JPH07501936A - ヌクレオシドオリゴマーを用いる一本鎖核酸の三本鎖ヘリックス複合体の形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシドオリゴマーを用いる一本鎖核酸の三本鎖へリノクス複合体の形成関 連出願との相互参照 本出願は、米国特許出ｍＮｏ、　９２４．２３４（１９８６年１０月２８日出１ ＪＩ）の一部継続出願である米国特許出願Ｎｏ、　３６８．０２７（１９８９年 ６月１９日出願ンの一部継続出願であり、これらの開示は本明細書の一部を構成 するものとする。

發肌Ω背屡 本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｕ、 Ｓ、Ａ、の援助（援助番号Ｃ＾４２７６２）を含む政府支援を受けて為されたも のである。政府は本発明に対して一定の権利を有している。

本明細書中で引用した出版物およびその他の参考文献資料は本明細書の一部を構 成するものとし、以下の文中で番号を付して引用し、請求の範囲のすぐ前に添付 した文献目録に各資料をまとめて示す。

本発明は、選択した一本鎖核酸構造と特異的に複合化して三本鎖へソックス構造 を与えつる第１および第２のヌクレオシドオリゴマーを用いて、−水路核酸（特 に、ＲＮＡ）中の特定の配列を検出および認識する新規な方法に関する。

フーグスティーン水素結合による二本鎖ＤＮＡ中のポリプリン区域へのホモピリ ミジンオリゴデオキシリボヌクレオチド結合による三本鎖へソックス構造の形成 が報告されている（例えば、ｌおよび２を参照）。このホモピリミジンオリゴヌ クレオチドは、三本鎖へリノクス形成によって二重らせんＤＮＡの主グローブ（ みぞ）中の長（延びたプリン配列を認識することがわかっていた。特異性は、ホ モピリミジンオリゴヌクレオチドとシトシン・クリック二本鎖ＤＮＡのプリン鎖 の間のフーグスティーン塩基対含によって付与されることがわかっていた。

第３の鏡上にシトシンとチミジンを含有する三重らせん複合体は酸性ないし中性 の溶液中でそれぞれ安定であることがわかっており、ｐＨの増加につれて解離す ることがわかっている。このフーグスティーン鎖にＴの修飾塩基（例えば、５− ブロモウラシル）およびＣの修飾塩基（例えば、５−メチルシトシン）を導入す ると、三本鎖ヘリックスの安定性がさらに高いｐＨ範囲で増加することがわかっ ている。シトシン（Ｃ）をフーグスティーン型対合に関与させるためには、ピリ ミジン環のＮ−３上の水素が水素結合に利用可能でなければならない。従って、 ある種の状況下では、シトシンがＮ−３においてプロトン化されることがある。

ＤＮＡは広範囲の多形性立体配座を示し、このような立体配座が生物学的過程に 必須であることがある。配列特異的なタンパク質−ＤＮへの結合および分子の相 互作用によるシグナル　トランスダクシタン（例えば、転写、翻訳、および複製 ）の変調は、ＤＮＡの立体配座に依存すると考えられている（３）。

ゲノムの重要な領域に結合し、異常細胞の機能、複製および生存を選択的に阻害 する治療薬物を開発する可能性を考えるのは興味あることである（４）。配列特 異的なりＮＡ結合分子の設計および開発は種々の研究所により推進されており、 外来遺伝物質（例えば、ウィルス）またはゲノムＤＮＡの変化（例えば、癌）が 関与する疾患の診断および治療に対して広範囲な関連を有している。

メチルホスホネート（ＭＰ）骨格からなるヌクレアーゼ耐性の非イオン性オリゴ デオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が、可能性ある抗癌物質、抗ウイルス物質およ び抗菌物質としてインビトロおよびインビボで研究されている（５）。これら類 似体の５°−３°結合したヌクレオチド間結合は、核酸ホスホジエステル結合の 立体配座に極めて近似している。このホスフェート骨格は１個のアニオン性ホス ホリル酸素のメチル置換によって中性にされており、荷電したホスフェート基に よる鏡開および鎖内の反発作用を減少させている（５）。ＭＰ骨格の類似体を生 細胞に入れることができるが、この類似体はグロビン合成および水庖性口内炎ウ ィルスのタンパク質合成におけるｍＲＮＡの翻訳を阻害し、Ｈ３Ｖ複製の阻害に おいてプレｎ＋ＲＮＡのスプライシングを阻害することが示されている。これら 非イオン性類似体による阻害の作用機序には、相補性のＲＮＡおよび／またはＤ ＮＡとの安定な複合体の形成が含まれる。

選択した一本鎖の外来核酸配列に相補性である非イオン性オリゴヌクレオシドの アルキルおよびアリールホスホネート類似体が、該核酸に結合するかまたは該核 酸に干渉することにより、細胞中に存在する他の核酸の機能または発現を妨げる ことなく該特定の核酸の機能または発現を選択的に阻害することができると報告 されている（例えば、米国特許Ｎ　ｏ、　４．４６９．８６３および４．５１１ ．７１３を参照）。哺乳動物細胞によって取り込まれる相補性のヌクレアーゼ耐 性の非イオン性オリゴヌクレオシドメチルホスホネート類を用いて、ある状況下 でウィルスタンパク質の合成（単純庖疹ウィルス１を含む）を阻害することが、 米国特許Ｎｏ、　４．７５７．０５５に開示されている。

ウィルスｍＲＮＡの一部に相補性であるアンチセンスのオリゴヌクレオチドまた はホスホロチオエート類似体を用いて、ウィルスａＲＮＡのタンパク質への翻訳 および転写を遮断することが提案されている。このアンチセンス構築物はウィル スｍＲＮＡに結合することができ、細胞リポソームがｎＲＮＡに沿って移動する のを妨げ、それによってｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を停止させるものと考え られている（「翻訳停止」または「リポソームハイブリダイゼーション停止」と 呼ばれる過程）。

ＨＴＬＶ−Ｉ＋＋の復製および／または発現に必要なＨＴＩ、Ｖ−１１１ゲノム の高保存性領域に相補性であるオリゴヌクレオチドの投与によってＨＴＬＶ−Ｉ Ｉ＋による細胞感染を阻害することが米国特許Ｎ　ｏ、　４．８０６．４６３に 開示されている。これらのオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素活性（複製）なら びにウィルスタンパク質ｐ１５およびｐ２４の産生（遺伝子発現）によって調べ ると、ウィルスの複製および／または遺伝子発現に影響を与えることがわかった 。

ヌクレオノド間メチルホスホネート結合を含むある種のアンチセンスオリボデオ キ／ヌクレオチドがＨ［Ｖ誘導のシンシチウム生成および発現を阻害する能力が 研究されている（７）。

ソラレン誘導体化したオリゴヌクレオシドメチルホスホネートが、暗号または非 暗号−水路ＤＮＡのいずれかを架橋しうることが報告されている；しかじ、二本 鎖ＤＮＡは架橋されなかった（２８）。

−吸史裂汐 本発明は、一本ｗ１核酸または一本鎖核酸配列の特定セグメントを検出または認 識する方法、ならびに二本鎖へワックス複合体を形成させることによっである標 的配列を有する一本鎖核酸の特定セグメントの機能の発現を妨げる方法に関する 。

１）ＮＡまたはＲＮＡのいずれかの標的配列の二本鎖へワックス複合体を形成さ せてよい。

また、本発明は、選択した一本鎖核酸配列の発現および／または機能化を妨げる のに有用であり、かつ所望により核酸を修飾する基を含有する新規な修飾化オリ ゴマーに関する。さらに、本発明はピリミジンおよび／またはプリンヌクレオシ ド類似体を含有するオリゴマーに関する。具体的には、これらプリンヌクレオ７ ド類似体は三本鎖構造の形成および安定性を有利にするように、そして標的核酸 配列の誤読を減少させるように修飾する。

１つの態様において、本発明は、−水路核酸標的配列の機能または発現を妨げる 方法であって、該標的配列を第１のオリゴマーおよび第２のオリゴマーと接触さ せることからなる方法に関する（ここで、該第１および第２のオリゴマーのヌク レオシド配列は二本鎖へリノクス構造が形成されるように選択する）。１つの好 ましい態様によれば、この核酸標的配列はポリプリンまたはポリピリミジン配列 のいずれかを念何する。この標的配列がホモプリン配列であるときには、第１お よび第２のオリゴマーはピリミジンヌクレオシドもしくは類似体だけを含有して いてよく、あるいは別法では該第１および第２のオリゴマーの一方がプリンヌク レオシドだけを含有し、他方がピリミジンヌクレオシドだけを含有する。しかし 、標的配列がホモピリミジン配列であるときには、第１および第２のオリコマ− はプリンヌクレオシドだけを含有していてよく、あるいは別法では該第１および 第２のオリゴマーの一方がプリンヌクレオシドだけを含有し、他方がピリミジン ヌクレオシドだけを含有する。

１つの特に好ましい態様においては、天然のプリンヌクレオシドの類似体を本！ 明のオリゴマーにおいて用いる。これらプリンヌクレオシド類似体を修飾して水 素結合立体配置を有利にする。この立体配置は、第１および第２のオリゴマー本 発明は、一本鎖核酸セグメントが生細胞中のｍＲＮＡであり、かつ二本鎖へ二本 鎖の安定性を助ける。

１つの態様において、本発明は、一本鎖核酸または一本鎖核酸配列の特定セグ／ 類似体を含有する新規なオリゴマーに関する。

さらに、本発明は、一本鎖核酸の特定セグメントと第１および第２のオリゴマー の相互作用によって二本鎖へリノクス構造を形成させることに関する。この第み それに塩基対合（または、ハイブリダイズ）するに十分な相補性を該ハイブリッ ドに対して有する。

従って１つの態様においては、本発明は一本鎖核酸の特定セグメントを検出また 鴎認識する方法であって、該セグメントと第１のオリゴマーの間でハイブリ・ノ ドを形成させ、該ハイブリッド核酸を第２のオリゴマー（このオリゴマーは、該 ハイブリッド中のプリン塩基の配列またはその一部に水素結合またはハイブリダ イズするに十分な相補性をそれに対して有しており、従って二本鎖へソックス構 造を与える）と接触させることからなる方法に関する。

別の態様において、本発明は、ある配列を有する一本鎖核酸の特定セグメントの 発現または機能を防止または阻害する方法であって、初めに相補性の第１のオリ ゴマーを用いてハイブリッドを形成させ、次いで該ハイブリッドを第２のオリゴ マー（該二本鎖ハイブリッドとの水素結合を形成するに十分な相補性を該ハイブ リッドに対して有しており、従って二本鎖へリノクス構造を与える）と接触させ ることからなる方法に関する。

る環位置での水素結合に利用可能な水素を有する複素環を含有するものであるオ リノクス構造の形成が該ｍＲＮＡを阻害または不活性化し、その翻訳を妨げるも のである方法に関する。

別の態様によれば、本発明は二本鎖へワックスの形成によってインビボで一本鎖 核酸配列配列の発現を妨げるかまたはそれに干渉する方法を提供する（ここで、 ｔ〒的配列は開始コドン、ポリアデニル化領域、ａＲＮＡキャップ部位またはス プライス連結点をコードしているＲＮＡ領域である）。第１および第２のオリゴ マーは、それらが二本鎖ヘリックスを形成し、従って標的配列の発現を実質的に 妨げるかまたはそれに干渉するように選択する。

また、本発明は、翻訳可能なｍＲＮＡを得るためのプレｍＲＮＡのスプライ／フ グを妨げることによって、細胞中の遺伝子または遺伝子のタンパク質産物の発現 を選択的に妨げるかまたはそれに干渉する方法を提供する。これらの方法によれ ば、第１および第２のオリゴマーは、それらが標的配列と二本鎖へリノクスを形 成するように選択し、細胞中に導入し、そして標的配列と二本鎖へワックスを形 成させ、プレｆｆ１ＲＮＡのスプライシングを妨げる。

別の態様において、本発明は、標的と第１および第２のオリゴマーによる二本鎖 へリノクスの形成によって、全体のＤＮＡ合成を実質的に阻害することな（イン ビボで一本鎖ＤＮＡ標的配列の復製または翻訳を阻害する方法を提供する。

好ましい態様においては、該第２のオリゴマーを修飾して核酸修飾基を導入する 。この基は、この第２のオリゴマーがハイブリッドに水素結合するかまたはノー イブリグイズした後に、ハイブリッドとの化学的反応を引き起こし、それを不可 逆的に修飾するものである。このような修飾には、共有結合を形成させることに よる第２のオリゴマーおよびハイブリッドの架橋、）・イブリッドのアルキル化 、ハイブリッドの特定位置での切断、またはハイブリッドの分解もしくは破壊に よるものか＾まれる。

また、本発明は、ントンン類似体かントンンの代わりとなっているヌクレオシド 配列位を含有するオリゴマーであって、該シトンノ類似体が、中性ｐＨでグアニ ン塩基と２つの水素結合を形成することが可能かつントシンのＮ−３に対応すリ ボマーをｔ是（共する。

本発明は、アデニンまたはグアニンのプリン類似体が少な（とも１つのアデニン またはグアニン塩基の代わりとなっているオリゴマーを提供する。具体的には、 ２−アミ／プリンがアデニ７の代わりとなっていてよく、グアニンはその６−セ レニウム類似体または６−インブロビレジンー７−ヂアザグ了コンに十−丁暦噛 結合には、リン含有結合、例えばホスホジエステル結合、アルキルおよびアリー ル−ホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホルアミダイト結合およ び中性リン酸エステル結合、例えばホスホトリエステル結合；ならびにリンを含 有しないヌクレオシリル間結合、例えばモルホリノ結合、ホルムアセクール結合 、スルファメート結合、およびカルバメート結合が含まれるが、これらに限定は されない。当分野で既知の他のヌクレオシリル間結合をこれらのオリゴマーに用 いてよい。また、好ましい態様によれば、これらのオリゴマーは修飾された糖部 分を何するヌクレオシジル単位を含有していてよい。これらの修飾された糖部分 には、リボシル部分、デオキシリボシル部分および修飾されたリボシル部分、例 えば２°−０−アリールリボシル（ｌ〜１０炭素原子数のアルキル）、２’−０ −アリールリボシル、および２′−ハロゲンリボシル（全てが所望によりハロゲ ン、アルキルおよびアリールで置換されていてよい）、ならびに、特に２′−〇 −メチルリボシル部分が含まれる。特に、修飾されたリボシル（特に、２°−０ −メチルリボシル）部分を有するヌクレオシジル単位の導入によって、二本鎖核 酸配列とのハイブリダイゼーションが好都合に改善され、また、酵素分解に対す る耐性が改善されるであろう。

別の態様において、本発明は、特定の一本鎖核酸の配列に十分に相補性であるこ れらプリンヌクレオシド類似体を含有する新規な非イオン性アルキルおよびアリ ール−ホスホネートオリゴマーを提供する。水素結合し、二本鎖へ１ルツクス構 造を形成するセグメント。非イオン性のメチルホスホネートオリゴマーが好まし い。

また、本発明は、シトシン類似体がシトシンの代わりとなっているヌクレオシジ ル単位を有するオリゴマーであって、該シトシン類似体が、中性ｐＨでグアニン 塩基と２つの水素結合を形成することが可能かつシトシンのＮ−３に対応する環 位置での水素結合に利用可能な水素ををする複素環を含有するもの（例えば、プ ソイドイソシトシン）であるオリゴマーを提供する。このようなシトシン類似体 には、５−メチルシトシン、ならびに表■に示す類似体が含まれる。

定義 本明細書で用いる以下の用語は、池に特記することがなければ以下の意味を有す る。

「プリン」または「プリン塩基」なる用語は、天然のアデニンわよびグアニン塩 基を含むだけでなく、これら塩基の修飾体、例えば８位で置換された塩基、６位 が修飾されたグアニン類似体またはアデニンの類似体、２−アミノプリンをも包 含する。

「ヌクレオシド」なる用語は、ヌクレオシジル単位およびそれと交換可能に用い られる単位を含み、５炭糖と窒素含有塩基からなる核酸のサブユニットを指す。

この用語には、塩基としてＡ、Ｇ、ＣＳＴおよびＵを有する単位だけでなく、こ れら塩基の類似体および修飾された形態（例えば、８−置換プリン）が含まれる 。

ＲＮＡでは５炭糖はリボースであり、ＤＮＡでは２°−デオキシリボースである 。

また、この用語には、このようなサブユニットの類似体が含まれる（２°−０− アルキルリボースなどの修飾された糖を含む）。

「ホスホネート」なる用語は、 ［式中、Ｒはアルキルまたはアリール基である］を指す。適当なアルキルまたは アリール基には、このホスホネート結合に立体１１１害性でないか、または互い に相互作用しない基が含まれる。このホスホネート基はｒＲＪまたはｒＳＪ立体 配置のいずれで存在していてもよい。ホスホネート基をヌクレオシリル間リン基 結合（または、連結）として用いてヌクレオシジル単位を連結させることができ る。

「ホスホジエステル」なる用語は、 ■ にこて、ホスホジエステル基をヌクレオシリル間リン基結合（または、連結）と して用いてヌクレオシジル単位を連結させることができる］を指す。「非ヌクレ オシド単量体（モノマー）単位」は、標的配列へのオリゴマーのハイブリダイゼ ーションに有意に関与しない単量体単位を指す。このような単量体単位は、例え ばヌクレオシドとのどのような有意の水素結合にも関与するものであってはなら ず、成分として５ヌクレオチド塩基またはその類似体のいずれかを有する単量体 単位を除外する。

「ヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマー」はヌクレオシドおよび非ヌクレオシ ド単量体単位からなるポリマーを指す。

［オリゴヌクレオシド」または［オリゴマーＪ　１１、ヌクレオシド間結合によ って結合したヌクレオシド鎖を指し、通常は長さが約６〜約１００ヌクレオシド であるが、約１００ヌクレオシドより長いものであってもよい。通常、これらは ヌクレオシド単量体から合成されるが、酵素法によって入手することもできる。

即ち、［オリゴマー号なる用語は、ヌクレオシド単量体を結合するヌクレオンジ ル間結合を有するオリゴヌクレオシド鎖を指す。従って、オリゴマーには、オリ ゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキルおよびアリール−ホス ホネート類似体、オリゴヌクレオチドのアルキルおよびアリール−ホスホノチオ ニート、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート類似体、オリゴヌクレ オチドのホスホルアミゲイト類似体、中性ホスフェートエステルオリゴヌクレオ シド類似体、例えばホスホトリエステルおよびその他のオリゴヌクレオシド類似 体および修飾されたオリゴヌクレオシドが含まれ、また、ヌクレオシド／非ヌク レオシドポリマーが含まれる。さらに、この用語には、単量体単位の間の１また はそれ以上のリン基結合が非リン結合、例えばモルホリノ結合、ホルムアセクー ル結合、スルファメート結合またはカルバメート結合によって置換されているに ヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーが含まれる。

「アルキルまたはアリール−ホスホネートオリゴマー」なる用語は、少なくとも １つのアルキルまたはアリール−ホスホネート　ヌクレオシリル間結合を有する オリゴマーを指す。

「メチルホスホネートオリゴマー」（または、ｒＭＰ−オリゴマー」）なる用語 は、少なくとも１つのメチルホスホネート　ヌクレオシリル間結合を有するオリ ゴマーを指す。

「中性オリゴマー」なる用語は、ヌクレオシド単量体の間に非イオン性ヌクレオ ンジル間結合（即ち、正味の正または負のイオン電荷を持たない結合）を有する オリゴマーを指し、これには、例えばヌクレオシリル間結合を宵するオリゴマー 、例えばアルキルまたはアリール−ホスホネート結合、アルキルまたはアリール −ホスホノチオエート、中性ホスフェートエステル結合、例えばホスホトリエス テル結合、特に中性エチルトリエステル結合；ならびに非リン含有のヌクレオシ リル間結合、例えばスルファメート、モルホリノ、ホルムアセクールおよびカル バメート結合を何するオリゴマーが含まれる。所望により、中性オリゴマーはオ リゴヌクレオシドまたはヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーと第２の分子（ コンジュゲート相手を構成する）の間のフンシュゲートからなっていてもよい。

このようなコンジュゲート相手は、インターカレーション試薬、アルキル化試薬 、細胞表面受容体の結合物質、親油性試薬、光架橋試薬、例えばソラレンなどか らなっていてよい。さらに、このようなコンジュゲート相手は、オリゴマーの取 込みを増強するか、オリゴマーと標的配列の相互作用を修飾するか、またはオリ ゴヌクレオシドの薬物速度論的分布を変化させるものであってもよい。必須の必 要条件は、コンジュゲートが含有するオリゴヌクレオシドまたはヌクレオシド／ 非ヌクレオシドポリマーが中性であることである。

「中性アルキルまたはアリール−ホスホネートオリゴマー」なる用語は、少なく とも１つのアルキルまたはアリール−ホスホネート結合を含有する中性ヌクレオ フジル間結合を有する中性オリゴマーを指す。

「中性メチルホスホネートオリゴマーＪなる用語は、少なくとも１つのメチルホ スホネート結合を含有するヌクレオシリル間結合を有する中性オリゴマーを指す 。

「三重Ａリボマ一対」なる用語は、一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ） のセグメントを読み、それと二本鎖ヘリックス構造を形成することができる第１ および第２のオリゴマーを指す。

「第３鎖オリゴマー」なる用語は、二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ二本鎖またはＤ ＮＡ−ＲＮＡ二本鎖）のセグメントを読み、それと二本鎖へリノクス構造を形成 することができるオリゴマーを指す。

三重オリゴマー対または第１および第２オリゴマー（または、第３鎖オリフマー ）について言及するときの「相補性」なる用語は、一本鎖核酸の塩基配列（また は、第３鎖オリゴマーの核酸二本鎖）に水素結合（および塩基対合またはハイブ リダイズ）して二本鎖ヘリックス構造を形成する塩基配列を有するオリコマ−を 指す。

本明細書中に列挙した種々のオリゴマー配列において、例えばＡＰＡ中のｒｐＪ はホスホジエステル結合を表し、例えばＣＰＧ中のＩＰＪはメチルホスホネート 結合を表す。また、［１１などの表示は、メチルホスボネート結合によって結合 したヌクレオンジル基を示す。

［読む−１なる用語は、別の核酸の塩基配列および水素結合相互作用を介して認 識する核酸残基の能力を指す。即ち、一本鎖ＤＮＡ配列を読む際に、それぞれの 三重オリゴマー対のオリゴマーの対応する塩基が、水素結合相互作用を介して、 一本鎖ＤＮＡのセグメントの対応する塩基を認識し、それとトリブレ、トを形成 することができる。

「トリブレット」なる用語は、図ＩＡ、ＩＢ：２Ａ〜２Ｄおよび３Ａ〜３Ｃに示 すような状況を指す。ここで、第１および第２のオリゴマーそれぞれの塩基は、 一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの標的セグメントの対応する塩基と水素結合（従って 、塩基対合）している。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢはトリブレットを示すものであり、ここでは２つのピリミジン 塩基が中心のプリン塩基とトリブレットを形成している。

図２Ａ〜２Ｄはトリブレットを示すものであり、ここではプリン塩基とピリミジ ン塩基が中心のプリン塩基とトリブレットを形成している。

図３Ａ〜３Ｃは、ＧまたはＡの類似体を導入したトリブレットを示す。

図４Ａ〜４Ｅは例示のための混合配列二本鎖ヘリックス構造の塩基配列を示すも のであり、ここで三重オリゴマー対の１つが他の２つの鎖を横断して「読み」、 従って他の鎖の両方のプリン塩基と塩基対合している。

図５は、ヌクレオシド間リン結合を長くするためのアルキレンオキシ連結を有す る修飾糖部分を有するヌクレオシジル単位およびその製造方法を示す。

図６は、ヌクレオシド間リン結合を長くするためのアルキレン連結を有する修飾 糖部分を有するヌクレオシジル単位およびその合成方法を示す。

図７は、二本鎖へすｌクス構造のＣＤスペクトルを示すものであり、（ニ）はＭ Ｐ−オリゴマー第３鎖を示し、（工）はオリゴヌクレオチド第３鎖を示す。

図８Ａおよび８Ｂは、ソラレン誘導体化したＭＰ−才リゴマ−を用いる（Ａ）一 本鎖ＤＮＡ、および（Ｂ）二本鎖ＤＮＡの架橋を示す。

図９Ａ〜９ＥはＣＤスペクトルを示す。図９Ａは、室温の緩衝液Ａ中のオリゴマ ー■（−）およびＩＩ（−−−）ならびに室温の緩衝液Ｂ中の１１１（−・−） のＣＤスペクトルを示す。図９Ｂは、室温の緩衝液Ａ（−）および緩衝液Ｂ　（ −−−）中のｔ−１１（２：１）のＣＤスペクトルを示す。図９０は、室温の緩 衝液Ａ中の１＝ｌの１’−１１のＣＤ７．ペク）ル（−）、および１／２ｒＩ− ＩＩ（２：１＋１１］から導いた計算ＣＤスペクトル（−−−）を示す。図９Ｄ は、ｌｌ−１１１（１：　１）＋１（−）、＋　（−−−）、ｌｌ−ｌ１１（＝ ・−）のＣＤスペクトル、および＋ｉ−ｍと１のスペクトルの和を示す（全て室 温の緩衝液人中）。図９Ｅは、緩衝液Ａ中で室温（−）および３℃（・・・）、 ならびに緩衝液Ｃ中で室温（−−−−）および３℃（−−−）の＋＋−１ｏ（ｔ 　：　１）ＩＩのＣＤスペクトルを示す。

図１０は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのオートラジオグラムを示 す：レーン１ｕｌｌ；レーン２　：　ＩＩＩ−１１（２：　１　）：レーン３　 ：　ｌ−１１（２：　ｌ）；レーン４：ＩＩＩ；レーン５　：　ｌｌｌ−１ｔ（ １，５：　１）；レーンｅ　：　ｌ　−ＩＩ−Ｉｌｌ（１゜５：Ｉ：１．５）。

レーン１〜３においては３叩でラベルした１１を、そしてレーン４〜６において は３１ＰでラベルしたＩＩＩを放射活性マークとして用いた。

図１１ＡおよびＩＩＢは、ｌ−１１−１のＵＶ融解／アニーリングのプロフィー ルを示す。図１１Ａは正規化した濃色効果の変化を示し、図１１Ｂは解離（＝） と会合（−−−）の濃色効果の変化の比を示す。

図１２は、室温での２′−〇−メチル（ｐｉＣＵ）ｓ・ｒ（ＡＧ）ｓ、２：Ｉ（ −）、および２′−〇−メチル（ｐｉｃｋ）。ｄ（八〇）ｓ（−−−）のＣＤス ペクトルを示す。

図１３は、２°−０−メチル（ｐｉＣＵ）、・ｒ（ＡＧ）ｓ（２：　１）の融解 曲線を示す。

図１４Ａおよび１４Ｂは、ｄ（ＡＧ）、＋ｄ（ＣＴ）。およびｄ（八Ω）、＋ｄ （ＣＴ）ｓの混合曲線の折り返し点を示す。

図１５Ａ〜１５ＤはＣＤスペクトルを示す。図１５Ａは、ｄ（ＡＧ）、・ｄ（Ｃ Ｔ）、、１：１（−）およびｄ（ＡＧ）、一本鎖（−−−）のＣＤスペクトルを 示す。図１５Ｂは、ｄ（ＡＧ）ｓ・ｄ（ＣＴ）、（２：　Ｉ　Ｘ−）、二本鎖と 一本鎖の重量平均からの計算スペクトの計算スペクトル（−−−）をホス。

図１６Ａ〜１６Ｃは、ｄ（ＡＧ）、・ｄ（ＣＴ）、（１：　］）（１６Ａ）；ｄ （ＡＧ）ｅ・ｄ（ＣＴ）、（１：　＋、）（ｔ　６Ｂ）：およびｄ（ｘＧ）、・ ｄ（ＣＴ）、（２：　１）（１８Ｃ）の熱変性曲線を示す。

図１７は、γ［”Ｐ］末端ラベルしたｄ（ＣＴ）お（レーン１〜１２）およびｄ （ＡＧ）。

（Ｌ／−７１３〜１７）を含む天然ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラ フを示す。

図１８Ａは、ｄ（Ａ　Ｇ）、・ｄ（ＣＴ）、ｉ！合物（１：１）および（２：１ ）の水素結合したＮ　Ｈ−Ｎ共鳴を示す。

図１８Ｂは、図１８への２−１混合物に対して観察された３つの共鳴の化学／フ トのａ度依存性を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、選択した標的−水路核酸配列との二本鎖へワックス構造の形成を包含 するものであり、この構造の形成は、該核酸を第１および第２のオリゴマー（三 重オリゴマー対）［標的配列との三重らせん（または二本鎖ヘリックス）複合体 を形成するヌクレオノド配列を有するように選択する］と接触させることによる 。

（Ａ）一般的態様 本明細書中に記載した他の管様に加えて、本発明は以下の態様を包含する。

第１の態様は、一本鎖核酸セグメント中の塩基の解読（または、認識）に関する ものであり、アデニンおよびグアニンまたはその類似体などのプリン類の余分の 水素結合部位を用いて第１および第２のオリゴマー中の塩基によって水素結合を 形成させうることに・よる。他の言い方をすると、一本鎖核酸中の塩基配列を読 んでトリブレットを与える際に、このトリブレットの中心位置に常にプリンが存 在する（「中心プリン」）。この中心プリン塩基は、−水路標的配列上にあって もよいし、また、標的がピリミジン塩基であるときには第１または第２のオリゴ マーのどちらかにあるであろう。このトリブレットは、中心プリン塩基の残存す る利用可能な水素結合部位と他の２本の鎖中の塩基とで水素結合を形成すること によって形成される。プリン類［アデニン（ａ）、グアニン（ｂ）、または本明 細書中に記載するアデニンおよびグアニンの類似体など］、またはピリミジン類 ［チミン（Ｔ）、シトシン（ｃ）、または本明細書中に記載するシトシンの類似 体］の両方が、中心プリンと水素結合を形成することができる。

（ｉ）トリブレットの中心位置のアデニン（Ａ）は、他の鎖中のＡ（または、へ 類似体）またはＴを読むか、それと水素結合する。

（ｉｉ））リブレットの中心位置のグアニン（Ｇ）は、他の鎖中のＣ（または、 Ｃ類似体）またはＧ（または、６類似体）を読むか、それと水素結合する。

本発明の好ましい帖様においては、第１および第２のオリゴマーのリン含有骨格 はメチルホスホネート基ならびに天然のホスホジエステル基を含有する。

プリンとピリミジンの基本の面は堅く、フラノース環は小さな波（面の上下に約 ０．５人）だけが可能である。従って、ヌクレオシドの立体配座の状態は、これ ら２つのどちらかというと堅い面の回転によって主に規定されている（即ち、塩 基とペントース、互いに関してＮ−９またはＮ−１結合に対するＣ’−１の軸の まわり）。糖に基づくねじれ角φ。は、結合に対してＣｏ−１に沿って見たとき のフラノース環の０−１゛結合に対するＣｏ−１の投影による塩基の面のトレー スによって形成される角度と定義されている。この角度はフラノース環の酸素が ピリミジンまたはプリン環のＣ−２に対して反平面的であるときにはＯとされ、 正の角度はＮに対してＣ−１゛を見たときの時計方向で測定した角度として採用 する。

また、この角度はグリコジルねじれ角とも呼ばれている。上記の定義を用いて、 ヌクレオシドに対して２つの範囲のφ。が存在すると結論されている［すなわち 、凱■立体配座に対しては約−３０１よびυ旦立体配座に対しては約１５０°］ 。それぞれの立体配座の範囲は約±４５°である（２２．２２ａ）。他の研究者 らは、この角度のわずかに異なる定義を使用または提案している（２３．２４． ２５．２６．２７）。φ。に関する情報は、Ｘ線回折法、プロトン磁気共鳴（Ｐ ＭＲ）および旋光分散−円二色性（ＯＲＤ−ＣＤ）などの方法を用いて得られて いる（２２ｍ）。

二本鎖核酸標的の場合、一方の鎖（「ワトソン鎖」と呼ばれる）から反対の鎖（ 「クリック鎖」と呼ばれる）へと読まれるプリン塩基の位置の変化を適応させる ために、第三鎖中のプリンヌクレオシジル単位の、グリコジル結合のねじれ角に よって定義される、ヌクレオシドの特定の立体配座が、第三鎖中のプリンヌクレ オシドを用いて二本鎖中のプリンを読むことができるようにするために必要とさ れることを認識した。他の言い方をすると、ＤＮＡ中のプリン塩基を読むために 、第三鎖中のプリンヌクレオシジル単位の立体配座は、第三鎖との関係でＤＮＡ 中で読まれるプリン塩基を含有する鎖の極性［平行（５°から３°）または反平 行（３゜から５°）の方向］によって影響を受ける。二本鎖中の平行鎖中のプリ ンを読む第三鎖中のプリンヌクレオシジル単位のためには、第三鎖中のプリンヌ クレオシジル単位の立体配座はｓｙｎ立体配座にあるべきである。他方、二本鎖 中の反平行鎖中の対応するプリンを読む際には第三鎖中のプリンヌクレオシジル 単位の立体配布【１．ているプリン塩基を読む際には、いずれか一方の鎖または 反対の鎖と同一の極性を有する（即ち、それに平行である）第三鎖を用いる選択 がある。この例としては、 ５′から３°までのワトソン鎖の同一極性を有するＤＮＡ二本鎖とのトリプレ１ トにおける第三鎖の配列は次のようであろう：５′ Ｇ＠ｙ′″ ３゜ Ｇｓ′１１ 　ｍＦｎ 本発明の１つの態様によれば、二本鎖の塩基対中のプリンを読むための第三鎖を 構築する際に、次の指針を適用する＋（ｉ）５°末端から３″末端の方向で開始 して、第三鎖のプリンヌクレオシジル単位（ＡまたはＧ）は、二本鎖核酸の平行 （「ワトソン」）鎖の塩基対中のプリン（ＡまたはＧ）を読む際にす見立体配座 にあることが必要とされる。第２の塩基対中の第２のプリンを読む際に、このプ リンが第１のプリンと同じ鎖中に位置しているときには、同一の必要条件が当て はまる。しかし、この第２のプリンが反対側の反平行（「クリック」）鎖（ここ で、反対側の鎖は第３鎖に対して反平行である）中に位置しているときには、ブ リンヌクレオンジル単位はａｎｔ　ｉ立体配座にあることが必要とされる。全て の場合において、第３鎖中のアデニンを用いて二本鎖中のアデニンを読み、第３ 鎖中のグアニンを用いて二本鎖中のグアニンを読む。

本発明の第３の態様は、二本鎖核酸のどちらかの鏡上のプリン塩基の解読を可能 にする第３鎖のリン骨格の結合の長さに関する。どちらかの鏡上のプリン塩基を 「読む」（または、それと塩基対化する）ことが可能であるためには、リン骨格 に沿うヌクレオンジル単位の間の距離が増加しなければならない。リン骨格のた めに２種類の結合を長くする形式が提案される。リン骨格のための１つの種類の 結合形式は、個々のヌクレオンジル単位に対して普遍の延長結合を用いる（即ち 、第３鎖の長くする結合の全てが同一である）。このような普遍の結合形式は、 プリン塩基だけを含有する第３鎖に特に適している。即ち、「ヌクレオシジル単 位↓」の５°炭素からそれに続く「ヌクレオシジル単位２Ｊの３°酸素までの間 の結６の長さを２原子（例えば、−ＣＨ、ＣＨｔ−）または３原子（例えば、− ０−ＣＨ。

−ＣＨ，−）で増加させ、それによって個々のヌクレオシジル単位の間の結合を ２〜６人長くすることができる。ヌクレオシジル単位の間の適切な距離を可能に するためには、これら単位の分離を１〜６の範囲の炭素原子数て増加させること が推奨される。図６は、この結合を長くする形式を含むヌクレオシジル単位の例 を示し、その合成経路を提案するものである。

リン骨格のための第２の結合を長くする形式は、不均一に長くする結合を含有す るであろう。第３鎖のための襟章のホスホジエステル骨格に似たヌクレオンジル 間距離を有する結合が、読まれるプリンが同−鏡上に存在するときに用いられ、 一方、長くした結合（１５〜１７人の長さ）［あるヌクレオシジル単位の３°炭 素上およびそれに隣接する５°炭素上に長（する結合を含むことができる］を用 いて反対側の鎖に位置するプリン塩基を読ませる。このような不均一に長くする 結合形式は、ピリミジン（または、ピリミジン類似体）とプリン塩基の両方を含 有する第３鎖において使用するのに特に適している。

（以下、余白） （Ｂ）二本鎖へり！クス構造の形成 図ＩＡは、どちらかの側でＴに水素結合している中心Ａ塩基を有するトリブレ、 。

トを示す。この場合、一方のＴ含有鎖はＡ含有鎖に平行に並び、他方のＴ含有鎖 はＡ含有鎖１こ反平行に並んでいる。従って、このトリブレットの配列は、次の ように記述される： 図ＩＢは、一方の側でプロトン化Ｃおよび他方の側でＣに水素結合している中心 Ｃを有するトリブレッドを示す。この場合、三重オリゴマー対の１つは、安定な トリプレ・ノドに必要な水素結合を形成するためにＮ３にプロトン化されたント ／ンを有する。所望により、この塩基を、Ｎ−３に類似する位置にプロトンを持 つ窒素を有するシトシン類似体によって置換することができる。示したトリブレ ットにおいては、Ｃ’（または、その類似体）含有鎖は中心Ｃ含有鎖に平行に並 んでいる。Ｃ含有鎖は中心（４有鎖に反平行に並んでいる。従って、このような トリブレット配列、は次のように記述される・図２Ａは、中心Ａが一方の側てＡ （ｒサイドＡＪ）および他方でＴに水素結合しているトリフッノドを示す。サイ ドＡ含有鎖は中心Ａ含有鎖に平行に並んでいる。

Ｔ含有鎖は中心／ｌｌ有位反平行に並んでいる。このような場合、サイドＡのグ リコジル（Ｃ−Ｎ）ねじれ角は用立体配座にあり、中心ＡおよびＴ塩基のグリコ ノルねしれ角は両方とも凹立体配座にある。このようなトリブレット配列は次の ように記述される： また、図２Ｂは、中心Ａが一方の側のＡおよび他方のＴとトリブレットを形成し ているトリブレットを示す。このトリブレットにおいては、サイドＡ含有鎖は中 心Ａ含有鎖に反平行に並んでいる。Ｔ含有鎖は、中心Δ含有鎖に平行に並んでい る。この場合、３つ全ての塩基は匹立体配座にある。このようなトリブレット配 列（オ次のように記述される・ 図２Ｃは、一方の側でＧ（ｒサイドＧ、Ｊ）および他方でＣに水素結合している 中心Ｇを膏するトリブレ、トを示す。サイドＣ含有鎖は中心Ｃ含有鎖に平行に並 んており、（４有鎖は中心Ｃ含有鎖に反平行に並んでいる。このような場合、サ イドＧのグリコジルねじれ角は拉立体配座にあり、中心ＧおよびＣのグリコジル ねじれ角は両方ともｇｎｔｉ立体配座にある。このようなトリブレット配列は次 のように記述される。

また、図２Ｄは、中心Ｃが一方の側でＧおよび他方の側でＣに水素結合している トリブレットを示す。この例においては、サイドＣ含有鎖は中心Ｃ含有鎖に反平 行に並んでおり、Ｃ含有鎖は中心Ｃ含有鎖に反平行に並んでいる。このような場 合、３つ全ての塩基のグリコジルねじれ角はａｎｔｉ立体配座にある。このよう なトリブレット配列は次のように記述される：図３Ａおよび３Ｂは、中心Ｇが一 方の側で修飾されたＧおよび他方の側でＣに水素結合しているトリブレットを示 す。修飾されたＧ［図３Ａの２−アミノ−９−β−Ｄ−リポフラノシルブリン− ６−セレン（「６−セレニウムグアノシン」）または図３Ｂの６−イソプロピリ デンー７−デアザグアノシンのどちらか］を含有する鎖は中心Ｃ含有鎖に反平行 に並んでおり、Ｃ含有鎖は中心Ｃ含有鎖に反平行に並んでいる。６−セレニウム グアノシンを含有するトリブレットは次のように記述され： そして、６−イソプロピリデンー７−デアザグアノンンを含有するトリブレット は次のように記述される。

第３鎖中の修飾されたＧの読みは、二本鎖形成において正常（即ち、未修飾）Ｇ の６−オキソ基の削除によってさらに特異性が高くなるであろう。

図３Ｃは、中心へが一方の側で修飾されたＡ（２−アミノプリン）および他方の 側でＴに水素結合しているトリブレットを示す。２−アミノプリン含有鎖は中心 Ａ含有鎖に平行に並んでおり、Ｔ含有鎖は中心Ａ含有鎖に反平行に並んでいる。

このようなトリブレット配列は次のように記述される；このトリブレットにおい て、２−アミノプリンのＮｌは中心Ａの６−アミ７基からプロトンを受容してお り、２−アミノプリンの２−アミン基は中心ＡのＮ７にプロトンを供与している ことに注意すべきである。この並びは第３鎖中のグアニン塩基を誘導し、Ｎ、Ｈ および２−アミン基から連続トリブレット中の中心ＧのＮ１基および６−オキソ 基にプロトンを供与することによって、水素結合の対を形成させる。このように して、八とＡの対合は第３鎖のＡからの供与および受容の並びを含有するはずで あり、ＧとＧの対合は第３鎖のＧからの両方の供与並びを含有するはずである。

従って、プリンによるプリンの読み取りがさらに特異性の高いものになるであろ う。

（２）ポリプリン標的配列 一本鎖核酸がポリプリン配列を含有しているときには、形成されるトリプレ、ノ ドの中心プリンをこの鎖が提供して該標的が第１および第２のオリゴマーによっ て完全にサントイ、チ化されるトリブレットを形成することができる。この三重 オリコマ一対は両方かｔ目補性のポリピリミジン配列を含有していてよいし、ま た、第１および第２のオリゴマーの一方がポリプリン配列を有し、一方がポリピ リミジン配列を有していてもよい。

（３）ポリピリミジン標的配列 一水路襟的核酸がポリピリミジン配列を含有しているときには、この標的核酸は トリブレット形成のための中心プリン塩基を提供しないであろう。−水路標的と 二本鎖へリノクス構造を形成する第１および第２のオリゴマーは両方がポリピリ ミジン配列を含有していてよいし、また、第１および第２のオリゴマー〇一方が ポリプリン配列を有し、他方がポリプリン配列を有していてもよい。標的のポリ ピリミジン塩基はトリブレ、トの中心塩基を与えないかもしれないので、「開い たサンドイッチ」の二本鎖ヘリックス慢合体が形成され、ここでは三重オリゴマ ー対の１つがトリブレットの中心プリン塩基を与える。この三重オリゴマー対の 間の二本鎖の形成を減少させるために、第１および第２のオリゴマーの両方がポ リプリン配列を含有するのが好ましいであろう。

（４）混合配列 混合配列とは、選択した一本鎖核酸標的配列がピリミジンとプリン塩基の両方を 含有する配列である。第１および第２のオリゴマーを用いて形成されるこのトリ ブレットは、他の２つの塩基に水素結合してトリブレットを形成することができ る中心プリン塩基を必要とする。従って、第１および第２のオリゴマーの一方は 、他の２つの鎖を交差して「読む」ことができるものでなければならない。第１ および第２のオリゴマーを適切に含む混合配列の例を図４Ａ〜４Ｅに示す。

図４Ａは、他の２つの鎖を交差して読むオリゴマーがピリミジンに富む混合配列 を示す。

図４Ｂは、他の２つの鎖を交差して読むオリゴマーがプリンに富む混合配列を示 す。

図４Ｃ，４Ｄおよび４Ｅは、プリン塩基だけを含有するオリゴマーを交差して読 む混合配列を示す。この図４Ｃ〜４Ｅにおいて、「ｓ」はシ」を示し、ｒａＪは 些を示し、上付き文字がないのはａ　ｎ　ｔ　ｉ　ヲ示ｔ。

第１および第２のオリゴマーの１つが、中心プリン塩基と塩基対合するために、 一方の鎖から反対側の鎖に交差して２つの鎖を読まなければならないときには、 先に記載した骨格結合形式をヌクレオンジル単位の糖部分を連結するリン骨格中 に導入することによって、長くなったヌクレオシジル間リン結合を供するのが好 都合であろう。

例えば、ヌクレオンジル単位の糖部分の５′−炭素と５′−ヒドロキシルの間の 結合または３“−炭素と３°−ヒドロキシルの間の同様の結合を長くする適当な アルキレン［−（ＣＨｔ）。−］またはアルキレンオキシ［−（ＣＨ，）１１０ −］の介在によってヌクレオ／ジル間の結合を長くすることができる（図５およ び図６を参照）。この図に示すように、延長のための結合を糖部分の３″および ５゛の両炭素のところに介在させることができる。

トリブレット形成に使用される連続した中心プリンが同−鎖に現れるときには、 このような延長のための結合を用いる必要はない（メチルホスホネート結合など のヌクレオンジル間リン結合が、池の鏡上の適当な塩基が同−鏡上の連続した中 心プリン塩基を読むことを可能にする）。

従って、表示したところにこのような延長のための結合を用いることによって、 −水路標的または池のオリゴマーのどちらかの中心プリン塩基を読むことができ るオリゴマーを調製することができる。

（Ｃ）第１および第２のオリゴマー 一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの選択した標的セグメントの所望の配列への特異的な 結合を可能にするに十分な数でありうる少なくとも約７個のヌクレオシドを有す る第１および第２のオリゴマーが好ましい。さらに好ましいのは約８〜約４０個 のヌクレオシドを有するオリゴマーであり、特に好ましいのは約１０〜約２５個 のヌクレオシドを有するオリゴマーである。合成における容易性、選択した標的 配列に対する特異性を、オリゴマー内およびヌクレオシド間相互作用（折り畳み およびコイル化など）の最少化と組合せることにより、約１２〜約２０個のヌク レオシドを有するオリゴマーが特に好ましい群を構成すると考えられる。

（１）好ましいオリゴマー これらのオリゴマーは、リボシル部分、デオキシリボシル部分、またはそれらの 修飾体からなっていてよい。しかし、それらの合成の容易性および安定性の増加 の故に、チオキシリポシルまたは修飾されたリボシル部分（例えｉｆ、２’−０ −メチルリボシル部分）を含有するオリゴマーが好ましい。

ヌクレオチドオリゴマー（即ち、天然のヌクレオチドオリゴマー、ならびに他の オリゴヌクレオチド類似体に存在するホスホジエステルヌクレオシド間結合を有 する）を本発明に従って用いることができるが、好ましいオリゴマーは、オリゴ ヌクレオシドアルキルおよびアリールホスホネート類似体、ホスホロチオエート オリゴヌクレオシド類似体、ボスホロアミデート類似体および中性ホスフェート トリエステルオリゴヌクレオシド類似体からなる。しかし、特に好ましいのは、 ホスホネート結合が１またはそれ以上のホスホジエステル結合（２個ノヌクレオ ンジル単位を連結する）の代わりとなっているオリゴヌクレオシドアルキルおよ びアリールホスホネート類似体である。このようなオリゴヌクレオシドルキルキ ルおよびアリールホスホネート類似体のいくつかの調製、および予めｓＮ択した 一本鎖核酸配列の発現を阻害するためのこれら類似体の使用は、米国特許Ｎｏ、 　４．４６９．８８３；　４．５１１．７１３＋　４．７５７．０５５；　４． ５０７．４３３；および４．５９１．６１４に開示すレテイル（これらの開示は 本明細書の一部を構成する）。これらホスホネート類似体の特に好ましいクラス は、メチルホスホネートオリゴマーである。

メチルホスフェートオリゴマー（ｒＭＰ−オリゴマー」）の好ましい合成方法ハ 、Ｌｅｅ、　Ｂ几、ら［Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓＬｒｙ　２７：３１９７−３２０ ３　（１９８ｇ）］、およびＭ　ｉ　ｌ　Ｉｅｒ、　Ｐ、　ＳAら［貼匹加 ｍ１ｓｔｒｙυ：５０９２−５０９７　（＋９８６）］に記載されている（これ らの開示は本明細書の一部を構成する）。

少なくともｌのホスホジエステルスクレオンド間結合が３°−５°結合したヌク レオシド間メチルホスホニル（ＭＰ）基（または、「メチルホスホネート」）に よって置換されているオリゴヌクレオンジルアルキルおよびアリールホスホネー ト類似体が好ましい。このメチルホスホネート結合は、オリゴヌクレオチドのホ スフェート基の結合長さに類似した結合長さを有している。従って、これらのメ チルホスホネートオリゴマー（「ＭＰ−オリゴマー」）は、選択した核酸配列と の相互作用において最小の立体制限を与えるはずである。また、アルキルまたは アリール基がホスホネート結合に立体障害を与えないか、または互いに相互作用 しない他のアルキルまたはアリールホスホネート結合が適している。このメチル ホスホニル基が天然の核酸分子中に見い出されないので、これらのＭＰ−才リゴ マ−は種々のヌクレアーゼおよびエステラーゼ活性による加水分解に対して非常 に耐性が高いはずである。メチルホスホネート結合の非イオン性の性質の故に、 これらのＭＰ−オリゴマーは細胞膜をよりうまく越えることができ、従って細胞 によりうまく取り込まれることができるはずである。ある種のＭＰ−オリゴマー は、ヌクレアーゼ加水分解に対して耐性がより高（、培養咄乳動物細胞によって 無傷の形態で取り込まれ、そして細胞ＤＮＡおよびタンパク質合成に対して特異 的な阻害作用を発揮しうろことがわかっている（例えば、米国特許Ｎｏ、　４． ４６９．８６３を参照）。

好ましいのは少なくとも約７個、より好ましいのは少なくとも約８個のヌクレオ ンジル単位を有するＭＰ−オリゴマーであり、通常、これは一本鎖ＤＮＡまたは ＲＮＡの所望のセグメントの特異的な認識を可能にするに十分である。さらに好 ましいのは約８〜約４０個のヌクレオシドを有するＭＰ−オリゴマーであり、特 に好ましいのは約１０〜約２５個のヌクレオシドを有するＭＰ−オリゴマーであ る。調製の容易性を、選択した配列に対する特異性およびオリゴマー内のヌクレ オシド間相互作用（例えば、折り畳みおよびコイル化）の最少化と組合せると、 特に好ましいのは約１２〜２０ヌクレオシドのＭＰ−オリゴマーである。

とりわけ好ましいのは、５°−ヌクレオ／ジル間結合がホスホジエステル結合で あり、ヌクレオ／ジル間結合の残りがメチルホスホニル結合であるＭＰ−オリゴ マーである。ＭＰ−オリゴマーの５゛−末端にホスホジエステル結合を有するこ とは、キナーゼによるラベルおよびこのオリゴマーの電気泳動を可能にし、また 、その溶解性を改善する。

選択した一本鎖核酸配列を配列決定し、そのプリン配列に相補性のＭＰ−オリゴ マーを上記特許または本明細書に開示されている方法によって調製する。

これらのオリゴマーは、核酸の混合物または単離した細胞、組織試料もしくは体 液を含む試料において、選択した一本鎖核酸配列の存在または非存在を決定する のに有用である。

これらのオリゴマーは、Ｉ＼イブリダイゼーンヨン検定のプローブとして有用で あり、検出検定において用いることができる。プローブとして用いるときには、 これらのオリゴマーを診断キットにも用いることができる。

所望によりラベル基、例えば、ソラレン、化学発光基、架橋試薬、インターカレ ーシコノ試薬（例えば、アクリジン）、またはウィルス核酸の標的部分を切断し うる基（例えば、０−フェナントロリン鋼またはＥＤＴＡ−鉄のような分子はさ み）を、このＭＰ−ｎリボマー中に導入することができる。

いくつかの周知の方法のいずれかによって、これらのオリゴマーをラベルするこ とができる。行用なラベルには、放射性同位体ならびに非放射活性リポータ−基 が含まれる。同位体ラベルには、′Ｈ１”３％３１ｐ、　１１Ｓ１．コバルト、 および１４ｃが含まれる。同位体ラベル法のほとんどは酵素の使用を包含し、既 知の二ノクトランスレーンヨン法、末端ラベリング法、第２鎖合成法、および逆 転写法を包含する。放射ラベル化プローブを用いるときには、万一トラジオグラ フィー、ンンチレー／ｇン計数、またはガンマ計数によってハイブリダイゼーシ ョンを検出することができる。選択される検出方法は、ハイブリダイゼーション 条件およびラベルに使用する具体的な放射性同位体に依存するであろう。

また、非同位体物質をラベルに用いることもでき、酵素の使用による修飾化ヌク レオノドまたはヌクレ雪シト類似体の導入によって、またはオリゴマーの化学修 飾によって、例えば非スクレオチドリンカー基の使用によって導入することがで きる。非同位体ラヘルには、蛍光分子、化学発光分子、酵素、補助因子、酵素基 質、ハブテンまたはその池のリガンドが含まれる。１つの好ましいラベル化法に は、アクリジニウムエステルの導入が含まれる。

このようなラヘル化オリゴマーは、ハイブリダイゼーション検定のプローブとし Ｃ，およびハイブリダイゼーション検定における使用に特に適している。

一本位核酸配列の機能または発現を妨げるために使用するときには、これらオリ コマ−の一方または両方を好都合に誘導体化または修飾して核酸修飾基を導入ケ ることかできる（これは、該核酸との反応を引き起こし、不可逆的にその構造を 修飾し、それによってそれを非機能的にする）。本発明者らの同時継続特許出願 である米国連続Ｎｏ、　９２４．２３４（１９８６年１０月２８日出願）［この 出願の開示は本明細書の一部を構成するコは、オリゴヌクレオシドアルキルおよ びアリールホスホネートを含有するオリゴマーの誘導体化ならびにこのような誘 導体化されたオリゴヌクレオシドアルキルおよびアリールホスホネートを用いて 標的化一本位核酸配列を非機能的にすることを教示している。

多種多様の核酸修飾化基を用いてこれらオリゴマーを誘導体化することができる 。核酸修飾化基には、誘導体化されたオリゴマー（または、オリゴマー群）が− 重鎖核酸セグメントと三本鎖へワックス構造を形成した後に、該核酸セグメント またはその標的配列部分の共有結合の形成、架橋、アルキル化、切断、分解、も しくは他の方法での不活性化または破壊を引き起こすことができ、それによって 該核酸セグメントの機能および／または発現を不可逆的に阻害することができる 基が含まれる。

オリゴマー（または、オリゴマー群）中の核酸修飾化基の位置は変化してよく、 使用する特定の核酸修飾化基および偉的化一本位核酸セグメントに依存するであ ろう。即ち、この核酸修飾化基はオリゴマーの末端に位置していてもよいし、両 末端の中間に位置していてもよい。多数の核酸修飾化基が含まれるであろう。ま た、第１および第２のオリゴマーの両方が核酸修飾化基を含有していてもよい。

１つの好ましい態様においては、この核酸修飾化基は光反応性（例えば、特定の 波長または波長範囲の光によって活性化される）であって、オリゴマーと一本鎖 核酸の間の反応、即ち架橋を引き起こす。

架Ｆを引き起こすことができる核酸修飾化基の例はソラレン、例えば、アミノメ チルトリメチルソラレン基（ＡＭＴ）である。このＡＭＴは好都合に光反応する ことができ、従って架橋を行なう前に特定波長の光への暴露によって活性化しな ければならない。光反応が可能または可能てはない他の架橋化基を用いてこれら オリゴマーを誘導体化することができる。

また、この核酸修飾化基は、反応したときにオリゴマーから分離し、核酸セグメ ントに共有結合してそれを不活性にするアルキル化試薬基を含有する。適当なア ルキル化試薬基は化学の分野で既知であり、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化ア セトアミドなどから導かれる基が含まれる。

核酸セグメントの切断を引き起こすであろう核酸修飾化基には遷移金属キレート 化フンブレＩクス、例えばエチレンジアミン四酢酸（Ｅ　ＤＴ　Ａ）またはその 誘導体が含まれる。切断を実施するために用いることができる他の基には、フェ ナントロリン、ポルフィリンまたはプレオマイシンなどが含まれる。ＥＤＴＡを 用いるときには、鉄をオリゴマーにつなぎ、切断する基の生成を好都合に助ける ことができる。ＥＤＴＡが好ましいＤＮＡ切断基であるが、他の窒素含有物質、 例えばアブ化合物もしくはニドリーン（ｎ　ｉ　ｔ　ｒｅｅｎ）、または他の遷 移金属キレート化コンプレックスを用いることもできる。

２つの鏡上のプリン塩基を読んで三重の配列を形成する第１または第２のオリゴ マーのヌクレオンジル単位は、プリンとピリミジン塩基の混合物またはプリン塩 基のみからなっていてよい。

三重配列の２つの鏡上のプリン塩基を読むべきときには、プリン塩基だけを有す る「交差解読」オリコマ−を用いるのが好ましい。このようなプリンだけのオリ ゴマーは、いくつかの理由で好都合であると考えられる：（ａ）プリンはピリミ ジンよりも高い積層の性質を有しており、これが得られる三本鎖へリンクス構造 の安定性を増加させる傾向がある：（ｂ）プリンの使用だけがシトシンのプロト ン化（それが中性ｐＨてＮ−３の位置に水素結合のために利用可能な水素を有す るように）またはピリミジン１のＮ３に対応する位置にそのような利用可能な水 素を何するント７ン類似体の使用のとちらかの必要性を排除し、そして普遍の延 長化結合の使用を可能にする。

とるように、置換基（例えば、メチル、ブロモ、イソプロピルまたは他のかさば った基）を用いてプリンを８位のところて修飾することかてきる。即ち、このよ うであろう。従って、更立体配座のプリン塩基が示されているときには、本発明 は未置換のＡまたはＧの代わりにこのような８−置換されたプリンの所望による 導入を意図している。Ｋｅｎｄｒｅｗモデルを用いた研究により、このような置 換が三本鎖へワックス構造の形成に影響を及ぼすはずがないことが示される。

適当なところで匹および工立体配座のプリンヌクレオシジル単位を使用すること は（本明細書中に記載した中心プリン塩基を読むための規則に従う）、２つの鏡 上の中心プリン塩基を読むことおよびプリンのみの第３鎖による三本鎖へワック ス構造の形成を可能にする。

ピリミドとプリンの両方を含有するオリゴマーを用いて三重配列の２つの鏡上の プリンを読ませるときには、本明細書中に記載したような非均−結合形式を用い て、第３鎖（「交差解読オリゴマー」）が２つの鎖の一方から他方に交差して読 むことを可能にする。

（２）好ましいプリンオリコマ一 本発明は、以下から選ばれるヌクレオシジル単位を含有する新しいクラスのプリ ンオリゴマーを提供する・ ［式中、Ｂｐはプリン塩基であり；Ｒは独立してアルキルおよびアリール基から 選択され（ホスホネート結合が立体障害を受けないように、かつこれらの基が互 いに相互作用しないように選択される）；Ｒ゛は水素、ヒドロキシまたはメトキ ンであり、そして、ａｌｋは２〜６個の炭素原子のアルキレンまたは２〜６個の 炭素原子のアルキレンである］。

好ましいのは、少なくとも約７個のヌクレオシジル単位を含有するオリゴマー・ である。

好ましいのは、Ｒがメチルであるヌクレオシジル単位である。また、Ｒ゛が水素 であるヌクレオ／ジル単位が好ましい。適当な塩基Ｂｐには、所望により８位が 置換されていることもあるアデニンおよびグアニンが含まれ、好ましい置換基に はメチル、ブロモ、イソプロピルなどが含まれる。また、他の好ましい態様によ れば、中心プリン塩基を読む好ましいオリゴマーは、トリブレットの形成および 安定性に有利に働くように修飾されたプリン類似体を含有していてよい。これら のプリン類似体には、グアノシンに代わる６−セレニウムグアノシンもしくは６ −イソプロピリデンー７−デアザグアノシン、またはアデノシンに代わる２−ア ミノブリンが含まれる。約２〜３個の炭素原子を有するａｌｋ基が好ましい。特 に好ましいのは２個の炭素原子を有するａｌｋ基であり、エチレンが含まれる。

（３）シトシン類似体を含有するオリゴマー本発明の他の態様においては、シト シンが複素環を含有するシトシン類似体によって置換されているヌクレオシジル 単位を含有する新規なオリゴマーが提供される。この複素環は、シトシン環の３ −Ｎと同様の環位置に利用可能な水素を有しており、中性ｐＨで二本鎖中のグア ニン塩基と２つの水素結合を形成することができ、従ってフーグスティーン型塩 基対合またはトリブレットの形成にシトシンが必要とするようなプロトン化を必 要としない複素環である。

適当なヌクレオシジル単位は、シトシンのＮ−３に対応する環位置の水素結合の ために利用可能な水素を有し、かつ中性ｐ）（で二本鎖中のグアニン塩基と２つ の水素結合を形成することができる６員の複素環を有する類似体を含有する。こ れには、２°−デオキシ−５，６−シヒドロー５−アザデオキシシチジ／（■） 、プソイドイソシチジン（１１）、６−アミ／−３−（β−Ｄ−リボフラノシル ）ピリミジン−２，４−ジオン（ＩＩ＋）、および１−アミノ−１，２，４−（ β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）トリアジン−３−［４Ｈ］−オン（！Ｖ）が 含まれる（これらの構造は表（１）〜般的説明 上記のように、メチルホスホネートオリゴマーの調製は米国４ｅ許Ｎ　ｏ、　４ ．４６９．８６３：　４，５０７，４３３；　４．５１１，７１３；　４，５９ １，６１４；および４．７５７．０５５に記載されている。

メチルホスホネートオリゴマーの好ましい合成法は、Ｌｉｎ、Ｓ、ら［Ｂｉｏｃ ｈｅ園１ｓｔｒｙ２８：ｌ０５４−１０６１　（１９８９）１：　Ｌｅｅ、Ｂ、 ＬらｆＢｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　２７：３１９７−３２０３　（１９８８）n ：およ びＭｉ　１ｌｅｒ、　Ｐ、　Ｓ、ら［２５：５０９２−５０９７　（１９８６） コに記載されている（これらの開示は本明細書の一部を構成する）。延長した結 合を有する修飾化糖部分を含むヌクレオシジル単位を含有するオリゴマー（図５ および図６を参照）は、通常、これらの方法によって調製することができる。

ホスホジエステルヌクレオシジル間リン結合を含むオリゴマーはいくつかの常法 のいずれかを用いて合成することができる。これら常法には、シアノエチルホス ホロアミダイト前駆体を用いる自動固相化学合成法が含まれる（２９）。

所望により、先に記したシトシン類似体を含有するヌクレオシジル単位（表５を 参照）を、反応混合物中の適当な／チジン類似体（表５を参照）を置換すること によって、ＭＰ−オリゴマー中に導入することができる。

糖部分の５°−炭素と５°−ヒドロキシの間の結合または３°−炭素と３′−ヒ ドロキシの間の結合のどちらかがアルキレンオキシ基（例えば、エチレンオキシ 基）によって置換されている修飾化ヌクレオシドを用いて、ＭＰ−オリゴマーを 調製することができる。

図５は、３゛−（エチレンオキシ）または５゛−（エチレンオキシ）結合のどち らかを有する修飾化ヌクレオシドのための中間体の調製のための提案反応式を示 すものである。図５において、Ｂは塩基を表し、ＴｒおよびＲは保護基を表す（ Ｔｒはジメトキシトリチルなどの保護基を示し、Ｒは（−ブチルジメチルシリル またはテトラヒドロピラニルなどの保護基を示す）。

所望により、糖部分の３゛−および５°−の同位置において該延長化結合を有す るヌクレオシジル単位を調製することができる。

標的配列と第１のオリゴマーの両方）には、リン骨格上にわずかに延長したヌク レオシド間結合を有するオリゴマーを使用するのが好ましいであろう。

このようなオリゴマーは、５°−ヒドロキシをβ−ヒドロキシエチル（ＨＯ−Ｃ Ｈ，−ＣＨ，−）基に置換するように糖（デオキシリボシルまたはリボシル）部 分を修飾したヌクレオシドを用いて調製することができる（このような５゛−β −ヒドロキシエチル−置換されたヌクレオシドの調製のための合成式を図６に示 す）。

図６は、５°−β−ヒドロキシエチル−置換された糖類似体のための提案反応式 を示すものである。図６において、ＤＣＣはジシクロへキシルカルボジイミドを 示し、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを示す。Ｂは塩基である。適当な保護基 であるＲには、ｔ−ブチルジメチルシリルおよびテトラヒドロピラニルが含まれ る。

上記の修飾されたヌクレオシジル単位を導入したＭＰ−オリゴマーは、修飾され たヌクレオシジル単位を置換して上記のように調製される。

プリン塩基だけを含有するオリゴマーを調製する際には、同一の延長化結合を何 するヌクレオシジル単位を用いることができる。しかし、ピリミジン（または、 ピリミジン類似体）塩基とプリン塩基の両方を含有するオリゴマーを調製する際 には、延長化していない結合と延長化している結合を有するヌクレオ／ジル単位 の混合物を用いる。糖部分の３°−炭素と５″−炭素の両方に延長化結合を有す るヌクレオ／ジル単位が好都合であろう。

（３）誘導体化したＭＰ−オリゴマーの５１ａｌ製誘導体化したオリゴマーは、 所望のＤＮＡ修飾化基をオリゴマーに付加することによって容易に調製すること ができる。注記したように、オリゴマー中のヌクレオシジル単位の数およびオリ ゴマー中のＤＮＡ＠飾化基の位置は変化することができる。このＤＮＡ修飾化基 は、ＤＮＡの標的配列を最も効率的に修飾するで部分が、関与するＤＮＡセグメ ントおよびその鍵となる標的部位または部位群に依存するであろうが、このよう な最適位置は当業者に既知の常法によって容易に決定することができる。

（ａ）ソラレンで誘導体化したＭＰ−オリゴマー〇調製８−メトキシソラレンお よび４°−アミ／メチルトリメチルソラレン（ＡＭＴ）などのソラレン類による ＭＰ−オリゴマーの誘導体化は、Ｋｅａｎ、　Ｊ、　Ｍ、ら［Ｂｔｏｅｈｅａｉ ｓＬｒｙ　２７：９１Ｈ−９１２１（１９８８）］、およびＬｅｅ、　Ｂ、　Ｌ 、ら［Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ１ｓＬｒｙ　２７：３１９７−３２O３　（１ ９８８）］に記載されている（これらの開示は本明細書の一部を構成する）。

二ｌ０５４−１０６１　（１９８９）］に記載されている（この開示は本明細書 の一部を構成する）。

（Ｅ）里塗 本発明によれば、−重鎖核酸の特定のセグメントを、本明細書中に記載したトリ ブレット塩基対合指針に従って一本鎖核酸と二本鎖へリノクスを形成する第１お よび第２のオリゴマーを用いて検出または認識することができる。これら第１お よび第２のオリゴマーは、各オリゴマーの各ヌクレオシジル単位の塩基が一本鎖 核酸配列の対応する塩基とトリブレットを形成して二本鎖へリノクス構造を与え るように選択された配列を有している。検出可能なようにラベルしたオリゴマー をハイブリダイゼー／：Ｉン検定で使用するためのプローブとして用いて、例え ば、特定の一本鎖核酸配列の存在を検出することができる。

また、本発明は、−重鎖核酸の選択した標的配列の発現または機能を妨げる方法 であって、上記のように一本鎖標的と水素結合し、そしてそれと二本鎖ヘリ・ノ クス構造を形成する第１および第２のオリゴマーを使用することによる方法を提 供する。二本鎖へリソクスの形成は、転写の防止、エフェクター分子（タンノ〈 り質など）の結合の防止などの様式により、発現および／または機能を妨げるで あろう。即ち、本発明によれば、−重鎖核酸の標的配列は２回または２工程で認 識されるであろう：（１）１回目は、第１のオリゴマーとのワトソンーク１ルッ ク塩基対合による二本鎖の形成によって、そして（２）２回目は、第２のオリゴ マーが複数の鎖を交差して読むことができるようにするための該第２のオリゴマ ーのヌクレオシドの開のヌクレオ７ジル間延長化結合を有するかまたは有さない 第２のオリゴマーとの二本鎖の形成による。このようにして、高度の選択性を伴 って高親和性の複合体が形成される。誘導体化したオリゴマーを用いて、一方ま たは両方の鎖を切断（ＥＤＴＡ）または架橋（ソラレン）することによって核酸 中の標的部位を検出または位置決定し、次いで不可逆的に修飾することができる 。切断のための標的部位の注意深い選択により、オリゴマーの一方を分子はさみ として用いて、選択した核酸配列を特異的に切除することができる。

これらオリゴマーを誘導体化して、核酸セグメントまたはその標的配列との反応 を引き起こし、該核酸を不可逆的に修飾するか、分解するか、または破壊し、こ うしてその機能を不可逆的に阻害しうる核酸反応性または修飾化基を導入するこ とができる。

これらのオリゴマーを用いて、生細胞中の特定の遺伝子またはその標的配列を不 活性化または阻害することができ、選択的な不活性化または阻害を可能にする。

この標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばブレｓＲＮへ、ａ＋ＲＮＡまたは ＲＮＡ配列、例えば開始コドン、ポリアデニル化領域、ｍＲＮＡキャ、プ部位ま たはスプライス機能であってよい。次いで、これらのオリゴマーを用いて、欠陥 もしくは望ましくない産物を生み出す遺伝子、または活性化されたときに望まし くない作用を引き起こす遺伝子を永久的に不活性化、変性または破壊することが できる。

本発明の別の態様は、特定の一本鎖核酸配列を検出するためのキ７）に関する。

このキットは第１および第２のオリゴマーを含有し、少なくともその一方は、− 重鎖核酸の標的配列に十分に相補性であって該標的配列と二本鎖へリノクス構造 を形成しうるように選択された検出可能にラベルされたプリンＭＰ−オリゴマー である。

本発明の理解を助けるために、コンピューターシミュレーションを含む一連の実 験の結果を記載する実施例を以下に挙げる。本発明に関するこれら実施例は、本 発明を具体的なものに限定することを意図するものではない。当業者の理解の範 囲内にある現在既知または将来開発される本発明の変法は、本明細書に添付した 請求の範囲に記載した本発明の範囲内にあるとみなされる。

（以下、余白） 実施例 実施ｆｆ１ｌ＋　二本鎖ヘリックス構造のコンピューターシミュレーションの過 程に関与する分子機構を洞察することである。

（Ａ）ノミュレーション法 二本鎖ポリ（ｄＴ＋ａ）−ポリ（ｄＡｌｏ）−ポリ（ｄＴ＋ｏ）［Ｔ＋ＡＴｔ］ 座標を、ＡｒｎｏｔＬおよびＳｅｌｓｉｎｇ（１０）のＡ−ＤＮＡ　Ｘ線構造か ら得た。同じ座標をポリ（ｄＴ、、）−ポリ（ｄＡ、。）−ポリ（ｄＴ、、）メ チルホスホネート［Ｔ１ΔＴ　ｔＭ　Ｐ　］の最初の外面的形態のために用いた 。ジメチルエステルメチルホスホネートフラグメントのための外面的形態の最適 化および部分的原子電荷帰属は、各々３−２１Ｇ＊および５ＴＯ（ｄ基礎セット を用いるＱｔＪＥＳＴ（バージョン１．ｌ）を用いた量子力学的方法により最初 から計算した（１１）。後者の基礎セットを用いて、ＡＭＢＥＲデータベースに おける核酸について既に算出されたものと同一の電荷帰属を維持した。ＭＰフラ クメントのための最後の１１極原子電荷帰属を行って、第三のＤＮＡ鎖のＭＰ背 骨、各塩基およびフラノースについての中立の正味の電荷を得た。Ｔ、ＭＰ鎖の 背骨ホスホリル酸素の、代わりとなるＲｐ−およびＳＰ−／チル置換を立体コン ピューターグラフィックスにより行った。合成を制御することはできないから、 ＭＰジアステレオマーの置換をこの方法で行い、実験的収量に近づけた。分子力 学および分子動力学的計算を、ＡＭＢＥＲの十分にベクトル化された（ｖｅｃｔ ｏｒｔｚｅｄ）バージョン（バージョン３．１）により、全原子力野を用いて行 った（１２．１３）。全ての計算はＣＲＡＹ　Ｘ−ＭＰ／２４およびＶＡＸ　８ ６００＋ンピユーター上で行ツタ。

ホスフェート酸素を二分しているリン原子の４Ａ内の正の対イオンの置換により ＤＮＡホスフェート背骨の負の電荷を中性にし；対イオンをＭＰ−置換鏡上に置 かなかった。二本鎖へリノクスおよび対イオンは間欠的な境界状態を有するＴＩ Ｐ３Ｐ水（１４）分子のＩＯＡ殻により囲まれていた。Ｔ、ＡＴ、およびＴ、Ａ Ｔ、ＭＰ系には各々９，２８３および１０，８２４原子が存在する。箱の次元は 、Ｔ、ＡＴ、について１０１，６８６．８Ａ’、およびＴ、ＡＴ、ＭＰについて １２４，３２１゜Ｓｋｓであった。最初に、ＤＮＡおよび対イオン原子を十分に 拘束し、周囲の水分子を８．ＯＡ非結合カットオフを用いて収束するまでエネル ギー最小化した（勾配の二乗平均［ｒｍＳ］＜　Ｏ、ｌ　ｋｃａ１１モル／Ａ） 。続いて、ＤＮＡ、対イオンおよび水を幾何学的な拘束を伴わずにさらに１５０ ０サイクルでエネルギー最小化を行い、続いて活性化された５ＨＡＫＥによる最 小化を２２０サイクル行った（１５）。常温および常圧（３００におよびＩ　／ ＜−ル）で５ＨＡＫＥを用いた分子動力学を、２分子集団の各々に対する４０ｐ ｓｅｃ軌跡について拘束を伴わずに行った。

（Ｂ）ンミｊレーション研究の結果 ＭＰ背骨を有する第三のＤＮＡ鎖により、二本鎖へリソクスにおいてＭＰ背骨を 何するＯＤＮの結合の増大と一致するいくつかの変化が生じた。平均水素結合距 離および平均原子ゆらぎは、Ｔ、ＡＴ、ＭＰ三本鎖において一貫して比較的小さ かった（表１）。鏡開リン原子距離はＡ−Ｔ、に対して９．６Ａ（±／−０，９ １）およびＡ　−Ｔ　、Ｍ　Ｐに対して８．３　Ａ（巴／−０，５８）であった 。第二および第三鎖の間の減少した鏡開リン原子距離わよび比較的小さな平均原 子ゆらぎは、背骨におけるＭＰ置換に付随する鏡開静電気的反発の減少によるも のである。

両方の二本鎖へ、リノクスＤＮＡ系は、分子動力学を通じて鎖特異的な多形性コ ンホメー／ｇン動作を有していた。フラノースにおいて両系における最初の外面 的形態に比べて有意なフンホメーンヨンの変化がある（表２）。Ｔ、ＡＴ、ヘリ ックスにおいてＴ、およびＴ、鎖のフラノース環集団は、Ａ−ＤＮＡコンポメー ンヨン（Ｃ３°エンド）において優勢のままであり、アデニン糖の最も大きな割 合がＢ−ＤＮＡフンホメー７ｇン（Ｃ２゛エンド）を採用した。注目に値する割 合のアデニンフラ／−１コンホＪ−７ｇンがＴ、ＡＴ、およびＴ、ＡＴ、ＭＰに おける０　１’エンドコンホメーション中にあった。ＭＰ置換へリノクスの糖ひ だの型は未置換のへリノクスに対してより大きな比率の０１’エンドおよびＣ２ ’エンドコンホメーシヨンを有していた。他のコンホメーションパラメーターの 分析は、これら二本鎖へリノクスの・−イブリノドフンホメーシジン的性質を支 持している。ヘリックスのねじり角（ＴＩおよびΔ鎖の間ンの平均はＴ、ＡＴ、 構造について３９．４度（士だ２．８６）であり、Ｂ−ＤＮＡフンホメーシ３ン （範囲３６〜４５）とさらに一致した。Ｔ１ＡＴ＋ＭＰへリノクスねじり角は平 均３２０度（±＼−２，１９）であり、Ａ−ＤＮＡのねしり角（範囲３０〜３２ ．７）に一層近い。全構造に対するヘリックス反復−個（ＴｌおよびＡ鎖の間） の平均はＴ、ΔＴ、につぃて１ｏ、２およびＴ、ＡＴｔＭＰについて１１．２度 である。４０ｐｓｅｃ軌跡以上の鎖内リン原子距離の平均を表３に示す。両ヘリ ックスにおいて、Ｔ、鎖の路内リン距離はＡ−ＤＮＡコンポメーンタン（７，Ｏ Ａ）と最も一致している。Ｔ、ＭＰ鎖の踏量リン距離は、Ｔ、鎖についてＡ−Ｄ ＮＡと比較的一致している値に対して、Ｂ−ＤＮＡフンホメ−７ジンと一層＝一 致している。

本発明者らは、Ｄ　Ｎ　Ａ背骨に沿ったｚ・ｔイオンと水の配位を分析して、Ｍ Ｐａ換に付随Ｖる変化を測定した。リン原子を有する対イオンの平均配位距離お よび原ｆゆらぎはＴ、ＡＴ、について３．８Ａ（＋＼−０，６）であり、Ｔ、Ａ Ｔ、ＭＰへワックスについて４．６Ａ（十＼−０，９）であった。Ｔ、ＡＴ、Ｍ Ｐにおける平均配位距離および原子運動の増大（０，８Ａ）は、第二の鎖に対し て配位された対イオンへのＲｐ（アキ／アル突出）メチル基の近接性による可能 性が最も大きい。ホスフェート基に対して配位された水分子の平均数は、ＭＰ置 換へリノクスにおいて有意に改変されない。

２つのヘリ、クス系のＤＮＡ背骨およびＣ１’−Ｎ（塩基）二平面転位を表４に 示す。アデニン鎖のα−二平面の比較により、ＭＰ置換を有する二平面の平均位 置における若干の変化、二平面をトランスに近いものへと位置させることが明ら かとなっているが、４０ｐｓｅｃ軌跡を通じて両二平面の転位運動において大き な重なりがある。ベースラインからの５　ｐ−Ｍ　Ｐジアステレオマーβ二面角 の平均において有意な変化（２７，０変）があった、Ｓｐ−ＭＰジアステレオマ ーを含有するβ二平面のゆらぎはＲｐ、、ＭＰより有意に小さかった。

（Ｃ）７　Ｅ　、ｓ　レーション結果の解釈これらの分子動力学的計算の結果に より、フーグスティーン型対合により同一線上の第三鎖として組み込まれている ＭＰ置換ＯＤＮは、ポリ（ｄＴ）ポリ（ｄＡ）ポリ（ｄＴ）の例における様に、 第三鎖としての天然の○ＤＮより安定な二本鎖ヘリックス１体を形成するであろ うことが予想される。ｉφＰ鎖結合の増大は、鏡開静電気的反発の減少によるも のである。ＭＰ置換へワックスは水素結合距離を減少させ、路間Ａ−Ｔ、リン距 離を減少させ、天然の二本鎖へリソクスに比べて原子位置のゆらぎを低下させた 。分子動力学の中での一層ぴったりした適合および減少した原子運動は、ＭＰ置 置換三本へリノクス複合体のさらに大きな結合のエンタルピーおよび安定性と質 的に一致している。これらの発見は、第三の鎖のＭＰ置換が鏡開ホスフェート反 発の減少により一層結合力のある二本鎖へワックス構造の形成を容易にし、第二 にフーグスティーンおよびワトソン・クリック水素結合相互作用のより一層の接 近をもたらすであろうことを支持している。フーグスティーン対合に対する優勢 な効果か予測されるであろ・うが、これらの計算においてＭＰ置換によりワトソ ン・クリ、り水素結合の予測されない増強が存在する。後者の発見は、Ｔ１お・ よびＴ、ＭＰ鎖の間の静電気的反発の減少および遮蔽（第三の鎖による）による 可能性が最も大きい。

これらＤＮＡｔｊｔ造のフンホメーションはファイバー図に基づく実験データと は異なる。ポリ（ｄＴ）ポリ（ｄＡ）−ポリ（ｄＴ）の構造は９２％湿度の条件 下でのＸ線回折研究により測定され、その構造は低分解構造である（１０）。分 子動力学シミュレーションは、対イオンを有する間欠的な境界状態下で十分に溶 媒和化されたＤＮＡ構造についてのものである。溶液中のＤＮＡは通常Ｂ型が優 勢であると考えられているが；比較的低湿度の条件下ではＡ−ＤＮＡコンポメー ンヨンが優勢である（１６）。いくつかの二本鎖ＤＮＡヘリックス構造がＸ線回 折研究により測定されており、低湿度および塩濃度増大の条件下でＡ−ＤＮＡフ ンポメーションにおいて一様に観察されている（Ｉｎ、　１７、＋８）。これら のコンピューターシミュレーションにより、異なるＤＮＡコンホメー／！１ンが 二本鎖ヘリックス内に共存し、ヘリックスの個々の鎖か優勢なフンホメーション 集団を有し、フーグスティーン対合したＭＰｉ換ＤＮＡ鎖はＢ型が優勢であるこ とが予測される。両三本鎖中の０１’エンド糖の大きな割合は、このフラノース フンポメーションが０２′エンドおよびＣ３、エンドＤＮＡ糖ひだより０．６ｋ ｃａ１１モル高いので重要である（Ｔ６）。ＤＮＡ１２ｆｆｉ体結晶構造（１９ ）は注目に値するＯ１’ｘンド集団を有し、５ｅｉｂｅｌら（２ｏ）によるｄｓ ＤＮＡの分子動力学において０１′エンド糖ひだの有意な割合が観察された。両 ヘリ・ノクス構造は、通常、Ｃ２’工ンド外面的形態を採用しているプリンヌク レオチド粘ヨヒ０３“エンド外面的形態を採用しているピリミジンの古典的観察 に従っている。

二本鎖におけるＲＰ、およびＳ　Ｐ、Ｍ　Ｐジアステレオマーのβ二平面および 可変性フンホメー／ヨンゆらぎの大きな動揺は、非結合性および疎水性相互作用 によるものである。Ｓ　ｐ−ＭＰ基は、同じＤＮＡ鎖上鏡上ミンメチル基（主溝 における）にきわめて接近しており、ファン・デル・ワールスカにより相互作用 し、この基はチミンをＳｐ　ＭＰ背骨に「固定する」ことにより局所的にヘリッ クスを不安定化し得るであろう。Ｒｐ−ＭＰ基のβ二平面にはさらに大きな偏向 があるが、これはこれらの基が溶媒水中に突出しておりチミンメチル基からさら に遠く離れて位置しているからである。リン原子上のメチル置換基の配向とＤＮ Ａ二本鎖安定性の間には既知の関係が存在し、Ｓ　ｐ−Ｍ　Ｐジアステレオマー の安定性の低下の提案された機構は局所的立体相互作用によるものである（２１ ）。本発明者らの計算により、立体十目互作用は局所的ヘリ、クス不安定化の方 向へほとんど寄与しておらず、優勢な機構は、Ｓｐ−ＭＰ背骨のメチル基と同じ 路上のチミンの間の非結合性相互作用により媒介されており、これがＤＮＡを局 所的に不安定化することが示唆されている。

友権皿λ　円偏光二色性分光学を用いた二本鎖ヘリックス形成の検出円偏光二色 性分光学研究を以下のヌクレオシドオリゴマーの組み合わせを用いて形成された 二本鎖へリノクス構造を用いて行った。

１　：ｄ（ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ）ｄ（ＣＴ）、と略す Ｅ　”’＝　９．２　Ｘ　１０　’Ｍ−’ｃｍ−’＋１：ｄ（ＡＧＡＧＡＧＡＧ ＡＧＡＧＡＧＡＧ）ｄ（ＡＣ）、と略す Ｅ”’＝　１．４５ｘ　１０’Ｍ−’ｃｍ−’ｌｉｔ：ｄ（ＣｐＴｐＣｐＴｐＣ ４ＴｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＴｐ）ｄ（ＣｐＴ）−＊たはｄ（ ＣＴ）８と略すＥ”’＝８．５ｘ　ｌ　Ｏ’Ｍ−’ａｍ−’（ａ）２　：　］　 ｄ（ＣＴ）ｓ　・ｄ（ＡＧ）ｓおよび（ｂ）ｌ　：　１　＋　１　ｄ（ＣＴ）ｓ −ｄ（ＡＣ）、・ｄ（ＣＰＴＰ）＊を用いて作成した二本鎖へリノクス構造につ いての円偏光二色性（ＣＤ）分光を、０．１Ｍリン酸緩衝液中、示されたｐＨで ＣＤ分光偏光計を用いて行った。

図７は二本鎖へリノクス（ａ）［２：　Ｉ　ｄ（ＣＴ）＊　・ｄ（ＡＧ）ｓ（二 ］および（ｂ）［１：　１　：　Ｉ　ｄ（ＣＴ）ｌｌ−ｄ（ＡＧ）、−ｄ（ＣＴ ）、（二二二）］に対するＣＤスペクトルを示す。

実施例３　ソラレン誘導体化ＭＰ−オリゴマーを用いた二本鎖ヘリックス構造の 架橋 ソラレン誘導体化ｄＴｐ（Ｔ）６オリゴマーをＬｅｅ、　Ｂ、　Ｌ、ら［Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：　３１９７−３２０３　（１９８８）］が開示して いるように調製した。

Ｔ７オリゴマーを、ｌ　５−ｍｅｒポリｄＡ部分配列を含む次の配列を有するＤ ＮＡとハイブリダイズさせた。

５’　１０　２０　３０　４０　３゜ ｄ−Ｔ＾＾ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＡＣＧＡＧＣＴｄ−−＾ＴＴＡＴＧＣ丁ＧＡＧＴＧ／、ＴＡＴＣＣＣＴ ＣＴＡ＾＾＾＾＾ＡＡＡ＾＾＾＾ＡＡＴＧＣＴＣＧＡ３゛５゛ ４゛−（アミノエチル）アミノメチル−４，５°、８−トリアネチルソラレン［ ”　（ａｅ）　ＡＭＴ”］、４“−（アミノブチル）−アミノメチル−４，５’ 、８−トリメチルソラレン［″（ａｂ）ＡＭＴ”］ｔよび４−（アミノ−キシル ）アミノメチル−４，５°、８−トリメチルソラレン［”（ａｈ）ＡＭＴ“］で 誘導体化したＭＰ−オリゴマーを、（ａ）上記のＤ　Ｎ’Ａ配列の一本鎖ＤＮＡ および（ｂ）上記の配列の二本鎖ＤＮＡと４℃でハイブリダイズさせ、照射して Ｌｅｅらが開示しているように架橋を引き起こした。

結果を図８八および８Ｂに示す。図８Ａはソラレン誘導体化Ｔ７オリゴマーの一 本鎖（ボＩＪＡ含有）ＤＮＡ配列との架橋を示す。

図８Ｂは二本鎖ＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡの架橋を示す。

表１ 平均水素結合距離（ＲＭＳ） ワトソン・クリック　ＭＰなし　ＭＰ有りＡＰＥ　ＨＮ６Ｂ−ＴＨＹ　０４　２ ．３３（＋／−０，３１）　１．９８（＋／−０，１５）ＡＤＥ　Ｎｌ　−ＴＨ Ｙ　Ｈ３２，１０（＋／−０，１７）　Ｉ、９５（＋／−０，１３）フーグステ ィーン ＡＤＥ　ＨＮ６Ａ−ＴＨＹ　０４　２．１２（＋／−０，２２）　２．０９（＋ ／−０，１９）ＡＤＥ　Ｎ？　−ＴＨＹ　８３　１．９４（＋／−０，１６）　 １．９２（＋／−０，１２）Ｔ、ＡＴ、およびＴ　＋　Ａ　Ｔ　ｔ　Ｍ　Ｐヘリ ツクスにおける平均ワトンン・クリックおよびフーグスティーン水素結合距離（ オングストローム）。これらの距離を二本鎖へ１ルックスＤＮＡ？１合体につい て計算する。原子位置のゆらぎ（二乗平均［ｒ＋ｎｓ］として計算）を（入）で 表す。

表２ フラノースひだ（Ｑ）の平均、相およびフンホメーシヲン集団ヘリフクス鎖　Ｑ 平均　（ＲＭＳ）　相　ＲＭＳ　Ｃ３’ｘンド　０１’　ｘンＦ　Ｃ２’　ｘン ド　０１’ｚ４ソＴｌ　Ｏ，３６（±０．０６）　３５．７０　（±２４．７） 　８６．８％　６．６％　６．６％　Ｏ，［１％Ａ　Ｏ，３９（ｔｈｏ、０５） 　１０７．４４　（±３０．８）　３．６％　３４．３％　５７．１％　５．０ ％Ｔ２　０．３８　（土ｏ、ｏ６）　４０．９９　（±２４．１）　７５．３％ 　２４．１％　０．６％　０．０％Ｔｌ　Ｏ，３８（”０．０６）　３６．７１ 　（±２６Ｊ６）　７９．１％　１８．Ｆ％　２．８％　０．０％Ａ　Ｏ，３９ （±０．０５）　１０９．７８　（＋２８．５９）　１４．７％　４１．５％　 ４３．８％　０．０％Ｔ２−ＭＰ　０．４０　（’０．０５）　１０３．１４　 （±２９．５０）　１１．２％　６１．８％　２７．０％　０．０％Ｔ、ＡＴ、 およびＴ　、　Ａ　Ｔ　、Ｍ　Ｐヘリックスについてのフラノースの糖ひだ（Ｑ ）の平均、相およびコンホメーン１ン集団（１５）。Ｑはオングストローム、相 は度、そして集団は３つのＤＮＡ鎖の各々における全フラノ−スコンホメーシせ ンに対するパーセントで表す。

表３ ＴＩ　６．５（±１０．２８）　６．２（±１０．３１）Ａ　７．０（±１０． ２６）　７．１（±１０．２４）Ｔ２　７．３（±１０．２９）　６．８（±１ ０．２６）Ｔ、ＡＴ、およびＴ、ＡＴ、ＭＰヘリックスの路内ホスフェート距離 。４０ｐｓｅｃ軌跡以上を平均して算出された路内ホスフェート距離（オングス トローム）を全二本鎖へリノクス系について示す。標準路間リン距離はＡ−ＤＮ Ａについて６．　ＯＡ、そしてＢ−ＤＮＡについて７．ＯＡである（１５）。

表５ 実施例４一本位ボリデオキシプリンヌクレオシド標的を用いた二本鎖ヘリックス 慢合体の形成 ｄ（ＡＧ）、一本鎖標的（１１）を用いた二本鎖へリノクス複合体の形成を、２ °−０−メチル−偽イソシチジン（ｐｉＣ）および２“−０−メチルウリジン（ Ｘ）を代わりの配列（ｐｉＣＸ）ｖｐｉＣＴ（１）中に含有するオリゴヌクレオ チド類似体の２つの鎖を用いて示した。さらに、ｄ（ＡＧ）、・ｄ（ＣＴ）、二 本鎖（ＩＩ　：　Ｉｌｌ）とＩの間の二本鎖ヘリックス複合体の形成を示した。

［ｄ（ＣＴ）ｓをＩｌｌで示す。］（Δ）衾秋ｎ方迭 全ての化学製品は＾Ｉｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ興１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　Ｉｎ ｃ、　（Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、冒Ｉ）から得た。

溶媒はＦｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ 、　ＰＡ）から得た。ＴＬＣはシリカゲル６０　Ｆ　ｔ５−プレート（Ｍｅｒｃ ｋ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）上で行い、カラムク０７トグラフイーはンリ カゲルＧ６０（７０〜２３０メツシュ、＾ＳＭＴ、　Ｍｅｒｃｋ）上で行った。

ＨＰＬＣはＰＲＰ−１カラム（Ｉ（ａｍｉｌｔｏｎ、　Ｒｅｎｏ＋　ＮＹ）を用 いたＶｉｓＬａ５５００　（Ｖａｒｉａｎ、　５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　Ｃ＾）上 で、または０ＤＳ−３カラム（ｌｈａｔａａｎ、　Ｃ１１ｒｔｏｎ、　ＮＪ）を 用いたＶａｒｉａｎ５０００上で行った。放射活性はＬＳ７５００液体シンチレ ーションカウンター（Ｂｅｃｋ＋ｕｎ、　Ｃｏｌｕｍｂｉａ、　ＶＤ）により計 測した。

ＣＤ、ＵＶ７ｉ合滴定、融解／アニーリングおよびゲル電気泳動研究においては 以下の緩ｔｈ液を用いた・緩ｉＩＩ液Ａ・０．０１Ｍ　リン酸ナトリウム、０． １ＭＮａＣ１，０，Ｏ１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，２：緩衝液Ｂ：０．０２Ｍ　 リン酸ナトリウム、０、ＯＩＭＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ、；緩衝液Ｃ：０． ０１Ｍ　リン酸ナトリウム、０．３５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、ｐＨ ７，２；緩衝液Ｄ：０．０６Ｍトリス・ボレート、５陪Ｍ　ＭｇＣ１，，０，０ ７５％Ｍ　Ｅ　ＤＴＡ、ｐＨ”？、３゜（Ｂ）ヌクレオノド類似体およびオリゴ ヌクレオチド類似体の合成ＸおよびｐｉＣを報告されている方法（３０，３１， ３２）に従って合成し、それらの対応するアミダイトシントン（ａｉｉｄｉＬｅ 　５ｙｎｔｈｏｎｓ）に変換させた（３３．３４）。オリゴヌクレオチドＩを、 報告されている方法（３１，３２）に従いＤＮＡ合成装置（Ｍｉｌ　Ｉ　ｉｇｅ ｎ７５００またはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍのどちらか）により合成 した。脱ブロックおよび濃Ｎ８４０Ｈ処理による固体支持体からの切断の後に、 保護しているジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基を有するＩをＨＰＬＣにより精 製した。分画を８０％酢酸溶液を用いて処理してＤＭＴｒ基を脱ブロックし、次 いでオリゴマーをＨＰＬＣにより精製した。この調製による精製オリゴマーＩは ＨＰＬＣ分析により単一ピークを示した。２μモル固体支持物質から出発して２ ．５０．Ｄ、単位のＩが得られＣＤスペクトルをＪ−５００Ａ　ＣＤ分光偏光計 （ｊａｓｃｏ、　Ｊａｐａｎ）により得た。サンプル温度を循環水浴を用いて制 御した。オリゴマー（１個または複数）の真空下での濃縮次いで残渣の適当な緩 衝液中への溶解は、１．−ＩＩ−Ｉ１１サンプルの調製を除いて行った。この混 合液は、緩衝液Ａ中のｌｌ−Ｉｌｌ二本鎖の溶液を水浴上で冷却し、次いでこの 溶液を１に加えることにより調製した。全溶液混合物を水浴上で３０分間保ち、 次いで室温でさらに３０分間保った。この混合物のＣＤスペクトルを測定した後 に、濃縮した塩溶液を該混合物に加えて最終塩条件を緩衝液Ｃ用に設定し、次い で別のスペクトルを測定した。サンプル温度を温度調節された水浴からの液体循 環により制御した。

（Ｄ）ゲル電気泳動 ゲル電気泳動実験は、２０Ｘ２２ｃｍガラススラブおよび０．７Ｆ＋ａ＋＊スペ ーサーを有するＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅａｎ　Ｉｆゲル装置において調製し た緩衝液り中に１５％ポリアクリルアミドを含有しているゲルを用いて行った。

二本鎖（ＩＩ−Ｉｌｌ）溶１ｆｆｌ（２，５μＬ）と第三の鎖（１）（２，５μ ｍ、）を４℃で混合することにより調製し次いで室温で５分間平衡化させたＩお よび二本鎖ＩＩ−ＩＩ＋の混合物を除いて、サンプル（５μＩ、）を３％グリセ ロールを有する緩衝液り中に調製し、室温で１時間保った。各サンプルは、５° 末端にマーカーとして３１Ｐによりラベルされたオリゴヌクレオチドを含有する 。ブロモフェノールブルー追跡色素（０，０２５％）を唯一のオリゴヌクレオチ ド分子を含有しているサンプルに加えた。実験を室温、２ｏｏボルト（５〜１０ ｍＡ）で４時間行った。電気泳動が停止した後に、そのゲルを真空下で乾燥し、 オートラジオグラフィーにかけた。さらに、ゲルからバンドも切断し、放射活性 を計測した。

（Ｅ）ＵＶ混会滴定および融解／アニーリングＬＩＶ吸収をＶａｒｉａｎ　ＤＭ Ｓ　Ｉ　ＯＯおよび２１９分光光度計により測定した。融解／アニーリングの温 度グラフを、温度調節されたサンプル区画を有するＶａｒｉａｎ２＋９によりモ ニターした。サンプル温度は、「グミ−」のキュベツト中に挿入された、目盛り を定められたサーミスタープローブでモニターされている温度調節浴からの液体 循環により制御した。

二本鎖１：１１：Ｉの形成をＣＤスペクトル研究により確認した。（図１０Ａか らＥを参照）。図９Δは、ｐＨ７，２での一本鎖ｌ、１１およびＩＩＩのＣＤス ペクトルを示す。１：１１（２：ｌ）のＣＤスペクトルはＯ，ＩＭ　ＮａＣ１（ 緩衝液Ａ）中で大きな負のバンドを２１３’ｎｍに示し＋　０．２５Ｍ　ＮａＣ ｌおよび５　ｎＭ　ＭｇＣＩｔ（緩衝液０）の添加により同様のスペクトルが観 察された。このようなスペクトルは、ポリマーおよびオリゴマー系の両方におけ る反（Ｍジヌクレオチド配列Ａ　Ｇ／ＣＴに対するホモピリミジノーホモプリン −ホモピリミジン二本鎖形成を暗示することが示されたく図９Ｂ）（３５，３５ ）。

図９Ｃは１１１混合物１対１の比のＣＤスペクトルを示す。図９０はこの波長範 囲においてそのような大きな負のバンドを示さないが：このスペクトルは一本鎖 １１の半分のスペクトルおよび１：１１（２：］）の半分のスペクトルから得た 算出されたスペクトルに同一である。観察されたＣＤスペクトルは、ｌ：ｌの１ ：１１混合物が１：１１：Ｉ二本鎖の半分および一本鎖１１の半分であることを 示す。即ち、このＣＤ研究は、二本鎖形成か好ましいであろう化学量論比でさえ １：１１：ＩがＩ・Ｉ＋二本鎖より好ましいことを示している。

０．１ＭＮａＣ１中のＩＩ−ＩＩ＋ＩＩ鎖および一本位■の混合物のＣＤスペク トルの２１３帥で観察された負のノ・ンドの大きさは、Ｉｔ−ＩＩ＋ＩＩ鎖およ び一本鎖Ｉの両者とも室温および３％におけるスペクトルの合計から得た算出さ れたスペクトルに類似している（図９Ｄおよび９Ｅを参照）。ＭｇＣＬおよび比 較的高いＮａＣ１濃変（緩衝液Ｃ）の存在下で、比較的大きな負のバンドが検出 され、これはｌ−１１−１１１三本鎖の形成を示唆するであろう。（図９Ｅを参 照。）（２）ゲル電気泳動による二本鎖の検出１−１１１およびＩ−ＩＩ−ＩＩ ＋三本三本形成を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（３０，３１）によりマー カーとして５゛末端でｓｅｐによりラベルされた異なるオリゴヌクレオチドを用 いて直接モニターすることができる。２つの組の実験の結果を図１Ｏに示す。

マーカーとして”Ｐによりラベルされた１１を用いて、一本鎖！１の移動度をレ ーン１に示す。同じ条件で、１１およびＩｌｌの混合物は１〜２濃度比にもかか わらず唯一のバンドを示す（レーン２）。このバンドの移動度はＩＩ単独の移動 度より小さい。１１および■の混合物中、再び濃度比１〜２で２つのバンドが検 出される（レーン３）。より速い移動度を有するバンドを１１−■二本鎖として 容易に認識することができる。より遅いバンドはｌ−１１１三本鎖の形成の証拠 である。唯一のバンドがレーン２において検出されることに注目するのは興味深 いことであり、これはＩＩＩ−ＩＩ−ＩＩ＋三本三本形れら条件で形成されない という明らかな証拠である。

図１０におけるレーン４〜６は、一本鎖Ｉ１１を５゛末端でｓｔｐによりラベル したときの電気泳動の結果である。１１１単独の移動度を参考としてレーン４に 示す。Ｉｌｌおよび１１の混合物（１，５：１）をレーン５に示す。より遅い移 動度のバンドはレーン２において観察されるバンドに匹敵する移動度を有し、こ れによりｌ１ｌ−１１二本鎖の形成については疑いがない。過剰量の一本鎖１１ １がより速い移動性のバンドとして存在し、このバンドはレーン４におけるバン ドと同一である。これにより、レーン２から得た結果、すなわちいかなるｌ１ｌ −ＩＩ−ＩＩ！三本三本中性ｐＨではＭｇＣｌ２の存在下でさえも形成されない という結果が確認される。他方では、二本鎖１−ＩＩ−ＩＩ＋が、１．５　：　 ｌ　：　１．５ｆｉ合物をレーン６において電気泳動した場合に観察される。こ の３つのバンドは、レーン２〜５において観察されるバンドとの比較により明ら かに二本鎖、二本鎖および一本鎖に上から下へ各々対応している。さらにいかな るＩＩＩ−ＩＩ−ＩＩ！三本三本中成されなかったことを立証するために、レー ン５および６におけるバンドをゲルプレートから切断して計測した。レーア５に おいて、二本鎖の一本鎖１１１に対する放射活性の比は約２対１（６５：３５） である。この結果は元の／Ｉ１合物比（１，５：１）に非常によく適合する。す なわち、１単位の二本鎖が形成されて０．５単位の一本鎖Ｉ１１が残る。ゆえに 、いがなる遊離の１１鎖も＋１−１１１（１：　１．５）Ｕ合物中に存在するは ずはない。ここでレーン５の計測結果を、レーン６において同じ目的のために内 部参考として用いることができる。レーン６における最も遅いバンドから最も速 いバンドの放射活性比は４２：２３：３５である。二本鎖および二本鎖の合計は 再び６５％（４２＋２３）である。従って、全ての１１鎖は二本鎖または二本鎖 のどちらかの形成に再び関与している。さらに、二本鎖の濃度は二本鎖および二 本鎖の３５％（２３／（２３＋４３））である。明らかに、ＩＩの約１／３が二 本鎖形成に関与しており、残りの２／３は二本鎖の形成に関与している。ゆえに 、観察された二本鎖のバンドはＩＩＩ−ＩＩ＋三本鎖本位成によるものにちがい なく、１ｌｉｌｌ−１１１ではあり得ない。これら議論は元の混合物における不 同変化による１−１１−１三本鎖の形成を除外するものであることは注目すべき である。

ＣＧ）ＵＶ混合滴定および融解／アニーリング研究Ｉｌ衝液Ａ中のＩ−ＩＩ系の ＵＶ混合滴定を行い、２６０ｎｍでモニターした。■対１１の６７　：　３３化 学量論比で唯一の終点が観察された。これは！−１１−ｒ三本鎖の形成を示した 。ｌ−１１−１三本鎖についての融解およびアニーリング工程の温度グラフを図 １１ＡおよびＪＩＢに示す。各解離または会合グラフは二本鎖の直接−水路への 融解または一本鎖から直接二本鎖の形成に仮に帰することのできる唯一の転移を 示す（ＵＶ混合滴定およびＣＤスペクトルから得た結果に基づく）。Ｌｌｌ−１ 三本鎖アニーリングに対する転移は、二本鎖の解離について観察された温度（Ｔ ｍ＝７４℃）より低い温度（Ｔｍ＝６６℃）にシフトした。いかなる融解／アニ ーリング実験もＩ　−ＩＩ−Ｉ１１１１鎖系については行わなかった。

実施例５−重鎖オリゴリボヌクレオシド標的を用いた二本鎖ヘリックス構造の形 成 一水路オリゴリボヌクレオシド悸的ｒ（ＡＧ）、を用いた二本鎖へリノクス構造 の形成を、２−０−メチル（ｐｉＣＵ）ｓを含む２つのオリゴマーを用いて図１ ２および１３に見られるように示した。ＣＤスペクトルおよび融解およびアニー リング研究を実施例４に記載のように、Ｃ１，０１Ｍリン酸ナトリウム、Ｏ，Ｉ Ｍ　ＮａＣ１゜０．０１鵬Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，２中て行った。

観察されたＣＤスペクトルは、特に二本鎖へリノクス形成を示す２１０ｎａ領域 において相加的なＣＤスペクトル（図１２を参照）とは異なる。

融解およびアニーリンググラフ（図１３を参照）は二本鎖について約７８〜８０ ℃のＴＩｌを示した。

（以下、余白） 実施例６　襟的としての一本鎖ポリピリミジンオリゴデオキシリボヌクレオシド およびポリプリンメチルホスホネートオリゴマーを用いた二本鎖へワックス複合 体の形成 一本鎖ｄ（ＣＴ）、オリゴヌクレオチドおよび２つのメチルホスホネートｄ（Ａ Ｇ）＠オリゴマーを用いた二本鎖へワックス複合体の形成を示した。

図１４はｄ（ＣＴ）、を有するｄ（八Ｇ）、ホスホジエステルおよびｄ（ＡＧ） 、メチルホスホネートホモプリンオリゴマーについて、４つの波長（・）２８０ ｎｍ、（■）２６０ｎｍ、（ロ）２５４ｎｍ、（○）２３５ｎＭで測定したＵＶ 吸収の組成物における連続的変化を示す。全路ＪＶはＯ，ＩＭ　Ｎａ”　０．０ １Ｍ　ＰＯ，−３，１０−’ＭＥＤＴ八、ｐＨ７，０１こおいて２４μｍであっ た。ホスホンエステルｄ（ＡＣ）＊およびｄ（ＣＴ）、の相互作用についてＩＩ Ｉプリン：ピリミジン化学量論比で単一の終点が観察され、これはワトソン・ク リック型二本鎖のみかこれらの条件下で形成されたことを示していた。ｄ（ＡＴ ）ｓメチルホスホネートおよびｄ（ＣＴ）、について３つの終点が観察された。

１：ｌプリン：ピリミジン化学量論比で、さらにワトソン・クリック型二本鎖が 検出された。６７　：　３３（２：　Ｄおよび３３　：　６７（１：　２）プリ ン：ピリミジン比ての付加的な終点は、プリンニブリン：ピリミジンおよびピリ ミジン・プリン・ピリミジン三本鎖へワックス複合体の形成をこの系においして 観察されたスペクトルは単純な相加により算出されたスペクトルとは非常に胃な っており、このスペクトルは二本鎖へワックス複合体形成を示していた。ＣＤス ペクトルをＯ，１ＭＮａ’、０．ＯＩＭ　ＰＯ４−’、１０−’Ｍ　ＥＤＴＡ、 ｐＨ８゜０中、２０°Ｃで得た。全路濃度は４８μＭであり、εは塩基残基の１ モル当たりで報告した。

図１６はｄ（ＡＧ）、：ｄ（ＣＴ）、Ｉ　：Ｌ　ｄ（ＡＧ）、：ｄ（ＣＴ）、２ 　：　１のＴＴｍおよび融解グラフを示す。オリゴマー１６体についての熱変性 グラフをＵＶ吸収増加によりモニターシた。全路濃度はＯ，１ＭＮａ’、０．Ｏ ＩＭ　ＰＯ，−’、１０−ｓλ’Ｉ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中、４．８μｍであ った。比較の目的のために、各曲線を吸収における全変化に正規化した。ｄ（Ａ Ｇ）、：ｄ（ＣＴ）、ｌ　：　１についてのＴ−は５０°Ｃであった。ｄ（Δｐ ）。：ｄ（ＣＴ）＊　１　：　１についてのＴＩは５３℃であった。

ｄ（ＡＧ）＊：ｄ（ＣＴ）−２：　１についてのＴＩは５１°Ｃであった。融解 曲線かられかるであろうが、二本鎖について観察された融解グラフははるかに狭 いかまたは鋭いものであった。このデータは二本鎖および二本鎖の同時の解離を 示唆したが、二本鎖の転移は熱安定性において一層均一であった。

図１７は天然ポリアクリルアミドゲルにおける複合体の電気泳動分析を示す。

図１６はγ〔３禦Ｐ］およびラベル化ｄ（ＣＴ）、（レーン１〜１２）およびｄ （人Ｑ）＠（レーン１３〜１７）ならびにそれらの複合体を含有している天然の １６％（２９：１ビス）ポリアクリルアミドゲルの放射能写真である。このゲル を、ｐＨ変化を防ぐための緩衝液再循環を有するＯ、ＩＭ　ＮａＣ１，０，０４ Ｍ　Ｔｒｉｓ、　Ｏ，ＯＬＭ　ＰＯ４−３，１０−３Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０ 中、ＣＭ当たり４ボルトで３０時間、５℃で電気泳動した。各レーン中のオリゴ マー濃度を相互作用鎖の化学量論比の下に示す。異なる移動度を有する各種の位 置を元の位置の左に示し、キシレンシアツールおよびブロモフェノールブルーマ ーカー色素を０、Ｘおよびｂで各々示す。

このゲルは明らかにｄ（匹）、・ｄ（匹）、・ｄ（ＣＴ）、二本鎖および５°Ｃ の０．ＩＭＮ　ａ　Ｃｌ中のｄ（ＡＧ）−・ｄ（ＡＣ）ｓ・ｄ（ＣＴ）＊二本鎖 の存在を示している。

図１８Ａは、０．１ＭＮａ”、Ｏ，ＯＩＭ　ＰＯ，−’、１０−’Ｍ　ＥＤＴＡ 、ｐＨ８゜０中、３００ＭＨｚでのｄ（八ｐ）、およびｄ（ＣＴ）ｅのｌ＝１お よび２：１混合物の水素結合したＮＨ−Ｈの共鳴を示す。図１７Ａはプリン：ピ リミジンオリゴマーの１：１および２：１化学量論比況合物の３０℃でのスペク トルを示す。図１８Ｂは２・１混合物について観察された３つの共鳴の化学シフ トの温度依存性を示す：ワトソン・クリックＧｕａ　Ｎ　Ｉ　Ｈ−Ｃｙｔ　Ｎ３ （■）；ワトソン・クリックＴｈｙＮ３Ｈ−Ａｄｅ　Ｎ１（・）；および新しい 第三鎖水素結合イミドプロトン（Δ）。ワトソン・クリック帰属は、仮説であっ てｄ（ＡＧ）、ホスホジエステル二本鎖について観察された化学シフトとの比較 に基づくものであった。これら３つの共鳴は６０℃まで容易に検出された。６５ ℃でそれらの強度は劇的に減少し、これは水素結合された複合体が一般に融解し たことを示していた。約１２ｐｐｍで観察されたＮ）（−Ｎ共鳴（ワトソン・ク リック塩基対合に帰属させるものに加えて）は二本鎖形成によるものであった。

高温で、二本鎖は直接解離して一本鎖型になることが観察された。

６、　Ｙａｒｃｈｏａｎら、　ｒＡＩＤｓ治療Ｊ＋　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ ｓｅｒｉｃａｎ、ｐｐ、１１０−１１９（Ｏｃｔｏｂｅｒ　P９８８）。

１２、Ｓｉｎｇｈ、　Ｕ、　Ｃ，ら、＾ＭＢＥＲ（ＵＣ５Ｐ）　Ｖｅｒｓｉｏｎ 　３．１　（１９８８）。

＋６．　Ｓａｎｇｅｒ、Ｌ、　ｒ核酸構造の原理Ｊ　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ ｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４）。

２２ａ、　Ｔｓ’ｏ、Ｐ、Ｏ，Ｐ、、　ｒ核酸化学における基本的原理Ｊ、　ｐ ｐ、４５３−５８４　（Ｐ、Ｏ，Ｐ、Ｔｓ’ｏ編。

＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、１９７４）。

２３、　Ｓｕｎｄａｒａｌｉｎｇｈａｍ、Ｍ、、　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　′ Ｌ：　８２１　（１９６９）。

２４、Ａｒｎｏｔｔ、Ｓ、、Ｐｒｏｇｒ、Ｎｕｅｌ、入ｃｉｄ　Ｒｅｓ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、１０：　１８３　（１９７０）。

２５、　５ａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ、　Ｖ、ら、Ｃｏｒｌｏｒｍ、Ｂｉｏｐｏｌ ｙｓ、、Ｐａｐ、ｌｎｔ、Ｓｙｍｐ、１９６７、Ｖｏｌ、２K ｐ、６４１　（１９６７）。

２６、Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎａｎ、Ａ、Ｖ、ら、ＢｉｏｃｈｅｔＢｉｏ ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２０４：　４９　（１９７０）。

２７、　ＬａｋｓｂＩＩｌｉｎａｒａｙａｎａｎ、ＡＶ、ら、　Ｂｉｏｐｏｌｙ ｍｅｒｓ　８Ｌ：　４７５および４８９　（１９７０）。

２８、Ｌｅｅ、Ｂ几ら、Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、１６：　１０６８１− １０６９７　（１９８８）。

２９、Ｂａｒｏｎｅ、　Ａ、　Ｄ、ら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、１２： 　４０５１−４０６０　（１９８４）。

３０、Ｉ　ｎｏｕｅ、　Ｈ，ら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、１５：　６１ ３１−６１４１１　（１９８７）。

３１、　０ｎｏ、Ａ　ら、Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１１３：　（１９９１ ）。

３２、０ｎｏ、Ａ、ら、　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　（１９９１）、印刷中。

３３、Ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、　Ｌ、ら、ＴｅＬｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ 、２２：　１８５９−１８６２　（１９８１）。

３４、　５ｉｎｈａ、Ｎ、Ｄ、ら、ＴｅＬｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２４： 　５８４３−５８４６　（１９８３）。

３５、Ｌｅｅ、Ｊ、Ｓ、ら、Ｎｕｃｌ。Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、％：　３０７３− ３０９１　（ｔ９７９）。

３６、’　Ｋａｎ、Ｊ、Ｓ、ら、Ｊ、Ｂｔｏｌｓｏｌ、Ｓｔｒ、Ｓｙｎ、、９１ １−９３３　（１９９１）。

３７、Ｋｉｂｌｅｒ−Ｈｅｒｚｏｇ、Ｌ、ら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｒ、Ｒｅｓ、 １８：　３５４５−３５５５　（１９９０）。

３８、　５ｈｅａ、Ｒ，Ｇ、ら、Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１８：　４８ ５９−４８６６　（１９９０）。

／ＺりｉｔＬ ／Ｚ受ノＺ− 、、□ｆ １）Ｎ　ｌ−ｌ徐弓−〃 ／ワ９Ｌ 特表千７−５０１９３６　（２０） 心〃−１１”ゝ 時間（分） Ｆ／Ｇ、　９ｏ。

Ｆ／Ｇ、　９ｂ。

Ｆ／Ｇ、　９ｃ 波長（ｎｍ） Ｆ／Ｇ、　９ｅ。

温度（”Ｃ） ＦＩＧ、　／幻。

温度（℃） ＦＩＧ　／／ｂ。

ＦＩＧ　／２゜ 温度（℃） ＦＩＧ、　／、３゜ （ＡＧ）８Φ（Ｃη８．ｐＨ７（鵠）８　＋　（ＣηＢ、ｐＨ７Ｆ／Ｇ、　／４ σ　ＦＩＧ、　／４ｂ 温度（℃） 温度（℃） 温度（’Ｃ） ｏ　ｋ　へ に ２：１混合物の温度依存性 温度（℃） フロントページの続き （７２）発明者　ツオ、ポール・オン−ポンアメリカ合衆国２１０４２メリーラ ンド、エリコツト・シティ−、ファロウ・アベニュー９０３９番 （７２）発明者　アダムス、トーマス・ヘンリーアメリカ合衆国９２０６７カリ フオルニア、ランチョ・サンタ・フエ、ポスト・オフィス・ボックス　３０９２ 、エル・ブエロ１７６４５番 （７２）発明者　アーノルド、ライル・ジェイ・ジュニアアメリカ合衆国９２０ ６４カリフオルニア、ボウエイ、マーティンコイト１６６２４番

Claims (72)

【特許請求の範囲】
1. １．一本鎖核酸の特定の標的セグメントを検出または認識する方法であって、（ ａ）該一本鎖核酸を、該標的セグメントに十分に相補性である第１のオリゴマー と接触させてそれとハイブリダイズさせ、安定な二本鎖を得、そして（ｂ）該二 本鎖を、該二本鎖に十分に相補性である少なくとも７個のヌクレオシジル単位を 有する第２のオリゴマーと接触させて安定な三本鎖ヘリックスを形成させ、それ により１回目は第１のオリゴマーとの二本鎖の形成によって、２回目は第２のオ リゴマーとの三本鎖へリックスの形成によって、該標的セグメントの塩基配列を ２回認識させる、 ことからなる方法。
2. ２．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立してオリゴヌクレオチド、ア ルキルもしくはアリールーホスホノチオエートオリゴマー、ホスホロジチオエー トオリゴマー、ホスホロチオエートオリゴマー、アルキルもしくはアリールーホ スホネートオリゴマー、ホスホトリエステルオリゴマー、ホスホルアミダイトオ リゴマー、カルバメートオリゴマー、スルファメートオリゴマー、モルホリノオ リゴマーまたはホルムアセタールオリゴマーからなる請求項１に記載の方法。
3. ３．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立して実質的に荷電していない 中性オリゴマーからなる請求項１に記載の方法。
4. ４．一本鎖核酸がＲＮＡである請求項１に記載の方法。
5. ５．一本鎖核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。
6. ６．標的セグメントがピリミジン塩基だけを含有する請求項１に記載の方法。
7. ７．第１および第２のオリゴマーがプリン塩基だけを含有する請求項６に記載の 方法。
8. ８．第１のオリゴマーがプリン塩基だけを含有し、第２のオリゴマーがピリミジ ン塩基だけを含有する請求項６に記載の方法。
9. ９．標的セグメントがプリン塩基だけを含有する請求項１に記載の方法。
10. １０．第１のオリゴマーがピリミジン塩基だけを含有し、第２のオリゴマーがプ リン塩基だけを含有する請求項９に記載の方法。
11. １１．第１および第２のオリゴマーがピリミジン塩基だけを含有する請求項９に 記載の方法。
12. １２．標的セグメントがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有する請求項１ に記載の方法。
13. １３．第１および第２のオリゴマーがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有 し、該第２のオリゴマーが所望により、該第２のオリゴマーの各塩基が二本鎖の 塩基対の中心プリンと水素結合してトリプレットを形成するためにヌクレオシジ ル単位の間に必要とされるヌクレオシジル間を長くする結合を含有する請求項１ ２に記載の方法。
14. １４．一本鎖核酸標的配列の機能または発現を妨げる方法であって、該標的配列 を、３本鎖ヘリックス構造が形成されるようにヌクレオシド配列が選択された第 １のオリゴマーおよび第２のオリゴマーと接触させることからなる方法。
15. １５．標的配列がプリン塩基だけを含有する請求項１４に記載の方法。
16. １６．第１および第２のオリゴマーがピリミジン塩基だけを含有する請求項１５ に記載の方法。
17. １７．第１および第２のオリゴマーの一方がピリミジン塩基だけを含有し、他方 のオリゴマーがプリン塩基だけを含有する請求項１５に記載の方法。
18. １８．標的配列がピリミジン塩基だけを含有する請求項１４に記載の方法。
19. １９．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方のオ リゴマーがピリミジン塩基だけを含有する請求項１８に記載の方法。
20. ２０．第１および第２のオリゴマーがプリン塩基だけを含有する請求項１８に記 載の方法。
21. ２１．標的配列がプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有する請求項１４に記 載の方法。
22. ２２．第１および第２のオリゴマーがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有 し、該第２のオリゴマーが所望により、該第２のオリゴマーの各塩基が標的配列 または第１のオリゴマーのいずれかの中心プリン塩基と水素結合してトリプレッ トを形成するために必要とされるヌクレオシジル単位の間の結合を長くするヌク レオシジル間単位を含有する請求項２１に記載の方法。
23. ２３．シトシンが、生理学的ｐＨでＮ−３の位置にプロトン化窒素を有するシト シン類似体によって置換されている請求項１４に記載の方法。
24. ２４．シトシン類似体が２′−Ｏ−メチル−プソイドイソシチジンである請求項 ２３に記載の方法。
25. ２５．２−アミノプリンが第２のオリゴマー中の少なくとも１個のアデニンの代 わりとなっている請求項１４に記載の方法。
26. ２６．６−セレニウムグアニンまたは６−イソプロピリデン−７−デアザグアニ ンが第２のオリゴマー中の少なくとも１個のグアニンの代わりとなっている請求 項１４または２５に記載の方法。
27. ２７．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立して、オリゴヌクレオチド 、アルキルもしくはアリールーホスホノチオエートオリゴマー、ホスホロチオエ ートオリゴマー、アルキルもしくはアリールーホスホネートオリゴマー、ホスホ トリエステルオリゴマー、ホスホルアミダイトオリゴマー、カルバメートオリゴ マー、スルファメートオリゴマー、モルホリノオリゴマーまたはホルムアセター ルオリゴマーからなる請求項１４、１５、１８、２１、２２、２３、２４または ２５のいずれかに記載の方法。
28. ２８．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立して、オリゴヌクレオチド 、アルキルもしくはアリールーホスホノチオエートオリゴマー、ホスホロジチオ エートオリゴマー、ホスホロチオエートオリゴマー、アルキルもしくはアリール ーホスホネートオリゴマー、ホスホトリエステルオリゴマー、ホスホルアミダイ トオリゴマー、カルバメートオリゴマー、スルファメートオリゴマー、モルホリ ノオリゴマーまたはホルムアセタールオリゴマーからなる請求項２６に記載の方 法。
29. ２９．第１および第２のオリゴマーが独立して、実質的に荷電していない中性オ リゴマーから選択される請求項１４、１５、１８、２１または２２のいずれかに 記載の方法。
30. ３０．第１および第２のオリゴマーがメチルホスホネートオリゴマーである請求 項１４、１５、１８、２１または２２のいずれかに記載の方法。
31. ３１．非標的タンパク質の合成を実質的に阻害することなく１またはそれ以上の 特異的に標的化したタンパク質の合成をインビボで選択的に阻害する方法であっ て、 （ａ）該標的化タンパク質をコードしているｍＲＮＡのセグメントを含有する核 酸標的配列を選択し； （ｂ）該ｍＲＮＡのセグメントと三本鎖ヘリックス配列を形成するように選択し たヌクレオシド配列を有する第１および第２のオリゴマーを合成し；そして（ｃ ）該第１および第２のオリゴマーを細胞中に導入し；それによって該第１および 第２のオリゴマーが該ｍＲＮＡセグメントとコンプレックス化し、これによりそ のヌクレオシド配列の翻訳を実質的に遮断し、標的タンパク質の合成を阻害する ことからなる方法。
32. ３２．ｍＲＮＡのセグメントがプリン塩基だけを含有する請求項３１に記載の方 法。
33. ３３．第１および第２のオリゴマーがピリミジン塩基だけを含有する請求項３２ に記載の方法。
34. ３４．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方がピ リミジン塩基だけを含有する請求項３２に記載の方法。
35. ３５．ｍＲＮＡのセグメントがピリミジン塩基だけを含有する請求項３１に記載 の方法。
36. ３６．第１および第２のオリゴマーがプリン塩基だけを含有する請求項３５に記 載の方法。
37. ３７．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方がピ リミジン塩基だけを含有する請求項３５に記載の方法。
38. ３８．ｍＲＮＡのセグメントがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有する請 求項３１に記載の方法。
39. ３９．第１および第２のオリゴマーがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有 し、該第２のオリゴマーが所望により、該第２のオリゴマーの各塩基がｍＲＮＡ セグメントまたは第１のオリゴマーのいずれかの中心プリン塩基と水素結合して トリプレットを形成するために必要とされるヌクレオシジル単位の間のヌクレオ シジル間を長くする結合を含有する請求項３７に記載の方法。
40. ４０．全体のＤＮＡの複製または転写を実質的に阻害することなく一本鎖ＤＮＡ の特定のセグメントの複製または転写をインビボで選択的に阻害する方法であっ て、 （ａ）該一本鎖ＤＮＡのセグメントの一部を含有する核酸標的配列を選択し；（ ｂ）該核酸標的配列と三本鎖ヘリックス複合体を形成するように選択したヌクレ オシド配列を有する第１および第２のオリゴマーを合成し；そして（ｃ）該第１ および第２のオリゴマーを細胞中に導入し；それによって該第１および第２のオ リゴマーが該標的配列とコンプレックス化して三本鎖ヘリックス複合体を与え、 これにより全体のＤＮＡの複製または転写を実質的に阻害することなく一本鎖Ｄ ＮＡの特定セグメントの複製または転写を実質的に阻害することからなる方法。
41. ４１．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立して、オリゴヌクレオチド 、アルキルもしくはアリールーホスホノチオエートオリゴマー、ホスホロジチオ エートオリゴマー、ホスホロチオエートオリゴマー、アルキルもしくはアリール ーホスホネートオリゴマー、ホスホトリエステルオリゴマー、ホスホルアミダイ トオリゴマー、カルバメートオリゴマー、スルファメートオリゴマー、モルホリ ノオリゴマーまたはホルムアセタールオリゴマーからなる請求項４０に記載の方 法。
42. ４２．二本鎖の塩基対合を遮断することなく二本鎖核酸の特定セグメントを検出 または認識する方法であって、該核酸セグメントを、該核酸セグメントまたはそ の一部に十分に相補性であるオリゴマーであって該オリゴマー中の少なくとも１ 個のアデニンの代わりに２−アミノプリンが置かれているオリゴマーと接触させ て三本鎖ヘリックス構造を形成させることからなる方法。
43. ４３．オリゴマーの少なくとも１個のグアニンが６−セレニウムグアニンまたは ６−イソプロピリデン−７−デアザグアニンによって置換されている請求項４２ に記載の方法。
44. ４４．二本鎖の塩基対合を遮断することなく二本鎖核酸の特定セグメントを検出 する方法であって、該核酸セグメントを、該核酸セグメントまたはその一部に十 分に相補性であるオリゴマーであって該オリゴマー中のグアニンの代わりに６− セレニウムグアニンまたは６−イソプロピリデン−７−デアザグアニンから選ば れる少なくとも１個の修飾されたグアニン類似体が置かれているオリゴマーと接 触させて三本鎖ヘリックス構造を形成させることからなる方法。
45. ４５．インビボで一本鎖核酸標的配列の発現を選択的に妨げるか、またはそれに 選択的に干渉させる方法であって、 （ａ）開始コドン、ポリアデニル化領域、ｍＲＮＡキャップ部位またはスプライ ス連結点をコードするＲＮＡ領域を含有する核酸標的配列を選択し；（ｂ）該Ｒ ＮＡ領域と三本鎖ヘリックスを形成するように選択したヌクレオシド配列を有す る第１および第２のオリゴマーを合成し；そして（ｃ）該第１および第２のオリ ゴマーを細胞中に導入し；それによって該第１および第２のオリゴマーが該ＲＮ Ａ領域とコンプレックス化して三本鎖ヘリックスを形成し、これにより該標的配 列の発現を実質的に妨げるか、またはそれに実質的に干渉させることからなる方 法。
46. ４６．標的配列がプリン塩基だけを含有する請求項４５に記載の方法。
47. ４７．第１および第２のオリゴマーがピリミジン塩基だけを含有する請求項４６ に記載の方法。
48. ４８．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方がピ リミジン塩基だけを含有する請求項４６に記載の方法。
49. ４９．標的配列がピリミジン塩基だけを含有する請求項４５に記載の方法。
50. ５０．第１および第２のオリゴマーがプリン塩基だけを含有する請求項４９に記 載の方法。
51. ５１．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方がピ リミジン塩基だけを含有する請求項４９に記載の方法。
52. ５２．ｍＲＮＡのセグメントがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有する請 求項４５に記載の方法。
53. ５３．第１および第２のオリゴマーがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有 し、該第２のオリゴマーが所望により、該第２のオリゴマーの各塩基がｍＲＮＡ セグメントまたは第１のオリゴマーのいずれかの中心プリン塩基と水素結合して トリプレットを形成するために必要とされるヌクレオシジル単位の間のヌクレオ シジル間を長くする結合を含有する請求項５２に記載の方法。
54. ５４．第１および第２のオリゴマーが独立して、実質的に荷電していない中性オ リゴマーから選択される請求項４５に記載の方法。
55. ５５．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立して、オリゴヌクレオチド 、アルキルもしくはアリールーホスホノチオエートオリゴマー、ホスホロジチオ エートオリゴマー、ホスホロチオエートオリゴマー、アルキルもしくはアリール ーホスホネートオリゴマー、ホスホトリエステルオリゴマー、ホスホルアミダイ トオリゴマー、カルバメートオリゴマー、スルファメートオリゴマー、モルホリ ノオリゴマーまたはホルムアセタールオリゴマーからなる請求項４５に記載の方 法。
56. ５６．第２のオリゴマー中の少なくとも１個のアデニンの代わりに２−アミノプ リンが置かれている請求項４５または５４に記載の方法。
57. ５７．第２のオリゴマーの少なくとも１個のグアニンが６−セレニウムグアニン または６−イソプロピリデン−７−デアザグアニンによって置換されている請求 項５６に記載の方法。
58. ５８．該オリゴマー中のグアニンの代わりに６−セレニウムグアニンまたは６− イソプロピリデン−７−デアザグアニンから選ばれる少なくとも１個の修飾され たグアニン類似体が置かれている請求項４５または５４に記載の方法。
59. ５９．翻訳可能なｍＲＮＡを得るためのプレｍＲＮＡのスプライシングを妨げる ことによって遺伝子のタンパク質産物または細胞中での遺伝子の発現を選択的に 妨げるか、またはそれに選択的に干渉させる方法であって、（ａ）遺伝子のタン パク質産物をコードするｍＲＮＡのスプライシング部位を含有する一本鎖核酸標 的配列を選択し； （ｂ）該標的配列と三本鎖へリックスを形成するように選択したヌクレオシド配 列を有する第１および第２のオリゴマーを合成し；そして（ｃ）該第１および第 ２のオリゴマーを細胞中に導入し；それによって該第１および第２のオリゴマー が該標的配列とコンプレックス化して三本鎖ヘリックスを形成し、これにより該 プレｍＲＮＡのスプライシングを実質的に妨げることからなる方法。
60. ６０．標的配列がプリン塩基だけを含有する請求項５９に記載の方法。
61. ６１．第１および第２のオリゴマーがピリミジン塩基だけを含有する請求項６０ に記載の方法。
62. ６２．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方がピ リミジン塩基だけを含有する請求項６０に記載の方法。
63. ６３．標的配列がピリミジン塩基だけを含有する請求項５９に記載の方法。
64. ６４．第１および第２のオリゴマーがプリン塩基だけを含有する請求項６３に記 載の方法。
65. ６５．第１および第２のオリゴマーの一方がプリン塩基だけを含有し、他方がピ リミジン塩基だけを含有する請求項６３に記載の方法。
66. ６６．標的配列がプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有する請求項５９に記 載の方法。
67. ６７．第１および第２のオリゴマーがプリンおよびピリミジン塩基の両方を含有 し、該第２のオリゴマーが所望により、該第２のオリゴマーの各塩基がｍＲＮＡ セグメントまたは第１のオリゴマーのいずれかの中心プリン塩基と水素結合して トリプレットを形成するために必要とされるヌクレオシジル単位の間のヌクレオ シジル間を長くする結合を含有する請求項６６に記載の方法。
68. ６８．第１および第２のオリゴマーが独立して、実質的に荷電していない中性オ リゴマーから選択される請求項５９に記載の方法。
69. ６９．第１および第２のオリゴマーのそれぞれが独立して、オリゴヌクレオチド 、アルキルもしくはアリールーホスホノチオエートオリゴマー、ホスホロジチオ エートオリゴマー、ホスホロチオエートオリゴマー、アルキルもしくはアリール ーホスホネートオリゴマー、ホスホトリエステルオリゴマー、ホスホルアミダイ トオリゴマー、カルバメートオリゴマー、スルファメートオリゴマー、モルホリ ノオリゴマーまたはホルムアセクールオリゴマーからなる請求項６８に記載の方 法。
70. ７０．第２のオリゴマー中の少なくとも１個のアデニンの代わりに２−アミノプ リンが置かれている請求項５９または６８に記載の方法。
71. ７１．第２のオリゴマーの少なくとも１個のグアニンが６−セレニウムグアニン または６−イソプロピリデン−７−デアザグアニンによって置換されている請求 項７０に記載の方法。
72. ７２．該オリゴマー中のグアニンの代わりに６−セレニウムグアニンまたは６− イソプロピリデン−７−デアザグアニンから選ばれる少なくとも１個の修飾され たグアニン類似体が置かれている請求項５９または６８に記載の方法。