JPH07501701A

JPH07501701A - 植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子

Info

Publication number: JPH07501701A
Application number: JP5510279A
Authority: JP
Inventors: ブローズ，ジヨン; グロー，ルイス・ペレズ; キニー，アンソニー・ジエイ; ピアース，ジヨン・ダブリユー，ジユニア; ウイアーズビツキ，アンナ・エム; ヤダブ，ナレンドラ・エス
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 1995-02-23
Also published as: EP0616644A1; WO1993011245A1; AU675923B2; DK0616644T3; AU3228893A; US5952544A; CA2124673A1; DE69233118D1; US20090205066A1; EP0616644B1; DE69233118T2; CA2124673C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子発明の分野本発明は、脂肪酸不飽和化酵素（デサチュラーゼ）をコード化すル核酸フラグメントの製造およびそれを用いて植物脂質組成物を修飾することに関する。

発明の背景植物の脂質は、種々の産業および栄養用途を有しており、そしてこれらは、植物の膜機能および気候適合の中心を成している。これらの脂質は、幅広い列の化学構造を表し、そしてこれらの構造により、その脂質が示す生理学的および産業的特性が決定される。これらの構造が多数存在していることは、直接もしくは間接的に、その脂質の不飽和度を変化させる代謝過程の結果によるものである。異なる植物における異なる代謝管理によりこれらの変化した脂質が産生され、そして所望の脂質を経済的に多量生産するには通常、外来植物種を内在化させるか或は農業経営的に適合した種を修飾することが必要とされている。

植物脂質の主要な用途は、トリアジルグリセロール類の形態の食用油としてである。食用油が示す特定の性能および健康上の特質は、主にそれらが有する脂肪酸組成によって決定される。商業的植物変種から誘導される大部分の植物油は主にバルミチン酸（１６：Ｏ）、ステアリン酸（１８：Ｏ）、オレイン酸（１８：　１）　、リノール酸（１８：２）およびリルイン酸（１８：　３）で構成されている。バルミチン酸とステアリン酸は、それぞれ１６−および１８炭素長の飽和脂肪酸である。オレイン酸、リノール酸およびリルイン酸は、それぞれ二重結合を１個、２個および３個含んでいる１８炭素長の不飽和脂肪酸である。オレイン酸は−（モノ）不飽和脂肪酸と呼ばれている一方、リノール酸およびリルイン酸は多（ポリ）不飽和脂肪酸と呼ばれている。通常用いられる食用植物油内の飽和および不飽和脂肪酸の相対的量を下記に要約する選択した曲用作物の油の中に存在している飽和および不飽和脂肪酸のパーセント飽和　−不飽和　多不飽和カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）　６％　５８％　３６％ダイズ　１５％　２４％　６１％トウモロコシ　１３％　２５％　６２％ビーナツツ　１８％　４８％　３４％ベニバナ　９％　１３％　７８％ヒマワリ　９％　４１％　５１％綿　３０％　１９％　５１％最近の数多くの研究努力により、冠心臓病の危険を低くすることで飽和および不飽和脂肪酸が果す役割が調査された。過去においては、飽和および多不飽和物と対照的に、−不飽和物は血清コレステロールおよび冠心臓病の危険に対して何の効果も示さないと信じられていた。最近のいくつかのヒト臨床研究により、−不飽和脂肪が高くて飽和脂肪が低い食事は、「良い」　（高密度リポ蛋白質）コレステロールを維持しながら「悪い」　（低密度リポ蛋白質）コレステロールを低くし得ることが示唆されている（Ｍａｔｔｓｏｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８５）　２６：ｌ９４−２０２）。

飽和物全体が少な（て−不飽和物が多い植物油は、消費者に有意な健康的利点を与えると共に曲加工業者に経済的利点を与える。例として、カノーラ油は非常に健康的な油であると見なされる。しかしながら、使用において、カノーラ油内の多不飽和脂肪酸レベルが高いことで、この油は不安定で酸化され易いと共に、不快な臭気と風味を生じ易い（Ｓｔｕｍｐｆ、　Ｐ、　Ｋ、編集「植物の生化学Ｊ　（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ）　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋの第４巻、８５−１１６頁、Ｇａ１ｌｌｉａｒｄ、　１９８０）　ｏ水添を行うことによってこの多不飽和物のレベルを下げることも可能であるが、この方法は高価であると共に、残存している不飽和脂肪酸の、栄養的に問題となり得るトランス異性体が同時に生じることから、その水添を行った油の全体的望ましさが低下する（Ｍｅｎｓｉｎｋ池、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ。

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９９０）　Ｎ３２３：４３９−４４５）　、ダイズ油およびトウモロコシ油に関しても同様な問題が存在している。

特殊な用途では、高レベルの多不飽和物が望ましい可能性がある。リル−トおよびリルネートは、人の食事に必須な脂肪酸であり、これらの脂肪酸類が豊富な食用油は、例えばベビーフードにおける栄養補給の目的で用いられ得る。亜麻植物（Ｌｉｎｕｍ　ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）から誘導されるあまに油は、リルイン酸を５０％以上含んでおり、そしてこれらの脂肪酸が有する二重結合は酸素と迅速に反応し重合して柔らかな柔軟性を示すフィルムを生じることから、家庭用および産業用コーテイング物として幅広く用いられている。亜麻に入っている油含有量はカノーラに匹敵しているが（種子乾燥重量の約４０％）、高収率が得られるのは温い温度の気候か或は亜熱帯気候でのみである。米国内の亜麻はさび病感染を非常に受け易い。適当なデサチュラーゼ遺伝子（類）を用いて遺伝的にダイスまたはカノーラの如き作物を形質転換させてリルイン酸含有量が高い油を合成することができるならば、これは経済的有効性ヲ示すであろう。

農業経営学的種の食用油の中に見いだされる多不飽和脂肪酸レベルを変化させるにおいて、変異育種プログラムがいくらか成功している。商業的に育てられている変種の例は、高（８５％）オレイン酸のヒマワリおよび低（２％）リルイン酸の亜麻である（Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ、　Ｔ、　Ｈ，編集「油脂産業会報のためのバイオテクノロジーに関する世界会議、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’　５ｏｃｉｅｔｙＪにおける３５−３８頁のＫｎｏｗｌｅｓ、　（１９８０））　ａ表１に示す他の植物に関する同様な商業的進展は、植物の耐久力および可能な収率に対する変異管理の操作および多相遺伝の効果が示す性質が異なっていることから、太き（捕え所のないものであった。

主要な植物脂質の生合成が数多くの研究の焦点であった（Ｂｒｏｗｓｅ他、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｍｏ１．　Ｒｉａｌ、（１９９１）　４２：４６７−５０６）　ｏ　これらの研究の結果、可溶ステアロイル −アシル担体蛋白質デサチュラーゼが例外である点は注目に値するが、膜会合脂肪酸デサチュラーゼが不飽和脂肪酸の産生調節段階を触媒していることが示された。不飽和化反応は、ガラクトラピッド類、スルホラピッド類およびホスホラピッド類を含む種々の基質が用いられて、プラスチド類および小胞体内で生じる。

種々の脂肪酸不飽和化反応で有効性を示すアラビドプシス・タリアナ（＾ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）核変異体を遺伝的および生理学的に分析した結果、その植物内の単−遺伝塵でコード化された酵素が上記反応の大部分を触媒していることが示された。これらの分析により更に、脂肪酸不飽和化の欠乏が異なると、これらの植物が示す超構造形態、寒冷地感受性および光合成能力に対して異なる難解な影響が生じ得ることも示された（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ他、Ｂｉｏｃｈｉａ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　（１９９１）　１９８２：１−２６）　、しかしながら、これらのデサチュラーゼ反応に関する生化学的特徴付けは不完全であった。これらの酵素が不安定であることと共に、それらの適当なアッセイが取り扱いにくいことで、粗膜調合物における酵素活性を調査する研究は太き（制限されていた。しかしながら、このような調査が行われた結果、２−オレオイルーホスファチンルコリンおよび２−リルオイルーホスプアチジルコリンからそれぞれリル−トおよびリルネートが作り出される時にデルタ−１２デサチユラーゼおよびデルタ−１５デサチユラーゼが示す作用の役割が示された（ｆａｎｇ他、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　（１９８８）　２６：７７７−７９２）　。従って、これらの酵素が示す活性を修飾することは、遺伝工学を用いて脂質の不飽和レベルを変化させることに関して魅力的な標的である。

ステアロイルーアンル担体蛋白質デサチュラーゼ、即ち知られているただ１つの可溶脂肪酸デサチュラーゼに関する、植物由来遺伝子が記述された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　（１９９１）　８８：２５７８−２５８２；　５ｈａｎｋｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　（１９９１）　８８：２５１０−２５１４）。酵母菌、ラットおよびマウス由来のステアロイル−補酵素− Ａデサチュラーゼ遺伝子もまた記述された（Ｓｔｕｋｅｙ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９９０）　２６５：２０１４４−２０１４９；　Ｔｈ１ｅｄｅ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８６）　２６１：１３２３０−１３２３５；　Ｋａｅｓｔｎｅｒ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８９）　２６４：１４７５５−１４７６）　ｃ高等植物由来のステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ以外の脂肪酸デサチュラーゼまたはそれらの相当する遺伝子の単離を記述している証拠は、公開された技術の中には全く存在していない。ラン色細菌であるシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）　Ｐ　ＣＣ６８０３由来の脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子もまた記述された（Ｗａｄａ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９９０）　３４７：２００−２０３）　。この遺伝子は、ガラクトリピッド類の第−位の所でオレイン酸からリルイン酸への変換を触媒する脂肪酸デサチュラーゼ（ｄｅｓＡと表示する）をコード化する。しかしながら、これらの遺伝子は、配列依存プロトコルを用いてステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ以外の植物脂肪酸デサチュラーゼを単離するには有効でないことが確かめられており、そしてこの技術には、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ以外の植物脂肪酸デサチュラーゼをどのようにして入手するか、或は脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をどのようにして入手するかに関しては何ら示されていない。従って、この技術には、グリセロリピッドデサチュラーゼをどのようにして植物から入手するかは教示されていない。更に、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ以外の脂肪酸デサチュラーゼをコード化する核酸を用いて植物内不飽和脂肪酸の性質およびレベルを調節する方法が本技術分野で公知であることの証拠は全く存在していない。

主要でない植物脂質の生合成はあまり研究されていない。植物領域から多くの、即ち数百に及ぶ異なる脂肪酸が見付は出されているが、それらの脂質含有量に関する研究が行われたのは、全ての植物のわずかな部分のみであった（Ｇｕｎｓｔｏｎｅ他編集（１９８６）　ｒ脂質ハンドブックＪ　（ＴｈｅＬｉｐｉｄｓ　Ｈｎａｄｂｏｏｋ）、Ｃｈａｍｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ　Ｌｔｄ、　、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）　、従って、このような通常でない脂肪酸および脂肪酸誘導体の生合成に関してはほとんど知られていない。このような脂肪酸で見られる興味の持たれる化学的特徴には、例えば脂肪酸鎖に沿った幅広い数の位置および構造配置におけるアレン結合および共役二重結合、アセチレン結合、トランス二重結合、多重二重結合、および単一二重結合などが含まれる。同様に、恐らくは、不飽和化によるこの脂肪酸の化学的活性化の後に続くさらなる代謝を通して、その通常でない脂質の中に見られる構造的修飾の多く（例えばヒドロキシル化、エポキシ化、環化など）が生じるか、或はこれらは、機構的に不飽和化に類似した化学反応を伴う。例えば、ステアリン酸のデルタ−９位にある炭素を硫黄原子に置き換えることによって、脂肪酸のヒドロキシル化機構は真核生物における酵素触媒不飽和化の一般的機構の一部であることに関する証拠が得られた。このチオステアレートを酵母菌抽出液と一緒にインキュベートすると、これは９−スルホキサイドに変化した（Ｂｕｉｓｔ他（１９８７）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２８：８５７−８６０）。このスルホキサイド化は、そのデルタ− ９位の硫黄に特異的であり、酵母菌のデルタ−９−デサチュラーゼ欠失変異体では生じなかった（ＢｕｉｓｔおよびＭａｒｅｃａｋ　（１９９１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３２：８９１−８９４）　ｏこの９−スルホキサイドは、９−ヒドロキシオクタデカステアレートの硫黄類似物、即ち提案されている、ステアレート不飽和化の中間体である。

従って、脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡは、脂肪酸ヒドロキシラーゼ類をコード化するｃＤＮＡ、並びに脂肪酸不飽和化に類似した反応機構を有する酵素をコード化する他のｃＤＮＡに有効な、プローブとして働き得る。このような特徴をそれらの構造の中に有している脂肪酸および誘導体の多くは、適当なデサチュラーゼをコード化する遺伝子を農業経営学的に有効な種に導入することによってこれらの種が上記脂肪酸および誘導体を合成するように誘発を行うことが可能になったならば、商業的有効性を示し得る。

発明の要約出願者らは、植物内の不飽和脂肪酸の性質およびレベルを調節する手段を見い出した。グリセロリピッドデサチュラーゼのｃＤＮＡまたは遺伝子由来の核酸フラグメントを用いてキメラ遺伝子を作り出す。これらのキメラ遺伝子を用いて種々の植物の形質転換を行うことによって、その植物の脂肪酸組成物か或はその植物が産生ずる油の修飾を行うことができる。より詳細には、本発明の１つの態様は、植物のデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化するヌクレオチド配列を含んでいる単離された核酸フラグメントであり、配列同定番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０Ｓ）　＋　１．４．６．８．１０，１２．１４または１６がコード化するポリペプチドに対するアミノ酸の同一性は５０％、６５％、９０％またはそれ以上である。これらの態様における単離フラグメントは、ダイズ、脂肪種子であるアブラナ種、アラビドプシス・グリアナおよびトウモロコシから成る群から選択される植物から単離されるものである。

本発明の別の態様は、配列依存プロトコルでこれらの核酸フラグメントを用いることを伴うものである。その例には、これらのフラグメントをハイブリッド形成プローブとして用いて他のグリセロリピッドデサチュラーゼのｃＤＮＡまたは遺伝子を単離することが含まれる。関連態様は、これらの開示した配列を用いて他のグリセロリピッドデサチュラーゼ類をコード化するＤＮＡフラグメントを増幅させることを伴っている。

本発明の別の面は、形質転換した植物細胞内のりルイン酸レベルを変化させ得るキメラ遺伝子を伴うものであり、この遺伝子は、植物のデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化する核酸フラグメントを含んでおり、適切な調節配列に適切な配向で使用可能なように連結している配列同定番号１．４．６．８．１０．１２．１４または１６がコード化するポリペプチドに対するアミノ酸同一性は５０％、６５％、９０％またはそれ以上である。好適なものは、デルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼのｃＤＮＡまたは遺伝子をコード化する核酸フラグメントを取り込んでいるキメラ遺伝子である。この記述するキメラ遺伝子を含んでいる植物およびその植物の種子から得られる油も請求する。

本発明の更に別の態様は、リルイン酸（１８：３）を変化したレベルで含んでいる種子油の製造方法を伴っており、この方法は、（ａ）上述したキメラ遺伝子を用いて植物細胞の形質転換を行い、（ｂ）段階（ａ）で形質転換した植物細胞から繁殖力のある植物を成育させ、（ｃ）段階（ｂ）の繁殖力のある植物由来の子孫種子を所望レベルのリルイン酸（１８：３）に関してスクリーニングし、そして（ｄ）段階（Ｃ）の子孫種子を処理して、変化したレベルでその不飽和脂肪酸を含んでいる種子油を得ることを含んでいる。好適な植物細胞および油は、ダイス、ナタネ、ヒマワリ、綿、カカオ、ビーナツツ、ベニバナ、ココナツツ、亜麻、アブラヤシおよびトウモロコシから誘導されるものである。上記植物細胞の形質転換を行う好適な方法には、アグロバクテリウム（Ａｇｒ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉおよびＲｉプラスミド類の使用、エレクトロポレーション、および高速弾道衝撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が含まれる。

本発明の１つの態様はまた、植物種の育種を行うことで油産生植物の種子油内の多不飽和脂肪酸、特にリルイン酸（１８：　３）を変化したレベルで得る方法である。この方法は、（ａ）リルイン酸特性が異なる２つの油種子植物変種間の交雑を行い、（ｂ）段階（ａ）の交雑で得られるいくつかの子孫植物から単離されたゲノムＤＮＡを制限酵素で消化させたもののサザンプロットを作成し、そして（Ｃ）このサザンプロットと、請求するグリセロリピッドデサチュラーゼをコード化する放射能標識核酸フラグメントとのハイブリッド形成を行うことを伴っている。

本発明の１つの態様はまた、本明細書に記述する単離されたアラビドプシス・グリアナのデルタ−１５デサチユラ一ゼ配列を用いたＲＦＬＰ地図作成方法である。

本発明の１つの態様はまた、本明細書に記述するキメラ遺伝子を含んでいることが原因でグリセロリピッドデサチュラーゼを変化したレベルで産生じ得る植物である。更に、本発明の１つの態様は、上記植物から得られる種子油である。

本発明の１つの態様はまた、ゲノムＲＦＬＰマーカー内のＲＦＬＰ地図作成方法であり、この方法は、（ａ）植物の２つの変種間の交雑を行い、（ｂ）段階（ａ）の交雑で得られるいくつかの子孫植物がら単離されたゲノムＤＮＡを制限酵素で消化させたもののサザンプロットを作成し、そして（Ｃ）このサザンプロットと、特許請求するフラグメントの放射能標識核酸フラグメントとのハイブリッド形成を行うことを伴っている。

本発明の１つの態様はまた、脂肪酸デサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化する核酸フラグメントを単離する方法であり、この方法は、（ａ）配列同定番号２．５．７．９．１１．１３．１５および１７と他の脂肪酸デサチュラーゼポリペプチド配列とを比較し、（ｂ）段階ａで得られる４個以上のアミノ酸を有する保存配列（類）を同定し、（ｃ）段階すで同定した保存配列を基準にして領域に特異的なヌクレオチドプローブ（類）またはオリゴマー（類）を作成し、そして（ｄ）段階Ｃのヌクレオチドプローブ（類）またはオリゴマー（類）を用いて、配列依存プロトコルにより、脂肪酸デサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化する配列を単離することを含んでいる。

この記述する単離方法の生成物もまた本発明の一部である。

配列記述の簡単な説明以下に示す詳細な記述および本出願の一部を成している配列記述から本発明がより完全に理解され得るであろう。これらの配列記述には、ヌクレオチド配列特徴のための一文字記号およびＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１３：３０２１−３０３０　（１９０８５）および３７　Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，８２２＜これらの引用することによって本明細書に組み入れられる）に記述されているＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ基準に類似しているアミノ酸のための三文字記号を含める。

配列同定番号１は、プラスミドｐＣＦ３内のデルタ−１５デサチユラーゼをコード化するアラビドプンスｃＤＮＡが有する１３５０個塩基対の５゛から３′への完全ヌクレオチド配列を示している。ヌクレオチド４６から４８はオーブン読み枠（ヌクレオチド４６から１２０６）の推定開始コドンである。ヌクレオチド１２０４から１２０６は終止コドンである。ヌクレオチド１から４５および１２０７から１３５０はそれぞれ５′および３゛の非翻訳ヌクレオチドである。配列同定番号１内の３８６個のアミノ酸から成る蛋白質配列は、そのオーブン読み枠から推定されたものである。

配列同定番号２は、配列同定番号１のオーブン読み枠の推定ペプチドである。

配列同定番号３は、デルタ−１５デサチユラーゼをコード化するアラビドプシスゲノム領域内のゲノム配列を示す、プラスミドｐＦｌ内のアラビドプシスゲノムＤＮＡ挿入断片の部分ヌクレオチド配列である。ヌクレオチド６８−２５５は配列同定番号１のヌクレオチド１−１８８と同じである。ヌクレオチド４７から４９および５６から５８は、配列同定番号１内のオーブン読み枠と同じ読み枠内の終止コドンである。

配列同定番号４は、ブラスチドのデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼをコード化するアラビドプシス・グリアナｃＤＮＡが有する１５２５個塩基対のプラスミドｐＡＣＦ２−２内挿入断片の５′から３′へのヌクレオチド配列を示している。

ヌクレオチド１０−１２およびヌクレオチド１３４８から１３５０はそれぞれオーブン読み枠（ヌクレオチド１゜から１３５０）の推定開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１から９および１３５１から１５２５はそれぞれ５° および３′の非翻訳ヌクレオチドである。

配列同定番号５は、配列同定番号４のオーブン読み枠の推定ペプチドである。

配列同定番号６は、ミクロソームのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼをコード化するプラスミドｐＢＮＳＦ３−２の中に見られるブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）種子ｃＤＮＡが有する１３３６個塩基対の５ ′から３′への完全ヌクレオチド配列を示している。ヌクレオチド７９から８２はオーブン読み枠（ヌクレオチド７９がら１２１２）の推定開始コドンである。

ヌクレオチド１２１ｏがら１２１２は終止コドンである。ヌクレオチド１から７８および１２１３から１３３６はそれぞれ５゛および３′の非翻訳ヌクレオチドである。

配列同定番号７は、配列同定番号６のオーブン読み枠の推定ペプチドである。

配列同定番号８は、ブラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼをコード化するプラスミドｐＢＮＳＦｄ−２の中に見られるブラシカ・ナブス種子ｃＤＮＡが有する１４１６個塩基対の５゛から３゛への完全ヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１から１２１５は４０４個アミノ酸の連続オーブン読み枠に相当している。ヌクレオチド１２１３から１２１５は終止コドンである。ヌクレオチド１２１５から１４１６は３′の非翻訳ヌクレオチドである。

配列同定番号９は、配列同定番号８のオーブン読み枠の推定ペプチドである。

配列同定番号１０は、プラスミドｐｘＦ１の中に見られるダイズ軸１ｙｃｉｎｅ　ｗａｘ）ミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡが有する完全ヌクレオチド配列であり、この配列の２１８４個のヌクレオチドは、このｃＤＮＡのコーディング配列および５゛および３°の非翻訳領域両方を含んでいる。ヌクレオチド８５５から８５７はオーブン読み枠（ヌクレオチド８５５から２０００）の推定開始コドンである。ヌクレオチド１９９５から１９９７は終止コドンである。ヌクレオチド１から８５４および１９９８から２１８４はそれぞれ５°および３′の非翻訳ヌクレオチドである。配列同定番号７内の３８０個のアミノ酸から成る蛋白質配列はこのオーブン読み枠から推定されたものである。

配列同定番号１１は、配列同定番号１０のオーブン読み枠の推定ペプチドである。

配列同定番号１２は、ダイス（ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）ブラスチドのデルタル１５デサチユラーゼをコード化するプラスミドｐＳＦＤ−１１８ｂｗｐ内に見られるダイス種子ｃＤＮＡが有する１６７６個塩基対の５′から３°への完全ヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１６９から１５３０は４５３個アミノ酸の連続オーブン読み枠に相当している。ヌクレオチド１６９から１７１はこのオーブン読み枠の推定開始コドンである。ヌクレオチド１５２８から１５３０は終止コドンである。ヌクレオチド１５３１から１６７６は３′の非翻訳ヌクレオチドである。ヌクレオチド１６９から３８２は、その推定ペプチドとダイスミクロ・ノームのデフレター１５ペプチドとの比較を基にすると、この推定ブラスチドシグナルベブチドをコード化する。

配列同定番号１３は、配列同定番号１２のオーブン読み枠の推定ペプチドである。

配列同定番号１４は、プラスミドルＰｃＲ２０内に見られるトウモロコシ種子ｍＲＮＡから誘導される３９６ｂｐのポリメラーゼ連鎖反応生成物が有する完全ヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１から３１および３６４か３９６はそれぞれ配列同定番号１８および配列同定番号１９に記述する増幅用プライマーに相当している。ヌクレオチド３１から３６３は、トウモロコシ種子のデルタ−１５デサチユラーゼの内部領域をコード化し、この領域の６１．９％は、配列同定番号７に示すブラシカ・ナブスのデルタ−１５デサチユラ一ゼペプチド配列が有するアミノ酸１３７と２４９の間の領域と同じである。

配列同定番号１５は、配列同定番号１４の推定アミノ酸配列である。

配列同定番号１６は、プラスチドのデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼをコード化するアラビトプンス・グリアナｃＤＮＡのためのプラスミドｐＦａｄｘ−２およびｐＹａｃｐＴ内の挿入断片から誘導される５゜から３゛への部分複合４７２ｂｐヌクレオチド配列を示している。ヌクレオチド２−４およびヌクレオチド４６８から４７０はそれぞれこのオーブン読み枠内の最初のコドンと最後のコドンである。

配列同定番号１７は、配列同定番号１６のオーブン読み枠の推定部分ペプチド配列である。

配列同定番号１８　１２８倍縮重センス３１−ｍｅｒ　ＰＣＲプライマー。ヌクレオチド１から８はＢａｍＨ１制限酵素認識配列に相当している。ヌクレオチド９か１３７は、配列同定番号６のアミノ酸残基１３０から１３７に相当しており、ヌクレオチド１１の所にデオキシイノシン塩基が存在している。

配列同定番号１９　２０４８倍縮重アンチセンス３５−ｍｅｒＰＣＲプライマー。ヌクレオチド１から８はＢａｍＨ１制限酵素認識配列に相当している。ヌクレオチド９か３５は、配列同定番号６のアミノ酸残基２４９から２５６に相当しており、ヌクレオチド１５の所にデオキシイノシン塩基が存在している。

配列同定番号２０　配列同定番号２内のアミノ酸残基９７−１０８に対して作り出した１６倍縮重センス３６−ｍｅｒ０配列同定番号２１　配列同定番号２内のアミノ酸残基９７−１０８に対して作り出した１６倍縮重センス３６−ｍｅｒ。

配列同定番号２２　配列同定番号２内のアミノ酸残基１００−１０５に対して作り出した７２倍縮重センス１８−ｍｅｒ０配列同定番号２３　配列同定番号２内のアミノ酸残基１００−１０５に対して作り出した７２倍縮重センス１８−ｍｅｒ。

配列同定番号２４　配列同定番号２内のアミノ酸残基２９９−３０４に対して作り出した７２倍縮重アンチセンス’Ｊ−８−ｍｅｒ。

配列同定番号２５　配列同定番号２内のアミノ酸残基２９９−３０４に対して作り出した７２倍縮重アンチセンス１８−ｍｅｒ。

配列同定番号２６　配列同定番号２内のアミノ酸残基３０４−３０９に対して作り出した７２倍縮重アンチセンス１８−ｍｅｒ。

配列同定番号２７　配列同定番号２内のアミノ酸残基３０４−３０９に対して作り出した７２倍縮重アンチセンス１３−ｍｅｒ０配列同定番号２８　配列同定番号２内のアミノ酸残基９７−１０８に対して作り出した１６倍縮重センス３６− ｍｅｒ０配列同定番号２９　配列同定番号２内のアミノ酸残基９７−１０８に対して作り出した１６倍縮重センス３６−ｍｅｒ０配列同定番号３０　配列同定番号２内のアミノ酸残基２９９−３１１に対して作り出した６４倍縮重アンチセンス３８−ｍｅｒ。

配列同定番号３１　配列同定番号２内のアミノ酸残基２９９−３１１に対して作り出した６４倍縮重アンチセンス３８−ｍｅｒ０配列同定番号３２　配列同定番号２内のアミノ酸残基９７−１４１に対するアンチセンスストランドとして作り出した１３５−ｍｅｒ。

発明の詳細な説明出願者らは、植物脂肪酸デサチュラーゼをコード化しそして油産生種内の脂肪酸組成を形質転換で修飾するに有効性を示す核酸フラグメントを単離した。

従って、機能的酵素をコード化する本発明の核酸フラグメントまたはそれの一部を、それらのｍＲＮＡの転写を支配するに適切な調節配列と−緒に、生きている細胞の中に転移させることにより、植物脂肪酸デサチュラーゼの産生または過剰産生をもたらし、そしてトリアジルグリセロール類を含む細胞脂質内の不飽和脂肪酸レベルの上昇をもたらす。

本発明の核酸フラグメントまたはそれの一部を、それらアンチセンスＲＮＡの転写を支配するに適切な調節配列と一緒に、植物の中に転移させることにより、その転移させた核酸フラグメントに本質的相同性を示す内在性脂肪酸デサチュラーゼの発現阻害をもたらし、そしてトリアジルグリセロール類を含む細胞脂質内の不飽和脂肪酸レベルの低下をもたらす。

本発明の核酸フラグメントまたはそれの一部を、それらのｍＲＮＡの転写を支配するに適切な調節配列と一緒に、植物の中に転移させることにより、その転移させた核酸フラグメントに本質的相同性を示す内在性脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子発現の共抑制による阻害をもたらすことが可能であり、そしてトリアジルグリセロール類を含む細胞脂質内の不飽和脂肪酸レベルの低下をもたらすことが可能である。

本発明の核酸フラグメントはまた、アラビドプシス遺伝子の地図作成および植物育種プログラムにおける制限フラグメント長さ冬型性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）　（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）　？−カーとして用いられ得る。

本発明の核酸フラグメントまたはそれらから誘導されるオリゴマー類を用いてまた、例えば核酸ハイブリッド形成方法およびポリメラーゼ連鎖反応による増幅などを含むよく知られている配列依存プロトコルにより、同じか或は異なる種由来のＤＮＡ、ＲＮＡまたはクローン化されたヌクレオチド配列ライブラリーを用いて他の関連したグリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子を単離することが可能である。

！舞この開示に関連して数多くの用語を用いる。本明細書で用いる用語「脂肪酸不飽和化酵素（デサチュラーゼ）」は、炭素−水素結合を壊して炭素−炭素二重結合を脂肪酸分子の中に導入するのを触媒する酵素を表している。この脂肪酸は遊離脂肪酸であるか、或はこれに限定されるものではないがアシル担体蛋白質、補酵素Ａ１ステロール類およびグリセロリピッド類のグリセロール部分などを含む他の分子にエステル化していてもよい。本明細書で用いる用語「グリセロリピッドデサチュラーゼ」は、脂肪アシル部分がグリセロールバックボーンにエステル化するとき働く脂肪酸デサチュラーゼのサブセットを表している。［デルタ−１２デサチユラーゼ」は、炭素位６と７（メチル末端からの番号）（即ち、これらは、１８個炭素長の脂肪アシル鎮の炭素位１２と１３（カルボニル炭素からの番号）が或は１６個炭素長の脂肪アシル鎖の炭素位１０と１１（カルボニル炭素がらの番号）に相当している）の間に二重結合が生じるのを触媒する脂肪酸デサチュラーゼを表している。「デルタ−１５デサチユラーゼ」は、炭素位３と４（メチル末端からの番号）（即ち、これらは、１８個炭素長の脂肪アシル鎮の炭素位１５と１６（カルボニル炭素からの番号）および１６個炭素長の脂肪アシル鎖の炭素位１３と１４（カルボニル炭素からの番号）に相当している）の間に二重結合が生じるのを触媒する脂肪酸デサチュラーゼを表している。脂肪酸デサチュラーゼの例には、これに限定されるものではないが、ホスファチジルコリン脂質基質に作用するミクロソームのデルタ−１２およびデルタ−１５デサチユラーゼ類、ホスファチジルグリセロールおよびガラクトリビッドに作用するクロロプラストのデルタ−１２およびデルタ−１５デサチユラーゼ類、並びにホスホリビノド類、カラクトリビッド類およびスルホリピッド類の如き脂肪酸基質に作用する他のデサチュラーゼ類が含まれる。「ミクロソームのデサチュラーゼ」は、この酵素が細胞質に位置していることを表しており、一方「クロロプラストのデサチュラーゼ」および「プラスチドのデサチュラーゼ」は、この酵素がブラスチドに位置していることを表している。これらの脂肪酸デサチュラーゼ類は、これに限定されるものではないが、高等植物、ケイ環、および種々の真核生物および原核生物微生物、例えば菌・カビおよび光合成細菌および藻類などを含む種々の有機体の中に見いだされ得る。用語「相同性脂肪酸デサチュラーゼ」は、同じ脂質基質に関する同じ不飽和化を触媒する脂肪酸デサチュラーゼを表している。従ってミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ類は、異なる植物種由来のものでも、相同性脂肪酸デサチュラーゼである。用語「非相同脂肪酸デサチュラーゼ」は、異なる位置における不飽和化および／または異なる脂質基質に関する不飽和化を触媒する脂肪酸デサチュラーゼを表している。従って、例えばホスファチジルコリン脂質に作用するミクロソームのデルタ−１２およびデルタ−１５デサチユラーゼは、同じ植物から得られた時でも、非相同脂肪酸デサチュラーゼである。同様に、ホスファチジルコリン脂質に作用するミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼと、ガラクトリピット類に作用するクロロプラストのデルタ−１５デサチユラーゼは、同じ植物から得られた時でも、非相同脂肪酸デサチュラーゼである。これらの脂肪酸デサチュラーゼ類は単離されておらずそして蛋白質として特徴付けされていないことを特記する。従って、「デルタ−１２デサチユラーゼ」および「デルタ−１５デサチユラーゼ」の如き用語は、便利さとして、分裂によって引き起こされる表現型効果を基にして単離された核酸フラグメントがコード化する蛋白質を記述する目的で用いるものである。用語「脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素」は、それらの触媒的産物は炭素−炭素二重結合でないかもしれないがその作用機構は脂肪酸デサチュラーゼのそれと類似している（即ち、脂肪酸鎖が有する炭素−水素結合の置換を触媒して脂肪−ヒドロキシアシル中間体または最終産物を生じさせる）酵素を表している。この用語は、脂肪酸デサチュラーゼ間の構造的類似性を表している「関連脂肪酸デサチュラーゼ類」とは異なっている。

用語「核酸」は、糖類、ホスフェートおよびプリンまたはピリミジンを含んでいる単量体（ヌクレオチド）類で出来ている、１本鎖もしくは２本鎖であってもよい大型分子を表している。「核酸フラグメント」は、一定の核酸分子の一部である。高等植物におけるデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）は遺伝材料であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内の情報を蛋白質に伝達することに関与している。「ゲノム」は、有機体が有する各細胞内に含まれている遺伝材料の全体である。用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ多量体の中に取り込まれ得る合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を任意に含んでいてもよく１本鎖もしくは２本鎖であってもよい、ＤＮＡまたはＲＮＡ多量体の配列を表している。用語「オリゴマーＪ　ｉｔ、通常長さが１５０個塩基以下である、短いヌクレオチド配列を表している。「領域に特異的なヌクレオチドプローブ」は、異なる脂肪酸デサチュラーゼの間で保存されているアミノ酸領域を知ることでｃＤＮＡまたは遺伝子から誘導される単離された核酸フラグメントを表しており、これらは、配列依存プロトコルを用いて他の脂肪酸デサチュラーゼ類または脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素のためのｃＤＮＡまたは遺伝子を単離する目的で用いられ得る。

本明細書で用いる用語「に相同性を示すｊは、２つの核酸分子が有するヌクレオチド配列間か或は２つの蛋白質分子が有するアミノ酸配列間の関係を表している。本分野の技術者によく知られている如き緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下でＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５）　ｒ核酸ハイブリッド形成Ｊ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）　、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、　Ｋ、　）を行うか、或は２つの核酸または蛋白質間の配列類似性を比較すること、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他の方法（ｌ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９７０）　４８：４４３−４５３）を用いることによって、上記相同性の見積もりが得られる。本明細書で用いる「本質的相同性」は、請求する配列のコーディング領域にヌクレオチドレベルで９０％以上の全体的同一性を示すヌクレオチド配列、例えばこれらのコーディング領域に相当している遺伝子または疑似遺伝子を表している。本明細書に記述する核酸フラグメントは、人工および天然両方で起こり得る変化、例えばこれに限定されるものではないが、（ａ）コード化されたアミノ酸に変化を生じさせない塩基変化を伴うもの、或は（ｂ）アミノ酸は変化しているが、ＤＮＡ配列がコード化する蛋白質が示す機能的特性に影響を与えない、塩基変化を伴うもの、（ｃ）核酸フラグメントの欠失、再配列、増幅、ランダムもしくは調節された変異誘発で誘導されるもの、並びに（ｄ）偶発的なヌクレオチド配列決定誤差さえ含む、分子を包含している。

「遺伝子」は、コーディング領域に先行する（５゛　非コーディング）およびそれに続＜（３°非コーデイング）調節配列を含む、特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを表している。「脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子」は、脂肪酸デサチュラーゼ活性を示す蛋白質を発現する核酸フラグメントを表している。「未変性」遺伝子は、天然に見いだされる如きそれら自身の調節配列を有する単離された遺伝子を表している。「キメラ遺伝子」は、天然に見られない非相同調節およびコーディング配列を含んでいる遺伝子を表している。「内在性」遺伝子は、ゲノム内のその天然の位置に通常見いだされる単離されていない未変性遺伝子を表している。「外来性」遺伝子は、宿主有機体の中に通常見いだされるものではなく遺伝子転移によって導入される遺伝子を表している。「疑似遺伝子」は、機能的酵素をコード化しないゲノムヌクレオチド配列を表している。

「コーディング配列」は、特定蛋白質をコードするＤＮＡ配列を表しており、非コーディング配列を排除する。これは、「介在なしコーディング配列」、即ちイントロンが入っていないコーディング配列を構成していてもよいか、或はこれは、適当なスプライス結合で限定されているイントロンを１個以上含んでいてもよい。「イントロン」は、−次転写物内に転写されるがその細胞内のＲＮＡの開裂を通して除去されそして細胞内のＲＮＡの再連結で成熟ｍＲＮＡ　（これは蛋白質に翻訳され得る）を作り出すヌクレオチド配列である。

「開始コドン」および「終止コドン」は、蛋白質合成（ｍＲＮＡ翻訳）のそれぞれ開始および連鎖停止反応を指定するコーディング配列内の隣接する３個のヌクレオチドから成る単位を表している。「オーブン読み枠」は、アミノ酸配列をコード化する開始コドンおよび終止コドンの間の、イントロンが介在していないコーディング配列を表している。

ｒＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写で生じる産物を表している。このＲＮＡ転写物がそのＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである時これを一次転写物と呼び、或は−次転写物の後転写プロセシングから誘導されるＲＮＡ配列であってもよくそしてこれを成熟ＲＮＡと呼ぶ。［メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）Ｊは、イントロンが介在しておらずそして細胞によって蛋白質に翻訳され得るＲＮＡを表している。ｒｃＤＮＡＪは、ｍＲＮＡに相補的でありそしてそれから誘導される２本鎖ＤＮＡを表している。「センスＪ　ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を表している。「アンチセンスＲＮＡＪは、標的 −次転写物またはｍ　ＲＮ　Ａの全部または一部に相補的でありそしてその一部転写物またはｍＲＮＡのプロセシング、輸送および／または翻訳を妨害することによって標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を表している。アンチセンスＲＮＡが示す相補性は、特定遺伝子転写物の何らかの部分に対する相補性、即ち５°非コーディング配列、３°非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列における相補性であってもよい。加うるに、本明細書で用いるアンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡが遺伝子発現をブロックする効力を上昇させるリポザイム配列の領域を含んでいてもよい。「リボザイム」は、触媒的ＲＮＡを表しており、これには、配列に特異的なエンドリボヌクレアーゼ類が含まれる。

本明細書て用いる「適切な調節配列」は、本発明の核酸フラグメント内および／または上流（５°）および／または下流（３゛）に位置している未変性もしくはキメラ遺伝子内のヌクレオチド配列を表しており、これらは、本発明の核酸フラグメントの発現を調節する。本明細書で用いる用語「発現」は、本発明の核酸フラグメント（類）から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を表しており、これは、この細胞の蛋白質器官と協力して、変化したレベルで脂肪酸デサチュラーゼ（類）をもたらす。この遺伝子の発現または過剰発現は、この遺伝子の転写、並びにｍＲＮＡが翻訳されて前駆体であるか或は成熟した脂肪酸デサチュラーゼ蛋白質を生じることを伴っている。「アンチセンス阻害」は、標的蛋白質の発現を防止し得るアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を表している。「過剰発現」は、正常であるか或は形質転換していない有機体における産生レベルを越える、形質転換した有機体における遺伝子産物の産生を表している。「共抑制」は、外来性および内在性両方の遺伝子発現の抑制をもたらす、内在性遺伝子に本質的相同性を示す外来性遺伝子の発現を表している。「変化したレベル」は、正常であるか或は形質転換していない有機体のそれとは異なる量または割合で、形質転換した有機体内に遺伝子産物（類）が生じることを表している。

「プロモーター」は、適当な転写に必要とされているＲＮＡポリメラーゼおよび他の因子に関する認識を与えることによってコーディング配列の発現を調節する、通常そのコーディング配列の上流（５°）にある、遺伝子内のＤＮＡ配列を表している。人よりＮＡ構築物内でも、アンチセンスＲＮＡの転写を行う目的でプロモーターが用いられ得る。プロモーターはまた、生理学的または発生状態に応答して転写開始の有効性を調節する、蛋白質因子の結合に関与しているＤＮＡ配列を含んでいてもよい。これはまたエンハンサ−成分を含んでいてもよい。「エンハンサ−」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列である。これは、このプロモーターの先天性成分であるか、或はプロモーターのレベルおよび／または組織特異性を増強する目的で挿入された非相同成分であってもよい。「構成プロモーター」は、全ての組織および全ての時間における遺伝子発現を支配しているプロモーターを表している。本明細書で表す「組織に特異的」または「発生に特異的」なプロモーターは、それぞれ、はとんど排他的に特定の組織、例えば葉または種子内の遺伝子発現を支配しているか、或は組織における特定の発生段階、例えば初期もしくは後期胚形成を支配しているプロモーターを表している。

「３゛　非コーディング配列」は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与え得る他の何らかの調節シグナルを含んでいる遺伝子のＤＮＡ配列部分を表している。このポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体が有する３′末端へのポリアデニル酸部分の付加に影響を与えることによって特徴づけられる。

用語「シグナルペプチド」は、ブラスチドまたはミトコンドリアの如きオルガネラの中にその蛋白質を吸収および輸送させるためのシグナルとして働く蛋白質のＮ末端伸長部を表している。

「形質転換」は、本明細書において、宿主有機体が有するゲノムへの外来遺伝子の転移およびそれの遺伝的安定性を示す遺伝を表している。

［制限フラグメント長さ冬型性」は、変異形態の遺伝子の中が或はその回りに存在しているヌクレオチド配列が変化したことが原因となる、大きさが異なる制限フラグメント長を表している。「繁殖力のある」は、性的に繁殖し得る植物を表している。

「油産生種」は、本明細書において、トリアンルグリセロールを産生して特定の器官、主に種子の中に貯蔵する植物を表している。上記種には、大豆（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）　）、ナタネおよびカノーラ（ブラシカ・ナブス、Ｂ、カムペストリス（Ｂ、　ｃａａ＋ｐｅｓｔｒｉｓ）を含む）、ヒマワリ（へりアンラス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｓ）　）、綿（ゴシヒウム・ヒルスッム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）　）、トウモロコシ（ゼアーフイス（Ｚｅａ　ｒｎａｙｓ）　）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）　）、ベニバナ（カルタムス・チンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）　）、アブラヤシ（エラエイス・グイネエンシス（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）　）、ココヤシ（ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ　ｎｕｃｉｆｅｒａ）　）　、亜麻（リヌム・ウシタチシムム（Ｌｉｎｕｍ　ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｉｕｍ）　）　、ヒマ（リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）　）およびビーナツツ（アラキス・ヒポガエア（＾ｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ）　）などが含まれる。この群にはまた、適当な発現ベクターを開発するに有効な非農業経営種、例えばタバコ、ラピドサイク１ルグ（ｒａｐｉｄ　ｃｙｃｌｉｎｇ）ブラシカ種およびアラビドプシス・グリアナ、並びにユニークな脂肪酸の給源となり得る野生種も含まれる。

「配列依存プロトコル」は、それらの利用度に関してヌクレオチド配列に頼っている技術を表している。配列依存プロトコルの例には、これに限定されるものではないが、核酸およびオリゴマーのハイブリッド形成方法、並びにポリメラーゼ連鎖反応の種々の使用で例示されている如きＤＮＡおよびＲＮＡの増幅方法などが含まれる。ｒＰＣＲ産物」は、ポリメラーゼ連鎖反応を通して得られるＤＮＡ産物を表している。

実験操作で用いる種々の溶液を、ｒＳＳＣｌ、ｒＳ　Ｓ　Ｐ　ＥＪ、「デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液」などの如き通常名を用いて表す。これらの溶液の組成は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他の付録Ｂを参照することで見付は出され得る（「分子クローニング、実験室？　−’−ユアルＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、第２版（１９８９）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）。

デルタ−１５不飽和化が不完全なアラビドプシス変異体のＴ−ＤＮＡ変異誘発および同定Ｔ−ＤＮＡ変異誘発（Ｆｅｌｄｍａｎｎ他、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４３二１３５１−１３５４）では、ゲノム内へのＴ−ＤＮＡ組み込みによって、この組み込み部位におけるか或はその近くの正常な遺伝子発現が妨害され得る。

その得られる変異体表現型が検出可能であり、そして遺伝的にそのＴ−ＤＮＡ挿入断片にしっかりと連結していることが示されている場合、その「標識を付けた」座およびそれの野生型相対物は、本分野の技術者による分子クローニングによって容易に単離され得る。

プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点領域とアンピシリン耐性遺伝子、細菌のカナマイシン耐性遺伝子および植物のカナマイシン耐性遺伝子で置き換えられている左側と右側のＴ−ＤＮＡ境界の間にＴ−ＤＮＡ領域を有している弱毒性ＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０・：ｐＡＫ１００３を有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｎｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｃ５８Ｃｌ　ｒ　ｉ　ｆ菌株を用いて、アラビドプシス・グリアナ種子の形質転換を行った（Ｆｅｌｄｍａｎｎ他、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８７）　２０８＋１−９）。処理した種子由来の植物は自己繁殖し、そしてカナマイシンの存在下で発芽するその得られる子孫種子は自己繁殖して、Ｔ３と表示する個体群をもたらし、これはＴ−ＤＮＡ挿入に関して分離していた。

約６０００個のＴ２植物から得られるＴ３種子を脂肪酸組成に関して分析した。

３７０３と表示する１つの系統が示すリルイン酸（１８：３）のレベルが低下していた。変異体である系統３７ｏ７の自己繁殖をもう１回行うことで、Ｔ４子孫種子を生じさせた。Ｔ４個体群におけるホモ接合変異体種子中の１８：２／１８：３比率は約１４であり、そして化学的変異誘発によって得られる野生型アラビドプシスおよびアラビドプシス・ファド（ｆａｄ）　３変異体におけるその比率はそれぞれ約１．８と約２３である［Ｌｅｍｉｅｕｘ他（１９９０）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐ、　Ｇｅｎ、　８０：２３４−２４０１　、これらの種子を植え付けて、２６３個から成る個々の植物を、葉抽出液の中にツバリンが存在しているが否かに関して分析した。脂肪酸組成およびカナマイシン存在下における発芽能力に関して更に、これらの植物から得られる１５種子を分析した。この変異体である脂肪酸表現型は、カナマイシンに関する発芽性と同様、１・２：１の比率で分離することが見いだされた。ツバリンは、変化した脂肪酸表現型を有する全ての植物で見いだされたが、野生型の分離体（ｓｅｇｒｅｇａｎｔｓ）内には見いだされなかった。これらの結果は、デルタ−１５不飽和化を調節している座は変異体系統３７０７内のＴ−ＤＮＡによって妨害されることの証拠を与えていた。

デルタ−１５不飽和化を調節する遺伝子を含んでいるアラビドプシスゲノムＤＮＡの単離野生型アラビドプシスからデルタ−１５不飽和化を調節する遺伝子を単離する目的で、宿主植物のＤＮＡの中に組み込まれたＴ−ＤＮＡ境界を含んでいるＴ−ＤＮＡ−植物のＤＮＡ　ｒ結合」フラグメントを、アラビドプシス変異体３７ｏ７がら単離した。この目的で、その変異体植物からゲノムＤＮＡを単離した後、ＢａｍＨＩまたは５ａｌＩどちらかの制限酵素を用いて完全に消化させた。各場合共、その得られるフラグメントの１つは、ｐＢＲ３２２の複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子と共に左側のＴ−ＤＮＡ−植物ＤＮＡ結合フラグメントを含んでいる。

自己連結を容易にする希釈した濃度でその消化させたゲノムＤＮＡフラグメントを連結させた後、この連結させたフラグメントを用いて大腸菌細胞の形質転換を行うことによって、上記フラグメントをプラスミドとして回収した。左側または右側どちらかのＴ−ＤＮＡ境界を含んでいるフラグメントに対するコロニーハイブリッド形成を行うことによって、アンピシリン耐性を示す大腸菌形質転換体の単離およびスクリーニングを行った。５ａｌＩ消化ゲノムＤＮＡのプラスミド回収で得られる１９２個のコロニーの中の３１個がその左側Ｔ−ＤＮＡ境界フラグメントにハイブリッド形成し、その中の４個が右側Ｔ−ＤＮＡ境界フラグメントにハイブリッド形成し、両方にハイブリッド形成するものは全（存在していなかった。ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡのプラスミド回収で得られる８５個のコロニーの中の６３個がその左側境界にハイブリッド形成し、そして右側境界にハイブリッド形成するものは全く存在していなかった。

ＢａｍＨ１消化で得られそしてその左側Ｔ−ＤＮＡ境界にハイブリッド形成する７種の回収プラスミドに関する制限分析を行った結果、これらを区別することは不可能であり、１．４ｋｂの推定フランキング植物ＤＮＡを含んでいることが示された。５ａ１１消化で得られそしてその左側Ｔ−ＤＮＡ境界にのみハイブリッド形成する別の回収プラスミドｐＳ１に関する制限分析を行った結果、これは２．９ｋｂの推定フランキング植物ＤＮＡを含んでいることが示された。このフランキングＤＮＡは、その左側Ｔ−ＤＮＡ境界からそれぞれ１．４ｋｂおよび２．２ｋｂ離れているＢａｍＨ１部位とＨｉｎｄｌＮ１部位を有しており、このことは、ＢａｍＨＩ回収プラスミド内の１．４ｋｂ推定植物ＤＮＡは５ａｉｌ回収プラスミド内の２．９ｋｂ推定植物ＤＮＡ内に含まれていることを示唆している。

ハイブリッド形成プローブとして放射能標識した１、４ｋｂのＤＮＡフラグメントを用いて野生型および変異体３７０７アラビドプシスのゲノムＤＮＡをサザンプロット分析した結果、このフラグメントは植物ＤＮＡを含んでおり、そしてそのＴ−ＤＮＡ組み込み部位は野生型アラビドプシスＤＮＡが有する２、８ｋｂのＢａｍＨＩ、５．２ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ、３．５ｋｂの５ａｉｌ、５．５ｋｂのＥｃｏＲＩおよび約９ｋｂのＣ１ａｌフラグメントの中に存在していることが確認された。左側Ｔ−ＤＮＡ境界配列に対して作り出したプライマーを用いてプラスミドｐＳ１のヌクレオチド配列決定を行った結果、ｐＳｌは、ヌクレオチド位置６５に及んでその左側Ｔ−ＤＮＡ境界の配列と共直線性を示すことが確認され（Ｙａｄａｖ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳ＾（１９８２）　７９：６３２２−６３２６）　、これは、Ｔ−ＤＮＡ境界反復の中に存在している。

Ｔ−ＤＮＡ−植物のＤＮＡ結合を越えるｐＳｌ内、即ちその左側Ｔ−ＤＮＡ境界に隣接している植物ＤＮＡ内の、約８００ｂｐから成る追加的配列は、ｐＧＶ３８５０　：　：　Ｉ）ＡＫ１００３（７）Ｔ−ＤＮＡに有、ｔな相同性を示さないと共に有意なオーブン読み枠を示さなかった。

その回収したプラスミドから単離した１、４ｋｂの植物ＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして用いてラムダファージアラビドプシス・グリアナのゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、その系統３７０７内のＴ−ＤＮＡに接している植物ＤＮＡに相当する野生型アラビドプシス由来核酸フラグメントを単離した。正のハイブリッド形成を示すゲノムクローンを７種単離したが、これらは、部分制限地図作成を基準にして５つの種類の１つに入うた。それらの平均挿入断片サイズは約１５ｋｂであったが、それらを−緒にすると、全体で約４０ｋｂのゲノムＤＮＡに及んでいた。制限分析とサザン分析とを組み合わせた結果、５つのクローンがＴ−ＤＮＡの左側境界の組み込み部位をオーバーラツプしており、そして野生型ゲノム植物ＤＮＡ内のそれと比較して、回収されたプラスミド内には検出され得る程の植物ＤＮＡ再配列は存在していないことが確認された。１１１１と表示するこれらのラムダファージクローンの１つは、その回収されたクローンの代表的なものであり、そしてこれは、そのＴ−ＤＮＡの左側境界の挿入部位の回りに多少とも対称的に配列している約２０ｋｂのゲノムＤＮＡ挿入断片を含んでいた。

このクローンを、ブダペスト条約の規定の下で＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９１年１１月２７日付けで寄託し、取得番号＾ＴＣＣ７５１６７を受理した。

アラビドプソスデルター１５デサチュラーゼｃＤＮＡの単離系統３７０７から回収した１、４ｋｂのフランキング植物ＤＮＡにハイブリッド形成しそして系統３７０７内のその中間部近（にＴ−ＤＮＡ挿入断片が介在している野生型ゲノムＤＮＡ含有５．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをラムダファージクローン４１Ａ１から単離し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ池［分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（７）中に記述されテイル標準的クローニング操作を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ部位にクローン化した。この得られるプラスミドをｐＦｌと表示した。この単離した５、２ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを放射能標識ハイブリッド形成プローブとして用いてまた、ラムダＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内の３日才の黄化アラビドプシス・グリアナ（生態型コロンビア）実生胚軸由来のポリＡ”ｍＲＮＡに対して作り出したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。正のハイブリッド形成を生じるいくつかのプラークの中で、強力にハイブリッド形成する４種にプラーク精製を受けさせた。その精製したファージストックの各々から得られる、ｃＤＮＡ挿入断片を含んでいるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターの配列を、ヘルパーファージの存在下で切除した。

その得られるファージミドを用いて大腸菌細胞の感染を行い、これによって、２本鎖プラスミドであるｐｃＦｌ、ｐＣＦ２、ｐＣＦ３およびｐＣＦ４が得られた。これらの４種は全て、その単離したファージクローン内に存在している野生型植物ゲノムＤＮＡの同じ領域にハイブリッド形成する約１．３から１．４ｋｂのＮｏｔＩ挿入断片フラグメント（Ｎ。

ｔｌ／ＥｃｏＲＩアダプターをこのｃＤＮＡライブラリーの製造で用いた）を少なくとも１個含んでいることが示された。この領域、即ち系統３７０７内の左側Ｔ−ＤＮＡ境界の組み込み部位近（に存在している領域は、以前にプラスミド回収（ｒｅｓｃｕｅ）を通して単離した左側Ｔ−ＤＮＡ境界に接している植物ＤＮＡのそれの反対側に在る、Ｔ−ＤＮＡ挿入断片の側面に存在している。これらの異なるｃＤＮＡの部分的配列決定を行うことにより、共通した同一性が存在していることが確認された。

デルタ−１５不飽和化を発現すると期待される黄化組織から作り出しなｃＤＮＡライブラリーではただ１つの型のｃＤＮＡから多数の変形が得られることと、高すノール酸／低すルイン酸表現型を有する系統３７０７内のＴ−ＤＮＡ組み込み部位に相当するゲノムＤＮＡにこれらのＣＤＮＡがハイブリッド形成することから、出願者らは、デルタ−１５デサチュラーゼをコード化する遺伝子の正常な発現を系統３７０７内のＴ−ＤＮＡが妨害するとの結論に到達した。ｐＣＦ３と表示する１つの。

ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を決定し、配列同定番号１として示す。

これは、３８６個のアミノ酸から成るポリペプチドをコード化するオーブン読み枠を表している。そのｐＣＦ３挿入断片に対して作り出した配列決定用プライマーの１つを用いてまた、ｐＦ１由来の２５５ｂｐから成る配列が得られ、これを配列同定番号３として示す。ｐＦ１内のゲノムＤＮＡのヌクレオチド６８がら２５５（配列同定番号３）は、そのＣＤＮＡのヌクレオチド１から１８８（配列同定番号１）と同じであり、このことは、これらが共直線性を示すことと、その単離したゲノムＤＮＡ内の遺伝子がそのｃＤＮＡの遺伝情報を指定していることを示している。配列同定番号３内のヌクレオチド１１３から１１５は、配列同定番号１内のヌクレオチド４６−４８に相当している最大オーブン読み枠の開始コドンである。このことは、ヌクレオチド４７から４９およびヌクレオチド５６から５８の所に枠内終止コドンが存在しておりそして配列同定番号３内には観察され得るイントロンスプライス結合が存在していないことから明らかである。この３８６個のアミノ酸から成るポリペプチドをデサチュラーゼとして同定したことは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎのＦＡＳＴ＾演算方式（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８ｇ）　８５：２４４４−２４４８）およびＢＬＡＳＴプログラム（＾１ｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、（１９９０）　２１５：４０３−４１０）が用いられている！ＪＩＳＳＰＲＯＴＥＩＮデータベースのリリース１９．０の中に見られる全ての蛋白質配列とそのアミノ酸配列とを比較することによって立証された。両方の研究で見付は出された最も高い相同性を示す蛋白質は、ラン色細菌シネコンスチスＦＣＣ６８０３（Ｗａｄａ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９９０）３４７：２００−２０３：　Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：Ｃ３ＤＥＳＡ；　Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号：　Ｘ５３５０８）由来ノｄｅｓＡ脂肪酸デサチュラーゼであった。配列同定番号１内の３８６個のアミノ酸から成るペプチドをまた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ他の方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ。

１、　（１９７０）　４８：４４３−４５３）により、ｄｅｓＡが有する３５１個ノアミノ酸から成る配列と比較した。それらが有する長さ全体に渡って、これらの蛋白質は２６％の同一性を示し、そしてこの比較により、そのｄｅｓＡ蛋白質配列の中に主要なギャップが４つ示された。この全体的相同性は低いが、より短い範囲内の相同性は良好であった。例えば、７８個のアミノ酸から成る範囲において、アラビドプシスのデルタ−１５デサチユラーゼ（配列同定番号１内のアミノ酸７８がら１５５）、およびｄｅｓＡ蛋白質（アミノ酸６７がら１４４）は、４０％の同一性と６６％の類似性を示した。更に短い範囲内の相同性は表２に示すように更に大きかった。

ラン色細菌のデサチュラーゼポリペプチドと配列同定番号２との間の、短い範囲のアミノ酸におけるこのような高いパーセントの同一性は、これらの２つの間に有意な関係が存在していることを示唆している。

配列同定番号１に相当するｍＲＮＡをコード化する遺伝子の発生発現を分析する目的で、Ｍａｎｉａｔｉｓ他「分子クローニング、実験室マニュアル」（１９８２）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓの中に本質的に記述されているように、野生型および変異体３７０７両方のアラビドプシス植物由来の葉、根、発芽実生および発生長角果から得られるｍ　ＲＮ　Ａサンプルに対する放射能標識ハイブリッド形成プローブとして、プラスミドｐＣＦ３内のｃＤＮＡ挿入断片を用いた。その結果、配列同定番号１に相当しているｍＲＮＡはその変異体植物由来組織全ての中で検出されるがそのレベルは野生型組織内よりも低いことが示された。このことは、系統３７０７内の脂肪酸変異は化学的変異誘発で得られた公知のアラビドプシス・ファド３変異体に関する漏出であることの観察と一致している。これらの結果により、系統３７０７内のＴ−ＤＮＡは脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の正常な発現を妨害することが確認された。ホモ接合変異体系統３７０７の脂肪酸表現型を基にして、出願者らは、ｐＣＦ３内のｃＤＮＡ挿入断片がそのデルタ−１５デサチュラーゼをコード化すると結論付けた。更に、出願者らは、これはミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼであり、クロロプラストのデルタ−１５デサチユラーゼではないと結論付けた、その理由は下記の通りである・ａ）この変異体発現型は系統３７０７の種子内て強力に発現するが、その葉の中では発現したとしても僅かであること、そしてｂ）このデルタ−１５デサチユラーゼのポリペプチドは、ｄｅｓＡのポリペプチドに比較して、核コード化クロロプラストデサチュラーゼに期待されるシグナルペプチドのＮ末端伸長部を有していないこと。

アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼとして配列同定番号２を同定したことを、それを植物組織内で生物学的に過剰発現させることによって立証した。この目的で、デルタ−１５デサチユラーゼのｃＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＣＦ３の１．４ｋｂ　Ｎｏｔ■フラグメントを、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの後方のセンス配向の中に入れて構成発現を生じさせるか、或はＢ −コングリシニン（７ｓ）種子貯蔵蛋白質のダイズａ′サブユニットをコード化する遺伝子のためのプロモーターの背後のセンス配向の中に入れて胚に特異的な発現を生じさせた。次に、アグロバクテリウム・ツメファシェンスのバイナリ− Ｔｉプラスミドベクター系［）１ｏｅｋｅｍａ他（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：１７９−１８０；　Ｂｅｖａｎ　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：８７１１−８７２２１を用いて、キメラ遺伝子である３５Ｓプロモ一ター／センス配列同定番号１／３゛　ツバリンシンターゼとＢ−コングリシニン／センス配列同定番号１／３′　ファセオリンを植物細胞に形質転換した。

配列同定番号１の同定を立証しそして非相同植物種内におけるそれの過剰発現の生物学的効果を試験する目的で、キメラ遺伝子である３５Ｓプロモ一ター／センス配列同定番号１／３′　ツバリンシンターゼをバイナリ−ベクターに形質転換し、これを次に、アグロバクテリウム・リゾゲネス（ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）由来のＲｉプラスミドｐＲｉＡ４ｂを有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌株Ｒ１００Ｏに形質転換した［Ｍ。

ｏｒｅ他（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄ　２：６１７−６２６］　。Ｐｅｔｉｔ他の方法（１９８６）　［Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　２０２：３８８−３９３］を用いて、そのキメラ遺伝子を有している菌株Ｒ１００Ｏと一緒にニンジン（ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ　Ｌ、　））の根雪を共培養することにより、ニンジン細胞の形質転換を行った。形質転換したニンジンの「毛状」根の脂肪酸分析を行った結果、アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼが過剰発現する結果、１８：２が失われて１８．３が１０倍以上増加し得ることが示された。

Ｔ−ＤＮＡ変異体系統３７０７におけるデルタ−１５不飽和化変異の補足を行いそして種子内で配列同定番号１が過剰発現することの生物学的効果を試験する目的で、その胚に特異的なプロモーター／配列同定番号１／３′　ファセオリンのキメラ遺伝子をバイナリ−ベクターに形質転換した後、これを弱毒性アグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４１ｍ形質転換した［）ｌｏｅｋｅｍａ他（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：１７９−１８０１゜遺伝工学したアグロバクテリウムを用いて系統３７０７の根の形質転換を行い、形質転換した植物を選択した後、成育させることで種子を生じさせた。２つの植物から得られる種子の脂肪酸分析を行った結果、各植物における６個の種子の中の１つが変異体である脂肪酸表現型を表す一方、その残りの種子に関しては約５５％に及んで１８：３が１０倍以上増加したことが示された。このサンプルサイズは小さいが、このような分離により、その脂肪酸表現型はメンデル遺伝を示すことが示唆された。

この増加の大部分は１８：２が失われることで生じる一方、それのいくらかは１８：１が失われることでも生じる。従って、油作物、特にアラビドプシスに近い関係にあるカノーラにおけるこの遺伝子の過剰発現はまた、亜麻の特殊な油の中に見いだされる１８：３を高レベルでもたらすと期待される。

Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ他の方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９７０）　４８：４４３−４５３）による３８６個のアミノ酸から成るポリペプチド配列と、ラット、マウスおよび酵母菌由来ミクロソームのステアロイル−ＣｏＡ　（デルタ−９）デサチュラーゼに関するそれらと比較した結果、それぞれ２１％、１９％および１７％の同一性が確認された。膜に会合しているアラビドプシスデルター１５デサチュラーゼ蛋白質はそのｄｅｓＡ蛋白質に対して有意であるが限定された相同性を示す一方、これは、アラビドプシス由来のものを含む高等植物由来の可溶ステアロイル−ＡＣＰ　（デルタ−９）デサチュラーゼに有意な相同性を全（示さなかった。

プラスミドｐＦ１とｐＳｌが有する部分的ヌクレオチド配列を比較した結果、左側のＴ−ＤＮＡ境界：植物ＤＮＡ結合は配列同定番号１内の開始コドン由来の約７００ｂｐであることが示された。そのｐＦｌ配列に関するもう一方のＴ−ＤＮＡ：植物ＤＮＡ結合の位置を決定する目的で、このＴ−ＤＮＡ：植物のＤＮＡ結合フラグメントの単離を行った。

上に記述した如く単離した変異体系統３７０７由来のゲノムＤＮＡを制限酵素Ｍｂｏｌで部分消化させることにより、約１５ｋｂの平均フラグメントサイズが生じた。クレノーを用いてそのフラグメント末端をｄＧＴＰおよびｇＡＴＰで部分充填した後、製造業者のプロトコルに従って、ラムダＧＥＭ　（商標）　−１１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＸｈｏＩ半分部位にクローン化した。このファージライブラリーのタイターを測定し、そして本質的にＡｕ５ｕｂｅｌ他［［分子生物学における現代プロトコルｊ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　（１９８９）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓn に記述されているように使用した。ｐＦｌ内の遺伝子の５°末端から誘導した約０．６ｋｂの放射能標識ＰＣＲ産物を用いて、そのゲノムファージライブラリーのスクリーニングを行った。この産物の長さは、その左側Ｔ−ＤＮＡ境界が挿入されているところの右側３ｂｐの所から、配列同定番号１内のヌクレオチド位置１の左側１５ｂｐの所までである。

ＥｃｏＲＩ制限消化および電気泳動に従って精製した正のハイブリッド形成を示すファージの１つから得られるＤＮＡをサザンプロット分析した結果、その０．６ｋｂのＰＣＲ産物に４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントがハイブリッド形成することが示された。このＥｃｏＲＩフラグメントをサブクローン化して、配列決定分析を受けさせた。このフラグメントから誘導される配列であるｐＦｌとｐＳｌを比較することにより、Ｔ−ＤＮＡが挿入される結果としてその挿入部位に５６ｂｐの欠失が生じ、そしてこのＴ−ＤＮＡが配列同定番号１内の開始コドンにアラビドプシス遺伝子７１１ｂｐの５°が向かうのを妨害していることが示された。

従って、このＴ−ＤＮＡはそのオーブン読み枠に５゛を挿入し、これは、配列同定番号１をコード化する遺伝子の漏出発現および変異体３７０７における漏出脂肪酸表現型に一致している。この左側Ｔ−ＤＮＡ：植物のＤＮＡ結合は正確である、即ちこの左側Ｔ−ＤＮＡ境界またはフランキング植物ＤＮＡのいずれも如何なる配列転位も伴っていないが、他のＴ−ＤＮＡ：植物のＤＮＡ結合は複雑であり、充分な特徴付けは行っていない。

プラスミドｐＣＦ３を、ブダペスト条約の規定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９１年１２月３日付けで寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６８８７５を受理した。

アラビドプシスデルター１５デサチュラーゼｃＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして用いた、アラビドプシスからの関連デサチュラーゼ類をコード化するｃＤＮＡ単離プラスミドｐＣＦ３から単離した１、４ｋｂのＮｏｔｌ挿入断片フラグメントを精製し、放射能標識した後、これを用いて、低緊縮（Ｌｏｗｅｒｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）　ハイブリッド形成（１〜丁のＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス■（ＣＬ　ｐＨ７，５，１％のＳＤＳ、５％のデキストランスルフェート、０．１ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡおよび５０℃）および洗浄（続けて、２Ｘ　５ＳＰＥ、領　１％ＳＤＳを用いて室温で５分間、そして再び新鮮な溶液を用いて１０分間、そして最後にＱ、５Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて５０°Ｃで５分間）を用いる以外は上述したように、３日才黄化アラビドプシス・グリアナ由来ポリＡ”ｍＲＮＡに対して作り出したｃＤＮＡライブラリーから、約８０，０００個のクローンをスクリーニングした。強力にハイブリッド形成するプラークを約１７個そして弱（ハイブリッド形成するプラークを１７個、−次スクリーニングで同定した。これらの弱（ハイブリッド形成するプラークの４つを取り上げて、それらが純粋になるまで、上述した如き放射能標識プローブを用いたスクリーニングを更に１回または２回受けさせた。これらがデルタ−１５デサチユラーゼクローンでないことを保証する目的で、デルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡ　（ｐＣＦ３）の３゛非コーデイング領域に特異的な１８ｂｐオリゴマーにそれらがハイブリッド形成するか否かを決定するさらなる分析を行った。これらのフィルターをオートラジオグラフィーにかけた後、これらのクローンの１つが上記プローブにハイブリッド形成しないことが確認された。このクローンを取り上げ、そして上述したようにして、そのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいるプラスミドクローンが得られた。ｐＣＭ２と表示するこのプラスミドの制限分析を行った結果、これは、ｐＣＦ３のアラビドプンスデルター１５デサチュラーゼｃＤＮＡに特徴的な０．７ｋｂのＮｃｏ　Ｉ−Ｂｇ　１１１フラグメントが欠乏している約１．３ｋｂのＣデサチュラーゼ挿入断片を有していることが示された。（このフラグメントは、配列同定番号１内のヌクレオチド４７４から４７９の所のＮｃｏ１部位とヌクレオチド１１６４から１１６９の所のＢｇｌ＋１部位との間に位置しているＤＮＡに相当している）。ｐＣＭ２の５°領域および３゛領域由来の１本鎮の部分ヌクレオチド配列により、このｃＤＮＡ挿入断片は不完全であり、そしてこれは、ｐＣＦ３内のｃＤＮＡがコード化するそれと類似しているがそれとは異なるポリペプチドをコード化することが確認された。プラスミドｐＣＭ２内のｃＤＮＡの全長板を単離する目的で、このｃ　ＤＮＡ挿入断片を含んでいるプラスミドｐＣＭ２由来の１．３ｋｂ　Ｎｃｏｌフラグメントを単離し、そしてこれを放射能標識ハイブリッド形成プローブとして用いて、上と同じアラビドプシスｃＤＮＡライブラリーの再スクリーニングを行った。強力にハイブリッド形成するプラークを３つ精製し、前に記述したのと同様にして、これらのプラスミドの切除を行った。この得られる３種のプラスミドをＮｃｏｌ制限酵素で消化させた結果、これらは大きさがｌｋｂから１．５ｋｂの範囲のｃＤＮＡ挿入断片を含んでいることが示された。これらのプラスミドの１つ（ｐＡＣＦ２−２と表示する）内のｃＤＮＡ挿入断片の完全ヌクレオチド配列決定の測定値を配列同定番号４の中に示す。配列同定番号４は、脂肪酸デサチュラーゼをコード化するアラビドプシス・グリアナｃＤＮＡが有する塩基対の５゛から３°へのヌクレオチド配列を示している。ヌクレオチド１０−１２およびヌクレオチド１３５８から１３５０は、それぞれオーブン読み枠（ヌクレオチド１０から１３５０）の推定開始コドンと終止コドンである。その推定アミノ酸配列を、本出願におけるダイズ由来の関連デルタ−１５脂肪酸デサチュラーゼのそれと比較することにより、このオーブン読み枠が立証された。ヌクレオチド１から９および１３５１から１５２５はそれぞれ５゛および３′非翻訳ヌクレオチドである。配列同定番号５における４４６個のアミノ酸から成る蛋白質配列は、配列同定番号４におけるオーブン読み枠から推定された配列であり、５１ｋＤの概算分子量を有している。配列同定番号２と５を並べることにより、全体で約８０％の相同性が示され、そしてその前者は約５５個のアミノ酸長から成るＮ末端伸長部を有しており、これは、核コード化ブラスチド蛋白質内に見られるシグナルペプチドであると推定される。

配列同定番号４に相当する遺伝子の発生発現を分析する目的で、Ｍａｎｉａｔｉｓ他［分子クローニング、実験室マニュアルＪ　（１９８２）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓの中に本質的に記述されテいルよウニ、野生型および変異体系統３７０７両方のアラビドプンス植物由来の葉、根、発芽実生および発生長角果から得られるｍＲＮＡサンプルに対する放射能標識ハイブリッド形成プローブとして、上記配列を用いた。その結果、配列同定番号１をコード化する遺伝子の構成発現とは対照的に、配列同定番号４に相当しているｍＲＮＡは、緑色の組織内に豊富で、根および葉の中には少なく、そして葉の中では、配列同定番号１のそれよりも約３倍豊富であった。プラスミドｐｃＭ２内のｃＤＮＡはまた、ＥｃｏＲＩで消化させたアラビドプシス・グリアナ（生態型Ｗａｓｓｉｌｅｓｋｉｊａおよびマーカー系統Ｗ１００生態型Ｌａｎｄｅｓｂｅｒｇ背景）由来のゲノムＤＮＡに冬型的にハイブリッド形成することが示された。これをＲＦＬＰマーカーとして用いて、アラビドプシス内でこの脂肪酸デサチュラーゼをコード化する遺伝子に関する遺伝座地図作成を行った。このデサチュラーゼｃＤＮＡに対応して単一の遺伝座が位置していた。このようにして、この位置はラムダＡＴ２２８とコスミドｃ３８３８ＲＦＬＰマーカーの間の染色体３上、即ち無毛（ｇｌａｂｒｏｕｓ）座の「北」に存在していると決定した（Ｃｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８８）　８５：６８５６−６８６０　；　Ｎａｌ１１他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：６９９−７０５））　。これは、アラビドプシスの脂肪酸デサチュラーゼであるファド２、ファドＤおよびファドＢ変異が位置している領域に近い［Ｓｏｍｅｒｖｉ１１他、（１９９２）、出版物］ｏ　ｐｃＦ３および、ＡＣＦ２−２のｃＤＮＡ挿入断片を用いてミクロソームのデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをクローン化する試みが不成功であったことと共に、上記データにより、出願者らは、フッドＤ座に相当しているプラスチドのデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼをｐＡＣＦ２−２内のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａがコード化すると結論付けた。このｃＤＮＡをｐＡＣＦ２−２内で生物学的に発現させることによって上記結論を立証する。

プラスミドｐＣＭ２を、ブダペスト条約の規定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９１年１１月２７日付けで寄託し、取得番号ＡＴＣＣ６８８５２を受理した。

プラスミドｐＣＦ３、ｐＣＭ２およびｐＡＣＦ２−２から単離した１゜４ｋｂ、１．３ｋｂおよび１．５ｋｂのＮｏｔＩ　ｃＤＮＡ挿入断片フラグメントを精製し、放射能標識した後１、これらを用いて、上述した如き低緊縮で２つの異なるｃＤＮＡライブラリーを数回スクリーニングした、即ち、上記ライブラリーの１つを、上述した如き３日才黄化アラビドプシス・グリアナ（「黄化」ライブラリー）由来のポリＡ”ｍＲＮＡに対して作り出し、そして１つを、アラビドプシス・グリアナ植物の地上部由来のポリＡ’ｍＲＮＡに対して作り出したが、これらのサイズは、それらの−吹音が開いた直後のものから、抽だいを生じて開化する植物に及んで変化していた［Ｅ１１ｅｄｇｅ他（１９９１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳ＾８８：ｌ７３１−１７３５コ。このライブラリー内のｃＤＮＡ挿入断片を、ラムダＹｅＳベクター［Ｅ１１ｅｄｇｅ他（１９９１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８：１７３１ −１７３５］内のＥｃｏＲＩに接しているＸｈｏｌの中に入れた（「葉」ライブラリー）。配列同定番号１および４両方に対して弱く２倍の盛り上がりでハイブリッド形成する両方のライブラリーから得られるい（っかのプラークにプラーク精製を受けさせた。上述した如き「黄化」ライブラリー由来の純粋なファージからファージミドを切除した。大腸菌株ＢＮＮ　１３２　［Ｅ１１ｅｄｇｅ他（１９９１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８８：１７３１ −１７３５］内のｃｒｅ−１ｏｘ組換えシステムを用いた部位特異的組換えを用いて、その「葉」ライブラリーの精製ファージからプラスミドを切除した。全ての場合において、そのクローン化したＤＮＡのヌクレオチド配列決定を行った結果、配列同定番号１または４と同じクローンか或は認識不可能な配列が確認された。

別の組の試験において、低緊縮（２６Ｃ，ＬＭのＮａ’、５０％のホルムアミド）および高緊縮（４２Ｃ，ＩＭのＮａ’、５０％のホルムアミド）で「葉」ライブラリー内の約４００，０００個のファージを配列同定番号１および４に関してスクリーニングした。この−次プラークリフト（ｌｉｆｔ）上のいくつかの陽性シグナルの中で１１個が、配列同定番号１に対して高緊縮ハイブリッド形成し、その３５個が配列同定番号４に対して高緊縮ハイブリッド形成し、そして３９個がそれらの両方に対して低緊縮でのみハイブリッド形成した。これらの低緊縮シグナルの２７個のプラークに二次低緊縮スクリーニングを受けさせ、これらの１７個を用いて、切除したプラスミドからＤＮＡを作り出した。その１７種のプラスミドＤＮＡの配列決定を行い、その８個は認識不可能な配列であり、５つは配列同定番号１と同じであり、２つは配列同定番号２と同じであり、そして２つは互いに同じであり関係していたが、配列同定番号１および４とは異なっていた。

ｐＦａｄ−ｘ２と表示するこの新規なデサチュラーゼ配列をまた「葉」ライブラリーから単離したが、ここでは、本明細書の別の所に記述するように、植物デルタ−１５デサチユラーゼ類とラン色細菌ｄｅｓＡデサチュラーゼの間で保存されている配列に対して作り出した縮重したオリゴマーを用い、カノーラの種子と共にアラビドプシスの葉の両方から作り出したポリＡ”ＲＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応によって誘導される０、６ｋｂのＰＣＲ産物を独立してハイブリッド形成プローブとして用いた。ｐＹａ　ｃ　ｐ　７と表示するそのＰＣＲ誘導プラスミドを、両末端から部分配列決定した。ｐＦａｄ−ｘ２とｐＹａ　ｃ　ｐ　７の配列を比較することにより、これらの２種の、独立してクローン化したｃＤＮＡは、その他のデルタ−１５デサチユラーゼに関係している同じ配列を含んでいることが確認され、そして両方とも不完全なｃＤＮＡであった。両方のプラスミドｐＦａｄ−ｘ２およびｐＹａｃｐ７から誘導される部分複合配列を、４７２ｂｐから成る５゛から３°へのヌクレオチド配列として配列同定番号１６の中に示す。ヌクレオチド２−４およびヌクレオチド４６８から４７０はそれぞれそのオーブン読み枠内の最初のコドンと最後のコドンである。このオーブンギヤツブ重量およびギャップ長さ重量値を用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ他［Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　（１９７０）　４８：４４３−４５３１の方法により、配列同定番号１７と、本出願の中に開示する他のデルタ−１５デサチユラーゼポリペプチド類との比較を行った。アラビドプシス、カノーラおよびダイズ由来のミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼと配列同定番号１７との間の全体的同一性は６５％から６８％の間であり、そしてアラビドプンス、カノーラおよびダイズ由来のブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼと配列同定番号１７との間の全体的同一性は７７％から８７％の間であった。

加つるに、配列同定番号１７は、ミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼに匹敵するＮ末端ペプチド伸長物を有しており、このことは、アラビドプシスブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ内のシグナルペプチド配列の相同性を示している。これらの比較を基にして、配列同定番号１６がブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化すると推定する。ブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼのための座が２個存在していることを示唆する、アラビドプシスに関する遺伝的データが存在している。本分野の技術者は配列同定番号１６の全長版を容易に単離することができるであろう。配列同定板１６またはそれの全長版を植物の中に導入することの生物学的効果を用いて、これの同定を立証する。

プラスミドｐＹａｃｐ７を、ブダペスト条約の規定の下でＡｌ１ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９２年１１月２０日付けで寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９１２９を受理した。

アラビドプシスデルター１５デサチュラーゼｃＤＮＡをハイブリッド形デルター１５脂肪酸デサチュラーゼをコード化するブラシカ・ナブス種子ｃＤＮＡのクローニングを行う目的で、ｐＣＦ３およびりＣＭ２由来のｃＤＮＡ挿入断片をその個々のプラスミドからポリメラーゼ連鎖反応で単離し、放射能標識した後、これをハイブリッド形成プローブとして用いて、授粉して２０−２１日後の発生ブラシカ種子由来のポリＡ”ｍＲＮＡを用いて作り出したラムダファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。このｃＤＮＡライブラリーを、低緊縮で数回、上述したアラビドプシスｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。

この初期スクリーニングで得られるブラシカ・ナブスｃＤＮＡの１つを、次の高緊縮スクリーニングにおけるプローブとして用いた。

アラビドプシスｐＣＭ２挿入断片を放射能標識し、そしてこれをプローブとして用いて、低緊縮ハイブリッド形成条件下で約３００，０００個のプラークをスクリーニングした。このフィルターハイブリッド形成を、５ＱｍＭのトリス、ｐ）（’７．６．６Ｘ　ＳＳＣ，５Ｘデンノ１ルト液、０．５％のＳＤＳ、１１００ｕの変性ウシ胸腺ＤＮＡ中５０℃で一晩実施した後、ハイブリッド形成後洗浄を、６Ｘ　５ＳＣ１０，５％ＳＤＳ中室温で１５分間実施し、そして２Ｘ　５ＳＣ１０，５％ＳＤＳを用い４５℃で３０分間繰’）　返シｆ：　後、０．２Ｘ　ＳＳＣ，０，５９６ＳＤＳを用いて２回、５０℃で３０分間繰り返した。強力にハイブリッド形成するファージが５つ得られた。これらをプラーク精製し、そしてこれを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩファージミドキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　１９９１力タログ品目２１２２０５）のマニュアルに記述されているように、これらのファージミドの切除を行った。これらの１つ（ｐＢＮＳＦ３−２と表示する）は１．３ｋｂの挿入断片を含んでいた。

ストランドおよびヌクレオチド配列の両方に関してｐＢＮＳＦ３−ｆ２を完全に配列決定し、そしてこのヌクレオチド配列を配列同定番号６の中に示す。プラスミドｐＢＮＳＦ３−２を、ブダペスト条約の規定の下で＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、　ＭａｒｙｌａｎｄＳＵＳＡに１９９１年１１月２７日イ寸けで寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６８８５４を受理した。

ｐＣＭ２プローブを用いた追加的低緊縮スクリーニングにより、強力にハイブリッド形成するファージが８つ得られた。これらの１つ（ｐＢＮＳＦｄ−８と表示する）は０．４ｋｂの挿入断片を含んでいた。１本鎖に関してｐＢＮＳＦｄ−８を完全に配列決定し、このヌクレオチド配列は、その相同性を示す領域内で有意に配列同定番号６と一致しておらず、このことは、これが配列同定番号６の中に示すものとは異なる新規なブランカ・ナブス種子デサチュラーゼに相当していることを示唆していた。ｐＢＮＳＦｄ−８挿入断片を放射能標識し、そしてこれを、ブラシカ・ナブス種子ｃＤＮＡライブラリーの高緊縮スクリーニングにおけるハイブリッド形成プローブとして用いた。このハイブリッド形成条件は上に記述した低緊縮スクリーン条件と同じであるが、但し、０．２ＸＳＳＣ１０，５％ＳＤＳ内におけるハイブリッド形成後洗浄の最後２回の３０分間の温度を６０°Ｃにまで上昇させた。このスクリーニングにより、強力にハイブリッド形成するファージが３つ得られ、これらを精製した後、切除した。この切除したプラスミドの１つであるｐＢＮＳＦｄ−３は１．４ｋｂの挿入断片を含んでおり、これを、両方のストランドに関して完全に配列決定した。配列同定番号８は、ｐＢＮＳＦｄ−２の完全ヌクレオチド配列を示している。

発生ダイズ種子から単離したポリＡ’ｍＲＮＡに対してｃＤＮＡライブラリーを作り出しそして本質的に上述したのと同様にスクリーニングしたが、但し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、ＩＭのＮａＣ１，１％のＳＤＳ、５％のデキストランスルフェートおよび０６１ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡから成るハイブリッド形成緩衝液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）の２５ｍＬ中５０℃で２時間、フィルターの前ハイブリッド形成を行った。上述した如＜ｐＣＦ３から調製した放射能標識プローブを加えて、５０°Ｃで１８時間ハイブリッド形成させた。これらのプローブを２Ｘ　５ＳＰＥ、１％のＳＤＳで５分間、室温で２回洗浄しりＶｔ、０．２Ｘ　５ＳＰＥ、１％ＳＤＳ中５０°Ｃで５分間洗浄した。これらのフィルターをオートラジオグラフィーにかけることにより、強力にハイブリッド形成するプラークが１つ、そして弱くハイブリッド形成するプラークが約５個存在していることが示された。このより強力にハイブリッド形成するプラークに、２回目の上記スクリーニングを受けさせたが、但し、その最終洗浄は０．２Ｘ　５ＳＰＥ、１％ＳＤＳ中６０℃で５分間であった。強力にハイブリッド形成するプラークが多数観察され、そして他のファージから充分に分離している１つを取り上げてさらなる分析を行った。

そのｃＤＮＡ挿入断片を含む、その精製したファージ由来のｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの配列を、ヘルパーファージの存在下で切除し、そしてその得られるファージミドを用いて、大腸菌ＸＬ−ＩＢｌｕｅ細胞に感染させた。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（［分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の中に記述されているアルカリ性溶菌ミニ製造（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）操作を用いて、ｐＸＦｌと表示するプラスミドからＤＮＡを作り出した。ｐＸＦｌから得られるアルカリ変性２本鎖ＤＮＡを、両方のヌ訃ランドに関して完全に配列決定した。ｐＸＦｌの挿入断片は１７８３個のヌクレオチドから成る範囲を含んでおり、これらは、未知のオーブン読み枠を含んており、そしてまたこのオーブン読み枠に３゛が向いている１６個のヌクレオチドから成るポリーＡ範囲（ヌクレオチド１７６７から１７８３）そして続いてＥｃｏＲ１制限部位を含んでいた。このＥｃｏＲＩ部位に１＜２１８４１１（７）塩基は、１１４５ｂｐのオーブン読み枠を含んでおり、これは、配列同定番号２の中に挙げるアラビドプシスデルター１５デサチュラーゼのポリペプチドに対して約６８％の同一性を示すと共に共直線性を示すポリペプチドをコード化する。この１１４５ｂｐのオーブン読み枠が有する推定出発メチオニンは、アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５ペプチドの出発メチオニンに相当しており、そしてこのメチオニンに５゜が向いているブラスチドのシグナルペプチドに相当するアミノ酸は全く存在していなかった。ｐＸＦｌ内の挿入断片をＥｃｏＲＩで消化させると４つのフラグメントが観察され、これらは、ｐＸＦｌ内の挿入断片が有する最初の１７８３ｂｐから誘導される約３７０ｂｐと１４００ｂｐのフラグメントと、Ｉ）ＸＦＩ内の挿入断片が有するその他の２１８４個のヌクレオチドから誘導される約６００ｂｐと約１６００ｂｐのフラグメントであった。サザンプロットにおいて、ｐＣＦ３から誘導されるプローブにハイブリッド形成するのは６００ｂｐのフラグメントと１６００ｂｐのフラグメントのみであった。ｐＸＦｌはＥｃｏＲ１部位で分離されている２つの異なるｃＤＮＡ挿入断片を含んでおり、これらの挿入断片の２番目のものは、グイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化する２１８４ｂｐのｃＤＮＡであると推定した。プラスミドｐＸＦＩの中に含まれているこの２１８４ｂｐのグイズミクロソームデルタ−１，５ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を配列同定番号１０の中に挙げる。プラスミドｐＸＦ１を、ブダペスト条約の規定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９１年１２月３日付けで寄託し、受託番号＾ＴＣＣ６８８７４を受理した。

グイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして用いた、ダイズからの関連デサチュラーゼをコード化するｃＤＮＡ単離プラスミドｐＸＦ］の中に含まれているダイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡのコーディング領域の一部に相当するＤＮＡの１、Ｏｋｂフラグメントを、制限酵素Ｈｈａｌで切除して、ゲル精製した。上に記述したのと同様にして、これらのフラグメントに３２ｐの標識を付け、そして上に記述したのと同様にして、これをダイズｃＤＮＡライブラリー用のプローブとして用いた。これらのフィルターをオートラジオグラフィーにかけることにより、ハイブリッド形成するプラークが８個存在していることが示され、これらに２回目のスクリーニングを受けさせた。ｃＤＮＡ挿入断片を含むその精製したファージの８個全てからそのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの配列を、ヘルパーファージの存在下で切除し、そしてその得られるファージミドを用いて大腸菌ＸＬ−ＩＢｌｕｅ細胞に感染させた。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の中に記述されているアルカリ性溶菌ミニ製造操作を用いて、それらのプラスミド類からＤＮＡを作り出した。制限分析により、これらは大きさが１．０ｋｂから３．０ｋｂの範囲の挿入断片を含んでいることが示された。これらの挿入断片の１つ（ｐＳＦＤ−１１８ｂｗｐと表示する）は、約１７００ｂｐ挿入断片を含んでいた。ｐＳＦＤ−１１８ｂＷｌ）由来のアルカリ変性２本鎖ＤＮＡを、両方のストランドに関して完全に配列決定し、配列同定番号１２の中に示す。このｐＳＦＤ−１１８ｂｗｐの挿入断片は、配列同定番号１３に示すポリペプチドをコード化するオーブン読み枠を含んでいる１６７５個のヌクレオチドから成る範囲を含んでおり、これらは、配列同定番号５に挙げるアラビドプシスプラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼのポリペプチドに対して約８０％の同一性を示すと共に共直線性を示していた。このオーブン読み枠はまた、このオーブン読み枠の５゛末端で、ブラスチドのシグナルペプチドに相当するアミノ酸をコード化した。このシグナルペプチドは、アラビドプシスブラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼに関して記述したシグナルペプチドと共直線性を示すと共に、いくらかの相同性を共有していた。この１６７５ｂｐから成るダイズブラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を配列同定番号１２の中に挙げる。

それぞれ３．０および０．　１のギャップ重量およびギャップ長重量値を用い、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ他（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９７０）　４８：４４３−４５３）の方法により、本出願で開示する異なるデルタ−１５デサチユラ一ゼ配列を比較した結果、表３に示す如きそれらの間の関係が確認された。

表３アミノ酸レベルにおける、異なるデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼ類ａ３　６６　９３　６６　６８　６７ａＤ　６７　９０　６７　６９ｃ３　−　６８　６８　６８ｃＤ　−−−６８７４ａ３、ａｄ、ｃ３、ｃＤ、ｓ３およびｓＤはそれぞれ配列同定番号２（アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ）、配列同定番号５（アラビドプシスブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ）、配列同定番号７（カノーラミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ）、配列同定番号９（カノーラブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ）、配列同定番号１１（グイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ）、および配列同定番号１３（ダイズブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ）を表している。これらの比較を基にして、ミクロソームおよびブラスチド型両方のデルタ−１５デサチユラーゼは、異なる植物種由来の時でさえ、アミノ酸レベルで６５％以上の全体的同一性を示す。

相同性および非相同グリセロリピッドデサチュラーゼ類をコード化するヌクレオチド配列の単離本発明のフラグメントを用いて、本発明のフラグメントと同じ種からか或は異なる種から、相同性および非相同グリセロリピッドデサチュラーゼのｃＤＮＡおよび遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコルを用いた相同性遺伝子の単離は本技術分野でよく知られている。サザンプロット分析により、アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡ（配列同定番号１）はトウモロコシおよびダイズのゲノムＤＮＡフラグメントにハイブリッド形成することが確認された。加つるに、出願者らは、ブラシカ・ナブス（配列同定番号６）およびダイズ（配列同定番号１０）由来の種子ミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ類をコード化するｃＤＮＡを単離する目的でそれを用いることが可能であることを示した。従って、同じか或は異なる高等植物種、特に油産生種から、相同性グリセロリピッドデサチュラーゼのためのｃＤＮＡおよび遺伝子を単離することが可能である。

より重要なことには、プラスチドの中に見られるものを含む非相同グリセロリピッドデサチュラーゼのためのｃＤＮＡおよび遺伝子を単離する目的で本発明のフラグメントを用いることができる。従って、アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡ　（配列同定番号１）をハイブリッド形成プローブとして用いて成功裏に、アラビドプシス（配列同定番号４）およびブラシカ・ナブス（配列同定番号８）由来の関連プラスチドデルター１５デサチュラーゼ類をコード化するＣＤＮＡを単離したと共に、ダイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡ　（配列同定番号１０）を用いて成功裏に、ブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ（配列同定番号１２）をコード化するダイズｃＤＮＡを単離した。

本発明の特別な態様において、異なるデサチュラーゼ類の間で保存される本発明の核酸フラグメントの領域を、本分野の技術者が用いて、他の相同性もしくは非相同グリセロリピッドデサチュラーゼｃＤＮＡまたは遺伝子をコード化する核酸フラグメントを単離することを目的とした配列依存プロトコルで用いるための縮重オリゴマー類の混合物を設計することが可能である。例えば、全てのデサチュラーゼポリペプチド類を比較することにより、それらの間で保存されるアミノ酸の範囲を同定した後、その保存アミノ酸配列を用いて、短縮型または畏縮型両方のオリゴマーを設計するか、或は本分野の技術者に知られている［ゲスマー類（ｇｕｅｓｓｍｅｒｓ）　Ｊを設計することが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（「分子クローニング、実験室？−ユアル」、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ参照）。上記オリゴマー類および「ゲスマー類」を、本分野の技術者に知られているようにハイブリッド形成プローブとして用いることができる。

例えば、ラン色細菌のｄｅｓＡと植物のデルタ−１５デサチユラーゼとを比較することにより、特に良好に保存されているアミノ酸の範囲（配列同定番号１内のアミノ酸９７−１０８）を確認した。配列同定番号２０および２１は２組の３５ −ｍａｒを表しており、各々この領域に対して作り出した１６倍縮重物である。

配列同定番号２０および２１の中に示した末端標識オリゴマーを混合し、これらをハイブリッド形成プローブとして用いて、アラビドプシスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。正にハイプリント形成するプラークの大部分はまた、アラビドプシスミクロソームおよびプラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ（配列同定番号１および４）をコード化するｃＤＮＡにハイブリッド形成した。しかしながら、配列同定番号２０および２１の使用は、一定した再現性のある結果を与えなかった。同じ保存領域のより長い範囲である配列同定番号１内のアミノ酸９７から１４１　（ＦＶＬＧＨＤＣＧＨＧＳＦＳＤ　Ｉ　ＰＬＬＮ５ＶＶＧＨＩ　ＬＨ３Ｆ　Ｉ　ＬＶＰＹＨＧＷＲＩ　５ＨＲＴＨＨ）に対するアンチセンスストランドとしてまた、長さが１３５個塩基のオリゴマー（配列同定番号３２）も作り出した。曖昧な位置における設計では、デオキシイノシン類を用いるか、或はアラビドプシス遺伝子におけるコドン使用を基としたコドンを最も頻繁に用いた。ハイブリッド形成プローブとして用いる場合、この１３５−ｍａｒは、アラビドプシスミクロソームおよびプラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ（配列同定番号１および４）をコード化するｃＤＮＡにもハイブリッド形成する全てのプラークにハイブリッド形成した。加うるに、これはまた、配列同定番号１および４にハイブリッド形成しなかったプラークにもハイブリッド形成した。

後者を精製して、上に記述した如く切除した。その得られるプラスミド内のｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列決定を行った結果、いずれのデサチュラーゼにも何ら関係を示さないＤＮＡ配列が確認された。

別の実施例では、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｉｎｎｉｓ他編集（１９９０）　ｒＰＣＲプロトコル：方法および応用に対する指針Ｊ　（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＳＳａｎ　Ｄｉｅｇｏ）において、本発明の現在のフラグメントが有する２つの短い片を用い、ＤＮＡまたはＲＮＡからより長いグリセロリピッドデサチュラーゼＤＮＡフラグメントを増幅することができた。このポリメラーゼ連鎖反応をまた、本発明のフラグメントを基とする１つのプライマーを用いてクローン化したヌクレオチド配列のライブラリーに対して行うことが可能であり、そしてその他、ポリＡ”テールまたはベクター配列のどちらかに対して行うことも可能である。これらのオリゴマー類は、本発明の核酸フラグメントから誘導されるユニークな配列であるか或は縮重しだ配列であってもよい。本方法を用いて生じさせた相同性グリセロリピッドデサチュラーゼＤＮＡの長い片は、その後、アラビドプシスまたは他の種から関連グリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子またはｃＤＮＡを単離するためのプローブとして用いられ得る。デオキシイノシンが用いられている長いオリゴマー類を含むオリゴマー類の設計、並びにハイブリッド形成またはポリメラーゼ連鎖反応のための「ゲスマー類」の設計は、本分野の技術者に知られており、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ他（「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の中で考察されている。デルタ−１５デサチユラーゼと他のデサチュラーゼ類、特にｄｅｓＡとの間で保存されているアミノ酸範囲を用いることで、上記オリゴマー類の設計を行うことが可能になる。例えば、ｄｅｓＡとデルタ−１５デサチユラーゼの間で保存されているアミノ酸範囲（上で考察した）は、ハイブリッド形成のための長いオリゴマー類の設計で有効性を示すと共に、ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーとして用いるための短いオリゴマー類を設計するに有効性を示す。これに関連して、配列同定番号２のアミノ酸９７から１０８の保存アミノ酸範囲が特に有効である。この目的で用いるに有効な、配列同定番号２内の他の保存領域は、アミノ酸２９９から３０９、アミノ酸１１５から１２１、およびアミノ酸１３３から１４１である。配列同定番号２内のアミノ酸範囲１３３から１４１は、いくつかデサチュラーゼ類に対して特に良好な相同性を示す。例えば、この範囲において、アミノ酸１３３．１３７．１３８．１４０および１４１は、植物のデルタル１５デサチュラーゼ類、ラン色細菌のｄｅｓＡ、酵母菌および哺乳動物ミクロソームのステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ類の中で保存されている。ラン色細菌のｄｅｓＡと植物のデルタ−１５デサチユラーゼ類を比較することにより、ＰＣＲで用いられ得る特に良好に保存された２つのアミノ酸範囲（配列同定番号１内のアミノ酸９７−１０８およびアミノ酸２９９−３１１）が確認された。これらの領域に対して下記の組のＰＣＲプライマーを作り出した：２０　３６　１６　９７−１０８　（Ｓ）　ＦＶＬＧＨＤＣＧＨＧＳＦ２１　３６　１６　９７−１０８　（Ｓ）　ＦＶＬＧＨＤＣＧＨＧＳＦ２８　３６　１６　９７−１０８　（Ｓ）　ＦＶＬＧＨＤＣＧ［（ＧＳＦ２９　３６　１６　９７ −１０８　（Ｓ）　ＦＶＬＧＨＤＣＧＨＧＳＦ２２　１８　７２　１００−１０５　（Ｓ）　（ＡＩＤＣＧＲ２３１８７２１００＝１０５　（Ｓ）　ＧＨＤＣＧＨ２４１８７２２９９−３０４（ＡＳ）　ＨＤＩＧＴＨ２５１８７２２９９−３０４（ＡＳ）　ＨＤＩＧＴＨ２６２３４１６３０４−３０９（ＡＳ）　ＨＶＩＲＨＬ２７　２３　４１６　３０４−３０９　（ＡＳ）　ＩＩＶＩＨＨＬ３０　３８　６４　２９９−３１１　（ＡＳ）　１ｌＤＩＧＴＩｆｆＩＨＨＬＦＰ３１　３８　６４　２９９−３１１　（ＡＳ）　ＨＤＩＧＴＨＶＩＨＨＬＦＰｌつの実験において、配列同定番号２２および２３をセンスプライマーとして用いてＰＣＲを実施し、そして配列同定番号２４と２５または配列同定番号２６と２７を、アラビドプシスの葉およびカノーラ発生種子両方から精製したポリＡ”ＲＮＡに対するアンチセンスプライマー類として用いた。全てのＰＣＲで、適当な大きさを有するＰＣＲ産物が生じた（約６３０ｂｐ）。アラビドプシスおよびカノーラ由来のＰＣＲ産物を精製し、これらを放射能標識ハイブリッド形成プローブとして用いて、上述した如きラムダＹｅｓアラビドプンスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。これにより、純粋なファージの単離がもたらされ、これを切除することでプラスミドｐＹａ　ｃ　ｐ　７が得られた。ｐｙａｃｐ７内のｃＤＮＡ挿入断片を部分配列決定した。これは、この配列により、前に記述した如き低緊縮ハイブリッド形成で単離した別のｃＤＮＡ（プラスミドｐＦａｄｘ− ２）と同じ不完全なデサチュラーゼポリペプチドをコード化することが示された。ｐＦａｄｘ−２およびｐＹａｃｐ７内のｃＤＮＡ挿入断片由来の部分配列から誘導される複合配列を配列同定番号１６の中に示し、そしてこれがコード化するポリペプチドを配列同定番号１７の中に示す。以前に考察したように、配列同定番号１７は推定プラスチドデルター１５デサチュラーゼである。これは更に、いくつかの酵素の１つで消化させたアラビドプシスゲノムＤＮＡに関して行った、ｐＣＦ２、ｐＡＣＦ２−２またはｐＹａｃｐ７由来の放射能標識ｃＤＮＡ挿入断片を用いたサザンブロソト分析により支持された。

これは、この異なる挿入断片は異なる制限フラグメントにハイブリッド形成し、モしてｐＡＣＦ２−２およびｐＹａ　ｃ　ｐ　７由来の挿入断片のみがある程度の交差ハイブリッド形成を表すことを示している。

別のＰＣＲ実験において、アラビドプシス変異体系統３７０７から精製したポリＡ＋ＲＮＡに対し、センスプライマーとして配列同定番号２８および２９の各々を約８０ｐモル用いそしてアンチセンスプライマーとして配列同定番号３０および３１の各々を約９４ｐモル用いてＰＣＲを実施した。ＧｅｎｅＡｍｐ　（商１）ＲＮＡ　ＰＣＲキットを用い、製造業者のプロトコルに従うと共に下記のプログラムを用いて上記を実施した：ａ）９５℃で２分間を１サイクル、ｂ）９５° Ｃ（変性）で１分間、５０℃（７二−リング）で１分間および６５°Ｃ（伸長）で１分間を３５サイクル、そしてｃ）６５℃で７分間を１サイクル。適当な大きさく約６３０ｂｐ）を有するその得られるＰＣＲ産物を精製し、放射能標識した後、上述したように、アラビドプシスゲノムＤ　Ｎ　Ａのサザンプロットに対するハイブリッド形成プローブとして用いた。これは、配列決定番号１（アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デザチユラーゼ）、配列決定番号４（アラビドプシスプラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ）、および配列決定番号１６（アラビドプシスプラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼ）にもハイブリッド形成する制限フラグメントにハイブリッド形成するが、これはまた、以前にクローン化したデサチュラーゼｃＤＮＡにハイブリッド形成しなかった新規なフラグメントにもハイブリッド形成した。しかしながら、何回か試みた後でさえ、その放射能標識したＰＣＲ産物は、異なるアラビドプシスｃＤＮＡライブラリーに対するプローブとして用いた時、如何なる新規ｃＤＮＡクローンにもハイブリッド形成しなかった、即ち全ての場合において、これがハイブリッド形成したのは、公知デサチュラーゼｃＤＮＡにもハイブリッド形成するプラークに対してのみであった。更に、このＰＣＲ産物をプラスミドベクターにサブクローン化し、そしてこれらの約１００個についてスクリーニングを行った後、新規なデサチュラーゼ配列を有するクローンは全く生じなかった。

本発明のフラグメントを用いて更に多（のグリセロリピッドデサチュラーゼの例を単離するにつれて、他のグリセロリピソドデサチュラーゼの単離がより容易になるであろう。多様なデサチュラーゼ類から保存アミノ酸配列を知ることでまた、更に多くのより良好な共通配列を同定することが可能になるであろう。上記配列を用いることでハイブリッド形成プローブまたは増幅プライマーを作り出すことが可能になり、これらは更に、菌・カビ、藻類およびラン色細菌などの如き非植物給源由来のデサチュラーゼ類を含む異なるグリセロリピッドデサチュラーゼ類、並びに他の有機体由来の他の膜会合デサチュラーゼ類を単離することの補助になるであろう。

本発明を用いて単離され得るグリセロリピッドデサチュラーゼ類をコード化する多様なヌクレオチドフラグメントが示す機能は、植物発現に必要とされる適切な調節配列にセンスもしくはアンチセンス配向で連結させたその単離したデサチュラーゼ配列を用いて植物の形質転換を行いそしてその得られる形質転換した植物の脂肪酸表現型を観察することによって同定され得る。この形質転換に好適な標的植物は、アンチセンス阻害または共抑制でその相当する内在性遺伝子の阻害を得ることがその目標である場合、その単離したヌクレオチドフラグメントの給源と同じである。その単離した核酸フラグメントの発現または過剰発現で用いるに好適な標的植物は、不飽和化反応で識別される変異を有する植物、例えばアラビドブノスデサチュラーゼ変異体、デルタ−１５不飽和化が不完全な変異体亜麻、またはデルタ−１２不飽和化が不完全な変異ヒマワリなどである。また、その単離した核酸フラグメントが示す機能は、同様に、その核酸フラグメントと適切な調節配列を含んでいるキメラ遺伝子を用いて他の有機体、例えば酵母菌またはラン色細菌の形質転換を行いそして脂肪酸組成および／または酵素活性を分析することによっても決定され得る。

形質転換した種におけるグリセロリピッドデサチュラーゼ酵素の過剰発里適切な調節配列と一緒に機能的グリセロリピッドデサチュラーゼ（類）をコード化する本発明の核酸フラグメント（類）を用いて、形質転換した有機体内でその酵素（類）を過剰発現させることができる。上記組換え型ＤＮＡ構築物は、未変性のグリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子か或はその宿主有機体と同一もしくは異なっていてもよい種から単離されたキメラグリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子のどちらかを含んでいてもよい。グリセロリピッドデサチュラーゼ（類）の過剰発現では、その導入する遺伝子は共抑制の起こり易さを低くする目的で異なる種由来のものであるのが好適である。例えば、ダイズ、ナタネまたは他の油産生種内でデルタ−１５デサチユラーゼを過剰発現させて多不飽和脂肪酸を変化したレベルで産生させることは、ｐＣＦ３内で見られるｃＤＮＡ全体からＲＮＡを発現させることによって達成され得る。同様に、アラビドブノス、ナタネおよびダイズ由来のグリセロリピッドデサチュラーゼ類をコード化する単離された核酸フラグメントを、本分野の技術者が用いてまた、本質的に相同性を示す全長ｃＤＮＡを得ること力呵能である（もし既に得られていないとしても）と共にその相当する遺伝子を本発明のフラグメントとして得ることも可能である。これらを用いて今度は、その相当するデサチュラーゼ類を植物内で過剰発現させることができる。本分野の技術者はまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（「分子クローニング、実験室？　ニュアル」、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の中に記述されているように、制限エンドヌクレアーゼ類を用いそして／またはそれらのための部位を作り出すことによって、本発明のフラグメント（類）からコーディング配列（類）を単離することも可能である。例えば、プラスミドｐＣＦ３の中に入っている配列同定番号１内のフラグメントをＮｏｔ１部位の側面に位置させてこれをＮｏｔｌフラグメントとして単離することが可能であるが、このＮｏｔｌフラグメントは、適切な植物調節配列に関してセンス配向に導入され得る。また、最初のコドンｒＡＴＧＪから出発するコーディング配列を正確に除去することを可能にするＮｃｏｌ　（５’　−ＣＣＡＴＧＧ−３°）または５ｐｈＩ　（５’　−ＧＣＡＴＧＣ−３ ’　）のための部位を、本発明のフラグメント（類）の中に遺伝工学で入れることが可能である。例えば、ｐＣＦ３由来のデルタ−１５デサチユラーゼのコーディング配列を用いる場合、配列同定番号１の位置４４．４５および４９にあるヌクレオチドをそれぞれＧ、ＣおよびＣで置き換えることによってｓｐｈ　１部位の遺伝工学処理を行うことが可能である。

アンチセンスＲＮＡを用いた植物標的遺伝子の阻害組織に特異的な様式で植物標的遺伝子を阻害する目的でアンチセンスＲＮＡが用いられている（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（＋９８８）　６：９５８−９７６参照）、ｃＤＮＡ配列全体（Ｓｈｅｅｈｙ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳ＾（１９８８）　８５：８８０５−８８０９）並びに部分的ｃＤＮＡ配列（Ｃａｎｎｏｎ他、ＰＩａｎｔ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　（１９９０）　１５：３９−４７）を用いたアンチセンス阻害が示されている。３°非コーディング配列（Ｃｈ’　ｎｇ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌ］Ｓ＾（＋９８９）　８６：１０００６−１００１０）　、並びにｉ、、８７ｋｂのｃＤＮＡの５′　コーディング配列のフラグメント（４１個の塩基対の如き少ない数で塩基対を含んている）　（Ｃａｎｎｏｎ他、Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　（１９９０）　１５３９−４７）がアンチセンス阻害で重要な役割を果し得るとの証拠も存在している。

これらのグリセロリピッドデサチュラーゼ類のアンチセンス阻害を用いるには、その標的植物が有する標的組織内で発現する１種以上のグリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子のための転写された配列を単離する必要がある。最も高度に発現する遺伝子がアンチセンス阻害に最良の標的である。これらの遺伝子は、本分野の技術者に知られている技術、例えばｍＲＮＡレベルまたは咳ランオフ転写の定量分析などによってそれらの転写レベルを決定することにより同定され得る。

例えば、多不飽和脂肪酸を変化したレベルでもたらすブラシカ、ナブスにおけるデルタ−１５デサチユラーゼのアンチセンス阻害は、ｐＢＮＳＦ３−２内に見られる全体もしくは部分ｃＤＮＡからアンチセンスＲＮＡを発現させることによって達成され得る。

共抑制による植物標的遺伝子の阻害組織に特異的な様式で植物標的遺伝子を阻害する目的でまた共抑制現象が用いられティる。ｃＤＮＡ配列全体（Ｎａｐｏｌｊ他、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９９０）　２：２７９−２８９：　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ他、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９９０）　２：２９１−２９９）並びに部分的ｃＤＮＡ配列（１７７０ｂｐのｃＤＮＡから７３０ｂｐ）（Ｓｍｉｔｈ池、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（＋９９０）　２２４：４７７−４８１）を用いた内在性遺伝子の共抑制が知られている。

適切ｆｊ調節配列と一緒にグリセロリピントデサチュラーゼ類もしくはそれの一部をコード化する本発明の核酸フラグメントを用いて、グリセロリピッドデサチュラーゼ類のレベルを低くすることで、その導入した核酸フラグメントに本質的相同性を示す内在性遺伝子を含んでいる形質転換した植物における脂肪酸組成を変化させることができる。これに必要とされる実験操作は、そのグリセロリピッドデサチュラーゼ核酸フラグメントの過剰発現に関して上述したのと同様である。例えば、多不飽和脂肪酸を変化したレベルでもたらすブラシカ・センスにおけるデルタ−１５デサチユラーゼの共抑制は、ｐＢＮＳＦ３−２内に見られる全体もしくは部分的種子デルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡをセンス配向で発現させることによって達成され得る。

宿主、プロモーターおよびエンハンサ−の選択本発明の核酸フラグメントを発現させるに好適な種類の非相同宿主は、真核生物宿主、特に高等植物の細胞である。これらの高等植物の中で特に好適なものは、油産生種、例えばダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）　）　、ナタネ（ブラシカ・センス、Ｂ、カムペストリス（Ｂ、　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）を含む）、ヒマワリ（へりアンラス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｓ）　）　、綿（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）　）　、）ウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）　）　、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）　）　、ベニバナ（カルタムス・チンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）　）　、アブラヤシ（エラエイス・グイネエンシス（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）　）　、ココヤシ（ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ　ｎｕｃｉｆｅｒａ）　）　、亜麻（リヌム・ウシタチシムム（Ｌｉｎｕｍ　ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）　）およびビーナツツ（アラキス・ヒポガエア（＾ｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ）　）などである。

植物内の発現では上記植物内で機能を果す調節配列を用いる。植物内における外来遺伝子の発現は充分に確立されている（Ｄｅ　Ｂｌａｅｒｅ他、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９８７）　１５３：２７７−２９１）　、本発明のフラグメントを発現させる目的で選択するプロモーターの給源は決定的でないが、そのグリセロリピッドデサチュラーゼ類のための翻訳可能ｍＲＮＡのレベルを所望宿主組織内でそれぞれ上昇もしくは低下させることで本発明を達成するに充分な転写活性を示すことを条件としている。好適なプロモーターには、（ａ）植物の強力な構成プロモーター類、例えばカリフラワーのモザイクウィルス内の１９Ｓおよび３５８転写物を支配しているプロモーター類（Ｏｄｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１３：８１０−８１２　：　Ｒｕ１ｌ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９８７）８６　：４８２−４９３）および（ｂ）組織に特異的が或は発生に特異的なプロモーター類などが含まれる。組織に特異的なプロモーターの例は、リブロース１，５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小型サブユニットの光誘発性プロモーター（光合成を示す組織内で発現させることが望まれている場合）、トウモロコシのゼイン蛋白質プロモーター（Ｍａｔｚｋｅ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８４）　３：１５２５−１５３２）およびりｏｏフィルａ　／　Ｂ結合蛋白質プロモーター（Ｌａｍｐａ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　３１６：７５０−７５２）などである。

特に好適なプロモーター類は種子に特異的な発現を可能にするプロモーター類である。種子が植物油の主要源であることがら、そしてまた、種子に特異的な発現では種子以外の組織内に起こり得る何らかの有害な影響が避けられることから、上記が特に有効である。種子に特異的なプロモーターの例には、これに限定されるものではないが、種子貯蔵蛋白質のプロモーターが含まれ、これは、数多くの植物における全種子蛋白質の９０％に及び得る。種子貯蔵蛋白質は厳格に調節されており、高度に組織に特異的な様式および段階に特異的な様式でほとんど排他的に種子内で発現が生じる（Ｈｉｇｇｉｎｓ他、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９８４）　３５：１９１−２２１：　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　５６：１４９−１６０）　、更に、種子貯蔵蛋白質が異なると、種子発生の異なる段階で発現が生じ得る。

種子に特異的な遺伝子発現は非常に詳細に研究されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　５６：１４９−１６０およびＨｉｇｇｉｎｓ他、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９８４）　３５：１９１−２２１の論評を参照）。現在、形質転換した双子葉植物内で種子貯蔵蛋白質遺伝子を種子に特異的に発現させる例が数多く存在している。これらには、豆のｂ−ファセオリン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌ、ａｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８５）　８２：３３２０−３３２４；　Ｈｏｆｆｍａｎ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８８）　１１ニア１７−７２９）　、豆のレクチン（Ｖｏｅｌｋｅｒ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８７）　６：３５７１−３５７７）　、ダイズのレクチン（Ｏｋａｍｕｒｏ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾（ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾（１９８６）　８３：８２４０−８２４４）　、ダイズのＫｕｎｉｔｚ　）リプシン阻害剤（Ｐｒｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：０９５−１１０９）　、ダイズのｂ−Ｄ：／グリシン（Ｂｅａｃｈｙ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８５）　４：３０４７− ３０５３）　、豆のビンリン（Ｈｉｇｇｉｎｓ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　（１９８８）　１１：６８３−６９５）　、豆のコンピッリン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎ他、Ｐｌａｎｔａ　（１９９０）　１８０：４６１−４７０）　、豆のレグミン（Ｓｈｉｒｓａｔ他、Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８９）　２１５：３２６−３３１）　、ナタネのナピ：／　（Ｒａｄｋｅ他、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９８８）　７５：６８５−６９４）　、のための双子葉植物由来遺伝子、並びに単子葉植物由来の遺伝子、例えばトウモロコシの１５ｋＤゼイン（Ｈｏｆｆｍａｎ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８７）　６：３２１３−３２２１）、トウモロコンの１８ｋＤオレオシン（Ｌｅｅ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄＳｃｉ、　ＵＳＡ（１９９１）　８８８：６１８１−６１８５）　、オオムギのｂ−ホルデイン（ＭａｒｒｉＳ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８８）　ＩＯ：３５９−３６６）およびコムギのグルテニン（Ｃｏｌｏｔ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８７）　６：３５５９− ３５６４）のための遺伝子が含まれる。更に、キメラ遺伝子構築物における、非相同コーディング配列に使用可能な様式で連結させた種子に特異的な遺伝子のプロモーター類もまた、形質転換した植物の中でそれらが示す一時的および空間的発現パターンを維持している。このような例には、アラビドプシスおよびＢ、センス種子内でエンケファリンペプチド類を発現させるためのアラビドプシス・クリアナ２８種子貯蔵蛋白質遺伝子プロモーターの使用（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８９）　７：９２９−９３２）　、ルシフェラーゼを発現させるための豆レクチンおよび豆ｐ−ファセオリンプロモーター類の使用（Ｒｉｇｇｓ他、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　（１９８９）　６３：４７−５７）、並びにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現させるためのコムギグルテニンプロモーター類の使用（Ｃｏｌｏｔ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８７）　６：３５５９−３５６４）などが含まれる。

本発明の核酸フラグメントを発現させるに特別な使用は、いくつかのダイズ種子貯蔵蛋白質遺伝子、例えばＫｕｎｉｔＺ　トリプシン阻害剤（Ｊｏｆｕｋｕ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：１０７９−１０９３）　、グリシニン（Ｎｉｅｌｓｏｎ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：３１３−３２８）およびｂ−コングリシニン（Ｈａｒａｄａ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：４１５−４２５）のための遺伝子がら得られる非相同プロモーター類である。形質転換した植物における種子発生の中間から最終段階における子葉内のｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ発現では、クイズ８−コングリシニン貯蔵蛋白質のａ−およびｂ−サブユニットのための遺伝子のプロモーター類が特に有効である（Ｂｅａｃｈｙ他、ＥＭＢＯＪ、　（１９８５）　４：３０４７ −３０５３）。これは、形質転換した種子におけるそれらの発現に対する位置の効果がほとんどないことと、これらの２つのプロモーターが異なる一時的調節を示すことが理由である。ａ−サブユニット遺伝子のためのプロモーターは、そのｂ−サブユニット遺伝子のためのプロモーターが発現する数日前に発現する。これは、種子貯蔵蛋白質合成の約１週間前に油生合成が始まるナタネを形質転換するにとって重要である（Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９８９）　１３５：６３−６９）。

特別な使用はまた、初期胚形成および油生合成が行われている間に発現する遺伝子のプロモーターである。本発明の核酸フラグメントを発現するグリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子が有する、未変性のプロモーター類を含む未変性調節配列を、本分野の技術者が単離した後、それらを用いることができる。種子油生合成に伴う他の遺伝子、例えばＢ。

センスのイソサイトレートリアーゼおよびマレートシンターゼ（Ｃｏｍａｉ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：２９３−３００）　、ベニバナ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９９１）　８８：２５７８−２５８２）およびヒフ　（Ｓｈａｎｋｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９９１）　８８：２５１０−２５１４）由来のデルタ−９デサチユラーゼ、アラビドプシス（Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８９）　１７：１７７７）　、Ｂ、ナプス（Ｓａｆｆｏｒｄ他、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８８）　１７４：２８７−２９５）およびＢ、カムペストリス（Ｂ、　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｒｏｓｅ他、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８７）　１５ニア１９７）由来のアシル担体蛋白ｉｔ　（ＡＣＰ）　、オオムギ由来のｂ−ケトアシル−ＡＣＰシンセターゼ（Ｓｉｇｇａａｒｄ−＾ｎｄｅｒｓｅｎ他、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９９１）　８８：４１１４−４１１８）およびゼアーフイズ（Ｌｅｅ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９９１）８８：６１８１−６１８５）　、ダイス（にｅ１ｂａｎｋ取得番号：　Ｘ６０７７３）およびＢ　ナプス（Ｌｅｅ他、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９９１）　９６：１３９５−１３９７）由来のオレオシンのための遺伝子から得られる非相同プロモーター類も有用である。これらの相当する遺伝子の配列が開示されていないか、或はそれらに含まれているプロモーター領域が同定されていない場合、本分野の技術者は、その公開された配列を用いて、その相当する遺伝子およびそのプロモーターが含まれているそれらのフラグメントを単離することができる。比較的豊富なエノイル−ＡＣＰレダクターゼおよびアセチル−ＣｏＡカルボキンラーゼに関する部分的蛋白質配列もまた公開されており（Ｓｌａｂａｓ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　（１９８７）　８７７：２７１ −２８０；　Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ他、Ｂｉ。

ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　（１９８８）　９５４：２０１−２０７）　、本分野の技術者はこれらの配列を用いて、これらのプロモーターと一緒にその相当する種子遺伝子を単離することができる。同様に、グリセロリピッドデサチュラーゼ類をコード化する本発明のフラグメントを用いて、発現するキメラ遺伝子内で用いる目的で、その相当する遺伝子のプロモーター領域を得ることができる。

本発明の核酸フラグメントの発現を適当なレベルで達成するには、異なるプロモーターが利用されている異なるキメラ遺伝子を用いる必要があり得る。上記キメラ遺伝子を、単一の発現ベクターの中に入れて一緒にか或は２種以上のベクターを用いて逐次的に宿主細胞の中に転移させることが可能である。

本発明を達成する目的で、本発明の未変性もしくはキメラどちらかの核酸フラグメントのプロモーター領域の中にエンハンサ−またはエンハンサ一様成分を導入する結果として発現を向上させることが考えられる。

コ、ｉｌｌ：ｌ；ｉ、３５Ｓプロモーターの中に見られる如きウィルスのエンハンサ−（Ｏｄｅｌｌ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８８）　１０：２６３−２７２）　、オビン（ｏｐｉｎｅ）遺伝子由来のエンハンサ−（Ｆｒｏｍｍ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：９７７−９８４）、或は本発明の核酸フラグメントに使用可能様式で連結させたプロモーターの中に入れたとき転写の増大をもたらす他の何らかの給源由来のエンハンサ−類が含まれる。

特に重要なものは、構成プロモーターに４０倍の種子特異的増強を与え得るｂ− コングリシニンのａ−サブユニットのための遺伝子から単離されるＤＮＡ配列成分である（Ｃｈｅｎ他、Ｄｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８９）　ＬＯ：１１２ −１２２）。本分野の技術者は容易にこの成分を単離して、何らかの遺伝子のプロモーター領域内に挿入することで、形質転換した植物内でそのプロモーターを用いて種子に特異的な増強発現を得ることができる。このｂ−コングリシニン遺伝子とは異なる時期に発現する種子に特異的な遺伝子いずれかの中に上記成分を挿入すると、形質転換した植物内で種子発生している間のより長い期間に渡って発現が生じるであろう。

本発明はまた、所望の最終目的を達成する他の種々の方法で達成され得る。１つの形態において、本発明は、本発明の核酸フラグメントを含んでいる外来遺伝子のコピーを２個以上導入して、グリセロリピッドデサチュラーゼを増大したレベルで産生ずるように植物を修飾することを基にしている。ある場合には、多不飽和脂肪酸を所望レベルにする目的で、グリセロリピッドデサチュラーゼのための外来遺伝子を２種以上導入する必要がある。

ポリアデニル化シグナル並びに本発明の核酸フラグメントを適当に発現させるに必要とされ得る他の調節配列を与え得る何らかの３°非コーデイング領域を用いて本発明を達成することができる。これには、未変性グリセロリピッドデサチュラーゼ（類）、ウィルスの遺伝子、例えば３５Ｓまたは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写物由来のウィルス遺伝子、オピン合成遺伝子由来のウィルス遺伝子、リブロース１．５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ、またはクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質などの３゛末端が含まれる。異なる３゛非コーデイング領域の有効性を教示している例は本技術に数多く存在している。

形質転換方法本分野の技術者は、本発明に従う高等植物細胞の形質転換を行う種々の方法を利用することが可能である（ヨーロッパ特許出願公開筒０２９５９５９　Ａ２号および０３１８３４１　Ａｔ号参照）。上記方法には、アグロバクテリウム種のＴｉおよびＲｉプラスミドが利用されている形質転換ベクターを基とする方法が含まれる。バイナリ−型の上記ベクター類を用いるのが特に好適である。Ｔｉ誘導ベクター類は、単子葉および双子葉植物を含む幅広い種類の高等植物の形質転換を生じさせる（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ他、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８７）　８：２０９−２１６：　Ｐｏｒｔｒｙｋｕｓ、　Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１X ８５）　１９９：１８３）。本分野の技術者は、他の形質転換方法、例えば外来ＤＮＡ構築物の直接吸収（ヨーロッパ特許出願公開筒０２９５９５９＾２号参照）、エレクトロポレーション技術（Ｆｒｏｍｍ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１９ニア９１）または核酸構築物をコートした金属粒子を用いた高速弾道衝撃（Ｋｌｉｎｅ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２７：７０）などを利用することができる。形質転換を行った後、本分野の技術者はその細胞を再生させることができる。

特に適切なものは、商業的に重要な作物、例えばナタネ（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ他、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９８９）　９１：６９４−７０１）　、ヒマワリ（Ｅｖｅｒｅｔｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８７）　５：１２０１）およびダイス（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＩＪｓＡ　（１９８９）　８６：７５００−７５０４）などの中に外来遺伝子を形質転換する、最近記述された方法である。

ＲＦＬＰ技術への応用植物育種における制限フラグメント長さ冬型性（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）マーカーの使用は本技術分野で充分に示されている（Ｔａｎｋｓｌｅｙ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｙ　（１９８９）　７：２５７−２６４）。本発明の核酸フラグメントは、グリセロリピッドデサチュラーゼの発現と組み合わされた特性のためのＲＦ　Ｌ　Ｐマーカーとして用いられ得る。これらの特性には、不飽和脂肪酸のレベルを変化させることが含まれる。本発明の核酸フラグメントはまた、変化したレベルで不飽和脂肪酸を有する変化した（変異を含む）植物からグリセロリピッドデサチュラーゼ遺伝子を単離する目的で用いられ得る。これらの遺伝子の配列決定を行うことにより、その変化を引き起こす、その正常な遺伝子とは異なるヌクレオチドが確認される。これらの相違の回りで設計した短いオリゴヌクレオチド類をその多不飽和物の変化を追跡するハイブリッド形成プローブとして用いることができる。その変化と組み合わされた差を基とするオリゴヌクレオチドは、これらの変異油清性を生じさせる時の分子マーカーとして用いられ得る。

実施例以下に示す実施例の中で本発明を更に明確に示し、ここで、特に明記されていない限り、全ての部およびパーセントは重量であり、そして度は摂氏度である。これらの実施例は、本発明の好適な態様を示すものであり、説明の目的でのみ示すものであると理解されるべきである。上記考察およびこれらの実施例から、本分野の技術者は本発明の必須的特徴を確かめることができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途および条件に適合させる目的で本発明の種々の変化および修飾を行うことが可能である。本明細書で言及する特許および特許以外の文献を含む全ての出版物は特に引用することによって本明細書に組み入れられる。

実施例１アラビドプシス・グリアナ変異体系統３７ｏ７内のＴ−ＤＮＡ挿入部位に接するゲノムＤＮＡの単離低いリルイン酸含有量を有するアラビドプシス・グリアナＴ−ＤＮＡ変異体の同定アグロバクテリウム・ツムファシェンスのＴ−ＤＮＡを含んでいるアラビドプシス・グリアナ（地方に特徴的な品種ｆａｓｓｈｉｌｅｗｓｋｉｊａ）形質転換体の個体群を、Ｆｅｌｄｍａｎｎ他（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８７）　２０８：１−９）に記述されている如き種子形質転換で生じさせた。この個体群において、これらの形質転換体は、ｐＢＲ３２２細菌ベクター、ツバリンシンターゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩ１１カナマイシン耐性を与える）およびｂ−ラクタマーゼ（アンピシリン耐性を与える）をコード化するＤＮＡ配列をそのＴ−ＤＮＡ境界配列内に含んでいる。

個々の形質転換体が有するクロモソームの異なる領域の中にそのＴ−ＤＮＡを組み込むことによって、その挿入部位の所か或はその近（で植物遺伝子機能の崩壊を引き起こすこと力呵能であり、そしてこの表現型に関してその個体群をスクリーニングすることにより、この遺伝子機能の損失に関連した表現型を分析することができる。

Ｆｅｌｄｍａｎｎ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４３：１３５１−１３５４）に記述されている如き自己受精を２回行うことにより、アグロバクテリウム・ツメファシェンスで処理した野生型種子がら１３種子を生じさせた。これらの子孫はＴ−ＤＮＡ挿入に関して分離を生じ、従ってこの挿入の結果として生じる何らかの変異に関して分離を生じる。６０００個の系統の各々が有する約１００個の種子を一緒にし、そしてそのプールした６０００個のサンプルの各々が有する脂肪酸含有量を、ｂｒｏｗｓｅ他（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）１５２：１４１−１４５）に本質的に記述されている如くその脂肪アシルメチルエステルをガスクロで測定したが、但しここでは、メタノール中２．５％のＨ２ＳＯ，をメチル化剤として用いそしてサンプルを８０’Ｃで１．５時間加熱してその種子のトリグリセライド類のメタノール分解を生じさせた。ｒ３７０７Ｊと表示する系統は、その個体群全体が示すそれに比較して変化した脂肪酸プロファイルを与える種子を産生じた。系統３７０７が産生する個々の１３種子からＴ３植物を成育させ、そしてホモ接合野生型、ホモ接合変異体または変異に関してヘテロ接合体である個々の植物に関して自己受精させることにより、Ｔ４種子を生じさせた。その個体群全体、そのプールした３７０７１３種子、およびホモ接合Ｔ４変異体である分離体の、代表的サブサンプルが示す脂肪酸組成パーセントを表４に示す。

バルミチン酸　７．４（０，３７）　７．０　６．４ステアリン酸　３．０（０，２２）　２．９　３．０オレイン酸　１７．０（１，５）　１７．７　１５．９リノール酸　２９．３（０，７８）　３５．０　４２．４リルイン酸　１．６．１（１，１）　１０．２　３．１エイコセン酸　２０．２（０，７３）　２０．５　２３．６系統３７０７の分離Ｔ３プールの表現型（高リノール酸、低すルイン酸）は、その個体群サブサンプルのそれとホモ接合Ｔ４変異体種子のそれとの中間であり、このことは、その種子内でリノール酸がリルイン酸に変化するのを調節している座に系統３７０７が変異を有していることを示唆している。系統３７０７における変異体表現型がＴ−ＤＮＡ挿入の結果であるか否かはまだ明らかでなかった。従って、出願者らは、分離Ｔ４個体群を検査することで、そのＴ −ＤＮＡ挿入断片がコード化するツバリンシンターゼ活性およびカナマイシン耐性と一緒にその変異体脂肪酸表現型が共分離するか否かを測定した。２６３個のＴ４植植物体を成育させ、そして葉抽出液内にツバリンが存在しているか否かを分析した（Ｅｒｒａｍｐａｌｌｉ他、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９９１）　３：１４９−１５７）、加うるに、これらのＴ４植物の各々から１５種子を採取し、モして１０−５０個の種子から成るサンプルを取り出して、その種子の脂肪酸組成を測定すると共に、カナマイシン存在下でそれらが発芽し得るか否かを測定した（Ｆｅｌｄｍａｎｎ他、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３＋１３５１−１３５４）　、これらの２６３個の植物は表５の如き３つの分類に入る。

表５個体数　表現型６３　Ｔ４植物：はとんどか全くツバリンが存在していない、１５種子：野生型脂肪酸組成、全部がカナマイシンに感受性を示す１．３４　Ｔ４植物・ツバリンが存在している、１５種子　３７０７　Ｔ３プールと同様なヘテロ接合脂肪酸組成、カナマイシン耐性に関して分離する６４　Ｔ４植物、ツバリンが存在している、１５種子：ホモ接合変異体脂肪酸組成、全部がカナマイシン耐性を示すＴ−ＤＮＡ配列によって与えられる表現型と一緒にその脂肪酸表現型が約１：２：１のパターンで共分離することは、系統３７０７における変異がＴ−ＤＮＡ挿入の結果であるとの強力な証拠を与えていた。次に、Ｔ−ＤＮＡ配列を含んでいるプローブを用いて系統３７０７からＴ−ＤＮＡ挿入断片およびフランキングゲノムＤＮＡをクローン化する計画でさらなる実験を実施した。

ホモ接合３７０７植物からのゲノムＤＮＡ製造アラビドプシス・グリアナ（地方に特徴的な品種Ｗａｓｓｈｉｌｅｗｓｋｉｊａ　（ＷＳ））から誘導されるホモ接合系統から得られる種子を、５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム（重量／体積）１０．１５％のＴｗｅｅｎ　２０　（体積／体積）から成る溶液中室温で５分間表面殺菌した後、無菌蒸留水内で数回洗浄した後、最後に５０％エタノールで濯いだ。このエタノール洗浄を行った後直ちに、これらの種子を無菌濾紙に移して乾燥させた。次に、１から３個の種子を、無菌Ｇａｍｂｏｒｇｓ　Ｂ５培地（Ｇｉｂｃｏ、５００−１１５３ＥＡ）　（ｐＨ６，０）が５０ｍＬ入っている２５０ｍＬフラスコに移した。７０μＥ・７ｍ−２・秒刊の連続光で約３週間２２ °Ｃで培養物のインキュベーションを行った後、その根組織を収穫し、１０ｇづつの一定分量にしく湿潤重量）、凍結乾燥した後、−２０°Ｃで貯蔵した。

５ｈａｒｅ他（Ｃｅｌｌ　（１９８３）　３５：２２５−２３３）の操作の変形を用いて、この根組織からゲノムＤＮＡを単離した。乳鉢と乳棒を用いて、その凍結乾燥した組織の一定分量の２つを粉砕して細かい粉末にした。この粉砕した組織を、８５ｍＬの溶菌緩衝液（７Ｍの尿素、０．３５ＭのＮａＣＩ、０．０５ＭのトＩＪス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，０，０２ＭのＥＤＴＡ、１％の５ａｒｋｏｓｙｌ、５％のフェノール）が入っているフラスコに加えた後ガラス棒で穏やかに混合することで均一な懸濁液が得られた。この懸濁液に等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４　：　１）（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡで平衡にした）を加えた。１０％のＳＤＳを８．５ｍＬ加えた後、この混合物を室温で１５分間、回転しているプラットフォーム上で渦巻き撹拌した。２０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、その上方の水相を取り出して新しい試験管に移し、そしてＳＤＳを加えない以外は上と同様にして更に２回抽出を行った。この最終的水相に１／２ｏ体積の３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５，５）を加えた後、その体積の２倍量の水冷１００％エタノールを加えた。

−２０℃で１時間インキュベートすることでそのＤＮＡが沈澱シ易＜シタ後、１２，０００ｘｇで１ｏ分間遠心分離した。その得られるペレットを、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡがら成る３ｍＬの中に再懸濁させ、これに、溶液１ｍＬ当たり０．９５ｇの塩化セシウム（ＣｓＣＩ）および２１．１＋Ｌの１０ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウム（Ｅ　ｔ　Ｂ　ｒ）を加えた。次に、ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒの密度勾配中１５℃で１６時間平衡になるまで２６５．０００ｘｇで遠心分離することによって、このＤＮＡを精製した。この勾配からそのＤＮＡを取り出した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡ）とＣｓＣＩを飽和させたイソプロパツールで抽出することによってＥｔＢｒを除去した後、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡに対して一晩４℃で透析することによってＣｓＣｌを除去した。透析からこのＤＮＡを取り出し、そしてｌ１ｏｅｃｈｓｔ蛍光測定アツセイを用いてその濃度を測定したが、ここでは、ＬＸ　ＳＳＣ（０，１５ＭのＮａＣｌ、０゜０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）（ｐＨ７，０）中１．５Ｘ１０−６Ｍのビス−ベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８、Ｓｉｇａ）の３ｍＬに一定分量のＤＮＡを加え、室温で５分間インキュベートした後、公知セットのＤＮＡ標準に対するフルオロメーターの読みを励起３６０、発光４５０で行った。

プラスミドの回収および分析上述した如く製造したホモ接合３７０７変異体から得られるゲノムＤＮＡの５ミクログラムを、製造業者の仕様に従い、５０μＬの反応体積中２０単位のＢａｍＨＩまたは５ａｉｌ制限酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）で消化させた。消化後、緩衝液を飽和させたフェノール（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でそのＤＮＡを抽出した後・エタノール中で沈澱させた。その得られるペレットを最終体積が１０μＬの１０ｍＭトリス、ｐＨ８の中に再懸濁させた後、上述した如きＨｏｅｃｈｓｔ蛍光測定アッセイを用いてそのＤＮＡ濃度を測定した。

末端と末端との結合とは対照的に、円形化を容易にする目的で、５００μＬの反応体積の中に２５０ｎｇのＢａｍＨＩもしくは５ａｉｌ消化ゲノムＤＮＡ、３Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　、５０ｐＬのＩＯＸリカーセ緩衝液（３０ｍＭのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，８，１００ｍＭのＭｇＣ１ □、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ）および５μＬの１００ｍＭＡＴＰが入っている希釈連結反応をセットアツプした。この反応物を１６°Ｃて１６時間インキュベートし、７０°Ｃで１０分間加熱した後、緩衝液を飽和させたフェノール（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）で一度抽出した。次に、２倍量の１００％エタノールと１／１０体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加えることでそのＤＮＡを沈澱させた。その得られるペレットを最終体積が１ｏルの１０ｍＭトリス、ｐＨ８の中に再懸濁させた後、上述した如きＨｏｅｃｈｓｔ蛍光測定アッセイを用いてそのＤＮＡ８度を測定した。

製造業者の仕様に従い、１００μＬの細胞当たり１０ｎｇのＤＮＡ濃度で、連結させたＤＮＡの５０ｎｇを受容能のあるＤＨＩＯＢ細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に移入した。５ａｉｌもしくはＢａｍＨ■消化物から得られる形質転換体を、それぞれ１００１１ｇ／ｍＬのアンピシリンまたは２５℃１ｇ／ｍＬのカナマイシンスルフェートが入っているＬＢプレート（１リツトル当たり１０ｇのＢａｃｔｏ−トリプトン、５ｇのＢａｃｔｏ− 酵母菌抽出液、５ｇのＮａＣｌ、１５ｇの寒天、ｐＨ７，４）の上で選択した。

−次形質転換体を取り上げた後、それらを最初にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬ含んでいるＬＢプレートに突き刺し続いてカナマイシンを２５μｇ／ｍＬ含んでいるＬＢプレートに突き刺すことによって、アンピノリン耐性（Ａｍｐ’：アンビシリン感受性、Ａｍ　ｐ’）ＳａｌＩ形質転換体をカナマイシン耐性（Ｋａｎ’；カナマイシン感受性、Ｋａｎ’）遺伝子の存在に関してスクリーニングした。３７℃で一晩インキユベートした後、これらのプレートをＡｍｐ’／Ｋａｎ “コロニーに関して評価した。−次形質転換体を取り上げた後、それらを最初にカナマイシンを２５μｇ／ｍＬ含んでいるＬＢプレートに突き刺し続いてアンピノリンを１００μｇ／ｍＬ含んでいるＬＢプレートに突き刺すことによって、カナマイノン耐性を示すＢａｍＨＩ形質転換体をアンピッリン耐性遺伝子の存在に関してスクリーニングした。３７℃で一晩インキユベートした後、これらのプレートをＫａｎ’／Ａｍｐ’コロニーに関して評価した。

１１００１Ｉ／ｍＬのアンピシリンと一緒に２００ｕＬのＬＢブロス（１リツトル当たりＬｏｇのＢａｃｔｏ　−トリプトン、５ｇのＢａｃｔｏ−酵母菌抽出液、５ｇのＮａＣ１）が入っている深ウェルのミクロタイタープレートノ中ニ直接１９２個のＡｍｐ’／Ｋａｎ’Ｓａ　ｌ　Ｉ形質転換体と８５個のＫａｎ’／Ａｍｐ’ＢａｍＨＩ形質転換体を入れることで培養物を作成した。５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｍｉｎｉｆｏｌｄ　Ｔ装置およびＮｙｔｒａｎ膜を用い、下記の条件を用いて二重にドツトプロットをセットアツプした＝５０μＬの培を物を１５０μＬの５ｘ　ｓｓｃの中に希釈し、この培養物を溶解させた後、０．５ＭのＮａＯＨ，１，５ＭのＮａＣ１溶液を１５０ｕＬ加えて室温で３分間そのＤＮＡを変性させ、そのフィルターをその装置カラ取り出し、０．５Ｍ（７）トリス、ｐＨ８，１，５ＭのＮａＣｌで中和し、そして続いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　５ｔｒａｔａｌｊｎｋｅｒを用いてこのＤＮＡをそのフィルターにＵＶ架橋させた後、これらのフィルターを８０℃で２時間加熱し、室温で貯蔵した。

これらの回収したプラスミドいずれかの中にＴ−ＤＮＡが含まれているか否かを測定する目的で、Ｔ−ＤＮＡの右側境界および左側境界部分をプローブとして用いてそのドツトプロットを試験した。この右側境界プローブは、プラスミドＨ２３ｐＫＣ７から得られるＤＮＡの２，２ｋｂ　Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｄｒａ　Ｉフラグメントから成っており［プラスミドベクターｐ　Ｋ　Ｃ７（Ｍａｎｉａｔｉｓ他「分子クローニング、実験室マニュアルＪ　、（１９８２）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）にクローン化したＴｉプラスミドｐ　Ｔ　ｉ　Ｃ５８（Ｌｅｍｍｅｒｓ他、Ｊ、　Ｍｏ］、Ｂｉｏｌ、（１９８９）１４４　：３５３−３７６）から得られる３、２ｋｂのＨｉｎｄｌ［Ｉ　２３７ラグメントで構成されており］、そしてこの左側境界プローブは、プラスミド）（ＩＱｐＫｃ７から得られる２、９ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲ１フラグメントから成うでおり［プラスミドベクターｐ　Ｋ　Ｃ７（Ｍａｎｉａｔｉｓ他「分子クローニング、実験室マニュアルＪ　、（１９８２）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１．ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）にクローン化したＴｉプラスミドｐＴｉｃ５８（ＬｅＩＩＩＩＩｌｅｒｓ他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８９）　１４４：３５３ −３７６）から得られる６゜５ｋｂのＨｉｎｄｌＩＴ　１０フラグメントで構成されており］、ここでは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されている標準的な消化、電気泳動法および電気溶離条件を用いた。製造業者の仕様を用い、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）にその溶離させたＤＮＡを通すことによって、最終的なりＮＡ精製物を得た。上述した如きｌｌ。

ｅｃｈｓｔ蛍光測定アッセイを用いてそのＤＮＡ６度を測定した。製造業者が推奨する条件下、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ！ｌ！Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒ１ａ＋ｉｎｇＫｉｔを用いて、各プローブの約１１００ｎをａ　［”Ｐ］　ｄＣＴＰで標識した。Ｓａｎ＋ｂｒｏｏｋ他［分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されている標準条件下、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５スパンカラムにその反応物を通すことにより、取り込まれなかったａ　［３２Ｐ］　ｄＣＴＰから標識プローブを分離した。

６Ｘ　５ＳＣ１ＩＯＸデンハルト溶液、１％ＳＤＳ、および１００ｇｇ／ｍＬの変性ウシ胸腺ＤＮＡから成る緩衝液１５０ｍＬ内で１６時間、そのフィルターを４２℃で前ハイブリッド形成させた。６Ｘ　５ＳＣ１１％ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェート、および５０μｇ　／　ｍ　Ｌの変性ウノ胸腺ＤＮＡから成るハイブリッド形成緩衝液の５０ｍＬにこれらのフィルターを移した後のその前ハイブリッド形成したフィルターに、その変性させ精製し標識したプローブを加えた。そのプローブの存在下６５℃で１６時間そのフィルターをインキュベーションした後、これらのフィルターを、６Ｘ　ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳの１５０ｍＬ内で２回、１ｘ　ＳＳＣ，１％ＳＤＳ内で２回、そしてＯ，ＬＸ　ＳＳＣ，１％ＳＤＳ内で１回、全て６５℃で洗浄した。これらの洗浄したフィルターを、８０°Ｃで一晩、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−２フイルム使用オートラジオグラフイーにかけた。

８５個のＢａｍＨＩ候補体の中で、６３個がその左側境界プローブにハイブリッド形成したが、その右側境界プローブにハイブリツド形成するものは全く存在していなかった。１９２個の５ａｌｌ候補体の中で、３１個がその左側境界プローブにハイブリッド形成し、４個がその右側境界プローブにハイブリッド形成したが、両方のプローブにノ＼イブ１ルソド形成するものは全く存在していなかった。ＢａｍＨ１候補体の１２個、即ち陽性の７個と陰性の５個を、Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａの左側境界の存在に関して更に制限消化分析した。

これらのＢａｍＨ１候補体由来のＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されているのと同様な、Ｂｉｒｍｂｉｏｍ他のアルカリ性溶菌ミニ製造操作（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　（１９７９）　７：１５１３−１５２３）で作り出した。このプラスミドＤＮＡを、製造業者の仕様に従い、ＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）て消化させた後、ＬＸ　ＴＨＥ緩衝液（０，０８９Ｍのトリス−ボレート、０．０８９Ｍのホウ酸、０．００２ＭのＥＤＴＡ）中０．８％のアガロースゲルを通す電気泳動にかけた。このＴ −ＤＮＡの左側境界プローブにハイブリッド形成するＢａｍＨＩ候補体の全てが同じＥｃｏＲ）制限パターンを示し、このことは、これらのクローンの中に１４．２ｋｂのＴ−ＤＮＡと１．　４ｋｂの推定植物ゲノムＤＮＡが存在していることを示していた。

５ａｌｌ候補体由来のＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよび５ａｉｌ酵素を用いた制限分析を行った後、上述したように０．８％のアガロースゲルを通す電気泳動にかけた。このＴ−ＤＮＡの左側境界プローブにハイブリッド形成する５ａｌｌ候補体の全てが２．９ｋｂの推定植物ＤＮＡを含んでいた。この中に含まれている２、９ｋｂのフラグメントは、そのＢａｍＨ１回収プラスミド類に関して見られるのと同様な１．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントであり、このことは、この１．．４ｋｂのフラグメントは２．９ｋｂフラグメントのサブセットであり、そしてこれはその植物ゲノム内にそのＴ−ＤＮＡが挿入された位置でそれの左側境界に隣接していることを示していた。Ｔ−ＤＮＡの左側境界配列に相同性を示すプライマーを用いて１つの５ａｌｌ候補体（ｐｓｉ）の配列決定分析を行った結果、ヌクレオチド６５に続く非Ｔ−ＤＮＡ　（推定植物）配列に及んで、このｐＳｌの配列はそのＴ−ＤＮＡ左側境界の配列（Ｙａｄａｖ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８２）　７９：６３２２−６３２６）に共直線性を示すことが確認された。

回収したプラスミド由来の推定植物ＤＮＡを用いたサザン分析そのＴ−ＤＮＡの左側境界にハイブリッド形成する７つのＢａｍＨＩ候補体由来のＤＮＡをプールし、その一部を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＴ制限エンドヌクレアーゼで消化させた後、ｌＸ　ＴＢＥ緩衝液中０゜８％のアガロースゲル使用電気泳動で分離させた。そのアガロースゲルから１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを切除した後、Ｂｉｏ　１０１製Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎ　Ｋｉｔを用いてその１，４ｋｂフラグメントを精製した。Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用い、この製造業者が推奨する条件下で、その得られるＤＮＡフラグメントの５０ナノグラムにａ　［”Ｐ］　ｄＣＴＰの標識を付けた。

ホモ接合野生型アラビドプシスおよびホモ接合３７０７変異体アラビドプシス植物由来の全ゲノムＤＮＡの３ミクロダラムを、下記の制限酵素：Ｓａｌ　ｌ５Ｈｉｎｄｌ　ｌｌ５ＥｃｏＲＩ、ＣＩａＩおよびＢａｍＨＩの１つを用い、その製造業者が提案する条件下で完全に消化させた。

この消化ＤＮＡに電気泳動を受けさせた後、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されているように、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にサザン転移させた。サザン転移後、５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、その製造業者の指示に従って、これらの膜をＵＶ光に暴露し、空気乾燥させた後、６８℃で２時間加熱した。

１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−０１、ｐＨ７，５，１％のドデシル硫酸ナトリウム、５％のデキストランスルフェート、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ内で一晩、そのフィルターを６５℃で前ハイブリッド形成させた。上で調製し放射能標識した１、４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ植物ＤＮＡフラグメントの５０ナノグラムを、そのサザンプロットが入っている前ハイブリッド形成溶液に加えた後、更に６５℃で一晩インキユベートした。このフィルターを２００ｍＬの２ＸＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中６５°Ｃで１０分間２回、そして２００ｍＬの０．　５％５ＳＰＥ、領　１％ドデンル硫酸ナトリウム中６５℃で１０分間洗浄した。オートラジオグラフィーを用いて、ノλイブリッド形成するフラグメントを検出した。この分析の結果、そのプローブフラグメントは植物ＤＮＡを含んでおり、そしてそのＴ−ＤＮＡ組み込み部位は、野生型アラビドプシスＤＮＡが有する２、８ｋｂのＢａｍＨＩ、５．２ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ、３．５ｋｂの５ａｌＩ、５．５ｋｂのＥｃｏＲＩおよび約９ｋｂのＣ１ａｌフラグメントの中に存在していることが確認された。

野生型アラビドプシス・グリアナ植物（地方に特徴的な品種ＷＳ）から単離したゲノムＤＮＡから作り出したｌＧｅｍ−１１ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、その１．４ｋｂのＥｃｏＲｌ　−Ｂ　ａｍＨＩフラグメント（上を参照）を用いた。このライブラリーを構築する目的で、５ａｕ３Ａ酵素を用いてゲノムＤＮＡを部分消化させた後、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されているのと同様に、塩勾配上で大きさによる分別を行った。次に、この大きさで分別したＤＮＡを、製造業者が概略を示すプロトコルに従い、ＢａｍＨＩ消化させたｌＧｅｍ− １１フアージＤ　Ｎ　Ａ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。ＮＺＹ寒天培地［１リツトル当たり５ｇのＮａＣｌ、２ｇのＮｇＳ０４・７Ｈ２０，５ｇの酵母菌抽出液、１０ｇのＮＺ　Ａｍ１ｎｅ　（ＩＣＮ　ＰｈａｒＩＩｌａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製カゼイン加水分解物Ｌ１５ｇの寒天、ｐＨ７，５１上に■くＷ２５１細胞のローンが含まれている１５０ｍｍペトリ皿５個の上に、約２５．０００プラ一ク生成単位のファージ各々を平板培養した。これらのプラークをナイロン膜（Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）上に吸着させたものを２つ作成した後、製造業者の教示に従い、これらのフィルターを空気乾燥した後、８０℃で２時間のインキュベーションを追加することによってそれの調製を行った。これらのフィルターを６５℃のハイブリッド形成緩衝液（１％のＢＳＡ、０．５ＭのＮａＰｉＳｐＨ７，２、（ＮａＨ，ＰＯ４およびＮａｚＨＰＯ４）　、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび７％の５ＤＳ）内で４時間前ハイブリッド形成させた後、これらを、その変性させた放射能標識プローブ（上を参照）が入っている新鮮な緩衝液に移し、そして６５°Ｃで一晩インキユベートした。これらのフィルターを６５℃のＯ，ＩＸ　ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて各々３０分づつ２回洗浄した後、８０℃で一晩、Ｋｏｄａｋ　ＸＡ−Ｒフィルム使用オートラジオグラフィーにかけた。正にハイブリッド形成するプラーク７個に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されているのと同様なプラーク精製を受けさせた。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓｌ：記述されテイルノト同様ニ、これらの７個のクローン各々から小スケール（５ｍＬ）液状溶解産物を調製し、そしてＫＷ２５１細菌に関するタイターを測定した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに従うがＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＴ　（Ｓｉｇｍａ）の濃度を半分にしそしてＰＥＧ沈澱段階を１６時間に延長した、初期溶解産物を作り出すＣｈｉｓｈｏｌｍ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８９）　７：２ｌ−２３）方法の変形を用いて、ファージＤＮＡを単離した。Ｈｉｎｄｌｌｌ、５ａｌＩおよびＸｈｏｌ酵素を用いた制限分析を基にすると、その元の７個の陽性ファージは、５つの異なる分類に分けられた。この挿入断片の平均サイズは約１５ｋｂであるが、これらのクローンを一緒にするとその長さはゲノムＤＮＡの４０ｋｂの範囲であった。４つの異なる酵素（ＨｉｎｄＩＩ　ＩＳＢａｍＨＩ、ＫｐｎｌおよびＳａ　ｌ　Ｉ）を単独および対にした様式の組み合わせで用いた制限地図作成と、１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩプローブ（上述した如き）およびその１クローンそれら自身から得られる他のプローブを用いたサザン分析とを組み合わせることにより、部分地図が得られ、ここでは、５個のクローン（１１１１１，１４１Ａ１．１４２１１．１４３１１および１４４１１）が全てそのＴ−ＤＮＡ挿入位置近くの約３ｋｂ範囲で相同性を共有していることが確認された。制限分析およびサザン分析により、出願者らは、クローン１１１１．４１Ａ１および４４１１内に存在している５、２ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩフラグメントもまたそのＴ−ＤＮＡ挿入部位の長さに及ぶことを確かめた。このフラグメントをラムダクローン４１Ａ１から切除し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄｌ　ｌ　１部位に挿入し、そしてｐＦｌと表示するその得られるプラスミドを調製した後、欅準プロトコルを用いてそれの単離を行った。次に、このＨｉｎｄｅｌ■フラグメントをプローブとして用いてアラビドプシスｃＤＮＡライブラリーを試験した（以下を参照）。

実施例２アラビドプシス・グリアナ変異体系統３７ｏ７内のＴ−ＤＮＡ挿入部位に接するゲノムＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして用いた、アラビドプシス・クリアナデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡのクローニヱグプラスミドｐＦ１をＨｉｎｄｌｌｌで消化させた後、アガロース使用電気泳動にかけることで、そのプラスミドｐＦ１から得られる５、２ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを精製した後、上述した如く３２Ｐで放射能標識した。アラビドプシスｃＤＮＡライブラリーの製造では、標準プロトコル［Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ］を用い、３日才黄化アラビドプシス（生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ）実生胚軸からポリアデニル化ｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡの５ミクログラムをオリゴｄ　（Ｔ）プライマーと一緒に鋳型として用い、そしてＭｏ１ｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　１．ｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて第一ストランドｃＤＮＡ合成を触媒させた。ＤＮＡリガーゼを除（以外はＧｕｂｌｅｒ他（Ｇｅｎｅ　（１９８３）　２５：２６３−２７２）に従って第二ストランドｃＤＮＡを作り出した。この第二ストランド合成後、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントと反応させることにより、そのｃＤＮＡの両末端を平滑にし、ＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔｌアダプタ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結させた。５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００使用スパンカラムクロマトグラフイーを用いてこれらのｃＤＮＡを精製し、１％の低融点アガロースゲルを用い、大きさで分別した。大きさで選択したｃＤＮＡ　（１−３ｋｂ）を、アガラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてそのゲルから取り出した後、フェノール；クロロホルム抽出およびエタノール沈澱で精製した。このｃＤＮＡの１００ナノグラムを、１ルｇのＩＺＡＰ　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ消化デホスホリル化アームと一緒に共沈澱させた。これらのＤＮＡを４ルの体積で一晩連結させた後、Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄパソケーシング抽出（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いインビトロで、その連結混合物のパッケージングを行った。

上述したのと本質的に同様にそしてＳａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｒａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記述されている如く、放射能標識した５、２ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩフラグメントをプローブとして用い、約８０．０００個のファージを、正にハイブリッド形成するプラークに関してスクリーニングした。

これらのファージプラークのレプリカフィルターを、前ハイブリッド形成段階（６５℃で８時間）を通してＩＭのＮａＣ１，５０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ７，５，１％のＳＤＳ、５％のデキストランスルフェート、０．１ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの中に浸漬した後、プローブを加え、そして同じ温度で１６時間ハイブリッド形成を進行させた。

フィルターを逐次的に２Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用い室温で５時間、そして次に再び新鮮な溶液を用いて１０分間、そして最後に０゜５Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用い６５℃で５分間洗浄した。正にハイブリッド形成するプラーク約２０個を一次スクリーンで同定した。

これらの４つを取り上げて更にスクリーニングと精製を２回受けさせた。

この三次スクリーンから４個の純粋なファージプラークを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅが供給するインビボ切除プロトコルに従い、ヘルパーファージの使用を通して、ｃＤＮＡ挿入断片を含んでいるプラスミドクローンが得られた。上に記述した如きアルカリ性溶菌方法を用いて２本鎖ＤＮＡを調製し、そしてその得られるプラスミドを、アガロースゲル使用電気泳動で、大きさに関して分析した。これらの中で最も大きいもの（ｐＣＦ３と表示する）は約１．４ｋｂの挿入断片を含んでおり、これを、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　）およびその製造業者の教示を用いて配列決定を行ったが、ここでは、そのｃ　ＤＮＡ挿入断片に接するベクター配列に相同性を示すプライマーを用いて開始し、そして連続的に、この配列決定実験が進行するにつれて新しく取得される配列から設計したプライマーを用いて継続した。この挿入断片の配列を配列同定番号１の中に示す。

実施例３ブラスチドのデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼをコード化するアラビドプシスｃＤＮＡのクローニング用いるプローブがｐＣＦ３に対するＰＣＲ反応から誘導されたものでなく、上述した如く精製および放射能標識したｐＣＦ３から単離した実際の１．４ｋｂ　Ｎｏｔｌフラグメントである以外は同様な様式で、関連脂肪酸デサチュラーゼをクローン化した。

上述したアラビドプシス黄化胚軸ｃＤＮＡライブラリー由来の約８０゜０００個のファージをプレートアウトさせた後、以下に示す以外は前と本質的に同様にしてスクリーニングを行った。前ハイブリッド形成段階（５０℃で８時間）を通して、ＩＭのＮａＣｌ、５ＱｍＭのトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５，１％のＳＤＳ、５％のデキストランスルフェート、０．１ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの中にこれらのフィルターを浸漬した。次に、プローブを加え、そして同じ温度で１６時間ハイブリッド形成を進行させた。フィルターを逐次的に２Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用い室温で５分間、そして次に再び新鮮な溶液を用いて１０分間、そして最後に０．５Ｘ　５ＳＰＥ、０　、　１９６Ｓ　Ｄ　Ｓを用い５０° Ｃて５分間洗浄した。強力にハイブリッド形成するプラークを約１７個そして弱くハイブリッド形成するプラークを１７個、この−次スクリーンて同定した。これらの弱（ハイブリッド形成するプラークを４つ取り上げて、それらが純粋になるまで更に、上述した如き放射能標識したプローブを用いたスクリーニングを１から２回受けさせた。これらがデルタ−１５デサチユラーゼクローンでないことを保証する目的で、これらがデルタ−１５デサチユラーゼの３′末端に特異的なプローブにハイブリッド形成するか否かを測定する分析を行った。用いたプローブは、配列同定番号１のヌクレオチド１２２９−１２４６に配列相補性を示す（即ちアンチセンス）１８ｂｐのオリゴヌクレオチドであった。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてそのプローブにガンマ−”Ｐ　ＡＴＰで放射能標識を付けた後、６Ｘ　ＳＳＣ，５Ｘデンハルト液、Ｏ，１ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、１ｍＭ（７）ＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ中４４℃で一晩、その単離したクローン由来のＤＮＡを含んているフィルターにハイブリッド形成させた。これらのフィルターを、室温で２回６Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で５分間、続いて４４ ℃の６ｘ　ｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ中で３−５分間洗浄した。これらのフィルターをオートラジオグラフィーにかけた後、これらのクローンの１つはこのプローブへのハイブリッド形成を示さなかつた。このクローンを取り上げ、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅが供給したインビボ切除プロトコルに従い、ヘルパーファージの使用を通して、そのｃＤＮＡ挿入断片を含有しているプラスミドクローンを得た。前に記述したのと同様なアルカリ性溶菌方法を用いて２本鎖ＤＮＡを調製し、そしてその得られるプラスミドを、Ｎｏｔｌ消化か或はＮｃｏｌおよびＢｇ！ＩＩの両方を用いた消化を行った後のアガロースゲル使用電気泳動により、サイズ分析した。これらの結果は、ｐＣＦ３のアラビドプンスデルター１５デサチュラーゼｃＤＮＡに特徴的な０゜７ｋｂのＮｅｏ　Ｉ−Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　Ｔフラグメントが欠乏している約１．　３ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片がこのプラスミド（ｐＣＭ２と表示する）の中に存在していることと一致していた。（このフラグメントは、配列同定番号１内のヌクレオチド４７４−４７９の所のＮｃｏ１部位とヌクレオチド１１６４−１１６９の所のＢｇ１１１部位との間に位置しているＤＮＡに相当している。このｐＣＭ２の完全ヌクレオチド配列を配列同定番号４の中に示す。

実施例４ハイブリッド形成技術を用いた、他の種からの植物脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡクローニング配列同定番号１のアラビドプシスデルター１５デサチュラーゼコーディング配列を含んでいる約１．４ｋｂのフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通してプラスミドｐＣＦ３から入手した。このＰＣＲではそのｐＣＦ３挿入断片に接しているプライマー［Ｍ１３（−２０）およびＴ７　１７ｍｅｒプライマー、それぞれ１９９１　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号３００３０３および３００３０２］を用い、このＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　Ｐ　ＣＲキットの売り主が供給した教示に記述されているのと本質的に同様にして実施した。このフラグメントをＮｏｔｌで消化させてベクター配列を除去し、アガロースゲル電気泳動で精製した後、前に記述したのと同様に３２Ｐの放射能標識を付けた。

発生ブラシカ・センス種子から得られるポリソームのＲＮＡ調合物の中に含まれているポリアデニル化ｍＲＮＡ画分を用いて、発生ブラシカ。

センス種子由来のｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｋａｍａｌａｙ他（Ｃｅｌｌ（１９８０）　１９：９３５−９４６）の操作に従い、授粉して２０−２１日後の種子からポリソームのＲＮＡを単離した。オリゴ−ｄＴセルロース使用アフィニティークロマトグラフィー（＾ｖｉｖ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾（１９７２）　６９：１４０８−１４１１）により、そのポリアデニル化ｍＲＮＡ画分を入手した。ポリアデニル化ｍＲＮＡの４ミクログラムを逆転写させた後、これを用い、ＺＡＰ−ｃＤＮ＾（商標）　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（１９９１Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ品目番号２００４００）に記述されているプロトコルを用いて、ラムダファージ（Ｕｎｉ−ＺＡＰ　（商標）　ＸＲベクター）内でｃＤＮＡライブラリーを構築した。

デルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼ類をコード化するブラシカ・センス種子ｃＤＮＡのクローニングを行う目的で、アラビドプシスｃＤＮＡｐＣＦ３およびｐＣＭ２から得られる挿入断片を放射能標識ハイブリッド形成プローブとして用いて数回、そのブラシカ・センス種子ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

これらのスクリーニングで得られるブラシカ・センスｃＤＮＡの１つを次のスクリーニングにおけるハイブリッド形成プローブとして用いた。

各スクリーニング実験に関して約３００，０００個のファージを低緊縮ハイブリッド形成条件下でスクリーニングした。５０ｍＭのトリス、ｐＩ（’７．６．６Ｘの５ＳＣ１５Ｘのデンハルト液、０．５％（７）ＳＤＳ。

１１００ｕの変性ラン胸腺ＤＮＡ中５０°Ｃで一晩、フィルターハイブリッド形成を実施した後、ハイブリッド形成後洗浄を６ｘ　ｓｓｃ、０．５％ＳＤＳ中室温で１５分間実施した後、２Ｘ　ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳを用い４５℃で３０分間繰り返し、そして続いて０．２Ｘ　ＳＳＣ，０゜５％ＳＤＳを用い５０°Ｃで３０分間を２回繰り返した。

ｐＣＭ２のアラビドプシスｃＤＮＡ挿入断片を低緊縮スクリーンにおけるプローブとして用いることで、強力にハイブリッド形成するファージが５つ同定された。これらのファージを精製し、そしてＺＡＰ−ｃＤＮ＾（商標）　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＫｉｔおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｐｈａｇｅｍｉｄ　Ｋｉｔ　（１９９１Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ品目番号２００４００および２１２２０５）に記述されているプロトコルに従って切除した。これらの１つ（ｐＢＮＳＦ３−ｆ２と表示する）は１．３ｋｂの挿入断片を含んでいた。ｐＢＮＳＦ３−ｆ２挿挿入片を両方のストランドに関して完全に配列決定した。ｐＢＮＳＦ３−ｆ２のヌクレオチド配列を配列同定番号６の中に示す。この配列をアラビドプシス・クリアナデルタ−１５デサチユラーゼクローンのそれ（配列同定番号１）と比較することにより、ｐＢＮＳＦ３−ｆ２は種子ミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化するブラシカ・センスｃＤＮＡであることが立証された。

ｐＣＭ２内のｃＤＮＡ挿入断片をプローブとして用いた、ブラシカ・センス種子ｃＤＮＡライブラリーの追加的低緊縮スクリーンにより、強力にハイブリッド形成するファージが８つ同定された。これらのファージをプラーク精製した後、これを用いて、上述した如くファージミドを切除シタ。こｈらの１つ（ｐＢＮＳＦｄ−８と表示する）ｆ；！０．３ｋｂの挿入断片を含んでぃた。ｐＢＮＳＦｄ− ８を１本鎮に関して完全に配列決定し、この配列はｐＢＮＳＦ３−ｆ２の配列とは有意に異なっていた。このｐＢＮＳＦｄ−８のｃＤＮＡ挿入断片を、ブラシカ・センス種子ｃＤＮＡライブラリーの高緊縮スクリーンにおけるハイブリッド形成プローブとして用いた。５ＱｍＭのトリス、ｐＨ７，６，６ｘのＳＳＣ。

５Ｘのデンハルト液、０．５％のＳＤＳ、１１００ｕの変性ウシ胸腺ＤＮＡ中５０℃で一晩、フィルターハイブリッド形成を実施した後、ハイブリッド形成後洗浄を６ｘ　ｓｓｃ、０．５％ＳＤＳ中室温で１５分間実施し、続いて２Ｘ　ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳを用い４５℃で３０分間、そして０．２Ｘ　ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳを用い６０℃で３０分間行った。この高緊縮スクリーンの結果、強力にハイブリッド形成するファージが得られ、これを精製し、上述した如（切除した。この切除したプラスミドの１つｐＢＮＳＦｄ−３は１．４ｋｂの挿入断片を含んでおり、これを両方のストランドに関して完全配列決定した。配列同定番号８はｐＢＮＳＦｄ−３のヌクレオチド配列を示している。この配列とアラビドプンス・クリアナデルタ−１５デサチユラーゼクローンのそれ（配列同定番号４）とを比較することにより、ｐＢＮＳＦｄ−３は種子プラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化するブラシカ・センスＣＤＮＡであることが確認された。

ｃＤＮＡライブラリーを下記の如く作り出した。さやからダイズの胚（各々約５０ｍｇの新鮮な状態の重量）を取り出した後、液体窒素の中で凍結させた。この凍結した胚を液体窒素存在下で粉砕して細かい粉末にし、そしてＣｈｉｒｇｗｉｎ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７９）　１８・５２９４−５２９９）の方法を用いて、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ均一化て抽出した後、分別して全ＲＮＡを豊富にした。Ｇｏｏｄｍａｎ他（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９７９）　６８ニア５−９０）に記述されているように、全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースカラムに通し、塩を用いてそのポリＡ’ＲＮＡを溶離させることにより、その核酸画分のポリＡ”ＲＮＡを豊富にした。ｃ　ＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　５ｙｓｔｅ＋ｓ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびその製造業者の教示を用いて、その精製したポリＡ÷ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いてその得られる２本鎖ＤＮＡの末端を埋めるに先立ッテ、このＤＮＡをＥｃｏＲＩＤＮＡメチラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でメチル化し、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてホスホリル化ＥｃｏＲ１リンカ−に平滑断端連結させた。この２本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素で消化させ、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ１−４８）　ｌ：通すことで過剰なリンカ−を分離させた後、製造業者の教示に従ってラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結させた。Ｇｉｇａｐａｃｋパッケージング抽出液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、その製造業者の教示に従って、その連結させたＤＮＡをファージの中にパッケージングした。その得られるｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの教示に従って増幅させた後、−８０℃ で貯蔵した。

ラムダＺ　Ａ　ＰＣｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　（７）中め教示ニ従イ、このｃＤＮＡファージライブラリーを用いて大腸菌ＢＢ４細胞に感染させた後、直径が１５０ｍｍのペトリ皿の上で約ｓｏ、ｏｏｏプラーク生成単位を平板培養した。これらの平板培養の二重リフトをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）上に作り出した。コれらノフィルターを、５ＱｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、ＩＭのＮａＣ１，１％のＳＤＳ、５％のデキストランスルフェートおよび０．１ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）から成るハイブリット形成緩衝液２５ｍＬ中５０℃で２時間、前ハイブリッド形成させた。上述したようにｐＣＦ３から調製した放射能標識プローブを加えた後、５０℃で１８時間ハイブリッド形成させた。これらのプローブを、室温の２Ｘ　５ＳＰＥ、１％ＳＤＳ中で５分間２回、続いて５０℃の０．２ＸＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ中で５分間洗浄した。これらのフィルターをオートラジオグラフィーにかけることにより、強力にハイブリッド形成するプラークが１つ、そして弱くハイブリッド形成するプラークが約５つ存在していることが示された。より強力にハイブリッド形成するプラークに、前と同様な２回目のスクリーニングを受けさせたが、但しここでは、最終洗浄を６０℃の０．２Ｘ　５ＳＰＥ、１％ＳＤＳ中で５分行った。

強力にハイブリッド形成するプラークが多数観察され、そして他のファージから充分に離れている１つを取り上げてさらなる分析を行った。

ラムダＺ　Ａ　ＰＣｌｏｎｊｎｇ　Ｋｉｔ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、その精製したファージから得られるｃＤＮＡ挿入断片を含んでいるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの配列をヘルパーファージの存在下で切除し、そしてその得られるファージミドを用いて大腸菌ＸＬ−Ｉ　Ｂｌｕｅ細胞に感染させた。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されているアルカリ性溶菌ミニ製造操作を用いて、ｐＸＦｌと表示するこのプラスミド由来のＤＮＡを作り出した。このアルカリで変性させたｐＸＦｌ由来２本鎖ＤＮＡを両方のストランドに関して完全配列決定した。このｐＸＦｌの挿入断片は、１７８３個のヌクレオチドから成る範囲を含んでおり、そしてこれらのヌクレオチドは、未知のオーブン読み枠を含んでおりそしてまたヌクレオチド１７６７から１７８３に及ぶオーブン読み枠に３゛が向いている１６個のヌクレオチドから成るポリーＡ範囲とそれに続＜ＥｃｏＲＩ制限部位を含んでいた。このＥｃｏＲ１部位に続＜２１８４個の塩基対は、配列同定番号２に挙げるアラビドプシスデルター１５デサチュラーゼのポリペプチドに約６８％の同一性を示すと共にそれに共直線性を示すポリペプチドをコード化する１１４５ｂｐのオーブン読み枠を含んでいた。この１１４５ｂｐのオーブン読み枠が有する推定出発メチオニンは、そのアラビドプシスミクロソームのデルタ−１５ペプチドの出発メチオニンに相当しており、そしてこのメチオニンに５゛が向いているブラスチドのシグナルペプチドに相当するアミノ酸は全く存在していなかった。このｐＸＦｌ内の挿入断片をＥｃｏＲＩで消化させると、４個のフラグメント即ちそのｐＸＦｌ内挿入断片の最初の１７８３ｂｐから誘導される約３７０ｂｐおよび１４００ｂｐフラグメントから成るフラグメントと、このｐＸＦｌ内挿入断片のその他の２１８４個のヌクレオチドから誘導される約６００ｂｐおよび１６００ｂｐのフラグメントが観察された。サザンプロットでｐＣＦ３から誘導されるプローブにハイブリッド形成したのはその６００ｂｐと１６００ｂｐフラグメントのみであった。ｐＸＦｌはＥｃｏＲ１部位で分離されている２つの異なるｃＤＮＡ挿入断片を含んでおり、そしてこれらの挿入断片の２番目のものがグイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化する２１８４ｂｐのｃＤＮＡであると推定した。プラスミドｐＸＦ１の中に含まれている２１８４ｂｐのグイズミクロソームデルタ−１５ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を配列同定番号１０の中に挙げる。

グイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡをノ＼イブリッド形成プローブとして用いたデルタ−１５グリセロリビツドデサチユラブラスミドｐＸＦ１の中に含まれているダイズミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡのコーディング領域の１．０ｋｂフラグメントを、制限酵素ＨｈａＩを用いた消化で切除した。この１．　Ｏｋｂフラグメントを、上に記述したのと同様にして、アガロースゲル電気泳動で精製した後、３２Ｐで放射能標識した。この放射能標識したフラグメントを用いて、上述した如き１００．０００プラ一ク生成単位のダイズｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。これらのフィルターをオートラジオグラフィーにかけることにより、ハイブリッド形成するプラークが８個存在しており、そしてこれらに２回目のスクリーニングを受けさせた。

そのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいる精製ファージの８個全てから得られるｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの配列を、ヘルパーファージの存在下で切除し、そしてその得られるファージミドを用いて大腸菌ＸＬ−Ｉ　Ｂｌｕｅ細胞に感染させた。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されているアルカリ性溶菌ミニ製造操作を用いて、上記プラスミド由来のＤＮＡを作り出した。制限分析の結果、これらは大きさが１．　Ｏｋｂから３．０ｋｂの範囲の挿入断片を含んでいることが示された。これらの挿入断片の１つ（ｐＳＦＤ−１１８ｂｗｆ）と表示する）は約１７００ｂｐの挿入断片を含んでいた。このアルカリで変性させたｐｓＦＤ−１１８ｂｗｐ由来２本鎖ＤＮＡを両方のストランドに関して完全配列決定した。このｐＳＦＤ−１１８ｂｗｐの挿入断片は、１６７５個のヌクレオチドから成る範囲を含んでおり、そしてこれらのヌクレオチドは、配列同定番号５に挙げるアラビドプシスプラスチドのデルタ−１５デサチュラーゼのポリペプチドに約８０％の同一性を示すと共にそれに共直線性を示すポリペプチドをコード化するオープン読み枠を含んでいた。このオープン読み枠はまた、このオープン読み枠の５°末端で、ブラスチドのシグナルペプチドに相当するアミノ酸をコード化した。このシグナルペプチドは、アラビドプシスブラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼに関して記述したシグナルペプチドに共直線性を示すと共にある程度の相同性を共有していた。アラビドプシスブラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼに相同性を示すことを基にし、そしてプラスチドのシグナルペプチドが存在していることから、このプラスミドｐＳＦＤ−１１８ｂｗｐの中に含まれているｃＤＮＡはダイズプラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼであると推定した。この１６７５ｂｐのダイズブラスチドのデルタ−１５グリセロリピツドデサチユラーゼの完全ヌクレオチド配列を配列同定番号１２の中に挙げる。

本発明で記述する異なる高等植物のグリセロリピッドデサチュラーゼ類の推定蛋白質配列を分析することにより、本分野の技術者は、高等植物の間および高等植物とラン色細菌ｄｅｓＡとの間で保存されているアミノ酸配列の領域を確認することができる。これらの短い範囲のアミノ酸を用いてポリメラーゼ連鎖反応用プライマーとしてオリゴマー類を設計することが可能である。そのｄｅｓＡと植物のデルタ−１５デサチユラーゼポリペプチドとの間で高度に保存されている２つのアミノ酸配列は、アミノ酸配列９７−１０８と２９９−３１１　（配列同定番号２）である。Ｇｅｎｅ＾−ｐ（商標）　ＲＮＡ　ＰＣＲＷｉｔ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用い、その製造業者のプロトコルに従って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。１つのＰＣＲ実験において、アラビドプシスの葉およびカノーラの発生種子の両方から精製したポリＡ’ＲＮＡに対するセンスプライマーとして配列同定番号２２と２３を用い、そしてアンチセンスプライマーとして配列同定番号２４と２５または配列同定番号２６と２７どちらかを用いた。この目的で、上述したように約１００ｎＨのポリＡ０ＲＮＡを単離し、そしてランダム六量体が用いられている上記キットを用いて逆転写を行った。次に、センスプライマーとして配列同定番号２２と２３各々６４ｐモル、モして６４ｐモルの配列同定番号２４と７８ｐモルの配列同定番号２５との混合物か或は３５ｐモルの配列同定番号２６と５０ｐモルの配列同定番号２７との混合物を用いたＰＣＲで、上記ｃＤＮＡを用いると共に下記のプログラムを用いた：ａ）９５℃で２分間と５０℃で１５分間を１サイクル、ｂ）６５℃で３分間（伸長）、９５８Ｃで１分２０秒（変性）、５０°Ｃで２分間（アニーリング）を３０サイクル、そしてｃ）６５６Ｃで７分間を１サイクル。ゲル電気泳動でＰＣＲ産物の分析を行った。全てのＰＣＲで適当な大きさく約６３０ｂｐ）を有するＰＣＲ産物が生じた。アラビドプシスおよびカノーラ由来のＰＣＲ産物を精製し、そしてこれを放射能標識ハイブリッド形成プローブとして用いて、上述した如き低緊縮で、ラムダＹｅｓアラビドプシスＣＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。これによって純粋なファージの単離がもたらされ、これを切除することでプラスミドｐＹａ　ｃ　ｐ７が得られた。このｐＹａ　ｃ　ｐ　７内のｃＤＮＡ挿入断片の部分配列決定を行った。この配列は、上述した如き低緊縮ハイブリッド形成で単離した別のｃＤＮＡ（プラスミドｐＦａｄｘ−２内の）に同一性を示す不完全なデサチュラーゼポリペプチドをコード化することが示された。ｐＦａｄｘ−２およびｐＹａ　ｃ　ｐ　７内のｃＤＮＡ挿入断片由来の部分配列がら誘導される複合配列を配列同定番号１６の中に示し、そしてこれがコード化するポリペプチドを配列同定番号１７の中に示す。上で考察したように、配列同定番号１７は推定プラスチドデルター１５デサチュラーゼである。これをハイブリッド形成プローブとして用いることで容易にｐＹａ　ｃ　ｐ　７の全長板を単離することができる。

２つの追加的保存領域は、配列同定番号７（ブラシカ・ナプスのグリセロリピッドデサチュラーゼデルタ−１５）のアミノ酸残基１３０から１３７および２４９と２５６に相当している。ＰＣＲ産物のサブクローニングを容易にする目的で各オリゴヌクレオチドの５°末端に付加させたＢａｍＨｌのための制限部位を含んでいる追加的ヌクレオチドを用いて、上記領域に対する縮重オリゴマー類を設計した。Ｆ２−３およびＦ２−３０と表示するこれらのオリゴヌクレオチド類のヌクレオチド配列をそれぞれ配列同定番号１８と配列同定番号１９に示す。

縮重オリゴヌクレオチドＦ２−３およびＦ２−３ｃの混合物を用い、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓから購入したＧｅｎｅＡｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲＫｉｔおよびＩｎｎ１５Ｍ１ｉ集、（１，９９０）　ｒ　Ｐ　ＣＲプロトコル、方法および応用に対するガイドＪ　（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：＾Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　、＾ｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＳＳａｎ　Ｄｉｅｇｏの中に記述されているのと本質的に同様にして、トウモロコシ種子ｍＲＮＡ個体群内の代表的グリセロリピントデサチュラーゼ配列を増幅、単離およびクローン化した。

Ｃｈｉｒｇｗｉｎ他（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９４の方法を用い、授粉して１５−２０日後の発生トウモロコシ種子からトウモロコシ種子のＲＮＡを入手した。オリゴ−ｄＴセルロース使用アフィニティークロマトグラフィーでトウモロコシ種子のポリアデニル化ｍＲＮＡを単離した（Ａｖｉｖ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾（１９７２）　６９：１４０８−１４１１）　、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　b ｅｔｕｓが推奨する反応緩衝液および条件を用い、オリゴ−ｄＴおよびランダム六量体プライマーを用いた逆転写反応では２２０−５０ｎのＡ＋ｍＲＮＡを用いた。次に、この得られるｃＤＮＡを鋳型として用い、そして配列同定番号１８および１９内の縮重プライマーのセットを用いて、トウモロコシ種子グリセロリピッド配列の増幅を行った。反応条件はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓが記述したのと同様であり、ここでの増幅プロトコルは、９５８Ｃ／１分間、５５６Ｃ／１分間および７２℃／２分間が３０−５０サイクルであるシーケンスから成っていた。その得られるポリメラーゼ反応産物をフェノール−クロロホルムで抽出し、ＢａｍＨＩで消化させた後、Ｌｉｎｋｅｒ　６スビンカラム（ｒ’ｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）使用ゲル濾過クロマトグラフィーにかけることによって、取り込まれなかったプライマーから分離させた。その得られるＰＣＲ産物を、そのＢａｍＨ１部位の所でｐＢｌｕｅｓｃｒｆｐｔ　ＳＫにクローン化し、そして受容能力のある大腸菌ＤＨ５細胞に形質転換した。その得られる形質転換したコロニー由来のプラスミドＤＮＡの制限分析を行うことにより、そのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　Ｂ　ａ　ｍＨ１部位に大きさが約０．５ｋｂの挿入断片を含んでいるコロニーであるＰＣＲ−２０が確認された。このＰＣＲ−２０挿入断片を両方のストランドに関して完全配列決定した。このＰＣＲ２０挿入断片のヌクレオチド配列を配列同定番号１４に示し、そしてその翻訳されたアミノ酸配列を配列同定番号１５に示す。このアミノ酸配列は、配列同定番号７に示すブラシ・ナプスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼが有するアミノ酸配列に全体で６１．９％の同一性を示す。この結果により、そのＰＣＲ２０挿入断片を、トウモロコシ種子のデルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡのポリメラーゼ反応産物であるとして同定する。ＰＣＲ２０挿入断片をプローブとして用いることで容易にトウモロコシ種子の全長デルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡを単離することが可能であり、或はそのままアンチセンスとして用いるか、または、適当なトウモロコシ遺伝子発現ベクターの中にそれをクローン化することで、形質転換したトウモロコシ植物内のトウモロコシ種子グリセロリピッドデルタ−１５デサチユラ一ゼ遺伝子発現を共抑制することが可能である。

実施例７アラビドプシス・クリアナデルタ−１５デサチユラーゼのゲノムクローンを制限フラグメント長条型性（ＨＥＬＰ）マーカーとして用いた、アラビドプシス内のデルタ−１５デサチユラーゼ座の地図作成変異体系統３７０７内のＴ−ＤＮＡ挿入部位に接するＤＮＡを用いて、アラビドプシス・クリアナ種子のデルタ−１５デサチユラーゼをコード化する遺伝子座の地図を作成した。このアラビドプシスデルター１５デサチュラーゼのコーディング配列を含んでいる約１２ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌを用いた消化でラムダ−４２１１クローンから取り出し、アガロースゲル電気泳動でそのラムダアームから分離させた後、標準操作を用いてそれの精製を行った。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ製ランダムブライミングキットを用い、この製造業者が推奨する条件下で、その単離したＤＮＡに３！Ｐの標識を付けた。この放射能を示すＤＮＡをプローブとして用いて、いくつかの制限エンドヌクレアーゼの１つを用いて消化させたアラビドプシス・クリアナ（生態型１ａｓｓｉ１ｅｓｋｉｊａおよびマーカー系統Ｗ１００生態型Ｌａｎｄｅｓｂｅｒｇ背景）由来のゲノムＤＮＡを含んでいるサザンプロットを分析した。標準条件（Ｓａ■ｂｒ。

ｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）下のハイブリッド形成および洗浄を行うことで、オートラジオグラムが得られた。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌｌｌ、ＣＩａＬＨｉｎｄｌｌＩＳＮｓｉＩおよびＸｂａＩを用いた消化で、異なるパターンのハイブリッド形成（多型性）を同定した。

同じ放射能標識ＤＮＡフラグメントを用いて、Ｈｅ１ｅｎｔｊａｒｉｓ他（Ｔｈｅｏｒ。

＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８６）　７２−７６１−７６９）が記述したのと本質的に同様に、その多型性の地図を作成した。アラビドプシス・クリアナマーカー系統Ｗ１００と生態型Ｗａｓｓｉｌｅｓｋｉｊａとの間の交雑で得られる１１７個の組換え型近交子孫（Ｆ６世代に対して単一種子遺伝から誘導）から単離したＸｂａｌ消化ゲノムＤＮＡのサザンプロットに、上述したように、その放射能標識したＤＮＡフラグメントを塗布した（Ｂｕｒｒ池、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８８）１１８：５１９−５２６）。このオートラジオグラム上の帯を、父方（生態型１ａｓｓｉ１ｅｓｋｉ　ｊａ）または母方（マーカー系統Ｗ１００）どちらかのＤＮＡからか或は両方（ヘテロ接合）ＤＮＡの遺伝の結果として解釈した。その得られる分離データを、コンピュータープログラムＭａｐｍａｋｅｒ　（Ｌａｎｄｅｒ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　（１９８７）　１：１７４−１８１）を用いて遺伝解析した。アラビドプシス・グリアナ内の不明な６３個のＲＦＬＰマーカーおよび９個の形態マーカーに関して以前に得られた分離データ（Ｃｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８８）　８５：６８５６−６８６０；　Ｎａｍ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：６９９−７０５）と協力させることで、このデルタ−１５デサチユラーゼのコーディング配列を含んでいるゲノムＤＮＡに対応して、単一の遺伝圧が位置していた。このようにして、このデルタ−１５デサチユラーゼ遺伝子の位置は、染色体２上、ｐｙおよびｅｒｅｃｔａ形態マーカ形態マーカームダＡＴ２８３とコスミドｃ６８４２　ＲＦＬＰマーカーとの間に存在していると決定した。

プラスミドｐＣＭ２内のｃＤＮＡはまた、ＥｃｏＲＩで消化させたアラビドプシス・クリアナ（生態型Ｗａｓｓｉｌｅｓｋｉｊａおよびマーカー系統Ｗ１００生態型Ｌａｎｄｅｓｂｅｒｇ背景）由来のゲノムＤＮＡに多量性／％イブＩルノド形成することが示された。これをＲＦＬＰマーカーとして用いて、上に記述した如きアラビドプシス内のこの脂肪酸デサチュラーゼをコード化する遺伝子に関する遺伝産地図を作成した。このデサチュラーゼｃＤＮＡに対応して、単一の遺伝圧が位置していた。このようにして、その位置は、染色体３上、無毛塵（Ｃｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８８）　８５：６８５６−６８６０；　Ｎａｍ他、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　１：６９９−７０５）の「北」、ラムダＡＴ２２８とコスミドｃ３８３８　ＲＦＬＰマーカーとの間に存在していると決定した。

実施例８制限フラグメント長条型性（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）マーカーとしてプラスミド内のダイズ種子ミクロソームデルター１５グリセロリピ・ノドデサチュラーゼｃＤＮＡ配列の使用Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記述されている標準的条件における制限酵素ＥｃｏＲ１を用いた消化により、約３００ｂｐのコーディング配列とａｏｏｂｐの３°非非翻訳列を含んでいる、プラスミドｐＸＦ１由来のｃＤＮＡ挿入断片の６００ｂｐフラグメントを切除した後、アガロースゲル電気泳動で精製し、そしてＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ製Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｉｎｇ　Ｋｉｔを用い、この製造業者が推奨する条件下でｓｘｐの標識を付けた。この得られる放射能を示すプローブを用いて、いくつかの制限酵素の１つで消化させたダイズ［グリシン・マックス（ｃｕｌｔｉｖａｒ　Ｂｏｎｕｓ）およびグリシン・ソジ＋　（Ｇｌｙｃｉｎｅ　５ｏｊａ）　（ＰＩ８１７６２）　］由来のゲノムＤＮＡを含んでいるサザンプロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）を分析した。標準的条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）下でハイブリッド形成と洗浄を行った後、オートラジオグラムが得られ、そして制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩを用いて行った消化でハイブリッド形成の異なるパターン（多型性）を同定した。次に、同じプローブを用い、Ｈｅ１ｅｎｔｊａｒｉｓ他（Ｔｈｅｏｒ。

＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８６）　７２ニア６ｌ−７６９）が記述したのと本質的に同様に、そのダイズゲノム上の多室性ｐＸＦ１座の地図を作成した。Ｇ、マックスＢｏｎｕｓ　ｘ　Ｇ、ソジャＰ■８１７６２の交雑で得られる６８個のＦ２子孫植物から単離してＥｃｏＲＩ、Ｐｓ　ｔ　ＩＳＥｃｏＲＶＳＢａｍＨＩまたはＨ４ｎｄＩＩＩで消化させたゲノムＤＮＡのサザンプロットに、上述したように、プラスミドｐＸＦ１／６００ｂｐプローブを塗布した。このオートラジオグラム上の帯を、父方（Ｂｏｎｕｓ）または母方（ＰＩ８１７６２）パターンどちらかか或は両方（ヘテロ接合）の遺伝の結果として解釈した。

その得られるデータを、コンピュータープログラムＭａｐｍａｋｅｒ　（Ｌａｎｄｅｒ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　（１９８７）　１：１７５−１８１）を用いて遺伝解析した。ダイズ内の不明な４３６個のＲＦＬＰマーカーに関して以前に得られたデータ（Ｔｉｎｇｅｒ他、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１４Ｅ　（１９９０）、２９１頁、ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｒ１５３）と協力させることで、出願者らは、ダイズ遺伝地図の上にｐＸＦ１／６００　ｂ　ｐプローブに対応する単一の遺伝塵を位置させることができた。このことは、ミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼのための遺伝子はこのダイズゲノム内の染色体１９上に位置していることを立証している。この情報は、変化した多不飽和物レベルを示す系統を開発することの標的となるダイズ育種で有効性を示すであろう。

ＤＮＡ操作の詳細な操作、例えば制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ修飾用酵素の使用、アガロースゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ単離、プラスミドＤＮＡを用いた大腸菌細胞の形質転換、およびプラスミドＤＮＡの単離および配列決定などは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他「分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓおよび＾ｕｓｕｂｅｌ他、（１９８９）　ｒ分子生物学における現在のプロトコルＪ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、Ｊ。

ｈｎ　ｆｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓの中に記述されている。全ての制限酵素および修飾用酵素を、特に明記されていない限りＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。

ミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼが示す過剰発現の生物学的効果を試験する目的で、配列同定番号１、即ちアラビドプシス・クリアナミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化するｃＤＮ特表千７−５０１７０１　（３Ｇ）Ａを、センス配向で、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの背後に位置させて構成発現を生じさせるか、或はＢ−コングリシニン（７Ｓ）種子貯蔵蛋白質のダイズａ゛サブユニットをコード化する遺伝子のためのプロモーターの背後に位置させて胚に特異的な発現を生じさせた。このキメラ遺伝子構築物を作り出す目的で、所望クローンの操作を容易にする特定の発現カセットを作り出した。次に、これらのキメラ遺伝子を、アグロバクテリウム・ツメファシェンスのバイチリ−Ｔｉプラスミドベクター系［Ｈｏｅｋｅｍａ他（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：１７９−１８０；　Ｂｅｖａｎ　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：８７１１−８７２０１を用いて植物細胞＋、：形質転ｍした。

形質転換したニンジン毛根におけるアラビドプシスデルター１５脂肪酸デサチュラーゼの過剰発現配列同定番号１（アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼ）の同定を立証しそして非相同植物種におけるそれの過剰発現が示す生物学的効果を試験する目的で、アグロバクテリウムを用いて、構成キメラ遺伝子３５Ｓ：配列同定番号１をニンジン組織の中に導入した。プラスミドｐＡＷ２８の中に入っている構成遺伝子発現のためのカセットは、ｐＫＮＫから誘導されるｐＫ３５Ｋを源としていた。

プラスミドｐＫＮＫは、植物カナマイシン耐性のためのキメラ遺伝子ニッパリンシンターゼ（ＮＯ３）プロモーター／ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）ＩＩココ−ィング領域／３°　ＮＯＳキメラ遺伝子を含んでいるｐＢＲ３２２を基とするベクターである。プラスミドｐＫＮＫを、ブダペスト条約の規定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに１９８７年１月７日付けで寄託シ、受託番号ＡＴＣＣ６７２８４を受理した。このプラスミドの地図はＬｉｎ他、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９８７）　８４：８５６−８６１の中に示されている。このＮＯＳプロモーター領域は、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ他（１９８２）　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　ｌ：５６１−５７４が記述したＮＯ８遺伝子の転写出発部位に関してヌクレオチド−２６３から＋３３Ｉ；相当している２９６ｂｐの５ａｕ３Ａ−Ｐｓｔｌフラグメントである。

このＮＯ３遺伝子の翻訳開始コドンの所に、３°末端のＰｓｔ１部位を作り出した。このＮｐｔＩＩコーディング領域は、それぞれヌクレオチド１５４０と２５１８の所にＨｉｎｄｌＩＩとＢａｍＨＩ部位を作り出すことによッテトランスポゾンＴ　ｎ　５　（Ｂｅｃｋ他、Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９：３２７−３３６）から得られる９９８ｂｐのＨｉｎｄｌＩＩ−ＢａｍＨ１フラグメントである。この３’　ＮＯ３は、ポリアデニル化領域を含んでいるＮＯ３遺伝子（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ他、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８２）　１：５６１− ５７４）が有する３°末端のヌクレオチド８４８から１５５０の７０２１）ｐ　ＢａｍＨＩ−Ｃ１ａｌフラグメントである。このＮＯＳプロモーターを含んでいるそのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　Ｔ　Ｉ　Ｉフラグメントを、そのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含んでいるＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントで置き換えることによって、ｐＫＮＫをｐＫ３５Ｋに変化させた。このＥｃｏＲＩ− Ｈｉｎｄ　ＩＩ　Ｉの３５Ｓプロモーターフラグメントは、ｐＵＣ３５Ｋ（ブダペスト条約の規定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏ　ｏｆ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄに１９８７年１月７日付けで寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６７２８５を受理した）の中に含まれているのと同じである。以下に示す如く、モして０ｄｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１３：８１０−８１３に記述されているようにして、この３５Ｓプロモーターフラグメントを調製したが、ここでは、このフラグメントの３′末端に、その転写出発部位に関して＋２１にＣａＭＶ配列を含めた。この３５３転写出発部位に関して−９４１と＋２０８の間の領域を含んでいるそのＣａＭＶゲノムの１．１５ｋｂＢｇｌｌｌフラグメントを、プラスミドｐＵＣ１３のＢａｍＨ１部位の中にクローン化した。このプラスミドを、そのＣａＭＶフラグメントに対して３゛に位置しているポリリンカー内の５ａ１１部位の所で線状にし、そしてこのフラグメントの３°末端を、ヌクレアーゼＢａ１３１を用いた消化で短くした。Ｈ４ｎｄｌｌｌリンカ−を加えた後、このプラスミドＤＮＡは再円形化した。その単離したクローンをヌクレオチド配列分析した結果、＋２１の所に位置しているＨｉｎｄＩＩＩリンカ−で３゛欠失フラグメントが選択された。この３５ＳプロモーターフラクメントをＥｃｏＲＩ−Ｈ４ｎｄＩ　Ｔ　Ｉフラグメントとして単離したが、このＥｃｏＲ１部位はｐＵｃ１３のポリリンカー由来のものであった。

ＨｉｎｄｌｌｌとＢａｍＨＩ制限酵素を用いた消化により、プラスミドｐＫ３５ＫからこのプラスミドｐＫ３５に内のＮＰＴＩＩコーディング領域を取り出した。消化後、クレノー酵素を用いて、このＤＮＡ分子の末端を埋めた。次に、Ｎｏｔｌリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）をそれらの末端に連結させた後、このプラスミドを再円形化させることでプラスミドｐＫ３５Ｎｔが得られた。３５Ｓプロモ一ター領域＝Ｎｏｔ１部位−ノバリンシンターゼ由来３゛非翻訳領域を含んでいる１、７ｋｂフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＣｌ　ａ　Ｉ　ヲ用いてｐＫ３５Ｎｔから遊離させた。制限消化に続いて、クレノー酵素を用いて、これらのＤＮＡ分子の末端を満たし、その後、Ｘｈｏｌリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた。ここで、各末端にＸｈｏ１部位を含んでいる１、７ｋｂフラグメントをゲル単離し、そしてユニークなＸｈｏ１部位の所で、プラスミドベクターｐ　Ｕ　ＲＡ　３　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ）にクローン化した。このベクターｐＵＲＡ３を選択した理由は、それにＮｏｔＩ制限部位が存在していないで単一のＸｈｏｌ制限部位が存在していることと、このベクター（ｐＵＲＡ３）が比較的大きなサイズを有していてその最終構築物から比較的容易にその遺伝子発現カセットを単離することが可能であることである。

アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ（配列同定番号１）を含んでいるプラスミドｐＣＦａ内の１．４ｋｂ　Ｎｏｔｌフラグメントを単離し、そして予めＮｏｔＩ制限酵素で線状にしたｐＡＷ２８（構成発現カセット）に連結させた後、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理することにより、そのプロモーターに関してそれぞれセンス配向およびアンチセンス配向でクローン化した配列同定番号１を有しているプラスミドｐＡＷ２９とｐＡＷ３０が得られた。適当な制限エンドヌクレアーゼを用いた消化か或はそのプロモーター−ｃＤＮＡ結合を交差する配列決定を用いることにより、これらのプロモーターに関するｃＤＮＡの配向を立証した。

キメラ遺伝子である３５Ｓプロモ一ター／センス配列同定番号１／３’　ＮＯ５および３５Ｓプロモ一ター／アンチセンス配列同定番号１／３’　ＮＯ５をそれぞれプラスミドｐＡＷ２９およびｐＡｗ３０がら３ｋｂのＸｈｏＩフラグメントとして単離した後、ユニークな５ａｌＩ部位の所でバイナリ−ベクターｐＺｓ１９４ｂにクローン化することによって、それぞれプラスミドｐＡＷ３１とｐＡＷ３２が得られた。ｐＡＷ３１およびｐＡＷ３２内の植物選択性マーカー遺伝子の配向は、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いた消化で確かめて、その３５Ｓプロモーターのそれと同じである。バイナリ−ベクターｐＺｓ１９４ｂは、ｐＢＲ３２２の複製開始点、このプラスミドをアグロバクテリウム内で複製させてそれを維持するに必要とされる緑膿菌プラスミドｐＶｓ１　［Ｉｔｏｈ他、（１９８４）　Ｐ１ａｓａ＋ｉｄ　１１：２０６−２２０）　（ｎｌｌａＪオにヒ安定化ｆｆｔｊ域、形質転換シタ細菌のための選択性マーカーとしてＴ　ｎ　５　（Ｂｅｒｇ他、（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：３６２８−３６３２）由来の細菌ＮＴＰＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性）、Ｔｊプラスミド（Ｂｅｖａｎ他、（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃｄｓ　Ｒｅｓ。

１２：８７１１−８７２０）が有するＴ−ＤＮＡの左側境界と右側境界を含んでおり、そしてこの左側と右側のＴ−ＤＮＡ境界の間に、Ｋｐｎｌと５ａｌＩのためのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位と一緒に、形質転換した植物細胞と大腸菌１ａｃＺ　ａ−相補セグメンｌ−（ＶｉｅｒｉａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６７）のための選択性マーカーとして、上述した植物カナマイシン耐性のためのキメラＮＯ３：ＮＰＴＩＩ遺伝子を存在させる。

凍結／解凍方法（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ他、（１９７８）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１６３　：１８１−１８７）を用い、アグロバクテリウム・リゾゲネス由来のＲｉプラスミドｐＲｉ　Ａ　４　ｂ　（Ｍｏｏｒｅ他、（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄ　２：６１７−６２６）を有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス株Ｒ１００Ｏにそのバイナリ−ベクターｐＡＷ３１とｐＡＷ３２を形質転換することにより、それぞれ形質転換体Ｒ１０００／ｐＡＷ３１とＲ１００Ｏ／ｐＡＷ３２を生じさせた。

Ｐｅｔｉｔ他、（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２：３８８−３９３）の方法を用いて、菌ＫＲ１０００／ｐＡＷ３１＊たはＲ１０００／Ｉ）ＡＷ３２と一緒ニニンジンの機盤を共培養することにより、ニンジン（ダウクス・力ロタ・Ｌ、　）細胞の形質転換を行った。接種用の外植片を調製する目的で、地方のスーパーマーケットから購入したニンジンを最初に水と器用洗剤で穏やかにこすった後、水道水と蒸留水で完全に濯いだ。５０％Ｃ１ｏｒｏｘと蒸留水から成る撹拌している溶液の中でこれらの表面を３０分間殺菌した後、無菌蒸留水で完全に濯いだ。オートクレーブにがけた野菜皮むき器を用いてこれらのニンジンの皮をむいた後、外科用メスの刃でスライスして厚さが約５　１０ｍｍの盤にした。これらの盤を、ペトリ皿の中に入っている０、７％の寒天で固化させた蒸留脱イオン水から成る培地の上に、このニンジンの根の先端に最も近いその切断した表面を接種に暴露させるような逆配向で置いた。

アグロバクテリウム菌株Ｒ１０００、Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１およびＲ１００Ｏ／ｐＡＷ３２の培養物を、最初適当な抗生物質選択剤（Ｒ１０００に関しては５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、或はＲ１０００／ｐＡＷ３１およびＲ１０００／ｐＡＷ３２に関しては各々５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールとカナマイシン）が入っているＬＢブロス内で新しく増殖させた平板培養から始めて、２８℃で増殖させることにより、６００ｎｍにおける光学密度が約１．０になるようにした。遠心分離で細菌細胞をペレット化し、濯いだ後、抗生物質が入っていないＬＢブロス内に再懸濁させた。新しく切り取ったニンジン盤各々の切った表面に上記細菌懸濁液を１００μＬ塗布することによって、接種を行った。対照として、無［ｉＬＢブロスのみを何枚かの盤に接種することで、アグロバクテリウムなしで根が生じる度合を示した。

接種した機盤を、Ｐａｒａｆｉｌｍて密封したペトリ皿の中に入れて暗所中２５ ℃でインキュベートした。アグロバクテリウムと一緒にニンジン盤を共培養して２週間後、アグロバクテリウムを逆選択するためのカルベニシリンが５００ｍｇ／Ｌ入っている新鮮な寒天固化水培地にこれらのニンジン盤を移した。この時点でいくつかの機盤上に毛根生成が見られた。

これらの外植片を４週間で新鮮な逆選択用培地に移した。これらの外植片からの個々の根の切除を６週間で始めた。１ｏ日後、必要に応じてこれらの外植片から更に根を採取した。

長さが約５−１０ｍｍの根を切除し、そして個々に、スクロース（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄＳＮ、Ｙ、、カタログ番号５１０−１１１８Ｅ＾）が３０ｇ／Ｌとカルベニシリンが５００ｍｇ／Ｌ入っているＭＳ最小有機物培地上でサブ培養した。おおよそ等しい数の根を液状培地内でサブ培養すると共に０．６％のアガロースで固化させた培地内でサブ培養した。固体培地上の培養物を６０ｘ１００ｍｍのペトリ皿内で増殖さ也そして液状培養物を６個のウェルが備わっている培養皿の中で増殖させた。根を切除する時、その傷付けた表面上の個々のカルス様生長物から根を１本選択する努力を行った。そのペトリ皿の蓋の上にこれらの切除した場所の印を付けることで、同じ形質転換出来事を基とする組織を繰り返してサンプリングするのを最小限にした。

これらの外植片から切除した後２がら３週間で、目で見てアグロバクテリウムに汚染されていない個々の毛根培養物を、カルベニシリンを５００ｍｇ／Ｌ補った新鮮なＭＳ培地に移した。各培養物の根集団を切断して、分枝した根が１本以上含まれている断片を生じさせ、そしてこれらの断片を、１グループとして、新しい培地が入っているプレートまたはウェルに移した。次の２がら３週間以内に適当な大きさにまで成育する根培養物の組織を約２０ｍｇ　（新鮮な状態の重量）サンプリングして１、　Ｂｒｏｗｓｅ他（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）　１５２：１４１−１４５）が記述したのと本質的に同様にして、脂肪アシルメチルエステルのガスクロにより脂肪酸組成を分析したが、ここでは、そのメチル化剤としてメタノール中２．５％のＨ，ＳＯ，を用いそして種子のトリグリセライド類のメタノール分解を行う目的でこれらのサンプルを８０℃で１．５時間加熱した。その結果を表６に示す。勢い良く成長している根先端の約１ｃｍから成る２番目の組織サンプルを切除し、そしてカルベニシリンを５００ｍｇ／Ｌとカナマイシンを２５−５０ｍｇ／Ｌ補充したＭＳ培地の上に置いて、そのバイナリ−ベクター（Ｓｉｍｐｓｏｎ他、（１９８６）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　６：４０３−４１５）と−緒に共形質転換させた毛根に関するカナマイシン耐性選択を試形質転換したニンジン機中の１８：３と１８　：　２／１８　：　３比のバーセＺよ根サンプル　用いた形質転換用ベクター　１８：３　（％）１８：２／１８：３（％）Ｉ　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　６２　０．０９２　Ｒ１００Ｏ／ｐＡ１３１　８　７．３０３　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　１０　５．６９４　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　６２　０．０６５　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　１０　５．０７６　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３］　４　１４．２７　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　６１　０．１８８　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　４　１５．　］９　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　６１　０．０７１０　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　６３　０．０９１１　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　１５　３．０４１２　Ｒ１００Ｏ／ｐＡ１１３１　６４　０．１４１３　Ｒ１００Ｏ／ｐＡｆ３１　５　９．９４１４　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３Ｌ　９　６．７２１５　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　８　７．０８１６　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　８　６．３１１７　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　２３　１．８６１８　Ｒ１００Ｏ／ｐＡｆ３１　８　７．３３１９　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　１０　５．９９２０　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１　７　８．８３２１　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　９　６．８０２２　Ｒ１００Ｏ／ｐＡ１１３２　４　１１．８２３　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　３　１８．８２４　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　１０　６．２１２５　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　７　８．５７２６　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　３　１６．４２７　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　６　８．２９２８　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　５　９．１９２９　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　５　８．４７３ＯＲ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　８　７．１７３１　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　４　１１．９３２　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　８　７．２０３３　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　’　５　１０．４３４　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　８　７．２９３５　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　３　１７．２３６　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　８　７．２７３７　Ｒ１００Ｏ／ｐＡｆ３２　９　６．０ｆ３８　Ｒ１００Ｏ／ｐＡ？３２　９　、　６．６２４０　Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３２　９　６．０２４１　Ｒ１００Ｏ８７，２３４２Ｒ１００Ｏ８７，８３４３Ｒ１００Ｏ１０６，２０４４Ｒ１００Ｏ９５，９７４５Ｒ１００Ｏ９６，７３４６Ｒ１００Ｏ９６，２７４７Ｒ１００Ｏ８７，２７４８Ｒ１００Ｏ７８，３０４９Ｒ１００Ｏ９７，１１Ｒ１００Ｏで形質転換した「毛」根が外因性植物ホルモンの存在なしに成育する能力は、そのＲｉプラスミドであるｐＲｉＡ４ｂに帰するものであり得る。Ｒ１０００／ｐＡＷ３１またはＲ１００Ｏ／ｐＡＷ３２菌株を用いて形質転換を行った時、またその実験的バイナリ−ベクターであるｐＡＷ３１またはｐＡＷ３２で形質転換した「毛」根は一部（約半分）のみである。従って、期待されるように、高い１８．３表現型を示すのはＲ１０００／ｐ　ＡＷ３１を用いた形質転換で得られる毛根の全部ではない。Ｒ１００Ｏ／ｐＡＷ３１で形質転換した「毛根」内には有意な脂肪酸表現型が存在していないと期待される、と言うのは、ニンジンとアラビドプシスデルター１５デサチュラーゼの配列は充分に関係していないと予測されるからである。これらの結果は、アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼが過剰発現する結果として非相同植物組織内の１８：２が失われて１８：３が１０倍以上増加し得ることを示している。

種子におけるアラビドプシスデルター１５脂肪酸デサチュラーゼの過剰発現および変異体３７０７におけるデルタ−１５不飽和化変異の補完Ｔ−ＤＮＡ変異体３７０７中のデルタ−１５不飽和化変異の補完を行うと共に、種子における配列同定番号１（アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５脂肪酸デサチユラーゼ）の過剰発現が示す生物学的影響を試験する目的で、胚に特異的なプロモーター：配列同定番号１のキメラ遺伝子を変異体植物に形質転換した。部分的にベクターｐｃＷ１０９の修飾版を用いて、ｐＡＷ４２の中でこの胚に特異的な発現カセットを作り出した。クローニングベクターｐ　Ｕ　Ｃｌ　８（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＨｉｎｄ１１１部位の中にＢ−コングリシニン遺伝子の５５５ｂｐから成る５°非コーデイング領域（プロモーター領域を含んでイル）ニ続いて、ＮｃｏｌＳＳｍａｌ、ＫｐｎｌおよびＸｂａＩのための制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる多重クローニング配列を挿入した後、ＨｉｎｄＩ　Ｔ　１部位の中に１１７４ｂｐの共通豆ファセオリン３° 非翻訳領域を挿入することによって、ベクターｐｃＷ１０９それ自身を作り出した［Ｓｌｉｇｈｔｏｍ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌ、ｓ、＾、　（１９８３）　８０：１８９７−１９０１１゜使用したＢ−コンクリシニンプロモーター領域は、２７ヌクレオチド位置が異なっていることから、公開されたＢ−コングリシニン遺伝子（Ｄｏｙｌｅ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８６）　２６１：９２２８−９２３８）の対立遺伝子である。さらなる配列記述はＳｌｉｇｈｔｏｍ　（Ｗ０９１／１３９９３）の中に見付は出され得る。

ベクターｐ　ＣＷＩ　０９に対する修飾は下記の通りであった。ＮｃｏｌおよびＸｂａｌ制限酵素を用いた消化に続くムングビーン（■ｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）使用処理を行うことにより、線状の平滑断端ＤＮＡ分子を作り出すことによって、可能な翻訳出発部位を壊した。Ｎｏｔｌリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を連結させモしてＮｏｔｌ制限酵素（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた消化を行った後、このプラスミドは再円形化した。ジデオキシ配列決定により、その所望の変化が生じたことが確認された。この得られるプラスミドを。ＡＷ３５と表示した。その修飾したＢ−フングリシニンプロモーター／３°フアセオリン領域を含んでいるｐＡＷ３５から得られる１、８ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩフラグメントを、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ　ＳＫ”　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内のＨｉｎｄｌ１１部位にサブクローン化することによって、プラスミドｐＡＷ３６を作り出した。プラスミドｐＡＷ３６をそのユニークなＥｃｏＲ１部位の所で線状にし、そしてＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌアダプタ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結させた。Ｘｈｏｌを用いた消化の後、そのＢ−コンクリシニンプロモーター／Ｎｏ　ｔ　１部位／３′　−フ７セオリン非翻訳領域を含んでいる１、７ｋｂのＸｈｏＩフラグメントを、ｐＵＲＡ３ベクター（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ）内のＸｈｏ１部位にクローン化した。その得られるプラスミドｐＡＷ４２は、修飾したＴ−ＤＮＡバイナリ−ベクターにクローン化するのを容易にするＸｈｏ１部位と標的ｃＤＮＡ配列のクローニングを容易にするユニークなＮｏｔ１部位とに境界を接している、種子に特異的な発現カセットを含んでいる。このベクターｐＵＲＡ３を選択した理由は、それにＮｏＬＩ制限部位が存在していないで単一のＸｈｏｌ制限部位が存在していることと、このベクター（ｐＵＲＡ３）が比較的大きなサイズを有していてその最終構築物から比較的容易にその遺伝子発現カセットを単離することが可能であることである。

アラビドプシスミクロソームのデルタ−１５デサチユラーゼ（配列同定番号１）を含んでいるプラスミドｐＣＦａ内の１．４ｋｂ　Ｎｏｔｌフラグメントを単離し、そして予めＮｏｔｌ制限酵素で線状にしたプラスミドｐＡＷ４２（種子に特異的な発現カセット）に連結させた後、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　１ｌａｎｎｈｅｉｓ）で処理することにより、そのプロモーターに関してセンス配向でクローン化した配列同定番号１を有しているプラスミドｐＡＷ４５が得られた。適当な制限エンドヌクレアーゼを用いた消化か或はそのプロモーター−ｃＤＮＡ結合を交差する配列決定を用いることにより、これらのプロモーターに関するｃＤＮＡの配向を確認した。

キメラＢ−コンクリシニンプロモーター／センス配列同定番号１／ファセオリン３′をプラスミドｐＡＷ４５から３．２ｋｂのＸｈｏｌフラグメントとして単離した後、ユニークな５ａ１１部位の所でバイナリ−ベクターｐＡＷ２５にサブクローン化した。その得られるベクターｐＡＷ５０内の植物選択性マーカーの配向は、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いた消化で確かめて、そのＢ−コンクリシニンプロモーターのそれと同じである。プラスミドｐＺ８９４にとｐＭＬ２からプラスミドｐＡＷ２５を誘導する。プラスミドｐＺ５９４には、ｐＢＲ３２２の複製開始点、このプラスミドをアグロバクテリウム内で複製させてそれを維持するに必要とされる緑膿菌プラスミドｐ　Ｖ　Ｓ　１　［１ｔｏｈ他、（１９８４）　Ｐｌａｓｍｉｄ　１１：２０６−２２０）の複製および安定化領域、形質転換した細菌のための選択性マーカーとしてＴ　ｎ　５　（Ｂｅｒｇ他、（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｔ、　Ｕ、Ｓ、＾、　７２：３６２８−３６３２）由来の細菌ＮＴＰＭＩ遺伝子（カナマイシン耐性）、オクトピンＴｉプラスミドｐＴｉＡ６のＴ−ＤＮＡ左側境界フラグメントおよびｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ他（Ｐｌａｎｔ　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、　（１９８５）　５：１４９−１５４）が記述したＴｉＡｃｈ５から誘導される右側境界フラグメントを含んでいる。これらの境界の間に、ｐＵｃ１８から誘導される制限エンドヌクレアーゼ部位５ａｌｌおよびＡｓｐ　７１８と一緒に、大腸菌１ａｃＺ　ａ−相補セグメント（ＶｉｅｒｉａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６７）が存在している。除草剤スルホニル尿素（ＳＵ）耐性を示すアセトラクテート（ＡＬＳ）キメラ遺伝子を含んでいる４、５ｋｂのＡｓｐ　７１８−５ａ　Ｉ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＭＬ２から入手して、プラスミドｐＺＳ９４にのＡｓｐ　７１８−３ａ１１部位１こクローン化した。このキメラＡＬＳ遺伝子は、ｌ１ａｒｐｓｔｅｒ他（ｉｌｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８８）　２１２：１８２−１９０）が記述したＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター／Ｃａｂ２２Ｌ　Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−Ｎｃｏｌフラグメント、およびＳＵ耐性形態のＡＬＳをコード化するように変異させたアラビドプシスＡＬＳコーディング配列と３゛非コーディング配列（Ｍａｚｕｒ他（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５：１１１０−１１１７）を含んでいた。部位に特異的な変異誘発で導入した変異は、Ｌｅｅ他、（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、　５：１２４１−１２４８に記述されてＬするタノ〈コＳＵ耐性Ｈｒａ遺伝子内に存在している変異である。その得られるプラスミドをｐＡＷ２５と表示した。

凍結／解凍方法（ｌｌｏｌｓｔｅｒｓ他、（１９７８）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６３：１８１−１８７）を用い、弱毒性アゲロバクチ１功ム菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４　（Ｈｏｅｋｅｍａ他、（１９７３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：１７９−１８０）の中に、胚１こ特異的なり一コングリシニンプロモーター・センス配列同定番号１のキメラ遺伝子を含んでいるバイナリ− ベクターｐＡＷ２５を形質転換した。

無菌培地を取り扱う標準的無菌技術を用いてアグロバクテリウムと共培養することによって、アラビドプシスの種培養物の形質転換を行い、そして全ての転移で薄層流フードを用いることを含む無菌植物／細菌培養に従った。この培養培地の組成を表８に挙げる。特に明記されていない限り、植物組織培養では２５ｘ１００ｍｍのベトリ皿を用いた。特に明記されていない限り、蛍光とｒＧｒｏ　ａｎｄ　５ｈｏＪ植物光（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を混合した一定照射下２３℃で植物組織培養物のインキュベーションを行った。Ｔ−ＤＮＡホモ接合変異体系統３７０７　（アラビドプシス・グリアナ（Ｌ、　）　Ｈｅｙｎｈ、地方に特徴的な品種ｆａｓｓｉｌｅｗｓｈｉ　ｊａ）のインビトロ根培養を開始させる目的で、この変異体系統の種子を、ＳＤＳが０゜１％入っている５０％Ｃｈｌｏｒｏｘ溶液内で１０分間殺菌し、無菌ｄＨ１０で３から５回濯ぎ、無菌濾紙上で完全に乾燥させた後、２−３個の種子を、２５０ｍＬのＢｅ１ｃｏフラスコの中に入っている液状Ｂ５培地の中に植えた。これらのフラスコにキャップを付け、７７０−８Ｏｒｐのロータリーシェーカーの上に置いて３−４週間インキュベートした。アグロバクテリウムを接種するに先立って、カルス誘発培地（ＭＳＫｉ　ｇ）上で根組織を培養した。そのＢｅ１ｃｏフラスコからその根集団を取り出すことによって根の収穫を行い、これをペトリ皿の中に入れた後、ピンセットを用いて根の小さい束をその根集団から引っ張り出して、それらをＭＳＫ１ｇ培地の上に置いた。ペトリ皿をフィルターテープで密封して４日間インキュベートした。

プラスミドｐＡＬ４４０４とｐＡＷ５０を有するアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４を、カナマイシンが２５ｍｇ／Ｌとリファムピシンが１００ｍｇ／Ｌ入っている５ｍＬのＹＥＢブロスの中で増殖させた。この培養物を、２８℃に維持されているＮｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋプラットフォーム振とう器（２２５ｒｐｍ）の中に入っているガラス培養管中で約１７−２０時間増殖させた。前培養した根を切断して０．５ｃｍの断片を生じさせ、これを、Ｔｒｉ−Ｐｏｕｒビーカー（ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｓａｎ　ＦｒａｎｃｉｓｃｏＳＣＡ　ＵＳＡ）およびペトリ皿の中にセットしたワイヤーメツシュから作成した１１００ａのフィルターの中に入れた。アグロバクテリウムの一晩培養物の１：２０希釈液３０３０−５Ｏの中で数分間、定期的に穏やかに混合しながら、根断片への接種を行った。接種した根を無菌濾紙に移すことで、この液体の大部分を排出させた。

数本の根断片から成る根の小さい束を、１００μＭのアセトシリンボン（３°、５°　−ジメトキシ−４゛−ヒトｏ　キ’、ｉ　７　セトーフェノン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、　ＩＩ、ＵＳＡ）が入っているＭＳＫｉｇ培地上に置いた。ペトリ皿をパラフィルムまたはフィルターテープで密封して２から３日間インキュベートした。

感染後、根断片を濯ぎ、そして抗生物質が入っている発芽誘発培地に移した。根の束を１００μｍのフィルターユニット（上に記述した）の中に入れて、３０３０−５Ｏの液状ＭＳＫｉｇ培地で濯いだ。このフィルターをその溶液内で激しく振とうすることにより、奇麗なベトリ皿に移行させるアグロバクテリウムの除去を補助し、そして再び濯いだ。根を無菌フィルターペーパー上にプロットし、そして根の束を、５００ｍｇ／Ｌのヴ７ンコマイシンと１０もしくは２０ｐｐｂのクロルスルフロンが入っているＭＳｇ培地の上に置いた。プレートをフィルターテープで密封して１２から１４日間インキュベートした。

約２−３週間で緑色の小結節と小さい発芽原基が見られるようになってきた。これらの外植片をそのまま放置するか、或は多数の片に破壊して、２００−３００ｍｇ／Ｌのヴアンコマイシンと１０もしくは２０ｐｐｂのクロルスルフロンが入っている０Ｍ培地上に置くことで、さらなる発芽発生を生じさせた。プレートを２枚のテープで密封するか或はフィルターテープで密封した。個々の発芽が発生するにつれて、これらをそのカルスから単離して１００ｍｇ／Ｌのヴアンコマイシンと１０もしくは２０ｐｐｂのクロルスルフロンが入っているＭＳＲｇ培地の上に置いた。上述した如く皿を密封して７から１０日間インキュベートした。次に、発芽を、２５ｘ１００のペトリ皿またはＭａｇｅｎｔａ　Ｇ７容器の中に入っているヴアンコマイシンが１００−２００ｍｇ／Ｌ含まれているＧＭ培地に移した。個々の容器に移した数多くの一次形質転換体（Ｔ１）が種子（Ｔ２）を生じた。

選択した推定形質転換体から１２種子を収穫して、クロルスルフロンが１０ｐｐｂ入っているＧＭ培地の上に植えた。プレートをフィルターテープで密封し、２日間以上４°Ｃで冷処理した後、上述した如き一定照射下２３℃で１０から２０日間インキュベートした。耐性（緑色、真の葉が発生）および感受性（真の葉が発生せず）として実生を評価した。

選択したクロルスルフロン耐性Ｔ２実生を土壌に移植して、６５−８０％相対湿度下、昼間（１６時間）２３℃夜間（８時間）１８℃で成熟させた。

２つの植物から得られる１２種子を成熟時に収穫して、Ｂｒｏｗｓｅ他（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８６）　１５２：１４１−１４５）が記述したのと本質的に同様にして、脂肪アシルメチルエステルのガスクロ分析により脂肪酸組成を個別に分析したが、ここでは、そのメチル化剤としてメタノール中２．５％のＨ，ＳＯ，を用いそして種子のトリグリセライド類のメタノール分解を行う目的でこれらのサンプルを８０℃で１．５時間加熱した。その結果を表７に示す。

表７形質転換した変異体３７０７の種子における脂肪酸パーセント種子サンプル　巧」　旦」　旦」　胆Ｊ　胆竪野生型（６）　６　４　１４　３０　１９変異体３７０７（６）　６　４　１４　４４　３２−５　ｔｏ　５　１９　９　５６２−６　ｔｏ　５　１７　１７　４８野生型および変異体系統３７０７が示す脂肪酸組成は６個の単一種子各々の平均を表している。植物１がら得られる種子を１−１か１−６で表示し、そして植物２から得られる種子を２−１から２−６で表示する。

２０：１および２０：２に関する量は示していない。このデータは、各植物における６個の種子の１つが変異体脂肪酸表現型を示す一方、その残りの種子は約５５％に及んで１０倍以上の１８＝３増加を示す。この増加の大部分は１８：２が失われることで生じる一方、これのいくつかはまた１８：１が失われることでも生じる。植物油におけるこのような高レベルのリルイン酸は、特に油作物、例えば亜麻で観察される。従って、この遺伝子を他の油作物、特にアラビドプシスと近い関係にあるカノーラの中で過剰発現させることによってもまたこのような高レベルの１８＝３がもたらされると期待される。

Ｂａｃｔｏ牛肉抽出液　５．０ｇ　ＩＰｋｇの、無スクロースムラシゲ・Ｂａｃｔｏ酵母菌抽出液　１．０ｇ　スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）ペプトン　５．０ｇ　最小有機物培地（Ｇｉｂｃｏ　＃５１０−３スクロース　５．０ｇ　１１８またはＳｉｇｍａ　８Ｍ６８９９）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ　１０ｍＬのビタミン補充寒天（任意）　１５．０ｇ　０．０５％ノＭ　Ｅ　３　０．５ｇ／ＬｐＨｏ、ｓ％の寒天　８ｇ／ＬＨ５０ｍｇ／Ｌのピリドキシン　１％のスクロース　１０ｇ／Ｌ５０ｍｇ／Ｌのニコチン酸２％のグルコース　２０ｇ／Ｌ　２％のグルコース　２０ｇ／ＬＯ，５ｍｇ／Ｌ（７）２．４−Ｄ　２．３＊Ｌ　Ｏ，１５ｍｇ／ＬノＩＡＡ　０．８６ｇ１１０．３ｍｇ／Ｌのキネチン　１．４ｓＭ　５、Ｏｓｇ／　Ｌの２　ｉ　Ｐ　２４．６ＩＩＭ５　ｍ　ｇ　／　ＬのＩＡＡ　２８．５ｇＭ２％のグルコース　２０ｇ／Ｌ１２ｍｇ／ＬのＩＢＡ　５８．８ｇ１ｌＯ，１ｍｇ／Ｌのキネチン　０．４６＋＋Ｍ実施例１０発生種子内のデルタ−１５デサチユラ一ゼ発現を低下させるためのブランカ・センス形質転換用ベクターの構築制限エンドヌクレアーゼ消化を用いたＤＮＡフラグメント操作の詳細な操作、アガロースゲル電気泳動によるサイズ分離、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメント単離、ＤＮＡフラグメントの連結、ＤＮＡフラグメントが有する切断末端の修飾、並びに円形ＤＮＡプラスミドを用いた大腸菌細胞の形質転換などは全て、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［分子クローニング、実験室マニュアル」、第２版（１９８９）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓおよび＾ｕｓｕｂｅｌ他、（１９８９）　ｒ分子生物学における現在のプロトコルＪ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、Ｊｏｈｎ　ｆｉｌｅｙ　＆　５ｏｎＳの中に記述されている。

Ｂ、センスの細胞質デルタ−１５デサチユラーゼおよびブラシカ・センスブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼをコード化するｃ　ＤＮＡの配列を、アンチセンス配向で、ダイズ貯蔵蛋白質Ｂ−コングリシニンのａ゛サブユニツト由来プロモーター領域の背後に位置させて胚に特異的な発現を高発現レベルで生じさせた。

デルタ−１５デサチユラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列をアンチセンス発現させるためのキメラ遺伝子構築の基本として働かせる目的で、胚に特異的な発現カセットを構築した。クローニングベクターｐＵｃ１８　（ＢＲＬ）内のＨ４ｎｄｌ１１部位に、ダイズ（グリシン・マックス）由来の５５５個の塩基対から成るＢ−フングリシニン（７ｓ種子貯蔵蛋白質のａ°サブユニット）、６−コングリシニン５゛非翻訳領域に続いて、ＮｃｏＩ、Ｓｍａ　Ｉ、ＫｐｎｌおよびＸｂａＩのための制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる多重クローニング配列、そして次に、１１７４個の塩基対から成る共通豆ファセオリン３゛非翻訳領域を挿入することによって、ベクターｐｃＷ１０９を作り出した。このＢ−コングリシニンプロモーター配列は、２７ヌクレオチド位置が異なっていることから、公開されたＱ−］ングクリニン遺伝子（Ｄｏｙｌｅ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ■ 、　（１９８６）　２６１：９２２８−９２３８）’の対立遺伝子を表している。さらなる配列記述はＳｌｉｇｈｔｏ禦（Ｗ０９１／１３９９３）の中に見付は出され得る。ファセオリンの３°非翻訳領域の配列はＳｌｉｇｈｔｏｍ他、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ、８０：１８９７−１９０１ノ中ニ記述サレテイル。

アンチセンス構築で用いるのを容易にする目的で、このプラスミドｐＣＷ１０９内のＮｃｏ１部位および可能な翻訳出発部位をＮｃｏ　Ｉを用いた消化で壊し、ムングビーンエキソヌクレアーゼ消化およびその平滑断端部位の再連結により、その修飾されたプラスミドｐＣＷ１０９Ａが得られた。そのＢ−コングリシニンプロモーター配列とそのファセオリン３′配列との間をＳｍａ　ｒを用いて消化してｐｃＷ１０９Ａを開くことで、これらのデルタ−１５デサチユラ一ゼ配列をコード化する平滑断端ｃＤＮＡ配列フラグメントが連結反応で挿入するのを可能にした。配列同定番号６に記述するｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド２０８から１３３６を含んでいるプラスミドｐＢＮＳＦ３から、この細胞質デルター１５デサチュラーゼの平滑断端フラグメントが得られた。Ｈｉｎｄｌｌｌを用いた消化で配列同定番号６の塩基６８２から６８７の所にあるＨ４ｎｄｌｌ１部位を除去し、クレノーで平滑にした後、再連結させることによって、ｐＢＮＳＦ３の修飾を行った。この得られるプラスミド［ｐＢＮＳＦ３　（−Ｈ）］をＥｃｏＲＩおよびｘｈＯＩで消化させることによってデルタ−１５ｃＤＮＡフラグメントを放出させ、全ての末端をクレノーで平滑にした後、この１．２ｋｂのコーディング領域をゲル単離で精製した。この１，２ｋｂのフラグメントを、上述した如＜　Ｓｍａ　ｒで切断したｐｃＷ１０９Ａの中に連結させた。このコーディング領域がアンチセンス配向である場合そのデルタ−１５デサチユラーゼコーデイング領域およびそのベクター内のそのΩ−コングリ７ニンプロモーターに対する５°を切断するＡａｔ＋を用いて消化すると１．４ｋｂのフラグメントが放出されることを用いて、そのローフングリノニンプロモーターに関するその挿入したｃＤＮＡのアンチセンス配向を立証した。このアンチセンス構築物にｐｃｃＦｄＲｌの名称を与えた。

Ｈ４ｎｄｌｌｌ消化により、ｐｃｃＦｄＲｌから転写ユニット［０−コングリシニンプロモーター：アンチセンスデルタ−１５デサチュラーゼ：）７セオリン３ °末端］を放出させ、単離した後、予めまたＨｉｎｄｌｌｌで消化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結させることで、プラスミドｐＣＣＦｄＲ２が得られた。

この構築物は、消化させたユニークなりａｍＨｌおよび５ａ１１部位を有している。その３ｋｂの転写ユニットを単離し、以下に記述するｐＺ１９９内のＢａｍＨＩおよび５ａ１１部位にクローン化することで、バイナリ−ベクターｐＺＣＣ３ＦｄＲが得られた。この指向性クローニングで得られる配向は、同じ方向でその右側境界ｔＤＮＡ配列に向かってその選択性マーカー遺伝子とデルタ−１５アンチセンス遺伝子両方の転写が行われる配向と同じである。

プラスミドｐＢＮＳＦＤ−８の中に含まれている配列同定番号８の４２５個から成る最大３°塩基を用いて、ブラスチドのデルタ−１５デサチユラーゼを基とするアンチセンス構築物を作り出した。ｐＢＮＳＦＤ−８は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内のプラスチドデルター１５デサチュラーゼのＣＤＮＡを表している。ＸｈｏｌおよびＳｍａｌを用いた消化でｐＢＮＳＦＤ−８からこのｃＤＮＡ挿入断片を取り出し、これらのフラグメントの断端を平滑にし、そしてゲル精製でその４２５個の塩基から成る挿入断片を単離した。この単離したフラグメントをｐｃＷ１０９ΔのＳｍａ１部位にクローン化し、そしてＰｓｔＴを用いたこのプラスミドの消化により、その選択したクローンのアンチセンス配向を立証した。このブラスチドのデルタ−１５配列およびそのｐｃＷ１０９Ａベクター内の、そのＢ− コングリノンプロモーターに対する５°をＰｓｔｌが切断することにより、このアンチセンス配向の指示となる１、２ｋｂのフラグメントが放出される。この構築物を含んでいるプラスミドをｐＣＣｄＦｄＲｌと呼ぶ。

Ｈｉｎｄｌｌｌを用いたｐｃｃｄＦｄＲｌの消化により、ソノ転写ユニット［Ｂ −コングリシニンプロモーター；ブラスチドデルター１５デサチュラーゼ：３° −ファセオリン配列］を含んでいる２、３ｋｂのフラグメントを取り出す。このフラグメントをゲル単離した後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化した。このフラグメントの配向がそのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのクローニング領域内のＢａｍＨ１部位に関係していることを、上述した如きＰｓｔｌを用いた消化で立証した。その５ａｌｌ含有末端に向かうプロモーターと同じ配向のクローンを選択して、ｐＣＣｄＦｄＲ２の名称を与えた。

ＢａｍＨＩと５ａｌｌを用いてｐＣＣｄＦｄＲ２を消化させ、ソノ放出されるフラグメントをゲル単離した後、予めＢａｍＨＴと５ａｌＩで消化させたｐＺ１９９に連結させることで、ノくイナリーベクターｐＺＣＣｄＦｄＲが得られた。

バイナリ−Ｔｉプラスミドベクター系（Ｂｅｖａｎ、　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１２：８７１１−８７２０）を構築することにより、アグロノくクテリウム・′ンメファシエンスを用いて植物の中にそのトコングリシニンプロモーター支配下のアンチセンスデルタ−１５デサチユラーゼ構築物を形質転換するためのベクターを作り出した。これらの系で用いるための出発ベクター（ｐＺｓ１９９）は、（１）形質転換した植物細胞のための選択性マーカーとしてのキメラ遺伝子ツバリンシンターゼ／ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｂｅｖａｎ他、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４：１８４−１８６）、（２）Ｔｉプラスミドが有するＴ−ＤＮＡの左側および右側境界（Ｂｅｖａｎ、（１９８４）　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：８７１１−８７２０）、（３）ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ。

ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ’Ｉ　Ｉ　Ｉおよび５ａｉｌのためのユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を有する大腸菌１ａｃＺ　ａ−相補セグメント（Ｖｉｅｒｉａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６７）、（４）シュードモナスのプラスミドｐｖｓ１由来の細菌複製開始点（Ｉｔｏｈ他、（１９８４）　Ｐｌａｓｍｉｄｌｌ：２０６−２２０）および（５）形質転換したＡ、ツメファシェンスのための選択性マーカーとしてのＴｎ５由来細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｒｇ他、（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｎｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、＾。

７２　：３６２８−３６３２）を含んでいるベクターを基としている。この植物選択性マーカー内のツバリンシンターゼプロモーターを、標準的制限エンドヌクレアーゼ消化および連結反応方策により、３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ他、（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０−８１３）で置き換えた。この３５８プロモーターは、以下に記述する如きブラシカ・センスの形質転換を効率良（行うに必要である。

実施例１１ブラシカ・センスのアグロバクテリウム介在形質転換凍結／解凍方法（ｌｌｏｌｓｔｅｒｓ他、（１９７ｇ）　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１６３：１８１− １８７）を用いてアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４　（Ｈｏｅｋｅｍａ他、（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ　３０３：１７９−１８０）にバイナリ−ベクターｐＺＣＣ３ＦｄＲとｐＺＣＣｄＦｄＲを転移させた。

適当なバイナリ−ベクターを含んでいる弱毒性（ｄｆｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリウム・ツメファシェンス株ＬＢＡ４４０４と一緒に実生片を共培養することにより、ブランカ・センスのカルチバーｒＷｅｓｔａｒＪの形質転換を行った。

１０％Ｃｈｒｏｒｏｘ、０．１％ＳＤＳ内で３０分間Ｂ　センス種子を殺菌した後、無菌蒸留水で完全に濯いだ。３ＱｍＭのＣａＣ１，と１．５％の寒天が入っている無菌培地の上でこれらの種子を発芽させ、そして２４℃の暗所で６日間成長させた。

植物形質転換用のアグロバクテリウム液状培養物を、カナマイシンが１００ｍｇ／Ｌ入っている最小Ａ培地中２８℃で一晩増殖させた。遠心分離でこれらの細菌細胞をペレット化した後、１ｍＬ当たり１０８個細胞の濃度で、アセトシリンボンが１００μＭ入っている液状Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ最小有機物培地内に再懸濁させた。

Ｂ、センスの実生胚軸を切断して５ｍｍ断片を生じさせ、これらを直ちに上記細菌愛濁液の中に入れた。３０分後、これらの胚軸片をその細菌督濁液から取り出して、アセトシリンボンが１１００ＩＩ入っているＢＣ−１２カルス培地上に置いた。この植物組織とアグロバクテリウムを鈍い光の中で３日間２４°Ｃで共培養した。

そのアグロバクテリウムを死滅させるためのカルベニ７リンが２００ｍｇ／Ｌと形質転換した植物細胞増殖を選択するためのカナマイシンが２５ｍｇ／Ｌ入っているＢＣ−１２カルス培地にその胚軸片を移すことにより、その共培養を停止した。連続光下２４℃で３週間、その実生片を上記培地上でインキュベートした。

３週間後、カルベニンジンが２００ｍｇ／Ｌおよびカナマイシンが２５ｍｇ／Ｌ入っているＢ５−４８再生用培地にこれらの片を移した。植物組織を、上記カルス培地に関して記述したのと同じ培養条件下の新鮮な選択再生用培地上で２週間毎にサブ培養した。形質転換したと推定されるカルスは、再生用培地上で急速に成育し、モしてカルスの直径が約２ｍｍになった時点で、これらをその胚軸片から取り外して、カナマイシンが入っていない同じ培地上に置いた。

Ｂ５−４８再生用培地に移した後数週間以内に発芽が見え始める。これらの発芽が区別できる程の軸を生じた後直ちに、これらをそのカルスから切除し、ＭＳＶ −ＩＡ伸長用培地に移し、そして２４℃の１６＝８時間から成る昼／夜光周期に移行させた。

発芽が伸びていくつかの箱間が生じた時点で、これらを寒天表面上で切断し、そしてその切断した末端をＲｏｏｔｏｎｅの中に浸漬した。処理した発芽を直接湿ったＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ　３５０土壌なしポット培地に植えた。このポットをプラスチック製バッグで覆い、そしてこれらの植物が明らかに成長した時点、即ち約１０日後それを取り外した。

昼の温度を２３℃にしそして夜の温度を１７℃にした１６：８時間から成る昼／夜光周期で植物を成育させた。−次間花軸が伸び始めた時点で、メツシュが付いた花粉封じ込め用バッグで覆って、異系交配が生じるのを防止した。１日に数回これらの植物を振とうすることで、自己授粉が生じるのを容易にした。自己授粉で生じる種子を、植えた後約３カ月で収穫した。

表呈蒸留水の中に、１０、５ｇの二塩基性燐酸カリウム　１リツトル当たり４．５ｇの一塩基性燐酸カリウム　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ最小有機１、Ｏｇの硫酸アンモニウム　物培地（ＭＳ塩、１（ｌｈｇルのｉ−イ０．５ｇのクエン酸ナトリウム　ノシトール、０．４■ｇ／Ｌのチアミニ水化物を溶解させた後、蒸留水テン；　ＧＩＢＣＯ＄５１０−３１１８）で９７９ｍＬにし、オートクレーブに　３０ｇのグルコースかけ、濾過滅菌した１０％スクロース　１８ｇのマンニトールを２０ｍＬ加え、濾過滅菌したＩＭの　１．０ｍｇ／Ｌの２．４−ＤＭｇＳＯ，を加える。　３．０■ｇ／Ｌのキネチン０．６％のアガロースｐＨ５，８ブラシカ再生用培地Ｂ５−４ｇ　ブラシカ発芽伸長用培地ＭＳＶ−ＬＡムランゲ６スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ最小有機ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）最小有機物培地ガン　物培地Ｇａ＋ｓｂｏｒｇ　Ｂ５ビタミン類ボルグ（Ｇａｓｂｏｒｇ）　Ｂ５ビタミン類　１０ｇのスクロース（ＳＩＧＩＩＡ　＄１１０１９）　０．６％のアガロース１０ｇのグルコース　ｐＨ５，ｇ２５ｈＨのキシロース６００ｉ＋ｇのＭＥＳ０１４％のアガロースｐＨ５，７濾過滅菌しそしてオートクレーブにかけた後下記を加える：２、０ｍｇ／Ｌのゼアチン（ｚｅａｔｉｎ）０．１ｍｇ／　Ｌの　ＩＡＡ実施例１２形質転換したブラシカ・センス植物の分析実施Ｐｉ５に記述したように形質転換した植物の葉組織をＤＮＡ源として用いたサザン分析により、損傷を受けていないアンチセンス転写ユニットが挿入されたことを立証した。１ｉＤＮＡの１０ミクロダラムを、ＢａｍＨＩと５ａｌｌ制限エンドヌクレアーゼの混合物で完全消化させた後、アガ叶スゲル電気泳動で分離した。この分離したＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ　Ｈ’膜に転移させた後、放射能標識したｐＢＮＳＦ３−２由来挿入断片にハイブリッド形成させた。ゲノム１個当たり１および５８のコピーに相当している標準量のｐＢＮＳＦ３−２を用いて各サンプル平均の目盛り付けを行い、そしてこれらの標準から生じるオートラジオグラフィーシグナルの強度と、内在性デルタ−１５デサチユラーゼシグナルと、その挿入した遺伝子のシグナルとが示す強度を比較することによって、その挿入されたトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）のコピー数を見積もった。今日までに、３８個の独立した形質転換体をその遺伝子の存在に関して分析し、そして３６個が陽性であると確認した。

０．５ｍＬのメタノール系ｉ１．Ｓｏｎ　（２，５％）内で直接個々の種子をエステル交換するが、或はバルクの種子サンプルをヘキサン抽出した後、メタノール中１％のナトリウムメトキサイド０．８ｍＬの中で一定分量をエステル交換することにより、カノーラ種子の中に存在している最も豊富な５種の脂肪酸の相対的含有量を測定した。等しい体積の水を加えると、脂肪酸メチルエステルはそのメタノール系溶液から抽出されてヘキサン溶液に移行した。

１８：３脂肪酸の相対的含有量は、種子発生が生じている間有意に変化する。低い度合であるが、１８：３対１８：２の比率も変化する。従って、意味のあるデータは、成熟して乾燥して落ちた後の種子から得られるデータのみであり得る。

更に、環境上の因子、生に温度により、全脂肪酸含有量に対する１８．３の比および１８：０に対する１８：３の比も有意に変化する。この状況における最も適当な対照は、サザン分析で試験してそのアンチセンスデルタ−１５トランスジーンを含んでいない形質転換系統である。乾燥種子に到達した最初の５種の形質転換体がら得られる分析値を以下の表１０に示す。ハンドセラシャー（ｈａｎｄ　ｔｈｅｓｈｅｒ）を用いて種子を収穫し、重量を測定して、１．５ｇ（約３００個の種子）サンプルを採取した。各形質転換体から得られる種子を乳鉢と乳棒で粉砕し、約５０℃のへキサン８ｍＬを用いて４回抽出した。これらの抽出液を一緒にしてその体積を５ｍＬにまで小さくした後、５０ミクロリツトルの一定分量を２つ採取して、上述した如きエステル交換を行った。２２０℃の等温で運転されているＯｍｅｇａｗａｘ　３２０カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ　ＩｎＣ１，０，３２ｍｍ内径Ｘ３０ＬＴ）使用ガス−液クロを用い、各注入の間で２６０℃にまで上げることにより、脂肪酸メチルエステルの分離を行った。

ｐＺｃｃ３ＦｄＲ−９１６，２０，３９０ｐＺｃｃ３ＦｄＲ−８１５，９０，３３１ｐＺＣＣ３ＦｄＲ−１５６，（１０，３１１！　２ｐＺＣＣ３ＦｄＲ−１１５，６０，３４１ｐＺＣＣ３ＦｄＲ−１４８１１１，２０，４０２４種の形質転換系統と系統９２との間の差は非常に小さいが、しかしながら、系統８１と９１の間の１８＋３／１８：２比の差は有意であることを試験する目的で、各系統から得られる個々の種子２５個をエステル交換して、それらの脂肪酸組成を測定した。系統８１に関する平均比は０．３４５であり、その変動係数は１１．６％であったが、系統９１に関する平均値は０．３７５であり、その変動係数は８．０％であった。

５ｔｕｄｅｎｔの【試験を用いた時のサンプル平均は０．０１％のレベルで有意に異なっている。

実施例１３発生種子におけるデルタ−１５デサチユラ一ゼ発現を低くするためのグリシン・マックス形質転換用ベクターの構築上の実施例１０に記述したベクターｐｃＷ１０９八を用いて、Ｂ−コングリシニンプロモーター支配下のアンチセンスＧ、マックスプラスチドデルタ−１５デサチユラ一ゼｃＤＮＡ配列を構築した。以下に記述するダイズの形質転換系における使用では、適当な選択性マーカー発現系と一緒に転写ユニットをベクターの中に入れた。この出発ベクターは、Ｂｅｃｋ他、（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：３２７−３３６の中に記述されているネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を引き起こす５０８Ｄと表示されティる［Ｈｅｒｓｈｅｙ　（ＷＯ９０１１３６１）に記述されている］組織に特異的でない構成プロモーターに続く、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ他、（１９８２）　Ｊ、＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、　１：５６１−５７４に記述されているヌクレオチド８４８から１５５０を含むツバリンシンターゼ遺伝子の３′末端を含んでいるｐＭＬ４５であった。この転写ユニットを市販のクローニングベクターｐＧＥＭ９Ｚ　（ＢＲＬ）に挿入し、そして制限部位５ａｌｌ、Ｘｂａｌ、ＢａｍＨｌおよびＳｍａＩをこの順で用いて、５０８Ｄプロモーターの５°末端に隣接させる。

追加的５ａ１１部位を、Ｎ０Ｓ３°配列の３゛末端に存在させ、そしてこのＸｂａｌ、ＢａｍＨＩおよび５ａｌＩ部位はユニークである。

ＨｉｎｄＩｌｌを用いた消化によりＩ）ＣＷ１０９Ａからユニット［１３−コングリシニンプロモーター：クローニング領域：ファセオリン３゛末端コを取り出し、それらの末端を平滑にした後、１．８ｋｂのフラグメントを単離し、そして上記単離したフラグメントをｐＭＬ４５のＳｍａ１部位に連結させることによって、発現カセットｐＣ８Ｔが得られた。

この５０８Ｄプロモーターと同じ配向にＢ−コングリシニンプロモーターを有するクローンを、Ｘｂａｌを用いた消化で選択した。配向が適当である７００ｂｐのフラグメントが放出される。このベクターカセットをｐｃｓＴと呼ぶ。

このダイスのプラスチドデルター１５デサチュラーゼをコード化する２、２ｋｂの挿入断片を、ＨｉｎＰＩを用いた消化でそのプラスミドｐＸＦＩからサブクローン化して、約１ｋｂの無関係なｃＤＮＡを除去した。ＨｉｎＰＩは、そのｃＤＮＡ挿入断片内の、そのデルタ−１５デサチユラーゼのためのｃＤＮＡの５°末端に非常に近い所を切断すると共にこのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３°末端から約３００ｂｐの所を切断する。このＣ１ａｌに適合性を示す末端を、Ｃ１ａｌで消化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化し、モしてＰｓｔｌを用いた消化で９００ｂｐのフラグメントが放出されることを基にして、このｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔクローニング領域内のＥＣｏＲＶ部位にそのｃＤＮＡの５′末端が向いているクローンを選択した。このサブクローン化したプラスミドをｐＳ３Ｆｄ　ｌと呼ぶ。

ＨｉｎｃＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いた消化により、ｐｓ３Ｆｄｌからそのデルタ−１５コ一ド化配列を取り出し、２．２ｋｂフラグメントをゲル単離した後、そのｐｃｓ”ｒ１内のその開いたＳｍａ　１部位にクローン化した。Ｘｂａｌを用いた消化により、そのＢ−コングリシニンプロモーターに対してアンチセンス配向にそのデルタ−１５配列を有するクローンを選択した。このアンチセンス構築物は４００ｂｐの片を放出し、このクローンをｐｃｓ３ＦｄｓＴＩＲと表示した。

実施例１４体細胞のダイズ胚培養物の形質転換１６：８時間の昼／夜スケジュールで蛍光と白熱発光を混合して用い、２８℃で、ロータリー振とう器（１５０ｒｐｍ）の上に置いた３　５ｍＬの液状培地（ＳＢ５５または５ＢＰ６）の中に、ダイス胚形成懸濁培養物を維持する。３５ｍＬの液状培地に約３５ｍｇの組織を接種することによって４週毎に培養物のサブ培養を行った。

粒子ガン衝撃方法（Ｋｌｉｎｅ他、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２７：７０）により、ｐｃｓ３ＦｄｓＴＩＲを用いてダイスの胚形成懸濁培養物の形質転換を行った。これらの形質転換てはＤｕ　Ｐｏｎｔ　Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ　ＰＤＳ１００Ｏ／ＩＩＥ装置（ヘリウムレトロフィツト）を用いた。

６０ｍｇ／ｍＬの１ｍｍ金粒子督濁液の５０ｍＬに、（次の順で）５μＬのＤＮＡ　（１Ｍｇ／μＬ）　、２０ａＬのスペルミジン（０，１Ｍ）および５０μＬのＣａＣ１２（２，５Ｍ）を加えた。この粒子調合物を３分間撹拌し、ミクロフユージ内で１０秒間高速回転した後、その上澄み液を除去した。次に、このＤＮＡがコートされている粒子を４００μＬの７０％エタノール内で一度洗浄した後、４０ｕＬの無水エタノール内に再懸濁させた。このＤＮＡ／粒子懸濁液の各１秒間音波処理を３回行った。

次に、このＤＮＡがコートされている金粒子の５μＬを各マクロ担体盤の上に置いた。

４週間才の懸濁液培養物の約３００−４００ｍｇを、空の６０Ｘ１５ｍｍペトリ皿の中に入れ、そしてピペットを用いて、その組織から残留液を除去した。各形質転換実験で、約５−１０枚の組織プレートに通常衝撃を与えた。膜崩壊圧力を１０００ｐｓｉにセットし、そして２８インチ水銀の真空に至るまでそのチャンバの排気を行った。この組織を、その保持用スクリーンから約３．５インチ離して位置させて３回衝撃を与えた。衝撃を与えた後、この組織を液体の中に戻して、上述した如く培養を行った。

衝撃後１１日で、この液状培地を、ヒグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）が５０ｍｇ／ｍＬ入っている新鮮な５Ｂ５５と交換した。この選択性培地を週毎に新しくした。衝撃後７週間で、緑色の形質転換した組織が、形質転換していない壊死した胚形成りラスターから増殖して来るのが観察された。分離している緑色の組織を取り出して、個々のフラスコに接種することにより、新しいクローン的に繁殖する形質転換した胚形成懸濁培養物を生じさせる。このように、新しい系統の各々を独立した形質転換出来事として処理した。次に、これらの懸濁液をサブ培養により未成熟発生段階中のクラスター状胚懸濁液として維持するか、或は成熟させることによって全植物に再生させて個々の体細胞胚を発芽させてもよい。

形質転換した胚形成りラスターを液状培養物から取り出して、ホルモンまたは抗生物質が全く含まれていない固体状寒天培地（Ｓ　Ｂ　１０３）の上に置く。１６：８時間の昼／夜スケジュールで蛍光と白熱発光を混合して用い、２６°Ｃで８週間胚を培養した。この期間の間、これらのクラスターから個々の胚を取り出して、胚発生の種々の段階における分析を行った。８週間後、これらの胚は発芽に適切になる。

表１１培地：５Ｂ５５および５ＢＰ６ストツク溶液（ｇ／Ｌ）　：　Ｂ　５ビタミンストックＭＳ硫酸塩の１００Ｘストツク　１０ｇのｍ−イノシトール１！ｇｓＯ４・７１１□０　３７．０　１００ｍｇのニコチン酸１ｌｌｎｓＯ４・ｎ２ｏ　１．６９　１００ｍｇのピリドキシンＨＣｌＺｎ５Ｏ＜”７Ｈ２００，８６１ｇのチアミンＣｕＳＯ４”５Ｔ１２０　０．００２５　３　Ｂ　５５　（１リツトル当たり）ＭＳハロゲン化物の１００Ｘストツク　ｌＱｍＬの各ＭＳストックＣａＣｌ２ ”２Ｒ２０４４，０１ｍＬのＢ５ビタミンストックＫＩ　Ｏ，０８３０，８ｇのＮＨ４ＮＯ。

ＣｏＣｌ２・６ＪＯＯ，００１２５３，０３３ｇのＫＮＯ３ＫＨ２ＰＯ４１７，Ｑ　ＩＢＬの２　、４−　Ｄ　（１０ｍｇ／　ｍＬの１４３ＢＯ３０，６２ストック）Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２００，０２５６０ｇのスクロースＭＳ　ＦｅＥＤＴＡの１００ｘストツク　０．６６７ｇのアスパラギンＮａ、ＥＤＴ＾　３．７２４　ｐＨ５，７ＦｅＳＯｎ”７ｔｌｚ０　２．７８４　５ＢＰ６Ｔ：は２．４−Ｄを０．５＋ｏＬ１．：置き換える５Ｂ１０３（１リツトル当たり）ＭＳ塩６％のマルトース７５０ｍｇのＭｇＣｌ２０．２％のＧｅ１ｒｉｔｅ形質転換したグリシン・マックス植物の分析ダイズの体細胞胚は、実施例１４に記述したように液状培養物内の小球胚状態にある間、成熟している接合ダイズ胚に典型的な非常に少ない量でトリアジルグリセロールまたは貯蔵蛋白質を含んでいる。この発生段階における全トリアジルグリセライドと全極性脂質（ホスホリピッド類およびグリコリピッド）の比は、体細胞胚培養を始める発生段階における接合ダイズ胚に典型的なように約１・４である。小球段階でも同様に、重要な種子蛋白質（Ｂ−コングリシニンのａ°サブユニット、Ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害剤ＩＩＩおよびダイズ種子レクチン）のためのｍＲＮＡは本質的に存在していない。実施例１４に記述したように、ホルモンが入っていない培地に移して、成熟する体細胞胚状態に分化させると、トリアジルグリセロールが最も豊富な脂質群になる。同様に、Ｂ−コングリシニンのａ°サブユニット、Ｋｕｎｉｔｚ　トリプシン阻害剤ＩＩＩおよびダイズ種子レクチンのためのｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団の中で最も豊富なメツセージになる。これに関して、この体細胞ダイズ胚系は、インビボにおいて、成熟する接合ダイズ胚に非常に類似した挙動を示し、従ってこれは、脂肪酸生合成経路における遺伝子発現修飾が示す表現型効果を分析するに良好で迅速なモデル系である。別の油種子作物であるナタネ（Ｔａｙｌｏｒ他、（１９９０）　Ｐｌａｎｔａ　１８１：１８−２６）でも、同様な体細胞胚培養系が示されておりそして用いられている。実施例１２に記述したように、その組織源として単一の胚を用いて脂肪酸分析を行った。系統２８７２（ｐＣ３Ｔで形質転換した対照組織）、および系統２９９，３０３，３０６および３０７（プラスミドｐｃｓ３ＦｄｓＴＩＲで形質転換した系統２８７２）由来の数多くの胚を脂肪酸含有量に関して分析した。ｐＣ３３ＦｄＳＴＩＲで形質転換した組織から採取した胚が示す相対的脂肪酸組成を、ｐｃｓＴで形質転換した対照組織と比較した。この分析結果を表１２に示す。

系統　胚　二　−ｎ２　五　４３０３−７−１　１　１＜、１　２．２　１０．６　５９．）　１３ｊ２　１４．０　２．Ｂ　、１２．５　５９，３　１１．４３０６−４−５　１　１７．５　４゜２　’ｆ１．ｌ　６２゜７７．４２１５・７３・３　９．０　６０゜５　１１．５３　１７．１　３．＜　９．３　６０．’７　９．５４　１５、Ｖ　３．８　９．２　Ｇ１．２　９．７Ｓ　１７ｊ、３．９　６．５　ＳＣ２１３，６６ユ６．６　３．＜　１０．２　５９．２　１０．６３０６−４−６　１　１６．６　３，９　１５．３　５０．７１１．８２　１７・ｆｌ　３．６　１５．７　５０，０　１０．Ｂ３　１６．７　３．３　１１．ユ　５２．０　１４．６４　１９．０　４．０　１０．３　５３，１　１２．３Ｓ　１９ｊ　３．５　９．０　５３．６　１３．０６　１！１．ｏ　２．９　１３，１　５２．８　１０．９３０７−１−１　１　１４．４　３．７　１１２　６４．４　６．３２　１５、＜　３．４　７．８　６１．０　１１．３３　１７．２　２．５　１２．０　５７ｔ２　１１．１３０′７−１−２１１３．４３．０８．４５５，４１９．９２　１６−３　３．１　６，４　５５．７　１８．７１　１４．０　３．３　Ｂ、Ｉ］　ＳＢ、１　１５．２＜　１５．８　２．５　９．ｅ　５９ｊ　１２．２Ｓ　１＜、６　３．７　１４，９　５１．１　１５，７１４．３　３．９　ユ１．４　５５．５　１４　１３　１８ｊ　２．６　６，８　５３．０　１９．０系統　胚　−二」　二　ニー　■− ３０７−１−７　１　１５．３　３，５　１２．ｓ　ｆｉｏ、３　・　Ｂ−５３１４，９３，１，１２，２５Ｂ、０　１１．１！３０７−！−９ユ１６．＜２．９２３．２４７．９９．６２　１９．６　０．０　２０．＜　５１．３　Ｂ、８３　１６、ｆｌ　３．３　２４．６　４９．６　５．７３０７−１−１ユ　ｌ　１１１．１　３．６　５，７　５２．９　１９．７対照胚の平均１８：３含有量は１４，５％であり、その範囲は１１゜１％から１８．０％であった。形質転換した胚の平均１８：３含有量は１１．５％であり、その範囲は６．３％から１９．９％であった。これらの形質転換した胚の約８０％（３８／４８）が示す１８：３含有量はその対照平均よりも低かった。約４４％が示す１８：３含有量は、対照で観察された最小値よりも低く、そして１２．５％が示す１８：３含有量は、その対照平均値の半分以下であった（即ち７．５％未満）。形質転換した組織内で観察される最小１８：３含有量は、その対照の最小値が１１．１％であるのに比較して６．３％であった（２９９−１−３．３０７−１−２＃１）。全ての場合において、形質転換した組織における１８：３含有量の低下は、１８・２含有量が相当して増加することが反映されており、このことは、１８・２から１８＝３への不飽和化が低下したことを示している。他の残りの脂肪酸が示す相対的含有量は変化しないままであった。

ＢａｍＨＩで切断したｃＤＮＡを用い、実施例１２に記述したのと同様にして、単一の形質転換出来事由来の胚のグループを用いた以下に挙げる数多くの形質転換系統に関して、その導入したアンチセンス構築物が損傷を受けないで存在していることに関するサザン分析を実施した。

オートラジオグラム上のハイブリッド形成帯の数および強度から、おおよその無傷アンチセンスコピー数を見積もり、表１３に示す。

２８７２　０　１１．１　１４．５　３．６３０３−７／１　１　１１．４　１２．６　４．７３０７−１／２　３　１２．２　１６．０　３．５３０６−４／８　３　１θ、８　１２．２　４．３３０７−１／７　４　８．５　１０．３　５．７３０６−４１５　６　７．４　１０．４　５．８３０７−１／１　６　６．３．９．６　６Ｊ２９９−１５／１　７　８．１　９．７　６．１３０７−１／４　８　６．７　７．７　８．０無傷アンチセンスコピー数と１８：３含有量との間にはかなりの相関関係が存在しており、１８・３の含有量が低下することに対応してコピー数が増加し、その結果として１８　：　２／１８　：　３比が増大する。アンチセンスｃＤＮＡのコピー数が少なくとも８である系統３０７− １／４が示す平均１８　：　２／１８　：　３比は、その対照が示すそれの２倍以上であった。

配列表（１）一般的情報（ｉ）出願者：　Ｂｒｏｗｓｅ、　Ｊｏｈｎ、　Ｋｉｎｎｅｙ、＾ｎｔｈｏｎｙ　Ｊ、、　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｊｏｈｎ、　ｆｉｅｒｚｂｉｃｋｉ、＾ｎｎａ　Ｍ、、　Ｙａｄａｖ、Ｎａｒｅｎｄｒａ　Ｓ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ、　Ｌｕ１ｓ（ｉ　ｊ）発明の表題：植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ｉｉｉ）配列の数＝３２（ｉｖ）通信住所：（Ａ）住所：　Ｅ、　１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ＋ｎｐａｎｙ（Ｂ）通り：　１００７　Ｍａｒｋｅｔ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市＋　ｌｌｉｌｍｉｎｇｔｏｎ（Ｄ）州：　Ｄｅｌａｗａｒｅ（Ｅ）国：米国（Ｆ）　ＺＩＰ　：　１９８９８（Ｖ）コンピューター読み取り形態：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）ｍンビューター：　ＭａＣｉｎｔＯ３ｈ（Ｃ）操作システム：　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｓｙｓｔｅｍ、　６．０（Ｄ）ソフトウェア：　Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｗｏｒｄ、　４．０（ｖｉ）現在の出願臼：（Ａ）出願番号（Ｂ）出願臼（Ｃ）分類（ｖｉｉ）優先出願臼：（Ａ）出願番号：　０７／８０４．２５９ＡＣ入ττ入Ｏ入入ＧＧ口Ｇτ入入＾　１３５０（２）配列同定番号２に関する情報・（１）配列の特徴・（Ａ）長さ、３８６個のアミノ酸（Ｂ）型；アミノ′酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉ　ｉ）分子型　蛋白質（ｘ　ｉ）配列記述、配列同定番号２・Ｈｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌλｌａ　ｈｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｒｑτｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ｐｘｏ　！ｌｈａ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｇｉｙ　Ａｓｐ　工１喀　入；９＾１ａ　入１ａ　Ｘ１ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　）Ｉｉｓ　Ｃｙｓ　ｒｒ■ ３５　＜ｏ　＜ｓＶａ上　ＬｙＳ　Ｓｅｒ　ＰＸＯＬｅｕ　Ａｒｇ　５ｅｒ　Ｈｅ７　ＳｅＸ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　＾：ｑ＾ｓｐ　Ｘｌｅ　ｌ１ｅＳｏ　５５　６０Ａ１ａ　Ｖａｌ　入１ａ　Ａｌａ　Ｘ／ｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　八ｌａ　Ａｌａ　ＶａＩ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　５ｅｒ　Ｔｒｐ　Ｐｈ■ ６５　７０　７５　Ｓ。

Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　）Ｉｉｓ　ＧＬｙ　丁ｘｐ　Ａｚｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅ：　Ｈｉｓ　λ：ｇ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ＨＬ■ １３Ｃ１３５１４０Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｒ＋　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｅｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　ＶａP 丁ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉ５５ｅ：　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｈｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　ＶａＩ　Ｐｒ。

シｃｕ　Ｐｒｏ　ｓｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　１’：ｏ　Ｌｅｕ　丁ｙｔ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇ１■ Ｇｌｕ　Ａ：ｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　へユａ　Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ｔｈ：　丁ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｎｅｔ　Ｐｈｅｖａ１　Ｓｅ：　Ｌｅｕ　ズｌｅ　Ａｌａ　！７ａｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖｉｌ　ｉ’ｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ｉモ■ Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇａｙ　ＶａｌＰｒｏ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　ｋ４ｅｔ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ＾ｓｐ　Ｊｕａ２４５　２５０　２５５　・Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｙｚ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　）ｌｉ３　八３Ｐ　Ｇｉｕ　ｐｙｓ　Ｌｅｕ　ｆ’＝ｏ　丁ｒｐＱｒ２６０　２６５　、　２７０人ｒｇ　Ｇｉｙ　Ｌｙｓ　Ｇｉｕ　Ｔｒｐ　５ｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌ＝ｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇコｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｘよｅ　Ａｓｐ２７５　２Ｂ０　２６５人ｘｑ　Ａｓｐ　Ｔｙｘ　Ｇｌｙ　１よｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　）ｌｉｓ　Ｈｉ５　Ａ５ｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　丁ｈｒ　Ｈｉ■ Ｖａｌ　Ｈｅ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｌ、ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｒ、　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　ｌｙｘ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾３Ｐ＾１ａ　Ｔｈｒ　Ｌｙ５　八ｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅ＊　Ｇｉｙ　入ｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｙ：　八ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｉｈｘ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｘｌｅ　ＰｒＱ　Ｉｌ＝　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｉｚｕ　Ｖａｌ　ＡｌａＳｅｘ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　−ＪａＬ　Ｓ＝ｒ　Ａｓｐ　丁ｎｒ　Ｃ１ｙ　Ａｓｐ　Ｘｌｅ　ＶａＬ　ｔｈ■ ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａ５Ｐ　ＰＸＯＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＶＬＬ　７ｙｘ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　Ｌ、ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ３７０　３７５　Ｂ８０Ｔ１ｅ　Ａｓｎ（２）配列同定番号３に関する情報（ｉ）配列の特徴− （Ａ）長さ　２５５個の塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎮　二本鎖（Ｄ）トポロノー：ｉｉｉ鎗状（ｉ　ｉ）分子型　ＤＮＡ　（ケノム）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル配列・なしくｖｉ）起源・（Ａ）有機体　アラビドプシス・グリアナ（ｖ　ｉ　ｉ）　１！接の起源・（Ａ）名称／鍵、エキノン（Ｂ）位置：６８．．２５５（ｘｉ）配列記述・配列同定番号３・（２）配列同定番号４に関する情報・（１）配列の特徴・（Ａ）長さ　１５２５個の塩基対（Ａ）有機体、アラビドプシス・クリアナ（ｖ　ｉ　ｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：ｐＡＣＦ２−２（ｉｘ）性質：（Ａ）名称／６！：ＣＤ５ＣＢ）位置：１０．．１３５０（ｘｉ）配列記述：配列同定番号４：２４Ｂ１５１り（２）配列同定番号５に関する情報（ｊ）配列の特徴：（Ａ）長さ　４４６個のアミノ酸（Ｂ）型　アミノ酸ＣＤ）トポロジー　直鎖状（１１）分子型：蛋白質（ｘｉ）配列記述：配列同定番号５）ｌｅｔ　入１ａ　Ａｓｎ　Ｌ４ｕ　Ｖａｌ　Ｌｃｕ　５ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　工１ｃ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｆ’ｒｏ　入窒X １　Ｓ　１０　１５エユｅ　丁ｙｔ　丁ｈ１　τｈｆ　Ｐｒｏ　Ａ：ｇ　Ｓｅ：　入ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｃｕ　Ｓｅｔ　入ｓｎ　Ａｓｎ　Ｊ’ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈ■ Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　ゴｌｅ　ｆ’ｒｏ　Ｌｙｓ　）Ｉｉｓ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌ凾■ ｌｏｏ　１０５　１１０八ｓｎ　Ｐｒｐ　丁ｒＰ　ＬＹ３　Ｓｅｒ　ｌ７ｅｕ　Ｓ６ｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｉ　Ｖａｉ　入ｘｑ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｘ１ｅ　Ｖａ■ ｍｉｓ　１２０　１２５Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌ４ｕ　Ａｌａ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　入ｕａ　Ｔｙｘ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　八ｓｎ　丁ｒｐ　Ｘｉｓ　Ｖａｌ　ＴｒｐＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｘ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌユ４５　１５０　１５５　１６０ＬｅｇＧユｙＨｉｓ＾５ｐＣｙｓＧｕｙＨｉｓＧｌｙＳ’ｅｘＰｈｅＳｅｒ入ｓｎ＾５ｐＰｒｏＬｙｓＬｅｕＡｓｎ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　ｌｚｕ　）Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｘ　ｌｉｅ　ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　丁ｙ■ １８０　１８５　１９ＧＨｉｓＧｉｙτｘｐＡｒｇ工１ｅＳｅｒ）ｌｉｓｋｘｑＴｈｒ）ｌｉｓＩ（ｉｓＧｌｎ＾コｎＨＬｓＧ上ｙＨ４ｓｋｕ　Ｖａｌ　Ｃ１０Ｌｅｕ　Ａ！Ｉｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｚ　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　）ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｈｅｔ　Ｌｓｕ　Ｌｙｓ　シｅｕＴｙ＝　Ｇｌｙ　ｍｉｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　丁ｒ２　工１ｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　丁ｒｐ　Ｌｅｕ　ｋｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　τｈｒ！０５　３１０　３１５　３２０ ↑ｙｒ　Ｌｅｕ　１４ｉｓ　）ｌｉｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　テｒｐ　Ｔ７ｔ　Ａｒｇ　Ｇ撃■ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔ＝ｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｘ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　１＜ｕ　丁ｈｒ　丁ｈｒ　Ｌａａｕ　Ａｌｐ　Ａｒｇ　Ａｓ■ τｙｘ　Ｇｉｙ　１．ｅｕ　エエＣ八ｓｎ　入ｓｎ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　ＨＬｓ　入ｓｐ　ズｌｅ　Ｇｌｙ　τｈｒ　Ｈｌｓ　ｖａｌ　！１ｅＨｉｓ　Ｈ二ｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐ：ｏ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　）ｌｉｓ　丁ｙｒ　Ｉ（ｉｓ　ｋｕ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　入１ａ　τｈF Ｇｉｕ　Ａｌａ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｕｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　入ｓｐ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌ、ｅｕ　’？ｘｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｚ■■ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　）ｌｉｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｘ　八ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｔ　Ｔｙｒ　Ｌ、凾■ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａ３ｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　八ｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ（２）配列同定番号６に関する情報＝（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１４２９個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖、−重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎮状（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列−なしく■１）起源（Ａ）有機体　ブランカ・ナプス（ｖｉｉ）直接の起源（Ｂ）クローン：　ｐＢＮｓＦ３−ｆ２（ｉｘ）性質：（Ａ）名称／ＩＩ：ＣＤ５（Ｂ）位置ニア９．．１２１２（ｘ　ｉ）配列記述、配列同定番号６：７Ｇ入八ｋＮ’−ＩＪｓＧ　ＣＴこＴ二人Ｇ入ＴＴ　ＴＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴｉ：Ｉ′ＩＣＣＡＣＣＴＧ　ＡＴＴ丁ＴＴ丁丁ＴＧＣ丁τ入ＴsｋＡ丁Ｇ　１２７２ τＣ入八丁丁ＣＡττ　ＧＴＧ丁τＡＣＣＡτ　τ入τＣ？ＣＴ（ａ八人　丁へ〇へ入τＣＡＧム　τＣＣ入λλＣＣＣＣλλＣ丁丁ＴＧＴ■■@１３３２（２）配列同定番号７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　３７８個のアミノ酸（Ｂ）型コアミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｉｉ）分子型、蛋白質（Ｘｌ）配列記述：配列同定番号７：ＰごＯｐｈｅ　ＴｙＸ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　入１ａ　Ａｒｇ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅ：　！！ｉｓ　τｙｘｌＢｏ　）４５．　１９０（２）配列同定番号８に関する情報（１）配列の特徴・（Ａ）長さ：１４２９個の塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖　一本鎗（Ｄ）トポロジー−直鎖状（１１）分子型　ｃ　ＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテイカル配列：なしくｖ　ｉ）起源：（Ａ）有機体：ブラシ力・ナプス（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：ｐＢＮＳＦｄ−２（ｉｘ）性質：（Ａ）名称／ＩＩ：ＣＤ５（Ｂ）位置：　１．．１２１５（ｘｉ）配列記述：配列同定番号８゜７丁Ｃ五人λ　７丁ＣＡ（Ｊｔ　ＣＡＡ　τｃｃ　ｃｃτ　１０丁　τＣ？　ＣＣＣＣＧＧ　７丁τ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣＴＣ丁　４６ＧＧＣＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　ＴｉＣＡＡＣＣ丁＾　ＣＣＴ　（ａＡｃ　入子Ｃ入Ｃ入　ＧＣＧ　ＧＣＧ　＾Ｔ入　ＣＣＴ　１９Q 人ＡＧ　ＣＡＴ　丁Ｇ：　丁ＧＳＧττ　入へＧ　入へＴＣＣへ　ＴＧＧ　人ＡＧ　丁ＣＴＡτＧＡＧ丁　丁入ＣＧＴＣＧ７二　２４０人ＧＡ　ＣＡＧ　Ｃτλ 　ＧＣＣＡＴＣＧＴＧ　τ丁ＣＧＣＡ　Ｃτ八　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　τ入ＣＣＴＣ２ｆｌａ人、ＸＣλンτ　丁ＧＧＣττ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　Ｃ口τ　ＣＴＣτ入丁　ＴＧＧ　Ａ丁丁　Ｇ：Ｔ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＡＣＣムチＧ　３３U ＴＴＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＣＴＣ７丁丁　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧ！：　ＣＡＴ　ＧＡＣ丁ＧＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＡＧＣ丁ＴＣ３８＜ｔｈｅ　Ｌｙｓ　ｔｈｅ　入ｚｇ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ｌ’ｘｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ｔ’ｒｏ　入ｒ９　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｚｕ　Ａｓｎ　５■■ １　５　１０　）ＳＡｒｇ　Ａｓｎ　丁ｒｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＶａＩ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　丁ｈｒＶ轟１　Ａｓｐ　Ｓｅｔ　５ｅｘＳｅｒ　Ｓｅｘ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ｆ’ｈｅ　入’Ｐ　ＰｒB ｃ１ｙ　入Ｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　Ｐｈｅ　入ｓｎ　Ｌｅｕ　Ａ１ａ　ムｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｒ９　人１ゐ　入１畠　工１ｅ　Ｐｒ。

Ｓｏ　５５　６０Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｅ’ｔｏ　丁ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｙｘ　Ｖａｉ　ＶａP 人ｚｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ｘｌｅ　Ｖａｌ　ｉ’ｈｅ　Ａｌａ　Ｉ、ａｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　入１１　人１１　丁ｙｒ　ＬbｕＡ：ｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌ４ｕ　Ｖａｌ　丁ｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　丁ｙｗ　丁ｒｐ　工ＩＣＡｌａ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ｔｈｚ　Ｍｅｔｌｏｏ　１０５　１１０ＰｈｅＴｒｐ入１ａＬｃｕＰｈｅＶａｌＬｅｕＧユｙＨｉｓ＾５ｐＣｙｓＧ１ｙＨ４ｓＧｌｙ５ｅｒＰｈｅ’、：ｓ　１２０　１２５Ｓｅｘ　ム已ｒ１　人ｓｐ　Ｐｘｓ　入ｒｇ　ｍｕ　入３ｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌ４ｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　５ｅｒ−３Ｓ　１３５　１４０５ｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｆｏ　Ｔｙｒ　Ｉ′Ｉ＝ｓ　Ｇｌｙ　丁ｒｐ　Ａｒｇ　Ｘｌｅ　Ｓｅｒ　）ｌｉｓ　Ａｒｇ　丁Ｍ　Ｈ奄■ Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　）Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＡＦＩＰ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　丁ｒｐ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｎ■■ ５ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｘｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙ３　Ｓｔ＋＋　ｔａｕ　八ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｘ　八ｚｇ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　＾ｒX １６０　Ａｓｓ　１９０ｆ’ｎｅ　Ｔｈｒ　Ｌｔｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｇｕ　Ｌｃｖ　＾ｌ＋　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　丁ｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　入１■ ｉ９５　２ＤＣＩ　２０５八ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒ＋　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙ５　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　）ｌｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　八ｓｐ　１ａ■ ２ユ０　２”５　２２０Ｐｈｑ　Ｌｅｕ　Ｐｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐ、ｒｃ；Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｘ　Ｔｈｒλｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ２２５　２３０　２３５　−’々０Ｔｈ＝　入１ａ　ｓｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌ４ＬＩ　Ｖｌｌｌ　ＣｙＳ　ｌ＜ｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　ＧｌＹ　Ｐ秩B Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌ４ｕ　Ｌｙ３　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｔｏ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｚｌｅ　入ｓｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＴｒｐ　１＜ｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｃｕ　ＨＬａ　ＨＬａ　ＨＬａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ＾ｓｐ　Ｌｙｓ２７３　２Ｂ０　２８５Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕシ？ｐ　Ｓｅｒ　％ｒ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌ４Ｌ１τｈ：　丁ｈｒ：　Ｌｅｕ　入３ｐ入＝ｑ入ｓｐ　Ｔｙｙ：　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　工１七入ｓｒ＋　ｋｓｎ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　ＨＬａ　Ａｓｐ！ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｘ　）Ｉｉｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　！ｘｕ　ｔｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　？ｙ■ Ｈｉｓ　Ｌ４ｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　！ａｕ　Ｇｌ！／　Ｌｙｓ　’ｔ■j 丁ｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ｈｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　１）ｒｏ　Ｌ４ｕ　Ｐｙ：ｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　ｔａｕ　Ｌｅｕ　Ｇ撃■ 工ｌｅ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　Ｘｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　１ｌｉｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌ■ 人ｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　テｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　入１ａ　入ｓｐ　Ｐｒｏ　八ｓｎ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＸＬｅ　Ｌｙｓ（２）配列同定番号１０に関する情報；（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＋　２１８１個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖、一本舗（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子型：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列、なしくｖｉ）起源：（Ａ）有機体　グリシン・マックス（ｖｉｉ）直接の起源・（Ｂ）クローン・ｐＸＦｌ（ｉｘ）性質。

（Ａ）名称／ＩＩ・ＣＤ５（Ｂ）位置　８５５．．１９９７（ｘ　ｉ）配列記述・配列同定番号１０゜Ｇ＾τ　入ＧＣＣＣτ　丁丁ＧＣ丁Ｇ　へ人丁　ＡＧＣＣ丁Ｇ　（ｉＴＧ　ＧＧＡ　ＣＡＣ＾丁ＣＴＴＧ　ＣＡＴ　ＴｃＣ１′ｃＡ　１２２U 八３ｐ　５＠ｒ　ｉ’ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｉ、ｅｕ　入ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＨＬｓ　工１ｅ　Ｌ＋ｅｕ　ｏｉａ　Ｓａｒ　Ｓ翌■ ユｌＤ　ｍｉｓ　１２０ＡＧＴＴＴＣＡ　２１Ｂ！（２）配列同定番号１１に関する情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ２３８０個のアミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロノー：直鎖状（１１）分子型・蛋白質（ｘｌ）配列記述・配列同定番号１１Ｌｃｕ　Ａｓｎ　Ｓｉｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｎ　ＧＡｙ１４ｉｓ　Ｉｌｅ　ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｘ　Ｉｌｅ　ｌａｕ　Ｖａｌ　ｌｌｒB Ｔ′ｙｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｘｉｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　入ｒ９　丁ｈｒＨ工ｓ　１４１ｓ　Ｇ工ｎ　Ａｓｒ＋　ＨＬａ　ｃ■■ Ｈｉｓ　Ｘｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｘ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｘｈｍ　？ｙｒ１４５　１５０　１５５　１ｇ。

ｆ’ｒｏ　Ｌｎｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ工Ｌ−Ｔｙｒ　ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｓｅｘ　ｋｘｑ　Ｓｅｘ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　１ａｙｓ１１０　１！Ｉ５　１９０Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　ｔｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｘ　Ａｓｎ　ｌａｕ　ｔｈｅ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｓｅｘ　Ｇｌ■ Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　入１ａ　Ｉｌｅ　５＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｌｎｕ　Ｃｙｓ　丁Ｌ’ｐ　入１１１　ｔｈｔ　ｍｔ　ＰＭ　ｊａｒＬｎｕ　Ｌｎｕ　工１ｅ　’ｉｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　１ユＣＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　１４ｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓτｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｆｌｉ５　ＨＬ５　Ｈｉｓ　Ｇユｙ１４土Ｓ　＋４ｉｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙ！ｌ　Ｌ＜ｕ　Ｐｒｏ　丁ｒｐ　Ｔｙに　Oｒ９Ａｓｐ　丁ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｘ１ｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　工１ｅ　Ｉ（ｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　丁ｈｒＨ工３　Ｖａ１（２）配列同定番号１２に関する情報・（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：１６７５個の塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）分子型：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列　なしくｖｌ）起源（Ａ）有機体：グリシジ・マックス（ｖｉｉ）直接の起源、（Ｂ）クローン　ｐＳＦＤ−１１，８ｂｗｐ（ｉｘ）性質（Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５（Ｂ）位置　１６９．．１５３０（Ｘｌ）配列記述　配列同定番号１２ニアＧ；　へ人′：　ＣＴＣＡＧＧ　Ｇ入ＧＡＧＧ　へ入子　τＧＧ　ＧＧＧ　ＣＴｙ　へ人入　ＧＴＧ　＾ＧＴ　ＧＣＣＣＣ丁　丁子Ｇ　３U９Ｔ？Ａ　ＧＡＧ　ＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡ　ＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡ　ＪＬＧＡＧＡＧＧＣＴＴ　Ａ？ＡＣＡＣＡＡＴＴ　P５７７Ｌｅｕ　Ｇｌｕ（２）配列同定番号１３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ、４５３個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）分子型：蛋白質（ｘｉ）配列記述　配列同定番号１３：Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｘｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　′ＩＡｕ　ｋｔｑ　Ｇｌｕ　ｋｒｑ　Ａｓｎ　丁ｒｐ　Ｇｌｙ　ｋｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　５ｅｒＬ＠ｕ　テｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　）Ｉｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｔｈ ■ ＩＩ５　９０　９５Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｉ’ｈ＠に！Ｉｎ　Ｌｊｌｕ　入ユａ　入ｓｐ　）ｌ＊　入ｔ９　人１−　人PａＺｏｏ　１０５　１１０１１ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＨＬｓ　Ｃｙｓ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ｈｅｏ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　５ｅｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　ＴｙｘＶａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　工ｍｅ　ｌＬａ　Ｖａｌ　ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　入１轟　入１ａＪｕ−＾ユａＡｌ慇ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　ｌｚｕ　Ｔｙｔ　丁ｒｐ　Ａｌａ　入１ａ　Ｇｉｎρ１ｙ１４５　１５０　１ｓｓ　ユ６゜Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｉ、ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＨＬｓ　Ｇｌ■ Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　ＬＩｅｕ　Ｌ４■ １ｇ０　１８５　１９０丁ｈｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　ＨＬｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｈｓｐ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｔｒｐ　ＨｉｓＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇ１１ｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　八ｒ９　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　丁ｈｚ　入に９５ｅｔＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ｆ’ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＩＪａｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌ■■ Ｐｈｅ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ｓ七　Ｐ：ｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　＋４ｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｐ　Ｌｅｕ　ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ｋｓｐ　Ｖａｌ　Ｘｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｘ　Ｔｈｒ　＾１ａＣｙｓ　Ｔｌ　ｋｌａ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ＬＴｅｕ　Ｌ＠ＬＩ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ｈｅ■ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌ４ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｆ’ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｚｌｅ　Ｐｈ■ Ｖａｌ　Ｍ！：　τｑ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　）ｌｉｓ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　）ｌｉｓ　Ｇ工t Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　丁ｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｌｓｕ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌ４ｕ　ｋｓｐ　Ａｚｇ　Ａｓｐ　丁ｙ１　Ｇｌｙ　τｌｌ’ｐ　Ｘ＞＠　Ａｓｎ　Ａｓｎ　工ｌｅ　Ｈ奄■ ＋４ｉｓ　Ａｓｐ　Ｚｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　！ｌ＠　）ｌｉｓ　）ｌｉｓ　Ｌｅｕ　ｆ’ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ｌｌｅ@Ｐｒ。

Ｈｘｓ　丁ｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　入１ｍ　ｋｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ｔｈｅ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ｋｒｑ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ＬｙＳ　ＬｑＢ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｊｕｍ　Ｐｒｏ　Ｌ＜ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｍｉｘ１ａｕｌｉｅＧユｙＧｌｕＸｌｅＸｌｅＡｒｇ５ｅｒＰｈｅＬｙｓＴｈｒＡｓｐ）ｌｉｓｔｈｅＶａ１５ｅｒ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｕｙ　Ｊｕｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｔ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｊｕｐ　Ｓｅｘ　Ｌｙｓ　Ｘｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ（２）配列同定番号１４に関する情報。

（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ、３９６個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖、一本舗（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）分子型：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列、なしくｖｉ）起源・（Ａ）有機体、ゼア・マイズ（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ｐＰｃＲ２０（１ｘ）性質・（Ａ）名称／鍵　エキソン（Ｂ）位置：３１．．３６３（ｘｌ）配列記述；配列同定番号１４゜ＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡｌｌＬ”ｉ−４ＴＣＪＩロＧＧτＣムｃ　１Ｔｃｃｈこ＾ＧＳＧ　へＣＧＩＡＧＴＣ入子Ｇ　ＧこＡＣbＣＧＡ’ｌＣ６０＾ＣＣＣ，Ｉｉ［ｉ入λＱＣτＧτ入口’５ＧＧＣ＾　入口τへＧＡＧに八　ＣＧこＡ口Ｃ五人Ｇへ　ＡＧＣτＧＡＧ八Ｔτ　ＣＡへＧＧＴfＣＣＣ二２り丁丁Ｃ口二口口７Ｇ；　丁ＣＧＣＡ丁τＣＣＣＣＧＴＣ丁ＡＣＣＴＣＴ７ＧＴＡＣＡＧＧＡ　ＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡ　ＧＣＴＣＧＣＣＴＣＣP８０こｆｉ、ｃＴＴ：ＣＴτＣＣＣＡＧｍＡＧＣＧＡ　ＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＣＣＣＪ、ＡＧＳＡＧＡ　ＡＧＡＧ口ＧＡＣＧＴ　ＣＡＴＧＧＴＧVＣＡ　２４ＯＡ’：ＣＡ：：τＧこ丁　ＧＧＴＧＣＡＴＣ入Ｔ　ＧＣＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧに＾　τＧＧＣＧＴＧＣＧ：　ＧＴ丁ＣＧ（／：ＣbＡ　３００Ｃ７ＣＯＧＧＴＧＣＴＣＡＡＱＡＴＧＴＡ　ＣＧＧＣＡＴＣＣＣＡ　ＴｋＣＣＴＧＧＴＧＴ　？ＣＧＴＧＡＴＧＴＧ　ＧＣＴＴＧｋＣＣＴＧ@３６０ＧＴＧＡＣＧＴ）”：Ｔ　ＴＡこＡＴＣＡＣＣＡ　ＣＧＧＣＣＡＣＧＡＴ　ＧＱＡτＣＣ３９６（２）配列同定番号１５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ１１２６個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）＠：未知（Ｄ）トポロジー二未知（ｉ　ｉ）分子型コ蛋白質（ｉ　＋　ｉ）ハイボセテイカル配列：有り（Ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（ｖ　ｉ）起源。

（Ａ）有機体：ゼア・マイズ（ｖ　ｉ　ｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：ｐＰＣＲ２０（ｘ　ｉ）配列記述・配列同定番号１５：丁ｒｐ　Ｃ１０１１ｅ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ａｉａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＬＣｕ　入１ｍ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　入１ａ　ｔｈａ　Ｇｌｙ（２）配列同定番号１６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ２４７２個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子型：ｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテイカル配列：なしくｖ　ｉ）起ｆ！Ａ：（Ａ）有機体；アラビドプシス・グリアナ（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）りｏ−：、ｚ：ｐＦａｄｘ−２およびｐＹａ　ｃ　ｐ　７（ｘｉ）配列記述　配列同定番号１６：（２）配列同定番号１７に関する情報。

（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　１５６個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖：未知（Ｄ）トポロジー二未知（ｉ　ｉ）分子型・蛋白質（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテイカル配列：有り（Ｖ）フラグメント型二Ｎ末端フラグメント（Ｖ］）起源：（Ａ）有機体・アラビドプシス・グリアナ（ｖ　ｉ　ｉ）　＠接の起源：（Ｂ）りＯ−：／：　ｐＦａｄｘ−２およびｐＹａ　ｃ　ｐ　７（ｘｌ）配列記述、配列同定番号１７゜Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｒ口　ｃｘｙ　入ユａ　ＰＬＱ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｔｈｅ　入１１ｎ　Ｌｅｕ　入ユａ　Ａｓｐ　Ｕｓ　Ａｒｇ　＾１ａ人１ａ　ｌ＠　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　１ｌｒｏ　Ｔｒｐ　）４ｅｔ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　５ｅ■ τｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ＾ｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｆｆ１ｅ　Ｖａｌ　ｆ’ｈｅ　Ｇｌｙ　ＸＡｕ＾１ａ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｍａ６５　７０　７５　ｇ。

Ａ上＋１　Ｔｙ：　Ｐｈｅ　八！Ｉｎ　Ａｓｎ　丁ｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　丁ｚｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　丁ｙ＝　丁ｒｐ　Ｐｈｅ　入１ａ　ＧP゜Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈ＠　丁ｒｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉ’ｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　ＧユｙｓユＳユ００　１０５　１１０Ｇｌｙ　Ｓｅｘ　Ｐｈｅ　Ｓｅｘ　Ａ３ｎ　Ａｓｐ　ＰｒＯ人ｆ９　Ｌｅｕ　ＡＳｒ＋　Ｓｅｘ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌａｕユ１５　１２０　１２５ＸＪｅｕＨｉｓＳｅ：ＳｅｗＸ：ＡｅＬｅｕＶａｌｐ：ｏ’Ｔ’ｙｒ１４ｉｓＧユｙＴｒｐＡｒｇＸ１ｅＳｅｒＨｉｓ（ｔ）　Ｉり別口ＪＡ［：曾７テ１０１− １笑１９９１霞稚：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ；３１個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｘ）性質８（Ａ）名称／鍵　雑多な性質（Ｂ）位置：１．．１１（Ｄ）他の情報：／注＝「Ｎ＝イノシン」（ｉｘ）性質：（Ａ）名称／鍵・雑多な性質（Ｂ）位置：１２．．３１（Ｄ）他の情報：／注＝　ｒＮ＝ＡまたはＴまたはＧまたはＣ」（ｘｉ）配列記述・配列同定番号１８：ＣＧＧＧ＾τＣＣＡＣＮＣＡＹＣＡＹＣＡＲＡＡＹＣＡＹＧＧＮＣ＾（２）配列同定番号１９に関する情報。

（１）配列の特徴：（Ａ）長さ　３５個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｘ）性質；（Ａ）名称／鍵・雑多な性質（Ｂ）位置：１．．１５（Ｄ）他の情報：／注−４Ｎ−イノシン」（１ｘ）性質・（Ａ）名称／鍵：１１多な性質（Ｂ）位置　１６．．３５（Ｄ）他の情報・／注＝　ｒＮ＝ＡまたはＴまたはＧまたはＣ」（ｘｉ）配列記述　配列同定番号１９：ＣＧＧＳＡ丁ＣＣＲ丁　ＣＲ丁ＧＮＣＣＲ丁Ｇ　ＲＴＧＲ？ＧＮ入Ｒ只　丁入ドＧ丁（２）配列同定番号２０に関する情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ＝４２個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖、−木調（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１ｘ）性質：（Ａ）名称／１１・雑多な性質（Ｂ）位置　１．．３６（Ｄ）他の情報　／注＝「Ｎ＝イノシンン（ｘｉ）配列記述、配列同定番号２０゜（２）配列同定番号２１に関する情報。

（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：３６個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）性Ｗ：（Ａ）名称／鍵：雑多な性質（Ｂ）位置・１．　３６（Ｄ）他の情報　／注＝［Ｎ＝イノシンン（ｘｉ）配列記述　配列同定番号２１ＴτＣＧＴトドτＮＧ　ＧＮＣＡＹＧＡＹＴＧ　ＹＧＧＮＣＡＹＧＧＮ　丁Ｃド丁子Ｃ（２）配列同定番号２２に関する情報：（１）配列の特徴（Ａ）長さ、１８＠の塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列記述　配列同定番号２２ＧＧＨこＡＹ（ａＡＹＴ　ＧＹＧＧＨこ＾Ｃ（２）配列同定番号２３に関する情報（ｉ）配列の特徴（ｉｘ）性質。

（Ａ）名称／鍵：雑多な性質（Ｂ）位置＋１．．３６（Ｄ）他の情報：／注＝「Ｎ＝イノシン」（ｘｉ）配列記述：配列同定番号２８：丁子ＣＧＴＮＮＴＮＧ　ＧＮＣＡＹＧＡＹＴＧ　ＹＧＧＮＣＡＹＧＧＮ　ＡＧ）ｆｆ？？（２）配列同定番号２９に関する情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：３６個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖・一本舗（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）性質：（Ａ）名称／鍵：雑多な性質（Ｂ）位置：１．．３６（Ｄ）他の情報・／注＝「Ｎ＝イノシンン（Ｘｌ）配列記述　配列同定番号２９・τ？ＣＧＴＮ’ＮＴＮＧ　ＧＮＣＡＹＧＡＹＴＧ　ＹＧＧＮＣＡＹＧＧＮ　ＴＣド丁丁子（２）配列同定番号３０に関する情報。

（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ・３８個の塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）性質：（Ａ）名称／鍵・雑多な性質（Ｂ）位置：ｉ、、ａｓ（Ｄ）他の情報：／注＝「Ｎ＝イノシン」（ｘｉ）配列記述：配列同定番号３０：Ｇ球ＣＴＲ丁入ｎ：　ＣＮＴＧＮＧ丁ＮＣＡ　Ｎτ入ＮＧ丁λＧＴＧ　λ入Ｎへ人ＧＧＧ（２）配列同定番号３１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ・３８個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニ一本舗（Ｄ）トポロジー・直鎖状（！Ｘ）性質：（Ａ）名称／ｌ！　雑多な性質（Ｂ）位置：１．．３８（Ｄ）他の情報：／注＝「Ｎ＝イノシン」（ｘｉ）配列記述：配列同定番号３１：ＧＴＲＣＴＲτ八ＮＣＣへＴＧＮＧＴＮＣλ　ド丁ＡＪＪＧ丁ＣａτＧ　罠入にＡ＾ＧＧＧ（２）配列同定番号３２に関する情報・（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ・１３８個の塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖　一本舗（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｘ〕性質（Ａ）名称／ｌ！・雑多な性質（Ｂ）位置・１．．１３５（Ｄ）他の情報・／注＝「Ｎ＝イノノン」（ｘｌ）配列記述：配列同定番号３２ＮＴＣＧＴＧＮ：”：１１　Ａ）ＪＮＡＣＧ人Ａ　１国際調査報告　）ＣＴＡＪＳ　９２／１０２８４国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１１Ｃ３１００２１１５−４ＨＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　９４５３−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　５／１０９１００　９３５９−４Ｂ（７２）発明者　キニー、アンソニー・ジエイアメリカ合衆国プラウエア州１９８０９ウイルミントン・ロアアベニュー６０９（７２）発明者　ピアース、ジョン・ダブリュー、ジュニアアメリカ合衆国プラウエア用１９８０３ウイルミントン・ジャクソンブールバード３０２Ｉ（７２）発明者　ウィアーズビッキ、アンナ・エムアメリカ合衆国プラウエア用１９８０５ウイルミントン・アイドルウッドロード１３１２（７２）発明者　ヤダブ、ナレンドラ・ニスアメリカ合衆国プラウエア用１９８１０ウイルミントン・ジエイドドライブ１２７

Claims

【特許請求の範囲】

１．配列同定番号１、４、６、８、１０、１２、１４または１６がコード化するポリペプチドに対するアミノ酸同一性が５０％以上である、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化する核酸配列を含んでいる単離された核酸フラグメント。
２．配列同定番号１、４、６、８、１０、１２、１４または１６がコード化するポリペプチドに対する該アミノ酸同一性が６５％以上である請求の範囲１の単離された核酸フラグメント。
３．配列同定番号１、４、６、８、１０、１２、１４または１６に対する該核酸同一性が９０％以上である請求の範囲１の単離された核酸フラグメント。
４．上記フラグメントがダイズ、油種子ブラシカ種、アラビドプシス・タリアナおよびトウモロコシから成る辞から選択される植物から単離される請求の範囲１の単離された核酸フラグメント。
５．形質転換した植物細胞内のリノレイン酸のレベルを変化させ得るキメラ遺伝子において、該遺伝子が、請求の範囲１、２または３いずれかの核酸フラグメントを含んでおり、ここで、このフラグメントが使用可能様式で適切な調節配列に連結しているキメラ遺伝子。
６．請求の範囲５のキメラ遺伝子を含んでいる植物。
７．請求の範囲５のキメラ遺伝子を含んでいる植物の種子から得られる油。
８．リノレイン（１８：３）酸を変化したレベルで含んでいる種子油を生じさせる方法において、（ａ）請求の範囲５のキメラ遺伝子を用いて油産生種の植物細胞の形質転換を行い、（ｂ）段階（ａ）で形質転換した植物細胞から繁殖力のある植物を成育させ、（ｃ）段階（ｂ）の繁殖力のある植物から得られる子孫種子を所望レベルのリノレイン（１８：３）酸に関してスクリーニングし、そして（ｄ）段階（ｃ）の子孫種子を処理することで、リノレイン（１８：３）酸を変化したレベルで含んでいる種子油を得る、ことを含む方法。
９．請求の範囲８の方法の産物。
１０．上記油産生種の植物細胞が、アラビドプシス・タリァナ、ダイズ、油種子ブラシカ種、ヒマワリ、綿、ココア、ピーナッツ、ベニバナおよびトウモロコシから成る群から選択される請求の範囲８の方法。
１１．油産生植物種の種子油内のリノレイン酸を変化したレベルで産生する植物種を育種する方法において、（ａ）リノレイン酸特性が異なっている油産生種の２つの変種間の交雑を行い、（ｂ）段階（ａ）の交雑の結果として得られるいくつかの子孫植物から単離した制限酵素消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットを作成し、そして（ｃ）請求の範囲１の放射能標識核酸フラグメントに該サザンブロットをハイブリッド形成させる、ことを含む方法。
１２．請求の範囲１１の方法の産物。
１３．ゲノムＲＦＬＰマーカーにおけるＲＦＬＰ地図作成方法において、（ａ）植物の２つの変種間の交雑を行い、（ｂ）段階（ａ）の交雑の結果として得られるいくつかの子孫植物から単離した制限酵素消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットを作成し、そして（ｃ）請求の範囲１の放射能標識核酸フラグメントに該サザンブロットをハイブリッド形成させる、ことを含む方法。
１４．脂肪酸デサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化する核酸フラグメントを単離する方法において、（ａ）配列同定番号２、５、７、９、１１、１３、１５および１７と他の脂肪酸デサチュラーゼポリペプチド配列とを比較し、（ｂ）段階（ａ）で得られる、４個以上のアミノ酸を含んでいる保存配列（類）を同定し、（ｃ）段階ｂで同定した保存配列を基にして、領域に特異的なヌクレオチドプローブ（類）またはオリゴマー（類）を作り出し、そして（ｄ）段階ｃのヌクレオチドプローブ（類）またはオリゴマー（類）を用いて、配列依存プロトコルにより、脂肪酸デサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコード化する配列を単離する、ことを含む方法。
１５．請求の範囲１４の方法の産物。
１６．受託番号ＡＴＣＣ　７５１６７で識別されるアラビドプシス・タリアナの単離ゲノムＤＮＡ。
１７．ダイズのデルタ−１５デサチュラーゼのためのコード化を行う単離されたｃＤＮＡクローンにおいて、ｐＸＦ１と表示するこのクローンが配列同定番号１０のＤＮＡ配列を含んでおりそして受託番号ＡＴＣＣ６８８７４で識別されるクローン。
１８．油種子ブラシカ種のデルタ−１５デサチュラーゼのためのコード化を行う単離されたｃＤＮＡクローンにおいて、ｐＢＮＳＦ３と表示するこのクローンが配列同定番号６のＤＮＡ配列を含んでおりそして受託番号ＡＴＣＣ　６８８５４で識別されるクローン。
１９．ゼア・マイスのデルタ−１５デサチュラーゼのための単離されたポリメラーゼ連鎖反応産物において、ｐｃｒ２０と表示するこのクローンが配列同定番号１４のＤＮＡ配列を含んでいる。