JPH07502016A

JPH07502016A - 流体からの荷電粒子の単離

Info

Publication number: JPH07502016A
Application number: JP5502493A
Authority: JP
Inventors: ミッチェル，イアン・ロバート; スミザーズ，ジェフリー・ウエルスフォード; ダイアニシャス，デイビッド・アラン; グリーブ，ポール・アンソニー; リジェスター，ジェフリー・オウイン; ジェイムズ，エリック・アーノルド
Original assignee: コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション; デーリー・リサーチ・アンド・ディベロプメント・コーポレイション; クイーンズランド州
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1995-03-02
Also published as: WO1993002098A1; EP0595993A4; EP0595993A1; NZ243727A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】流体からの荷電粒子の単離本発明は、イオン交換体を用いた流体からの荷電粒子の分離方法に関する。詳細には、本発明は、乳および乳製品のごとき生物学的流体からの蛋白成分の抽出に適する。特に乳および乳製品からの蛋白成分の抽出に関して本発明を以下に記載するのが便利であるが、本発明は、それに限定されないことを理解すべきである。

乳は、栄養を供給するために、すべての種の哺乳動物により分泌され、子供に免疫性および非免疫性の保護を与える。乳は水、脂肪、炭水化物、塩類、ビタミンおよび種々雑多な成分からなる。子供および成人は、多量の牛乳を消費しており、したがって、該流体は栄養的にも商業的にも重要である。広義には、牛乳蛋白（３０〜３５ｇ／Ｌ）は、カゼイン（約８０％）、乳清蛋白（約２０％）および多種の主要でない蛋白／酵素成分からなる。商業的規模で使用できる迅速かつ効率の良い分離法がないために、連続的かつ拡張的な乳蛋白フラクションの利用が妨げられている。

チーズおよび酸カゼインの製造過程においてカードから分離する乳清（黄緑色液体）は、長い間、乳製品工業における不要副産物であると考えられてきた。乳清中の蛋白は、牛乳蛋白全体の約２０％になる。乳清の主要な蛋白性成分は、β− ラクトグロブリンおよびα−ラクトアルブミンてあり、これら２種の小型の球状蛋白は、乳清蛋白全体の７０〜８０％になる。主要でない蛋白成分は、グリコマクロペプチド、血清アルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリン、ホスホリポ蛋白および多種の酵素（ラクトペルオキ／ダーゼを含む）を含む。噴霧乾燥乳清粉末および乳清蛋白濃縮物（ＷＰＣ）の製造は、これらの蛋白の潜在能力のほんの一部を現実のものとしているに過ぎない。個々の乳清蛋白が、食品および池の工業において栄養的、機能的生物学的に大きな価値のある製品を生み出すと信じられているため、個々の乳清蛋白を単離することは有利であろう。例えば、ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼのごとき主要でない成分は、天然型の抗菌剤として役立つ可能性があり、したがって、ヒトの医薬および獣医分野の医薬の領域に属するっさらに、ラクトフェリンはヒトの乳中において高濃度（約２ｇ／Ｌ）であることが分かっているので、精製ウソ・ラクトフェリンの供給は、新世代の乳幼児用処方物の調製を容易ならしめるであろう。

主要でない乳清蛋白成分は低濃度であるため、その単離は相変わらず多量の乳清または乳の加工を要する。過去において、該加工においてはカラムまたはバッチ式クロマトグラフィー的方法が通常用いられていた。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼ双方の等電点（ｐｉ）は９．０よりも大きいが、その一方て乳清蛋白の大部分は５．１ないし５．４付近の等電点を有する。カゼインの等電点は４．６である。チーズ乳清からの主要でない蛋白／ペプチド成分（主としてラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼ）の単離に関して、カチオン交換クロマトグラフィー法が記載されている。この方法は、通常、伝統的なカラム充填型ベッドに属する適当なカチオン交換樹脂による蛋白成分の吸着に依存している。

ペルキー国特許明細書第９０１６７２号には、ジルコン、チタン、珪素（水晶）またはアルミニウムの酸化物混合物によりイオン交換能を付与されたアルギン酸カル／ウム媒体によるイオン交換法の別法が記載されている。撹拌タンク内で、乳または乳清をイオン交換体を混合し、それにより７５以上の等電点を有する蛋白をイオン交換体に吸着させる。平衡化後、乳または乳清から該イオン交換ゲルを機械的に分離し、塩化カルシウムで洗浄し、希釈する。慣用的なイオン交換カラムは乳製品を供給すると汚れ易いため、該ベルギー国特許の方法は、この一般的でない方法論を取り入れている。バストリゼーンヨン／分離された乳清中に通常見られる脂肪、カゼインおりおよび他の微粒子成分が、カラム汚染物質として作用し、樹脂の能力および生成物の回収率双方を低下させるため、クロマトグラフィー的方法による伝統的なカラムにおいて問題を生じる。

伝統的なイオン交換カラムが詰まるという問題は、国際特許出願ＰＣＴ／５Ｅ８８１００６４３　（Ｗ０８９１０４６０８）において述べられており、その中で、強力チオン交換ベッドを用いた乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラクト７エリンの純粋なフラクンタンの抽出が記載されている。目詰まりの問題を避けるために、この特許出願は、乳副産物をイオン交換ベッドと接触させる前に、これをクロスフロー精密濾過することを必要とする。使用するクロスフロー精密濾過膜は１４ミクロンの孔サイズを有している。

精密濾過工程が、カチオン交換ベッドの目詰まりを避けるのを助けるのであるが、ＰＣＴ、／５Ｅ８８１００６４３記載の方法は、カラム式イオン交換クロマトグラフィーの欠点（すなわち高画なカラム機材およびイオン交換樹脂を要すこと、樹脂の調製および洗浄に時間がかがること、およびカラムが乾燥しないようにする必要があること）を解決できていない。さらなるクロスフロー精密濾過工程もまた、さらなる設備および操作時間を要する。

ついに、イオン交換体の担体どして役立つ多孔性膜に流体を通す単一工程において、イオン交換クロマトグラフィーの利点が見い出されるに至った。

本発明によれば、多孔性膜１に配置されたイオン交換体を用侍し、流体を膜に通し、荷電分そを優先的にイオン交換体に吸着させ、吸着しまた分子をイオン交換体から溶離させることを特徴とする、流体がらの荷電分子の分離方法が提供される。

上記方法を、流体からのいがなる荷電分子の分離に用いてもよい。本明細書中、「分子」なる語はかかる分子のν集物をも包含する。詳細には、該方法は、乳または乳製品、血液または血漿のごとき生物学的流体、あるいは発酵液、細胞培養液のごとき他の形態の流体等の処理に適するつ本明細書中、「乳または乳製品」なる語は、スキムミルク、乳清、発羽等のごとき乳製品を包含する。該方法を用いてラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、増殖促進因子および１１ゾチームのごときカチオン性蛋白成分を乳または乳製品から単離してもよい。該方法を用いてα−ラクトアルブミ゛／、グリコマクロペプチド、血清アルブミン、免疫グロブリンおよび酵素のごとき他の荷電分子を単離してもよい。

また、本発明方法を、池の生物学的流体（例えば、血液および血漿のごとき血液産物）からの荷電分子の単離に用いてもよい。例えば、凝血因子、血清アルブミンおよび免疫グロブリンを血液または血漿がら単離してもよい。

本発明を、医薬品、ビタミン、ホルモンあるいは治療用蛋白を単離するための発酵液または細胞培養液のごとき他の流体を処理するのに用いてもよい。

本発明方法を用いて、乳または乳製品のごとき大量の流体を効率良く濾過し、伝統的クロマトグラフィー的方法を用いたのでは単離困難な主要でない蛋白種を単一操作で抽出してもよい。伝統的なイオン交換体を詰まらせる脂肪球および蛋白性凝集物が該多孔性膜を通過しないようにし、膜の保持液側に保持しておいて、イオン交換体がラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼのごとき有用蛋白種をトラップできるようにする。

膜上にミクロンまたはミリター・ターのオーダーの厚さで配置されたイオン交換体により、乳のごとき流体からある種の蛋白種を効率良く高収率で抽出できることが見いだされている。過去においては、かかる種を効率良（高収率で得るには、長いイオン交換カラムおよび長い滞留時間が必要であると考えられていた。

イオン交換膜に適する孔サイズは、約１１から約１２ミクロンまでであり、好ましくは約０２ないし約０６ミクロン、最も好ましくは０．４ミクロンであるっ本発明方法は、簡単に汚れるイオン交換カラムを用いるのではなく、本発明方法で用いる膜は、膜でもってすべての微粒子物質を排除することが重要でないという理由で、ＰＣＴ／５Ｅ８８１００６４３に用いられたクロスフロー精密濾過法に用いるものよりもやや大きい孔の膜である。やや大きな孔は、本発明において、高い透過流速を達成することを助ける。所望であれば、流体を該膜に通す前に、精密＃過工程に付してもよい。

デノドエント濾過法あるいはクロスフロー濾過法いずれによっても流体を膜に廼寸ことができる。慣用的なデソドエントまたは静圧濾過は、フィルターに垂直に物質を供給する力を要するが、クロスフロー濾過は、平行な２枚のフィルター間の狭い隙間に供給物質を、大きな線速度でフィルター表面を横切るように通過させることを要する。

他のイオン交換体の場合と同様に、連続的に高い塩濃度の溶液を用いて／あるいは溶離液のｐＨを連続的に変化させて、イオン交換体のｐＨを蛋白のごとき所望の荷電分子の等電点以上もしくは以下にシフトさせることにより、本発明に使用できる膜から定量的に溶離させる。したがって、種々の荷電分子間のｐ＋または池の結合パラメーターの相違を利用して、例えばＰＣＴ／５Ｅ８８１００６４３記載のごとく、相対的に純粋なそれぞれの荷電分子のフラクションを得ることができる。

特定の蛋白の優先的結合を用いて、他の蛋白に優先して流体から１種の蛋白を単離してもよい。例えば、ラクトフェリンは、ラクトペルオキシダーゼよりも固く膜に結合するので、ラクトペルオキシダーゼを膜から追い出して入れ代わる。

したがって、膜をラクトフェリンで飽和させて、ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼ双方を含む乳製品から相対的に純粋なラクトフェリンのフラクションを単離し、でもよい。

流体を膜に通過させた直後（すなわち膜の上流側の表面に付いた脂肪球および蛋白性残渣をクリーニングする前）から荷電分子の溶出を開始することができる。

別法として、例えば、溶離溶媒を供給する前に、かかる物質を膜からクリーニングすることができる。

伝統的なイオン交換カラムとは異なり、本発明で用いられる膜は、交換体の膨潤またはパラキンクの問題がなく、維持がより簡単である。例えば、もしイオン交換膜が乾いた場合でも詰め直す必要がない。さらに、衛生化または滅菌法がより多様で、蒸気処理、界面活性剤あるいは水酸化ナトリウムのごときアルカリ溶液のごとき乳製品工業で用いられている現存法が適用できる。

強または弱あるいはカチオンまたはアニオン交換体いずれをを用いてもよい。

「強」および「弱」なる語は、イオン交換体の官能基のｐＨによるイオン化の程度を言う。強イオン交換官能基は広いｐＨ範囲にわたり総体的にイオン化する。

強力チオン交換官能基（例えばスルホプロピル）は、ｐＨ２以上で総体的にイオン化（脱プロトン化）する。交換体を選択して所望の荷電分子の結合を確実にしてもよい。例えば、ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼのｐ＋が９゜５付近であり、一方乳清蛋白の大部分が５．４以下のｐＴを有するので、強力チオン交換体を用いて高いｐｉ値を有する蛋白種の結合を確実にしてもよい。この場合、適当な強力チオン交換体は、対称的なポリアミド担体上に配列したスルホン酸官能基からなる。

ポリマーを不活性多孔性膜上に付け、ついで所望のカチオンまたはアニオン性官能基を導入することによる２段階法でかかる膜を調製してもよい。したがって、広い範囲の孔サイズおよびポリマー量が利用できることが明らかである。本発明に用いられる膜を、慣用的なりロスフローカートリッジ（モジュール）またはデッドエンドフィルターの形態で提供することがてきる。

本発明の産物として得られる流出物もまた有利な特性を有している。例えば、チーズ乳清からのカチオン性蛋白であるラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの抽出は、これらのカチオン性蛋白が乳清蛋白全体の３％未満であるという理由で、供給物質として用いたのと本質的に変わらない乳清製品を生じる。さらに、該方法はまた、この乳清製品中には微粒子がなく、微生物および脂肪もごく僅かしかないことを保証する。したがって、この乳清製品をさらに、高い溶解度をはじめとする利点を伴った低脂肪乳清蛋白濃縮粉末に加工してもよい。

本発明方法の好ましい具体例を、添付図面を参照にして実施例により説明する。

図１：精製蛋白および牛乳由来の製品双方を用いたクロスフロー膜イオン交換法の実験装置の模式図である。本明細書に示すデータのパラメーターを以下のごと（定義する　結合容ＩＩ　（ｍｇ／Ｃｍ２）＝　Ｉ　（Ｃ９ＸＶＩ）＋　（ｃ、ｘｖ、）ｌ　、、。

／′モノニール表面積（ｃｍ２）；ここにＣ＝溶液濃度（ｍｇ／Ｌ）、ｖ＝体積（Ｌ）。

回収率（％）＝　［Ｉ　（ｃｃｘｖｏ）＋　（Ｃ，ＸＶＴ）ｌ　負、＋　［（ｃ、ｘｖ、）　＋（ｃ。

Ｘｖ、）ｌ、、］　Ｘ１００／　（ｃ：ｘｖ：）：ここにＣ＝溶質濃度（ラクトペルオキシダーゼについては活性、ラクトフェリンについてはＨＰＬＣ分析）、 ■＝体積（Ｌ）、１）”透過液、ｒ＝保持液、ｌ＝初発供給物質。

図２　精製蛋白および牛乳由来の製品双方を用いたデッドエンド膜イオン交換法の実験装置の模式図である。ここに示すデータのパラメーターを以下のごとく定義する：結合容量（ｍｇ／ｃｍ２）＝　（ｃ−ＸｖＪ　／フィルター表面積（ｃｍ’）：ここにＣ＝溶質濃度（ｍｇ／ｍＬ）　、ｖ＝体積（ｍＬ）。溶出率（％）＝ｆ（ｃ、ｘｖ、）　Ｘ１００／　（（ｃ：ｘｖ＝）　−（ｃ＋ｘｖ＋）　− （ｃ、ｘｖ−）　Ｉ　、回収率（％）＝　ｌ　（ｃ＋Ｘｖ＋）＋　（ｃ、ｘｖ、）＋　（ｃ、ｘｖ、）Ｉ　Ｘ１００／（ｃ：Ｘｖ＋）：ここにＣ＝溶質濃度（ラクトペルオキ／ダーゼについては活性、ラクトフェリンについてはＩ（Ｐ　Ｌ　Ｃ分析）、■＝体積（ｍＬ）、ｆ＝濾液、Ｗ＝洗液、ｅ＝溶出液、！＝初発供給物質。

図３　りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，７）中の純粋蛋白のクロスフロー膜イオン交換１１！遇における透過流束（ム）、ラクトペルオキ／ダーゼ活性（・）およびラクトフェリン濃度（■）。供給物質中の初発レベル・ラクトペルオキ／ダーゼ５．３　１Ｕ／ｍＬ＋ラクトフェリン１００．０ｍｇ／Ｌ０図４：りん酸ナトリウム緩衝Ｗ！　（ｐＨ６，７）中の純粋蛋白のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰＬＣクロマトグラム。ａ、供給物質：ｂ、１０７Ｌ操作後の透過液：　ｃ、０．２Ｍ　ＮａＣＩでの溶出液（１：２４希釈）。

図５・りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，７）中の純粋蛋白のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥｆｌｔ気泳動。レーン１、初発供給物？Ｉ：レーン２．負μｆ中の保持液、レーン３．負荷中の透過液、レーン４゜０゜２ＭＮａＣ１ての溶出液：レーン５．０．４ＭＮａＣｌでの溶出液、レーン６、］、ＯＭ　ＮａＣＩでの溶出液：レーン７．低分子量蛋白マーカー。

図６．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，０）のクロスフロー膜イオン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキシダーゼ活性（・）およびラクトフェリン濃度（■）。乳清供給物質中の初発レベル：ラクトペルオキ／ダーゼ７．８　１Ｕ／ｍｌ７．ラクトフェリン８１．４ｍｇ／Ｌ。

図７．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，０）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラム。ａ、供給物質、ｂ。

３７Ｌ操作１漫の透過液：ｃ、ＩＭＮａＣＩでの溶出液（１：９希釈）。

図８：精密濾過されたチェダーチーズ乳ｍ（ｐＨ６，０）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動。レーン１．初発供給物′Ｎ：レーン２．負荷中の保持液：レーン３．負荷中の透過液：レーン４および５．１Ｍ　ＮａＣ１での溶出液、レーン１０．低分子量蛋白マーカー。

図９．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，９）のクロス７０−膜イオン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキ／ダーゼ活性（・）およびラクトフェリン濃度（■）。乳清供給物質中の初発レベル：ラクトペルオキシダーゼ３．４　１Ｕ／ｍＬ＋ラクトフェリン４０．０ｍｇ／Ｌ０図１０＝精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，９）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰＬＣクロマトグラム。ａ、供給物質：ｂ、５３Ｌ操作後の透過液；ｃ、ＩＭＮａｃＩでの溶出液（１，：１２希釈）。

図１１：精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，９）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動。レーン６、初発供給物質；レーン７、負荷中の透過液、レーン８．負荷中の保持液：レーン９゜１、ＯＭ　ＮａＣｌでの溶出液：レーン１０．低分子量蛋白マーカー。

図１２　精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキシダーゼ活性（・）およびラクトフェリン濃度（■）。表面積０．６ｍ”のクロスフローモジュールを用いた。供給物質の初発レベル　ラクトペルオキ／ダーゼ１１．ＯＩＵ／ｍＬ、ラクトフェリン１１６．０ｍｇ／Ｌ０図１３：精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰＬＣクロマトグラム。ａ、供給物質；ｂ、２５Ｌ操作後の透過液；ｃ、ＩＭＮａＣｌでの溶出液（１：１５希釈）ロー膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン１．初発供給物質：レーン２．負荷中の保持液；レーン３．負荷中の透過液；レーン４および５．１ＭＮａＣｌでの溶出液：レーン１０．低分子量蛋白マーカー。

図１５：精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキ／ダーゼ活性（・）およびラクトフェリン濃度（−）。表面積０．５ｍ２のクロスフローモジュールを用いた。供給物質の初発レベル・ラクトペルオキ／ダーゼ１１．２１Ｕ／ｍＬ：ラクトフエリン１１６．０ｍｇ／Ｌ０図１６　精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換＃過により得られた試料のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラム。ａ、供給物質：ｂ、２６Ｌ操作後の透過液：　ｃ、ＩＭ　ＮａＣｌでの溶出液（１：５希釈）。

図１７・精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られｔコ試料の電気泳動図。レーン１．初発供給物質、レーン６、負荷中の保持液、レーン７、負荷中の透過液：レーン８および９゜１ＭＮａＣｌでの溶出液、レーン１０　低分子量蛋白マーカー。

図１８　精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のデ・ノドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラム。ａ、供給物質。

ｂ、５０ｍＬ操作後の透過液：　ｃ、ＩＭ　ＮａＣｌての溶出液（１，３希釈）。

図１９・精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のデ・ノドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン１゜低分子量蛋白マーカー、レーン４．初発供給物質、レーン５．負荷中の濾液（透過液）：シー２６．１．０Ｍ　ＮａＣｌでの溶出液。

図２０．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ７，０）のデ・ノドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラム。ａ、供給物質。

ｂ、ＩＭＮａｃＩての溶出液（１３希釈）。

図２１　精密濾過されたチェダーチーズ乳ｉ’１ｌ（ｐＨ７，０）のデッドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン１゜低分子量蛋白マーカー、レーン２．負荷中の濾液（透過液）、レーン３．１．０ＭＮａＣ１ての溶出液、レーン４．初発供給物質。

図２２．透析され、精密濾過されたチェダーチーズ乳清ＣｐＨ７，０）のデッドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラムラミ。

供給物質：ｂ、３０ｍＬ濾過後の透過液：ｃ、１ＭＮａＣｌての溶出液（１，３希釈）。

図２３：透析され、精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ７，０）のデ・ノドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン１．低分子量蛋白マーカー、レーン２．負荷中の濾液（透過液）；レーン３゜１．０ＭＮａＣｌでの溶出液、レーン６、初発供給物質。

図２４．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，５）（Ａ）および精密濾過されていないチェダーチーズ乳ｍ（ｐＨ６，５）（Ｂ）の、サルトビンド（Ｓａｒ＋ｏｂｊｎｄ）　Ｓフィルター（５，４ｃｍ？、０．４５μｍ孔）（釦または慣用なミニザルト（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）　Ｎフィルター（■）を用いたデ・ソドエンド濾過における濾過（透過）流束。流束を５０　ｋ　Ｐ　ａ定圧下５０℃ にて測定した。

実施例一般的方法論原材料乳清はチェダーチーズの副産物であり、商業的チーズ生産者から、また１まシーニスアイ・ディリー・リサーチ・ラボラトリ−（Ｃ３Ｉ　Ｄａｉｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において「室内的」に調製するかのいずれかにより、新鮮な状態で得た。使用前に該乳清を分離しく４０°Ｃ）、ノクストリゼーノヨン（７２’Ｃ，１５秒）した。

無脂肪乳を、分離（３５〜４０℃）およびノくストリゼーンヨン（７２℃、１５秒）により調製した。純粋蛋白での試験を行うために、チトクロームＣ（ウマ・ｌ仁〜臓）をベーリンカー・マンノ１イム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社力＼ら得、ウノ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを、本質的に以前に記載されてＬする方法（ロー・ヒ’＝Ｌイ（ｌａｗ、Ｂ＾、）およびレイター・ビー（Ｒｅｉｔｅｒ、　Ｂ、　）　（１９７７年）ザ・アイ゛ルーンヨン・アンド・ノくクテリオスタテイ・ツク・プロ、＜−ティース・オフ・ラクトフェリン・フロム・ホエくイン・ミルり・ホエー（ＴｈｅＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　１ａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖ奄獅■@ｍ１ｌｋｔｈｅｙ）　、　ン＋−す／Ｌ／・オフ・ディリー・１け−チ（Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｒｅｓ、　）　、第４４巻、５９５〜５９９頁）で単離した。牛乳限外濾過物を、無脂肪乳を５０℃で限外濾過（分子量ｉｓ、ｏｏｏてカントオフする膜を使用）しな力くら得ｔこ透過液を集めることにより調製した。

膜処理前処理　いくつかの実施例については、指示する箇所て、チーズ乳清および無脂肪乳の原材料を、膜イオン交換する前に精密濾過を用いて前処理した。クロスフロー型の膜イオン交換を包含する実験については、はじめにチーズ乳清を、４５ ℃においてザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）社の三酢酸セルロースクロスフローモジュール（０，６ｍ”＝６　Ｘ　１０３ｃｍ２．０．４５μｍ孔）を用いて精密濾過した。

デッドエンド型の膜イオン交換を包含する実験については、はじめにチーズ乳清を、ザルトリウス社のミニサルｉＮ　（５，３ｃｍ２．０．２１℃ｍ孔）を用いて精密濾過し、無脂肪乳については六ルケ／（Ｎａｌｇｅｎｅ）　？１の酢酸セルロース（３８ｃｍ２゜０．１５μｍ孔）を用いて、２０°℃で精密ｔ！遇した。

膜イオン交換（クロスフロー型）セルトリウス社のＳＣＸ］ポリスルホン膜材料（強力子オン交換体）（０２１１ｍ孔）を用いて作られたサルｉ・コシＩＩ　（Ｓａｒｔｏｃｏｎｌｌ）ブラント設置型の受注生産されたクロスフローＥツユ〜ル（２種−広チヤンネル（０，５ｍ２＝５Ｘ１０３ｃ　ｍ２）および狭チャンネル（０，６ｍ２＝６Ｘ１０’ｃｍ ”））を用いて実験を行った。、他の一般的操作条件は１°ノ丁のことし　圧力２０（１ｋＰａ（入［１）および１０（ｌｋＰａ（出口）：ＡＫ度４：）で（ＰＩ荷および洗浄）および２（１℃（溶離）。個々の実施例において、断らないかぎり、使用前にクロスフローモノニールを平衡化しておき、］　ＱｍＭ　ＮａＣｌ　（＝Ｉ５Ｌ）にて洗浄し、結合蛋白を］ＭＮａＣｉ（２０１、）にて溶離させた、膜のクリーニングおよび衛生化を、１５％（Ｗ／ｖ）Ｐ：３−ウルトラフル（Ｕｌｔｒａｓｊｌ）　５３　（１０Ｌ）にて３７℃で行い、膜をＩＭＮａＣ１含有２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中１．４℃で保存した。該クロスフロー型実験装置の概略図を、用語の定義およびデータベラメーターとともに図１に示す。

膜イオン交換（プントエンド型）ミニザルト型のサルトリウス社のサルトヒンドＳフィルターユニット（５，４ｃｍ２＝、４，５ｘｌＱ−’ｍ２．０．４５／１ｍ孔）を用いて実験を行った。１０ｍＬ／分に流速を調節して、結合および回収のデータを室温および５０℃において集めた。一定圧力（５０ｋＰａ）において、流束のデータを５０℃にて集めた。使用前にフィルターを平衡化させておき、１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７，０，１０ｍＬ）て洗浄し、結合蛋白を、１０ｍＭりん酸すｌ・リウム（１０ｍＬ）中ＩＭＮａＣＩて溶離させた。ＩＭ　ＮａＯＨ（１０ｍＬ）で膜をクリーニング、衛生化し、該サルトヒンドフィルターを１．ＭＮａＣＩ含有２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中、４°Ｃて保存した。該デッドエンド型実験装置の概略図を、用語の定義およびデータパラメーターとともに図２に示す。

分析方法高品質液体クロマトグラフィー　原材料および膜イオン交換工程後の試料中の蛋白成分の定性的および定量的分析を、ウォーターズ（ｆａｔｅｒｓ）社のシステムを用いた高品質液体クロマトクラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。５０ｍＭりん酸すトリウム（ｐｊ−１７，５）で平衡化したモノＳ　（ＭｏｎｏＳ）ＨＲ５１５カラム（ファルマンア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）に試料（］、００μ Ｌ）を負荷し、１４分かけて同緩衝液中て直線的に塩濃度を上昇（０〜１０〜１　、　Ｎ　ａ　Ｃｌ　）させるグラジェント法（流速１．０ｍＬ／分）により溶離を行った。２２０ｎｍにおいて、カラ１．溶出物を連続的にモニターした。対象とする蛋白（例えばラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ）を表すピーク面積を、デルタ・ジュニア・データ・アナ＋１シス・ソフトウェア・ハンゲー／（Ｄｅｌｔａ　Ｊｕｎｉｏｒ　ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅ）　（オーストラリア国デン・タル・ソリュー／ヨンズ・ピーティーワイ（Ｄｉｇｉｔａｌ　５ｏｌＪｔｉｏｎｓ　Ｐｔｙ）　＞を製）を用いた電子式積分により測定した。上記条件にて、標準ラクトペルオキ／ダーゼおよびラクトフェリンは、それぞれ保持時間９７分および１８．９分てカラムから溶出した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動　原材料および膜イオン交換工程後の試料中の蛋白成分の同一性、純度および分子サイズの決定を、以前に記載されている垂直スラブゲル装置（レムリ、ニー・ケイ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、）　（１９７０年）クリーニング・オフ・ストラクチャル・プロテインズ・デユーリング・ザ・アセンブリー・オフ・ザ・ヘンド・オフ・ザ・バクテリオファーン・ティーフォー（Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａп@ｏｆ　ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４）　、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７巻、　６８０〜６８５頁）を用いて、トデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下（変性条件）におけるポリアクリルアミドケル電気泳動により行った。試料（５０／／Ｌ）中の蛋白を、直線的勾配ケル（１０〜１５％）中で分離し、クーマノ−・ブリリアント・ブルーＲ（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ）にて蛋白バンドを染色した。低分子１１７−カー蛋白（ファルマ／ア社製）を用いてゲルをキャリブレーションした。マーカーは、ホスホリラーゼｂ　（９４ｋＤａ）　、ウノ・血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オバルブミン（４，３ｋ　Ｄ　ａ　）　、カルホニノク・アンンヒトラーセ（３０ｋＤａ）　、大豆・トリプシンインヒヒター（２０，ｌ　ｋＤａ）およびα−ラクトアルブミン（１４，４ｋＤａ）を含む。用いた条件下で、ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼは、ゲル上８０ｋＤａの分子量に相当する場所に現れた。

分光学的分析　ラクトペルオキシダーゼの酵素活性を、以前に記載（バッター、ノエイ（Ｐｕｔｔｅｒ、　Ｊ、　）および八ツカー。アール（Ｂｅａｋｅｒ、　Ｒ，）　（１９８３年）。

メツ゛ノズ・オフ・エンザイマティソク・アナリンス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ＾ｎａｌｙｓｊｓ）　（ベルシマイヤー。エイチー　ニー（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、　Ｉｔ、　Ｌｌ）編、ペルオキシダーゼス（Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅｓ）第３巻（第３版）２８６〜２９３頁、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）のフエアラーク・ヘミ−（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ）　）されている人工基質２．２°　−アント−ヒス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホンＢＴＳ）を用いた連続的分析において分光学的に測定した。測定用混合液（２。

３８ｍＬ）は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中、ＡＢＴＳ１．６７ｍＭおよび８２０２０．１８ｍＭを含有する。酵素含有溶液（２０μＬ）を添加することにより反応を開始し、４０５ｎｍの吸光度変化の速度を、記録計付き分光光度計て２５℃にて測定した。酵素活性１単位（ＩＵ）は、上記条件にて１分間に１マイクロモルのＡＢＴＳの酸化を触媒する。純粋蛋白で試験を行う場合には、供給、洗浄および溶出フラクション中の蛋白含量を、２８０ｎｍにおける吸光度から計算した。

膜イオン交換の実施例純粋蛋白のクロスフロー濾過実施例］　純粋蛋白に対する膜イオン交換体（クロスフロー型）の結合容量を測定する試験において、３０ｍｇ／Ｌのラクトペルオキシダーゼおよび１００ｍｇ／Ｌのラクトフェリンを含有する２００Ｌの１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６　７）を供給物質として用いた。保持液流れをリサイクルするようにザルトコンＩＩプラントを構成した。負荷中の透過液および保持液の試料を、後のＨＰＬＣＳＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性測定による分析のために集めた。負荷後、膜を１ＯＬの１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６．７）で洗浄し、ＮａＣｌ含有りん酸ナトリウム緩衝液の３回（各１ＯＬ）のバッチ（すなわちＮａＣｌ含有度を０。

２Ｍ．０．４Ｍおよび１．０Ｍと増加させる）で、蛋白の溶離を行った。溶離中は、保持液流れをリサイクルさせなかった。溶離中、透過液および保持液フラクションから引き続いて行ｐ分析用に試料を集めた。膜に負荷している間の透過流束測定結果およびラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに関する透過液の分析を図３に示す。試験により得られたＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果をそれぞれ図４および図５に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を示すデータを、表１に示す。

表１：ｐＨ６．７の緩衝溶液中、強力チオン交換クロスフロー膜に一緒に適用した場合の精製ラン・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量およおび回収率 °精製蛋白を１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６．７）に溶解し、４５℃で狭チヤンネル膜（０．６ｍ２）に供した。′定義を図１に示す。

チェダーチーズ乳清を用いたクロスフロー濾過実施例２　この試験において、ｐＨ６．０のチェダーチーズ乳清を膜イオン交換の前に精密濾過した。精密濾過した乳清（１２ＯＬ）を、保持液をリサイクルするように構成されｔ：ザルトコンＩＩプラントを用いて狭チャンネルクロスフロ−モジュール（０，６ｍ”）に供した。試験中に透過液および保持液の試料を集めておいて、引き続き行うＨＰＬＣ，５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性測定によるラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼ含量の測定を可能にした。該乳清供給物質の負荷に続いて、４５Ｌの１０ｍＭ　ＮａＣ１で膜を洗浄した。ついで、保持液流れをリサイクルしないやり方にして、２０ＬのＩＭ　ＮａＣ１で２０℃において溶離を行った。溶離工種の完結後、ついで行う分析のために、溜めておいた透過液および保持液から試料を集めた。試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白の「ブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）　Ｊを示すデータを図６に示す。試験により得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図７および８に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表２に示す。

表２：強カチオン交換クロス７０−膜に適用した場合のｐＨ６，０における分離／パストリゼーンヨンしたチェダーチーズ乳清（前以て精密濾過した）からのウノ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率°ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清（ｐＨ６，０）を、４５℃て狭チヤンネル膜（０，６ｍ”）に供した。５定義を図１に示す。

実施例３　この試験において、膜イオン交換の前に、濃ＮａＯＨ溶液で、乳清のｐＨを６．９に合わせた以外は、実験条件は上記実施例２と同じであった。

ｐＨ調節に続いて、該乳清（９７Ｌ）を精密濾過し、ついで、２０℃において１０ＬのＬＭ　ＮａＣ］で溶離を行うこと以外は実施例２記載のごとくクロスフロー膜イオン交換に供した。試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白の「ブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）　Ｊを示すデータを図９に示す。試験により得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１０および１１に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表３に示す。

表３　強力チオン交換クロスフロー膜に適用した場合のｐＨ６，９における分離／パストリゼーンヨンしたチェダーチーズ乳清（前以て精密濾過した）からのウノ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率１ラクトフエリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清（ｐＨ６，９）を、４５℃で狭チヤンネル膜（０，６ｍ２）に供した。′定義を図１に示す。

実施例４　この試験において、乳清を膜イオン交換の前に精密濾過しないこと以外は、上記実施例２と同様にして、ｐＨ６，２のチェダーチーズ乳清を用いた。

該乳清（８０Ｌ）を、保持液をリサイクルするように構成されたザルトコンＩＩプラントを用いた狭チヤンネルクロスフローモジュール（０，６ｍりに供した。

池の操作条件は、２０℃においてＩＯＬのＩＭ　ＮａＣ１で溶離を行うこと以外は実施例２に関して記載したのと同じであった。試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白の［ブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）　Ｊを示すデータを図１２に示す。試験により得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１３および１４に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表４に示す。

表４　強力チオン交換クロスフロー膜に適用した場合のＩ）Ｈ６，２における分離／バストリゼーションしたチェダーチーズ乳清（精密濾過せず）からのウシ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率°ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清を、４５℃で狭チヤンネル膜（０，６ｍ２）に供した。６定義を図１に示す。

実施例５　乳Ｍ　（ｐＨ６，２，７６１−、実施例４で使用したのと同じバッチ）を、広チャンネルクロスフローモジュール（０，５ｍ２）に供した以外は、実施例４記載の試験の繰り返しであった。他の操作条件は、２０℃におてＩＯＬのＩＭＮａＣｌで溶離を行う以外は、実施例２について記載したのと同様であった。

試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白の「ブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）　ｊを示すデータを図１５に示す。試験により得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１６および１７に示す。

ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表５に示す。

表５　強力チオン交換クロスフロー膜に適用した場合のｐＨ６，２における分離／パストリゼーノヨンしたチェダーチーズ乳清（精密濾過＋！ｉ）からのウシ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率′ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清を、４５℃て広チャンネル膜（０，５ｍ”）に供した。゛定義を図１に示す。

純粋蛋白を用いたデッドエンド濾過実施例６　純粋蛋白に対する膜イオン交換体（プントエンド型、すｌレトヒンドＳ、　５．４　ｃｍ２）の結合容量を測定する試験において、０．６ｍｇ／ｍＬのチトクロムＣまたは０．６ｍｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼあるいは０．６ｍｇ／ｍＬのラクトフェリンを含有する２０ｍＬの１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７０）を供給物質として用いた。実験を２０℃で行った。供給液、濾液、洗浄液および溶出液の試料を、後のＨＰＬＣおよび分光学的分析のために集めた。チトクロムＣおよびラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量、溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表６に示す。

表６＋ｐ）１７．０の緩衝液中、強イオン交換デッドエンド膜に別々に適用した場合の、精製ウマ・チトクロムＣおよびウノ・ラクトフェリンならびにラクトペルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回収率°精製蛋白をｌＱｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解し、２０℃でザルトビノドＳフィルター（５，４ｃｍ２）に供した。１定義を図２に示す。゛データは、４回の試験の平均値および標準偏差を表す。１データは、８回の試験の平均値および標準偏差を表す。

実施例７　この試験において、牛乳限外濾過物に溶解した純粋蛋白（ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼ）に対する膜イオン交換体（デッドエンド型、ザルトビンドＳ、　５．４　ｃｍ２）の結合容量を２０°Ｃおよび５０℃で測定した。

供給物質が、０．６ｍｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼを左１ｔｏ、６ｍｇ／ｍＬのラクトフェリンを含有する無脂肪乳限外濾過物であることを除き、実験を実施例６記載のごとく行った。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量ならびに溶離後のこれらの蛋白の回収率を表７に示す。

表７：ｐＨ６，７の牛乳限外濾過物中、強イオン交換デッドエンド膜に別々に適用した場合の、精製つ戸ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回収率１　ラクト７エリ７゛　２０　１．１±０２　６０±１７　９６±２１ルν一（５，４ｃｍ”）に供した。′定義を図２に示１゛。゛データは、４回（２０℃）または２回（５０℃）の試験の平均値および標準偏差を表す。

実施例８　この試験において、１０ｍＭのりん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解したラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼ（両方の蛋白を含有する溶液として膜に供した）に対する膜イオン交換体（デッドエンド型、ザルトビンドＳ、　５．４　ｃｍ２）の結合容量を、２０℃および５０℃両方て測定した。供給物Ｍ　（６０ｍＬ）が、０．０３ｍｇ／’ｒｎＬのラクトペルオキ／ダーゼおよび０．１５ｍｇ／ｍＬのラクトフェリン（牛乳および乳清における濃度に似ぜた）を含有していること以外は実施例６記載のごと（実験を行ったうラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量ならびに溶離後のこれらの蛋白の回収率を表８に示す。

表８：ｐＨ７，０の緩衝液中、強イオン交換デッドエンド膜に同時に適用した場合の、精製ウマ・チトクロムＣおよびウシ・ラクトフェリンならびにラクトペルオキ／ダーゼの結合容量、溶出率および回収率゛精製蛋白を１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶解し、２０℃または５０℃で一緒にづルトビンドＳフィルター＜５．４ｃｍ２）に供した。５定義を図２に示す。

チェダーチーズ乳清を用いたデッドエンド濾過実施例９　この試験において、精密濾過したｐＨ６，２のチェダーチーズ乳清（１５０ｍＬ）を、膜イオン交換フィルターに２０℃にて供した。供給液、濾液および溶出液の試料を、後のＨＰＬＣ，５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび分光学的分析用に集めた。試験により得られたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１８および１９に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表９に示す。

表９二強カチオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ６，２における分離／バストリゼーンヨンされたチェダーチーズ乳清（精密濾過済み）からのウシ・ラフ）・フェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回収率°ラクトフェリン（６３，１ｍｇ／Ｌ）およびラクトペルオキシダーゼ（２，４１Ｕ　／　ｍ　Ｌ　）を含有する乳清を、２０℃でザルトビノドＳデッドエンドフィルター（５，４ｃｍ２）に供した。

１゛定義を図２に示す。

実施例１０　この試験は、膜イオン交換の前に、乳清のｐＨをＩＭ　ＮａＯＨて７．０に合わせること以外は実施例９記載の試験の繰り返しであった。試験により得られたＨＰＬＣおよびＳ　Ｄ　’Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ分析の結果を、それぞれ図２０および２１に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表１０に示す。

表１０　強力チオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ７，０における分離／バストリセーションされたチェダーチーズ乳清（精密濾過済み）からのウシ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回収率 ”ラクトフェリン（６１，４ｍｇ／′Ｌ）およびラクトペルオキ／ダーゼ（４，６１Ｕ　／　ｍ　Ｉ−）を含有する乳清を、２０℃でザルトビノドＳデッドエンドフィルター＜５．４　ｃ　ｍ２）に供した。

５定義を図２に示す。

実施例１１・　この試験は、膜イオン交換の前に乳清（５０ｍＬ）を１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に対して透析する以外は実施例９記載の試験の繰り返してあった。試験により得られたＨ　Ｐ　Ｌ　ＣおよびＳ　Ｉ）Ｓ−Ｐ、Ａ　Ｇ　Ｅ分析の結果を、それぞれ図２２および２３に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表１１に示す。

表１１１強イオンカチオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ７，０における分離／バストリゼーンヨンされたチェダーチーズ乳清（透析および精密濾過済み）からのつ／・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量、°ラクトフェリン（５５，８ｍｇ／Ｌ）およびラクトペルオキシダーゼ（５６ＩＵ／ｍＬ’）を含有する乳清を、２０°ＣでザルトビノドＳデッドエンドフィルター（５，４ｃｍ２）に供した。

５定義を図２に示す。

実施例１２　この試験において、デッドエンド膜イオン交換濾過（ザルトビンドＳ、　５．４　ｃｍ”、　０．４５μｍ孔）の濾過（透過）流速を、精密濾過済みのチェダーチーズ乳清および精密濾過していないチェダーチーズ乳清の両方（ｐＨ６゜５）を用いｔこ慣用的な濾過（ミニザルトＮ、　５．３　ｃｍ２．０．２μｍ孔）の流速と比較した。該実験を、３０ｋＰａ定圧て５０°Ｃにて行った。結果を図２４に示す。

無脂肪乳を用いたデッドエンド濾過実施例１３　二の試験において、牛乳中のラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜イオン交換体の結合容量を測定した。精密濾過したｐＨ６，７の無脂肪乳（６０ｍＬ）を、２０℃にてデッドエンド膜イオン交換フィルター（ザルトビンドＳ、　５．４　ｃｍ２．０．４５μｍ孔）に供した。他の条件は実施例６について記載したのと同じであった。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表１２に示す。

表１２　強力チオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ６，７における分離／バストリゼーションされ精密濾過された牛乳からのウシ・ラクトフェリンＵ／ｍＬ）を含有する無脂肪乳を、２０℃でサルトビンドＳデ・ソドエンドフイルタ−（５，４ｃｍりに供した。

５定義を図２に示す。

本発明を、上記した特別なザルトリウス社の膜に関して説明した力（、他の膜構造、官能基および多孔性度の使用は本発明の精神の範囲内であること力（容易１＝理解されよう。

ここに記載の本発明は、特別に記載された以外の変法および改変を許容することを当業者は容易に認識するであろう。本発明は、その精神および範囲内の変法および改変を包含することが理解されるべきである。

保持液の「リサイクル」透過液（ｐ）１’ｌＧ、１洗浄液（Ｗ）ＦＩＧ、　２透過液体積（Ｌ）ＦＩＧ、３０．００　５．００　１０．００　＋５．００　２０．（Ｘ）分ＦＩＧ、’１旦１ｊ２５０　、５０　−＝　１５ＦＩ６．９０．０Ｏ５ｊ）０　１α℃０　１５℃）０　２０．００分ＦＩＧ、　１０ＦＩＧ、　１２ＦＩＧ、　１３ＦＩＧ。１５ＦＩＧ、　１６ＦｌＧ、　１８ＦＩＧ、　２００．００　５．００　１０．００　１５．００　２０．ＣＸ）分ＦＩＧ、２２時間（分）ＦＩＧ、２１４国際調査報告　ｌｌｍｍ息１□Ｎ。

ＦｅｒｍＰＣＴｎ５Ａｎ１０ｆｅ口ｆ武馴り關−屹一り陀ｅｌＧｒｇｍｍｍｌｆｌ＃１９１−！ｌｏｏｐｌｐ国際調査報告　＋′−１１暑−ＮａＫＪＩＡＩＭ＆＋３１１１Ｆｏｒｍ　ＰＣ７ｎｓＮ２＋ｏ　ｔｗｍ＋＋ｕａｂａｅ　ｎｒ　−刻−ｒｈｅｍｙｒｕ＋ｙ　＋　ｗ■ａｐｈフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／７４５　８３１８−４Ｈ１４／７９　８３１８−４Ｈｌ６１００　８３１８−４Ｈ（７ｌ）出願人　クイーンズランド州オーストラリア連邦　４０００　クィーンズランド、ブリスベン、アシ・ストリート６２−８０番（７２）発明者　ミッチェル、イアン・ロバートオーストラリア連邦　３８０５　ビクトリア、ナーレ・ウォーレン、キルガーロン・コート８番（７２）発明者　スミザーズ、ジェフリー・ウェルスフオードオーストラリア連邦　３１９２　ビクトリア、チェルチンハム、ローナ・ストリート６３番Ｉ（７２）発明者　ダイアニジヤス、ディピッド・アランオーストラリア連邦　４０１４　クイーンズランド、ナラジー、オーバーリー・ストリート７番（７２）発明者　グリープ、ポール・アンソニーオーストラリア連邦　４１２７　クィーンズランド、スプリングウッド、ジャールディン・ドライブ３番（７２）発明者　リジェスター、ジェフリー・オウインオーストラリア連邦　３０５６　ビクトリア、ファーントゥリー・ガリイ、パンフィールド・コート１番（７２）発明者　ジェイムズ、エリツク・アーノルドオーストラリア連邦　４０６７　クィーンズランド、セント・ルシア、スワン・ロード２９潜

Claims

【特許請求の範囲】

１．多孔性膜上に配置されたイオン交換体を用意し、流体を膜に通し、荷電分子を優先的にイオン交換体に吸着させ、吸着した分子をイオン交換体から溶離させることを特徴とする、流体からの荷電分子の分離方法。
２．流体が生物学的流体である請求項１記載の方法。
３．荷電分子が１種またはそれ以上の蛋白である請求項１記載の方法。
４．膜の孔サイズが十分小さく、流体中の脂肪球および微粒子が膜を通過するのを妨げる請求項１記載の方法
５．流体が乳または乳製品である請求項１記載の方法。
６．乳製品が乳清からなる請求項５記載の方法。
７．流体が血液または血液製品である請求項１記載の方法。
８．該荷電分子が、ホルモン、ビタミン、酵素、凝血因子、免疫グロブリン、べプチド、リゾチームおよび抗体から選択される請求項１記載の方法。
９．膜が約０．１μｍないし約１．２μｍの範囲の孔サイズを有する請求項１記載の方法。
１０．膜が約０．２μｍないし約０．６μｍの範囲の孔サイズを有する請求項１記載の方法。
１１．膜の保持液側から脂肪球および微粒子を除去する前に、吸着した荷電分子を膜から溶離させる請求項１記載の方法。
１２．荷電分子を溶離させる前に、膜の保持液側から脂肪球および微粒子を除去する工程からさらになる請求項１記載の方法。
１３．イオン交換体が強イオン交換体である請求項１記載の方法。
１４．イオン交換体が強カチオン交換体である請求項１３記載の方法。
１５．荷電分子がラクトフェリンおよび／またはラクトペルオキシダーゼからなる請求項５記載の方法。
１６．ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳または乳製品からラクトフェリンを分離する請求項５記載の方法。
１７．請求項１記載の方法を用いて流体から分離された荷電分子。
１８．いずれか１の実施例に関して前記した方法と実質的に同じである請求項１記載の方法。