BE901672A - Procede de purification de proteines du lait et de ses derives. - Google Patents
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Abstract
Procédé de purification de protéines du lait dont le pH isoélectrique est supérieur à 7,5 qui consiste (1) à faire passer le milieu contenant les protéines sur des particules d'un polysaccharide acide gélifiable, pris sous forme de gel, la teneur en polysaccharide acide dans le gel étant comprise entre 1 et 8 % en poids, le gel étant utilisé à raison de 1 à 20 % en poids dans une solution dans laquelle il est insoluble et (2) à récupérer les protéines.
Description
PROCEDE DE PURIFICATION DE PROTEINES DU LAIT ET DE SES DERIVES. PROCEDE DE PURIFICATION DE PROTEINES DU LAIT ET DE SES DERIVES. La présente invention se rapporte à un procédé de purification de protéines se trouvant dans le lait ou dans ses dérivés comme le lactosérum. En particulier, la présente invention concerne un procédé de purification ou d'extraction de protéines en les traitant dans des conditions adéquates en présence d'un polysaccharide acide gélifiable avec des ions métalliques. Plus particulièrement encore, la présente invention concerne l'extraction ou la purification par ce procédé, de protéines se trouvant dans le lait ou dans ses dérivés, dont le pH isolélectrique est supérieur à 7, 5. comme notamment la lactoferrine, la lactoperoxydase et d'autres analogues. Il est bien connu que les protéines comme la lactoferrine et la lactoperoxydase ont de nombreuses applications dans le domaine alimentaire, ou dans le domaine thérapeutique. En raison de la demande toujours croissante, il est évidemment souhaitable de disposer d'un procédé unique pour être appliqué à différents milieux et aux différentes protéines, ce qui n'est généralement pas le cas actuellement. Ainsi, on a déjà proposé, dans le brevet français 2.505.615, un procédé pour extraire deux protéines particulières du lait, mais ce procédé nécessite notamment que l'on modifie le pH du lait. De plus, le procédé décrit dans le brevet fait appel à des poudres de substances minérales absorbantes comme la silice) prises sous forme de billes macroporeuses et microscopi- <EMI ID=1.1> caséine et de lipides, pour éviter le colmatage rapide de la résine. On a également proposé des procédés qui utilisent des résines échangeuses d'ions dont les particules sont moins fines que les billes de poudre minérale, mais qui par leur structure macroporeuse, présentent également l'inconvénient d'être rapidement colmatées. On a également proposé d'utiliser comme matériau absorbant des billes d'oxyde de titane dont le diamètre peut varier entre 50 microns et quelques centimètres. Cependant,ce type de matériau nécessite un prétraitement du lait et/ou du lactosérum afin d'en réduire la concentration en ions, ce qui constitue ainsi des opérations supplémentaires et une modification du milieu. Il serait dès lors souhaitable de disposer d'un procédé qui permette d'extraire facilement les protéines d'un milieu aussi complexe que le lait entier qui comporte notamment graisses, globules lipidiques et micelles de caséine, ce procédé ne présentant pas les inconvénients de colmatage mentionnés ci-dessus, ni la nécessité de prétraiter le milieu. Le but de la présente invention est de mettre au point un tel procédé. La Demanderesse a maintenant trouvé que l'utilisation de polysaccharides acides gélifiables dans des conditions adéquates permet une séparation et une purification de diverses protéines du lait. La présente invention a pour objet un procédé de purification et de séparation de protéines par traitement en présence d'un polysaccharide acide gélifiable dans des conditions adéquates. La présente invention a également pour objet un tel procédé de purification de protéines sans qu'il en résulte une altération significative du milieu hors duquel on extrait les protéines. <EMI ID=2.1> procédé d'extraction de protéines qui permette d'effectuer la séparation des protéines de manière beaucoup plus rapide qu'avec les autres procédés, en évitant le colmatage des résines ainsi que tout prétraitement du milieu. La présente invention a également pour objet un tel procédé de purification qui permette de traiter les protéines du lait ayant un pH isoélectrique supérieur à 7,5. Le procédé de la présente invention pour la purification des protéines du lait dont le pH isolélectrique est supérieur à 7,5 est caractérisé en ce que (1) l'on fait passer le milieu contenant la protéine recherchée sur des particules d'un polysaccharide acide gélifiable pris sous forme de gel, ces particules ne mesurant pas moins de 0,5 mm dans leur plus petite dimension, la teneur en polysaccharide acide dans le gel étant comprise entre 1 et 8 % en poids, ce gel étant utilisé à raison de 1 à 20 % en poids dans une solution dans laquelle il est insoluble et (2) l'on récupère les protéines dans une solution de sel dont le taux en ions est supérieur à 0,05 % en poids par volume (ci-après exprimé par pds/vol.). La Demanderesse a maintenant trouvé d'une manière inattendue que l'on pouvait purifier et séparer les protéines mentionnées ci-dessus seulement lorsque les particules de polysaccharide acide gélifiable ne mesurent pas moins de 0,5 mm dans leur plus petite dimension. Ceci est d'autant plus inattendu que les résines utilisées antérieurement devaient avoir une surface spécifique d'absorption la plus grande possible pouvant aller jusqu'à 700 m<2>/g pour mener à bien l'extraction des protéines. Or, dans le procédé de l'invention, les gels formés à partir des polysaccharides acides gélifiables ne sont que peu perméables aux protéines et de ce fait l'absorption est limitée en surface, ce qui réduit considérablement la surface spécifique du gel, qui peut être comprise entre 2.10 <3> et 0,2 m<2>/g. Les polysaccharides acides gélifiables utilisés dans la présente invention sont choisis parmi les alginates et les carraghénans. Ces polysaccharides acides gélifient lorsqu' on les met en contact avec une solution comprenant des cations comme notamment des cations de métaux alcalins, alcalino-terreux, ceux de la série du fer et également le cation ammonium. La Demanderesse a également trouvé d'une manière inattendue que 1',on pouvait adsorber les protéines recherchées sur le gel du polysaccharide acide. On a d'ailleurs constaté que le mode de préparation du gel de polysaccharide acide était également très important pour la réussite du procédé de l'invention. Lorsqu'on choisit l'alginate comme polysaccharide acide, on prépare généralement le gel en prena'nt un sel soluble d'alginate en solution aqueuse, habituellement le sel de sodium, que l'on met en contact avec un contre-ion pour obtenir la formation du gel. Généralement, on utilise une solution de CaCl2. On a remarqué cependant que pour obtenir un gel utilisable dans le procédé de l'invention, il fallait que la concentration en alginate dans le gel soit comprise entre des limites bien définies, en l'occurence entre 1 et 8 % en poids,le reste étant constitué par de l'eau. Lorsque la concentration en alginate dans le gel est plus faible qu'environ 1 %, la stabilité du gel est considérablement réduite, du fait de l'excès d'eau, ce qui le rend inutilisable pour purifier les protéines. Par contre, avec une concentration supérieure à 8 %, on observe également une augmentation de la viscosité, ce qui ne permet plus de manipuler le milieu aisément, rendant ainsi la préparation du gel pratiquement impossible. On peut utiliser le gel obtenu dans de bonnes conditions sous forme de billes, de perles, de lamelles,de fils, de fibres ou même de tissu. Selon un mode d'exécution de la présente invention, on prend de l'alginate de sodium en solution aqueuse et on le <EMI ID=3.1> présence de l'ion responsable de la gélification. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, le lait ou le lactosérum traités ont une concentration suffisante en calcium pour assurer la stabilisation du gel d'alginate. Lorsqu'on choisit le carraghénan comme polysaccharide acide, on prépare généralement le gel en prenant un sel soluble de carraghénan en solution aqueuse. Habituellement,on prend le sel de sodium, que l'on met en contact avec un contreion pour obtenir la formation du gel. Généralement, on utilise une solution de KCl, NH Cl ou RbCl. On a remarqué que pour obtenir un gel utilisable dans le procédé de l'invention, il fallait que la concentration en carraghénate dans le gel soit comprise entre des limites bien définies, en l'occurence entre 1 et 8 %, le reste étant constitué par de l'eau. Lorsque la concentration en carraghénate dans le gel est plus faible qu'environ 1 %, la stabilité du gel est considérablement réduite, du fait de l'excès d'eau, ce qui le rend inutilisable pour purifier les protéines. Par contre,avec une concentration supérieure à 8 %, on observe également une augmentation de la viscosité, ce qui ne permet plus de manipuler le milieu aisément, rendant ainsi la préparation du gel pratiquement impossible. On peut utiliser le gel obtenu dans de bonnes conditions sous forme de billes, de perles, de lamelles, de fils, de fibres ou même de tissu. Selon on mode d'exécution de la présente invention, on prend du carraghénate de sodium en solution aqueuse et on le gélifie avec KC1. Le gel obtenu, selon la forme désirée, est ensuite mis dans une solution de KC1, de manière à toujours être en présence de l'ion responsable de la gélification. Quel que soit le polysaccharide acide utilisé pour former le gel, on peut également incorporer à celui-ci un oxyde de métal, insoluble dans les conditions d'utilisation. A titre d'exemple d'oxydes que l'on peut utiliser, on peut notamment citer les oxydes de titane, zirconium, silicium, aluminium, la sépiolithe� et analogues. La quantité d'oxyde incorporé ne dépasse généralement pas 3 % en poids. Cependant, des quantités supérieures peuvent être utilisées sans pour autant apporter un effet significatif. Selon le procédé de la présente invention, on utilise le gel ainsi obtenu dans une solution où il reste insoluble, à raison d'une quantité comprise entre 1 et 20% en volume par rapport à la solution de protéines. Cette quantité dépend également de la concentration de protéine à absorber. En ce qui concerne les protéines qui peuvent être séparées par le procédé de l'invention, elles doivent avoir un pH isoélectrique d'au moins 7,5. A titre d'exemples de protéines du lait qui peuvent être séparées et purifiées par le procédé de l'invention, on peut notamment citer la lactoferrine,la lactoperoxydase, certaines immunoglobulines et d'autres protéines analogues. Les protéines qui sont adsorbées sur le gel du polysaccharide acide doivent alors être récupérées. Il est entendu que le procédé de la présente invention peut être appliqué pour séparer d'autres protéines, éventuellement présentes dans d'autres milieux, selon des conditions à déterminer par l'homme de métier. Dans le cas de l'utilisation d'un gel d'alginate pour éluer les protéines ainsi adsorbées sur le gel, on peut utiliser le CaCl2 lorsque l'on a comme gel un alginate de cal- <EMI ID=4.1> suffisantes. La concentration de la solution en sel utilisée pour éluer les protéines du gel d'alginate n'est pas critique: elle dépend du sel utilisé, de la protéines et du pH de la solution. <EMI ID=5.1> tration d'au moins 0,1 % en pds/vol. Le sel utilisé pour éluer la protéine du gel peut être, mais non nécessairement, le même que celui utilisé pour son adsorption. Quand on utilise deux sels différents, il est évident qu'il faut qu'ils soient compatibles, c'est-à-dire qu'ils ne réagissent pas pour former eux-mêmes un précipité. Généralement, avant de recommencer une nouvelle élution, on lave le récipient et le gel d'alginate avec une solution de sel dont la concentration est suffisante pour ne pas déstabiliser le gel. Le plus souvent, on utilise une solu- <EMI ID=6.1> Le procédé de la présente invention pour séparer et purifier les protéines, peut être réalisé en continu ou en discontinu. Selon un mode d'exécution en discontinu du procédé de la présente invention, on prépare le gel d'alginate de calcium, on l'introduit dans un récipients quelconque avec la solution de protéine, on agite l'ensemble pendant une période de 10 minutes à 24 heures, selon le pourcentage d'extraction désiré, et en fonction de la concentration de la protéine à extraire dans la solution, et de la concentration et de la nature en éléments contaminants. On lave le gel avec une solution de <EMI ID=7.1> concentration est supérieure à 0,1 % en pds/vol.et on récupère ainsi la protéine en solution. Selon un mode d'exécution en continu du procédé de l'invention, on prépare le gel d'alginate de calcium et on l'introduit de préférence dans une colonne à lit fixe ou à lit lit fluidisé et on fait passer la charge à une LHSV comprise entre 0,1 et 3. <EMI ID=8.1> tion est supérieure à 0,1 % en pds/volet on récupère ainsi la protéine en solution. Dans le cas de l'utilisation d'un gel de carraghénan pour éluer les protéines ainsi adsorbées sur ce gel, on peut utiliser une solution aqueuse de n'importe quel sel organique ou minéral hydrosoluble. Cependant, on préfère utiliser le KC1 ou le NH.C1 lorsque l'on a comme gel un carraghénate de K ou de NH. ou un mélange d'ions contenant le KC1 ou NH.C1 en quantités suffisantes. La concentration de la solution en gel utilisée pour éluer les protéines du gel de carraghénan n'est pas critique: elle dépend du sel utilisé, de la protéine et du pH de la solution. Ainsi, lorsque l'on utilise du KC1, on travaille à une concentration d'au moins 0,1 %. Le sel utilisé pour éluer la protéine du gel peut être, mais non nécessairement, le même que celui utilisé pour son absorption. Quand on utilise deux sels différents, il est évident qu'il faut qu'ils soient compatibles, c'est-à-dire qu'ils ne réagissent pas pour former eux-mêmes un précipité. Généralement, avant de recommencer une nouvelle élution, on lave le récipient et le gel de carraghénan avec une solution en sel dont la concentration est suffisante pour ne pas déstabiliser le gel. Le plus souvent, on utilise une solution de KC1 ayant une concentration égale à 0,1 % en pds/vol. Le procédé de la présente invention pour séparer et purifier les protéines, peut être réalisé en continu ou en discontinu. Selon un mode d'exécution en discontinu du procédé de la présente invention, on prépare le gel de carraghénate de potassium, on le verse dans un récipient quelconque qui contient la solution de protéine, on agite l'ensemble pendant une pério- de de 10 minutes à 24 heures, selon le pourcentage d'extraction désiré, et en fonction de la concentration de protéine à extraire dans la solution et. de la concentration et de la nature en élements contaminants. On lave le gel avec une solution de KC1 à une concentration au moins égale à 0,1 % en pds/vol,on élue alors le gel de carraghénan avec une solution de KCl dont la concentration est supérieure à 0,1 % en pds/vol. et on récupère ainsi la protéine en solution. Selon un mode d'exécution en continu du procédé de l'invention, on prépare le gel de carraghénate de K, et on l'introduit de préférence dans une colonne à lit fixe ou à lit fluidisé et on fait passer la charge à une LHSV comprise entre <EMI ID=9.1> concentration est supérieure à 0,1 % en pds/vol.et on récupère ainsi la protéine en solution. Les exemples suivants sont donnés afin de mieux illustrer le procédé de la présente invention, mais sans pour autant en limiter la portée. Exemple 1 On a préparé un gel d'alginate sous forme de fils, d'une longueur d'environ 5 cm et d'un diamètre d'environ 1 mm, comme plus petite dimension, par extrusion d'une solution aqueuse homogène contenant 30g/1 d'alginate sodique et 20g/1 d'oxyde <EMI ID=10.1> Par ailleurs, on a préparé du lactosérum doux non pasteurisé par coagulation lente de lait frais à 32[deg.]C en présence de 0,03 vol.% de présure de force 7000. Ce lactosérum est caractérisé par un pH de 6.6 à 20[deg.]C et des teneurs de 4 % en lactose, 0,35 % en lipides et 0,7 % en protéines (y compris 0,001 % en lactoperoxydase et 0,003 % en lactoferrine). Après addition de 200 g de gel d'alginate à 5 1 de lactosérum, on agite le mélange à 4[deg.]C pendant 18 h. Le gel est séparé par filtration sur tamis métallique puis lavé trois fois <EMI ID=11.1> On récupère les matières fixées par le gel par deux lavages du gel dans 1 1 d'une solution aqueuse à 50g/1 de CaCl2, sous agitation à 4[deg.]C pendant 2 h. Les 2 1 de solution ainsi obtenus contiennent environ 250 mg de protéines, dont 130 mg de lactoferrine et 20 mg de lactopéroxydase. Exemple 2 On a préparé une solution aqueuse contenant 30g/1 d'alginate. On a pulvérisé 3 litres de cette solution dans une <EMI ID=12.1> On a placé 200 ml de perles dans une colonne de 5 cm de diamètre pour former un lit de gel de 11 cm de hauteur. On a: traité 13 volumes de lait, soit 2,575 1 de lait entier contenant environ 5 % de lactose, 4 % de lipide, 0,9 % de sel et 3,3 % de protéines dont approximativement 0,008 % de lactoferrine et 0,003 % de lactopéroxydase. La LHSV à laquelle on a fait passer le lait sur la colonne de gel était de 1,5. Après passage du lait, on a transféré le gel dans <EMI ID=13.1> fois, le gel a été séparé par décantation et filtration sur filtre nylon. On a récupéré les protéines adsorbées sur le gel par deux lavages du gel dans 300 ml d'une solution aqueuse à 3 % en <EMI ID=14.1> Les 600 ml de solution ainsi obtenus contiennent environ 260 mg de protéines, dont 31 mg de lactopéroxydase et 125 mg de lactoferrine. Le rendemant de l'extraction était de 72
Claims (7)
- (1) l'on fait passer le milieu contenant la protéine recherchée sur des particules d'un polysaccharide acide gélifiable pris sous forme de gel, ces particules ne mesurant pas moins de 0,5 mm dans leur plus petite dimension, la teneur en polysaccharide acide dans le gel étant comprise entre 1 et 8 % en poids, ce gel étant utilisé à raison de 1 à 20 % en poids dans une solution dans laquelle il est insoluble et1) Procédé de purification de protéines du lait dont le pHisoélectrique est supérieur à 7,5, caractérisé en ce que
- (2) l'on récupère les protéines dans une solution de sel dont le taux en ions est supérieur à 0,05 % en pds/vol.
- 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce quel'on utilise un polysaccharide acide gélifiable choisi parmi les alginates et les carraghénans.<EMI ID=17.1>gélifie le polysaccharide acide gélifiable en le mettant en contact avec une solution comprenant des cations choisis parmi les cations de métaux alcalins, alcalino-terreux, ceux de la série du fer, et le cation ammonium.
- 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3,caractérisé en ce que l'on gélifie l'alginate avec une solu-<EMI ID=18.1>
- 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3,caractérisée en ce que l'on gélifie le carraghénan avec une solution de KC1, ou de NH4Cl ou de RbCl.
- 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,caractérisé en ce que l'on utilise un gel de polysaccharide.<EMI ID=19.1>7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,caractérisé en ce que l'on utilise un gel de polysaccharide acide pris sous forme de perles, de billes, de lamelles, de fibres, de fils ou de tissus.[ 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7,caractérisé en ce que l'on incorpore dans le gel de polysaccharide acide une quantité ne dépassant pas 3 % en poids, basée surle poids de gel, d'un oxyde de métal, insoluble dans les conditions d'utilisation.9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce quel'oxyde de métal est choisi dans le groupe comprenant les oxydes de titane, de zirconium, de silicium, d'aluminium, la sépiolithe, et autres analogues.10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9caractérisé en ce que l'on traite les protéines du lait choisies parmi notamment la lactoferrine, la lactopéroxydase, les immunoglobulines et autres analogues.11) Procédé de purification de protéines du lait selon l'unequelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on verse un gel d'alginate dans un récipient approprié contenant la solution de protéines, l'on agite l'ensemble pendant une période de 10 minutes à 24 heures, on lave le<EMI ID=20.1>avec une solution de CaCl2 et on récupère les protéines en solution.12) Procédé de purification de protéines du lait selon l'unequelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on verse un gel de carraghénan dans un récipient approprié contenant la solution de protéines, l'on agite l'ensemble pendant une période de 10 minutes à 24 heures, on lave le gel avec une solution de sel choisi parmi KC1, NH.C1 ou RbCl, on élue le gel de carraghénan avec une solution du même sel et on récupère les protéines en solution.13) Procédé de purification de protéines du lait selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on verse un gel d'alginate dans une colonne à lit fixe ou fluidisé, on fait passer la charge contenant les protéines sur le gel d'alginate à une LHSV comprise entre 0,1 et 3, on<EMI ID=21.1>protéines en solution.14) Procédé de purification de protéines selon l'une quelconquedes revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on verse un gel de carraghénan dans une colonne à lit fixe ou fluidisé, on fait passer la charge contenant la solution de protéines sur le gel de carraghénan à une LHSV comprise entre 0,1 et 3, on lave le gel avec une solution de sel choisi parmi KC1, NH4CL ou RbCl, on élue ensuite le gel de carraghénan avec une solution du même sel et on récupère les protéines en solution.15) Protéines du lait ayant un pH isolélectrique supérieur à
- 7,5 séparées et purifiées par le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications précédentes.
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