｍ　ＮａＣ ｌを使用してカラムからＮＩＭする。スパロース１２（ファーマンア、ニュージ ャーシイ州ビス力タウェイ）媒質のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、 天然の酵素のサイズの推定値を得そして候補のポリペプチドの同定を促進する。

同定条件下にクロマトグラフィーにかけた分子量の樟準との比較により、天然の ろうシンターゼ活性について約４６ｋＤの推定値が得られる。ろうシンターゼ活 性とともに足跡を残す、４５ｋＤ、５８ｋＤおよび６４ｋＤの見掛けの分子量を もつ３つのポリペプチドのバンドが同定された。４５ｋＤのポリペプチドのＮ− 末端の配列、ろうシンターゼについて最強の候補、はＸＤＩＡＩＩＧＳＧｓＡＧ ＬＡＱａｘｉｌｋｄａｇとして決定され、ここでアミノ酸についての１文字のコ ードを使用し、「Ｘ」ははアミノ酸を同定することができなかった位置を表し、 そして下の大文字で表すアミノ酸はより低い信頼度で同定された残基を表す。

Ｂ、　１ツブＬｚｔ−（Ｅｕ　ｉｅｒ＋ａ）エウグレナ・グランリス（Ｅｕｇｌ ｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｊｓ）、株Ｚ　（ＡＴＣＣＮｏ、１２７１６）を、約２６ ℃において適度に農機しながら暗所で従属栄養的に成長させる（Ｔａｎｉら（１ ９８７）Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、５１：２２５−２３０）ｏ細胞を集 め、そして２５ｍＭ　ビス−トリス−プロパン、ｐＨ７，０，０，２５Ｍ　Ｎａ ｃＩおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する緩衝液中で洗浄する。洗浄した細胞を新 鮮な緩衝液の中に再懸濁させ、そしてフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）圧力セルを２！ Ｉ過させることによって（約１６．０００ｐｓｉで２回の通過）破壊する。破壊 しない細胞、細胞破片および核を２０．０００×ｇにおいて２０分間遠心するこ とによって除去し、そして２００．　０００Ｘｇにおいて１時間遠心することに よってミクロソームの膜を集める。膜のベレットを貯蔵緩衝液（２５ｍＭビス− トリス−プロパン、ｐＨ７，０，０，２５Ｍ　ＮａＣＬ　１０％（ｗ／ｖ）グリ セロールおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ）の中でホモジナイゼインヨンする。ホホバの 酵素について記載したアッセイ条件を使用して、ろうシンターゼ活性をこれらの 膜の中で検出する。放射線標識化した基質はホホバの実施例についてと同一であ る（すなわち、［１−１４Ｃｌバルミトイル−ＣｏＡ）が、１８．１ではなく１ ６：１をアルコール受容体として使用し、そしてビス−トリス−プロパン緩衝液 ｐＨ７，０を使用する。

エウグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）のろうシンターゼ活性を２％ＣＨＡＰＳと０．５ Ｍ　ＮａＣｌの存在下にインキュベージジンすることによって可溶化する。２０ ０．ＯＯＯｘｇにおいて１時間遠心した後、上澄み液の両分の中の酵素活性の検 出により、タンパク質の可溶化は証明される。可溶化された酵素の活性は、ＣＨ ＡＰＳ濃度を約０３％（すなわち、そのＣＭＣ以下）に単に希釈することによっ て、検出される。可溶化されたホホバろうシンターゼについての場合のように、 リン脂質のベヒクルの中への酵素の組み込みむことは不必要である。

精製のために、可溶化されたエウグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）のろうシンターゼ活 性をブルーへのアガロース媒質のクロマトグラフィーで分離する。カラムを次の 成分を含有するカラム緩衝液中でＯ，ＩＭ　ＮａＣ１と平衡化する；２５ｍＭ　 ビス−トリス−プロパン、ｐＨ７，０，２０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．７ ５％ＣＨＡＰＳおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ０可溶化されたろうシンターゼ活性を含 有する試料を０．ＩＭＮａＣｌに希釈し、そしてｌＸ７ｃｍのカラム（５，５ｍ ｌのベッド体積）上に負荷する。このカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、モしてカ ラム緩衝液中の直線のＮａＣｌ勾配（０，１Ｍ−１，０Ｍ　ＮａＣ＋）にかける 。ろうシンターゼ活性は塩勾配の最後の半分において広いピークとして溶離され る。

カラムの画分のＳＤＳ　ＰＡＧＥにおいて、カラムから溶離される活性のポリペ プチドの複雑さは負荷した物質に関して大きく減少することが明らかにされた。

約４１ｋＤの見掛けの分子量をもつポリペプチドは、カラムの両分においてろう シンターゼ活性をもって足跡を残すことが観察される。それ以上の精製技術、例 えば、ホホバおよびアシネトバクタ−（Ａｃｊｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）について 記載した技術を実施して、約４１ｋＤののペプチドとろうシンターゼ活性との関 連性を評価する。

エウグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）におけるろうシンターゼ活性のそれ以上の分析の ために、サイズ排除クロマトグラフィーを次のようにして実施した。暗所で液体 の従属栄養の培地（Ｔａｎｉら、前掲）上で成長させたエウグレナ（Ｅｕｇｌｅ ｎａ）細胞から、ミクロソームの膜調製物を得た。膜を緩衝化溶液（２５ｍＭビ ス−トリス、ｐ）（’７．０．１ｍＭＥＤＴＡおよび１０％（ｗ／ｖ）グリセロ ール）中で２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳおよび５００ｍＭ　ＮａＣｌで氷上におい て１時間処理することによって、ろうシンターゼ活性を可溶化した。希釈緩衝液 の添加に、Ｊ：すＣＨＡＰＳをＯ，’　７５％Ｉ：そＬｔ’ＮａＣ１を２００ｍ Ｍ１ｍ希釈した後、試料を約２００．０００ｘｇにおいて１５時間遠心した。ま た、２００ｍＭ　ＮａＣｌを含有するカラム緩衝液（２５ｍＭビス−トリスｐＨ ７，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％グＩＪ−ｔｙｏ−／ｌ／、ｏ、７５％ＣＨＡ ＰＳ）と前以て平衡化したブルー八色素のカラム上に、上澄み液の両分を負荷し た。流出液のＡ２８０が負荷前の値に戻るまで、２００ｍＭＮａＣ１を含有する カラム緩衝液でカラムを洗浄した。カラム緩衝液の中のＮａＣ１濃度を１．５Ｍ に増加することによって、カラムに結合したろうシンターゼ活性を解放した。１ ．５Ｍ　ＮａＣ１により解放されたろうシンターゼ活性を含有するブルーＡのカ ラムからの画分（約２０ｍ１の一緒にした体積）をプールし、そして限外濾過（ ＹＭ３０膜を装備したアミコンの圧力セル）によりほぼ３０倍に濃縮した。ブル ーＡのカラムからの濃縮した材料を、スパロース１２媒質（）７−マンア）のサ イズ排除クロマトグラフィーによる分離のための試料として使用した。

０．５Ｍ　ＮａＣ１を含有するカラム緩衝液と前以て平衡化したスバロース１２ カラム（ＨＲ１０／３０）上に、はぼ２００μｍの試料を負荷し、モしてＯ，１ ｍｌ／分の流速で展開した。ろうシンターゼ活性はカラムから滑らかなピークと して溶出した。ろうシンターゼ活性の溶離体積を分子量標準のタンパク質の溶離 のプロフィルと比較すると、酵素の見掛けの分子量について１６６ｋＤの推定値 が得られた。ろうシンターゼ活性を含有する両分を、５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲルの電気泳動により分析し、次いで銀染色した。種々の画分のポリペプチド のプロフィルの予備的分析において、活性のプロフィルと合致するように思われ る染色強度をもつ、１００ｋＤまたはそれより大きい分子量を有するタンパク質 は明らかにされなかった。ろうシンターゼ活性は、銀染色したゲル上で容易に検 出可能である試料混合物中の小さい成分として存在することがある。あるいは、 この酵素はＳＤＳ　ＰＡＧＥの間に解離するサブユニットから構成されることが ある。

実施例７−　ろうシンターゼの核酸配列の単離ホホバ胚のＣＤＮＡライブラリー あるいはゲノムのＤＮＡからのろうシンターゼの核酸配列の単離を記載する。

Ａ　ホホバのＣＤＮＡライブラリーの構成ポリリポソーム方法［最初にＪａｃｋ ｓｏｎおよびＬａｒｋｉｎ（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９７６）５ ７：５　１０）により記載され、Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 　Ｂｉｏｌ（１９８１）８３　：　２０１−２１７）により変更された］を使用 して、開花期後８０〜９０日において集めたホホバの胚からＲＮＡを単離する。

この方法において、すべての工程は、特記しない限り、４℃において実施する。

１０ｇの組織をワーリングブレンダーの中の液体窒素中で粉砕して、組織を微細 な粉末にする。液体窒素が蒸発した後、１７０ｍ１の抽出緩衝液（２００ｍＭ　 Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，０，１６０ｍＭ　ＫＣＩ。

２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、７０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１％トリトンＸ−１００，０５に ナトリウムデオキシコレート、１ｍＭスペルミジン、１０ｍＭβ−メルカプトエ タノール、および５００ｍＭスクロース）を添加し、そして組織を約２分間均質 化する。ホモジネートを無菌のミラクロスを通して濾過し、そして１２．０００ ｘｇにおいて２０分間遠心する。上澄み液を５００ｍ１の無菌のフラスコの中に デカンテーションし、そしてｌ／１９体積の２０％洗浄剤溶液（２０％Ｂｒ１ｊ 　３５．２０％ツイーン４０．２０％Ｎｏ１ｄｅｔ　ｐ−４０ｗ／ｖ）を室温に おいて添加する。この溶液を４℃において３０分間中程度の速度で撹拌し、次い で上澄み液を１２．０００Ｘｇにおいて３０分間遠心する。

７０ｍ１の４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，０１５ｍＭ　ＥＧＴＡ、２００ｍＭ　 ＫＣＩ、３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１．８Ｍスクロース、５ｍＭ　β−メルカプト エタノールを含有する溶液を下に配置した無菌のＴ１６０遠心管に、約３０ｍ１ の上澄み液のアリコートを入れる。管の上部に抽出緩衝液を満たし、そしてＴ１ ６０ローターの中で４℃において６０、ＯＯＯｒｐｍで４時間回転する。遠心後 、上澄み液を吸い上げ、そして０．５ｍｌの再警濁液（４０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ 　ｐＨ９，０１５ｍＭ　ＥＧＴＡ、２００ｍＭ　ＫＣＩ、３ＱｍＭ　ＭｇＣ１ｙ 、５ｍＭβ−メルカプトエタノール）を多管に添加する。管を氷上に１０分間配 置し、次いでベレットをよく再懸濁させ、そしてプールする。次いで上澄み液を １．２０　Ｘ　ｇで１０分間遠心して不溶性物質を除去する。１体積の２０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，６，２００ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％Ｎ−ラウリル−サルコン ネート中の自己消化した１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを上澄み液に添加し、 そしてこの混合物を室温において３０分間インキュベーションする。

１／１０体積の酢酸ナトリウムおよび２体積のエタノールを添加して、ＲＮＡを 沈澱させる。−２０°Ｃにおいて数時間後、ＲＮＡを１２．０００ｘｇ、４℃に おいて３０分間遠心することによって沈降させる。このベレットを１０ｍ１のＴ Ｅ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）の中に再懸濁させ、そし て等しい体積のＴｒｉｓ　ｐＨ７，５飽和フエノールで抽出する。相を１０．Ｏ ＯＯＸｇで２０分間４℃において遠心することによって分離する。水性相を除去 し、そして有機相を１体積のＴＥ緩衝液で再抽出する。次いで水性相をプールし 、そして１体積のクロロホルムで抽出する。再び、相を遠心により分離し、そし て水性相を前述したようにエタノール沈澱させて、ポリリポソームのＲＮＡを得 る。

高い塩の緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ］、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７５，１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）中のセルロースのカラム（ソゲマーセル５０）上 でＲＮＡを展開することによって、ポリリポソームのＲＮＡ調製物中の多糖類の 汚染物質を除去する。汚染物質はカラムに結合し、そしてＲＮＡは溶離液の中に 集められる。溶離液の両分をプールし、モしてＲＮＡをエタノール沈澱させる。

次いで沈澱した全体のＲＮＡをより小さい体積の中に再懸濁させ、そしてオリゴ （ｄＴ）セルロ特表千７−５０１２２１　（１Ｑ） −スカラムに適用してポリアデニル化ＲＮＡを単離する。

商用クローニングベクターのブルースクリプト（ＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｍ１３ −　（ストラタンーン・クローニング・システムス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃ １’ｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）から誘導された、プラスミドクローニングベ クターｐｃＧＮ１７０３の中でｃＤＮＡライブラリーを構成するために、ポリア デニル化ＲＮＡを使用し、そして次のようにして作る。ブルースクリプトＭ１３ −のポリリンカーをＢａｍＨＩで消化して変更し、ヤエナリのエンドヌクレアー ゼで処理し、そして平滑末端結合してＢａｍＨＩ欠失プラスミド、ｐｃＧＮｌ、 ７００をつくる。ｐｃＧＮｌ、７００をＥ　ｃ　ｏ　Ｒ，Ｔおよび５ｓｔｌ（隣 接する制限部位）で消化し、そしてＢａｍＨＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ａ ｐａ　１およびＳｍａｌのための制限部位、ＡＡＴＴの５゛オーバーハング、お よびＴＣＧＡの３゛オーバーハングを有する合成リンカ−とアニーリングする。

ｐｃＧＮ１７００の中へのリンカ−の挿入はＥｃｏＲ１部位を排除し、ブルース クライブ（Ｂｌｕｓｃｒｉｂｅ）の中に見いだされる５ｓｔｌ（また、ここにお いて時にはｒｓａｃｌＪと呼ぶ）部位を再びつくり、そしてリンカ−上に含有さ れる新しい制限部位を付加する。生ずるプラスミドＤＣＧＮ１７０２をＨｉｎｄ ｌｌｌで消化し、そしてりＬ／／−酵素で平滑末端とする。こ、の線状ＤＮＡを ｐｖｕｌｌで部分的に消化し、そして希溶液中でＴ４ＤＮＡろうシンターゼと結 合する。欠失された１ａＣプロモーター領域を有する形質転換体を選抜しくｐｃ ＧＮ１７０３）そしてプラスミドクローニングベクターとして使用する。

簡単に述べると、ｃＤＮＡの合成について回交換のする方法は次の通りである。

プラスミドクローニングベクターを５ｓｔｌで消化し、そして末端のデオキシヌ クレオチンルトランスフエラーゼを使用して生ずる３′−オーバーハングの粘着 末端上にホモポリマーのＴ−テイルを発生させる。ティルトプラスミドを未消化 またはアンティルトプラスミドとオリゴ（ｃｌ　Ａ）−セルロースのクロマトグ ラフィーにより分離する。生ずるベクターは、ベクターのプラスミドのいずれか の末端に共有結合したｃＤＮＡの第１＃Ｉの合成のためのプライマーとして働く 。ｃＤＮＡ−ｍ　Ｒ，Ｎ　Ａ−ベクター複合体を末端のトランスフェラーゼでデ オキシグアノノントリホスフエートの存在下に処理し、ｃＤＮＡ鎖の末端におい てＧ−テイルを発生させる。Ｂａｍ８１部位に隣接する余分のｃＤＮＡ−ｍＲＮ Ａ複合体をＢａｍＨＩ消化により除去し、一方の末端にＢａｍＨ■粘着末端およ び他方の末端にＧ−テイルをもつｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ−ベクター複合体を残す。

この複合体を、５’　ＢａｍＨＩ粘着末端、制限酵素Ｎｏｔ　ｌ５ＥｃｏＲＩお よび５ｓｔｌのための認識配列、および３゛　Ｃ−テイルを有するアニーリング した合成環化リンカ−を使用して環化する。結合および修復後、円形複合体を大 腸菌（Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ）　ＤＨ５α（Ｂ　Ｒ１，、、マリイランド州ガイサー スバーグ）の中に形質転換してｃＤＮＡライブラリーを発生させる。ホホバ胚の ｃＤＮＡバンクはほぼ５００塩基対の平均のｃＤＮＡインサートをもつほぼ１． ５Ｘ１０＠クローンを含有する。

さらに、ホホバのポリアデニル化ＲＮＡを、また、クローニングベクターλＺＡ Ｐ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＴ　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフ ォルニア州すンディエゴ）中でｃＤＮＡライブラリーを構成するために使用する 。このライブラリーは製造業者により供給されたプロトコル、ＤＮＡおよび細菌 の株を使用して構成する。また、製造業者の推奨に従い、ギガバック・ゴールド （Ｇｉｇａｐａｅｋ　Ｇｏｌｄ）バー）ケージング抽出物（ストラタノーン）を 使用してクローンをパッケージングする。この方法において構成されたｃＤＮＡ ライブラリーは、はぼ４００塩基対の平均ｃＤＮＡインサートサイズをもつほぼ １×１０６のクローンを含有する。

Ｂ　ポリメラーゼ連鎖反応 実施例５に記載するようにして得られたアミノ酸配列の情報を使用して、ろうシ ンターゼタンパク質の核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得る。

選択したろうシンターゼのペプチドの断片のアミノ酸配列に相当する合成オリゴ ヌクレオチドを合成する。ろうシンターゼタンパク質の中の断片の順序が知られ ている場合、例えば、ペプチドの１つがＮ−末端からのものであるか、あるいは 選択したペプチドが１つの長いペプチド断片上に含有されているとき、ただ１つ のオリゴヌクレオチドが各選択されたペプチドのために要求される。よりＮ−末 端のペプチドのためのオリゴヌクレオチドのプライマー、すなわち、前方のプラ イマーは、そのペプチドのためのエンコーディング配列を含有する。

よりＣ−末端のペプチドのためのオリゴヌクレオチドのプライマー、すなわち、 逆のプライマーは選択したペプチドのためのエンコーディング配列に対して相補 的である。あるいは選択したペプチドの順序が未知である場合、２つのオリゴヌ クレオチドのプライマーが各ペプチドのために要求され、１つは選択したアミノ 酸配列をエンコードし、そして１つは選択したアミノ酸配列に対して相補的であ る。任！のろうシンターゼタンパク質をオリゴヌクレオチドの構成のために選択 することができるが、より望ましいペプチドは少なくともある数のコドンをエン コードするアミノ酸、例えば、メチオニン、トリプトファン、ソステイン、およ び４コドンより少ないコドンによりエンコードされる他のアミノ酸を含有するも のである。こうして、オリゴヌクレオチドは選択したペプチドのためのすべての 可能な配列の混合物であるとき、縮重オリゴヌクレオチドの数は低いことがある 。

当業者によく知られている技術により、これらのオリゴヌクレオチドのプライマ ーを使用してＰＣＲを実施する。ホホバの核酸配列、例えば、逆転写されたｃＤ ＮＡ、前述のｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡ をこれらの反応において鋳型として使用する。

この方法において、ろうノンターゼのＤＮＡのセグメントをＰＣＲ生成物を遺伝 子操作技術により分析して、望ましいろうノンターゼの断片を生ずる反応を選択 する。

Ｃ１ろうシンターゼ配列についてのライブラリーのスクリーニングＰＣＨにより 得られたろうシンターゼのＤＮＡ断片を標識化し、そしてプローブとして使用し て前述のｃＤＮＡライブラリーからクローンをスクリーニングした。ＤＮＡライ ブラリーのスクリーニングの技術は当業者に知られておりそして、例えば、Ｍａ ｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。この方法において、核酸配列に ついて分析することができかつ原核生物および真核生物の両者のベクター宿主の 中のろうシンターゼの発現のために使用することができる、ろうシンターゼの核 酸配列が得られる。

はぼ１５００ヌクレオチドのｃＤＮＡクローンがこの方法において得られる。表 ２に記載されているろうシンターゼタンパク質と比較すると、５Ｑ１１２９を除 外して、翻訳された配列の中にこれらのペプチドの各々が存在することが明らか である。ホホバ胚のＲＮＡのノザン分析は、ろうシンターゼのｍＲＮＡがほぼ２ ｋｂの長さであることを示す。追加のろうシンターゼの核酸配列は、他のＰＣＲ 技術、例えば、５’　ＲＡＣＥ　（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９８８）８５・８９９８−９００２）を使用して得られる 。あるいは、追加の配列はｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするか、あ るいはゲノムのＤＮＡから得ることができる。ホホバろうシンターゼ遺伝子のＤ ＮＡ配列は第２図に表されている。ｐｃＧＮ１７０３の中に全体のろうシンター ゼ配列を含有する植物をｐｃＧＮ７６１４と表示する。

Ｄ、大％ＩＩＩ　（Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ）中のろうシンターゼの発現ｐｃＧＮ７６ １４からのろうシンターゼ遺伝子を、次のようにして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）発 現ベクターｐＤＲ５４０（ファーマシア）のＴａｃプロモーターのフントロール 下に置く。ｐｃＧＮ７６１４のＤＮＡをベクタ−５ａｌＩ部位において消化し、 そしてＤＮＡポリメラーゼｒ特表千７−５０１２２１　（１９） のクレノー断片およびヌクレオチドＴＴＰおよびｄＣＴＰを使用して末端を部分 的にフィルインする。ＢａｍＨＩで消化しそして末端をｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ でフィルインすることによって、ｐＤＲ５４０ベクターを調製する。ｐｃＧＮ７ ６１４からの１．８ｋｂの断片および消化したｐＤＲ，５４０を低融点のアガロ ースを使用してゲル精製し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して一緒に結合す る。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のプロモーターに関してセンスの向きでろうシンタ ーゼを含有するコロニーをｐｃＧＮ７６２０と表示し、そしてアンチセンスの向 きでろうシンターゼ遺伝子を含有するコロニーをｐｃＧＮ７６２１と表示する。

ろうシンターゼ活性をアッセイするために、ｐｃＧＮ７６２０およびｐＣＧＮ７ ６２１の５０ｍ１の培養物を液体培養において対数期に成長させ、そしてＩ　Ｐ ＴＧを１ｍＭの濃度に添加することによって２時間インキュベーノａンする。細 胞を遠心により収穫し、モしてホホバの抽出物について記載したようにろうシン ターゼ活性についてアッセイする。ＴＬＣ分析により、ｐｃＧＮ７６２０からの 細胞抽出物はろうエステルの合成を指令するが、ｐｃＧＮ７６２１からの対照の 抽出物はろうエステルの合成を指令しないことが示される。

実施例８−　植物の発現のためのろうシンターゼおよびリダクターゼの構成体 植物細胞の中でろうシンターゼおよびリダクターゼの配列を発現させる構成体を 、次のようにして調製することができる。

Ａ１発現力セント 種子の組織の中で優先的に発現される遺伝子からの５゛および３゛領域を含有す る発現カセットを、例えば、ＷＯ９２１０３５６４に記載されているように、ナ ピン、Ｂｃｅ４およびＡＣＰ遺伝子から調製することができる。

例えば、ナピン発現カセットは次のようにして調製することができる。

ろうシンターゼまたはりダクターゼの遺伝子構成体の発現のために使用できるナ ビン発現カセットｐｃＧＮ１８０８は、Ｋｒ１ｄｌら（Ｓｅｅｄ　５ｃｉｅｎｃ ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９９１）１：２０９−２１９）（その開示をここに 引用によって加える）に記載されている。

あるいは、ｐｃＧＮ１８０８はフランキング制限部位を含有するように修飾して 、抗生物質耐性マーカーではなく発現配列のみがバイナリ−ベクター、例えば、 ｐｃＧＮ１５５７　（ＭｃＢｒ　ｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、前掲）に 動くようにさせることができる。ＫｐｎｌＳＮｏｔ＋およびＨｉｎｄｌｌｌの制 限部位を含有する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし、そしてｐｃＧＮ１ ８０８の独特Ｈｉｎｄｌｌｒ部位において結合し、こうしてＨｉｎｄｌ　ｌ　１ 部位のみが回収されるようにする。生ずるプラスミドｐｃＧＮ３２００は、配列 の分析により確証されるように、独特Ｈｉｎｄｌ１１部位、ＮｏｔｌおよびＫｐ ｎｌ制限部位をナピン３゛　−調節配列の３°末端に含有する。

ナビン発現カセットの大部分を、ｐｃＧＮ３２００から、Ｈｉｎｄｌｌｌおよび ５ａｃｌを使用する消化およびＨｉｎｄｌｌｌおよび５ａｃＩ消化ｐｌｃ１９Ｒ （Ｍａｒｓｈら（１９８４）Ｇｅｎｅ３２　：　４８１−４８５）への結合によ りサブクローニングしてｐｃＧＮ３２１２を作る。鋳型としてｐｃＧＮ３２００ を使用しかつ５ａｃｌ部位およびナピン５”　−プロモーターおよびｐｃＧＮ１ ８０８構成体からのｐＣＧＮ３２００のｐＵＣ主鎖の接合をフランキングする２ つのプライマーを使用して、ナピンプロモーター領域の極端の５′−配列を再構 成する。前方のプライマーはＣ１ａＴ、ＨｉｎｄＩＩＩＳＮｏｔ＋およびＫｐｎ ｌ制限部位ならびにナピン５゛−配列のヌクレオチド４０８　４２３　（Ｅｃｏ ＲＶ部位から）を含有し、そして逆のプライマーは５゛−プロモーターの中に独 特Ｓａｃ　Ｉを含むナピン配列７１８−７３９に対する相補性を含有する。パー キン・エルマー／センス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）サーモサイ クラ−を製造業者の仕様書に従い、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ断片を平滑末端の 断片をｐＵｃ８の中にサブクローニングしくＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓ　ｉｎ ｇ　（１９８２）Ｇｅｎｅ　１９　：　２５９−２６８）そしてＨｉｎｃｌｌで 消化してｐｃＧＮ３２１７を生成する。ナピンのインサートを横切るｐｃＧＮ３ ２１７の配列は、不適切なヌクレオチドがＰＣＲにより導入されないことを評価 する。ｐＣＧＮ３２１７の中のナビン５−配列を、ナビン発現カセットの残部に 、Ｃ１ａｌおよび５ａｃｌを使用する消化およびＣ１ａｌおよび５ａｃｌ消化ｐ ｃＧＮ３２１２への結合により結合する。生ずる発現カセットｐＣＧＮ３２２１ をＨ４ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化し、モしてナビン発現配列をゲル精製し、そして Ｈｉｎｄｌｌｌ消化ｐ　Ｉ　Ｃ２ＯＨ（Ｍａ　ｒ　ｓ　ｈ、前掲）に結合する。

最終の発現カセットは、アンビンリン耐性のバックグラウンドの中に、ｐｃＧＮ １８０８において見いだされるのと本質的に同一の１７２５ナピン５°および１ ．２６５５°再結合配列を含有するｐＣＧＮ３２２３である。調節領域はＨｉｎ ｄｌ　Ｉ　Ｉ、ＮｏｔｌおよびＫｐｎｌでフランキングされており、そして独特 ５ａｌｌ、ＢｇｌｌＩ、ＰｓｔｌおよびＸｈｏｌクローニング部位は５゛および ３′非コーデイング領域の間に位置する。

ろうシンターゼ遺伝子の配列をこのようなカセットの中に挿入して、植物の形質 転換法のための発現構成体を得る。例えば、このような構成体は、後述するよう に、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換のためのバイナリ−ベ クターの中に挿入することができる。

Ｂ、ろうシンターゼ遺伝子のプラスミドＤＣＧＮ７６１４をＡｆ　Ｉ　Ｉ　ＩＩ で消化し、そしてアダプターと結合してＢｃ１１部位をＡｆｌｌｌｌ粘着末端に 付加し、次いで５ａｃｌおよびＢｅ１ｌで消化する。ろうシンターゼ遺伝子を含 有する断片をゲル精製し、そして５ａｌｌ／ＢａｎＨＩ　’ｔ１４化ｐＣＧＮ３ ２２３、ナビン発現カセットの中にクローニングする。ナピン発現カセットの中 にセンス向きでろうシンターゼ遺伝子を含有する生ずるプラスミドをｐＣＧＮ７ ６２４と表示する。ｐＣＧＮ７６２４から単離されたＤＮＡをＡｓｐ７１８　Ｃ Ｋｐｎ　Ｉアイソンゾマー）で消化し、モしてナピン／ろうンンターゼ融合遺伝 子をＡｓｐ７１８消化バイナリ−ベクターｐｃＧＮ１５７８の中にクローニング する（ＭｅＢｒｉｄｅおよびＳ’ｕｍｍｅｒｆｅ　１５前掲）。生ずるバイナリ −ベクターをｐＣＧＮ７６２６と表示し、癌腫ＩＩ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ）ＥＨＡｉｏｌの中に形質転換し、モしてアラビドプシス（Ａｒａｂｊｄｏｐ ｓｉｓ）および菜種の外植体の形質転換のために使用する。

Ｃ０植物の形質転換のためにリダクターゼ構成体ナピン遺伝子からの５°および ３°調節領域を使用する植物細胞の中のりダクターゼの発現のための構成体を調 製する。

ｐｃＧＮ７５７１と表示するりダクターゼｃＤＮＡ　（前述のｐＣＧＮ１７０３ ベクターの中の）を５ｐｈｌで消化しく塩基１５９４−１５９９における３゛未 未翻訳列における部位）モして５ａｌｌリンカ−をこの部位に挿入する。生ずる プラスミドをＢａｍＨＩおよび５ａｉｌで消化し、そしてリダクターゼｃＤＮＡ を含有する断片をゲル精製し、そしてＢｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ消化ｐＣＧ Ｎ３２２３、前述のナピンカセットの中にクローニングしてｐＣＧＮ７５８５を 生成する。

ナピン５°／リダクターゼ／ナピン３゛構成体を含有するｐＣＧＮ７５８５（７ ）Ｈｉｎｄｌ　ＩＩ断片をＨｉｎｄＩ　ｒ　Ｉ消化ｐｃＧＮ１５７８（ＭｃＢｒ ｉｄｅおよびＳｕｍｍｅ　ｒ　ｆ　ｅ　Ｉ　ｔ、前掲）の中にクローニングして 、植物の形質転換のためのバイナリ−ベクターｐＣＧＮ７５８６を生成する。

ナピンのプロモーターの発現下にホホバのリダクターゼ遺伝子をまた含有する、 植物の形質転換構成体ｐＣＧＮ７５８９を次のようにして調製する。ｐｃＧＮ７ ５７１を突然変異誘発して、リダクターゼコーディング配列の最初のＡＴＧＩ： Ｎｄｅ１部位およびＮｄｅ１部位の直ぐ上流にＢｇｌＪＪ部位を導入する。Ｂａ ｍＨＩリンカ−をリダクターゼコーディング領域の上流にｓｐｈ　１部位を導入 する。１．５ｋｂのＢｇｌｌｌ−ＢａｍＨ１断片をゲル精製し、そしてＢｇｌ　 Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ３６８６　（下を参照）の中にクローニングし てｐＣＧＮ７５８２を生成する。

ｐＣＧＮ３６８６はブルースクリプトＫＳ＋　（ストラタジーン・クローニング ・システムス、カリフォルニア州ザンディエゴ）から誘導されたクローニングベ クターであるが、クロランフェニコール耐性遺伝子および修飾されたリンカ−領 域を有する。クロランフェニコール耐性遺伝子源ｐＣＧＮ５６５はｐＵｃ１２− Ｃｍに基づくクローニングベクター（Ｋ、Ｂｕｃｋｌｅｙ　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓ ｉｓＳｐｈｉＸ１７４溶解遺伝子の調節および発現、カリフォルニア大学、サン ディエゴ、１９８５）であるが、ｐＵｃ１８リンカ−（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ ｒｏｎら、Ｇｅｎｅ　（１９８５）５３　：１０３−１１９）を含有する。ｐＣ ＧＮ５６５をＨｈａｌで消化し、そしてクロランフェニコール耐性遺伝子を含有 する断片を切除し、ヤエナリのヌクレアーゼの使用により平滑末端とし、そして ブルースクリプトＫＳ＋　（ストラタジーン・カリフォルニア州うジョラ）のＥ ｃｏＲＶ部位の中に挿入してｐｃＧＮ２００８をつくる。ｐｃＧＮ２００８のク ロランフェニコール耐性遺伝子をＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌ＋消化により除去す る。クレノー酵素で処理して末端を平滑末端とした後、断片をＤｒａ　Ｉ消化ブ ルースフリブ１−ＫＳ＋に結合する。クロランフェニコール耐性と置換した抗生 物質耐性を含有するＤｒａｌ断片を有するクローンを選択し、そしてｐｃＧＮ２ ０１５と命名する。ｐｃＧＮ２０１５のリンカ−領域を修飾して、Ｉ　ａｃＺリ ンカ−領域において５°→３゛に、次の制限消化部位を含有するｐＣＧＮ３６８ ６を生成する：Ｐｓｔｌ、Ｂｇ１１１．ＸｈｏｌＳＨ４ｎｃｌｌ、５ａｌｌ、Ｈ ｉｎｄｌｌｒ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、Ｓｍａ■、＋３ａｍＨｆ、 ５ｐｅｌ、Ｘｂａｌおよび５ａｃｋ。

Ｘｈｏ　Ｉリンカ−をｐＣＧＮ７５８２のＸｂａ１部位に挿入す。リダクターゼ 遺伝子を含有するＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片を単離し、そしてＢｇｌｌ ｌ−ＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ３２２３の中にクローニングする。

ホホバの遺伝子からの５°未翻訳リーダー配列を欠如する生ずるプラスミドを、 ｐｃＧＮ７８０２と表示する。Ｉ）ＣＧＮ７８０２から生ずるナビン／リダクタ ーゼ断片をＨｉｎｄｌｌｌで消化し、そしてＨｉｎｄ［１■消化ｐｃＧＮ１５７ ８の中にクローニングしてｐｃＧＮ７５８９を生成する。

ｐＣＧＮ７５８６およびｐＣＧＮ７５８９を、Ｈｏ１ｓｔｅｒｓらの方法（Ｍｏ １．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、（１９７８）１６３二１８１−１８７）により、癌腫 菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細胞、例えば、株ＥＨＡ　１０１の細胞（ Ｈｏｏｄら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８６）１６８　：１２９１− １３０１）の中に形質転換し、そして後述するように植物の形質転換法において 使用する。

実施例９−　植物の形質転換法 問題のＤＮＡ配列を植物宿主のゲノムの中に挿入して配列を転写または転写およ び翻訳して表現型を変化させるために、種々の方法が開発されてきている。

ブランカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ｃ＋）形質転換高いエルカ酸の種子、例えば、栽 培変種植物のレストン（Ｒｅｓｔ。

口）、またはブランカ・ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）のカノラ（Ｃ ａｎｏ　Ｉ　ａ）型変種の種子を９５％のエタノールの中で２分間ソーキングし 、１ｍのツイーン２０を含有する次亜塩素酸ナトリウムの１０％溶液の中で２分 間表面滅菌し、そして無菌の蒸留水の中で３回すすぐ。次いで、ピリドキシン（ ５０μｇ／ＩＬニコチン酸（５０μｇ／ｌ）、グリノン（２００１１ｇ／Ｉ）お よび０．６％のフィタガル（Ｐｈｙｊ、ａｇａｒ）（ギブ：］　（Ｇ　ｉ　ｂｃ ｏ））ｐＨ５，８を補充した１／１０濃度のムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｇｅ）最小 有機培地（ギブコ。

ニューヨーク州グランドアイランド）を有するマゲンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）ボッ クスの中に種子を入れる。パーシバル（Ｐｅｒｃｉｖａｌ）チャンバーの中で２ ２℃においてほぼ６５μアインシュタイン／平方メートル／秒（μＥｍ”Ｓ−り の強度の冷蛍光および赤色光を使用する１６時間の光周期で、種子を発芽させる 。

胚軸を５〜７の日齢の実生から切除し、はぼ１ｍｍの長さの片に切り、そしてフ ィーダープレート上にプレートする（Ｈｏｒｓｃｂら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９ ８５）２２７：　１２２９−１２３１）、使用の１日前に、約３０ｍ１のＭＳ塩 塩基（カロリナ・バイオロジカル（Ｃａｒｏｌｉｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ） 、ノースカロライナ州バーリントン）１０Ｑｍｇ／ｌのイノシトール、１．３ｍ ｇ／Ｉのチアミン−ＨＣｌ、２００　ｍ　ｇ　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏａおよび３％のス クロース、２．　４−Ｄ　（１，０ｍｇ／ＩＬ０．６％ｗ／ｖフィタガル（Ｐｈ ｙｔａｇａｒ）を含有しそしてオートクレーブ処理の前にｐＨ５，８に調節した ペトリ皿（１００Ｘ２５ｒｎｒｎ）（ＭＳ　Ｏ／１／Ｄ培地）上に１．０ｍｌの タバコ懸濁培養物をプレートすることによって、フィーダープレートを調製する 。使用前に、無菌の濾紙のディスク（ワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）３ｍｍ） をフィーダ一層の上部に配置する。毎週２．　４−Ｄ　（０，２ｍｇ／Ｉ）、カ イネチン（Ｋｉｎｅｔｉｎ）（０，１ｍｇ／Ｉ）を含むフィーダープレートにつ いて前述したような１００ｍ１の新鮮なＭＳ培地の中に１０ｍ１の培養物を移す ことによって、タバコの懸濁培養物を継代培養する。

フィーダー細胞を使用しない実験において、胚軸を切断し、そしてＭＳＯ／Ｉ１ ０培地の上部上の濾紙のディスク上に配置する。強度３０μＥｍ−２３−’〜６ ５μＥｍ′□２Ｓ−１の連続的光の中で、胚軸の外植体をフィーダープレート上 で２４時間の間２２℃において前インキュベーションする。

所望の遺伝子構成体を有するバイナリ−プラスミドを含有するアグロバクテリウ ム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＫＥＨＡＩＯＩの単一の コロニーを、５ｍｌのＭＧ／Ｌブロスに移し、そして３０℃において一夜成長さ せる。胚軸の外植体をｌＸｌ０＠細ｍ／ｍ１に希釈した細菌を有する７〜１２ｍ １のＭＧ／Ｌブロスの中に浸漬させ、そして１０〜２５分後、フィーダープレー ト上に配置する。１リツトル当たりＭＧ／Ｌブロスは５ｇのマンニトール、１ｇ のし一グルタミン酸または１．．１５ｇのグルタミン酸ナトリウム、０．２５ｇ のＫＨ。

ＰＯ，，０，１０ｇのＮａＣＬ　０．１０ｇのＭｇＳＯ４・’７Ｈｚ０，１ｍｇ のビオチン、５ｇのトリプトファン、および２．５ｇの酵母エキスを含有し、そ してブロスをｐＨ７，０に調節する。癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と ４８時間共インキュベーションした後、胚軸の外植体を濾過滅菌したカルベニシ リン（５００ｍｇ／ｌ、オートクレーブ処理後に添加する）および硫酸カナマイ シン（ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ） 、インジアナ州インジアナポリス）を２５ｍｇ／ｌの濃度で含有するＢ５　０／ Ｉ１０力ルス誘発培地に移す。

６５μＥｍ−２８−１の連続的光の中で３〜７日間培養した後、カルスの組織は 切断表面上に可視であり、そして胚軸の外植体をシュート誘発培地、Ｂ５ＢＺ（ ３ｍｇ／Ｉのベンジルアミノプリン、１ｍｇ／Ｉのゼアチン、１％のスクロース 、０．６％のフィタガル（Ｐｈｙｔａｇａｒ）を補充しそしてｐＨ５，８に調節 した）に移した。この培地は、また、カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）および 硫酸カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する。胚軸の外植体を２週毎に新鮮な シュート誘発培地上に継代培養する。

１〜３力月後に、シュートは胚軸カルスから再生する。少なくとも１ｃｍの高さ の緑色のシュートをカルスから切除し、そしてＢ５塩およびビタミン、１％スク ロース、カルベニシリン（３００ｍｇ／Ｉ）、硫酸カナマイシン（５０ｍｇ／Ｉ ）および０，６％Ｗ／Ｖフィタガル）を含有する培地上に配置する。２〜４週後 、緑色に止まるシュートを基部で切断し、そして根誘発培地（Ｂ５塩およびビタ ミン類、１％スクロース、２ｍｇ／］ヨード酪酸、５０ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシ ンおよび０．６％フィタガル）を含有するマジエンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）ボック スに移す。

緑色の根づいたシュートをチオエステラーゼ活性について試験する。

アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）植物 を、Ｖａｌｖｅｒｋｅｎｓら（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ １９８８）８５：５５３６−５５４０）により記載されるように、癌腫菌（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換から得ることができる。構成体を、Ｈｏ １ｓｔｅｒｓら（Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９７８）１６３：１８１ −１８７）の方法により、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞、例えば 、ＥＨＡＩＯＩ（Ｈ。

ｏｄら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（１９８６）１６８：１２９１−１３ ０１）の中に形質転換する。

植物の形質転換 問題のＤＮＡ配列を、少なくともプロモーター領域、問題の遺伝子および停止領 域に相当する発現カセットとして、粒子衝撃により植物のゲノムの中に導入する ことができる。

簡単に述べると、０．５ｍｍ〜３ｍｍの範囲の大きさのタングステンまたは金の 粒子を発現カセットのＤＮＡで被覆する。このＤＮＡは水性混合物または乾燥Ｄ ＮＡ／粒子沈澱物の形態であることができる。

衝撃ののための標的として使用する組織は、胚軸の外植体、シュートの分裂組織 、未熟の小菓、または朽からのもであることができる。ＤＮＡ被覆粒子による組 織の衝撃は、バイオリスティクス（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）粒子ガン（デュポン 社：デラウエア州つィルミントン）を使用して実施する。粒子をバレルの口がら １ｃｍ〜１４ｃｍの変化する距離の範囲でバレルの中に入れる。衝撃すべき組織 を停止プレートの下に配置する。試験を組織について２０ｃｍまでの距離で実施 する。発射の瞬間において、組織をナイロンネットまたはナイロンネットと１０ ｍｍ〜３００ｍｍの範囲のメッシュとの組み合わせにより保護する。

衝撃後、植物をＡｔ　ｒｅｙａら（Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　（１９８’４）３４：３７９−３８３）の方法に従い再生することができる 。簡単に述べると、胚の軸組織または子葉のセグメントをＭＳ培地（Ｍｕｒａｓ ｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９６２）１５： ４７３）（子葉のセグメントについてＭＳ＋２０．ｍｇ／ｌの６−ベンジルアデ ニン（ＢＡ））上に配置し、そして暗所で２５±２℃において１週間インキュベ ーションし、引き続いて連続的冷い白色の蛍光（６，８Ｗ／ｍ”）に移す。培養 の第１０日に、小植物を無菌の土を含有するポットに移し、日陰に３〜５日間保 持し、そして最後に温室に移す。推定上のトランスジェニックシュートは根づく 。植物のゲノムの中への外因性ＤＮＡの組み込みは、この分野において知られて いる種々の方法により確証することができる。

実施例１０−　ろう生産のための形質転換された植物の分析形質転換された植物 からの種子または他の植物材料を、実施例１に記載するろうシンターゼのアッセ イ法により、ろうシンターゼ活性について分析することができる。

リダクターゼおよびろうシンターゼの両者の構成体を有する植物を、また、アッ セイしてろうの生産を測定する。このような植物は、前述したように、癌腫１１ （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換により準備することができる。所望 の遺伝子構成体の両者を有する植物は、リダクターゼおよびろうシンターゼの両 者の構成体で共形質転換するか、あるいは単一の植物の形質転換のバイナリ−ベ クター上でろうシンターゼおよびリダクターゼの構成体を組み合わせることによ って、準備することができる。さらに、ろうシンターゼを発現する植物またはり シンターゼを発現する植物を他の所望の遺伝子配列をエンコードする構成体で再 形質転換する方法を使用して、このようなりシンターゼおよび零賀的にを発現す る植物を得ることができる。あるいは、ここに記載する方法により生産されたり シンターゼを発現するトランスジェニック植物を、同様に生産されたろう゛シン ターゼを発現する植物と交雑することができる。

この方法において、植物の品種改良の既知の方法を使用してリダクターゼおよび ろうシンターゼを発現するトランスジェニック植物を得る。

このような植物は、例えば、Ｔａｎ　ｉら（前掲）により記載されるように、ろ うエステルからＴＡＧを分離することによって、ろうエステルの存在についてア ッセイすることができる。ＧＣ分析法を使用して、例えば、Ｐｉｎａら（Ｌｉｐ ｉｄｓ　（１９８７）２２　（５）：３５８−３６１に記載されているように、 生ずるろうを分析することができる。

上の結果は、脂肪アルコールおよび脂肪アシルの基質からのろうエステルの生成 において活性である、部分的に精製されたろうシンターゼタンパク質を得る能力 を実証する。ろうシンターゼタンパク質およびそれらのアミノ酸配列を得る方法 が提供される。促進、アミノ酸配列から得られるろうシンターゼの核酸配列が、 また、提供される。これらの核酸配列を操作して、宿主細胞の中でろうシンター ゼタンパク質の配列の転写および／または発現を得ることができ、このようなタ ンパク質は種々の用途に使用することができる。このような使用は、脂肪アルコ ール基質源を有する宿主細胞の中でろうシンターゼを使用するときのろうエステ ルの生産を包含し、このような基質は宿主細胞に対して固有であるか、あるいは 脂肪アシル基質からのアルコールの生成において活性である脂肪アシルリダクタ ーゼタンパク質をエンコードする組み換え構成体の使用により供給することがで きる。

この明細書の中に引用したすべての刊行物および特許出願は、各個々のの刊行物 および特許出願が特別にかつ個々に引用によって加えるべきであることを示した 場合、ここに引用によって加える。

本発明を明瞭さおよび理解を目的として例示および実施例により多少の詳細に記 載したが、当業者とって本発明の教示に照らして容易に明らかなように、本発明 の精神および範囲から逸脱しないで変化および変更が可能である。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＣＡ 、ＪＰ、ＫＲ，ＵＳＩ （Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｃ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃｌ２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　ラスナー、マイケル　ダブリュ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５６１６゜ディビス、ファルコン　アベニ ュ　７２１

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．ろうシンターゼタンパク質の少なくとも一部分をエンコードする核酸配列、 および前記ろうシンターゼエンコーディング配列に天然に関連しない異種ＤＮＡ 配列を含んでる組み換えＤＮＡ構成体。
2. ２．前記ろうシンターゼが脂肪アシルーＣｏＡ基質に対して活性である請求の範 囲１の構成体。
3. ３．前記ろうシンターゼが式Ｃ２ｘ（式中Ｘは群６〜１２から選択される）の炭 素鎖を有する脂肪アシル基質に対して活性である請求の範囲１の構成体。
4. ４．前記ろうシンターゼが式Ｃ２ｘ（式中Ｘは群６〜１２から選択される）の炭 素鎖を有する脂肪アルコール基質に対して活性である請求の範囲１の構成体。
5. ５．前記ろうシンターゼエンコーディング配列が種子植物からのものである請求 の範囲１の構成体。
6. ６．前記ろうシンターゼエンコーディング配列がホホバからのものである請求の 範囲１の構成体。
7. ７．宿主細胞において前記ろうシンターゼエンコーディング配列の少なくとも転 写を提供するプロモーターをさらに含む請求の範囲１の構成体。
8. ８．前記プロモーターが植物細胞において前記ろうシンターゼエンコーディング 配列の発現を提供する請求の範囲７の構成体。
9. ９．前記植物細胞が植物胚種子細胞である請求の範囲８の構成体。
10. １０．前記プロモーターが細菌細胞において前記ろうシンターゼエンコーディン グ配列の発現を提供する請求の範囲７の構成体。
11. １１．前記プロモーターが植物胚種子細胞の中で優先的に発現される遺伝子であ る請求の範囲８の構成体。
12. １２．請求の範囲１の構成体を含んでなる細胞。
13. １３．請求の範囲１の構成体を含んでなる植物細胞。
14. １４．脂肪アシルリダクターゼタンパク質をエンコードする核酸配列を含んでな る組み換え構成体；および ろうシンターゼタンパク質をエンコードする核酸配列を含んでなる組み換え構成 体； を含んでなる宿主細胞であって、ここで前記ろうシンターゼエンコーデイング配 列は前記宿主細胞に対して異種であり、そして前記リダクターゼおよびろうシン ターゼエンコーディング配列は前記宿主細胞の中で機能的なプロモーターの調節 コントロール下にある、宿主細胞。
15. １５．前記宿主細胞が植物細胞である、請求の範囲１４の宿主細胞。
16. １６．前記植物細胞がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物細胞である、請求の範 囲１５の植物細胞。
17. １７．請求の範囲１の構成体からなるブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物細胞。
18. １８．種子植物のろうシンターゼからなる原核生物細胞。
19. １９．工程： 組み換え構成体を含んでなる宿主細胞を成長させ、前記構成体はろうシンターゼ をエンコードする核酸配列を含んでなり、ここで前記ろうシンターゼエンコーデ ィング配列は前記細胞の中で機能的な調節要素のコントロール下にあり、 前記成長を前記ろうシンターゼエンコーディング配列の発現を引き起こす条件下 に実施する、 を含んでなる宿主細胞るの中でろうシンターゼを生産する方法。
20. ２０．前記宿主細胞が原核生物である請求の範囲１９の方法。
21. ２１．前記宿主細胞が種子植物の胚細胞である請求の範囲１９の方法。
22. ２２．前記種子植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である請求の範囲２１の方 法。
23. ２３．前記ろうシンターゼエンコーディング配列が種子植物からのものである請 求の範囲１９の方法。
24. ２４．工程： 組み換え構成体を含んでなる宿主細胞を成長させ、前記構成体はろうシンターゼ をエンコードする核酸配列を含んでなり、ここで前記ろうシンターゼエンコーデ ィング配列は前記宿主細胞の中で機能的な調節要素のコントロール下にあり、そ して前記宿主細胞は前記ろうシンターゼの脂肪アルコール基質を含んでなり、前 記成長を前記ろうシンターゼ配列の発現を引き起こす条件下に実施する、 を含んでなる宿主細胞の中でろうシンターゼを生産する方法。
25. ２５．異種組み換え構成体からの脂肪アシルリダクターゼエンコーディング配列 の発現の結果として、前記ろうシンターゼの前記脂肪アルコール基質が前記宿主 細胞の中で生産される、請求の範囲２４の方法。
26. ２６．前記宿主細胞が植物細胞である、請求の範囲２４または２５の方法。
27. ２７．前記植物細胞が種子植物の胚細胞である、請求の範囲２６の方法。
28. ２８．前記種子植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である請求の範囲２７の方 法。
29. ２９．請求の範囲２４または２５の方法により生産されたろうエステルからなる 宿主細胞。
30. ３０．前記宿主細胞が植物細胞である、請求の範囲２９の宿主細胞。
31. ３１．前記植物細胞がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子の胚細胞である、請 求の範囲３０の宿主細胞。
32. ３２．前記種子細胞の内部の脂質貯藏組織がろうエステルからなるブラシカ（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ）の種子細胞。
33. ３３．前記ろうエステルが長鎖ろうエステルである、請求の範囲３２のブラシカ （Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子細胞。