JPH07501940A

JPH07501940A - 酵素的に得られたグリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸混合物の水素添加

Info

Publication number: JPH07501940A
Application number: JP5508669A
Authority: JP
Inventors: アントン，デイビツド・レロイ; デイコージモ，ロバート; ポータ，アーネスト・ウイリアム
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Priority date: 1991-11-06
Filing date: 1992-11-03
Publication date: 1995-03-02
Also published as: CA2123079C; BR9206882A; CN1073482A; HU9401416D0; EP0541333A1; JPH07504084A; EP0611398A1; IL103645A; CA2123081C; HUT71955A; CZ111394A3; IL103646A; NZ245012A; AU3061692A; DE69210771T2; CA2123081A1; WO1993009242A1; AU658956B2; CZ111494A3; BR9206884A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称酵素的に得られたグリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸混合物の水素添加発明の背景１、発明の分野本発明は、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）　、並びに酵素グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダーゼ、ＥＣＩ。

１、　３．　１５）及びカタラーゼ（ＥＣ１，１１，１，６）を含有する水溶液中グリコール酸と酸素との反応によって得られた混合物の水素添加によるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造に関する。Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンは、多種多様の植物の生育をコントロールする際有用である広範囲発生後除草剤である。

２、関連技術の説明葉状緑色植物及び哺乳類細胞中に普通見出される酵素であるグリコレートオキシダーゼは、グリオキシル酸へのグリコール酸の酸化の触媒となり、同時に過酸化水素を生じる：Ｉ　ＯＣ）１２　ＣＯ２Ｈ＋　０２　→　０ＣＨＣＯ，ｏ＋Ｈ，ｏ２Ｎ、Ｅ、Ｔｏｌｂｅｒｔら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１８１巻、９０５〜９１４頁（１９４９年）は、グリコール酸の酸化の触媒となり、中間のグリオキシル酸の生成を経由してギ酸及びＣ０２とする酵素を、タバコの葉から抽出して最初に報告した。ある種の化合物、例えばエチレンジアミンの添加は、中間体グリオキシル酸がそれ以上酸化されるのを限定する。この酸化は、典型的には約３〜４ＱｍＭ（ミリモル）のグリコール酸濃度を使用して、約８のｐＨにおいて実施された。このグリコレート酸化のための至適ｐＨは、８．９であると報告された。シュウ酸は、グリコレートオキシダーゼの触媒作用を阻害すると報告された。

同様に、Ｋ、Ｅ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＮ、Ｅ、Ｔｏｌｂｅｒｔ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２３６巻、１２８０〜１２８４頁（１９６１年）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩ　Ｓ）を含有する緩衝液は、グリコレートオキシダーゼ触媒のグリコール酸の酸化においてシュウ酸の生成を阻害することを示した。Ｃ，Ｏ，Ｃｌａｇｅｔｔ、Ｎ、Ｅ、Ｔｏｌｂｅｒｔ及びＲ，Ｈ，Ｂｕｒｒｉｓ、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、、１７８巻、９７７〜９８７頁（１９４９年）は、酵素によるグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒の酸化のための至適ｐＨは、７．８〜８．６であり、至適温度は３５〜４０”Ｃであることを報告した。

１、Ｚｅｌｉｔｃｈ及びＳ、０ｃｈｏａ、Ｊ、ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２０１巻、７０７〜７１８頁（１９５３年）、並びにＪ、Ｃ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２３７巻、２ｏｏ１〜２ｏ０９頁（１９６２年）は、グリコール酸のほうれん草グリコレートオキシダーゼ触媒の酸化が、グリオキシル酸とのＨｔ　Ｏｔの非酵素反応から生じることを報告した。かれらは、Ｈ２Ｏ２の分解の触媒となる酵素であるカタラーゼの添加が、ギ酸及びＣＯ２の生成を抑えることによってグリオキシル酸の収量を大きく改善することを観察した。ＦＭＮ　（フラビンモノヌクレオチド）の添加も、グリコレートオキシダーゼの安定性を大きく増大させることが見出だされた。

Ｎ、Ａ、Ｆｒｉｇｅｒｉｏ及びＨ，Ａ、Ｈａｒｂｕｒｙ、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ６．２３１１．１３５〜１５７頁（１９５８年）は、はうれん草から単離されたグリコール酸オキシダーゼの製造及び性質について報告している。

精製された酵素は、溶液状態できわめて不安定であることが見出された：この不安定性は、酵素活性部位＾、のフラビンモノヌクレオチド（Ｆ　Ｍ　Ｎ　）の比較的弱い結合に、又この酵素の酵素活性があるテトラマー及び（又は）オクタマーの酵素活性がないモノマー及びダイマーへの解離に帰せられ、後者は不可逆的に凝集し、沈殿する。　酵素の溶液へのＦＭＮ　（フラビンモノヌクレオチド）への添加は、その安定性を大きく増大させ、高タンパク濃度又は高イオン強度は、酵素をオクタマー又はテトラマーとして保持した。

グリコール酸オキシダーゼが触媒となるグリコール酸の酸化に多くの池の参考文献がある。酵素の単離（及びア一・セイ法）、次の文献に記載されている：１．Ｚｅｌｉｔｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９５５年、５２８〜５３２頁（はうれん草及びタバコの葉がら）、ＨｌＡｓｋｅｒ及びり、Ｄａｖｉｅｓ、Ｂｔｏｃｈｉｍ、ｎ１ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、７６１巻、１０３〜１．０８頁（１９８３年）（ラット肝から）、並びにＭ、Ｊ、Ｅｍｅｓ及びに、　Ｈ，Ｅｒ　ｉ　ｓｍａｎ、Ｉ　ｎ　ｔ、、ｙ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６巻、１３７３〜１３７８頁（１９８４年）　（Ｌ！」上意ａＭｔｎ−λｒ　Ｉ−から）。この酵素の構造も報告されている：Ｅ、Ｃｅｄｅｒｉｕｎｄら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１　−３巻、５２３〜５３０頁（１９８８年）、並びにＹ、Ｌｉｎｄｑｕｉｓｌ及びＣ，Ｂｒａｎｄｅｎ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４巻、３６２４〜３６２８頁（１９８９年）。

アミノメチルホスホン酸およびグリオキシル酸からＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造するため多（の方法が知られている。上記の方法の１つは、Ｒｏｇｅｒｓら、ヨーロッパ特許出願１８６．６４８に記載され、グリオキシル酸又はその塩をアミノメチルホスホン酸又はその塩と縮合させて、一般にアルドイミン（シッフ塩基）とみなされる中間生成物を生成させ、これを単離することなしに触媒水素添加等によって還元してＮ−（ホスホノメチル）グリシンとすることを含む。ｃａｅｒｔｎｅｒ、米国特許４．０９４．９２８に記載されている第２の方法は、非水性溶媒中グリオキシル酸エステルのアミノメチルホスホネートエステルとの反応によってこれらの同じ中間体カルボニルアルドイミノメタンホスホネートを単離する；水の共沸蒸留及び溶媒の除去の後、カルボニルアルドイミノメタンホスホネートエステルを還元し、エステル基を加水分解してＮ−（ホスホノメチル）グリシンを得る。

Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンへの上記の経路は、グリオキシル酸がどちらかというとコストの高い出発物質である点で問題があり、所望のものへの池のそれより安価な経路が実施されている。グリオキシル酸の製造のための既存の方法、例えばジハロ酢酸の加水分解、シュウ酸の電解還元、グリオキサールの酸化、エチレン又はアセトアルデヒドの接触酸化及びマレイン酸、そのエステル又は無水物のオゾン分解は、実施上１つ又はそれ以Ｊ−の難点、例えばコストのがかる分離／精製工程、低い収量又は大きい廃流を示す。Ｇｏｅｒｔｎｅｒ中記載されている方法も、いくつかの追加工程（対応して収量の損失を伴う）及び不中要な中間体の単離を必要とするという点で不利である。

Ｋｌｅｉｎｅｒ、米国特許４，６７０，１９１に開示されている、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの別の一合成法は、水性触媒中アミノメチルホスホン酸又はその塩の約２モル当量のグリオキシル酸との反応よりなる。過剰のグリオキシル酸は、明らかに還元剤として機能し、中間体グリオキシル酸−アミノメチルホスホン酸反応生成物を所望のＮ−（ホスホノメチル）グリシンに変換し、それ自体は酸化されてｃｏ２を含む１種又はそれ以上の副生成物となる。同様に、Ｆｉｅｌｄｓらは、米国特許４，８５１，１５９において、Ｎ−アシルアミノメチルポスホン酸をグリオキシル酸又はその誘導体と共に加熱することによってＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造する。グリオキシル酸対Ｎ−アシルアミノ成分のモル比は好ましくは２対１であり、そうでない場合にはそれより小さい比において収量が損なわれる。

Ｋｌｅｉｎｅｒ及びＦｉｅｌｄｓの方法は、比較的高価なグリオキシル酸を用いるだけではなく、慣性還元剤として（得られるＮ−（ホスホノメチル）グリシンモルごとに用いられるグリオキシル酸約１モル）、並びにアミノ（又はＮ−アンルアミノ）メチルホスホン酸のための縮合剤としてそれを用いるという不利点を伴う。

発明の要約本発明によるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製法は、混合物がアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）　、並びに酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼを含有する水溶液中グリコール酸と酸素とを反応させることによって酵素的に得られる場合、この混合物を水素添加することを含む。本発明の目的のためには、アミノメチルホスポン酸の存在下グリコール酸の酵素酸化は、所望のグリオキシル酸成分の外に酸化副生物（例としてオキサレート、ホルメート及び二酸化炭素を含むが、それらに限定されない）の分布を本来的に生じることが認められるべきであるつ又上記混合物中には未反応のグリコレート、並びに種々の添加剤、例えばフラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮという）が存在し、それらはすべて所望の後の水素添加反応に影響することもしないこともある（再び例として、ホルメート及びＦＭＮは、ＡＭＰＡの存在下グリオキシル酸の水素添加の間に存在するときには、回収炭素バランスを低下させることが見出されているが、それらに限定されない）。即ち本発明は更に、酵素酸化の結果得られた溶液から酵素の除去及び回収、並びに場合によっては水素添加の前ＦＭＮの除去を準備する。

即ち、本発明は、水溶液中にグリコール酸、グリコール酸の酸素による酸化の触媒となり、グリオキシル酸及び過酸化水素とするのに適応した第一の触媒、並びに過酸化水素の分解の触媒となるのに適応した第二の触媒を配合し、溶液のｐＨを６〜約１０に調節し、有効な温度において、アミノメチルホスホン酸の存在下グリコール酸成分の少なくとも一部をグリオキシル酸成分に変換するのに十分な時間この溶液を酸素源と接触させ、そして還元工程の前に溶液の酸素との接触を停止することによって水溶液中系内で酵素的に生じた混合物を還元する工程よりなるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの改良製法を提供する。

好ましくは、触媒は酵素的であり、更に好ましくは第一の酵素はグリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダーゼＥＣ１，１，３，１５）であり、第二の酵素はカタラーゼ（ＥＣ１，１１゜１．６）である。触媒／酵素の存在下溶液の０２との触媒を停止して後、溶液をＮ−（ホスホノメチル）グリシンを得るために還元条件にかける前に、濾過又は遠心分離機等により触媒／酵素を除去する。

即ち、別の工程においてグリオキシル酸を製造する必要を回避することにより、本発明は、より効率的かつ経済的なＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製法を準輛する。

別にグリオキシル酸を製造する必要を避ける、グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸の混合物の還元によるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの改良製法を提供することが本発明の一目的である。

他の一目的は、グリオキシル酸が容易に入手されるその前駆体、則ちグリコール酸からアミノメチルホスホン酸の存在下に系内で酵素的に生成される上記の方法を提供し、それによってより効率的かつ経済的なＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製法を得ることである。

発明の詳細な説明によるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの改良製法は、グリオキシル酸（又はその適当な誘導体）をアミノメチルホスホン酸（八ＭＰＡ）（又はその適当な誘導体）と共に含有する混合物の還元を含む。好ましくは、ＡＭＰＡ及びグリコール酸の０２との反応の触媒となってグリオキシル酸を生成させるのに有効な触媒の存在下グリコール酸成分を分子状酸素源と接触させることによってグリコール酸成分又はその適当な塩を接触酸化させることによりこの混合物は製造される。上記の触媒の１つは、天然産の酵素グリコレートオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３゜１５）（グリコール酸オキシダーゼとしても知られる）であり、このものは、温和名ｐｉ（及び温度の条件下水性媒質中高いグリコール酸変換においてグリオキシル酸を高収量で得る反応の触媒となることができる。

即ちｌ０ＣＩＩｚＣＯ□ｉｉ＋ｏｔ→ＯＣＨＣ０２Ｈ＋　Ｈｔｏ　２グリコール酸又は適当なその塩の接触酸化は、グリコール酸の０．による酸化の触媒となってグリオキシル酸を生成される酵素触媒の存在下グリコール酸を分子状酸素源と接触さ七ることによって都合よ〈実施される。を記触媒の１つは、グリコール酸オキシダーゼとしても知られる酵素グリコレートオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１５＞である。グリコ１ノートオキシダーゼは、当該技術に周知の多くの源から単離することができる。この反応中使用されるグリコレートオキシダーゼは、有効濃度、通常約ｃ、ｏｉ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約４ＩＵ／ｍｌの濃度で存在するべきである。ＩＵ（国際単位）は、毎分基質１マイクロモルの転換の触媒となる酵素の量と定義される。この酵素のアッセイ操作は、１．Ｚｅ！１ｔｃｈ及びＳ、０ｃｈｏａ、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、、２０１巻、７０７−７１８頁（１９５３年）に見出される。この方法は、回収又はリサイクルグリコレートオキシダーゼの活性をアッセイするためにも使用される。

グリコール酸の酸素との酵素触媒反応は周知であるが、グリオキシル酸への高い選択性は以前には得られていず、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）の存在下グリコール酸の酵素的酸化を行った以前の報告はない。

前の出願、１９９１年５月２日の国際公開番号ＷＯ９１１０５８６８ｒグリコール酸の酵素的酸化によるグリオキシル酸の製造」は、酸素、アミン緩衝剤、並びに可溶性酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下グリコール酸のグリオキシル酸への酵素的変換法を記載した。

この方法は、カタラーゼ（副生物過酸化水素を破壊する）及び得られるグリオキシル酸との化学的アダクトを形成する（それ以上の酸化を限定する）ことができるアミン緩衝剤を共に使用することの予期されない相乗効果を実証した。カタラーゼ又はアミン緩衝剤の別々の添加は、両者が存在したとき観察された高い選択性を得なかったことが見出され、得られたグリオキシル酸のほとんど定量的な収量は、カタラーゼ又はアミン緩衝剤単独を使用する単なる相加効果から予期される以上であった。。

グリオキシレートとアミン緩衝剤との酸化抵抗性コンプレックスの形成（Ｎ−ｆｆ換へミアミン系及び（又は）イミンの生成経由）によって得られたグリオキシレートの収量の改善はは、プロトン化アミン緩衝剤のｐＫａに依存することが見出された。アミン緩衝剤（０，３３Ｍ、ｐｌ（８，３）、グリコレートオキシダーゼ（０，５１Ｕ／ｍ　Ｉ）　、カタラーゼ（１，４００１Ｕ／ｍｌ）及びＦＭＮ　（０，０１ｍＭ）の存在下３０℃において、そして酸素１気圧下に２４時間グリコール酸（０，２５Ｍ）の水溶液を酸化した結果を、グリコレートとコンプレックスを形成することが期待されない２種のｌ１ｌｉ剤（ホスフェート及びビシン）を使用して行われた反応と共に下の表に列記する。

オキザレート　グリオキシ　グリコレート　ホルメート緩衝剤　（ｐＫａ）　（％）　レート（％）　（％）　（％）エチレンジアミン　６，８　８５．５　０．８　２．４（６，８５，９，’］３）トリス（８，０８）１．１８１．０２．８１２．０メチルアミン（１０，６２）　１，０　５３．９　３９．８　５．１エタノールアミン　１，８　６９．６　４．８１　２４．５（９，５０）塩化アンモン（９，２４）　１，１　３９．９　３７．７　１８．９イソプロパツール　２，０　６０．０　４．８　３７．４アミン　（９，４３）イミン（８，３０）　１．０　２４．９　２５，６　４３．８ホスフエート　０．７　２４，５　５２．４　２１．２（２，＋５．７．＋０．１２．３）調べられたアミン緩衝剤のうち、反応混合物のｐＨとほぼ等しいか又はそれより低いｐＫａをもつアミンは、ｐＫａが反応が行われるｐＨより高いアミンよりはるかに高い収量のグリオキシレート（並びに低いホルメート及びオキサレート産生）を生じた（即ち、エチレンジアミン及びトリス）。これらの結果は、グリオキサレートとの酸化抵抗性Ｎ−ｆｉ換へミアミン系及び（又は）イミンコンプレックスを形成するためには、非プロトン化アミンが必要であることがあるという予期と一致した；ｐＫａが反応混合物のｐ　Ｉ−１よりはるかに高いアミン緩衝剤は、反応混合物のｐＨよりはるかに高いアミン緩衝剤は、反応混合物中に優先的にプロトン化アンモニウムイオンとして存在し、従ってグリオキシレー１・との上記コンプレックスを形成する可能性が少ないことになる。

アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）のプロトン化アミンのｐ　Ｋ　ａは、１０．８であると報告され（Ｌａｎｇｅ’　ｓ　ｌ１ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｊ、八、　Ｄｅａｎ編、ＭｃＧ　ｒ　ａｗ　−１−１ｉＩｌ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７９年、１２版）、従ってｐ　Ｈ７〜９の範囲内のグリコール酸の酵素的酸化物にＡＭＰＡを添加することがグリオキシル酸の高い収量を生じさせることは予期されなかった。添付実施例は、このアミンを使用して９２％の高いグリオキシル酸の収量が得られたことを例示する。得られるグリオキシル酸の予期されなかった高い収量の外に、ＡＭＰＡの使用は、添加ＡＭＰＡの不存在下で実施された反応（実施例１３）と比較するとき、グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性の回収の改善も生じる。リサイクルのための触媒の回収は、酵素触媒を用いる方法において必要であり、その場合触媒のコストが、製造のコストにかなり関係した。

グリオキシル酸へのグリコール酸の酸化的変換のための触媒としてグリコレートオキシダーゼを使用する際の最適の結果は、反応溶液中に過酸化水素の分解のための触媒を配合することによって得られる。グリコ。

レートオキシダーゼと組み合わせて有効である上記過酸化物破壊触媒の一つは、酵素カタラーゼ（ＥＣ１，１１，１，６）である。カタラーゼは、過酸化物水素の水及び酸素への分解の触媒となり、グリコール酸の０、によるグリコレートオキシダーゼ触媒の反応においてグリオキシル酸と共に生じる過酸化水素の分解を加速することによって、本方法中グリオキシル酸の収量を改善すると考えられる。カタラーゼの濃度は、５０〜５０．０ＯＯＩＵ／ｍｌ、好ましくは５００〜１５，０ＯＯＩＵ／ｍｌであるべきである。カタラーゼ対グリコレートオキシダーゼの比（各酵素についてｌＵ単位で測定して）が少な（とも約２５０：１になるように、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼの濃度を上の範囲内に調節することが好ましい。

反応溶液中随意かつ有益なことが多い他の一成分は、一般に０．０〜２．０ｍＭ、好ましくは約０．０１〜・約０．２ｍＭの濃度で使用されるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）である。ＦＭＮは、グリコレートオキシダーゼの生産性を増大させると考えられ、生産性とは、酵素の単位あたりグリオキシル酸に変換されるグリフール酸の量の増大であることを意味する。ＦＭＮは、酵素の調整の間に酵素に添加されることも多いので、添加ＦＭＨの濃度は、酵素と共に存在するＦＭＮの外であると理解されるべきである。ＦＭＮの構造及びその分析法は、Ｋ、Ｙａｇａｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｘ巻、ＩｎＬｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６２年、３１９〜３５５頁（参照によって本明細書に加入される）に見出される。

グリコール酸（２−ヒドロキソ酢酸）は市販されている。本反応においては、初期濃度は、０．　１０Ｍ・〜２．　ＯＭ、好ましくは０．２５Ｍ〜１．０Ｍの範囲である。それはそのままか、又はその相容性の塩、即ち水溶性であり、そしてグリオキシル酸へのグリコール酸の所望の変換、もしくは後のグリオキシル酸生成物のアミノメチルホスホン酸とのＮ−（ホスホノメチル）グリシンを生成する反応をその陽イオンが妨害しない塩として使用することができる。適当かっ相容性の塩形成イオン基は、試験によって容易に決定される。上記の塩の代表的なものは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、置換アンモニウム、ホスホニウム及び置換ホスホニウム塩である。

グリコール酸のグリオキシル酸への変換は、水性媒質中実節することが都合よくかつ好ましい。アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）又はその適当な塩は、０．０１／１．０〜３．　０／１．　０、好ましくは０．　２５／１．０〜１．　０５／１゜０の範囲のＡＭＰＡ／グリコール酸（出発量）のモル比を得るように添加される。水溶液中ＡＭＰＡとグリコール酸とを合して後、得られた混合物のｐＨを６〜１０、好ましくは７．０〜９．０の値に調節する。このＤＨの範囲内で、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩及び燐酸塩を含むいずれかの相容性の妨害しない塩基を添加することによって、正確な値を調節して所望のｐＨを得ることができる。反応混合物のｐＨは、反応が進行するのに従ってわずかに低下するので、最高酵素活性ｐＨ範囲、約９０〜８．５の上限近くで反応を開始し、そして反応の間に低下させることがしばしば有用である。酵素活性はｐＨと共に変動するので、場合によっては妨害しない無機又は有機緩衝剤の別の添加によってｐＨを保持することができる。

グリコール酸及びグリオキシル酸は、水中高度に解離されており、６〜１０のｐＨにおいては実質的に全部でなくても大部分グリフレート及びグリオキシレートイオンとして存在すると理解される。グリオキシル酸（及びその共役塩基、グリオキシレート陰イオン）は、水和物、例えば（ＩＩＯ）　２ｃｌＩｃＯＯＩＩ及び（又は）ヘミアセタールとしても存在することがあることも、当業者に認められる。ｌ１００ＣＣＨ（０４１）　ＱＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨは、その組成及びその陰イオン相補物は、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの生成のための適当な反応剤であるという本発明の目的の場合にはグリコール酸及びその陰イオンと均等である。

グリコール酸のグリオキシル酸への変換のための酸化剤である酵素（０２）は、ガス−液界面における液の撹拌によるか又は酸素透過性の膜を通して、ガスとして反応物に添加されてよい。大抵の条件下では、酸素が水性媒質中に溶解することができる速度によって反応速度が少なくとも部分的にコントロールされると考えられる。即ち、酸素は、空気として反応物に添加することができるが、比較的純粋な形態の酸素を使用し、そして高圧で使用することさえも好ましい。酸素圧の上限は知られていないが、５０気圧までの酸素圧を使用することができ、１５気圧の上限が好ましい。高い酸素溶解（従って、反応）速度を維持するために撹乱が重要である。撹拌等のいずれかの都合のよい撹乱の形態が有用である。一方、酵素技術者に周知のように、高せん断撹乱又は泡を生じる撹乱は、酵素の活性を低下させることがあり、避けるべきである。

反応温度は、反応速度及び酵素の安定性に影響するという点で重要な変数である。０°Ｃ〜４０℃の反応温度を使用してよいが、好ましい反応温間範囲は５℃〜１５℃である。好ましい温度範囲において操作することは、反応の終末において回収される酵素活性を最大にする。この温度は、水溶液が凍結し始める稈低くてはならない。温度は、普通の方法、例えばジャケット型反応容器を使用し、そして適当な温度の液をジャケットに通すことによってコントロールすることができるが、これに限定されない。反応容器は、反応成分に不活性であるいずれかの材料によって構築されてよい。

反応の完了時、酵素は、濾過又は遠心分離によって除去し、再使用することができる。別法として、それらは加熱（例えば７０℃において５分間）によって変性析出させることができ、そして（又は）グリオキシル酸−アミノメチルホスホン酸混合物をＮ−（ホスホノメチル）グリシンに変換し、そして反応混合物からＮ −（ホスホノメチル）グリシンを回収する後の工程においてそれらの存在が異議がない場合には、反応混合物中に留まらせることができる。

反応混合物の０２との接触を停止して後、そして好ましくは酵素グリコレートオキシダーゼ及び酵素カタラーゼ（存在するときには）の除去の後、溶液を活性炭と接触させることによって、場合によってはフラビンモノヌクレオチドを除去することができる。グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸（これは対応するイミンと平衡状態にあると考えられる）を含有する溶液を還元し、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを得る。

接触水素添加は、グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸の混合物からのＮ −（ホスホノメチル）グリシンの好ましい製法である。この目的のために適当な触媒は、種々の白金族金属、例えばイリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、白金及びパラジウム；文種々の他の遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル及び亜鉛を包含する（がそれらに限定されない）。触媒は、例えばラネーニッケル又は酸化白金のように支持されていなくてよく、又は例えば白金黒、アルミナ上パラジウム、あるいは珪藻上上ニッケルのように支持されていてよい。パラジウム黒、珪藻上上ニッケル及びラネーニッケルが好ましい。

水素添ｌＩ！Ｉ」は、４〜１１、好ましくは５〜１０のｐ［Ｔにおいて行うことができる。このｐＨ範囲内で、いずれかの相容性の妨害しない塩基又は酸を添加することにより、正確な値を調節して所望のｐＨを得ることができる。適当な塩基は、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩及び燐酸塩を包含するが、それらに限定されず、一方適当な酸は、塩酸、硫酸、又は燐酸を包含するが、それらに限定されない。

水素添加の温度及び圧力は広く変わることができる。温度は、一般に０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲であってよく、一方Ｈ２圧は、一般にほぼ大気圧〜約１００気圧、好ましくは１〜１０気圧である。水素添加触媒は、所望の反応速度及び選ばれた反応条件下出発物質の全変換を得る最低濃度で用いられる。この濃度は試験によって容易に決定される。触媒は、反応中用いられるグリコール酸及びＡＭＰＡを合わせた重量１００部あたり触媒の重量でｏ、ｏｏｔ〜２０部又はそれ以上の量で使用することができる。

Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンは、発生後除草剤として有用であり、還元法として何が用いられたにしても、米国特許４．８５１．１５９及び４．６７０．１９１、並びにヨーロッパ特許出願１８６６４８及び４１３６７２に開示されている方法を含む、当該技術に既知の回収法のいず卓１かによって還元溶液から回収することができる。

次の実施例は、本発明を更に例示する役割を果たし、そこではグリオキシレート、ホルメート及びオキサレートの収量、並びにグリコレートの回収収量は、反応の始めに存在したグリコール酸の全量を基にした百分率である。反応混合物の分析は、高圧液体クロマトグラフィーを使用して行われた。有機酸の分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＩＩＰＸ−８７１１カラムを使用して行われ、そしてＡＭＰＡ及びＮ−（ホスホノメチル）グリシンは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ａｍ１ｎｅｘグリホセ一ト分析カラムを使用して分析された。Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの報告されている収量は、どちらが反応において限界試剤であるかにより、グリオキシレートかＡＭＰＡかを基にする。

実施例１３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロゾル反応容器に、。

磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸（０，２５モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．２６３モル）、ＦＭＮ　（０，０１ミリモル）、プロピオン酸（ＨＰＬＣ内部規格、０．１２５モル）、グリコレートオキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、１．　０　１　Ｕ／ｍＬ）　、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１．４００１Ｕ／　ｍ　Ｌ　）を含む水溶液１０　ｍ　ＬをｐＨ８，５で装入した。反応容器をシールし、反応混合物を１５°Ｃに冷却し次いで反応容器を撹拌しながら５回７Ｑｐｓｉｇに加圧しては常圧に戻して酸素でフラシュさせた。この反応容器を次いで７０ｐｓｉｇに酸素で加圧し混合物を１５°Ｃで撹拌した。反応の進行をモニターするためのＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分析のために定期的な間隔で分別量（０，１０ｍＬ）をサンプリングボートから（反応容器の圧力損失なしに）シリンジで取り出した。５時間後のＨＰＬＣでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ７０．４％、１９．６％、及び２．２％　で、５．３％のグリコレートは残留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ２７％および１００％であった。

実施例　２（比較例）０２６５モルのＡＭＰへの代わりに０．３３モルのＫ　２ＨＰ　Ｏ４を用いて実施例１の反応を繰り返した。５時間後の１１　Ｐ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ３４．１％、１１．１％、及び０．　２％　で、５８．７％のグリコレートは残留した。２３時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキサル−１・の収率は、それぞれ３９．４％、４４７％、及び１５゜３４％　で、グリコレートは残留しなかった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ８５％および８７％であった。

実施例　３（比較例）０．２６５モルのＡＭｒ’Ａの代わりに０．２６３モルのビシン緩衝液を用いて実施例１の反応を繰り返した。５時間後の）ＩＰｆ、Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ４２゜５％、４９．６％、及び１０．１％　で、０．　２％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ４７％および１００％であった。

実施例　４アスペルギルス　ニガーからのカタラーゼ５．６００１Ｕ／ｍＬを用いて実施例１の反応を繰り返した。６時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８５．５％、７６％、及び３．３％　で、２．５％のグリコレートが残留した。

グリコレートオキシダーゼおよびカタラー身の残留活性はそれらの初期値のそれぞれ３６％および１００％であった。

実施例　５アスペルギルス　ニガーからのカタラーゼ１４，０ＯＯＩＵ／ｍＬを用いて実施例１の反応を繰り返した。６時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８８゜０％、３３％、及び３．０％　で、３．４％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ２８％および９６９６であった。

実施例　６アスペルギルス　ニガーからのカタラーゼ５６．０ＯＯ１Ｕ／ｍＬを用いて実施例１の反応を繰り返した。６時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８４゜０％、０．４％、及び２．５％　で、８．４％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ１６％および７６％であった。

実施例　７３オンスのフィンシャー−ポーターのガラス製エアロゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸＜ｏ、２５モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．２０モル）、ＦＭＮ　（０，０１ミリモル）、酪酸（Ｉ（Ｉ’ＬＣ内部規格、０．１０モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、１．０　１Ｕ／ｍＬ）、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４．０００１　Ｕ／ｍＬ）を含む水溶液１０ｍＬをｐ）１８．５で装入した。反応容器をシールし、反応混合物を５’Ｃに冷却し次いで反応容器を撹拌しながら５回７ＯｐＳｉｇに加圧しては常圧に戻して酸素でフラシュさせた。この反応容器を次いで７０ｐｓｉｇに酸素で加圧し、混合物を５°Ｃで撹拌した。反応の進行をモニターするためのＨＰ　Ｌ　Ｃによる分析のために定期的な間隔で分別ＪＲ（０，１０ｍＬ）をサンプリングボートから（反応容器の圧力損失なしに）シリンジで取り出した。６時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ９２゜３％、４．３６％、及び５．５％　で、グリコレートは残留しなかった。

グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ８７％および８８％であづた。反応混合物の最終ｐＨは６゜７であった。

得られたグリコール酸（０，２３モル）とＡ　Ｍ　Ｐ　／〜（０，２０モル）の混合物をＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０　濃縮器（１０゜０００分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次いでｆＩＬ液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に１０％Ｐｄ／Ｃの０．１００ｇを加え、瓶をソールし窒素ガスでフラシュし、次いで水素で５０ｐｓｉｇに加圧し２５°Ｃで撹拌した。１７時間後のＮ− （ホスホノメチル）−グリシンの濃度はＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃで定量して０．１３モル（ＡＭＰＡに基づいて６６％収率）であった。

実施例　８３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸（０，５０モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．４０モル）、ＦＭＮ　（０，０１ミリモル）、酪酸（ＨＰＬＣ内部規格、０．１０モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、１．ＯＩＵ／ｍＬ）、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４．　０００１　Ｕ／ｍＬ）を含む水溶液１０ｍＬをｐＨ８，５で装入した。反応容器をシールし、反応混合物を５°Ｃに冷却しくさきの実施例の１５°Ｃに代えて）、次いで撹拌しながら反応容器を５回７０ｐｓｆｇに加圧しては常圧に戻して酸素でフラシュさせた。この反応容器を次いで７０ｐｓｉｇに酸素で加圧し、混合物を５°Ｃで撹拌した。反応の進行をモニターするためのＨＰ　Ｌ　Ｃによる分析のために定期的な間隔で分別量（０，１０ｍＬ）をサンプリングボートから（反応容器の圧力損失なしに）シリンジで取り出した。１７．５時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ９１．０％、２．９％、及び２゜９％　で、４．１％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終ｐ■は６．７であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ６３％および９１％であった。

得られたグリコール酸（０，４６モル）とＡＭＰＡ（０，４０モル）の混合物をＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｊｐｒｅｐ　１０　濃縮器（１０゜０００分子員カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶にＩＯ％Ｐｄ／Ｃの０゜１００ｇを加え、瓶をシールし窒素ガスでフラシュし、次いで水素で５０ｐｓｉに加圧し２５°Ｃで撹拌した。１７時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はＨＰ　Ｌ　Ｃで定量して０２９モル（ＡＭＰＡに基づいて７２％収率）であった。

実施例　９実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸（０，７５モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．６０モル）　、ＦＭＮ　（０゜０１ミリモル）、酪酸（ＩＩＬＣ内部規格、０．１０モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、２．Ｏ［Ｕ／ｍＬ）、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４．　０００１０／ｍ１．、）を含む水溶液１０ｍＬを用いてｐｆ（８，５で繰り返した。

４０時間後のＨＰＬＣでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８３．２％、２．３％、及び７．５％　で、グリコレートは残留しなかった。反応混合物の最終ｐＨは６．８であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ６５％および８６％であった。

得られたグリコール酸（０，６２モル）とＡＭＰＡ（０，６０モル）の混合物をＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０　濃縮器（１０゜０００分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に１０％Ｐｄ／Ｃの０．１００ｇを加え、瓶をシールし、窒素ガスでフラシュし、次いで水素で５０ｐｓｉに加圧し２５°Ｃて撹拌した。２４時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はＨＰ　Ｌ　Ｃで定量して０，４２モル（ＡＭＰＡに基づいて７０％収率）であった。

実施例　１０実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸（１，０モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．８０モル）、ＦＭＮ　（０，０１ミリモル）、酪酸（ＨＰＬＣ内部規格、０．１０モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、２．ＯＩＵ／ｍＬ）。

およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４．０００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液ＬＯｍＬを用いてｐＨ８，５で繰り返した。

６６時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃてのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ７８．９％、２．２％、及び１２．１％で、２．０％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終ｐＨは６゜９であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ６４％および８７％であった。

得られたグリコール！’＋２（０，７９モル）と八ＭＰＡ　（０，８０モル）の混合物をＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０　濃縮器（１０゜０００分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に１０％Ｐｄ／Ｃの０．１００ｇを加え、瓶をシールし、窒素ガスでフランスし、次いで水素で５０ｐｓｉに加圧し２５°Ｃで撹拌した。２３時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はＨＰ　Ｌ　Ｃで定量して０．５１モル（グリコール酸に基づいて６５％収率）であった。

実施例　１１実施例８の反応をｐＨ８，０で繰り返した。１７．５時間後のＩＩ　Ｐ　ＬＣでのグリオキシレートホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８７．０％、２．２％、及び１．９％　で、８．５％のグリコ１ノートが残留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ４４％および９７％であった。

実施例　１２実施例８の反応をｐ　Ｈ７で繰り返した。１７．５時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレー　トの収率は、それぞれ８８，０％、１．４％、及び１．９％　で、８．２％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ４４％および９３％であった。

実施例　１３３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸（０，５０モル）　、ＦＭＮ　（０，０１ミリモル）、イソ酪酸（ＨＰＬｃ内部規格、０．１０モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、１．０ＩＵ／ｍＬ）、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４゜０００１Ｕ／ｍＬ）を含む水溶液１０ｍＬをｐＨ８，５で装入した。反応容器をシールし、反応混合物を５°Ｃに冷却し次いで反応容器を撹拌しながら５回７ＱｐｓｉＨに加圧しては常圧に戻して酸素でフランスさせた。この反応容器を次いで７０ｐｓｉｇに酸素で加圧し、混合物を５０Ｃで撹拌した。反応の進行をモニターするためのＨＰＬＣによる分析のために定期的な間隔で分別量（０，１０ｍＬ）をサンプリングボートから（反応容器の圧力損失なしに）シリンジで取り出した。２１時間後の１１　Ｐ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８１．７％、１．２％、及び２．２％　で、７．５％のグリコレートが留した。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ１９％および７７％であった。

この反応を次ぎにグリコール酸０．５０モルおよびアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）０．２５モル、０．４０モル、０．５０モル、または０．６２モルの存在下に繰り返した。お混合物の１０％　ｐＨは６．７であった。これらの反応の反応生成物の収率、および酵素回収率は次に示される。

０．００　８１．７　１．２　２．２　７．５　１９　７７０．２５　７９．４　２．１　３．３　２．５　’４８　７９０．３７５　７８．３　２．３　３．６　１．７　５７　９５０．４０　９＋、０　２．９　２．９　４．１　６３　９１０．５０　８５．２　１．５　３．３　５．５　４９　９３０．６２５　７９．６　１．７　１，８　１４．０　４２　９４実施例　１４実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸（０，２５モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．２６３モル）　、ＦＭＮ　（０゜０１ミリモル）、酪酸（１■ＰＬＣ内部規格、０．２５モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、１．ＯＩＵ／ｍＬ）、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４，０００１Ｕ／ｍＬ）を含む水溶液１０ｍＬを用いてｐ）１７．Ｏで１５６０において繰り返した。８時間後のＨＰＬＣでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８２．８％、０．９％、及び２．１％　で、１３．９％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終ｐＨは６．６であった。

このグリコール酸（０，２１モル）とＡＭＰＡ　（０，２６３モル）の混合物をＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　ｔｏ　ｌ検器（１０゜０００分子熾カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次いでこの濾液と５０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃとをガラス内張りを施したステンレス鋼製圧力容器に装入した。次いでこの容器をシールし、窒素ガスでフランユし、次いで水素ガスで１０００ｐｓ　ｉに加圧し２５’Ｃで震盪した。容器の圧力は最初の０，５時間に着実に下降し、ついで容器を１０００ｐｓ　ｉに再加圧した。４時間後に容器の圧力を放出し容器を窒素でフランスした。Ｎ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はＨＰ　Ｌ　Ｃで定量して０．１６モル（グリコール酸に基づいて７６％収率）であった。

実施例　１５実施例１４のグリコール酸の酵素酸化をｐ　Ｈｆ３で繰り返した。８時間後の）Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８６．７％、１，８％、及び４．１％　で、１３゜２％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終ｐＨは６．７であった。

このグリコール酸（０，２２モル）とＡＭＰＡ　（０，２６３モル）との混合物を実施例５に記載された操作と同じ操作で１０００ｐｓ　ｉで水素化した。４時間ＩＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度をＩ（Ｐ　ＬＣで定量したところ０．１４モル（グリコール酸に基づいて６４％収率）であった。

実施例　１６実施例１４のグリコール酸の酵素酸化をｐＨ９で繰り返した。７時間後のＨＰＬＣでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ７０．０％、５．６％、及び１１．１％　で、グリコレートの残留はなかった。

反応混合物の最終ｐＨは６．８であった。

このグリコール酸（０，１８モル）とＡＭＰＡ　（０，２６３モル）との混合物を実施例５に記載された操作と同じ操作で１０００ｐｓ　ｉで水素化した。４時間後Ｎ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度をＨＰＬＣで定量したところ００９４モル（ＡＭＰＡに基づいて５２％収率）であった。

実施例　１７実施例１４のグリフール酸の酵素酸化をｐＴ−１８，５でグリコール酸とＡＭＰＡの初期濃度をそれぞれ０．５０モルおよび０．４０モルとして繰り返した。１６．５時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８５．４％、３，５％、及び６，３％　で、１．４％のグリコレートが残留していた。反応混合物の最終ｐＨは７．０であった。

このグリコール酸（０，４３モル）とＡＭＰＡ　（０，４０モル）との混合物を実施例５に記載された操作と同じ操作で１０００ｐｓ　ｉで水素化した。４時間後Ｎ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度をＨＰＬＣで定量したところ０．３０モル（ＡＭＰＡに基づいて７５％収率）であった。

実施例　１８実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸（０，５０モル）、アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ、０．３７５モル）　、ＦＭＮ　（０゜０１ミリモル）、酪酸（ＨＰＬＣ内部規格、０．１０モル）、グリコレート　オキシダーゼ（ホウレンソウからのもの、１．ＯＩＵ／ｍＬ）、およびカタラーゼ（アスペルギルス　ニガーからのもの、１４．０００１Ｕ／ｍＬ）を含む水溶液１０ｍＬを用いてｐＨ８，５で繰り返した。

１７時間後のＨＰ　Ｌ　Ｃでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ８７．１％、１．９％、及び２．１％　で、８．９％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終ｐ　Ｔ−１は６．７であった。

このグリコール酸（０，４３５モル）と八ＭＰＡ　（０，３７５モル）の混合物をＡｍｔｃｏｎ　Ｃｅｎｔ、ｒｉｐｒｅｐ　ＩＱ　濃縮器（１０゜０００分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次いでこの濾液を５０ｍｇの脱色用のカーボンと混合して（ＦＭＮを除き）再び濾過した。

濾液を磁気撹拌棒を装着した３オンスのフィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶にの０．１００ｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加え、瓶をシールし、窒素ガスでフラシュし、次いで水素で５０ｐｓ目こ加圧し２５°Ｃで撹拌した。１７時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はｌＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃで定量して０．３７２モル（ＡＭＰＡに基づいて９９％収率）であった。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年５月６１

Claims

【特許請求の範囲】

１．アミノメチルホスホン酸とグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの酵素とを含有する水溶液中においてグリコール酸と酸素との反応により酵素的に製造された混合物を水素添加することからなるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造方法。
２．グリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸との混合物を水素添加により還元する工程からなり、該混合物は、グリコール酸、酸素によるグリコール酸の酸化を触楳してグリオキシル酸と過酸化水素とを生成させるための第１の触媒ならびに過酸化水素の分解を触媒するための第２の触媒を水溶液に加え、該溶液のｐＨを６と約１０の間に調整し、該溶液を酸素源と有効な温度および十分な時間接触させてアミノメチルホスホン酸の存在下で少なくともグリコール酸成分の１部をグリオキシル酸成分へは変換することにより系中で酵素的に生成され、上記還元工程の前に該溶液と酸素との接触が停止されたものからなるＮ−（ホスホノメチル））グリシンの改良された製造方法。
３．第１の触媒がグリコレートオキシダーゼであり、第２の触媒がカタラーゼである請求項２の製造方法。
４．水素添加が水素添加触媒の存在下で実施される請求項１の製造方法。
５．還元が水素添加触媒の存在下で実施される請求項２の製造方法。
６．水素添加触媒がバラジュウム炭素、ニッケル珪藻土およびラネーニッケルからなる群から選択されたものである請求項４または５の製造方法。
７．水素添加触媒が使用されたグリコール酸とアミノメチルホスホン酸の合計重量１００部当たり０．００１乃至２０重量部存在する請求項６の製造方法。
８．水素添加が４乃至１１のｐＨ、０℃乃至１５０℃の範囲の温度および１乃至約１００気圧の水素圧で実施される請求項７の製造方法。
９．水素添加が５乃至１０のｐＨ、２０℃乃至９０℃の範囲の温度および１乃至約１０気圧の水素圧で実施される請求項７の製造方法。
１０．上記のいずれかの請求項に記載の方法により製造された生成物。