JPH07502401A - ヒトβ−カゼインを生成するヒトβ−カゼイン産生プロセスをコードする遺伝子および乳児用調合乳におけるその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトβ−カゼインを生成するヒトβ−カゼイン産生プロセスをコードする遺伝子 および乳児用調合孔におけるその用途本発明はヒト乳汁タンパク質のβ−カゼイ ンをコートするＤＮＡ配列に関する。さらに詳しく述へると、そのＤＮＡ配列は 、ＳＥＱ　ｉＤ　Ｎ（１：　２　（配列認識番号：２）て示されるアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコートしている。このＤＮＡ配列は、原核または真核の 産生系によって、またはより有利にウシ種のような遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅ ｎｉｃ）がなされた非ヒト咄乳動物に産生さ仕ることによって、組換えヒ［・β −カセインを製造するのに有利に利用される。組換えヒトβ−カゼインの主な用 途は、ヒト乳汁の代替物とし、て乳児に与えるのに用いる乳児用調合孔の成分と しての用途であり、組換えヒ１−β−カゼインが乳児用調合孔の成分どして用い られると、ヒト乳汁に一層近いものか得られるという点て調合孔の栄養上および 生物学上の価値が実質的に改善されると考えられる。

発明の背景 乳児にピ１〜乳汁を給食することは、調合孔を給食するより優れていることは公 知である。ヒト乳汁は、よくバランスのとれた栄養供給を与えるだけでなく、乳 児により容易に消化される。

したがって、乳児において生理学的機能を有することが分がっているいくつかの 生物学的に活性の成分は、ヒト乳汁の成分またはその消化中に生成する成分であ り、感染に列する防衛に関与する成分およびヒト乳汁からの栄養の摂取を容易に する成分が含まれている。

乳児用調合孔を製造することに多大の努力が注がれたにもかかわらず、ヒト乳汁 の有利な特性を十分にもっている乳児用調合孔を製造することは不可能であった 。したがって、乳児用調合孔は牛乳に基づいて製造されることが多いが、一般に 乳児によって不完全に消化され、乳児の生理学的機能に対して作用することか知 られている物質か欠除している。ヒト乳汁に類似の栄養価を有する乳児用調合孔 を得るために、ヒト乳汁を乳児が消化している間に通常生成するかまたは吸収さ れるタンパク賀フラグメント類、ビタミン類、無機物類などを含む多数の添加物 が乳児用調合孔に含有されているが、そのため、肝臓および腎臓のような重要な 臓器に対する負担の増大と長期間にわたるｔｉ傷を起こす危険かある。牛乳ベー スの乳児用調合孔の使用に付随する池の欠点は、ウシタンパク質に対するアレル ギーを乳児に誘発する危険が増大することである。

牛乳ベースの乳児用調合孔に代わるものとして、いわゆる母乳銀行から入手でき るヒト乳汁か使用されてきた。しかしながら、母乳銀行からのヒト乳汁で新生乳 児に給食することは、ヒト乳汁中にＨＩＶおよびＣＭＶのよ・うな感染因子が存 在していることに対する恐れのために近年避ける場合が増大してきている。ヒト 乳汁中の感染因子を破壊するために、使用前に乳汁を低温殺菌することが必要に なった。しかしながら、低温殺菌によって、乳汁成分の栄養価ど生物学的効果が 低下し、ヒト乳汁の使用はさらに減少している。

現在、母乳に代わって用いられている市販のヒト乳児用調合孔は、主として牛乳 のタンパク質成分に基−１さいている。これりの乳児用調合孔の組成物は、栄養 バランス、栄養の生物学的利用能およびヒト乳児の非ヒ１〜／′動物タンパク質 （コ、対する感受性の＜ｙか問題になってきている。特に、牛乳に対して〕し・ ルギ一体質の乳児の多く；ま大豆ベースの乳汁にもアレルギ一体質であるか、こ れらの乳児用調合孔に用いられる非ヒト動物タンパク質に対するアレ／ｌギー反 応により、市販調合孔のタンパク質成分を大豆タンパク質をベースにした調合孔 に変えさゼた〔アムアカト、才ブ　ベディアトリクス　コム、オン　ヌトリンヨ ン。

ベディアトリクス（Ａｍ、　Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｅｓ　Ｃｏｍ ｍ、　ｏｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）７２巻、３５９〜 ３６３頁、１９８３年〕。

加えで、生乳タンパク質を使用することによる多くの問題は、ウソカゼインの含 有量と構造のために消化が困難であることに付随している〔エル　ハンブレウス （Ｌ、　Ｈａｍｂｒａｅｕｓ）　、エル。

ニー。ハンソン（Ｌ、、Ａ、　Ｈａｎｓｃｎ）およびエイチ、マクファルラン（ ｌ（、ＭｃＦａｒｌａｎｅ）編集、アルムクイスト　アント　ライクセル社（Ａ ｌｍｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｗｉｋｓｅｌｌ）、１９７７年、“フード　アンド　 イムノロジー（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）−１１１６〜１２４ 頁、エル　ハンブレウス（Ｌ、　Ｈａｍｂｒａｅｕｓ）、イー、フォルサム（Ｅ 、　Ｆｏｒｓｕｍ）およびビー　ロンネルダル（Ｂ、　Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ）： ｌ。

上記のことから、乳漿タンパク質はヒト乳児によって一層容易に消化される〔エ ム　ジエイ、ニューボート（Ｍｌ、　Ｎｅｗｐｏｒｔ）およびエム　ジェイ、ハ ンシェル（Ｍ、Ｊ、　Ｈｅｎ５ｃｈｅｌ）　、ペディアトリク　レス、　（Ｐｅ ｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、）、１８巻、６５８−６６２頁、１９８４年〕ので、 乳漿タンパク質を大きな比率で含有し、かつウシカゼインをほとんど含有してい ないかもしくは全く含有していない乳児用調合孔が生産されるようになってきた 。しかしながら、牛乳の乳暗の主タンパク質はβ−ラクトグロブリンである。

このタンパク質はヒト乳汁には本来含有されておらず、乳児の牛乳アレルギーの 主な原因の一つであるとされている〔アイ。

アクセルソン（［、Ａｘｅｌｓｓｏｎ）、アイ、ジャコブソンｃ［、Ｊａｋｏｂ ｓｓｏｎ）、ティー、リンドバーグ（Ｔ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）およびビー、ベ ネディクソン（Ｂ、　ｂｅｎｅｄｉｋｔｓｓｏｎ）　、アクタ　ペディアトリ力 　ス力二ノド、　（Ａｃｔａ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｅａ　５ｃａｎｄ、）７５巻、 ７０２〜７０７頁、１９８６年〕。牛乳に基づいた調合孔に対するアレルギーに 関する問題の程度は、現在大豆ベースの調合孔が米国におけるヒト乳児用調合孔 の市場の大きな部分を占めていることから理解できる。

大豆タンパク質の調合孔は、炭水化物源およびタンパク質源が異なるが、ザ　ア メリカン　アカデミ−オブ　ペディアトリクス、コミッテイ　オン　ヌトリショ ン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ 、　ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）が勧告する乳児用調合孔 の栄養レベルにしたがっている牛乳タンパク質の調合孔に組成か類似している。

その相異点には、タンパク質のレベルかわずかに高いことと炭水化物の含量がわ ずかに低いことが含まれる。タンパク質源は一般に大豆タンパク質であり、脂肪 は植物油の混合物であり、および炭水化物源は、通常スクロース、コーンシロッ プの固体またはこれら両者の混合物である。

しかしながら、大豆調合孔を使用すると、ウシ由来タンパク質の乳児用調合孔を 使用したときに遭遇するアレルギーと消化率の問題を起こすのに加えて、乳児の 血清アルカリホスファターゼと血液尿素の濃度が上昇する傾向がある。

ヒト乳汁は、タンパク質の組成が異なるだけでなく、全タンパク質含量が低くか つカゼイン／乳漿の比率が低い点で、ウシを含む他の哺乳動物の種の乳汁と著し く異なっている。例えば、ヒト乳汁のカゼインサブクラスはβ−カゼインとに一 カゼインだけからなるが、一方つツカゼインのサブクラスはα−カゼイン、β− カゼインおよびに一カゼインである〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら〕。また、ヒト 乳汁タンパク質のアミノ酸配列は他の哺乳動物の乳汁タンパク質のそれと異なっ ている。

β−カゼインは、それが主要カゼインサブユニットであるヒトを含むいくつかの 種の乳汁中に存在するリン酸化タンパク質である。このタンパク質またはその消 化されたフラグメントは、カルシウムをそのリン酸化された残基にキレート化し てカルシウムを吸収可能な形態に保持することにより、カルシウムの吸収を促進 すると考えられている。ヒトβ−カゼインは新生乳児によって容易に消化され、 その消化生成物は、カルシウムの摂取およびそれによる骨格の鉱化（ｍｉｎｅｒ ａｌｉｚａｔｉｏｎ）に重要な役割を果たしていることが見出された。ヒトβ− カゼインの消化生成物（β−カッモルフイン）は、オピオイド活性を有すること が見出されており、母乳を与えられた乳児の睡眠パターンに関与するであろう。

ヒト乳汁に近い組成を育する乳児用調合孔を製造して牛乳ベースの乳児用調合孔 に付随する上記欠点を回避すること、例えばヒト乳汁タンパク質からなる調合孔 を製造することができることが望ましいであろう。しかしながら、これには、ヒ ト乳汁タンパク質を大量に入手できることが必要である。ヒト乳汁タンパク質は ヒト乳汁から直接精製することができるか、この方法は大規模な調合孔生産に必 要な大量を得るには現実的であり、十分に経済的な方法ではなく、ヒト乳汁タン パク質からなる乳児用調合孔を製造する前に池の方法が開発されなければならな い。

今までのところ、ヒト乳汁タンパク質の例えばアミノ酸配列に関する詳細な特性 決定はほとんどなされていない。グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）らは天 然のヒトβ−カゼインの単離と精製およびそのアミノ酸配列について報告した。

天然のヒトβ−カゼインの全組成は２１２個のアミノ酸であると述べられており 、かつ種々のリン酸化部位が配列中に同定された。

いくつかの乳汁タンパク質の遺伝子、主にげっ歯動物または搾乳動物由来の遺伝 子がクローン化されて配列が決定されているが〔以下の著者の論文参照。ボンシ ング（Ｂｏｎｓｉｎｇ）およびマツキンレイ（Ｍａｃｋｉｎｌａｙ＞　；　ホー ル（Ｈａｌｌ）ら、ブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）およびローイン（Ｒ ｏｓｅｎ）　：ジョーンズ（、Ｉ　ｏ　ｎ　ｅ　３　）ら：ヨシムラ（Ｙｏｓｈ ｉｍｕｒａ）ら、ヨシムラ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ）および才力（Ｏｋａ）、メノ ン（Ｍｅｎｏｎ）およびハム（Ｈａｍ）　；　ステワード（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら 、ブロヴオト（Ｐｒｏｖｏｔ）ら、デビノイ（Ｄｅｖｉｎｏｙ）ら；シエアラー （Ｓｃｈａｅｒｅｒ）ら〕、ヒト乳汁タンパク質をコードする遺伝子の知識は依 然として貧弱なものである。最近、メノン（Ｍｅｎｏｎ）とハム（Ｈａｍ）がヒ トβ−カゼインをコードする部分ｃＤＮＡクローンの単離と配列決定を開示した 。そのクローンは、該成熟タンパク質のアミノ酸残基１４６〜２１２に対応する コーディング配列と、全３゛非コーディング配列を含有していた。その推定され た部分のアミノ酸配列（ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉ ｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）は、グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）らが報告し た天然のタンパク質の配列と比較され、これら二つのアミノ酸配列の間にはいく つかのアミノ酸が異なることが見出された。しかしながら、メノン（Ｍｅｎｏｎ ）とハム（Ｈａｍ）は、ヒトβ−カゼインをコードする全ｃＤＮＡを単離するこ と及びヒトβ−カゼイン配列の実質的な部分（６７個より多いアミノ酸残基）か らなるポリペプチドを産生ずるのに有用なりＮＡ配列を提供することのいずれに も成功しなかった。このことは、本発明者らレナダールら（Ｌｔｌｎｎｅｒｄａ 　ｌら）によって初めて達成され、記載される。

発明の詳細な説明 本発明の目的は、組換えヒトβ−カゼインを、高い収率と現実的な価格で製造す る手段を提供することである。

したかって、一つの観点によれば、本発明は、ヒトβ−カゼインのカルシウム結 合活性（ｃａｌｃｉｕｍ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）またはオピオイ ド活性またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性 のいずれか二つもしくは三つの組合わせを存するアミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２またはその類似体もしくは変異体を存するポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列からなり、かつ該ＤＮＡ配列の発現を仲介することができる５′フランキ ング配列を含有する発現系に関する。

遺伝子導入細胞または遺伝子導入動物は、そのゲノム中に一つ以上の導入遺伝子 を含有する。導入遺伝子は、ゲノムの遺伝子座に組込まれたＤＮＡ配列であり、 その遺伝子導入ＤＮＡ配列は、そのゲノムのその遺伝子座には通常見られない。

導入遺伝子は、非相同ＤＮＡ配列（他の種のゲノムに通常見られる配列）または 相同ＤＮＡ配列（同じ種のゲノム由来の配列）で構成されている。遺伝子導入動 物はすでに報告されている。例えば米国特許第４．７３６．８６６号は、ｃ−ｍ ｙｃ癌遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを開示している。遺伝子導入動物の他 の報告としては、ＰＣＴ特許願公開第ＷＱ８２１０４４４３号（マウスの接合体 の前核に注射されたウサギβ−グロビン遺伝子ＤＮＡフラグメン））；ＥＰＯ特 許願公開第０２６４１６６号（Ｂ型肝炎表面抗原および乳房組織の特異的発現の ための乳漿の酸性タンパク質プロモーターの制御下にある組織プラスミノーゲン 活性化因子の遺伝子）：ＥＰ○特許願公開第０２４７４９４号（種々の形態のイ ンスリンをコートする非相同ＤＮＡを含有する遺伝子導入マウス）；ＰＣＴ特許 願公開第ＷＯ３８１００２３９号（乳漿タンパク質プロモーターの制御下にある ＩＸ因子をコードするＤＮＡの組織特異的発現）；ＰＣＴ特許願公開第ＷＯ３８ １０１６４８号（乳ラクトゲン誘発可能調節領域および非相同タンパク質をコー ドする構造領域からなる組換え発現系を組込んでいる乳分泌細胞を有する遺伝子 導入哺乳動物）、ＥＰＯ特許願公開第０２７９５８２号（遺伝子導入マウスにお けるラットβ−カゼインプロモーターの制御下にあるクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼの組織特異的発現）、およびＰＣＴ特許願公開第Ｗ０９ １１０８２１６号（ラン種と遺伝子導入法による組換えポリペプチド類の産生） がある。

本願で用いる場合、”組換えポリペプチド“　（またはこのポリペプチドをコー トする組換えＤＮＡ配列）は、“非相同ポリペプチド′である。非相同ポリペプ チドは、遺伝子導入動物か通常は産生しないポリペプチドである。非相同ポリペ プチドの例としては、ヒトβ−カゼインのようなヒト乳汁タンパク質が挙げられ る。

各々の非相同または相同ポリペプチドは、特定のアミノ酸と核酸の配列によって 特徴づけられる。しかしながら、上記の配列には、その天然に生成する対立変異 、および上記の核酸およびポリペプチドの配列か、組換えポリペプチドにおける 一つ以」−のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を起こさせるように、その核 酸中の−一つ以上のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失によって修飾 かなされる組換え法によって産生される変異体か含まれることが理解されるであ ろう。

本発明のＤＮＡ配列は、グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）らが開示しｔ＝ ヒトβ−カゼ・イン配列のアミノ酸残基１１７〜１３０に基づいて調製された特 異的な４２量体のオリゴヌクレオチドのプローブによるハイブリッド形成法を用 いて、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンに基づい て決定された。ヒトβ−カゼインｃＤＮＡ配列を単離するのに用いた手順は、後 記の実施例１に要約して示しである。

上記のストリンジェント（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリッド形成条件は、その 通常の意味で理解されるべきである。すなわち、そのハイブリッド形成は、後述 の実施例の”定義”の項で指定されている方法を用いて６７“Ｃにて２ＸＳＳＣ 中で行われ、かつ最終の洗浄か６７°Ｃにてｌ　Ｘ５ＳＣ中で行オ）れる。

“相同”という用語は、ここで用いる場合、得られたポリペプチドのアミノ酸配 列とＳＥＱ　１０　Ｎｏ＋　２に示されるアミノ酸配列との間の同一性の度合を 示す。ＳＥＱ　１０　Ｎｏ＋　２に示されるアミノ酸配列と比較されるアミノ酸 配列は、例えば、前記定義のハイブリッド形成法で得られるかまたは通常のアミ ノ酸配列決定法で得ることができるＤＮＡ配列から推定することができる。相同 度の決定は、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列について、すなわちリーダー配列 は全く考慮せずに行うのが好ましい。相同度は、ＳＥＱ　ｉＤ　ＮＯ：　２に示 されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％が好ましく、例えば少なくとも ９０％、好ましくは少なくとも９５％または９８％である。

“有効部分配列（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　５ｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）”という用語 は、本発明で用いる場合、上記定義のヒトβ−カゼインの活性について少なくと も部分的に機能するペプチドをコードする部分配列を意味する２１部分配列は、 ＤＮＡ配列のとちらか一方の端における切断、またはＤＮＡ配列内の一つ以上の ヌクレオチドまたはヌクし・オチド配列の除去によって生成する。有効部分配列 は、ヒ）・β−カゼインのすビオイド活性またはへＣＧ阻害活性を有するペブヂ １：をコードする場合、好ましくは、少なくともＸ５個のヌクレオチド例えば少 なくとも２０個のヌクレオチドを含有している。

“カルシウム結合活性”という用語は、本発明のポリペプチドのカルシウムを結 合する能力を意味し、この活性は平衡透析法または類似の方法て測定することか できる。この用語は、問題のポリペプチドかヒトβ−カゼインと同じかまたは実 質的に同じ機序でカルシウムを結合することができるという意味て理解されるへ きであるが、この用語は、とりわけカルシウム結合能力かリン酸化度に依存し、 そのリン酸化度が、そのポリペプチドにおいて、組換えポリペプチドが産生され る種によってかなり異なることを考慮して、その結合性か定量的に同しであるこ とを必ずしも意味しない。“オピオイド活性“という用語は、ペプチドのすビエ ート様作用と、そのペプチドのすピエート受容体と結合する能力（オピエート受 容体親和性）を意味する。

この“オピオイド活性”は、プラントル（Ｂｒａｎｔｌ）　（１９８４年）およ びミグリオリーサモー（Ｍｉｇｌ　ｉｏｒｉ−Ｓａｍｏｕｒ）らか開示したよう にして測定される。“ＡＣＥ阻害活性”という用語は、ペプチドかアンギオテン ノン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害する能力を意味し、心臓障害を治療するのに重要 な指標である。ＡＣＥ阻害作用は、マルヤ７　（Ｍａｒｕｙａｍａ）らおよびコ ームラ（Ｋｏｈｍｕｒａ）らが開示した方法を用いて測定される。

上記の仁について、″カルシウム結合活性２、“オピオイド活性”および“ＡＣ Ｅ阻害活性”の用語ならびに関連する用語は、まず第一にカルシウム結合活性の 性質のような活性の性質に関連し、および／またはヒトβ−カゼインについて測 定されるポリペプチドの活性のレベルに関連する、定性的および／または定量的 用語であると理解されるべきであることに留意されなけれはならない。ＡＣＥ阻 害作用またはオピオイド作用について、これらもまた、各々ＡＣＥ阻害活性また はオピオイド活性を有するヒトβ−カゼインの消化フラグメントについての文献 に記載されているのと同し定性的性質を有する。

上記の点について、“消化フラグメント”という用語は、母乳を与えられた乳児 がヒトβ−カゼインを消化する間に実際に生成するペプチドのフラグメントを意 味する。このようなフラグメントは、例えば、組換えヒトβ−カゼインの開裂、 このようなフラグメントをコードするＤＮＡ配列からの発現または従来のペプチ ド合成法の使用によって製造することができる。

他の観点によれば、本発明は、本発明のＤＮＡ配列によって産生されるポリペプ チド、好ましくは、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性を有するＳＥＱ　［ Ｄ　ＮＯ：　２に示されるアミノ酸配列またはその類似体もしくは変異体：また はヒトβ−カゼインの消化フラグメントのＡＣＥ阻害活性もしくはオピオイド活 性を存するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示されるアミノ酸配列の部分配列または その類似体もしくは変異体を育する組換えヒトβ−カゼインタンパク質に関する 。上記の変異体と部分配列については、さらに以下に定義される。

さらなる観点によれば、本発明は、本願で定義されるポリペプチドをコードする ＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列を保持しかつ発現できる複製可能な発現ベクター、 このようなベクターを保有する細胞、本発明のポリペプチドの製造方法、本発明 のポリペプチドを発現できる遺伝子導入非ヒト動物の作製方法、このような遺伝 子導入動物自体、このような遺伝子導入動物からの乳汁、本願で定義されるポリ ペプチドを含有する乳児用調合乳、本願で定義されるポリペプチドの単離方法、 およびその適正なポリペプチドに関する。

本発明の詳細な説明 本発明の発現系は、哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子由来の５゛−フランキング 配列、およびヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性また はアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれら活性の二つもしく は三つの組合わせを有するアミノ酸配列ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　２またはその類 似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコートするＤＮＡ配列を含有し、そ の５°　フランキング配列が上記ポリペプチドの発現を仲介することができる発 現系である。

以下に詳細に論じられるように、本発明の発現系は、多くの用途に用いられ、好 ましくは、そのＤＮＡ配列が少なくとも一つのイントロン配列を含有し、かつ好 ましくは少なくとも一つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有する発現系であ る。

好ましい実施態様において、本発明の発現系は、上記ＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動 物の乳汁タンパク質遺伝子に挿入して非ヒト哺乳動物の成熟雌の乳腺内で発現可 能なハイブリッド遺伝子を生成させ、その結果、該ハイブリッド遺伝子が発現さ れると、該ＤＮＡ配列がコードするポリペプチドが産生される発現系である。− 例として、その乳汁タンパク質遺伝子は、乳漿の酸性タンパク質（ＷＡＰ）の遺 伝子から選択されるものが挙げられる。

上記のように、本発明の発現系は、コードされるポリペブチＩ・の類似体または 変異体がアミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２と少なくとも８５％相同である のが好ましい。ＤＮＡ配列ＳＥＱ　［ＯＮＯ：　２に近い構造上の類縁物を発現 する他の方法としては、ハイブリッド形成法かある。本発明の発現系は、好まし くは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ストリンジェントハイブリッド 形成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１またはその一部とハイブリッ ドを形成する発現系である。

本発明の特に興味深い発現は、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　２のアミノ酸配列１６− ２２５に相当する図１に示されるアミノ酸配列１〜２１０を含有するかまたは実 質的にそのアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする発現系である。

図１に示されるｃＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）テールを含めて全長がｌ０６５ｂｐ である。その開放した読取り枠は、５′末端における第一ヌクレオチド“Ａ“か ら始まり、１５個のアミノ酸のシグナルペプチドおよび２１０個のアミノ酸残基 からなる成熟カゼインをコードしている。ヒトβ−カゼインのコーディングｃＤ ＮＡは、その３゛末端に一つの３９０ｂｐ非コーデイング領域が隣接し、５′末 端には一つの４８ｂｐが隣接している。図１に示されるヒトβ−カゼインｃＤＮ Ａの大きさは、ヒツジのβ−カゼイン〔ブロヴオト（Ｐｒｏｖｏｔ）らの文献〕 の大きさに似ている。

図１に示されるヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、グリーンハー グ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）らが報告したものと比へていくらか相違している。す なわち、その推定されたアミノ酸配列は２１０個のアミノ酸残基で構成され、グ リーンハーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）らが報告した２１２個のアミノ酸配列の１ ９位と２０７位のアミノ酸に対するフトンがないことが分かる。その池の相違は 、１５位（Ｐｒｏの代わりにＴｈｒ）、３２位（Ｔｈｒの代わりにＧｌｙ）、３ ４位（Ｇｉｎの代わりにＧｌｕ）、１０４位（Ｇｉｎの代わりに５ｅｔ）、１３ ３位（Ｓｅｔの代わりにＬｅｕ）、１５８位（ＧｌｕＯ代わりにＧｌｎ）、１６ ７位（Ｇｌｕの代わりにＧｉｎ）、１６９位（Ｌｅｕの代わりにＶａｌ）、１７ ３位（ＶａｌＯ代わりにＧｌｎ）、１９２位（Ｐｒｏの代わりにＴｈｒ）、１９ ８位（Ｐｒｏの代わりにＴｈｒ）、１９９位（Ｇｌｕの代わりにＧｉｎ）、およ び２０１〜２０６位（Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｘ−Ａｌａ−Ａｓｚ−Ｈｉ ｓの代わりにＬｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ）に見られる。

４５〜６２％の比較的大きい相同度か、ヒトβ−カゼインと他の種由来の相当す るタンパク質との間でみられる。さらに、ヒトβ−カゼインの１５個の残基のシ グナルペプチドは、ウノ、ヒツジおよびウサギのβ−カゼインのそれと同一であ り、１個の残基を除いてラットとマウスのβ−カゼインのそれと同一である。

異なる起源のβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列を比較したところ、種の間で 、通常ゆらぎ位置におこり、従って同じアミノ酸をコードする単一の塩基の置換 が見出された。

共通ポリアデニル化（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ） 認識シグナルＡＡＵＡＡＡは、ポリ（Ａ）テールから１６個のヌクレオチド上流 に位置している。また、そのｍＲＮＡの安定化に関与しているかもしれない１１ 個のヌクレオチド長のモチーフ（ｂｐ　８２３−８３３　；ＴＴＴＡＴＴＴＡＴ ＴＴ）も見出されており、他の起源のβ−カゼイン遺伝子について見出された配 列と一致している〔ブロヴオト（Ｐｒｏｖａｔ）ら〕。

ヒトβ−カセインボリペブチトに翻訳可能な興味深いＤＮＡ配列は、ヒトβ−カ ゼイン遺伝子を含有する配列である。したかって、別のさらなる観点において本 発明は、ヒトβ−カゼイン遺伝子またはその有効部分配列を含有するＤＮＡ配列 に関する。

本発明のこの観点は、とりわけ、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性または オピオイド活性またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれ らの活性のいずれか二つもしくは三つの組合わせを有するアミノ酸配列ＳＥＱ　 ［Ｄ　ＮＯ：　２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドをコー ドし、少なくとも一つのイントロン配列を含有し、好ましくは少なくとも一つの 許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有するＤＮＡ配列に関する。

好ましい実施懸様において、そのＤＮＡ配列は、実質的にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： １に示されるＤＮＡ配列で構成されている。また、そのＤＮＡ配列は、少なくと も一つのヌクレオチドが欠失、置換もしくは修飾されているか、または少なくと も一つの付加ヌクレオチドが挿入されて、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活 性に比較して類似しているか、増大しているがもしくは減少しているカルシウム 結合活性を存するポリペプチド、ＡＣＥ阻害活性を有するポリペプチドまたはオ ピオイ１ｓ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列になっている点て 、上記定義のＤＮＡ配列と異なる修飾ＤＮＡ配列であってもよい。

本願明細書において用いられる“遺伝子”という用語は、ポリペプチド鎖の産生 に関与し、がっコーディング領域に先行しおよび続く領域（５′上流配列と３′ 下流の配列）、ならびに個々のコーディングセグメントであるエキソンの間また はその５゛上流もしくは３゛下流領域に配置された介在配列であるイントロンを 含有するＤＮＡ配列を示す。その５°上流領域は、遺伝子の発現を制御する調節 配列、一般的にプロモーターを含有している。

３゛下流領域は、遺伝子の転写の終止に関与する配列と、任意に、転写物のポリ アデニル化に関与する配列及び３゛非翻訳領域とを含有している。

上述の調節配列または発現調節配列は、転写を制御するのに加えて、少なくとも ＲＮＡも転写される程度にＲＮＡの安定性とプロセンシングに寄与している。

このような発現調節配列は、組換えＤＮＡの組織特異的発現または細胞型特異的 発現を行うように選択される。一度組織または細胞型が発現を行わせるために選 択されると、５°及び任意の３″の発現調節配列が選択される。一般に、このよ うな発現調節配列は、選択された組織または細胞型内で主に発現される遺伝子由 来のものである。他の組織および／または細胞型内での二次の発現は、このよう な組織または細胞型内の導入遺伝子の組換えＤＮＡの発現が遺伝子導入動物に対 して有害でないならば許容されるけれども、これらの発現調節配列が得られる遺 伝子は、実質的に、選択された組織もしくは細胞型内でしか発現されないのか好 ましい。特に好ましい発現調節配列は、操作される動物の種に対して内因性の配 列である。しかしながら、ヒト遺伝子由来のもののような他の種由来の発現調節 配列も使用することかできる。場合によっては、発現調節配列と構造ＤＮＡ配列 （ゲノムまたはｃＤＮＡのどちらが一方）は、例えば各々ウシの種またはヒトの 源由来のような同じ種由来のものである。このような場合、発現調節配列とＤＮ Ａ配列は互いに相同である。また、発現調節配列とＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたは ゲノムのどちらか一方）は、例えばウシ種由来の発現調節配列およびヒトの源由 来のＤＮＡ配列のよ・うな異なる種から得ることができる。このような場合、発 現調節とＤＮＡ配列は互いに非相同である。内因性遺伝子由来の発現調節配列を 以下のように定義する。このような定義は、非内因性の非相同遺伝子由来の発現 調節配列にも適用することができる。

一般に、５″発現調節配列は、翻訳開始配列の上流の内因性遺伝子の転写される 部分（５゛非翻訳領域または５’ＵＴＲ）、およびこの部分の上流に位置する機 能性プロモーターを含有するそれらのフランキング配列を含有している。本願で 用いられる場合、“機能性プロモーター”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼを 内因性遺伝子に結合させて転写を促進するのに必要な非転写ＤＮＡ配列を含んで いる。典型的に、このような配列は、転写開始部位から一般に約２５〜３０個の ヌクレオチドの位置に位置しているＴＡＴＡ配列すなわちＴＡＴＡボックスをも っている。このＴＡＴＡホックスは、時には近位シグナルと称されることもある 。多くの場合、プロモーターはさらに、近位シグナル（、ＴＡＴＡホックス）か ら上流に位置する、転写を開始するのに必要な一つ以上の遠位シグナルをもって いる。このようなプロモーター配列は、一般に転写開始部位の上流に位置してい る最初の１００〜２００個のヌクレオチドの中に含まれているが、転写開始部位 から５００〜６００個以上のヌクレオチドまで延びていてもよい。このような配 列は、当該技術分野の当業者にとって容易に分かることであるか、または標準の 方法によって容易に同定することができる。このようなプロモーター配列は、単 独または５′非翻訳領域と組合せて、本願では“近位５′発現調節配列”と称す 。

このような近位５゛発現調節配列に加えて、追加の５″フランキング配列（本願 ては“遠位５゛発現調節配列“と呼称する）も該導入遺伝子に含めることが好ま しい。このような遠位５゛発現調節配列は、内因性遺伝子の発現を容易にし、そ の結果として遠位および近位の５″発現調節配列に作動可能に連結されている構 ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を発現しやすくする一つ以上のエンハンサ−および／または 他の配列を含有していると考えられる。これらの５″発現調節配列は、遺伝子発 現の空間分布もしくは時間分布を制御する。遠位５゛発現調節配列の量は、その 発現調節配列が由来される内因性遺伝子によってきまる。しかしながら、一般に 、このような配列は、約１ｋｂの５°フランキング領域を含有し、より好ましく は＋６ｋｂ、および最も好ましくは約３０ｋｂの５″フランキング配列をもって いる。特定の内因性遺伝子由来の使用される遠位５′発現調節配列の最適量は、 最大の発現が得られるように遠位５゛発現調節配列の量を変えることによって容 易に決定される。一般に、遠位５°発現調節配列は、隣接遺伝子にまて延びるほ とに大きくはなく、かつ導入遺伝子の発現のレベルに対して不利に影響するＤＮ Ａ配列を含有していない。

加えて、３″発現調節配列も組織または細胞型特異的発現を補充するために含有 させるのが好ましい。このような３″発現調節配列は、適当な内因性遺伝子由来 の３″近位および３°遠位の発現調節配列を含有している。その３″近位発現調 節配列は、組換えＤＮＡ配列中の翻訳停止シグナルから下流に位置する転写され るか翻訳されないＤＮＡ（３’非翻訳領域または３’ＵＴＲとも称される）を含 有している。このような配列は、一般に、ポリアデニル化配列（内因性遺伝子ま たはＳＶ４０のような他の起源由来）およびＲＮＡの安定性に影響する配列で終 結する。一般に、３’　Ｕ　Ｔ　Ｒは、３″調節配列が由来される遺伝子の翻訳 停止シグナルから下流に約１００〜１０００個以上のヌクレオチドを含有してぃ る。遠位３゛発現調節配列は、近位３゛発現調節配列から下流のフランキングＤ ＮＡ配列を含有している。これらの遠位配列のいくつかは転写されるが、ｍＲＮ Ａの部分を形成せず、一方この３゛遠位発現調節配列中の他の配列は全く転写さ れない。このような遠位３′発現調節配列は、発現を増大するエンハンサ−およ び／または他の配列を含有していると考えられる。このような配列は、有効なポ リアデニル化を行うために必要であり、かつ転写終止配列を含有していると考え られる。このような配列は、好ましくは約２　ｋｂ、より好ましくは８ｋｂおよ び最も好ましくは約＋５ｋｂの３゛フランキング配を含有している。

５°と３゛の両方の発現調節配列を使用することが好ましいが、本発明のいくつ かの実施態様では、内因性３°調節配列を用いない。このような場合、組換えＤ ＮＡ配列によってコードされているゲノムＤＮＡと通常結合している３゛近位発 現調節配列は、ポリアデニル化を指示するために使用される。さらに、組換えポ リペプチドをコードするゲノムＤＮＡ由来の遠位３′調節配列も、内因性３゛発 現調節配列について述べたのと同じ量で用いられるのが好ましい。このような場 合、導入遺伝子によってコードされる組換えポリペプチドは、ゲノムＤＮＡまた はｃ　ＤＮＡ由来の二本ｆｔ１ｉＤＮＡで構成されていてもよいと理解されるべ きである。５゛発現調節配列の場合と同様に、３゛発現調節配列の最適量は、組 換えポリペプチドの最大の発現が得られるように３゛フランキング配列の量を変 えることによって容易に決定することができる。一般に、遠位３′調節配列は、 内因性遺伝子または非相同遺伝子由来であるが、それが由来される隣接遺伝子に までは延びず、かつ導入遺伝子の発現レベルに不利に影響するいずれの配列も除 外するであろう。

本発明の導入遺伝子は、５′と３゛の発現調節配列及び組換えＤＮＡ（ゲノムの またはｃＤＮＡ由来の組換えＤＮＡ）に加えて、導入遺伝子の転写領域を分断す るイントロン配列も含有しているのが好ましい。しかしながら、組換え介在配列 は、“ハイブリッド介在配列”を含有していてもよい。このようなハイブリッド 介在配列は、異なる源由来の介在配列由来の５’ＲＮＡスブライスノグナル及び ３’ＲＮＡスプライスシグナルを含有している。

許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有するこのようなハイブリッド介在配列は、 組換えＤＮＡがｃＤＮＡ配列に相当する場合に用いられるのが好ましい。

しかしながら、このようなハイブリッド介在配列は、ｃＤＮＡ配列を利用する導 入遺伝子に限定されない。むしろハイブリッド介在配列は、組換えポリペプチド がゲノム配列によってコードされるときにも有用である。ｃＤＮＡ組換えＤＮＡ によって得られた結果およびゲノムＤＮＡ配列はｃＤＮＡ由来の配列より高いレ ベルで発現するという一般的な予想に基づいて、ゲノム組換えＤＮＡとともに用 いられるこのようなハイブリッド介在配列は、ゲノム配列だけで得られる発現レ ベルより一層発現レベルを増大させると予想される。

上記のことに基づいて、好ましい導入遺伝子が多量の５°と３゛の発現調節配列 を含有していることは明らかである。さらに、組換えＤＮＡは、長さが数百キロ ベースにもなるゲノムクローンから由来されるのが好ましい。ＤＮＡをクローン 化して操作する現行の技術では、導入遺伝子の構築と微量注射は実際には長さか 約５０ｋｂより長くない線状ＤＮＡに限定される。しかしながら、本発明の導入 遺伝子、特に約５０ｋｂより長い導入遺伝子は、所望の導入遺伝子の二つ以上の オーバーラツプフラグメントを胎児性標的細胞に導入することによって容易に生 成させることかできる。オーバーラツプフラグメントは、このように導入される と、相同的組換えを受けて、充分に再構成された導入遺伝子か標的細胞のゲノム に組込まれる。一般に、このようなオーバーラツプ導入遺伝子のフラグメントは 、オーバーラツプする領域に１００％相同であるのが好ましい。しかしながら、 低い配列相同性でも、有効な相同的組換えが起こるならば許容される。

非相同性が相同配列部分の間に存在する場合には、その非相同性は相同配列の部 分全体に広がらずに離れた領域に位置しているのが好ましい。鴫乳動物細胞内で 相同的組換えを行うには１４個はとの少数の塩基対が１００％相同性であれば充 分であるが〔ルブニツ、ジエイ、　（Ｒｕｂｎｉｔｚ、　Ｊ、）およびスブラマ ニ、ニス。

（Ｓｕｂｒａｍａｎ　ｉ、　ｓ、　）、モル　セル、パイオル、（Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）４巻、２２５３〜２２５８頁、１９８４年〕、より長い 相同配列部分か好ましく、例えば各相同配列部分について５ｏｏｂｐであり、よ り好ましくは＋０００ｂｐて、さらに好ましくは２ｏｏｏｂｐてあり、最も好ま しくは２０００ｂｐより大きい。

最終目的が組換えポリペプチドを分泌することである場合は、機能分泌シグナル ペブチトをコードする“分泌ＤＮＡ配列”も、遺伝子導入動物の一つ以上の細胞 型から組換えポリペプチドを分泌させるために、導入遺伝子内に作動可能に連結 される。分泌ＤＮＡ配列は、一般に同し種の遺伝子導入動物の分泌タンパク質を コードする遺伝子から由来される。

本発明の導入遺伝子が、ゲノムＤＮＡ由来かまたはゲノムＤＮＡに相当する組換 えＤＮＡがコードする組換えポリペプチド（またはこのようなゲノム配列て実質 的に構成されている組換えＤＮＡがコードする組換えポリペプチド、例えば該組 換えポリペプチドをコードするコドンの約５０％より多く、より好ましくは７５ ％より多く、最も好ましくは９０％より多くがゲノム配列由来のもの）をコード する場合には、ウシ遺伝子導入牛乳のモル濃度とタンパク質しベルはｃＤＮＡの 場合と同しか高い。一般に、このような遺伝子導入乳汁中の組換えポリペプチド のモル濃度は、好ましくは約５０μＭより大で、より好ましくは約１５０μＭよ り大てあり、最も好ましくは約５００μＭより大である。

遺伝子導入乳汁のタンパク質のレベルからみて、そのレベルは好ましくは約１■ ／　ｍｌより大で、より好ましくは約２．５■／　ｍｌてあり、最も好ましくは ５■／艷より大である。

ウシ遺伝子導入乳汁中の上記モル濃度とタンパク質のレベルは、特定の組換えポ リペプチドの分子量によって変化する。ウシ遺伝子導入ミルク内に組換えポリペ プチドを産生ずる場合の特別の利点は、原核発現系のような他の系では大量に産 生させることか困難な比較的大きな分子量のポリペプチドを産生させることがで きるということである。

しかしながら、マウスは通常乳汁１ｄ当り５５〜８０■のタンパク質を産生ずる 。一方、ウソは通常ＩＪ当り３０〜３４■のタンパク質を産生ずる。組換えポリ ペプチドの産生が例外的に高いレベルになると、内因性乳汁タンパク質の産生に 不利に影響する場合があり、かっ／′または乳汁分泌線に不利な影響を与える場 合かあるので、組換えポリペプチドの濃度は、通常の牛乳タンパク質濃度の約３ 〜５０％（すなわち遺伝子導入乳汁の１−当り組換えポリペプチドか約１〜１７ ■）か好ましく、牛乳中に産生されるタンパク質の通常の量の１０〜２０％（す なわち１ｍｌ当り３〜約７■）がより好ましく、１０〜１５％（すなわち１ｍｌ 当り３〜５■）が最も好ましい。また、このような好ましい範囲は、遺伝子導入 牛乳中に産生されるタンパク質の上記し・ベルに対する好ましい最高限度を示す 。

遺伝子の“有効部分配列′という用語は、ＤＮＡ配列について先に定義したのと 同様に理解されるべきである。

ハイブリッド形成は、後述の実施例の“定義”の項に記載されているように、後 記のＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１に示されるＤＮＡ配列のコーディング部分を含有 するプローブに基づいて実施されるのか好ましい。”相同”および“有効部分配 列”という用語は、先に定義したのと同様にして用いられる。

ＤＮＡ配列の類似体によってコートされるポリペプチドは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ：　２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％相同で、例えば少なくとも９ ５％相同またはさらに９８％相同であるのが好ましい。

β−カゼインの遺伝子は、後述の実施例ＩＣに記載の方法を用いて単離し配列を 決定した。実施例ＩＢではヒトβ−カゼイン遺伝子の異なる遺伝的変異体を考察 する。

本発明のＤＮＡ配列の特定の類似体の例は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に示され るＤＮＡ配列を含有し、特にイー・コリＣＥ、　ｃｏｌｉ）内での発現に適応す るＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列はイー・コリ中に適切な調節配列とともに 挿入されると、ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：　２に示されるアミノ酸配列を存するポリ ペプチドを発現するようになるＤＮＡ配列である。したがって、このＤＮＡ配列 は、イー・コリによって認識される特異的なコドンを含有している。

このＤＮＡの製造は実施例２に記載されている。

上述のように、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌに示されるＤＮＡ配列は、ヒトβ−カ ゼインの単位機能ドメイン／複数機能ドメインと、これに天然に付随しているシ グナルペプチドとからなるポリペプチドをコードしている。はとんどの場合にお いてシグナルペプチドか存在することは、ＤＮＡ配列から発現されたポリペプチ ドを、そのポリペプチドが産生される細胞から移送させるのに欠くことはてきな いが、使用される特定のシグナルペプチドの種類と源（ｓｏｕｒｃｅ）は変える ことができ、ヒトβ−カゼインに天然に付随するシグナルペプチドである必要は ない。

したかって、本発明の特に興味深いＤＮＡ配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＩにおけ るアミノ酸１６−２３５に相当する図１に示されるアミノ酸１−２１０　、すな わち成熟ヒトβ−カゼイン（三相光するアミノ酸からなるポリペプチドをコード するＤＮＡ配列である。

ヒトβ−カゼインはＮ末端に近いセリンとトレ才二：）の残基か高度にリン酸化 されており、β・〜カゼインのこのリソ酸化された部分は、その分子に、カルシ ウムを結合してミセル形成に関与する能力を与えると考えられる。したかって、 その分子のＮ末端部分はβ−カゼインの生物活性に関連して非常に重要である。

したか−って、本発明のＤ　Ｎ　Ａ配列の重要な部分配列は、図１に示されるア ミノ酸配列の最初の部分、特にアミノ酸１〜１２からなる部分を少なくともコー ドするＤＮＡ配列である。しかしなから、その分子の＋＋ｈの部分も、ヒトβ− カゼイ：ノのカルシウム結合活性と関連して重要である。

図１に示されるヌクレオチドと推定されたアミノ酸配列のさらに興味深い部分配 列について以下に考察する。Ａ　ＣＥ阻害活性を有すると予想されるヘプタペプ チド（ＶＰＹＰＱＲＡ）をコードするヌクレオチド配列は、図１に示されるアミ ノ酸配列のアミノ酸残基１６７〜＋７３に見られる。その予想されるＡＣＥ阻害 活性は、このような活性を有しかつ上記で挙げられた７個のアミノ酸残基のなか の６個を含有する類似のβ−かゼインペプチドがＡＣＥ阻害活性をもっているこ とが見出されたことに基づいている（マルヤマら）。これに関連して、図１に示 されるアミノ酸配列の１６８〜１７２位に相当するペンタペプチドもＡＣＥ阻害 活性を有すると考えられるが、ペンタペプチドは本来、上記へブタペプチドの分 解生成物と考えられる。また、図１に示される配列のアミノ酸３９−５２の部分 で構成されているペプチド、好ましくはへブタペプチド、ヘキサペプチドまたは へブタペプチドは、ＡＣＥ阻害活性を存すると考えられる。この予想は、ヒトβ −カゼインの先に引用した領域に見出されたペプチドと類似のアミノ酸配列を有 する合成ペプチドの、Ａ、　ＣＥ阻害活性を分析した結果に基づいている（Ｋｏ ｈｍｕｒａ　（コームラ）ら〕。

オピオイド活性および免疫刺激活性を存するペプチドは、プラントル（［３ｒａ ｎｔｌ）の開示に基づいて決定することかできる。

さらなるｖ１屯によれば、本発明は、少なくとも一つのヌクレオチドが欠失、置 換もしくは修飾されるか、または少なくとも一つの追加のヌクレオチドか挿入さ れて、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性に比へて類似しているか、増大し ているかもしくは減少しているカルシウム結合活性を存するポリペプチドをコー トするＤ　Ｎ　Ａ配列になっている点で、上記定義の本発明のＤＮＡ配列とは異 なる修飾ＤＮＡ配列に関する。他の興味深い修飾によって、オピオイド活性また はＡＣＥ阻害活性を有するペプチドか得られる。

その修飾ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは、通常、ヒトβ−カゼ インのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をもっている。本発明の修飾ＤＮＡ 配列は、ヒトβ−カゼインもしくはその消化フラグメントと比べて改善された活 性また；」他の同様に重要な活性を存する新規なポリペプチドを製造するのに重 要であると理解されるであろう。

“置換“が行われると、全ヌクレオチド配列中の一つ以上のヌクレオチドが一つ 以上の異なるヌクレオチドで置換され、“付加“が行われると、一つ以上のヌク レオチドが全ヌクレオチド配列のいずれかの末端に付加され、“挿入”が行われ ると全ヌクレオチド配列内に一つ以上のヌクレオチドが挿入され、および”欠失 “が行われると、一つ以上のヌクレオチドが配列のいずれかの末端または該配列 内の適切な位置にかかわらず、全ヌクレオチド配列から欠失される。

修飾ＤＮＡ配列は、公知の方法、例えばこの技術分野の教科書に記載されている ような部位特異的突然変異誘発法を用いて得ることができる。

本発明の重要な修飾ＤＮＡ配列の例は、セリンもしくはトレオニンの残基をコー ドする付加コドンが挿入されて、リン酸化できる残基の数か増大しているポリペ プチドをコードする修飾ＤＮＡ配列になっているＤＮＡ配列である。付加残基は 、いずれかの末端に付加されるかもしくは本発明のＤＮＡ配列内に付加されるか 、または本発明のＤＮＡ配列内に存在する一つ以上の非セレンもしくは非トレオ ニンのコドンを置換することによって挿入することができる。このような修飾Ｄ ＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは、リン酸化度が高いので、天然の ヒトβ−カゼインに比べてカルシウム結合活性が増大していると考えられる。こ のような修飾ＤＮＡから産生されるポリペプチドは、カルシウム摂取量を増大す る必要がある固体群、例えば未熟児、女性および老人に対する栄養補充物として 使用することができる。

同様に、カルシウム摂取量を低下させることが重要な場合には、そのポリペプチ ドよりもリン酸化されうる残基の数が少ないポリペプチドをコードする本発明の 修飾ＤＮＡ配列（そのアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に示される）が 重要である。この場合に、一つの方法として、セリンもしくはトレオニンの残基 に対する一つ以上のコドンを除くか、または、二のようなコドンの一つ以上を非 セリンもしくは非トレオニンの残基で置換する方法がある。

興味深い修飾ＤＮＡ配列の他の例は、グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　） らによって開示され、先に考察した変異体のような、ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　２ に示されるものとは異なるアミノ酸配列を有する天然に産生ずるヒトβ−カゼイ ンの類似体もしくは変異体、または実施例ＩＢで考察されるような他の遺伝変異 体のアミノ酸配列をコートするＤＮＡ配列である。この目的のために、関連する アミノ酸残基を交換／除去する特定のオリゴヌクレオチドのプローブを用いて部 位特異的突然変異誘発が行われるであろう。

上記定義の本発明のＤＮＡ配列の別の重要な用途は、一方ではＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ ｏ・２に示されるアミノ酸配列、または上記定義のその類似体もしくは部分配列 を含有するポリペプチド、他方では他の乳汁タンパク質のポリペプチドまたはペ プチドの部分のような別の起源のポリペプチド、例えばα−ラクトアルブミンの ようなヒト乳汁タンパク質またはウシβ−カゼインのごときウシもしくはヒツジ の乳汁タンパク質のような非ヒト乳汁タンパク質を含有する融合タンパク質を製 造する場合の用途である。

この融合タンパク質は、本発明のＤＮＡ配列を、融合タンパク質の発現を起こさ せる方法で、融合タンパク質の池の部分をコードするＤＮＡ配列および適正な調 節配列と融合させることによって製造することかてきる。

本願で説明される本発明のＤＮＡ配列は、天然のＤＮＡ配列と合成のＤＮＡ配列 で構成され、その天然の配列は、一般に例えば以下て述へられるような通常哺乳 動物起源のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡから直接由来される。合成的に配列は 、合成でＤＮＡ分子を製造する通常の方法により、例えば固相または液相のペプ チド合成法の原理を用いて製造することができる。

勿論、そのＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡとゲノム起源の混合したもの、ｃＤＮＡと合 成起源の混合したもの、およびゲノムと合成起源の混合したものであってもよい 。

本発明の配列類、部分配列類、類似体類およびポリペプチド類について本願で用 いられる“配列”、“部分配列”、”類似体”および“ポリペプチド”という用 語は、勿論、それらの天然の環境内ではこれらの現象を含まず、むしろ例えば単 離され、精製された生体外または組換え形態で含まれると理解さけるへきである 。本発明のＤＮＡ配列について引用されるとき、これは上記定義の“類似体類“ 、“部分配列類”および“修飾配列類”を含むと理解されるへきである。同様に 、“本発明のポリペプチド”について引用される場合、これは以下に定義するい ずれかのポリペプチドを含むと理解されるへきである。

別の重要な観点において、本発明は上記定義の本発明のＤＮＡ配列によってコー トされるポリペプチドに関する。本発明の特に興味深いポリペプチドは、ヒトβ −カゼインのカルシウム結合活性を有するＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　２に示される アミノ酸配列またはその部分配列を含有する組換えヒ）・β−カゼインポリペプ チドである。前記アミノ酸配列の重要な部分配列を含有する重要なポリペプチド の例は、シグナルペプチドなしの成熟組換えヒトβ−カゼインに相当する、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：　２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２１０を含有 するポリペプチドである。

上記の開示から明らかなように、本発明の別の興味深いポリペプチドは、少なく とも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基て置換される点、および／または 少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失されているかもしくは付加されて、図１に 示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を存し、かつヒトβ−カゼインの カルシウム結合活性に比べて類似しているか、増大しているかまたは減少してい るカルシウム結合活性を有し、またはＡＣＥ阻害活性もしくはオピオイド活性を 存するポリペプチドを生成する点て、図１に示されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチドとは異なるポリペプチドである。本発明の修飾ポリペプチドを設計し、 製造する方法の例は、上記の開示から明らかである。

本発明のポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基が翻訳後修飾によって 修飾され、好ましくはグリコジル化および／またはリン酸化された形態であるポ リペプチドである。通常グリコジル化は、ポリペプチドが、酵母または好ましく は哺乳動物のような高等生物の細胞によって発現されるときに行われ、一方リン 酸化は、細菌のような下等生物中で発現される場合に行われる。通常リソ酸化さ れる本発明のポリペプチドのアミノ酸残基は上述のとおりである。グリコジル化 は、通常アミノ酸残基のＡｓ口、Ｓｅｒ、　Ｔｈｒまたはヒドロキシリジンに関 して見られる。

さらなる観点において、本発明は、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列を 保持し、かつ該ＤＮＡ配列の発現を仲介できる複製可能な発現ベクターに関する 。

本願明細書において、“複製可能な２という用語は、ベクターか導入された所定 の種類の宿主細胞内で、ベクターが複製できることを意味する。ヒトβ−カゼイ ンＤＮＡ配列のすぐ上流に、シグナルペプチドをコードする配列か提供されると 、その存在によってベクターを保有する宿主細胞が発現するヒトβ−カゼインか 確実に分泌される。このシグナル配列は、ヒトβ−カゼインＤＮＡ配列に天然に 付随しているものまたは他の起源のものであってもよい。

そのベクターは、組換えＤＮＡ手順を便利に受けることができるいずれのベクタ ーであってもよく、ベクターの選択は、ベクターか導入される宿主細胞によって きまることが多いであろう。したがって、そのベクターは、自律複製ベクターす なわち染色体外要素として存在するベクターであってもよく、その複製は、染色 体の複製とは別個の複製であり、このようなベクターの例は、プラスミド、ファ ージ、コスミド、微小染色体またはウィルスである。また、ベクターは、宿主細 胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組込まれ、組込まれた染色体とともに 複製されるベクターである。適切なベクターの例は、例えば実施例２に例示され ているような細菌の発現ベクター、および例えば実施例３に例示されているよう な酵母の発現ベクターである。本発明のベクターは上記定義の本発明のいずれの ＤＮＡ配列でも保育することができ、上記定義の本発明のいずれのポリペプチド の発現にも使用できる。しかしながら、細菌のベクターか関連している場合には 、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　Ｉに示 される配列、すなわち細菌の細胞内での発現に特に適応させられた配列を含有す るのが好ましい。

さらに、本発明は、上記定義の複製可能な発現ベクターを保存する細胞に関する 。原則として、この細胞はいずれのタイプの細胞でもよく、細菌例えばイー・コ リ（Ｅ、Ｃｏ１１）のような原核細胞、単細胞真核生物である真菌もしくは酵母 例えばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）　、または例えば哺乳動物のような多細胞生物由来の細胞がある。

哺乳動物の細胞は、この目的に特に適しており、さらに以下で考察される。

別の重要な観点において、本発明は、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列 を、特定の宿主細胞内で複製できるベクター中に挿入し、得られた組換えベクタ ーを宿主細胞内に導入しその宿主細胞をヒトβ−カゼインを発現するのに適切な 条件下で適切な培地内または培地の上で増殖させ、ヒトβ−カゼインを回収する ことからなる組換えヒトβ−カゼインの製造方法に関する。該細胞を増殖させる のに使用する培地は、この目的に適した通常の培地のいずれてもよい。適切なベ クターは上記定義のベクターのいずれてもよく、かつ適切な宿主細胞は先に挙げ た細胞型のいずれてもよい。ベクターを構築し、そのベクターを宿主細胞に導入 するのに用いる方法は、組換えＤＮＡの技術分野でこのような目的のために知ら れているいずれの方法でもよく、その例は、ｉ（達する実施例２および３に示さ れている。細胞か発現する絹換えヒｉ〜β−力ぜインは、細胞の種類とベクター の構成によって、分泌すなわち細胞膜を通して放出させることかできる。

細胞内と細胞外それぞれの発現を行う細菌と酵母の発現系の例は、実施例２およ び３に示されている。先に要約した方法は、すなわち本発明のＤＮＡ配列に基づ いて、先に定義した本発明のポリペプチドのいずれを製造するのにも等しく有用 である。

ヒトβ−カゼインか組換え宿主によって細胞内で産生される場合、すなわち細胞 によって分泌されない場合、ヒトβ−カゼインは、機械的手段例えば音波処理も しくはホモジナイゼーンヨンにより、または酵素的もしくは化学的手段によって 細胞を破裂させ、次いて精製することからなる標準の方法て回収することかでき る。このような方法はさらに後述され、回収法の例は実施例５に示される。本発 明は、β−カゼインを含有するカゼインタンパク質を精製する一般に新規な精製 法を提供するものである。この方法についてはさらに以下で考察する。

分泌させるためには、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列に先行してシグ ナルペプチドをフードする配列を配置しなければならず、そのシグナルペプチド の存在によって、ヒトβ−，カゼイ゛）が細胞から確実に分泌され、その結果発 現されるヒトβ−カゼインの少なくともかなりの量か培地に分泌され、回収され る。

例えば中位の収率のヒトβ−カゼインで充分である場合、短期間の産生か望まし い場合、またはタンパク質特に乳汁タンパク質のような他の哺乳動物由来の物質 を実質的に含有していない高純度のヒトβ−カゼインが望ましい場合には、いく つかの目的のために、産生生物として細菌と酵母のような下等生物を用いる上記 のようなヒトβ−カゼインの組換え製造法で充分であるか、本発明の組換えヒト β−カゼインを製造する現在の好ましい方法は、ヒトβ−カゼインをその乳汁中 に分泌できる遺伝子導入非ヒト哺乳動物を使用する方法である。遺伝子導入非ヒ ト哺乳動物を使用することには、大収量の組換えヒトβ−カゼインが妥当な費用 で得られ、特に非ヒト哺乳動物が乳牛のようなウシ種の場合、組換えヒトβ−カ ゼインが例えば乳児用調合孔の通常の成分である乳汁中に産生され、そのため組 換えヒトβ−カゼインが乳汁ベースの製品の栄養補充物として使用されるときに は広範な精製は全く不要であるという利点かある。

さらに、非ヒト哺乳動物のような高等動物内で産生させると、例えば先に考察し たような翻訳後のプロセッシング、および適切な折りたたみについて、通常、哺 乳動物タンパク質の正しいプロセッシングが行われるようになる。また、かなり 純度の高いヒトβ−カゼインを大量に得ることもできる。

ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列としては、ＳＥＱ　ＩＤＮ０：１に示 されるＤ　Ｉ’Ｊ　Ａ配列またはその類似体もしくは有効な部分配列のような、 ＳＥＱ　ｉＤ　Ｎｏ：　２に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする上記定義のＤＮＡ配列が好ましい。

乳汁タンパク質は、乳腺内で高い発現レベルで天然に産生されるので、発現組織 としての乳腺および乳汁タンパク質をフード　する遺伝子は、一般に、遺伝子導 入非ヒト哺乳動物内で非相同タンパク質を産生させるために使用するのに特に適 していると考えられる。また、乳汁は収集が容易であり、がっ大量に入手できる 。この点について、組換えヒトβ−カゼインを製造するのに乳汁タンパク質の遺 伝子を使用することは、さらに発現の調節と産生の場所（乳腺）についてその天 然の産生条件に類似の条件下で該β−カゼインが産生されるという利点がある。

本願において“ハイブリッド遺伝子”という用語は、一方では上記定義のヒトβ −カゼインをコードするＤＮＡ配列を含有し、他方ではハイブリッド遺伝子産物 の発現を仲介できる乳汁タンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を含有しているＤＮＡ配 列を意味する。“乳汁タンパク質遺伝子“という用語は、問題の組織すなわち乳 腺でのハイブリッド遺伝子の発現を仲介しがっ目的とすることができる全遺伝子 およびその有効部分配列を意味する。その乳汁タンパク質遺伝子は、β−ラクト グロブリン、α−ラクトアルブミンまたはカゼインに対する遺伝子でもよいが、 乳漿の酸性タンパク質の遺伝子が特に好ましい。

通常、有効部分配列は少なくとも一つ以上のプロモーター領域、転写開始部位、 ３°と５゛の非コーディング領域および構造配列を保持する部分配列である。ヒ トβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、ベクター配列のような原核配列を実 質的に含有しないのが好ましい、このベクター配列は例えば該ＤＮＡ配列をクロ ーン化した後にＤＮＡ配列に結合することができる。

ハイブリッド遺伝子は、当該技術分野で公知の方法を用いて、ヒトβ−カゼイン をコードするＤＮＡ配列を、生体外で、乳汁タンパク質遺伝子に挿入することに よって作ることが好ましい。

また、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、相同的組換え法によって生 体内で挿入することもできる。

通常、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、第一エキソンおよび好まし くは調節のために重要であると考えられる５°−フランキング領域の実質的部分 を含有する、選択された乳汁タンパク質遺伝子またはその有効部分配列の第一エ キソンの一つに挿入される。

ハイブリッド遺伝子は、ハイブリッド遺伝子産物が乳腺中に正しく分泌されるこ とができるようにシグナルペプチドをコートする配列を含有しているのが好まし い。このシグナルペプチドは、一般に問題の乳汁タンパク質遺伝子中に通常見ら れるがまたはヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列に付随している。しかし ながら、ハイブリッド遺伝子産物の乳腺への分泌を仲介できる他のシグナル配列 も適切なものである。勿論、ハイブリッド遺伝子の種々の要素は、その遺伝子の 産物の正しい発現とプロセッシングを行わせるような方法で融合されなければな らない。したがって、通常、選択されたシグナルペプチドをコートするＤＮＡは 、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列のＮ末端部位に正確に融合されなけ ればならない。ハイブリッド遺伝子において、ヒトβ−カゼインをコードするＤ ＮＡ配列は、通常その停止コドンを含有しているが、それ自身のメソセージクリ ーバンス（ｍｅｓｓａｇｅ　ｃｌｅａｖａｎｃｅ）およびポリアデニル化部位を もっていない。ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列の下流には、乳汁タン パク質遺伝子のｍＲＮＡプロセッンング配列が通常保持されるであろう。

多くの因子が特定のハイブリッド遺伝子の実際の発現レベルに関与していると考 えられる。プロモーターおよび上述の他の調節配列の能力、哺乳動物のゲノム内 の発現系の取込み部位、乳汁タンパク質をコードする遺伝子内の、ヒトβ−カゼ インをコートするＤＮＡ配列の取込み部位、転写後の調節を行う要素および池の 類似の因子は、得られる発現レベルに対して不可欠の重要なものである。ハイブ リッド遺伝子の発現レベルに影響を与える種々の因子の知識に基づいて、当該技 術分野の当業者は本発明の目的に有用な発現系を設計する方法か分かるであろ各 種の異なる乳汁タンパク質が乳腺によって分泌されている。

乳汁タンパク質には二つの主要グループがある。すなわち、カゼイン類と乳漿タ ンパク質類である。異なる種から得られる乳汁の組成は、そのタンパク質につい ては定量的のみならず定性的に異なっている。はとんどの非ヒト哺乳動物は、３ 種の異なるタイプのカゼイン、すなわちα−カゼイン、β−カゼインおよびに一 カゼインを産生する。最も普通のウシ乳漿タンパク質は、α−ラクトアルブミン とβ−ラクトアルブミンである。

種々の起源の乳汁の組成は、さらに１９８７年にクラーク（Ｃ１ａｒｋ）らによ って開示されている。

使用される乳汁タンパク質の遺伝子は、発現系が挿入されるのと同し種由来のも のでもよく、または他の種由来のものでもよい。この点について、遺伝子を乳腺 で発現させるのを目的としている調節要素か、種の境界を越えて機能すること（ このことは祖先が共通である可能性があるためがもしれない）が示されている〔 ヘンニゴーセン（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ）ら〕。

本発明の発現系を構築するのに使用される乳汁タンパク質をコードする適切な遺 伝子またはその有効部分配列の例は、通常、各種の哺乳動物起源の乳漿タンパク 質例えば乳漿の酸性タンパク質（ＷＡＰ）の遺伝子で好ましくはマウス起源のも の、およびβ−ラクトグロブリン遺伝子で好ましくはヒツジ起源のものにみられ る。また、各種の起源のカゼイン遺伝子は、ヒトβ−カゼインの遺伝子導入産物 、例えばウシαＳｌ−カゼインおよびウサギβ−カゼインに適していることが分 かるであろう。本発明において好ましい遺伝子は、マウスＷＡＰ遺伝子であり、 その理由は、この遺伝子は、異なる遺伝子導入動物の乳汁中に多数の異種ヒトタ ンパク質を高レベルで発現することができることが見出されたからである〔ペン ニゴーセン（Ｈｅｎｎ　ｉｇｈａｕｓｅｎ）ら〕。

本発明の発現系に好ましく付随する別の配列は、高レベルの発現を仲介すること ができるいわゆる発現安定化配列である。

このような安定化配列は乳汁タンパク質遺伝子の近くおよび上流にみられるとい う強力な証拠がある。

本発明の発現系に挿入、される、ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、 ｃＤＮＡ、ゲノムもしくは合成の起源のものまたはその組合わせたものでもよい 。い（つかの発現系は、所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡを用いたときに 最高に機能することが見出されているが、他のものは、満足すべき発現を得るた めにイントロンおよび他の調節領域の存在が必要であることが見出されている〔 ヘンニゴーセン（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ）ら〕。場合によって　は、ポリペ プチドをコートする要素としてゲノム構造体を、ｃＤＮＡ要素に比べてベクター 構造体中に導入する方が有利であろう〔プリンスター（Ｂｒ　ｉｎｓ　ｔｅｒ） ら〕。

プリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら（ＰＮＡＳ　８５巻、８３６〜８４０頁、 １９８８年）は、イントロンが、遺伝子導入マウス中の導入遺伝子の転写効率を 増大することを示した。プリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）らは、天然遺伝子の エキランとイントロンの全部が有効でかつ信頼性の高い発現（すなわち発現のレ ベル及び発現する動物の割合の両者を行うのに重要であり、このような発現はそ の遺伝子中の天然のイントロンが原因であることを示している。

いくつかの場合には、このことは、イントロン中の組織特異的調節配列の存在が 原因ではないことが知られている。その理由は、この現象が、遺伝子の発現が、 非相同プロモーターによって、通常はその遺伝子が発現されない組織に向は直さ れる（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）ときに観察されるからである。プリンスター（Ｂｒｉ ｎｓｔｅｒ）らは、この作用は遺伝子導入動物に特有のものであり、細胞系には みられないと述べている。

イントロンとエキランの構造体は、ｃＤＮＡベースのベクターが用いられるとき に得られるよりも高い安定した状態のｍ　′ＲＡＭレベルをもたらす。発現系が ＷＡＰ遺伝子に基づいている場合は、ＷＡＰ遺伝子がゲノムＤＮＡを発現させる のと同様に良好にｃＤＮＡを発現させることができることが種々の実験によって 証明されているので（ヘンニゴーセン（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ）ら）、ｃＤ ＮＡ配列か好ましい。実施例４に、マウスのＷＡ、Ｐ遺伝子に基づいて発現系お よびヒトβ−カゼインをコードする本発明のｃＤＮＡ配列に基づいた発現系を示 し、さらに考察する。

本願明細書において、“イントロン′という用語には、あらゆる天然イントロン の全てまたはその部分が含まれる。

ハイブリッド遺伝子とその成分は、先に詳細に考案された。

そのハイブリッド遺伝子は、上記のような本発明の発現系を構築する際の重要な 中間体を構成している。

別の観点において、本発明は、上記定義′の発現系を保育する非ヒト哺乳動物の 細胞に関する。この哺乳動物細胞としては、胚細胞または前咳か好ましい。その 発現系は、以下に説明されかつ実施例４および６〜９に具体的に示される方法を 用いて、哺乳動物の細胞に適切に挿入される。

さらに重要な観点によれば、本発明は、ヒトβ−カゼインのカルンウノ、結合活 性またはオピオイド活性またはアンギオテンノン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性ま たはこれらの活性にニー）もしはく三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱ　 ［Ｄ　Ｎｏ：　２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドを発現 できる遺伝子導入非ヒト哺乳動物の製造方法であって、該ポリペプチドをコート するＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動物のゲノムに染色体によって組込むことからなる 方法に関する。

本発明の“非ヒト哺乳動物”には、“所望の表現型“を有する”遺伝子導入非ヒ ト哺乳動物“を産生ずることができるすへての非ヒト哺乳動物か含まれる。この ような哺乳動物には、非ヒトの霊長類、ネズミ種、ウシ種、イヌ種などが含まれ る。好ましい非ヒト哺乳動物には、ラン、ブタまたはヒツジ種か含まれ、最も好 ましいのはラン種である。

遺伝子導入非ヒト哺乳動物の所望の表現型には、雌の遺伝子導入非ヒト哺乳動物 の乳汁内での組換えポリペプチドの産生か含まれるか、それに限定されない。

本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、選択された動物の胚の標的な細胞に“導 入遺伝子”を導入することによって製造される。本発明の一つの観点において、 導入遺伝子は、遺伝子導入非ヒト哺乳動物の細胞のゲノム中に含有されていると きに所望の表現型を産生ずることができるＤＮＡ配列である。特定の実施態様に おいて、導入遺伝子は、“組換えポリペプチド”をコードする“組換えＤＮＡ配 列”を含有している。このような場合には、導入遺伝子は組換えポリペプチドを 産生ずるように発現させることかできる。

哺乳動物の生殖細胞系への発現系の組込みは、例えば、１９８６年のア　ラホラ トリー　マニュアル（八しａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　ｆこおけるコ ールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−プレス（Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉｒ＋ｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の　ホーガン。

ビー、　（Ｈｏｇａｎ、Ｂ、）、コンスタンチニ、エフ、　（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｉｎｉ、Ｆ、）およびレージ−、イー（Ｌａｃｙ、　Ｅ、　）によるマユピュレ ーテイングザ　マウス　エンブリオ（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏ ｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ）またはＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９１１０８２１６号に記 載されているような適切な方法を用いて実施することができる。

胚の標的細胞に導入遺伝子を導入または導入遺伝子のフラグメントをオーバラッ プする方法としては、導入遺伝子を、非ヒト動物の、受精卵母細胞の前核もしく はＥＳ細胞の核に微量注射する方法かある。マウスの種に対するこのような方法 は、当該技術分野の当業者によく知られている。また、導入遺伝子は、これを含 有するレトロウィルスを有する接合体を感染させることによって動物に導入する ことができる〔ジャニッシュ。アール（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、　Ｒ，）ブロク、ナ トル、アカド、サイ、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）米国 、７３巻、１２６０−１２６４頁、１９７６年〕。好ましい方法は受精卵母細胞 への微量注射である。この好ましい実施態様において、受精卵母細胞は最初に標 準技術によって微量注射される。次にこの卵母細胞は、“着床前の胚（ｐｒｅ− ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｅｍｂｒｙｏ）”が得られるまで生体外で培養され る。このようにして得られた着床前の胚は、好ましくは約１６〜１５０個の細胞 を含有している。１６〜３２個の細胞の段階の胚は、通常桑実胚と呼ばれている 。３２個より多い細胞を含有するこれら着床前の胚は、通常胚盤胞と呼ばれてい る。それらは、一般に、６４個の細胞の段階て胞胚腔のキャビティの発生を示す ことを特徴としている。受精卵母細胞を着床前の段階まで培養する方法としては 、ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら、メソズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、　１０１巻、４１４頁、１９８４年： マニピュレーティング　ザ　マウス　エンブリオ（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　 ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅεｍｂｒｙｏ）　、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラ トリ−プレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｐｒｅｓｓ）、コールド　スプリング　ハーバ−ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、）、１９８６年、ホーガン（ｔ（ｏｇａｎ） ら（マウスの胚についての方法）、およびハンマー（Ｈａｍｍａｒ）ら、ネイチ ャー（Ｎａ　ｔｕｒｅ）、３１５巻、６８０頁、１９８５年（ウサギとブタの胚 についての方法）；ガンドルフィ（Ｇａｎｄｏｌｆｉ）ら、ジエイ、レプロット 。

フェート（Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、）８１巻、２３〜２８頁、１９８ ７年；レックスロード（Ｒｅｘｒｏａｄ）ら、ジェイ、アニム、サイ、　（Ｊ、 　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、）　、６６巻、９４７〜９５３頁、１９８８年（ヒツジ の胚についての方法）：およびアイストーン、ダブリュ、エイチ、　（Ｅｙｅｓ ｔｏｎｅ、　Ｗ。

Ｈ，）ら、ジェイ、レブロツド、フエ−ｈ、　（Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒ ｔ、）、８５巻、７１５〜７２０頁、１９８９年、カムス（Ｃａｍｏｕｓ）ら、 ジエイ、レブロ−７ド　フエ−ト、　（Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、）　、 ７２巻、７７９〜７８５頁、１９８４年、およびヘイマン、ワイ、　（Ｈｅｙｍ ａｎ、Ｙ、）ら、セリオゲノロジー（ＴｈｅｒｉｏＨｅｎｏｌｏｇｙ）、２７巻 、５９６８頁、１９８７年（ウシの胚についての方法）に記載の方法がある。こ のような着床前の胚は、次に導入遺伝子が導入されるときの発生の段階によって 遺伝子導入動物またはキメラ動物を出生させることができるように、標準の方法 によって適当な雌に移される。よく知られているように、モザイク動物を出生さ せて真の生殖系列遺伝子導入動物を作成することができる。

導入遺伝子組込みの頻度は低いことが多いので、着床前の径内への導入遺伝子の 組込みを検出することが非常に望ましい。

本発明の一つの観点によれば、遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）が起こ り、次に遺伝子が導入された胚を着床させて遺伝子導入動物を作ることかできる 胚を同定する方法が提供される。この方法では、１個以上の細胞が着床前の胚か ら除去される。均等分割法を用いた場合、胚は桑実胚の段階（３２個の細胞）以 後は培養しないのが好ましい。着床前の胚を分割すると〔ウィリアムス（Ｗｉｌ ｌｉａｍＳ）ら、セリオゲノロシー（ＴｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇＹ）、２２巻 、５２１〜５３１頁、１９８６年に概説されている〕、二つの“半径“（半桑実 胚または半径盤胞）が生成し、そのうち一方が、適当な雌に着床した後続いて発 育し分娩まで子宮内で発育することがてきる。着床前の胚は等分割が好ましいが 、このような胚は、故意にまたは故意ではなく、細胞の数が必ずしも等しくない ２個の半径に不均等に分割されてもよいと理解されるべきである。

特に必要なことは、後述のように分析されない胚の一つが子宮内で充分な期間発 育するのに充分な細胞数のものであるということである。特定の実施態様におい て、本願に記載されているように分析されない半径は、遺伝子導入された胚であ ることが分かっている場合には、遺伝子導入された非ヒト動物のクローン集団を 生成させるために使用される。

着床前の胚の分割によって生成した各半径のうちの一つは、導入遺伝子か生物の ゲノムに組込まれたか否かを決定するために分析される。残りの半径は各々、続 いて、その種の宿主の雌に着床させるために保持される。

組込まれた導入遺伝子を含有する着床前の胚の同定は、各半径のうちの一つから のＤＮＡを分析することによって達成される。このようなりＮＡは、一般的に、 実施例８に記載されているようにその半径を溶解し、かつ放出されたＤＮＡを分 析することによって得られる。ポリメラーゼ連鎖反応を行って導入遺伝子の全部 もしくは一部を増幅させる。全導入遺伝子か増幅される場合、導入遺伝子の両端 において向かい合っている鎖に各々相補的な２つの延長プライマーか増幅に使用 される。一般に、半径からの増幅ＤＮＡは、電気泳動に付され、次にその２つの 延長プライマー間の導入遺伝子の領域に相補的な標識されたプローブを用いてハ イブリットか形成される。このことを行えば増幅されたＤＮＡ配列の大きさの決 定が容易になり、半径が得られた（“遺伝子導入半径“と称する）着床前の胚に 導入遺伝子が組込まれたか否かの証拠が提供される。導入遺伝子が組込まれたな らば、残りの未処理の遺伝子導入半径が宿主の親に移植される。子宮内での発育 の後、組込まれた導入遺伝子によって与えられる所望の表現型を有する遺伝子導 入非ヒト動物は、子宮内または分娩後に適当な方法で同定される。

着床前の径内における遺伝子導入を検出する上記の方法は、遺伝子導入動物を産 生ずるのに必要な妊娠の数をを意に減らして、着床された胚か遺伝子導入非ヒト 動物を産生ずる可能性を著しく増大するので、遺伝子導入非ヒト動物を生成する 経済的でかつ時間を節約した方法を提供する。このような方法は、遺伝子導入の 頻度が非常に低いかまたはゼロである動物例えばウシの種に対して特に重要であ る。

別の実施態様では、着床前の径内における遺伝子導入の上記検出法は、遺伝子導 入された胚のクローン集団を生成させ、次いてこのクローンを宿主の雌に着床さ せて、同じ表現型を有する遺伝子導入非ヒト動物のクローン集団を生成させるた めに、胚のクローン化ステップと組合わされる。この点については、同じ“表現 型”を存する遺伝子導入された胚および／または非ヒト遺伝子導入動物は、その ゲノムＤＮＡが遺伝子導入された胚および／または遺伝子導入動物の集団の個体 間で実質的に同一であることを意味すると理解されるべきである。しかしなから 、有糸分裂中に、各種の体細胞突然変異が起こり、一つ以上の細胞および／また は動物の表現型に変化を生じることがあると理解されるべきである。したがって 、同じ表現型を有する集団が個体または分集団の変化を示すことがある。

半径は遺伝子導入半径として同定された後クローン化される。

このような半径のクローン化は、いくつもの異なる方法で実施することができる 。一つのクローン化方法では、遺伝子導入半径は、着床前の段階まで個々の卵母 細胞を培養するのに用いたのと同じかまたは類似の培地で培養される。このよう にして調製された“遺伝子導入された胚”　（好ましくは遺伝子導入個体胚）は 、次いで“遺伝子導入半径′に分割され、次にこれを宿主の雌に着床させて二つ の遺伝子導入非ヒト動物のクローン集団を作ることかできる。また、得られた二 つの遺伝子導入された半径は、再び着床前の段階まで培養され、分割され、次い て遺伝子導入された胚の段階まで再培養されてもよい。この手順は、同じ表現型 を有するクローン遺伝子導入胚の所望の数が得られるまで繰返される。このよう にして得られた遺伝子導入胚は、次に宿主の雌に着床させて、遺伝子導入非ヒト 動物のクローン集団を作ることができる。

好ましいクローン化法において、上記の遺伝子導入胚は、ブラサー（Ｐｒａｔｈ ｅｒ）ら、パイオル、レブロツド、（Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、）３７巻、５ ９〜８６頁、１９８８年：ロブル（Ｒｏｂｌｅ）ら、ジエイ、アニム。

サイ　（Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、）　、６４巻、６４２〜６６４頁、１９８ ７年の技法に従って核転移（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってクロ ー二ノ化される。

この方法によれば、遺伝子導入胚の核は脱核卵母細胞に移植され、次いでその卵 母細胞の各々は、胚盤胞の段階まで培養される。この時点で、遺伝子導入胚は、 核移植法によって別のラウンドのクローン化を再度行うか、または受容体の親に 移植して同じ表現型を有する遺伝子導入された子孫を産生ずることができる。

初期の遺伝子導入を検出する上記の方法に加えて、他の方法を遺伝子導入の検出 に使用することができる。このような方法には、組織の子宮内と分娩後の分析が ある。分娩前の分析はいくつもの技法で行われる。一つの方法では、羊膜腔の経 膣穿刺がエコスコープの案内に基づいて行われる〔ボウグツ（Ｂｏｗｇｓｏ）ら 、ヘト、レス、　−（Ｂｅｔ、　Ｒｅｓ、）　、９６巻、１２４〜１２７頁、１ ９７５年：ラムセイ（ｔｌｕｍｓｅｙ）ら、ジエイ、アニム、サイ、　（Ｊ、　 Ａｎｉｍ。

Ｓｃｉ、）、３９巻、３８６〜３９１頁、１９７４年〕。この方法では、妊娠の 約３５日〜１００日の間に約１５〜２０ｍ１の羊水が回収される。

”この容量の羊水は、発育中の胚の泌尿性器管、皮膚およびおそらく肺に由来す る細胞を１ｍｌ当り約１．０００−１２．０００個含有している。これらの細胞 の大部分は死んでいる。しかしながら、このような細胞は、ゲノムＤＮＡを含有 しており、そのゲノムＤＮＡは成功した遺伝子導入の証拠としての導入遺伝子に ついてＰＣＲ分析に付される。また、胎児細胞を繊毛膜穿刺によって回収しても よい。この方法も、経膣的にエコスコープの案内によって行われる。この方法で は、宿主動物の胎盤の特に胎盤構造体（腟壁に対して固定されている）を穿刺す るのに針が用いられる。このようなサンプリングは、ウシ種の場合、妊娠の約６ ０日月に行われる。繊毛膜細胞は、必要に応じて、母親の組織から分離され、成 功した遺伝子導入の証拠として導入遺伝子のＰＣＲ分析に付される。

遺伝子導入は分娩後にも検出することができる。このような場合、導入遺伝子の 組込みは、推定上の遺伝子導入動物の耳もしくは尾からのような適切な組織の生 検材料を採取することによって検出することができる。約１〜２ｃｍの尾または 約５〜１０ｍｍ’の耳を採取し、続いて、ホーガン（）Ｉｏｇａｎ）ら、マニピ ュレーティング　サ　マウス　エンブリオ（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅ　 Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ）、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、１９８６ 年の方法にしたかって、導入遺伝子についてプローブを用いてサザンプロット法 を行う。

通常、注射された卵子のすへてか、ヒトβ−カゼインを発現できる遺伝子導入哺 乳動物に発育するわけてはない。遺伝子導入始祖動物は、例えば実施例４に記載 したように同定することかてきる。哺乳動物の約１／２、は統計的観点から雄で ある。同定された遺伝子導入個体の雄と雌に基づいて、子孫が確立され、次いて 遺伝子導入動物の安定した系が確立される。

ヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列は、生殖細胞系に一旦組込まれると、 高レベルで発現され、正しくプロセスされた機能性のヒトβ−カゼインを産生ず ることができる。したがって、組換えポリペプチドを収穫することができる遺伝 子導入された雌を次の世代で繁殖させることかできる。

哺乳動物のβ−カゼインを発現する能力は、そのβ−カゼインの発現に関与して いるＤＮＡ配列に突然変異を導入することによって破壊することができる。この ような突然変異には、ＤＮＡ配列をフレームの範囲外に作る突然変異、または停 止コドンの導入もしくはＤＮＡ配列の一つ以上のヌクレオチドの欠失か含まれる 。

哺乳動物のβ−カゼイン遺伝子またはその一部は、相同的組換えの公知の原理を 用いて、上記のような発現系またはヒトβ−カゼインをコードするＤＮＡ配列で 置換されてもよい。

遺伝子の標的化（ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、選択された内在性配列” 　に対して相同性を持つ外在性ＤＮＡ配列を用いた相同的組換えによる、細胞の 内在性染色体の選択された染色体皮の定方向修飾を意味する。遺伝子の標的化は 内在性遺伝子の発現を増大し、修飾しおよび断絶させるのに利用されている〔ボ ラグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら、アン、レプ、ゲネト（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅ ｔ、）　２３巻、１９９〜２２５頁、■９８９年参照〕。

さらなる観点によれば、本発明は、上記の方法で製造された遺伝子導入非ヒト哺 乳動物に関する。

遺伝子導入された細胞および動物を作るのに使用されるＤＮＡはｃＤＮＡてはな く、むしろゲノムＤＮＡで構成されているのが好ましい。この理由は、導入遺伝 子の発現が組織特異的発現と時間特異的（ｔｅｍｐｏｒａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ）発現に限定されるのが好ましいからである。導入遺伝子がゲノムＤＮＡ由来の 場合、イントロン中または構造遺伝子から離れた領域のどちらか一方に位置して いるエンハンサ−及び他の調節要素のごとき重要なシス作用を行う（ｃｉｓ−ａ ｃｔｉｎｇ）１４節配列を含めることができる。このような調節配列は、転写中 およびＲＮＡプロセッシング中に失われるので、一般にｃＤＮＡ由来の導入遺伝 子では利用することはできない。

その最も広い観点における本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、特定の種類の 哺乳動物に限定されないが、その哺乳動物は、通常、マウス、ラット、ウサギ、 ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシからなる群から選択される。ヒトβ−カゼインを 大規模に生産するには、ヒツジ、ヤギ、ブタおよび特にウシのような大型の動物 は乳汁の産生量が高いので通常好ましい。しかしながら、マウス、ウサギおよび ラットは、例えばウシの場合よりも取扱いが簡単でかつ一層迅速に遺伝子導入動 物が得られるために重要である。

ヒトβ−カゼインを産生ずることができる、上記のような遺伝子導入哺乳動物の 子孫も本発明の適用範囲内に含まれる。

さらに別の観点において、本発明は、上記定義の本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳 動物から乳汁を集め、次いでその乳汁からヒトβ−カゼインを回収することから なるヒトβ−カゼインの製造方法に関する。その乳汁は、問題の哺乳動物から乳 汁を集めるのに通常使用されている適切な方法で集めることができる。

本発明によれば、第一に、ヒトβ−カゼイン（その重要性と育用性は本願明細書 の説明から明らかであろう）を含有する乳汁を非ヒト哺乳動物から製造できるこ とは、上記説明から明らかであろう。したがって、本発明のさらなる観点には、 組換えヒトβ−カゼインを含有する、非ヒト哺乳動物由来の乳汁が含まれる。特 に重要なのは、Ｓ８Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：　２に示されるアミノ酸配列を育する上記 定義の本発明のポリペプチド、または上記定義のＳＥＱ　［ＯＮｏ：　ｌで定義 されたＤＮＡ配列またはその類似体もしくは部分配列でコートされたポリペプチ ドを含有する、非ヒト哺乳動物由来の乳汁である。一般的に、本発明の乳汁は、 上記定義の本発明の遺伝子導入哺乳動物から得られる。

本発明のポリペプチドの重要な用途は、栄養剤としての用途、特に乳児用調合孔 の代替品としての用途であることは上記説明から明らかてあろう。

さらに別の観点によれば、本発明は、組換えヒトβ−カゼイン特に上記定義の本 発明のポリペプチドを含有する乳児用調合孔に関する。この乳児用調合孔は、乳 児用調合孔の通常の成分に、組換えのヒトβ−カゼインまたはポリペプチドを精 製された形態または部分的に精製された形態で添加することによって製造するこ とができる。しかしながら、通常、乳児用調合孔は、特にウシが起源の場合、上 記定義の本発明の乳汁で製造するのが好ましい。本発明の乳児用調合孔は、通常 の手順を用いて製造することができ、無機質類、ビタミン類などの必要な添加物 を含有していてもよい。

乳児用調合孔の製造 遺伝子工学的に製造されたヒトα−ラクトアルブミンとβ−カゼインが分離され てかつ精製されたならば、それらはヒト乳児用調合乳に混合される。ウシのα− ラクトアルブミンとカゼインに基づいた乳児用調合孔の配合は定義されている〔 ヴイ。

ニス、バラカート（Ｖ、Ｓ、　Ｐａｃｋａｒｄ）、“ヒユーマン　ミルクアンド 　インファント　フオーミュラ（Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　ａｎｄ　Ｉｎｆａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａ）　”　、１４７〜＋５４頁、アカデミツク　プレス（Ａｃａｄ ｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８２年〕。乳漿タンパク質とカゼインは、６０　 ：　４０、または乳汁１００　ｍｌ当り合計１．５ｇのタンパク質に対してα− ラクトアルブミン領９重量％、カゼイン０．６重量％の比率が提案されている。

しかしながら、ヒト乳汁中に実際に認められる量に相当する各アミノ酸の量を得 るための、ヒトタンパク質に対するこの比率のコンピュータ最適化によれば、４ ０　：　５０、または　”α−ラクトアルブミン０．６７重量％：β−カゼイン ０．８３重量％の比率（乳汁１００　ｍｌ当り合計１．５ｇのタンパク質につい て）が、全必須アミノ酸の公知のレベルを達成するのに必要である。大豆ベース の調合乳に用いられるし一メチオニンのような補充アミノ酸は不要である。

カルシウムは、生物学的に適合性で、例えばシグマ化学会社（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から市販されている化学形態のものが好ましく、好まし くは最少量で５０■／１ｏＯｋｃａｌ存在させるべきである。リンの最少量は２ ５■／１００ｋｃａｌである。ナトリウム、カリウムおよび塩素も最少量と最大 量を守らなければならない。

これらのレベルは、６７０ｋｃａｌ／　１を提供する調合乳では、それぞれ６〜 １７、■４〜３４および１１〜２９ミリ当量（ｍＥｇ）の範囲内にある。

１ミリ当量は、その元素の原子量（■で示す）を原子価で割り算して得た値に等 しい。浸透圧（ｉｌ当りの溶質のモル数）は、４００ｍ０５ｍを越えてはならな い。

６７０ｋｃａｌ／ｆの乳児用調合孔のカロリー密度（ｃａｌｏｒｉｃ　ｄｅｎｓ ｉｔｙ）は、通常の満期出産の乳児に対してほぼ最適のようである。

その配合のカルシウム−リンの比率は、１．１：１．０〜２：１が好ましい。最 も好ましくはその比率は、少なくとも出生後の最初の一年間の大部分を通じてほ ぼ１．５：１である。−歳年齢までに、適切な比率はｌ・１に一層近くなる。

乳児用調合孔は組成を変えることができるが、かなり狭くかつ極めて厳密な限度 内にある。一般に、ヒト乳汁の完全な代替゛　物として、調合乳は、約７０　： 　３０〜約３０・７０の範囲内のα−ラクトアルブミン、β−カゼインの好まし い比率でカロリーの７〜１６％のタンパク質を含有し、カロリーの３０〜５４％ の脂肪を含有し、カロリーの２〜３％のリノール酸を含有し、かつ残りの力口り −は炭水化物源由来のものであるのが好ましい。調合乳の脂肪成分は、各種の植 物性脂肪で構成されているのが好ましい。

食物の多くの不純物および汚染物質は脂肪に可溶性であるので、特別に精製され た植物性の脂肪と油によって調合乳成分の開園が良好に行われる。脂肪酸のシス 形からトランス形への変換とそれに伴う必須脂肪酸の損失を防止するために、プ ロセッシング全体を通して低温（または超高温）処理を用いるのが好ましい。

成分の代表的な一覧表は次のとおりである。

水 ラクトース（コーンシロップまたはスクロースを使用することができる） ヒトα−ラクトアルブミン 大豆油 加工コーンスターチ モノ−およびジークリセリド類 カラゲニン ビタミン源 バルミチン酸ビタミンＡ ビタミンＤ３ α−トコフェロール酢酸（ビタミンＥ）フィトナジオン（ビタミンＫ） アスコルビン酸（ビタミンＣ） 塩化チアミン・塩酸ＩｊｉＸ（ビタミンＢｌ）リポフラビン ソアノコバラミン（ビタミンＢ　１２）ナイアシンアミド パントテン酸カルシウム ピリドキシン・塩酸塩（ビタミンＢ６）ビオチン 葉酸 塩化コリン 無機質源 三塩基性リン酸カルシウム 硫酸第二鋼 硫酸第一鉄 塩化マグネシウム 塩化カリウム クエン酸カリウム ヨウ化カリウム 硫酸亜鉛 列挙した各成分の量は、以下に開示するように、エフディーニー（ＦＤＡ）（ヴ イ、ニス、パラカード（Ｖ、Ｓ、　Ｐａｃｋａｒｄ）、“ヒユーマン　ミルク　 アンド　インファント　フォーミュラ（ｌ（ｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　ａｎｄ　１ｎ ｆａｎｔ　Ｆｏｒｍｕｌａ）　”　、　１４７〜１５４頁、アカデミツク　プレ ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８２年〕およびザ　アメリカン　ア カデミ−オブ　ベディアトリクス（ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＡｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）　（アム、アカド、オブ　ベリディアトリクス（ Ａｍ、　Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）、コム、オン　ヌトリショ ン（Ｃｏｍｍ、　ｏｎ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、ベディアトリクス（Ｐｅｄｉａ ｔｒｉｃｓ）、７２巻、３５９〜３６３頁、１９８３年〕によって推奨されてい る最高および最低のガイドライン内に各栄養成分を保持するように、調節される 〔調合乳に対する提案標準を含む、ナメリカン　アカデミ−才ブ　ペリディア） ・リクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ） 、コミソテ、イー　オン　ヌトリション（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｎｕｊｒ ｉｔｉｏｎ）　コメ：ノタリ・−オン　ブ！１−ス）・−フィーディングアント 　インファント　フす−ミュラス（Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ　ｏｎ　Ｂｒｅａｓｔ −Ｆｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｎｆａｎｔ　Ｆｏｒｍｕｌａｓ）、ペリディ了ト リクス（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ’）、５７巻、２７８頁、１９７６年を修正〕。

炭水化物源はツク）・−ス（またはラクトースを含有する乳汁と乳漿の製品）、 スクロース、コーンシロップ固形物（グルコース源）およびデンプンを含有して いる。

適切な粘稠化剤、乳ｆヒ剤、抗酸化剤およびｐＨ調節化合物を用いてもよい。米 国では乳児用調合乳に添加物を使用する場合の条件は、連邦規則法典（ｔｈｅ　 Ｃｏｄｅ　ｏｆ　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（ＣＦＲ）第２１ 条、１７２．６２０項および１８０項で制限さねている。

乳児用調合乳に用いられるしタミ：ノ添加物は、食糧農業機構（ｔｈｅ　Ｆｏｏ ｄ　ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）　（Ｆ　 Ａ　Ｏ）によって認可されている。ブロセッソングの必要条件、有用性および／ ′または特定の食品系内での安定性は、とちらの影響か最高に役立つかを示すて あろう。

ＦＡＯは、乳児用調合乳に用いる無機質源も認可している。

与えられる無機質添加物の適切性は、食料製品の組成および水分に左右される。

さらに、各食品は香味および／または構造の安定性に対してそれ自体の必要条件 を課している。酸化性の腐敗臭は、不飽和脂肪を含有する、鉄および／または銅 で強化された食品に常に存在する問題である。ゲル化は、濃縮液乳児用調合乳に 起こる可能性がある問題である。還元鉄または電解鉄は、乾燥食品中では充分に 役立つが、液体調合孔内ては沈降物として析出するであろう。ＦＡＯは、ｐＨの 調節を行うために酸および塩基が必要であることも認めているが、これらのもの は、所定の無機質の全含有量を決定するために考慮されなければならない。

ある種の無機質の化合物、例えばカル：ノウムとリンの化合物は、乳児用調合乳 にはかなり大量に必要である。その他の無機質成分は痕跡量しか必要でない。し たかって、乳児用調合乳の成分中の痕跡無機質は、種々の乾燥成分を再構成する ｔ、−めに用いられる給水に加えられている無機質とともに考慮されなければな らない。給水は、全特性に依存して、この目的のために処理される場合も処理さ れない場合もある。しかしながら、水質は、調合乳の仕上げ製品の痕跡無機質の 含有量とともに監視されなければならない。

痕跡の無機質を調合乳に添加する場合、通常硫酸塩が用いられる。しかしなから 、硫酸イオンの許容濃度は特定されていない〔アンダーラン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ）ら１９８０年〕。硝酸塩は、メトヘモグロビン血症を起こす可能性かあるため 、通常、調合乳には添加されない。植物製品で製造された調合乳には、痕跡量が 生じる場合かある。また、硝酸塩か生じ、時おりいくつもの給水中に高濃度で見 出されることがある。銅は、水中に存在している可能性がある別の毒性成分であ る。しかしながら、生物学的に許容される塩の組成物は、本発明に用いることか で′きると考えられる。

調合乳に通常添加される無機質としては、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄 、銅、ヨウ素、亜鉛、カリウム、ナトリウム、マンガンおよび塩素（塩化物とし て）がある。従来の乳児用調合乳の組成物には、タンパク質成分とともにかなり の量の無機質を保有するウシまたは大豆のタンパク質源を添加する必要がある。

これらの無機質が存在すると、製造された乳児用調合乳の無機質成分の決定精度 が低下する。電気透析法、イオン交換法および限外濾過法を含む従来の方法は、 タンパク質に付随する無機質およびその他の不純物からタンパク質を分離するの に通常使用される。本発明の組換えＤＮＡ由来のヒトタンパク質をヒト乳児用調 合乳に用いると、必要なタンパク質精製の回数が減少し、その結果、無機質含量 の一層正確な決定がなされ、タンパク質プロセッシングの経費が減少する。

早産乳児に対する配合物 早産または低体重（２５００ｇ未満）の乳児に対して、調合乳は、タンパク質と 無機質濃度の評価について通常修正がなされる。

ラクトースの濃度を通常の量の１／３〜１／２に減少させ、その差をコーンシロ ップ固形物のようなより容易に吸収できる炭水化物源で補うことが好ましい。脂 肪、カルシウムおよびリンは、容易に利用可能な形態て利用できなければならな い。

カロリー密度は、８００〜１０００ｋｃａｌ／　Ｉ！まで上昇させ、カロリー約 １１％はタンパク質から、および５０％脂肪からとするのか好ましい。一般に、 とうもろこし油と大豆油は、早産乳児においてかなりよく吸収されるようである 。

乳児用調合乳に加えて、他の食品配合物も、遺伝子導入ウシの牛乳由来の組換え ポリペプチドで補充することができる。例えば、このような組換えポリペプチド は、通常の制限食の配合物を補充するのに使用することができる。

したかって、遺伝子導入ウシの種の乳汁中にヒトβ−カゼインを産生させると、 ヒトβ−カゼイン源か与えられる。このようなヒトβ−カゼインは、配合する目 的のために遺伝子導入乳汁から精製されしてもよい。また、遺伝子導入乳汁全体 を、好ましくは低温殺菌した後に、液体または乾燥した形態で使用することがで きる。さらなる観点によれば、本発明は、カゼインと異なるタンパク質を含む成 分の混合物からカゼインタンパク質を単離および／または精製する一般に新規な 方法に関する。

この方法は、カゼインが単離および／または精製される成分の混合物に、０．０ ５Ｍ以上の濃度の硫酸アンモニウムを添加してカゼインタンパク質を沈殿させ、 その沈殿したβ−カゼインタンパク質を成分の混合物から分離し、および任意に 、沈殿したカゼインから塩を除去することからなる方法である。

本発明の精製法は、タンパク質が塩の存在下では溶解度が低下するという事実に 基づいている。この作用は“塩析“として知られている。

その方法は、カゼインタンパク質が天然に存在する混合物例えば乳汁、およびカ ゼインタンパク質が人工的に添加されたかまたは合成された混合物、例えば組換 えカゼインが産生された細胞または細胞要素の混合物由来の混合物を含むあらゆ る種類の混合物からあらゆる種類のカゼインタンパク質を単離するのに一般に利 用できると考えられる。その細胞は、細菌もしくは酵母の細胞のような微生物の 細胞でもよく、または哺乳動物の細胞でもよい。

従来、乳汁中のカゼインは、例えばローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）が１９３８年 に記載したように、その等電点における酸沈膜性によって分離されてきた。しか しなから、酸沈膜性は、ｐＨ制御の必要性を含むいくつかの欠点かあり、この欠 点は大規模にカゼインを精製する場合特に顕著である。

したかって、例えば実施例５に記載したように、成分の混合物からカゼインを分 離する際に、０．０５Ｍというような低濃度の硫酸アンモニウムか、従来法に比 へて極めて選択的なカゼイン分離法を提供したということを見出したのは驚くべ きことである。低濃度の硫酸アンモニウムを使用することは、安価であり、カゼ インの大規模の単離および／または精製に容易に用いることかできる。

各種のタイプのカゼイン例えばα−カゼイン、β−カゼイン、およびに−カゼイ ンは、上記方法を使用することによって互いに分離することはてきないか、本発 明の極めて選択的なカゼイン分離法に基づいて、この単離されたカゼインの沈殿 中に任意に存在する各種のタイプのカゼインは、必要に応してクロマトグラフィ ーによってさらに分離することができる。

さらに詳しく述へれば、本発明のカゼイン単離法は、例えば先に開示したような 、組換えヒトβ−カゼインが産生される細菌または酵母の細胞の混合物から数組 換えヒトβ−カゼインを単離するのに用いすることができる。したがって、さら なる観点によれば、本発明は、細菌または酵母の細胞内で組換えヒトβ−カゼイ ンの細胞内発現が行われる場合、組換えヒトβ−カゼインを保存する細胞を培地 から分離し、分離された細胞を破壊して該細胞にその内容物のとりわけ組換えヒ トβ−カゼインを放出させ、任意に破壊された細胞の混合物から細胞の破片を除 去し、およびＯ，’０５Ｍ以上の濃度の硫酸アンモニウムを添加することによっ て放出されたβ−カゼインを沈殿させることからなる、前記定義の細菌または酵 母の細胞から組換えヒトβ−カゼインを単離する方法に関する。

結果として、その沈殿は、それが存在する混合物から分離され、塩は任意に除去 され、β−カゼインは例えば凍結乾燥によって濃縮される。

細菌もしくは酵母の細胞の培地からの分離、細胞破片の任意の除去および沈殿の 分離は、遠心分離法または沈降法または他の従来利用されている分離法によって 便利に実施される。細菌または酵母の細胞の破壊は、音波処理法、凍結／融解処 理法による破壊、フレンチプレス処理法などによる適切な方法で達成することが できる。

いずれの塩も、従来の方法、例えば透析法もしくはサイズ排除クロマトグラフィ ーによって除去することができる。その１ｐ離されて任意に精製されたβ−カゼ 、インは、限外濾過法および／または凍結乾燥によって濃縮するのが好ましい。

そのβ−カゼインの沈殿は、それが濃縮される前か、またはその方法に塩の除去 か含まれている場合にはこれを行う前に、−同辺上の洗浄処理に付すのが有利で ある。

組換えヒトβ−カゼインが細胞外で産生された時には、組換えヒトβ−カゼイン はすてに培地中に分泌されているので、はとんどの場合、細菌または酵母の細胞 を破壊する必要かない。

しかしながら、細胞外発現か満足すべきほと有効でなく、産生された組換えヒト β−カゼインの大部分が細胞内に存在している場合には、勿論、このような細胞 を破壊することは有利である。しかしながら、細胞外発現が行われる場合は通常 、上記定義の細菌または酵母の・細胞から組換えヒトβ−カゼインを単離する方 法は、細菌または酵母の細胞を培地から除去し、０．０５Ｍ以上の濃度の硫酸ア ンモニウムを添加することによりて培地中に存在する組換えヒトβ−カゼインを 沈殿させ、沈殿された組換えヒトβ−カゼインを培地から分離し、および任意に 上記の塩を除去し、単離されたβ−カゼインを濃縮することからなる。

本発明の組換えピトβ−カゼインか、上記のように遺伝子導入非ヒト哺乳動物に よって産生きれる乳汁から分離される場合には、硫酸アンモニウムは乳汁に直接 添加され、組換えヒトカゼインを含有する沈殿し、たカゼインが乳汁から回収さ れる。組換えヒトβ−カゼインと異なるタフ１′ブのカゼ、イン、例えばウンカ ゼインタンパク質類を含有するカゼイン画分は、例えばクロマトグラフィーまた は分別脱塩法によって、該両分から組換えヒトβ−カゼインを精製するためにさ らに精製される。本発明の精製方法に用いられる硫酸アンモニウムの濃度は、０ ．０５Ｍを越えるのが好ましく、例えば０．０６Ｍ以上、例えば０．０７Ｍ以上 の濃度である。しかしながら、０．０７５　Ｍ、　０．０８Ｍおよびさらに０゜ ０９Ｍと０．１Ｍ以上の濃度のようなより高い濃度もこの目的に適していると考 えられる。

本発明を、下記の添付図面を参照してさらに説明する。

図１は、実施例１に記載したようにして得られたヒトβ−カゼインｃＤＮＡフラ グメントの完全ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸の配列を示す。ｃＤＮＡ ライブラリーのスクリーニングに使用したオリゴヌクレオチドのプローブの位置 は、下線を付けて示しである。破線の矢印は、該ｃＤＮＡフラグメントの配列決 定を行うのに使用した異なるオリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマーの位 置を示す。

図２は、イー・つり（ε、Ｃｏ１１）中で発現するのに有用であり、（実施例２ に記載されているように）　ｐＵｃ１９中にＥｃｏＲＩフラグメントとしてクロ ーン化されたヒトβ−カゼインのｃＤＮＡ配列を示す。このｃＤＮＡは、５°末 端と３′末端の両方に合成のオリゴヌクレオチドを導入することによって修飾さ れた。この修飾によって、５゛末端におけるコドン使用頻度が変わり、３°末端 には追加の終止コドンが付加され、および発現ベクターへのクローン化を容易に 行えるようにする制御部位の導入が行われた。

図３は、実施例２に記載いｉ二ようにして１陶築された発現ベクター　ｐ３２６ を示し、このベクターはヒトβ−カゼインをイー・フリ中で細胞内発現させるの に有用である。

図４は、実施例２に記載されたようにして構築された発現ベクターｐｓ　２１３ を示し、このベクターはヒトβ・−カゼイミノをイー・コリＣ！Ｉ’ｌ胞外発現 させるのに有用である。

図５は、イー・二］すＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ中で発現された組換えヒ トβ−カゼインをＳＯ３ＰＡＧＥ分析に付した結果を示す。

Ａ）　ｔＰＴＧて誘導さ第１た、ブ→スミトｐＳ　２６およびｐ３２８をそれぞ れ有するイー　・コリ　Ｂ１．２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓの細胞質および周辺 畑胞質の標品由来の可溶性タ、ノバク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。

タンパク質は、１０〜１７５％ａ［勾配のポリアクリルアミ１へケルで分離され 、次いてクーマシーブリリアントブルーＲ−２”、）Ｏて染色された。

レーン１　分子１−の標準、９４．６７．４３．３０．２０．１およびｌ・１． ４ｋＤ（ファルマノア社） レーン２・ＩＰＴＧて誘導された、プラスミドｐｓ　２６を有するイー・コリＢ Ｌ２１（、ＤＥ３）ｐｌｙｓ　Ｓ由来の細胞質。

１ノーン３　レー：、２と同一であるか誘導されていない。

レーン４　：　ＩＰＴＧて誘導された、プラスミドｐｓ　２６を有するイー・コ リ　ＢＬ２１（ＤＢＳ）ｐｌｙｓ　Ｓ由来の周辺細胞質。

レーン５　レーン４と同一であるか誘導されていない。

レーン６１１ＰＴＧで誘導された、プラスミドｐｓ　２８を有するイー・コリ　 ＢＬ２１（ＤＥＳ）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の細胞質。

レーン７・レーン６と同一であるか誘導されていない。

レーン８・ＩＰＴＧで誘導された、プラスミドｐｓ　２Ｂを有するイー・フリＢ Ｌ２＋（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の周辺細胞質。

レーン９・レーン８と同一であるが誘導されていない。

■！−レ１０・乳汁から調製した未変性のヒトβ−カゼイン。

Ｂ）　ＩＰＴＧて誘導された、プラスミドｐｓ　２６およびｐｓ　２８をそれぞ れ有するイー・フリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ中に発現された組換えヒト β−カゼインのウェスタンプロットの分析結果。

試料は、４０ｍＭ　）リス塩酸塩、ｐｉ（８，２中ての凍結＝融解を１サイクル 行い、遠心分離し、ベレットの不溶性画分と上澄み液の可溶性画分に分離した後 、Ｓｔ″ｌ５−ＰＡＧＥによって分離された。次いて、試料は、イモピロン（［ ｍｍｏｂｉｌｏｎ）（ミリボア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）〕膜に移され、高度に 精製されたヒトβ−カゼインを用いて製造されたアルカリホヌフ了ターゼ標識ポ リクローナルウサ５　抗体を用いて視覚化された。

し・−ンｌ、予め染色された分子量マーカー＋０６．８０．４９．５．３２．５ ．２７．５および１８．５ｋＤ　Ｃバイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　）。

レーン２　：　ＩＰＴＧで誘導された、プラスミドｐＳ　２６を有するイー・コ リＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の不溶性画分。

レーン３　レーン２と同一であるが誘導されていない。

レーン４　：　ＩＰＴＧで誘導された、プラスミドｐＳ　２６を存するイー・コ リＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬＹＳ　Ｓ由来の可溶性画分。

レーン５・Ｌノーン４と同一であるか誘導されていない。

レーン６・［ＰＴＧて誘導された、プラスミドｐｓ　２８を有するイー・コリＢ Ｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の不溶性画分。

レーン７：レーン６と同一であるが誘導されていない。

レーン８　：　ＩＰＴＧで誘導された、プラスミドｐｓ　２８を有するイー・コ リＢＬ２１（ＤＢＳ）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の可溶性画分。

レーン９：レーン８と同一であるが誘導されていない。

図６は、ヒトβ−カゼインをニス、セレビシェ（Ｓ、　５ｅｒｅｖｉｓｉａｅ） で細胞外発現されるのに用いた発現ベクターｐＳ　２３２を示す。

このベクターについては、さらに実施例６で記載する。

図７は、ｐＳ　２３２プラスミドを含有する酵母細胞由来の細胞抽出物のウェス タンプロット分析の結果を示す。タンパク質をｌＯ〜１７．５％濃度勾配のポリ アクリルアミドゲル上で分離し、次いでイモピロン（［ｍｍｏｂｉｌｏｎ）　Ｃ ミリボッ社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　）膜にエレクトロブロッティングを行った 。展開を行う前に、フィルターを２，５％ＢＳＡでブロックした。β−カゼイン は、高度に精製したヒトβ−カゼインを用いて製造されたアルカリホスファター ゼ標識ポリクローナルウサギ抗体を用いて視覚化された。

そのフィルターは、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルホスファターゼで展開された。

レーンｌ：予め染色された分子量マーカー１０６　、８０．４９．５．３２．５ ．２７．５および＋８．５ｋＤ　（バイオ−ラッド社）。

レーン２：乳汁から調製した未変性のヒトβ−カゼイン。

レーン３　：　ＩＰＴＧで誘導された、プラスミドｐｓ　２６を有するイー・コ リＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の可溶性画分。

レーン４　：　ＩＰＴ［：、で誘導された、プラスミドｐｓ　２８を有するイー ・コリＢＬ２１（Ｄε３）ｐＬｙｓ　Ｓ由来の可溶性画分。

Ｉ／−ン５　；　ｐＳ２３２プラスミドを含有する酵母細胞由来の細胞抽出物。

レーン６：レーン２と同じ。

レーン７：レーンｌと同じ。

図８ Ａ）実施例４で記載したようにして、マウスＷＡＰ遺伝子に挿入されたヒトβ− カゼインｃＤＮＡの構成。

Ｂ）実施例４で記載したようにして構築され、マウス中でヒトβ−カゼインを発 現させるのに用いられる発現ベクターｐｓ１３３゜ 図９は、実施例４に記載したようにしてＰＣＲ法によって生成されたＫｐｎ　［ およびＳａｌ［フラグメントの配列を示す。

図１０は、１１Ｓ３１６由来のベクターフラグメントを有する、ヒトβ−カゼイ ンを得るために遺伝子導入された二種のマウス系由来の乳汁試料のウェスタンプ ロット分析の結果を示す。そのタンパク質は５ＯＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、イ モピロン（Ｉｍｍｏｂｉ　Ｉｏｎ）膜（ミリボア社）に移され、高度に精製され たヒトβ−カゼインを用いて製造されたアルカリホスファターゼ標識ポリクロー ナルウサギ抗体で視覚化された。レーンｌは、精製されたリン酸化天然ヒトβ− カゼインの５００ｎｇでスパイク（ｓｐｉｋｅ）された非β−カゼイン遺伝子導 入系由来の対照乳汁■μｌを含有している。レーン２には分子量マーカー：　１ ０６．８０．４９．５．３２．５．２７゜５および１８．５ｋＤが含有されてい る。レーン３は、精製された非リン酸化天然ヒトβ−カゼイン約１１００ｎを含 有している。レーン４は、精製されたリン酸化天然ヒトβ−カゼインｓｏｏｎｇ を含有している。レーン５は、遺伝子導入マウス系＃９３由来のマウス乳汁２μ ｌを含有している。レーン６は、遺伝子導入マウス系＃９４由来のマウス乳汁２ μβを含有している。レーン７は、精製ヒトβ−カゼインを添加することなく、 レーン１と同様の対照の非β−カゼイン遺伝子導入マウス乳汁２μｌを含有して いる。

図１１は、実施例５に記載したように組換えヒトβ−カゼインを精製した後に得 られた結果を示す。

Ａ）イー・コリ内で産生された組換えβ−カゼインの精製物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ 分析結果。得られたゲルは、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色さ れた。

レーント低分子量の標準（ファルマシア社）レーン２−４：濃度を増大させた場 合の硫酸アンモニウムで沈殿させたβ−カゼイン。

Ｂ）Ａ）において行ったのと同様にして精製された組換えβ−カゼインのウェス タンプロット分析結果。

レーン１および５・予め染色された低分子量標準（バイオ−ラッド社）。

レーン２：ヒト乳汁から精製した天然のβ−カゼイン。

レーン３および４・Ａ）において行ったのと同様にして精製された組換えβ−カ ゼイン。

図１２は、実施例５に記載したのと同様にして精製され、イオン交換クロマトグ ラフィーで分析された組換えヒトβ−カゼインの純度を示す。試料は、２０ｍＭ エタノールアミン塩酸塩、６Ｍ尿素、ｐＨ９，５中のカラムに負荷され、同じ緩 衝液中の０．６Ｍまでの直線勾配濃度のＮａＣ１溶液で溶出された。

図１３は、ヒトβ−カゼイン遺伝子座を示す。そのエキフン／イントロン構成お よび使用された制限酵素部位を示す。エキランは黒四角印１〜８で示されている 。使用した酵素は、Ａ＝Ａｃｃ　［、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、　Ｈ＝ｔ（ｉｎｄＩ［、 Ｋ＝ＫｐｎｌＳＰ＝Ｐｓｔｌ、Ｘ＝Ｘｂａ　Ｉである。

図１４は、ヒトβ−カゼイン遺伝子の制限地図を示し、２１の異なるサブクロー ンｐｓ３６１〜３８１の位置を示す。エキランは黒四角印で示されている。

ｐｓ３６１　、　ｐＳ３６２　、ｐＳ３６３およびｐＳ３６４は異なるＥｃｏＲ Ｉフラグメントである。ｐＳ３６５　％　ｐＳ３６６　％　ｐＳ３６７　、ｐＳ ３６８　、ｐＳ３６９およびｐｓ３７０は異なるＸｂａ　Ｉフラグントである。

ｐｓ３７１　、　ｐＳ３７２　、ｐＳ３７３　、ｐＳ３７４およびｐＳ３７５は 異なるＨｉｎｄＩ［［フラグメントである。

ｐＳ３７６は、Ｘｂａｉ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであり、ｐＳ３７７およ びｐＳ３７８は異なるＰｓｔ［／Ｘｂａｌフラグメントてあり、ｐＳ３７９およ びｐｓ３８１は異なるＸｂａ［／Ａｃｃ！フラグメントてあり、ｐｓ３８０はＡ ｃｃ　［フラグメントである。

すへてのフラグメントはｐＵｃ１９にサブクローン化される。

制限マツプ中に示された二つのＸｂａ　［部位はダムメチル化されているのて（ ｄａｍ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）、実験にてＸｂａ　［で処理されても切断され ない。

記号　Ｅ＝ＥｃｏＲ１、Ｈ＝ＨｉｎｄＩ［Ｉ、Ｘ＝Ｘｂａ　［、Ａ＝Ａｃｃ［、 Ｐ＝Ｐｓｔｌおよびに＝Ｋｐｎ　［。

１１１５は、ｐｓ３１６中の１’／ＡＰ／β−カゼイン組換え遺伝子の構成を示 す。ＷＡＰエキソンラン画角印で１−ｉＶの番号を付けて示されている。β−カ ゼインのｃＤＮＡは白画角印で示されており、ＣＤＮＡを挿入するのに使用した 制限部位、Ｋｐｎ　［および５ａｉｌが示されている。

図１６ Δ）ヒトβ−カゼイン遺伝子導入動物を同定するために用いたＰＣＲプライマー の位置を図式的に示す。その５′プライマーは、ＷＡＰとβ−カビインの間の融 合部の一１４８ｂｐ上流の位置で出発するマウスＷＡＰ配列内に位置している。

その３′プライマーは、融合部の５４６ｂｐＴ流で終わる最初のβ−カゼインイ ントロン内に位置している。

Ｂ）使用されたＰＣＲオリゴヌクレオチドブライマーの配列。

Ｃ）始祖である可能性かある遺伝子導入動物のＰＣＲスクリーニングの一般的分 析結果を示すアガロースゲル。

Ｍ　分子量マーカー。大きさは左側にＫｂ単位で示されている。

レーン１１　ｐｓ３＋６から生成された対照のＰＣＲ生成物。

レーン２　陰性対照、非遺伝子導入マウスから調製されたＤＮＡのＰＣＲ分析結 果。

レーン３〜１６　始祖である可能性かある各種の遺伝子導入動物から調製された ＤＮＡ試料のＰＣＲスクリーニングの結果。

レーン５．１３および１５では、ＰＣＲて生成したバンドが明らかに目視可能で あり１、これらの試料中における遺伝子導入動物由来のＤＮＡ試料を論証してい る。そのＰＣＲ生成物の予想される大きさ、６９６ｂｌ）かを右側に示されてい る。

図１７ Ａ）　ｐｓ３１６　ＷＡＰ／β−カゼイン組換え遺伝子の構成。β−カゼインフ ラグメントを白画角印で示し、ＷＡＰエキソンラン画角印で示す。ハイブリッド 形成試験で用いた、標識されたβ−カゼインｃＤＮＡプローブすなわちＩ）５２ ＋がら単離されたＥｃｏＲＩフラグメントの位置か示されている。

Ｂ）フィルター膜への転移およびハイプツト形成前のＤＮＡ試料の分離を示す臭 化エチジウムで染色されたアガロースゲル。

種々のレーンに負荷されたマウス由来のＤＮＡの量は、非常によく類似している 。

Ｍ・分子量マーカー、大きさは左側に示されている。

レーンＩ　：　Ｘｂａｌ／Ｂｇ１．ＩＩて消化されたｐｓ３１６ＤＮＡ　（１ｎ ｇ）。

レーン２〜Ｉ６：始祖である可能性がある異なるβ−カゼイン遺伝子導入動物か ら調製された、Ｘｂａｌ／ＢｇｌＩ［で消化されたＤＮＡ試料（１０μｇ）。

Ｃ）Ｂ）で示されたゲルを移し、Ａ）で示されたｐｓ２１がら単離された１０７ ６ｂｐのｃＤＮＡ　ＥｃｏＲ［フラグメントである３１１ｐで標識されたプロー ブでハイブリットを形成させた後のＤＮＡハイブリッド形成の結果を示す。レー ンｌのハイブリッド形成シグナルは、組換えｐｓ３１６由来の遺伝子のハイブリ ッドを形成するＸｂａ［／Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントの予想される大きさを示す 。

図１８は、プラスミドｐＳ３５８の環状地図を示す。１）Ｓ３５８は、実施例１ に記載したように、Ｓａｌ＋で消化され７’：＝ｐｔ）Ｃ１９中にクローン化さ れた精製λフアージ由来のヒトβ−カゼインゲノム配列を含有している。Ｅｃｏ Ｒｌ制限部位は、β−カゼインフラグメントの配向を示している。矢印は、β− カゼイン遺伝子の転写方向を示す。

図１９は、実施例４に記載されている第一β−カゼインエキノンを含有するＷＡ Ｐ／ゲノムβ−カゼイン構造体の模式地図を示す。

マウスＷＡＰ遺伝子フラグメントは、第一エキノンの上流に約４、５ｋｂのＤＮ Ａ配列を含有している。転写の方向は、矢印で示されいる。いくつかの重要な制 限酵素部位か示されている。ＷＡＰ配列の第一エキノン中のＫｐｎ　［部位およ びＳａｌ［部位の位置は、合計８個のエキノンを含有するヒトβ−カゼインゲノ ム配列を導入するのに用いられる。ヒトβ−カゼインの第二エキノン中の翻訳開 始部位の位置は、星印で示されている。黒画角印はエキノンを表わし、下に示す 番号はもとの遺伝子内での順序を示す。

図２０は、第二エキノン中に位置するβ−カゼイン翻訳開始点か実施例４に記載 されているように第−ＷＡＰエキラン中に挿入されている第二ＷＡＰ／ゲノムβ −カゼイン構造体の模式地図である。このようにして、ヒトβ−カゼイン遺伝子 のエキノンｌおよび第一イントロンか除去される。マウスＷＡＰ遺伝子フラグメ ントは、第一エキノンの上流に約４．５ｋｂのＤＮＡ配列を含有している。転写 方向は矢印で示されている。いくつかの重要な制限酵素部位か示されている。Ｗ ＡＰ配列の第一エキノン中のＫｐｎ１部位とＳａｌ１部位の位置は、７個のエキ ノンを含有するヒトβ−カゼインのゲノムフラグメントを導入するのに用いられ る。黒画角印はエキノンを示し、下に記入した番号はそれらのもとの遺伝子中て の順序を示す。

（以下余白、次頁に続く） 引用文献 −Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、　Ｄ、ε、、　Ｈｏｂｂｓ、　Ａ、Ａ、　ａｎｄ　Ｒｏ ｓｅｎ、　Ｊ、Ｍ、　Ｒａｔ　ｂｅｔａｃａｓｅｉｎ　ｃＤＮＡ：５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｏｍｐａｒｉ ｓｏｎｓ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０．２２９５−２３０７ ．１９８２゜−Ｂｏｎｓｉｎｇ、Ｊ、、Ｒｉｎｇ、Ｊ、Ｍ、、　Ｓｔｅｗａｒｔ 、Ａ、Ｆ、ａｎｄ　Ｍａｃｋｉｎｌａｙ。

Ａ、Ｇ、　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅβ−ＣａＳｅｉｎ　ｇｅｎｅ、＾ｕｓｔ、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｓｃｉ、　４１．５２７−５３７．１９８８゜−Ｂｏｎｓｉｎｇ、　Ｊ 、　ａｎｄ　Ｍａｃｋｉｎｌａｙ、　Ａ、Ｇ、　Ｒｅｃｅｎｔ　５ｔｕｄｉｅｓ 　ｏｎ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈ ｅ　ｃａｓｅｉｎｓ、　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｒｅｓ、　５４．４４７−４６１． １９８７゜ −Ｂｒａｎｔｌ、　Ｖ、　Ｎｏｖｅｌ　ｏｐｉｏｉｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｄｅ ｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎβ−ｃａｓｅｉｎ：Ｈｕｍａｎβ−ｃａｓｏ ｍｏｒｐｈｉｎｓ、　Ｅｕｒ　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　１０６゜２１３− ２１４．１９８４゜ −Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、、　Ａｌ１ｅｎ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｂｅｈｒｉｎ ｇｅｒ、　Ｒ，Ｒ，、Ｇｅ１ｉｎａｓ。

Ｒ１巳、ａｎｄ　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、Ｒ，Ｄ、［ｎｔｒｏｎｓ　１ｎｃｒｅａｓ ｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｉｎ　ｔｒａｎ ｓｇｅｎｉｃ　ｍ１ｃｅ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ玉、　［ＪＳＡ 　８５．８３６−８４０．１９８８゜−Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｓ、Ｍ、、Ｒｏｓｅ ｎ、Ｊ、Ｍ、、Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ、Ｌ、Ｇ、、　５ｔｒｅｃｈ−Ｊｕｒ ｋ、Ｕ、ａｎｄ　５ｉｐｐｅ１．　Ａ、Ｅ、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｗｈｅｙ　ａｃｉｄｉｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒ ａｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１２．８６８ ５−８６９７．１９８４゜−Ｃ１ａｒ１．　Ａ、Ｊ、、Ｓｉｍｏｎｓ、Ｐ、、Ｗ ｉｌｍｕｔ、　１．　ａｎｄ　Ｌａｔｈｅ、Ｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　１ｉｖｅｓｔｏｃｋ、　Ｔ［ＢＴＥＣＨ ５，２０−２４、１９８７゜ −Ｄｅｖｉｎｏｙ、Ｅ、、５ｃｈａｅｒｅｒ、Ｅ、、Ｊｏｌｉｖｅｔ、Ｇ、、Ｆ ｏｎｔａｉｎｅ、Ｍ、Ｌ、。

Ｋｒａｅｃｈｅｎ−ｂｕｈｌ、Ｊ、Ｐ、ａｎｄ　Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ、Ｌ、Ｍ、 ５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ａｌｐｈａ　５ｔ−ｃａｓｅ ｉｎ　ｃＤＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６゜１１８１３、　 １９８８゜ −Ｇ１１１．　Ｄ、Ｒ，、Ｈａｔｆｕｌｌ、Ｇ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓａｌｍａｎｄ、 Ｇ、Ｐ、Ｃ，Ａ　ｎｅｗ　ｃｅＩＩ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｐｅｒｏｎ　ｉｎε 、ｃｏｌｉ、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０５．　１３４−１４５．　１ ９８６゜ −Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｒ，、Ｇｒｏｖｅｓ、Ｍ、Ｌ、ａｎｄ　Ｄｏｗｎ、Ｈ， Ｊ、Ｈｕｍａｎ　β−Ｃａｓｅｉｎ、ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　ａｎｄ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉ ｏｎ　５ｉｔｅｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９．　５１３２−５１３８． 　１９８４゜−Ｈａｌｌ、Ｌ、、Ｅｍｅｒｙ、Ｄ、Ｃ，、Ｄａｖｉｅｓ、Ｍ、Ｓ 、、Ｐａｒｋｅｒ、Ｄ、ａｎｄ　Ｃｒａｉｇ、Ｒ，に、Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ａｌｐｈａ−ｌａ ｃｔａｌｂｕｍｉｎ　ｇｅｎｅ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２４２．７３５−４２．　１９８７゜−）Ｉｅｎｎｉｇｈ ａｕｓｅｎ、Ｌ、Ｇ１．　Ｒｕ１ｘ、Ｌ、ａｎｄ　Ｗａｌｌ、Ｒ，Ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃａｎｉｍａｌｓ　−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｍ１ｌｋ、Ｃｕｒｒ。

０ｐｉｎｉｏｎｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、１．　７４−７８．　１９９０゜−Ｈｏ ｇａｎ、　Ｂ、、　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｌａｃｙ、　Ｅ 、　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ、Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６゜−Ｊｉｍｉｎｅｚ−Ｆｌａｒｅｓ、 Ｒ，、Ｋａｎｇ、Ｙ、Ｃ，ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１４２．　６１７−６２１．　１ ９８７゜−Ｊｏｎｅｓ、Ｗ、に、、Ｙｕ−Ｌｅｅ、Ｌ、Ｙ、、Ｃ１１ｆｔ、Ｓ、 Ｍ、、Ｂｒｏｗｎ、Ｔ、Ｌ、ｑｎｄ　Ｒｏｓｅｎ、Ｊ、Ｍ、Ｔｈｅ　ｒａｔ　ｃ ａｓｅｉｎ　ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ、Ｆｉｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒ ｅ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ　ｇ ｅｎｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６０．　７０４２−７０５０．　１９８５゜−Ｋｏｈｍｕｒａ、　 Ｍ、、　Ｎｉｏ、　Ｎ、、Ｋｕｂｏ、Ｋ、、　Ｍｉｎｏｓｈｉｍａ、　Ｙ、、　 Ｍｕｎｅｋａｔａ、Ｅ、ａｎｄ　Ａｒ１ｙｏｓｈｉ、Ｙ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉＢ　ｅｎｚｙｍｅ　ｂｙ　 ５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　β−ｃａｓｅｉｎ 。

Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、５３．　２１０７−２１１４．　１９８９゜ −Ｋｕｎｚ、Ｃ，ａｎｄ　Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ、Ｂ、）ｌｕｍａｎ　ｍ１ｌｋ　 ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｓｅｉｎ　ａｎｄ　ｃａｓ ｅｉｎ　５ｕｂｕｎｉｔｓ　ｂｙ　ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ、　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　ａｎｄ　 ５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｎｕｔｒ、５１．　３７−４６．　１９９０゜−Ｌａｅｍｍｌｉ、ｌＪ、に、Ｎ ａｔｕｒｅ　２２７．　６８０．　１９７０゜−Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ、　Ｂ、、 Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ、　Ｓ、、　Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、　Ｙ、、　Ｈｊａｌｍａ ｒｓｓｏｎ、　Ｋ、、５ｕｎｄｑｖｉｓｊ、　Ａ、に、　ａｎｄ　Ｈｅｒｎｅｌ ｌ、　０．　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｃＤ ＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｍ１ｌｋ　β−ｃａｓｅｉｎ、ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔ、２６９．　１５３−［５６，＋９９０゜−Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｓ、 、Ｎａｋａｇｏｍｉ、Ｋ、、Ｔｏｍｉｚｕｋａ、Ｎ、ａｎｄ　５ｕｚｕｋｉ、Ｈ 。

Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　［−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　１ｎｈｉ ｂｉｔｏｒ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍａｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏ ｌｙｓａｔｅ　ｏｆ　ｃａｓｅｉｎ、ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｒａ−ｄ ｙｋｉｎｉｎ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｕ ｔｅｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｌｅｕｍ　ｏｆ　ｒａｔｓ、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、４９．　１４０５−１４１０．　１９８５゜−１Ｊｅｎｏｎ、　 Ｒ，Ｓ、　ａｎｄ　Ｈａｍ、　Ｒ，Ｇ、　）Ｉｕｍａｎ　β−ｃａｓｅｉｎ：　 ｐａｒｔｉａｌｃＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ｐｏ ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１７．　２８６ ９．　１９８９−帽１１ｅｒ、　Ｍａｒｋ　Ｊ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ。

１９５、　１４３−１５９．　１９９０゜−Ｍｏｕｎｔ、Ｓ、Ｍ、Ａ　ｃａｔａ ｌｏｇｕｅ　ｏｆ　５ｐｌｉｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０．　４５９−４７２．　１ ９８２゜−Ｐｉｃｋｅｎ、Ｒ，Ｎ、、Ｍａｚａｉｔｉｓ、Ａ、Ｊ、、　Ｍａａｓ 、　Ｗ、に、、Ｒｅｙ、　Ｍ、　ａｎｄＨｅｙｎｅｋｅｒ、Ｈ，Ｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｈｅａｔ−ｓｔ ａｂｌｅ　ｅｎｊｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｉｔ　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｉｎｆｅｃｔ 、Ｉｍｍｕｎ、４２゜２６９−２７５．　１９８３゜ −Ｐｒｏｖｏｔ、　Ｃ，、Ｐｅｒｓｕｙ、　Ｍ、Ａ、　ａｎｄ　Ｍｅｒｃｉｅｒ 、、１．Ｃ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ 　ｏｖｉｎｅ　ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ　ｃＤＮＡ：　１ｎｔｅｒ−ｓｐｅｃｉ ｅｓ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、Ｂｉｏ−ｃｈｉｍｅ　７１．８２７−３２．　１ ９８９゜−Ｒｏｗｌａｎｄ、Ｓ、ｊ、Ｊ、Ｄａｉｒｙ　Ｒｅｓ、９．　４７−５ ７．　１９３８゜−Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、ａｎｄ 　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、Ｅ、Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　 １ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ− ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、＋９８９゜−５ｃ ｈａｅｒｅｒ、Ｅ、、Ｄｅｖｉｎｏｙ、Ｅ、、Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ、Ｊ、Ｐ 、　ａｎｄ　Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ、Ｌ、Ｍ、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　 ｒａｂｂｉｔ　ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ　ｃＤＮＡｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉ ｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｃａｓｅｉｎ　ｃＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｎｕｃｌｅ ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１６．１１８１４．１９８８゜−Ｓｔｅｗａｒｔ、Ａ 、Ｆ、、Ｂｏｎｓｉｎｇ、Ｊ、、Ｂｅａｔｔｉｅ、Ｃ，Ｗ、、５ｈａｈ、Ｆ、。

Ｗｉｌｌｉｓ、１．Ｍ、、Ｍａｃｋｉｎｌａｙ、Ａ、Ｇ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ａｌｐｈａ　 ５２−ａｎｄ　ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ　ｃＤＮＡｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ 　ｗｉｔｈ　ｒｅｌａｔｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　５ｐｅ ｃｉｅｓ、Ｍａｔ、Ｂｉ。

１、Ｅｖｏｌ、４．２３１−４１．１９８７゜−５ｔｕｄｉｅｒ、Ｆ、Ｗ、、Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｈ，、Ｄｕｎｎ、Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｄｕｂｅｎｄ。

ｒｆｆ、Ｊ、Ｗ、Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｔｏ　 ｄｉｒｅｃｔ　ｅｙｐｒｅｓｓｉ。

口　ｏｆ　Ｃ１ｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ、Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ、ｅｄ、ＤａｖｉｄＶ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｐ、　６０−８９． 　Ａｃｊｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９９０゜−Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、　Ｍ、　 ａｎｄ　Ｏｋａ、　Ｔ、１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　 ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ　ｇｅ ｎｅ、　Ｇｅｎｅ　７８．２６７−２７５゜１９８９゜ −Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、　Ｍ、、Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ｍ、Ｒ，ａｎｄ　Ｏｋａ、 　Ｔ、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃ ｏｄｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｂｅｔａ　ｃａｓｅｉｎ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ｓ　Ｒｅｓ、１４．　８２２４．　１９８６゜実施例 以下の実施例は、例示するのを目的とするものであり、本発明を限定するもので はない。

本発明の発現系の構築とその分子生物学的特性決定は、組換えＤＮＡの技術分野 で一般に知られている標準の方法を使用する。特にことわらない限り、使用する 方法は、サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、ら１９８９年に記載されている方 法である。

定義 ＤＮＡのハイブリッド形成 例えばニトロセルロースフィルター−上にあるＤＮＡを、２×ＳＳＣ（ＩＸＳＳ Ｃ：　０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ　’；ｌ　エン酸３ナトリ ウム、ｐＨ７，０）で濡らし、予め昇温させた（６７°Ｃ）前ハイブリッド形成 溶液が入った熱シールプラスチックバッグ内に入れる。該バックをおだやかに振 盪しながら、６７℃で２時間、前ハイブリッド形成を行う。その溶液を予め昇温 させた（６７°Ｃ）ハイブリッド形成溶液と交換し、放射性プローブを添加し、 ハイブリッド形成を６７°Ｃて１８時間行う。該バッグをゆっくりと振盪して、 確実に、液体がニトロセルロースのフィルターを覆って常に移動するようにする 。ハイブリッド形成を行った後、洗浄手順を実施する。

放射性プローブは、配列表１　（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｌｉｓｔｉｎｇ　＋　）に 示されるＤＮＡ配列またはその一部、特にアミノ酸１〜２１０に相当するヌクレ オチドのようなコーディング部分または上記定義のＤＮＡ配列の有効な部分配列 に基づいて、例えばサムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らか記載したように公知 の方法番用いて製造する。

使用される前ハイブリット形成溶液とハイブリッド形成溶液は、１０×デ：７ハ −ｌ−液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）、４　ＸＸ５ＳＣ，Ｏ，１，％ＳＤＳ、ｌ ｏｔ１ｇ／ｍｌのポリＡ、５ｕｇ／ｍｌの分析される変性ＤＮＡおよび変性（熱 ）放射性プローブである。−ノイルターを、予め昇温させり（６７°Ｃ）溶液（ ｌＯ×デンハート液、２　ｘｓｓｃ　、　０．１％ｓＤｓ内て２×１５分間、ｌ 　Ｘ５ＳＣ、Ｏ月％ＳＤＳで４×１５分間）洗浄する。得られたフィルターを風 乾し、つ゛ターラップ（Ｖｉ　ｔａ−Ｗｒａｐ）て覆い、増感スクリーンを使用 もしくは使用せずにＸ線フィルムを３時間・・−３週間上記フィルターに対し２ て露出させる。

実施例ＩＡ ヒトβ−カゼインをコードするｃＤＮＡのクローン化ど配列決定 乳分泌能力を有する成人ヒトの乳腺から調製したλ−ｇｔｌｌ　ヒト乳腺ｃＤＮ Ａう、イブラリ−を、クロンチック　ラブ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂ、）　 （米国、カリフォルニア州、バロ・アルド（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）　）から入手 した。ぞのヒトβ−カゼインのクローンを、イー・コリＹ１０９０を用いてプラ ークハイブリッド形成法てスクリーニングした。β−カゼイン配列中のアミノ酸 １１７〜１３０に相当する合成の４２量体のオリゴヌクレオチドプローブ５−Ｇ ＡＧＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡ ＧＴＣ，ＡＡ−３’を合成した〔グリーンーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら、１９ ８４年〕。このオリゴヌクレオヂトの構築は、ヒトの相対物に対して大きな相同 度を有するウノのβ−カゼインアミノ酸配列の領域に基づいて行った。しかしな から、合成オリゴヌクレオチドの選択には、ヌクレオチド配列４４９−４９０に ついて、ウシｃＤＮＡ配列における以下の修飾か含まれている〔ジミネズーフロ レス（Ｊ　１ｍ１ｎｅｚ−Ｆｌｏｒｅｓ）ら、１９８７年〕。すなわちｉ）ヌク レオチド４５８（Ｇ→Ｃ交換）、ｉｉ）ヌクレオチド４８０　（Ｃ−”Ｔ）　、 ｉｉ）ヌクレオチド４８３　（Ｔ→Ｃ）である。オリゴヌクレオチドプローブを 、メーカーの指示にしたかって、ホスホルアミダイト法を用いて、ベックマン（ Ｂｅｃｋｍａｎ）２０ＯＡ　ＤＮＡ合成機て合成した。得られたプローブは、Ｔ ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて〔γ−３２Ｐ）ｄＡ、ＴＰで標識された〔 ニュー　イングランド　バイオラプス社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ）　、？サチューセッッ州、ビバリー〕。

ハイブリット形成を、４０°Ｃて１２〜１５時間実施し、その膜を洗浄し、Ｘ線 フィルム〔アマーソヤム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国〕を用いてオートラジオ グラフィーに付した。６個の陽性プラークが、−次のスクリーニングで同定され た。

二次のスフリーリングに続いて、精製クローンのファージＤＮＡをプレート溶解 物（ｐｌａｔｅ　１ｙｓａｔｅ）から単離した。制限地図を作成し、β−カゼイ ンｃＤＮＡをサザンプロット法によりクローン化フラグメント中に配置した。

β−カゼインの４２量体のプローブとハイブリッドを形成する挿入断片を存する λ−ｇｔ　１１クローンの一つを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ［で消化し、 そのｃＤＮＡ挿入断片を１％シー　ケムＧＴＧアガロース（Ｓｅａ　Ｋｅｍ　Ｇ ＴＧ　Ａｇａｒｏｓｅ）　（ＦＭＣバイオプロダクツ社（ＦＭＣＢｉｏ　ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ）、メーン州〕を用いて電気泳動に付すことによってすべてＤＮＡか ら分離した。得られたｃＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲ（で消化されアルカリ ホスファターゼで処理されたｐｔｌｃ１９　ＤＮＡ　（ファルマシア社）に連結 し、その連結したものでイー・コリＴＧＩＣスタディール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら 〕を遺遺伝子犬した。遺伝子導入体を、１００μ／　ｍｌのカルベニシリン、４ ０μｇ７ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−叶ガラクトシト （Ｘ−ｇａｌ）およびｌｌｎＭ　イソプロピル−β−叶チオガラクトシド（［Ｐ ＴＧ　、ソグマ社、ミズーリ州、セント　・ルイス）を含有するプレート上で選 択した。上記ｃＤＮＡ挿入断片を保有する組換えプラスミドを同定してｐＳ　２ １と命名した。

プラスミドｐｓ　２１１）ＮＡを制限エンドヌクレアーゼ分析に付した。

β−カゼインをコードする領域の両方の鎖の完全ヌクレオチド配列を、メーカー か記載したように二本鎖鋳型上で、Ｔ７配列決定キット（ファルマソア社、スエ ーデン、アブサラ）を用いて決定した。配列決定反応に用いるプライマーとして 、ｐＵｃＩ９またはβ−カゼイン配列に相補的な特異的オリゴヌクレオチドを用 いた。

得られたヌクレオチド配列は、２１０個のアミノ酸と１５個のアミノ酸の一つの シグナルペブチトとで構成された、β−カセイン前駆タンパク質の全アミノ酸配 列をコードするのに充分な読取り枠を含有していた（図１）。

実施例ＩＢ ヒトβ−カゼインの遺伝的変異体 ヒトβ−カゼインは、限られた数の遺伝的変異体で存在していると推測される。

これらの変異体は、図１に示されずｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列と 比べていくつかのアミノ酸が置換されている。上記の推測は、現在まで研究され ている他のほとんどの種が遺伝的変異体をもっていることに基づいているが、得 られたｃＤＮＡ配列（図１）と古典的なアミノ酸配列決定法で決定された配列〔 グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら）どの間に相違かあることにも基づい ている。遺伝的変異体、ナなオ）ち図１に示されるＤＮＡ配列の類似体は、下記 の手順によって咽離して特性を決定することができる。

ＤＮＡを、遺伝的背景（民族性）が異なるドナーが提供した新鮮なヒト乳汁から 単離する。同様に、ｍＲＮＡを新鮮な乳汁から単離し、ｃＤＮＡを逆転写酵素法 を用いて合成する。顕著なアミノ酸の相違がある配列に隣接する領域から選択さ れた特異的合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ法 で合成する。合成されたＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、ジデ オキシチェインターミネーション法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉ ｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）で配列を決定する。

実施例ＩＣ ヒトβ−カゼイン遺伝子のクローン化、配列決定および構成りローン化した前述 のヒトβ−カゼインｃＤＮＡをプローブとして用いて、ヒトβ−カゼイン遺伝子 の転写部分を含有するゲノムクローンをヒトゲノムライブラリーから単離した。

ヒトゲノムライブラリー（カタログ＃　ＨＬ　１０６７Ｊ、ロット１２２１）を クロンチック社（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）　（米国、パロ・アルド）から入手した。

このライブラリーは、λＥＭＢＬ−３ベクター中にクローン化されたヒトβ−カ ゼイン胎盤ＤＮＡから構築されている。

挿入断片の平均の長さは１５ｋｂてあり、独立クローンの数は２．５Ｘ　１０＠ である。

ヒトβ−カゼインのエキランとイントロンの配列を含有する組換えファージを単 離するために、直径が１５０ｍｍの５８ｇＡの個々の細菌プレートをスクリーニ ングした。

使用した方法は、ライブラリー　プロトコール　ハンドブック（いｂｒａｒｙ　 Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）：ジエネラル　プロセデュア−フォー　 サ　ハイフ゛リダイゼーション　オフ゛　ラムダ　ファージ　ライブラリーズｗ ／ＤＮＡ　ブローブス（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒ　ｔｈｅ 　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｍｂｄａ　Ｐｈａｇｅ　Ｌｉｂｒａ ｒｉｅｓ　ｗ／ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ）　（クロンチック社（Ｃ１ｏｎｔｅｅｈ ））に記載された方法を、下記の説明から明らかなようにいくつか改変した方法 である。

実験はおおむね次のようにして実施された。その番号はプレートベースて付けら れてい。０．１滅菌ラムダ希釈剤で希釈されたファージライブラリーの試料を、 推定１０．０００ｐｆｕを調製するために作製した。イー・コリ宿主菌株ＮＭ　 ５３９（Ｃｌｏｔｅｃｈ社からの入手）の０．６ｍ１ＬＢ培地培養物に、１００ ００ｐｆｕ　（プラーク形成単位）の組換えライブラリーファージを感染させ、 次いて０．３ＭのＳＭ緩衝液を添加した。感染させた培養物を３７°Ｃで２０分 間インキュベートした。

次いて、得られた培養物をトップアガロースと混合しくＬＢ中７．２ｇのアガロ ース）　、ＬＢプレート上にそそいだ。そのプレートを３７°Ｃで約７時間イン キュベートした。得られたプレートを４°Ｃで冷却した。

プラークハイブリッド形成法の試験を、次のようにして行った。メンブランフィ ルタ−のコロニー／プラーク　スクリーン（Ｃｏｌｏｎｙ／ＰＬａｑｕｅ　５ｃ ｒｅｅｎ）　（デュポン社、米国）をプレートの上面上に２〜３分間置装た。そ のフィルターを取外し、ＤＮＡを変性するため、プラークの側を上にして、プラ スチックのラップ上の０．５Ｍ　ＮａＯＨ中に２分間浮遊させた。有効な変性を 確実に行うために、上記ステップを一回繰り返した。次にそのメンブランフィル タ−を、中和溶液、１Ｍトリス塩酸塩ｐＨ７，５中に２分間づつ２同人れて、有 効な中和を確実に行った。次いて、そのメンブランフィルタ−を乾燥させた。

上記メンブランフィルタ−をＤＮＡノ＼イプリ・ノド形成法てスクリーニングす るのに用いるプローブ゛を得るために、ｐＳ　２１をＥｃｏＲＩて消化し、１０ ７５ｂｐのフラグメントをアガロースの電気泳動法で分離し、切取ってポリプロ ピレン製の微量遠心分離管に移した。単離されたｃＤＮＡフラグメントは、マル チプライムＤＮＡ標識化装置〔アマージャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）を用い 、下記の手順により３２ｐで標識した。水をゲル１ｇ当り３ｍｌの比率で添加し 、次いて沸騰水浴中に７分間入れてゲルを融解させてＤＮＡを変性させた。次に 、上記の管を３７°Ｃの湯浴中に少なくともＩＯ分間入れた。２５ｎｇのＤＮＡ を含有するＤＮＡ／アガロース溶液の同容積を、メーカーの指示にしたかつて、 標識化反応液に添加した。

上記ハイブリッド形成法を、下記の方法に１−またがって６５°Ｃでストリンジ ェント条件で行った。フィルターメンプランは、ハイブリッド形成オーブン（Ｈ ｙｂａｉｄ）を用いて９．６５°Ｃにて少なくとも１時間、びん中の１％ＳＤＳ 　、　１．Ｍ塩化ナトリウム、１０％硫酸デキストランの溶液内で処理すること によっ“Ｃ前ハイブリッド形成を行った。前ハイブリッド形成に続いて、最終濃 度がＬｏｎｇ／　ｍｌの変性されたニシンの精子のＤ　Ｎ　Ａと、ｌｏｎｇ／ｍ ｌより低いａ度３２Ｐで標識を付け？−Ｄ　Ｎ　Ａゾローブとを含有する溶液（ パックグランド比に対して最適のシグナルを得るため）を上記の前ハイブリット 形成溶液に添加し、上記メンブランフィルタ−を６５°Ｃて１０〜２０時間イン キュベートした。メンブランフィルタ−を洗浄するｔ−め、ハイブリッド形成溶 液を除去した。最初のスヂップで、メンブランフィルタ−を、２　Ｘ　５ＳＣ（ ０，３１１１１化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ溶 液で、室温にて５分間ず−）２回洗浄した。次のステップで、メンボランフィル ターを、同し溶液内で、６５°Ｃで３０分間ずつ２回イ〕ノキュベー１−　した 。次いて、最後に、メンブランフィルタ−をＤＮＡの面を上にして一枚の濾紙の 上に置いて乾燥させた。乾燥されたメンブランフィルタ−をＸ線フィルムに露出 してオートラジオグラフに付した。

上記のようにして分析した約６０００００の個々のプラークのうち、−・つのハ イブリット形成プラークが検出され１．：ｔｌを９離した。

いくつかの再スクリーニング試験を行った後、その組換えファージをサムブロノ ・７　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）の方法にしたかってｆｆ４Ｈした 。精製したＤＮＡを５ａｌｌで消化し、アガロース電気泳動によって約１４ｋｂ のフラグメントを単離した。この１４ｋｂのフラグメントを、５ａｔｌで消化し て線状にしたｐＵｃ１９中にクローン化してｐＳ３５８（図１９）を得た。

クローン化した１４ｋｂのフラグメントは、ＥｃｏＲｌ　、Ｈｉｉｄｌ［［、ｘ ｂａｔ、　Ａｃｃｌ、Ｐｓｔｌ、　Ｋｐｎｌ、ＢｇｌＩ［、Ｂａｍ）Ｉ　ｌおよ びＳａｃ　Ｉを用いて、制限酵素による地図作成法で特性が決定された。得られ た制限地図を図１３に示す。エキランの概略位置とイントロンの概略の大きさを ＰＣＲと電気泳動法で分析した。ｐｓ３５Ｂのクローンから得られた結果を、鋳 型としてヒＨ）ＮＡを用いた同じＰＣＲプライマーで得られた結果と比較した。

二つの鋳型から得た結果は同一であった。

ヌクレオチド配列分析を容易に行うために、ｐＳ３５８由来の２１個の制限フラ グメントを単離し、ｐｔＪｃＩ９中にザブクローン化してｐｓ３６１〜ｐｓ３８ ｔを得た（図１５）。サブクローン化したフラグメントの配向をＰＣＲ分析法で 決定した。以下の方法を採用した。すなわち、ｐＵｃ１９配列内でそのクローン 化部位の各側に別個に位置しているＰＣＲプライマーと、配向が分かっていてか つ決定可能な、β−カゼイン由来のサブクローン化フラグメントに対して特異的 な他のＰＣＲプライマーとを結合する方法である。

２１種のプラスミドｐｓ３６１〜３８１内の挿入断片のヌクレオチド配列分析を 行った。全サブクローンについての完全ヌクレオチド配列は、Ｔ７配列決定キッ ト〔ファルマシア社、スエーデン、ユナイテ・・・ド　スティン　バイオケミ’ ｈル（Ｕ旧ｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）　、米国〕を、メー カーが説明するように、−重鎖鋳型について用いて決定した。配列決定反応に用 いるプライマーとして、ｐＬｌｃＩ９に相補的な特異的オリゴヌクレオチド〔Ｅ ２゜０５’　−ＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ−３’　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ・６）、ＳＹＭ　１１２１５−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ ＡＣ−３“（ＳＥＱ　１０　ＮＯニア）、　ＳＹＭ　２５８９５’　−ＴＴＣＣ ＧＧＣＴＣＧＴ、ＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧ−３’　（ＳＥＱ　１ＯＮｏ、８）） またはβ−カゼイン（表１参照）の配列を使用した。

Ｃ以下余白、次頁に続く） ヒトβ−カゼイン遺伝子の配列を決定するのに使用したオリボックレオチドプラ イマー。配列は５’　−３’　の方向で示される。

方向は配列分析の読取り方向を示す。

プライマー　位置　配列　方向 分析したヒトβ−カゼインゲノムヌクレオチド配列は１０６０７ｂｐ（ＳＥＱ　 ｔＤ　ＮＯ：１）で構成されている。

このヒトβ−カゼイン遺伝子フラグメントは、この遺伝子の完全なエキランとイ ントロンの構造をもっている。ヒトβ−カゼイン遺伝子は８個のエキランと７個 のイントロンで構成されている（表２参照）。翻訳開始点はエキラン２の中に位 置しており（ｂＰ　４８０４）　、および翻訳終止点はエキラン７の中に位置し ている（ｂｐ　９４４３）。これらのエキランは比較的小さく、大きさの範囲は ２１〜５３１ｂｐであり、イントロンの大きさは９８〜４６７０ｂｐの範囲内に ある（表２参照）。

表３から分かるように、エキラン／イントロンの境界はすべてＡＧ／ＧＴ規則に したがっており、マウント（Ｍｏｕ口【）ら（１９８２年）が示唆した共通配列 によく一致してる。

エキラン由来の配列をｃＤＮＡ誘導の配列と比較したとき、一つだけ差異かみと められた。すなわちエキラン８中の２８５　ｎｔはＣであるか、ｃＤＮＡの配列 ではＴである。この位置は翻訳終止コドンの下流に位置しているので、この差異 はアミノ酸配列に影響を与えない。

（以下余白、次頁に続く） 表２ ヒトβ−カゼイン遺伝子のエキソンーイントロン構成。

ヌクレオチド位ｉｌｌは、ラムダＥＭＢＬ−３のアームに対する融合点である５ ａｕ３Ａ（ＧＡＴＣ）認識配列中のＧと指定され、位置はそれからのヌクレオチ ドの数で示されている（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：Ｉ参照）。

マウス（ヨシムラおよび才力、１９８９年）およびウシ（ボンシング（Ｂｏｎｓ ｉｎｇ）ら、１９８８年）のβ−カゼイン遺伝子の構成はすでに記載されている 。マウスとウソのβ−カゼイン遺伝子は９個のエキランを含存している。しかし ながら、その翻訳開始点は、ヒトβ−カゼイン遺伝子と同様にマウスとウシの両 方の遺伝子内のエキフン２内に位置している。マウス、ウシおよびヒトのβ−カ ゼインの遺伝子配列を比較すると、最も顕著な相同性はエキラン２の中にあるこ とが分かる。

（以下余白、次頁に続く） 表３ β−カゼイン遺伝子のエキソンーイントロンの境界エキソンーイントロン結合部 における配列５゛スプライスドナー　３′スプライス了クセブタ−実施例２ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）における組換えヒト β−カゼインの発現 ヒトβ−カゼインに対するブローポリペプチド（ｐｒｏ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄ ｅ）をコートするｃＤＮＡを、１０７５ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントとして、 上記のようにして単離し、ｐＵｃ１９中にクローン化してｐｓ　２＋を生成させ た。

そのｃＤＮＡ末端を以下のように修飾した（図２）。ｐｓ　２１をＥｃｏＲ［と Ａｃｃ　Ｉて消化して３２８ｂｌ）のフラグメントをアガロースゲルの電気泳動 法によって単離した。単離された３２８ｂｐのフラグメントは電気溶出法によっ てアガロースゲルから精製し、次いてＡｖａ　ｎで消化して、Ａｖａ　Ｉ［とＡ ｃｃ［による１９７ｂｐのフラグメントを単離した。

適切な制限部位を存し、成熟β−カゼインのアミノ末端をコードするイー・コリ の発現のために適合された、変更されたコドンの使用を有するオリゴヌクレオチ ドのＳＹＭ　１３２８、ＳＹＭ　１３２９、ＳＹＭ　１３３０、ＳＹＭ　＋３３ Ｌ　ＳＹＭ　１３３２およびＳＹＭ　１３３３を合成した。

その配列は以下に示すとおりである。

ＳＹＭ　１３２８　５°−ＣＴＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＣＡＣＣＧＡ Ａ−３’ＳＹＭ　１３２９　５−ＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡ ＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’ＳＹＭ　１３３０　５′−ＴＡＣＡＡＡＡＡ ＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧ−３’ＳＹＭ　１ ３３１　５−ＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＧＣ ＴＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＴ−３’ ＳＹＭ　＋３３２　５’　−’ＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＴＡＡＣ ＴＴＴＴＴＣＡＡ−３゛ＳＹＭ　＋３３３　５°−ＣＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＧ ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡ−３゜上記の６個のオリゴヌクレオチドをアニ ールし、次いでＰｓｔ［とＢａｍＨ［て切断されたｐｊｌｃ１９に連結し、得ら れたプラスミドの配列を決定してｐＳ２４と命名した。５９ｂｐのＰｓｔｌとＡ ｖａ　ＩＩによる制限フラグメントをｐｓ２４から単離した。

３°末端を修飾するために、ｐｓ　２１をＡｃｃｌで消化して６４１ｂｐのフラ グメントを単離した。このフラグメントを電気溶出し、次いてＢｇＩＩＩＩで再 消化して３０３ｂｌ）のフラグメントを単離した。

その３０３ｂｐのフラグメントを、ＡｃｃｌとＢｇｌＩ［て消化されたｐＳ　２ 〔ノンビコム社（Ｓｙｍｂｉｃｏｍ））中にサブクローン化してｐｓ　２２を生 成させた。ｐｓ　２２をＲｃｏＲｉとＢｇＩＩ［で消化し約２．９６ｋｂのフラ グメントを単離した。

適切な制限部位を導入して３゛非翻訳配列を修飾するために、オリゴヌクレオチ ドを合成し、ｐｓ　２２由来の上記２．９６ｋｂのフラグメントに連結した。

下記のオリゴヌクレオチドを使用した。

５ＹＩＪ　１３３５　５’　−ＣＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＴＡＧＴＧ ＴＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧ−３’ＳＹＭ　１３３６　５−ＧＡＴＣＴＡＣ ＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣ−３’ＳＹＭ　１３３８　５’　 −ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＧ−３’ＳＹＭ　 １３３９　５−ＧＧＴＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＴＣ ＡＣＡＧＧＧＴＡ−３’得られたプラスミドの配列を決定し、ｐＳ　２３と命名 した。

成熟β−カゼインをコートする修飾フラグメントを得るために、下記の３個のフ ラグメント、すなわち第一の、ｐＳ　２３由来の約３．　ＯｋｂのＰｓｔ［とＡ ｃｃ　ｌによるフラグメント、第二の、ｐｓ　２４由来のＰｓｔ［とＡｖａＩＩ よる８９ｂｐのフラグメント、および第三の、ｐｓ　２１由来のＡｖａ　Ｉ［と Ａｃｃｌによる１９７ｂｐのフラグメントを連結してｐＳ　２５を得た。

シグナルなどのβ−カゼインをフードする配列を、Ｎｄｅ　ｌとＢａｍＨＩ　と による６４１ｂｐのフラグメントとしてｐＳ２５から単離し、Ｎｄｅ［、！：Ｂ ａｍＨＩて消化したベクタープラスミドｐｓｌＪ中に導入し、得られたβ−カゼ イン発現ベクターをｐｓ　２６と命名した（図３）。

ベクターｐｓ　２６は、β−カゼインの発現を調節する、バクテリオファージＴ ７φ１０プロモーターとφターミネーター〔スタディール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）１ ９９０年〕を保育している。またこのベクターは、ｐＢＲ３２２の複製開始点お よびアンピシリン耐性をコードする配列を含有している。このベクターを適正な 酵素で分析して関連するセグメントの配列を決定した。

組換えヒトβ−カゼインを分泌させるためにエシェリキア・コリの熱安定エンテ ロトキシンＩＩ　（ＳＴＩＲ）のシグナルペプチドをコードする配列を導入した 。

ｐｓ　２５をＡｖａ　ＩとＥｃｏＲ［で消化し、β−カゼインのアミン末端を除 いて主要部分をコードする６ｔｑｂｐのフラグメントを単離した。このフラグメ ントを、合成のオリゴヌクレオチドとともに、Ｎｄｅ　［とＥｃｏＲ［で切断さ れたｐＬｌｃ１９中にクローン化した。その合成オリゴヌクレオチドは、５ＴＩ Ｉのシグナル配列と融合可能な適正な制限部位を有する、成熟β−カゼインのア ミノ末端そのものをコート′する。下記のオリゴヌクレオチドを使用した。

ＳＹＭ　１４９５　５−ＴＡＴＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＴＣＣＣ ＴＧＡＧＣ−３’ＳＹＭ　１５００　５−ＴＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＴＣＧ ＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＧＴＧＣＡ−３゜上記の３種のフラグメントを連結するこ とによってプラスミドｐＳ２７を得た。このプラスミドは、配列分析によって確 認された。

次のステップで、ｐｓ　２７をＮｄｅ　ｌとＨｉｎｄＩ［で切断して７００ｂｐ （７）フラグメントを単離して配列を決定した。この７００ｂｐのフラグメント を、ＨｉｎｄｌｌＩとＮｄｅ（で消化された５ＴＩＩ含有発現ベクターｐＳ２９ 中に導入した。得られた、ヒト組換えβ−カゼインに用いる発現ベクターをｐＳ 　２８と命名した（図４）。ｐ８２８はＰｓ　２６と同じ調節要素、複製シグナ ルおよび耐性マーカーを含有している。その構成は、制限分析法でｖｆｉ認され た。

発現ベクターｐｓ　２６とＩ）５２８は、次のエシェリキア・コリ菌株、Ｂ１． ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２＋（ＤＥ３）ｐｌｙｓＥおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌ ｙｓｓ　（スタディール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）　、１９９０年〕中にて形質転換さ れた。発現実験を、スタディール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら（１９９０年）によって 記載されたようにして実施した。得られた結果は、組換えヒトβ−カゼインか、 ２種の異なる発現ベクターｐｓ　２６とｐｓ　２８によって可溶性タンパク質と して在勤に発現されることを示した（図５）。

しかしながら、イー・コリが産生したβ−カゼインはい（ぶん低い見掛けの分子 量を示している。

実施例３ サツカロミセス　セレビン、ｒ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）内ての組換えヒトβ−カゼインの発現 全β−カセインボリペブチトをコートするフラグメン１〜を、アガロ−スゲルミ 気泳動法を用い、ｐｓ１３３から、６９８ｂｐのＫｐｎｌと５ａｌｌによるフラ グメントとして単離した（図８およびさらに実施例４に記載する）。単離された フラグメントを、Ｋｐｎ　ＩとＸｈｏｆて消化されたｐＹＥｓ２．ｏ　（イン　 ビトローゲン　コーポレーシヨン（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ）　、米国〕と連結した。得られたβ−カゼイン発現へフタ−をｐＳ　２ ３２と命名しく図６）、制限酵素の地図を作成することによって分析した。

発現ベクターはポリリンカーを含有し、サツカロミセス　セレビシェ中で高いレ ベルの発現を行うよう設計されている。そのベクターは、イー・コリおよび酵母 の両者に保持されるように設計されている。

上記ベクターは、ポリリンカー中に挿入された遺伝子の発現を誘導可能にするた め、サツカロミセス　セレビシェ由来のＧａ１１／Ｇａｌ　１０プロモーター領 域のＧａｌ　１部分を含有している。またこのベクターは、ＣＹＣ１転写終止シ グナル、２μの複製開始点と分配要素および酵母中での選択に用いるＵＲＡ　３ 遺伝子を含有している。ｐｔｌｃ１９由来のアンピシリン耐性遺伝子と複製開始 点ならびにＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとＦ【オリジン（Ｆｌ　ｏｒｉ ｇｉｎ）が、それぞれ、保持と選択、転写と一本鎖の救援を行うためにイー・コ リ中に存在している。

Ｇａ１ｌプロモーターは、転写開始の調節にｌ・要な配列とｍＲＮＡ出発部位と をもっているか、翻訳を開始するためのＡＴＧを含有していない。したかって、 翻訳開始点は、挿入された配列に配置しされなければならない。

発現ベクターｐＳ　２３２は１．サツカロミセス・セレビシェの宿主菌株ＵＭＹ 　５１９　（ＬＩＲＡ−、Ｇａじ）中で形質転換され（ニー、ピストレム（Ａ、 ＢｙｓｔｒＯｍ）　、個人的な通信〕、ウラシル欠失培地中で選択か行われた。

制限条件下で増殖するコロニーを単離し−Ｃ分析した。

陽性のコロニーを、ウラシルを欠き、約ｏ、５０Ｄｇ。。の濃度まて２％のグル コースを含有する最小培地で培養した。その培養物を遠心分離にかけて、生成し たペレットを蒸留水で洗浄した。洗浄したペレットを分割した。一方の部分をさ きに述べたのと同し培地中に再懸濁させ、残りの部分をグルコースの代わりに２ ％のガラクトースを用いることを除いて同し培地中に再懸濁させた。これらの二 つのペレットを約０、ｌＯＤ、。。の濃度に再懸濁した。これらの二つの培地を ３．０ＯＤｓ。。の濃度まて一夜培養し、培地を回収した。

上記培養物を遠心分離した後、得られたベレットを再懸濁させ、その上澄み液を 、ＳＯＳ、尿素およびメルカプトエタノールを含有する試料緩衝液〔レムリ（Ｌ ａｅｍｍｌｉ）ら、１９７０年〕と混合し、２０分間沸騰させた。得られた試料 を５ＤＳ−ＰＡＧＥのｌＯ〜１７．５％濃１ｊ勾配のゲル中に負荷した〔レムリ （Ｌａｅｍｍｌｉ）ら、１９７０年〕。

分離を行った後、ゲルをクーマシープル−（シグマ社、米国、セント・ルイス） で染色するか、またはニトロセルロース膜へのタンパク質転移の処理を行い、ア フィニティゲルに結合された高度に純粋の天然のカゼインに対して、アフィニテ ィで精製されたポリクローナルウサギ抗β−カゼイン抗体を用いて抗体を検出し た。得られた結果は、酵母内での組換えヒトβ−カゼインの有効な発現を示した 。試料は、精製された天然のヒトβ−カゼイン〔［酸で沈殿させたヒト天然のβ −カゼインをさらにイオン交換樹脂クロマトグラフィーで精製することによって 得られた〔ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）　、１９３８年、クンヅ（Ｋｕｎｚ） とレネルダル（ＬＯｎｎｅｒｄａｌ）　、　１９９０年］〕とともに共電気泳動 を行い、組換え分子が同し方式で泳動じ、それは正しくかつ自然のままのタンパ ク質であることを示したく図７）。

発現のレベルは、組換えヒトβ−カゼインの培養物のＩ！！当り５０■より大き いと推定された。

実施例４ 遺伝子導入マウス内での組換えヒトβ−カゼインの発現ＥｃｏＲ１部位において クローン化された７、　２ｋｂのゲノムフラグメントどして、マ・クス乳漿の酸 性タンパク質（ＷＡＰ）の遺伝子を含有するプラスミドをロザー　ヘンニゴーセ ン（Ｌｏｔｈａｒ　Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ）博士から入手した〔キャンベル （Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、１９８４年〕。このプラスミドをＥｃｏＲｌとＫｐｎ 　［で消化し、アガロースゲル上で分離して約２．６ｋｂの上流の調節要素を得 た。またそのプラスミドを５ａｉｌとＨｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル上で 分離し、約２．３ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントとして、３番目のエキラン 、最後のイントロン、４番目のエギランおよび下流に位置するｍＲＮＡプロセッ シングシグナルを含有するフラグメントを得た。これら２種のフラグメントを、 ＥｃｏＲ１部位を除いてポリリンカー中の制限部位を除くために、ヒ）−ｃＤＮ Ａフラグメントとともに、ｐＵｃ１８とｐＵｃＩ９の融合体として構築されたプ ラスミド中にクローン化して、ｐＳ８８を得た。

Ｋｐｎ　［と５ａｌｌの部位を付加することによってヒトβ−カゼインのＷＡＰ 調節要素へのクローン化を容易にし、かつ開始コドンの上流のマウス５′非翻訳 部分ど同一の配列を導入するために、元のｃＤＮＡクローンｐｓ２１をポリメラ ーゼ連鎖反応を用いて修飾した。

二つのＰＣＲプライマー、すなわち下記の配列を有するＳＹＭ２０４４とＳＹＭ 　２０４５を合成した。

ＳＹＩ、ｌ　２０４４ ５−ＣＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧＡＣＴＴＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴ ＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧ−３゛ ５Ｙ）Ｊ　２０４５ ５’　−ＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＣＴＡＡＴＧＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＣ ＴＧ−３’上記の二つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応において、プ ラスミドｐＳ２１を鋳型として用いた。

次いて、５゛末端にＫｐｎ　Ｉ部位、３′末端にＳａｌ１部位、および修飾され た５′非非翻訳列を有する、ヒトβ−カゼインをコートする６９８ｈｐの得られ たフラグメントを、Ｋｐｎ　Ｉと５ａｉｌて消化されたｐＳ８８フラグメント（ 約７．５ｋｂ）中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定法で分析した。得られた発現 ベクターをｐｓ１３３と命名した（図８）。Ｋｐｎ　ｌとＳａｌ［とによるＰＣ Ｒで生成したフラグメントの配列を図９に示す。

発現ベクターｐｓ１３３は、遺伝子導入動物内での組換えヒトβ−カゼインの段 階および組織特異的発現を仲介することができる。その調節要素は、泌乳中、乳 腺に遺伝子発現を命令するので、それによ−って非相同のタンパク質を乳汁から 単離することかできる。

発現ベクターを胚に注射する前に、ｐｓ］３３をＥｃｏＲＩて消化し、次いてＷ ＡＰ−β−カゼインフラグメントをアガロースゲル上て単離し、続いて電気溶出 を行った。溶出されたＤＮＡを沈殿させて、微量注射を行うためにｌ０ｍＭ　ト リス（ｐＨ７，５）およびＯ，１ｍλＩＥＤＴＡに再溶解した。

ｐｓ１３３のベクター要素の変異対を構築し、ｐｓ３１６（図１６）と命名した 。ｐｓ３１６はｐｓ１３３に比へて三つの特徴に関して修飾されている。第一に 、ＷＡＰ上流の調節要素が約２．６ｋｂから約４．３ｋｂまで長くなった。第二 に、β−カゼインｃＤＮＡフラグメントか、第一エキソンＫｐｎ　１部分にクロ ーン化リンカ−を導入することにより、第一エキランのＫｐｎ　［に挿入されて 、ＷＡＰ構造の残りの部分はそのまま残っている。第三に、ヒトβ−カゼインｃ ＤＮＡの翻訳開始部ＡＴＧが、余分の非翻訳ヌクレオチドを添加することなしに Ｋｐｎ１部位の後に直接クローン化される。

ｐｓ３１６フラグメントは内部ＥｃｏＲ１部位を含有しているので、プラスミド ｐＵｃ１９由来の配列から単離するのを容易にするために、ＷＡＰ／’β−カセ インフラグメントをフランキング制限部位をＮｏｔｌに変えた。

ゲノムＤＮＡを含有する遺伝子導入マウスを作製するため、にヒトβ−カゼイン の上流と下流の調節要素か隣接しているヒトβ−カゼインエキラン／イントロン ゲノム構造を含有するプラスミドｐＳ３５８を５ａｉｌて消化して、機能ＤＮＡ フラグメントを得た。この＋４ｋｂのフラグメントをアガロース電気泳動法で単 離し、電気溶出し、沈殿させ、次いて微量注射に用いるため１０ｍＭトリス（ｐ Ｈ７，５）とＯ，１ｍＭ　ＥＤＴＡに再溶解した。

遺伝子導入動物を得るために用いた実験手順は、ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、１ ９８６年に記載されている。

過排卵を行わせるために、５１Ｕの妊娠雌鳥の血清ゴナドトロピンでプライムし 、４８時間後に５［Ｕのヒト繊毛膜ゴナドトロピンでプライムしたトナーマウス から得たＣ５７Ｂ１／６ＪｘＣＢＡ／２Ｊ−ｆ。

の胚の前核に、単離したフラグメントを３　ｎｇ／μｌの濃度て注射した。Ｃ５ ７Ｂ　ｌ／　６Ｊ　ＸＣＢＡ／　２Ｊ　−ｆ　を動物は、ボムホルトガード　ブ リーディング　アンド　リサーチ　センター社（ＢｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄＢｒ ｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｌｔｄ、）　（デン マーク、Ｒｙ）から入手した。上記の胚を卵管から集めた後、胚は、培地Ｍ２内 でヒアルロニダーゼで処理することによって押庄細胞から分離した〔ホーガン（ Ｈｏｇａｎ）ら、１９８６年〕。上記の胚を洗浄後、培地Ｍ１６に移しくホーガ ン（Ｈｏｇａｎ）ら、１９８６年〕、５％Ｃｏｔ大気のインキュベーター内に保 持した。注射は、ナリシギ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｌ）液圧顕微操作器と、ノマルス キー０ＪｏＩｎａｒｓｋｉ）光学機器を備えたニコン倒立顕微鏡とを用いて、軽 パラフィン油下のＭ２の微小液滴中て行った。注射後、健康に見える胚を、２． ５％了バーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）０．３７　ｍｌを腹腔内投与された偽妊娠 Ｃ５７Ｂ　ｌ／６Ｊ　ｘＣＢＡ／２．１−ｆ、宿主内に着床させた。

遺伝子導入マウスは、切取った尾の試料から調製されたＤＮＡ分析により同定さ れた。組織の試料をプロテイナーゼにとともにインキュベートし、フェノールク ロロホルムで抽出した。

発現ベクターフラグメントを示す非相同の導入ＤＮＡが存在する場合に、単離さ れたＤＮＡを、特異的フラグメントを増幅するプライマーとともにポリメラーゼ 連鎖反応に使用した。またこれらの動物をＤＮＡハイブリッド形成試験で分析し て、ＰＣＲデータを確認し、起こりつる再配列、組込まれたベクター要素の構造 について試験し、かつ組込まれたベクター要素のコピー数についての情報を得た 。

１組の実験で、２０匹のマウスを二つの方法で分析し、その試験結果から、１１ 匹のマウスがｐｓ！３３由来の非相同ＤＮＡベクター要素をもっていることが論 証された。ＰＣＲ分析とハイブリッド形成試験とから得た結果は同一であった。

ハイブリッド形成試験の結果から、再配列は全く認められず、そして組込まれた ベクターのコピー数は、１〜４０ベクターコピー／細胞という大きな変動を示し ている。

他の組の実験では、ｐｓ３１６由来のベクター要素を含有するＮ。

ｔ１フラグメントが注射された。８４個の卵子を口頭の里親の母親（ｆｏｓｔｅ ｒ　ｍｏｔｈｅｒ）に着床させて２１匹の子供が生まれた。

これら始祖になる可能性のある動物を、ＰＣＲ（図１７）およびＤＮＡハイブリ ッド形成法（図１８）で分析した。３匹のマウスが遺伝子導入動物であり、９Ｓ ３１６由来の組換えＷＡＰ／β−カゼインベクター要素を保有していることが分 かった（図１７および１８）。２匹のマウスが雌であり、１匹が雄であった。ハ イブリッド形成シグナルは、始祖動物間でのベクターコピー数について変動を示 している（図１８）。再配列の徴候は全く検出できなかった（図１７および１ｍ １８）。

第三の実験ては、ｐｓ３５８から単離された、１４ｋｂの５ａｉｌゲノムヒトβ −カゼインフラグメントを注射した実験で得られた１１匹の動物を、前記のよう にして分析した。このスクリーニングに使用したＰＣＲプライマーは、ＳＹＭ　 ２８８７とＳＹＭ　３１２０であった（表１参照）。この試験によって、ヒトβ −カゼインゲノムフラグメントを保存する２匹の遺伝子導入始祖動物を同定した 。

上記の３ｆｉのすへての実験からの子孫は、以下のようにして確立された。

ベクターＤＮＡ要素を保有していることが同定されたマウス、すなわち始祖動物 を交配させ、Ｆｌの同腹子を同じ方法で導入遺伝子について分析した。予想通り に、はとんど５０％の子孫が遺伝子導入動物であることが分かった。安定した系 の遺伝子導入動物か生成されたのである。

乳汁の試料は、腹腔内に２１［Ｊのオキシトシンを注射し、１０分後に２．５％ アバ−チン０．４０ｍ１を腹腔内に注射して麻酔した、雌の泌乳中の動物から収 集した。乳汁収集装置を、シリコーン処理をしたチューブを介して乳首に取付け て、乳腺をゆるやかにマツサージすることによって、乳汁を１．＋ｍｌのエッペ ンドルフ管中に集めた。乳汁の量は、泌乳日によって変動して０．１〜０゜５ｍ ｌ／マウス・収集てあった。収集した乳汁は、組換えヒトβ−カゼインの存在に ついて分析された。この分析は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ニトロセルロース膜への転 移および天然のヒトβ−カゼインに対して生成したポリクローナル抗体とともに インキュベートを行って実施した。得られた試験結果は、ｐｓ３１６由来のＤＮ Ａベクター要素を保有する遺伝子導入マウスからの乳汁中に、組換えヒトβ−カ ゼインが発現されることを論証したく図１０）。

その発現レベルは、２匹の異なる遺伝子導入動物の分析結果てはほぼ同してあっ た。

遺伝子導入動物内で産生された組換えβ−カゼインは、天然のヒトβ−カゼイン と比へて、同一の泳動を５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で示した。ｐｓ１３３由来のＤＮＡ ベクター要素による遺伝子導入動物は、発現レベルか低かった。

ヒトβ−カゼイン遺伝子を含存するゲノムフラグメントを用いて、遺伝子導入動 物由来の乳汁中に組換えヒトβ−カゼインを高レベルに発現させるために、以下 の発現ベクターを構築する。第一の発現ベクターは、マウスＷＡＰ上流調節配列 の転写制御下に、すへての無傷のイントロンを育するエソキンｌからエキラン８ まての全ゲノム配列（ＳＥＱ　＋ｌ）　Ｎｏ・ｉ中のヌクレオチド８７〜１０５ ３９　）をもっている。これは、ＰＣＲを介して、β−カゼインのエキラン１の 前にＫｐｎ　［部位を導入して、マウスＷＡＰエキランの第一エキソン内に位置 しているＫｐｎ１部位への連結を容易にすることによって得られる。下流調節要 素およびｍＲＮＡプロセッシングシグナルは、ヒトβ−カゼインゲノムフラグメ ントによって提供され、３′側に位置するＳａｌ［部位まての全配列（図１９） か該ベクター内に含まれている。このベクターの構築を図２０に図式的に示す。

要約すると、該ベクターは下記の三つのフラグメントを連結することによって構 築される。すなわち、第一は、第１ヒトβ−カゼインエキソンの５′末端のＫｐ Ｎ１部位から第１イントロン内に位置する独自の５ｅａｌ部位までを有するβ− カゼイン遺伝子の５゛部分、第二は、ヒトβ−カゼイン遺伝子の残りの部分と、 ｐＳ３５８由来の約１０．３ｋｂの５ｅａｌおよび５ａｌｌによるＤＮＡフラグ メントとして単離された下流の要素：第三は、マウスＷＡＰ上流調節配列と、Ｋ ｐｎ　ＩおよびＳａ、ｌＩで消化されたｐ３３１６由来の細菌中でベクターを増 殖させるためのプラスミド配列である。

第二の発現ベクターにおいて、ヒトβ−カゼイン遺伝子のエキラン２内に位置し ている翻訳開始点は、マウスＷＡＰ遺伝子の第一エキソン中に位置しているＫｐ ｎ　Ｉ部位に直接連結される。

マウスＷＡＰの天然の翻訳開始点はＫｐｎ　Ｉ部位のすぐ下流に位置している。

このベクターは、この位置が最適の翻訳開始シグナルを与えるか否かを分析する ために構築されている。この構造体と第一のベクターとの間の差は、ヒトβ−カ ゼイン遺伝子の第一エキランとイントロンを欠いていることと、翻訳開始シグナ ルＡＴＧの前方の配列が変更されていることである。このベクター構造体は図２ １に図式的に例証されている。

このベクターは、次のようにして構築される。まず、翻訳開始コドンのすぐ前に Ｋｐｎ　１部位を導入するために、合成のオリゴヌクレオチドを合成した。この １４ｂｐのオリゴヌクレオチドは、開始コドンＡ　Ｔ　Ｇから、エキラン２内の 隣接して位置しているＤｒａ１１部位まての間にヒトβ−カゼイン配列を含有し ている。

エキラン２の叶ａｌ１部位からインドロン５内に位置する独自の５ｐｈＩ部位ま での間にヒトβ−カゼイン遺伝子配列を含有する他のＤ　Ｎ　Ａフラグメントを 単離した。これらの二つのフラグメントを、Ｋｐｎ［および５ｐｈｔて消化され たｐＵｃ１９中に導入して配列分析を行った。次いて、得られたプラスミドＫｐ ｎｌおよび５ｐｈＩて消化されて、約３．５ｋｂの１＝トβ−カゼインフラグメ ントが単離される。ヒトβ−カゼインの遺伝子の残りの部分は、ＰＳ３５８を５ ｐｈｌおよび５ａｄ（て消化することによって得られ、約３．５ｋｂのフラグメ ントが単離される。これらの二つのフラグメントは、マウスＷＡＰ上流の調節要 素の制御下にある発現ベクターに挿入される。このことは、ｐｓ３＋６をＫｐｎ 　Ｉおよび５ａｌｌて消化して約＋２ｋｂのフラグメントを単離し、次にこのフ ラグメントを前記二つのフラグメントに連結する、二とによって行われる。Ｉ） Ｓ３１６から生成したフラグメントは、細菌内でベクターを増殖させるプラスミ ド配列も含有している。

実施例５ イー・コリ由来の組換えβ−カゼインの精製組換えヒトβ−カゼインを発現する イー・コリ細胞を上記実施例２に記載したようにして製造し遠心分離によって培 養物から分離し、得られたベレットの凍結と融解を数回行って細胞を破壊した。

細胞を破壊する他の方法には、浸透圧ショック法、圧力変更法および音波処理法 がある。追加の遠心分離を行った後、上澄み液を収集し、０．０５Ｍから出発し て濃度を変えた硫酸アンモニウムを添加してβ−カゼインを沈殿させた。

５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０〜１７％）（図１１Ａ）と液体クロマト グラフィー（図１２）を実施して純度を分析し、ウェスタンプロット法で同定し た。ウェスタンプロット法に用いた抗体は、前記実施例２に記載したようにして 乳汁から精製された、高度に精製した天然のヒトβ−カゼインを用いてウサギ中 に生しさせ、固定化されたヒトβ−カゼインでのアフィニテイクロマトグラフィ ーによって精製された。宿主タンパク質との交差反応性は全くみられなかった。

実施例６ ウシ卵母細胞の生体外での成熟、受精および培養屠殺場で得た卵巣の濾胞を吸出 す二とによって、未成熟の卵母細胞を大量（４００〜６００／日）に得る。未熟 の卵母細胞は、受精される８１能か得られるまで生体外である期間培養される。

卵母細胞は、“成熟した″ならば、生体外で予め成熟させたか、ξたは“受精能 を得させた″精子と受精させる。次に、受精卵母細胞の前核に、ヒトβ−カゼイ ンの発現と分泌をコードする導入遺伝子を注射する。上記の生体外での受精と微 量注射て得られた接合体を、後期の桑実胚または胚盤胞の段階まて（５〜６日間 ン、卵管組織によって調製されたかまたは“条件づけられた”培地で培養される 。次に、胚盤胞は、妊娠を平衡させるため：二非外科的な方法で宿主のウシの種 に移されるか、またはここで記載したように導入遺伝子の組込みについて分析さ れる。

生体外での成熟（ＩＶＭ） 卵巣は、地元の屠殺場て屠殺直後に入手され、卵母細胞が回収される。また、卵 母細胞は、外科的方法、内視鏡法、または経腔超肝波法によって、生きているウ シの種から得られる。ずへての場合、卵母細胞は卵巣の濾小胞（直径か２〜ｌＯ 工）から吸引される。卵母細胞は、洗浄後、１０％ウシ胎児血清を補充したＭ２ Ｏ３からなる培地のような成熟培地内に入れられ、３９℃で２４時間培養される 〔シラルド（Ｓｉｒａｒｄ）ら、パイオル、レブロノド。

（Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、）　３９巻、５４６〜５５２頁、１９８８年）。

生体外での受精（ＩＶＦ） 成熟させた卵母細胞は、新鮮または融解された精子と受精させる。精子は、まず ”スライム−アップ（ｓｗｉｍ−ｕｐ）”分離法で自動運動性が高められた精子 集団を得ることによって受精用に調製された〔バリシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）ら、 セリオゲノロジ−（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏ　１ｏｇｙ）、２５巻、５９１＝６０ ０頁、１９８６年〕。次いで、自動運動性の精子は、精子に受精能を獲得させる ために、ヘパリンを補充した改変タイロード溶液〔バリシュ（Ｐａｒｒｉｓｂ） ら、１９８６年の上記文献〕からなる受精培地に添加される、〔バリシュ（Ｐａ ｒｒｉｓｈ）ら、パイオル、レブロツド、　（Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、）　 ３８巻、！１７１−１１８０頁、１９８８年〕。この受精能獲得は、受精を行う のに不可欠の最終的な精子成熟過程である。精子と卵母細胞は、１８時時間項養 される（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）。このＩＶＦ法の有用な特徴は、（凍結精液の 場合）特定の精液について最適の受精条件が一旦きめられると、矛盾しない再現 性のある試験結果か得られることである〔バリシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）ら、１９ ８６年の前記文献〕。

生体外での培養（ＩＶＣ） 従来の培養系は、マウス、ウサギおよびヒトの卵子の発育を保持するが、８〜１ Ｇの細胞段階を経過したウシ胚の発育は保持しない。この問題は、培地を卵管組 織で前処理することによって克服されている。卵管−条件化された培地は、生体 外で８〜１６の細胞段階をすぎて胚盤胞段階までのウシ胚を保持する〔アイスト ンおよびファースト（ＥｙｅｓｔｏｎｅおよびＦｉｒｓｔ）、ジェイ。

レブロソド、フェルト（Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、）　８５巻、７１５ 〜７２０頁、１９８９年〕。

ウシの胚は、カムス（Ｃａｍｏｕｓ）ら〔ジェイ、レブロツド、フェルｈ、　（ Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、）　７２巻、４７９〜４８５頁、１９８４年 〕によって胚を栄養膜組織と共培養すると２１６個の細胞に分割することか論証 されるまでは、８〜１６の細胞の“ブロック（ｂｌｏｃｋ）”を経過した後生体 外で培養する試みはなされなかった。

上記の共培養法は、接合体から胚盤胞までの発育を保持する同型または異型の卵 管の能力に基づいて、卵管組織にまで広がった。したがって、ウシ胚は、生体外 において、卵管組織とともに共培養されるか、または卵管組織で条件化された培 地内で、接合体から胚盤胞まで発育した〔アイストンおよびファースト（Ｅｙｅ ｓｔｏｎｅおよびＦｉｒｓｔ）、ジエイ、レブロツド、フェルト。

（Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、）　、８５巻、７１５〜７２０頁、１９８９ 年ニアイストン、ダブリュ、エイチ、　（Ｅｙｅｓｔｏｎｅ、Ｗ、ｔ（、）（１ ９８９年）“ファクターズ　アフエクティング　ザ　デベロブメント　オプ　ア ーリー　ホビン　エンブリオ　インビボ　アンド　インビトロ（Ｆａｃｔｏｒｓ 　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　 ｂｏｖｉｎｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ） −Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、ライスコンシン大学〕。胚盤胞は、過俳卵およ び人工的授精注入の後に、または未成熟卵母細胞の生体外での成熟（ＩＶＦ）と 受精（ＩＶＦ）によって、上記の系に産生された。このようにして産生された胚 盤胞は、宿主の動物に移された後妊娠し、子ウシが生まれる。

得られた結果は次のとおりである。

（以下余白、次頁に続く） 効率　数 （％）　（１００当り） ＩＶＭ　９０　９０ 胚転移　５０　１１ （妊娠の％） したがって、最初の毎日５００個の卵母細胞の収穫から、約５５の妊娠が達成さ れることが予想される。

卵管組織の調製 共培養と条件化された培地 ！１層絞殺後たは卵管摘除術によって卵管を得る。

２、無傷の卵管を、スライドガラスでゆるやかにこすって管腔組織を収穫する。

３、組織を、改変タイロードヘベス溶液１０−で５回洗浄する〔バリシュ（Ｐａ ｒｒｉｓｈ）ら、パイオル、レブロツド、　（Ｂｉ。

１、　Ｒｅｐｒｏｄ、）　３８巻、１１７１〜１１８０頁、１９８８年〕。

４、最終の組織ベレットを、Ｍ１９９４１０％ウシ胎児血清中に、ｌ容積の組織 ：５０容積の培地の比率で再懸濁させる。

５、組織の懸濁液は胚の共培養に使用できる。

６、また、培地を４８時間条件化してもよい。上記懸濁液を遠心分離に付した後 、上澄み液を胚の培地として使用することができる。条件化された培地は、所望 によって一７０℃で貯蔵してもよい。条件化された培地は、胚の培養に用いる場 合、全強度で用いなければならない（希釈なし）〔アイストン（Ｅｙｅｓｔｏｎ ｅ）の１９８９年の前記文献〕。

実施例７ ヒトβ−カゼインの導入遺伝子のウシ前核への微量注射ヒトβ−カゼイン発現系 を含有するＤＮＡフラグメントを、適当な制限酵素で消化することによってベク ターから切取り、次にアガロースゲルで分離する。そのフラグメントはく電気溶 出法、フェノールとクロロホルムによる抽出およびエタノールによる沈殿法〔マ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら〕によって精製される。該ＤＮＡフラグメン トを、１〜２μｇ／−の濃度となるよう１０ｍＭトリス、Ｏ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ ｐＨ７，２に溶解し、この液で透析する。微量注射針を上記の透析されたＤＮＡ 溶液で満たす。

生体外での受精を行う前に、卵子を最大速度で２分間渦動させるか、または漂準 の微量ピペットで数回上下に卵子をピペッティングすることによって卵子から卵 母細胞を除く。ウシの前核は原則としてマウスの前核と同様に注射されるが〔ホ ーガン。

ビー　（Ｈｏｇａｎ、　Ｂ、　）ら、１９８６年、マニビュレーティング　ザ　 マウスエンブリオ（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒ ｙｏ）コールドスプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）　、その前核を視覚化するために遠 心分離が追加される。この注射は受精してから１８〜２４時間後に行われる。こ の時間は、精液源として使用される雄ウシによって変わる。異なるハツチの精液 によって、咳は異なる時間に目視可能になる。

生体外で成熟させて受精させたウシ卵母細胞を、エッペンドルフ管中、■−のタ イロードーヘペス溶液〔パリシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）　、　１９８７年〕内で１ ４５００ｇで８分間遠心分離に付した〔つオール（Ｗａｆｔ）ら、パイオル、レ ブロツド（Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　）、３２巻、６４５〜６５１頁、１９ ８５年〕。パラフィン油で覆った穎微鏡スライドガラス上の一滴のタイロードー ヘペス溶液に胚を移す。液圧装置を用いて、卵母細胞を、両方の前核が目視可能 になるような［干渉差（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ　）また は位相差の光学的機器を用いる〕方式で卵子ホルダーに固定する。必要に応して 、前核を目視可能にするために、卵母細胞を、卵子ホルダー上でころがしてその 位置を変える。−個の前核に合わす焦点と同じ焦点に注射針を合わす。次に、針 を透明帯すなわち細胞質を通過して前核内へ進行させる。小容積の１３　ｐｉ（ ２〜１００のＤＮＡコピーを含有している）を、針からのＤＮＡ溶液の一定流動 またはパルス流動（スイッチを使用する）を用いて前核に注射する。また、二つ の細胞段階の胚を前記のように遠心分離し、次に両方の制球の核に前述のように 注射する。次に、注射された胚は、桑実胚もしくは胚盤胞の段階まて発育させる ために実施例６に記載されているように一滴の共培養培地に移される。

実施例８ ヒトβ−カゼインの導入遺伝子による遺伝子導入の初期の検出 実施例７に記載されているように構造体を微量注射するとき、卵母細胞は培養さ れている。各胚の適正な部位が切断されて溶解され〔キング、ディー（ｋｉｎｇ 、　ｐ、）ら、モレキュラー　リプ口ダラシ３ン　アンド　デベロブメント（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉ。

ｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、１＠、５７〜６２頁、１９８８年〕、 タンパク質分解反応に付され〔ヒグチ、アール、　（Ｈｉｇｕｃｈｉ、　Ｒ，） 、“アムブリフィケーションズ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）’　ア　フォ ルム　フｔ　−ＰＣＲウセルス（ａ　ｆｏｒｕｍ　ｆｏｒ　ＰＣＲＵｓｅｒｓ） 　２巻、１〜３頁、１９８９年）、消化される。ＰＣＲは、二つのプライマーす なわち一方はエキラン３の中にあり（ＳＹＭ　３１２０）　（表１参照）および 他方はエキラン４の中にある（ＳＹＭ　２８８７）セットを用いて実施例４で先 に記載したとおりに実施される。

実施例９ ウシの種の乳汁中でのヒトβ−カゼインの産生微量注射された卵母細胞から発育 したウシ桑実胚は、ドナウ（Ｄｏｎａｈｕｅ）の方法〔ジエネティック　エンジ ニアリング　オブマニアルズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ 　Ａｎｉｍａｌｓ）、ジエイ、ウオーレン　エバンス（Ｊ、Ｗａｒｒｅｎ　Ｅｖ ａｎｓ）ら編集１９８６年、ブレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）社中のドナウ、ニス、　 （Ｄｏｎａｈｕｅ、Ｓ、））にしたがって分割される。桑実胚の％は培養物中に 保持され胚盤胞まで発育させる。他方の洛は実施例８に記載されているようにＤ ＮＡ分析に付される。この分析の結果が分かるときに、培養物中に保持されてい る桑実胚は、胚盤胞まで発育するか、脱核された接合体に核転移する源として発 育する。同調化されたウシへの胚盤胞の転移はペソテリッジ（Ｂｅｔｔｅｒｉｄ ｇｅ）の方法にしたがって実施される〔“エンブリオ　トランスファー　イン　 ファーム　アニマルズ（Ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｔｅｒ　ｉｎ　ｆａｒｍ　ａ ｎｉｍａｌｓ）ニア　レビューオブ　テクニックス　アンド　アプリケージ台ン ズ（ａ　ｒεｖｉｅｗｏｆ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａＨ ｏｎｓ）　’中のベッテリツジ、ケー。

ジエイ（Ｂｅｔｔｅｒｉｄｇｅ、　Ｋ、Ｊ、）、１９７７年〕。

ヒトβ−カゼインは、実施例４に記載の方法を用いて、泌乳中の遺伝子導入動物 の子孫の乳汁中に検出される。

寄託 ｐＳ　２１　、　ｐＳ　２６　、ｐＳ　２８　、ｐＳ　１３３およびｐＳ　２３ ２と命名されたプラスミドＤＮＡは、ドイチュ　ザムルング　フォノ　ミクロ− オルガニスメン　ランド　セルクルトウーレン　ゲーエムビーハ−（Ｄｅｕｔｓ ｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎ ｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ）　（ドイツ、Ｄ−３３００ブラウン シユベーク、マッシエローデル　Ｗｅｇ　ｌｂ）のコレクションに、ブダペスト 条約の規定にしたがって、１９９１年８月１９日付けで寄託され、それぞれ受託 番号ＤＳＭ　６６５３　、ＤＳＭ　６６５４、ＤＳＭ　６６５５、ＤＳＭ　６６ ５６およびＤＳＭ　６６５７に　よって識別された。ｐｓ３１６およびｐ３３５ ８と命名されたプラスミドＤＮＡは、ＤＳＭに１９９２年７月９日付けで寄託さ れ、それぞれＤＳＭ　７１６３とＤＳＭ　７１６４という受託番号を受けた。

（以下余白、次頁続く） 配列一覧表 （１）一般ｆ片報 （ｉ）出願人　ベルストレーム、スヴエンイヤルマッラン、カリシ （１、発明の名称　ヒトβ−カゼインを生成するヒトーカセイン産生プロセスを コードする遺伝子おび乳児用調合孔におけるその用途 （ｉｉｉ）配列の数、２ （ｉｖ　）通信住所 （Ａ）宛て名、ブローマン　アント　ヴインクトフト　ニー／ニス （Ｂ）通り　サックス　アネ　ブラズ　１１．ポストボックス（Ｃ）都市　、コ ペンハーゲン　ケ−１０２１（Ｅ）国　デンマーク （Ｆ）郵便番号　ＤＫ−１０２１Ｋ （ｖ）コンピュータにより読み取り可能な形態。

（Ａ）媒介の型　フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ　アイビーエム　ビーン−コンパチブル（Ｃ’）ソフトウェ ア・パテントイン　リリース＃１．０．バージョン＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ。

（Ａ）出願番号・ （Ｂ）出願日　１９９２年８月１９日 （Ｃ）分類 （ｖｆｉ　）代理人／代行者情輯。

（Ａ）名称・ブローマン　アント　ヴインクトフト　ニー／ニス（ｖＦｎ　）電 気通信情報 （Ａ）　を話　３３　ＩＩ　０５　６６（Ｂ）テレファックス−３３１１１８８ ７（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌについての情報・（ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ＋　１０６０７塩基対 （Ｂ）様式　核酸 （Ｃ）鎖、−重鎖 （Ｄ）位相幾何　直線 （ｉｉ）分子の様式：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説、なし く　ｉｖ　）アンチセンス：無 （ｖｉ）直接の源 （Ａ）ライブラリー、ヒトゲノムライブラリー（カタログＨＬ　１０６７Ｊ、ロ ット１２２１） （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーション：ジョイン（４８０４，，４８５４，５７２０，，５７４６ ゜６７２６、　、６７４６．６８４５．　、６８８６．７９９１．　、８５２１ 、　９４４０．．９４４５　） ５　（ｘｉ）配列の記ａ　：　ＳＥ９１０　Ｎｏ：　１（以下余白、次頁に続く ） ＧＡτＣＴ丁ＡＴＴＴ　ＣＡＡＡＴＣＡＣＡＡ　ＡＡＴＴＡＧＴにＴｌ；　丁Ｃ ＡＴτＡＡＡτＡτＡＣτＡ丁Ａ丁ＡＡ　ＡＣＡＧ’ＴＣＡi：＾Ｇ　６０ ζひＡτＡＣＡＡＴ　ＴＡτＧＴｒＣＡＡＣ（ＴｒＣＡＡＡＴＡＴ　ＴＧＡＡＡ ＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＭ　ＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧ　ＬR２０ ＡＣＴｒＴｒＴｒ（ｕＡ　ＴＧＡＡＧＴＡｍ　ＴＡにττＣＡＡＡＡ　ＡＴＴＴ ＡＧＴＴＣＡ　ＡＡＡＡＴτｃＡｃ丁　ＴｒＣＡＡτＡＴＣ■@１〕８゜ ＣＴＧＧＡＴＡＴｒＡ　ｃｃｃｃ’ｒｒｒｃｒｃ　ＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧ　ＡＴ ｒＧＣＡＡＡＡＡ　ＴＴＩＴσｒＣＴＣＡτｒＣＭＣＡαｉ@３０００ ＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡ　ＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴ　ＴτＴτＴτσｒ丁τＴＡＴＡ ＡＡＡＡＧＴ　ＡＡＣＣＴ丁ＡＣＣＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡ@４７４０ ＧＴＡ？ＡＴＣＣＡＡ　ＴｒＧＡＣＣＡＡτＣＴｒＣ（：Ａ（：ＣＡＴＴ　ＣＣ ＡｍＴｒＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡ　（：ＧＡＣ１ゴＡＧＴ`　４８００ ＧＧＣＡＧＡＣＧＴＧ　ＣＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡ’ｒＴＴＴＡＴＡ　Ａ−＾ ＣＡＡτＡＧ　ＣＣＡσ口τＡにＴ　ＡＡＡτん１ｉＧｃＧ`　６２０６ ＡＡＴＩＴＣＧＴＣＴ　ＡＣＴＡｒｒｃｃｃＡ　ｃＡＡｃτＧ？σττ　ＧＡＡ ＡＡＧＴＡＡＡ　ＴＴＣＴＣ丁ＣｒＧＡ　ＡＧＡＣＣＡＡＡfＴ　７６８６ ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＧＴＡＡＧ’ＴＣ（：ＡＡ　ＡＴＴＴＡＣＴＧ（ＸＣＴＩＴＧ 口’ＧＴＴＴ　ＣＡＴｒＣＡＡにＡτＧＴＣ丁ＡＴにＴＣＡ@８５　’７１ １１ａ　Ｓｅτ ＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴ　ＭＡＡにＴ（ＳＭＧＡにＡ（ＴｒＧＡＡＴ　ＡにＴＴＡ ＣＧＭＴ　ＴＡＴＡＡＣＡＴＡＡ　ＣＴＡＡＴＴＡＴＡＴ　P０１８２ （２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さコク２５アミノ酸 （Ｂ）様式＝アミノ酸 （Ｃ）位相幾何：直線 （ｉｉ）分子の様式：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　２（以下余白、次頁に続く） Ｋａｔ　Ｌｙｓ　ＶａＬ　Ｌａｕ　Ｉｌｅ　ｔＪｕ＾Ｌａ　Ｃ戸ムｕ　Ｖａｌ　 ＡＬａムｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ＡｌａＫａｔ　５　１０　１５ Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ｔａｕ　Ｌａｕ　Ｊｕｎ　Ｇｉｎ　ＧＬｕ　ｔａｕ　 Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｋｉＬｍ　Ｇ１■ ａｎ 図ＩＡ ＨＮＰＩＳＶ会 図ＩＢ 図３ 図４ 図５Ａ 図５Ｂ 図６ 図７ 図８Ａ 図８Ｂ １０　２０　〕０　４０　５０　６０ 図９ 図１０ 図１１Ａ 図１１Ｂ ｉｎ 図１２ 図１９ 図２０ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年２月１８岨い

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアンギ オテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つもし くは三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体も しくは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と該ＤＮＡ配列の発 現を仲介することができる５′フランキング配列とからなる発現系。
2. ２．哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子からの５′フランキング配列とヒトβ−カ ゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンシン変換 酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの組合 せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体を 有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とからなり、該５′フランキング配 列が該ＤＮＡ配列の発現を仲介することができる発現系。
3. ３．ＤＮＡ配列が、少なくとも１つのイントロン配列を含有する請求項１または ２による発現系。
4. ４．ＤＮＡ配列が、少なくとも１つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを含む請求 項３による発現系。
5. ５．ＤＮＡ配列が、ハイブリッド遺伝子が発現されるときに該ＤＮＡ配列によっ てコードされるポリペプチドが産生されるように、該ハイブリッド遺伝子を保有 する非ヒト哺乳動物の成熟雌の乳腺で発現可能なハイブリッド遺伝子を形成する ために、哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子に挿入される前記請求項のいずれかに よる発現系。
6. ６．乳汁タンパク質遺伝子が、乳漿の酸性タンパク質（ＷＡＰ）遺伝子から選択 される前記請求項のいずれかによる発現系。
7. ７．ポリペプチドの類似体または変異体が、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２と 少なくとも８５％の相同性がある前記請求項のいずれかによる発現系。
8. ８．ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ストリンジェントハイブリッド形 成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１もしくはその一部とハイブリッドを形 成するＤＮＡ配列である前記請求項のいずれかによる発現系。
9. ９．ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、少なくとも一つのイントロン配列 を含有し、かつストリンジェントハイブリッド形成条件下でＤＮＡ配列ＳＥＱＩ ＤＮＯ：１もしくはその一部とハイブリッドを形成する請求項８による発現系。
10. １０．ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列１６−２２５に相当する、図１に示さ れるアミノ酸配列１−２１０からなるポリペプチドをコードする前記請求項のい ずれかによる発現系。
11. １１．ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアン ギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つも しくは三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体 もしくは変異体を有するポリペプチドをコードし、かつ少なくとも一つのイント ロン配列を含有するＤＮＡ配列。
12. １２．少なくとも一つの許容ＲＮＡスプライスシグナルを含有する請求項１１に よるＤＮＡ配列。
13. １３．実質的にＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるＤＮＡ配列からなる請求項１２に よるＤＮＡ配列。
14. １４．少なくとも一つのヌクレォチドが欠失、置換または修飾されるか、または 少なくとも一つの付加ヌクレオチドが挿入されて、ヒトβ−カゼインのカルシウ ム結合活性と比較して類似しているか、増大しているかもしくは減少しているカ ルシウム結合活性を有するポリペプチド、ＡＣＥ阻害活性を有するポリペプチド またはオピオイド活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列になってい る点で、請求項１〜４および８〜１３のいずれかに定義されるＤＮＡ配列と異な る修飾ＤＮＡ配列。
15. １５．請求項１〜４および８〜１４のいずれかに定義されるＤＮＡ配列を保持し 、かつ該ＤＮＡ配列の発現を仲介することができる複製可能な発現ベクター。
16. １６．ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアン ギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性の二つもしくは三 つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは 変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を保持し、かつ該ＤＮＡ配 列の発現を仲介することができる複製可能な発現ベクター。
17. １７．ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列１６−２２５に相当す る、図１に示されるアミノ酸配列１−２１０からなるポリペプチドをコードする 請求項１６による複製可能な発現ベクター。
18. １８．ドイチュザムルングフォンミクロォルガニスメンウンドセルクルトゥーレ ンゲーエムビーハ−（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒ ｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅＩＩｋｕＩｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）のコレ クションに、ブダペスト条約の規定にしたがって、１９９１年８月１９日付けで そのすべてが寄託され、受託番号ＤＳＭ６６５３、ＤＳＭ６６５４、ＤＳＭ６６ ５５、ＤＳＭ６６５６およびＤＳＭ６６５７をうけているｐＳ２１、ｐＳ２６、 ｐＳ２８、ｐＳ１３３およびｐＳ２３２と命名された発現ベクター、およびドイ チュザムルングフオンミクロォルガニスメンウンドセルクルトゥーレンゲーエム ビーハ−（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍＩｕｍｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ ｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）のコレクションに 、ブダペスト条約の規定にしたがって、１９９２年７月９日付けで寄託され、そ れぞれ受託番号ＤＳＭ７１６３、ＤＳＭ７１６４をうけているｐＳ３１６および ｐＳ３５８と命名された発現ベクター、および該寄託された発現ベクターのＤＮ Ａ配列とは異なるが、ヒトβへーカゼインのカルシウム結合活性またはオピオイ ド活性またはアンギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性 のいずれか二つもしくは三つの組合せを有する同じポリペプチドまたはその類似 体もしくは変異体をコードするＤＮＡ配列を発現する発現ベクターから選択され る複製可能な発現ベクター。
19. １９．発現されるＤＮＡ配列が、少なくも一つのヌクレオチドが欠失、置換また は修飾されているか、または少なくとも一つの付加ヌクレオチドが挿入されて、 ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性と比較して類似しているか、増大してい るかもしくは減少しているカルシウム結合活性を存するポリペプチド、ＡＣＥ阻 害活性を有するポリペプチドまたはオピオイド活性を有するポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列になっている点で、寄託されたベクターのＤＮＡ配列と異なる ＤＮＡ配列である請求項１８による複製可能な発現ベクター。
20. ２０．請求項１５〜１９のいずれかで定義されるベクターを保有する細胞。
21. ２１．原核細胞、単細胞真核生物もしくは多細胞生物由来の細胞である請求項２ ０による細胞。
22. ２２．多細胞生物、例えば動物由来である請求項２１による細胞。
23. ２３．ポリペプチドをコードするＤＮＡが非ヒト哺乳動物の分泌腺内で発現され るような様式で非ヒト哺乳動物のゲノム中に請求項１〜１０のいずれかに記載の 発現系を導入し、および腺から分泌される分泌物を集収することからなる、ヒト β−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンシ ン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つ の組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変 異体を有するポリペプチドを産生する方法。
24. ２４．分泌腺が乳腺であり、分泌物が乳汁である請求項２３に記載の方法。
25. ２５．非ヒト哺乳動物のゲノム中にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を染色 体的に導入することからなる、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオ ピオイド活性またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれら の活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮ Ｏ：２またはその疑似体もしくは変異体を有するポリペプチドを発現することが できる遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作成する方法。
26. ２６．哺乳動物の受精卵または胚の細胞に請求項１〜１０いずれかで定義される 発現系を注射して哺乳動物の生殖細胞系に発現系を導入し、およびその注射され た受精卵または胚を成熟雌哺乳動物中で発育させることからなる請求項２５によ る方法。
27. ２７．１）実質的に非内在性のポリペプチドが発現されるように哺乳動物の内在 性のポリペプチド発現能力を破壤し、およびヒトβ−カゼインのカルシウム結合 活性またはオピオイド活性またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性 またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを有するアミノ酸配列 ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチドが哺 乳動物内で発現されるような方法で哺乳動物の生殖細胞系に請求項１〜１０のい ずれかで定義される発現系を挿入し、および／または ２）内在性のポリペプチドまたはその一部をコードする遺伝子を請求項１〜１０ のいずれかで定義される発現系で置き換え、それによって該非ヒト哺乳動物が、 実質的に、相当する内在性のポリペプチドを発現することができないようにする ことからなる請求項２５による方法。
28. ２８．非ヒト哺乳動物ゲノムあるいは該非ヒト哺乳動物の始祖のゲノムヘの染色 体的な導入の結果として、該非ヒト哺乳動物の生殖細胞および体細胞が、ヒトβ −カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンシン 変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの 組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異 体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝子導入非ヒト哺 乳動物。
29. ２９．ＤＮＡ配列が、請求項１１〜１４のいずれかによるＤＮＡ配列である請求 項２８による遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
30. ３０．ＤＮＡ配列が、哺乳動物の乳汁タンパク質遺伝子中に存在する請求項３０ 記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
31. ３１．請求項２５〜２７のいずれかによる方法によって作成された遺伝子導入非 ヒト哺乳動物。
32. ３２．マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ（Ｉａｍａ）、ラク ダおよびウシ種からなる群から選択される請求項２８〜３１のいずれかによる哺 乳動物。
33. ３３．請求項２８〜３２のいずれかに記載の哺乳動物から乳汁を集収し、および 任意に乳汁からその組換えポリペプチドを回収することからなる、ヒトβ−カゼ インのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンシン変換酵 素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれら活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを 有するアミノ酸配列ＳＥＯＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体を有す るポリペプチドを製造する方法。
34. ３４．ヒト乳汁構成物と異なる乳汁構成物と共に、ヒトβ−カゼインのカルシウ ム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻 害活性またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを有するアミノ 酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチ ドを含有する非ヒト哺乳動物由来の乳汁。
35. ３５．非ヒト哺乳動物に対して内在性である乳汁構成物と共に、ヒトβ−カゼイ ンのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンンン変換酵素 （ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを 有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体を有す るポリペプチドを含有する請求項３４による乳汁。
36. ３６．請求項３０〜３４のいずれかによる遺伝子導入哺乳動物から得られる乳汁 。
37. ３７．請求項３４〜３６のいずれかで定義される乳汁、または請求項２４により 製造された乳汁から製造された乳児用調合乳。
38. ３８．ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアン ギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）活性またはこれらの活性のいずれか二つもしく は三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もし くは変異体を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが非ヒト哺乳動物の乳腺で 発現されうる様式で非ヒト哺乳動物のゲノム内に請求項１〜１０のいずれかによ る表現系を導入し、 該遺伝子導入非ヒト哺乳動物によるポリペプチドの発現を得、該遺伝子導入非ヒ ト哺乳動物より発現されたポリペプチドを収穫しおよび任意に精製し、 および該ポリペプチドを有するヒト乳児用調合乳を調合すること からなる、ヒト乳児の栄養的要求を溝たすために必須の、他の乳汁タンパク質類 、脂質類、炭水化物類、ビタミン類、無機物類および他の栄養物から選択される 少なくとも一つの他の乳児用調合乳構成物と共に、ヒトβ−カゼインのカルシウ ム結合活性またはオピオイド活性またはアンギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻 害活性またはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを有するアミノ 酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体を有するポリペプチ ドからなるヒト乳児用調合乳を生産する方法。
39. ３９．成分の混合物に０．０５Ｍ以上の濃度で硫酸アンモニウムを添加してポリ ペプチドを沈殿させ、および成分の混合物から沈殿したポリペプチドを分離する ことからなる、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性ま たはアンギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれ か二つもしくは三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはそ の類似体もしくは変異体を有するポリペプチドを成分の混合物から単離する方法 。
40. ４０．培地から組換えポリペプチドを保有する細胞を分離し、分離された細胞を 破壊して組換えポリペプチドの成分を放出させ、 任意に、破壊された細胞の混合物から細胞の破片を除去し、０．０５Ｍ以上の濃 度で硫酸アンモニウムを添加することによって放出された組換えポリペプチドを 沈殿させて、沈殿したポリペプチドを得、および 沈殿したポリペプチドを単離すること からなる、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性または アンギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはそれらの活性のいずれか二 つもしくは三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類 似体もしくは変異体を有する組換えポリペプチドを、実質的に細胞内でそれを産 生する細菌または酵母の細胞から単離する方法。
41. ４１．培地から細菌または酵母の細胞を除去し、０．０５Ｍ以上の濃度で硫酸ア ンモニウムを添加して沈殿したポリペプチドを得、および 沈殿したポリペプチドを単離すること からなる、ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性または アンギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二 つもしくは三つの組合せを有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類 似体もしくは変異体を有する組換えポリペプチドを、実質的に細胞外でそれを産 生している細菌または酵母の細胞から単離する方法。
42. ４２．ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性またはオピオイド活性またはアン ギォテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性またはこれらの活性のいずれか二つも しくは三つの組合せを有するミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはその類似体も しくは変異体を有する組換えポリペプチド。
43. ４３．ヒトβ−カゼインのカルシウム結合活性を有するアミノ酸配列ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２またはその類似体もしくは変異体、またはＡＣＥ阻害活性またはオピオ イド活性を有する該アミノ酸配列の部分配列もしくはその変異体を有する組換え ポリペプチド。
44. ４４．請求項１１〜１４のいずれかに記載のＤＮＡ配列によってコードされる組 換えポリペプチド。
45. ４５．図１に示されるアミノ酸配列からなる請求項４４によるポリペプチド。
46. ４６．図１に示されるアミノ酸配列１−２１０からなる請求項４５によるポリペ プチド。
47. ４７．少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換され、および ／または少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失されあるいは付加されて、図１に 示されるアミノ酸配列と異なる了ミノ酸配列を含有し、かつヒトβ−カゼインの カルシウム結合活性と比較して類似しているか、増大しているかまたは減少して いるカルシウム結合活性を有するか、ＡＣＥ阻害活性を有するか、オピオイド活 性を有するかまたはこれらの活性のいずれか二つもしくは三つの組合せを有する ポリペプチドになっている請求項４２〜４６のいずれかによるポリペプチド。
48. ４８．少なくとも一つのアミノ酸残基が、翻訳後修飾によって修飾されている請 求項４２〜４了のいずれかによる組換えポリペプチド。
49. ４９．グリコシル化および／またはリン酸化された形態での請求項４２〜４８の いずれかによるポリペプチド。
50. ５０．請求項２３、２４または３３による方法によっていつでも製造される請求 項４２〜４９のいずれかによるポリペプチド。