JPH07502640A

JPH07502640A - シグナルペプチド、選択的相互作用ポリペプチド及び膜固定配列をコードする組換えｄｎａ配列

Info

Publication number: JPH07502640A
Application number: JP4510568A
Authority: JP
Inventors: ストール，ステフアン; ニグレン，ペル−オーク; ハンソン，マリアンヌ; ユーレン，マテイアス; ングエン，テイアン・ンゴツク
Original assignee: ピエール・フアーブル・メデイカマン
Priority date: 1991-05-13
Filing date: 1992-05-11
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: CA2103021A1; SE9101433D0; JP3423712B2; AU1789992A; EP0584167B1; WO1992020805A1; CA2103021C; ATE270335T1; DE69233375D1; DE69233375T2; EP0584167A1; AU664841B2; US5958736A; OA09866A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】シグナルペプチド、選択的相互作用ポリペプチド及び′膜固定配列をコードする組換えＤＮＡ配列本発明は、実質的に３種類の異なるＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ配列及びそのような配列を含む発現ベクターまたはプラスミド、並びにそのようなりＮＡ配列を含有するかまたは示されたようなベクター若しくはプラスミドにより形質転換されるグラム陽性菌細胞に関する。本発明はさらに、グラム陽性菌細胞の同定または選択的単離方法も包含する。

本発明は、細菌細胞上に発見された表面レセプター構造体の使用を含む全（の新規概念に基づく新規方法を包含する。これらの新規方法により多くの興味深い用途が発見された。本発明の２つの主態様の一つ目は治癒的または防御免疫であり、二つ目はグラム陽性菌細胞の同定または選択的単離の実際的な方法である。

最近のワクチン学に於いて、生有機体が死滅若しくはサブユニットワクチン調製物に優れた免疫原性を示すこともあるため、組換え免疫原の生送達系（ｌｉｖｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ）の開発が非常に注目されてきた。多くの生組換え弱毒化ウィルスが外来エピトープのキャリヤとして試されて来た。

これらの例としては、ワクシニアウィルス［Ｍｏ５ｓら、　Ｎａｔｕｒｅ　３１１．６７−６９（１９８４）］、アデノウィルス［Ｂａ１ｌａｙら、　ＥＭＢＯＪ。

４、３８６１−３８６５（１９８５）］、ポリオウィルス［Ｅｖａｎｓら、　Ｎａｔｕｒｅ３３９、３８５−３８８（１９８９月及びヘルペスウィルス［５ｈｉｈら、　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８１．５８６７−５８７０（１９８４）］が挙げられる。例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｌＪＩｏｓｉｅｔｈ及び５ｔｏｃｋｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ２９１、２３８−２３９（１９８１）］、非定型ミコバクテリア［Ｊａｃｏｂｓら。

Ｎａｔｕｒｅ　３２７．５３２−５３５（１９８７）］及びＥ、ｃｏｌｉ［０’ ｃａｌｌａｇｈａｎら。

Ｒｅｓ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４１．９６３−９６９（１９９０）］などの生組換え細菌を使用する細菌系も開発されており、この系では細菌全体を組換え免疫原のキャリヤとして使用している。

さらに最近の組換えＤＮＡ方法により、免疫感作した動物またはｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫感作したリンパ球から直接抗体遺伝子を単離及びクローニングできるようになった（Ｒｕｓｅら、　５ｃｉｅｎｃｅ、１９８９．　２４６．　１２７５− １２８０）［Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　ｌ９８８．８５．３９９５−３９９９］。抗体能力（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の遺伝子ライブラリーは細菌ベクター系で確立されＨ（ＶＨ）及びＬ　（ＶＬ）鎖から誘導した変異性領域と細菌宿主中で次の発現をコードする遺伝子の「ランダム」結合（ｃｏ■ｂｉｎａｔｉｏｎ）により、結合特性をスクリーニングし得るＶＨ／ＶＬ対が新しく形成される［Ｈｕｓｅら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８９．２４６．１２７５−１２８０］。しかしながら、この方法を使用して産生じた多くのクローンには、実際の方法で関連クローンを単離し得る効率的なスクリーニング法が必要である。近年、表面に露出した免疫グロブリンフラグメントのキャリヤとして細菌ファージを使用する方法が記載され、これにより所望の抗原を結合し得るＶｌｌ／ＶＬドメインの結合を保持する単一ファージ粒子を選択し得るようになったＣＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、　１９９０゜Ｎａｔｕｒｅ、　３４８．５５２−５５４）。

単一表面に露出した構造を保持する媒質をクローン特異的に単離するための新規方法の重要性は、ホルモン−ホルモンレセプター認識［Ｂａ５ｓら、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　８．３０９−３１４（１９９０）］及び酵素−基質混和性［Ｃａｒｔｅｒら、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　６．２４０−２４８（１９８９）］などの分野にも関連する。

しかし、使用したファージコート蛋白質に免疫グロブリンセグメントを含ませるための構造的強制により、負の生物学的選択、続いてＶＨ／ＶＬ結合の理論的能力が欠損し得る。

さらに、各ファージ粒子に露出した少数、１〜約５個の分子の免疫グロブリン分子により、ファージ粒子の低い親和性による温和な結合能を持つ結合の回収に関して克服できない問題が発生し得る。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの表面に異種蛋白質を表出する系、例えば、鞭毛（ｆｌａｇｅｌｌｏｒ）フィラメント（Ｋｕｖａｊｉｍａら、　１９８８゜Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６．１０８０−１０８３）または外部膜蛋白質しａｌｌＩＢ　（０’　Ｃａｌｌａｇｈａｎら、１９９０．　Ｒｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｆｏｌ、１４１．　９６３−９６９）への抗原ペプチドの融合も記載されている。やはり、このような概念を実際の用途でそれ程有用とさせない構造的強制が存在する。

本発明は、広範囲の実際的な用途のための組換え表面レセプター構造体を使用する概念に基づく新規方法を提供することを主な目的とする。

本発明のもう一つの目的は、免疫原を向けるキャリヤとしてダラム陽性菌を使用することである。本発明により免疫応答が非常に促進し、且つ慣用のアジュバントの使用がそれほど重要でないかまたは余計にすらなる。

本発明のさらにもう一つの目的は、種々の組換え表面レセプター構造体を保持するそのような細胞の異種集団がらグラム陽性菌細胞を同定及び／または単離し得る方法を提供することである。

本発明のまたもう一つの目的は、組換えＤＮＡ配列、そのような配列を含む発現ベクター若しくはプラスミド及びそのような配列を含有したりまたはそのようなベクター若しくはプラスミドにより形質転換されるグラム陽性菌細胞を提供することである。

以下の記載により明らかになるこれら及び他の目的に関しては、本発明は、ダラム陽性菌の表面上に天然では知見されず、且つ選択的相互作用し得る第２のアミノ酸配列をコードする第２のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合した、グラム陽性宿主中で操作可能なシグナルペプチドとして操作する第１のアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ配列であって、第２のＤＮＡフラグメントは、細胞壁拡張（ｓｐａｎｎｉｎｇ）及び膜固定配列としてグラム陽性宿主中に操作可能な第３のアミノ酸配列をコードする第３のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合している、該そのような組換えＤＮＡ配列では、前記第２のアミノ酸配列は、抗原的に作用し得るか、または抗体（免疫グロブリン）若しくはその活性フラグメントにより構築され得る。

本発明の好ましい態様により、組換えＤＮＡ配列は、前記第３のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌蛋白質Ａまたは連鎖球菌蛋白質Ｇの細胞壁拡張及び膜固定領域をコードするような該配列である。

本発明の好ましい態様に於いて、前記第１のＤＮＡフラグメントは、ブドウ球菌蛋白質Ａの単一ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントなどのグラム陽性菌細胞由来である。

前記第３のＤＮＡフラグメントは、ブドウ球菌蛋白質Ａの細胞壁拡張及び膜固定領域をコードするのが好ましい。

本発明の免疫学的態様に関しては、前記第２のＤＮＡフラグメントが、ワクチン接種目的または抗体の産生に有用な免疫応答を誘引し得るアミノ酸配列をコードするのが好ましい。

本発明は、概説した組換えＤＮＡ配列を含む発現ベクターまたはプラスミドも提供する。本発明によるそのようなベクターまたはプラスミドは、グラム陽性菌宿主中で複製し得る。

さらに本発明は、上記定義の組換えＤＮＡ配列を含有するか、またはそのようなりＮＡ配列を含むベクター若しくはプラスミドにより形質転換されるグラム陽性菌細胞も網羅する。

最後に、本発明は、異なる組換え表面レセプター構造体を保持し、個々の細胞は特異的な組換え表面レセプター構造体の多重コピーを保持する、そのような細胞の異種集団からグラム陽性菌細胞を選択的単離または同定する方法を提供する。

そのような方法は、細胞の異種集団を特異的な相互作用パートナ−（例えば、抗原）と相互作用させ、１個の特異的な組換え表面レセプター構造体を保持する細胞を同定及び／または単離し得る段階を包含する。そのような本発明の方法の一態様により、前記レセプター構造体は、抗体またはその活性フラグメントにより構築され得る。

前記相互作用パートナ−は、免疫形で使用するのが好ましく、これにより特異的な構造体を保持する細胞は効率的に単離され得る。このような免疫感作は、好ましくは、例えば、カラム形の固体支持体上で実施する。

本発明は、実施例の形で表される特異的な態様の記載により詳細に説明されよう。これらの実施例は、付記図面１〜９を参照し、その内容は以下の説明文から図面で明らかになろう。

出発物質１ｆｅｒ及びＫｌｏｏｓ、Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、２５．　５Ｏ−６１（１９７５）コを、細胞表面上の組換え蛋白質の発現に使用した。

ｐＲＩＴ２８Ｃｔｌｕｌｔｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓ、ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔ、７．　６２９−６３７（１９８８）］、Ｉ）ＵＣｌ３［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇＪ、、Ｇｅｎｅ　３３．　１０３−１１９（２９８５）］、ｐＲＩＴ２４　［Ｈａｍｍａｒｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、８６．　４３６７−４３７１（１９８９）］、ｐＨＥＲＡＴ及びｐＬＥＲＡＴ（Ｄｒ、　Ｇｒｅｇ　Ｗｉｎｔｅｒ　ＭＲＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍからの贈与）。

実施例中で使用した全ての株、ベクター、オリゴヌクレオチド及び抗体は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｙａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ。

Ｓｗｅｄｅｎで入手可能であった。

べ’７　ター　ｐＳＢＢ−Ｍ３−ＸＭ及びｐＳＢＢ−３ｃＦｖ（Ｄｉ、　３）− ＸＭｌｔ、ブタペスト条約の下に、ｔｈｅ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨｉｎ　Ｂｒａｕｎｓｃｈｖｅｉｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙに１９９１年５月１０日に寄託し、各々受託番号筒ＤＳＭ　６５１６及びＤＳＭ　６５１７を受けた。

ブイヨン酵母抽出物（５ｇ／ｌ）を含んだトリプシン大豆ブイヨン（Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ）（３０ｇ／ｌ）をＤｉｆｃｏ　Ｉｎｃ、より入手し、滅菌水中に溶解し、好適な抗体の添加前にオートクレーブにかけた。

緩衝液ＴＳＴ　：　ＴＲｌ５／ＨＣＩ（２５ｍＭ　ｐＨ７，４）、ＮａＣ１（１５０ＩＩＭ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０．ＰＢＳ　：　０．０５　Ｍ　リン酸ナトリウムｐＨ７，１，０，１５ＭＮａＣ１゜ＰＣＲ増幅Ｔｅｃｈｎｅ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｄｒｉ　Ｂｌｏｃｋ　ＰＨＣ−１上でＰＣＲ増幅を実施した。

１０ＸＰＣＲ緩衝液：　１００　ｍＭ　ＴＲｌ５／ＨＣＩ、　ｐＨ８，３，５００＋＊Ｍ　ＫＣＩ。

２０ｍＭ　Ｍｇ”、１％Ｔｗｅｅｎ　２０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰ及び実施例に記載したオリゴヌクレオチドプライマー［各々５　ｐｍｏｌｅ］ＤＮＡポリメラーゼ：　＾ｍｐｌｉ　Ｔａｑ（登録商標）［Ｐｅｒｋｉｎ　ＥｌｉｅｒＣｏｒｐ、］　０．５単位。

ＰＣＲプログラム：９７℃、０．５分；６５℃、１．０分；７２℃、１．０分。

オリゴヌクレオチドＫＳＩ　：５’　−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣ−３’ＫＳ２　：　５’　−ＣＧ＾＾ＧＣＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧ−３’ＫＳ３；５°−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ−３゜ＫＳ４　：　５°−ＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３゜ＫＳ５：５°−Ｔ　ＧＧ　Ａ　ＣＣＣＡ　ＣＣＡＣＣＧＣＣＣＧ　Ａ　ＧＣＣＡ　ＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴ　ＴＧ　Ａ　ＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’ ＫＳ６：５°−ＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧ　ＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡ　ＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣ−３’ ５ＴＳＴ　３３：５°−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴ−３゜５ＴＳＴ　３４：５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＣ＾＾ＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＨｕｌｔｗａｎら［Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１７．　４９３７−４９４６．（１９８９）］に従って固相ＤＮ＾配列決定を実施した。

タンパク質のアフィニティー精製［＋１ＳＡ及びＨＥＬ］異なる構造体を含有する細胞を、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを補ったブイヨン中、−晩生長させた。

培地を１回目は５０００ｇ、次いで２回目は９０００ｇで遠心分離して透明にした。

透明にした培地をＨＳＡ−セファロースまたはＨＥＬ−セファロース上に直接装填した。１ｘＴｓＴ次いで０．５ｍＭ　ＮＨ４＾ｃＳｐ■５．０で洗浄後、タンパク質を０．５Ｍ　ＨＡｃ、　ｐＨ２，８で溶出した。２８０ｒｏｎでの吸収を測定し、関連画分を凍結乾燥した。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥタンパク質を、２．５％ドデンル硫酸ナトリウム［ＳＯ３］、５％ジチオスレイトール［ＤＴＴ］及び０．０１％ブロモフェノールブルー［ＢＦＢ］中に溶解し、５分沸騰させ、ＰＨＡＳＴ（登録商標）系［Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｓｗｅｄｅｎ］に従って１０−１５％ポリアクリルアミドゲル勾配上で１０＋ｎＡで、３０分かけた。続いてゲルをクーマノ−ブリリアントブルーで染色した。

専！店分子生物学で日常的に使用される方法、例えばエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの制限、ＤＮＡフラグメントの連結などは記載しない。

ＧＯｔｚら［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４５．７４−８１（１９８１）］の記載の如（実形質転換したブドウ球菌からのプラスミドＤＮＡのミニブレバレージョンを、アルカリ性抽出法［Ｂｉｒｎｂｏｉｏ＋　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−１５２３（１９７９月を使用して実施した。異なる構築物を含有する細胞を、クロラムフェニコール２０＋Ｉ１ｇ／ｌを補ったブイヨン１．５ｍｌ中で一晩生長させた。

標準法にかける前に、細胞を生理食塩水緩衝液（１００μｍ）中リソスタフィン５μｇと共に３７℃で１時間インキュベートした。

ウサギ抗血清ウサギ抗血清Ｒ１２０を、融合タンパク質ＺＺ−Ｍ３及びＺＺ−Ｍ５　［５ｔＡｈｌら、　Ｇｅｎｅ　８９．１８７−１９０（１９９０）］の混合物と共有結合で結合した予め形成したインフルエンザ膜糖タンパク１　ｒｓｃ。

ＭＳ［Ｍｏｒｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３０８．　４５７−４６０　（１９８４）］６０μｇを筋肉内で２回免疫感作したウサギから得た。

インフルエンザｌＳＣ０Ｍ５の調製及び融合タンパク質のカップリングは、ＬＱｖｇｒｅｎら［Ｊ、　ｌｍ１ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　９８．１３７−１．４３（１９８７月に記載の如〈実施した。抗血清Ｒ１２０はＥＬＩＳ＾中、日ペプチドと強く反応し、ＢＢ領領域は非反応性であり、続いてブドウ球菌の表面上でＭ３ペプチドを検出するのに使用した。抗血清Ｒ１０２は、フロイントのアジュバント中、融合タンパク質ＢＢ−Ｍ５［５ｔａｈｌら、　Ｇｅｎｅ　８９．１８７ −１９０（１９９０）］で２回免疫感作したウサギから得られた。フロイントの完全アジュバントを１回目の注射に使用し、次いでフロイントの不完全アジュバントを２回目の注射に使用した。抗血清Ｒ１０２はＥＬＩＳＡ中でＢＢ領領域強（反応したが、ｌｌｌ３ペプチドに対する反応性は示され得なかった。従って、抗血清Ｒ１０２はブドウ球菌の表面上でＢＢの検出に好適であった。

異なる構築物を含有する細胞を、クロラムフェニコール（２０ａ＋ｇ／ｌ）を補ったブイヨン中で３７℃で一晩生長させた。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した。１５−ウェルマルチテストスライド（Ｆｌｏｗ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、室温で３０分湿潤チャンバ内でコーティング緩衝液（１５ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３，３５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，ｐ■９．６）とインキュベートした。コーティング緩衝液はＰＢＳ中細菌１滴（１０７細［／ｍｌ）でディスプレイし、スライドを室温で３０分、湿潤チャンバ内でインキュベートした。未結合細菌をＰＢＳで洗浄し、細胞１層をＰＢＳ中１％グルタルアルデヒドで２秒間固定した。最後にスライドを蒸留水中で洗浄し、風乾し、−２０℃で貯蔵した。ウサギ抗血清をＰＢＳ中１　＋　１０００に希釈し、各ウェルに１滴ずつ加え、室温で３０分湿潤チャンバ内でインキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄後、スライドをビオチン化抗つサギＩｇＧ−分子（１５μｇ）と３０分インキュベートし、ＰＢＳ中で再び洗浄後、３０分のインキュベーション間にアビジン−結合フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（５０，ｃｚ　ｇ／＋１）（Ｖｅｃｔｏｒ、　ＵＳＡ）を添加した。最後に、スライドを洗浄し、臭化エチジウムを添加して細菌ＤＮＡを可視化し、ＵＶ−顕微鏡下で調べた。

ブドウ球菌タンパク質Ａをその異なる領域と共にコードする遺伝子の図である。

Ｓは、シグナル配列である。Ｅ。

Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣは、同種性の高いＩｇＧ＝結合ドメインをコードする。Ｘは、細胞壁拡張領域をコードし、Ｍは膜固定領域をコードする。

図ＩＢ。

ブドウ球菌の外部細胞表面に結合した加工タンバク質Ａを示す図である。

図２Ａ。

実施例１に記載のプラスミドｐｓＢＢｍｐ１８ＸＭ及びｐｓＢＢｍ３ＸＭを示す図である。この場合のＢＢ−領域は、連鎖球菌タンパク質Ｇをベースとする血清アルブミン結合領域であるのに注意されたい。

略号：　ｂｌａ、β−ラクタマーゼコード遺伝子；ｃａｔ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子：図２Ｂ。

ブドウ球菌の細胞表面に結合した、プラスミドｐｓＢＢａ＋ｐ１８ＸＭ及びｐＳＢＢＭ３ＸＭからコードされた、加工及び分泌された発現産生物の説明図である。

図３゜細胞表面でＢＢを発現する固定Ｓ、　ｘｙｌｏｓｕｓ細胞の免疫蛍光反応を示す図である。反応性はＢＢ＝特異的な抗血清（Ｒ１２０）で得られた。細胞の内部部分は、臭化エチジウム染色により明らかにする。

図４゜細胞表面で８８Ｍ３を発現する固定Ｓ、　ｘｙｌｏｓｕｓ細胞の免疫蛍光反応を示す図である。反応性はＭ３−特異的な抗血清（Ｒ１０２）で得られた。細胞の内部部分は、臭化エチジウム染色により明らかにする。

図５゜細胞表面でＢＢｌ１３を発現する固定Ｓ、　ｘｙｌｏｓｕｓ細胞の免疫蛍光反応を示す図である。予備免疫血清を使用しても、反応性は得られなかった。細胞の内部部分は、臭化エチジウム染色により明らかにする。

図６マウス抗リゾチーム抗体Ｄ１．３の５ｃＦｖフラグメントをコードする遺伝子を図示する。異なるオリゴヌクレオチドのアニーリング部位は矢印で示されている。

図７゜ＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭ融合タンパク質をコードするｐＳＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭプラスミドを図示する。幾つかの制限酵素認識部位が示されている。ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ。

図８゜表示の制限酵素で消化後に得られたｐＳＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭプラスミドの異なるＤＮＡフラグメントを含む、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ［２５４ｒ＋ｒａ］で露出したゲルのポラロイド像を示す図である。

パネルＡ　：　Ｓ、ｘｙｌｏｓｕｓ細胞から調製したプラスミド；マーカーＤＮＡフラグメントサイズを左側に示した。

図９゜ｐＳＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭプラスミドによりコードされたＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭタンパク質のＳ、　ｘｙｌｏｓｕｓ宿主細胞壁中の予想オリエンテーションを図示する。

されたｐＳＢＢＧ３ＸＭプラスミドを図示する。

Ｓ、ブドウ球菌タンパク質Ａ　［ＳＰ＾］から誘導したシグナルペプチド；ＢＢ、連鎖球菌タンパク質Ｇから誘導した血清アルブミン結合領域；Ｇ３．３：＋ピーＲ８ｖエヒトーフ；ＸＭ、　ＳＰＡ由来の細胞壁固定領域。

ｃａｔ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：ｐｓｐａ、　Ｓｐａルミオペロンのプロモーター。

図１１゜第１回目の経口投与後、異なる時点に於ける免疫感作したネズミの血液中に存在する抗−ＢＢＧ３抗体を検出するためのＥＬＩＳＡからの結果を示す図である。

実施例ＩＥ、Ｃｏ１１−ブドウ球菌シャトルベクターｐＲＩＴ１６のＮｏｔＩ−ＮｄｅＩ消化［＾ｂｒａｈｍｓ６ｎら、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．７４８７−７５００（１９８６）］により、ブドウ球菌タンパク！　Ａ　（ＳＰＡ）に関する遺伝子を、ＳＰＡの転写、翻訳及び分泌シグナルにより先行された、合成二価ＩｇＧ−結合ドメイン、ＺＺをコードするプラスミドｐＥＺＺ３１８Ｔ［Ｎｙｇｒｅｎら、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｒｅｃｏｇｎ、１．　６９−７４（１９８８）］から制限されたＮｏｔＩ−ＮｄｅＩ遺伝子フラグメントと置き換えた。

得られたプラスミドｐｓＺＺｍｐ１８Ｔは、Ｅ、ｃｏＬｉ及び５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの両方に関して複製のオリジンを含んでいた。

ＳＰＡのＩｇＧ＝結合領域Ａ、Ｂ及びＣと、細胞壁拡張領域Ｘ及び膜固定領域Ｍ（図１）をコードする遺伝子フラグメントは、）１ｉｎｄＩＩＩ及びＥＣ０ＲＶを使用してプラスミドｐＳｔ）＾３［Ｕｈ１６ｎら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、　２５９．１６９５−１７０２（１９８４）］から制限し、同一酵素で予め制限したプラスミドｐｓＺＺｍｐｌＳＴ中のｍｐ１８マルチクローニング部位［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、　Ｇｅｎｅ３３．１０３ −１１９（１９８５）］の下流に挿入した。得られたベクターをｐｓＺＺｍｐ１８＾ＢＣＸＭと命名した。このプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔｌで消化し、ＳＰＡの領域Ｖの半分と、領域ＡＳＢ、Ｃ及びＸをコードする遺伝子フラグメント欠失する。領域Ｘ及びＭの完全配列は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を適用することにより修復され得る。上流プライマーとして５ＴＳＴ３４、下流プライマーとして５ＴＳＴ３３及びＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＳｐ＾８を使用してＰＣＲ増幅を実施した。上流プライマーは、その非アニーリング５゛配列により１ｌｉｎｄＩＩＩ認識配列を産生認識下流プライマーはＳＰＡのＭ領域中の元のＰｓｔＩ認識配列に重複した。従って、ＰＣＲで増幅したフラグメントはＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで制限され得、同一酵素で予め制限されたプラスミドｐＲＩＴ２８［Ｈｕｌｔｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓ、　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔ、７．　６２９−６３８（１９８８）］にサブクローンし、プラスミドｐＲＩＴ２８ＸＭを産生した。ＰＣＲでサブクローンしたフラグメントのヌクレオチド配列を、固相ＤＮＡ配列決定により確認した［Ｈｕｌｔｍａｎら、　Ｎｕｃｌ、　ａｎｄ　Ｒｅｓ。

１７、　４９３７−４９４６（１９８９）］。ｐＲＩＴ２８ＸｕのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔｌ制限により、ＳＰＡの領域Ｍの半分と領域Ｘをコードする遺伝子フラグメントを単離し得、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＳＺＺｍｐ１８ＡＢＣＸＭ（上述）に融合すると、ｍｐ１ｇマルチクローニング部位のＭ下流とｉｎ　ｆｒａｍｅ且っ完全領域ＸをもつプラスミドｐＳＺＺＩＩｌｐ１８ＸＭカ得ラレタ。フラスミＦ　ｐＳＺＺＩＩＩｐ１８ＸＭ（７）　Ｎｏｔｌ −ＥｃｏＲｒ消化により、ｚＺコード遺伝子フラグメントをプラスミドｐＢＩＢ２ｍｐ１８から制限されたＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置き換え得［５ｔａｈｌら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　１２４．、４３−５２（１９８９）コ、ＳＰＡの転写、翻訳及び分泌シグナルにより先行されたＢＢと命名された、連鎖球菌タンパク質Ｇの血清アルブミン結合領域をコードする。得られたベクターｐｓＢＢａｐ１８ＸＭ（図２Ａ）はＥ、ｃｏｌｉ及び５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの両方に関する複製のオリジンを含んでいた。

通常の発現ベクターｐｓＢＢｍｐｌｓＸＭ中のＩＩＩｐＩ８マルチクローニング部位をＥｃｏＲＩ４ｉｎｄＺＩＩ制限により除去した。反復性の高いペプチドＭ３をコードする遺伝子フラグメント［５ｔＡｈｌら、　Ｇｅｎｅ　８９．　１８７−２９３（１９９０月をプラスミドｐ＋ｕＴ２８Ｍ３　［５ｔａｈｔら、Ｇｅｎｅ　８９．　１８７−１９３（１９９０）コから切り出した。まず、Ｍ３配列を停止する停止コドンを特定部位の固相ｉｎ　ｖｉｖｏ突然変異［Ｈｕｌｔｍａｎら、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１８．５１０７−５１１２（１９９０）］により除去した。Ｍ３をコードする、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで制限された遺伝子フラグメントを同様に消化したｐｓＢＢｔｎｐ１８ＸＭに連結させて、プラスミドｐｓＢＢＭ３ＸＭを産生じた（図２Ａ）。Ｍ３ポリペプチドは、マラリャ血液段階抗体Ｐｆ１５５／ＲＥＳ＾［Ｂｅｒｚｉｎｓら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　１１１３．１０６５−１０６９（１９８６）］（７）免疫原性の高イｃ −末端部分から誘導する。

プラスミドｐｓＢＢｍｐ１８ＸＭは、ＳＰＡ由来のシグナルペプチド、連鎖球菌タンパク質Ｇから誘導した血清結合８８部分及びｓＰ八へ来の細胞壁結合ＸＭ領領域含む３部分からなる誘導タンパク質をコードする。細胞膜を介する分泌時に、シグナルペプチドが切断される。プラスミドｐｓＢＢＭ３ＸＭ１１、マラリャ抗原ペプチドＭ３がＢＢとＸＭ領領域間に配置される３部分からなる融合タンパク質をコードする（図２Ｂ）。

プラスミドｐｓＢＢｍｐ１８ＸＭ及びｐＳＢＢＭ３ＸＭは、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｘｙｌｏｓｕｓ（詳細は、以下の「出発物質」参照）がら製造したプロトプラストに形質転換される。表１に示されているように、ＢＢまたはＭ３の各々に特異的なポリクローナルウサギ抗血ｆ青を使用するイムノアッセイから、プラスミドｐｓＢＢｍｐ１８ＸＭを含有するＳ、　ｘｙｌｏｓｕｓ−細胞は細胞表面にＢＢを発現しく図３参照）、ｐｓＢＢ１１３ＸＭを含む細胞は細胞表面にＢＢとＭ３の両方を発現しく図４）、この方法により組換え融合タンパク質を発現する際に分泌シグナルと細胞壁結合部分、ＸＭの両方が機能的であることを示している。プラスミドを含まない糺であり、前免疫血清は全ての場合で陰性であった（図５）。

表１ウサギ抗血清Ｓ、　ｘｙｌｏｓｕｓ細胞　ＢＢ−特異的　Ｍ３−特異的含有　前免疫　（Ｒ１２０）　（Ｒ１０２）ｐｓＢＢｍｐ１８Ｘｌｉ　＋　− ｐＳＢＢＭ３ＸＭ　＋　十プラスミドなし　−−一実施例■ 抗すゾチーム抗体旧、　３［ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４ｇ、　５５２−５５４］のＨ［ｐＨＥＲＡＴ］及びＬ　［ｐＬＥＲＡＴ］鎖の変異性ドメインを含有するプラスミド鋳型ｐＨＥＲＡＴ及びｐＬＥＲＡＴ上のオリゴヌクレオチドプライマ一対ＫＳＩ／２及びＫＳ３／４を各々使用するＰＣＲ増幅により、２種類の変異性ドメインをコードする遺伝子フラグメントを単離し得た。プライマーを含んだ好適な制限酵素認識部位Ｅｃｏ　ＲＩ及びＢａｌ１１旧を使用することにより、フラグメントをｐＲＩＴ２８に挿入し、固相配列決定用に改造した。

正しい配列を確認後、得られたプラスミドｐＲＩＴ２８−ＶＨ及びｐＲＩＴ２８ −ＶＬを別個に、オリゴヌクレオチドプライマ一対ＫＳ６／２［ｐＲＩＴ２８− ＶＯ３及びＫＳ３１５［ｒ＋ＲＩＴ２８−ＶＬコ各々を使用する続＜　ＰＣＲ増幅中の鋳型として使用した。得られたＰＣＲ産生物の約５ナノグラムを混合し、８５℃に加熱し、その後室温に冷却した。Ｔａｑポリメラーゼ［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ｃｏｒｐ、コ０．５単位、ＰＣＲ緩１ｊ液を添加後、標準ＰＣＲを２回実施し、二重鎖ＤＮＡを得た。この方法により、ＫＳ５及びＫＳ６オリゴヌクレオチドによる２回目のＰＣＲの際に取り込まれた重複配列によって２個の免疫グロブリンコード遺伝子フラグメントが結合した。

結合ＤＮＡ配列は、２個の免疫グロブリンドメイン間に柔軟性の高い１５アミノ酸残基結合ペプチドをコードする。得られた７３０塩基対フラグメントは、式％式％に記載の如く抗リゾチーム抗体Ｄ１３［図６１の単一鎖Ｆｖ［５ｃＦＶ］をコードし、５ｃＦｖコードフラグメントをさらにクローニングするために十分な量を得、外部プライマーＫＳ３及びＫＳ２を使用してさらにＰＣＲを２０回実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｅｃｏ　ＲＴ及びＢａｍ　ＩＩＩで制限し、続いてクローニングベクターｐＵｃ１９に連結した。配列を確認後、正しく組み立てられた５ｃＦｖｌ伝子フラグメントを含むクローンをＥｃｏ　ＲＩベクターｐＲＩＴ２４のＥｃｏ　ＲＩ及びＢａｍ　ＨＩ部位に挿入した［Ｈａｍｍｅｒｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、８６．　４３６７−４３７Ｉ］。得られた構築物ｐＲＩＴ２４−ｓｃＦｃは３部分からなる融合２Ｚ−ｓｃＦｖ−ＢＢをコードする。ｐＲＩＴ２４−ｓｃＦｖで形質転換したＥ、　ｃ。

算細胞を、アンピシリン［１００ｍ１／１］を補ったトリプシン大豆１４３２士酵母抽出物中、３０℃で一晩生長させた。

組換えＺＺ−ｓｃＦｖ−ＢＢ融合タンパク質の安定性及び生物学的活性を調査するために、−晩発酵させた培地を、ヒト血清アルフミン［ＩＳＡ］及び鶏卵卵白リゾチーム［ＨＥＬ］セファロースカラムを各々通過させた。０．５Ｍ　ＨＡＣ／ＮＨ４＾ｃｐＨ２，８テ溶出したタンパク質を凍結乾燥し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｈ３＾−及び肛り一親和性精製物質の両方に関する主要バンドは、完全長であることが知見された。ＨＥＬを用いるＺＺ−ｓｃＦｖ−ＢＢの好結果のアフィニティー精製から、５ｃＦｖ免疫グロブリンフラグメントは２個の親和性末端（ｔａｉｌ）ＺＺ及びＢＢによりフランクされるが、自然の生物学的に活性な構造に折り畳み（ｆｏ　ｌ　ｄ　）　ｉｌることが示唆されている。

構築である。　５ｃＦｖフラグメントの挿入に関してこのベクタ−を適用するために、ｍｐ１８リンカ−をＭ１３ｍｐ８から誘導した短いｏ＋ｐ３リンカ−［Ｍｅｓｓｉｎｇら、　１９８２．　Ｇｅｎｅ　１９．２６９−２７６］と置換して、ｐｓＢＢｍｐ８ＸＭを産生した。５ｃＦｃをコードする遺伝子フラグメントをＥｃｏ　ＲＩ及びＢａ■■■制限によりＵＣｌ３−ｓｃＦｃプラスミドから放出し、続いてｐｓＢＢｍｐ８ＸＭベクターに連結した。

Ｓ、　ｘｙｌｏｓｕｓ細胞を得られたｐＳＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭ構築物［図７１で形質転換し、生育し得るコロニーをプラスミド調製用にクロラムフェニコール［２０ｍｇ／ｌ］を補ったＴＢＳ中で３７℃で一晩生長させた。形質転換したブドウ球菌細胞から調製した、ｐＳＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭ構築物の制限酵素マツピングは、予想した結果と一致した［図８］。このことは、ｐＳＢＢ−ｓｃＦｖ− ＸＭ構築物がブドウ球菌宿主内で遺伝子的に安定であることを示している。

この構築物は、宿主細胞壁に取り込まれるべきＢＢ−ｓｃＦｖ−ＸＭ融合タンパク質をコードする［図９］。

実施例■ 経口投与後のネズミに於ける特異的抗体の発達呼吸性合胞体ウィルス［Ｒ３Ｖ］糖タンパク質Ｇエピトープ［Ｔｒｕｄｅｌら、（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８５ニア４９−７５７］Ｃ−末端繰り返シ配列、ＶＳＩＣＳＮＮＰＴ（ＪＡＩＳＫＮ（７）　３個ノコピーを含むペプチドＧ３をコードする遺伝子を、実施例１に記載のＭ３ペプチドの構築に関して記載された重合概念に従って、オリゴヌクレオチドニＴＨ５：５°−＾ＴＧＴＡＴＣＴＡＴＣＴＧＣＴＣＴ＾＾ＣＡＡＣＣＣＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＣＣ＾ＡＡＡ−３’及びＴＨ６：５’−ＡＣＡ　ＴＴＴＴＴＧＧ　ＡＧ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＧＣＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＧＴＣＧＧＧＴＴＧＴＴＡＧ　ＡＧＣＡＧＡ　ＴＡＧＡＴ−３’ を使用して構築し、ｐＲＩＴ２８Ｈに挿入したｐＲＩＴ２８ＥＧ３を産生した。

Ｇ３をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、同相ＤＮＡ配列決定［Ｈｕｌｔｍａｎら、　（１９８９）、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｃ、　１７：４９３７−４９４６］により確認した。Ｇ３遺伝子フラグメントをＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌＩＩでｐＲＩＴ２８ＥＧ３から切り出し、同様に消化したｐＢＢ２ｎ＋ｐ１８［５ｔＡｈｌら、（１９８９）、　Ｊ、ＩＩＩＩＩｌ、　Ｍｅｔｈ、１２４：４３−５２］に連結した。得られたベクター、ｐＢＢＧ３［５１５３ｂｐｌは、連鎖球菌タンパク質Ｇ　［ＳＰＧ］由来の血清アルブミン結合領域とトリペプチド繰り返し部分からなる、ＢＢＧ３［３０，９ｋＤａ］の融合タンパク質をコードする。ｐＢＢＧ３プラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ細胞をアンピシリン［１００ｍｇ／ｌ］を補った５００ｍ１　ｌ−リブシン大豆ブイヨン［３０ｇ／ｌ］中、３７℃で一晩生長させた。融合タンパク質を、Ｎｙｇｒｅｎら［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、１：６９−７４］に従ったＨ３Ａ−セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーによりｐａｒｉｐｌａｓｍｉｃスペース及び培地から精製した。

Ｇ３をコードする遺伝子フラグメントを、実施例１のＭ３遺伝子に関する記載通り、固相部位特異的突然変異によりＧ３配列を停止する停止コドンを除去後、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限したｐＲＩＴ２８ＥＧ３から回収した。制限フラグメントを同様に制限したｐｓＢＢｍｐ１８Ｘ旧こ連結すると、プラスミドｐＳＢＢＧ３ＸＭ［図１０］が得られた。プラスミドｐｓＢＢＧａＸ旧よ、ＳＰＡ由来のシグナルペプチド、ＳＰＧから誘導した血清アルブミン結合ＢＢ領域、Ｒ８ｖ抗原性ペブチＦＧ３及びＳＰＡ由来の細胞壁結合ＸＩ領領域含むテトラペプチド誘導タンパク質をコードする。

プラスミドｐｓＢＢｍｐ１８ＸＭ及びｐｓＢＢＧ３ＸＩＩを、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｘｙｌｏｓｕｓ［詳細に関しては、「出発物質」を参照］から調製したプロトプラストに形質転換し、細胞を一晩生長させた。

実験の開始時に、６週齢のメスのネズミＯＦＩ　４匹［ＩＦＦＡＣＲＥＤＯ９Ｆｒａｎｃｅ］に各々、経口的に、ｐＳＢＢＧ３ＸＭプラスミドを含有する一晩成長させた培地由来の１０”　Ｓ、　ｘｙｌｏｓｕｓ細菌［改良Ｎｅｕｂａｕｅｒ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｃｈａｍｂｅｒを使用して顕微鏡で計測］を、３週間、続いて４３日後に第２期の３週間に、各火曜日、水曜日、木曜日及び金曜日に投与した。２１．２８．３５及び６３日目に血液を個々に採集し、ＥＩＩＳ＾アッセイでコーティング抗原として精製ＢＢＧ３タンパク質を用いて抗ＢＢＧ３抗体の存在を試験した。ミクロ滴定プレートをＢＢＧ３の１．２５μｇ／ｍｌ溶液で一晩被覆し、次いでＰＢＳ中の１％スキムミルクで２時間飽和させた。免疫感作したネズミか４の血液サンプルを装填し、インキュベーション後に濯ぎ、結合抗体を色素産生細菌アルカリ性フォスターゼ基質と一緒に抗マウスＩｇＧ−アルカリ性フォスターゼ結合体［Ｓｉｇｍａ　Ｉｎｃ、試薬Ｎｏ、＾１９０２］を使用して検出し、４０５ｎｍでモニターした。試験は、負の対照として０日に採取した血清で３回実施し、ウサギ抗ＢＢＧ３ポリクローナル血清を正の対照として使用した。図１１に示された結果は、処置６３日間に４匹全部の動物でＢＢＧ３特異的免疫応答が発達したことを示している。

ＦＩＧ、１ＡＦＩＧ、３ＦＩＧ、５ＦＩＧ、６ＦＩＧ、９ＦＩＧ、ＩＯプラスミドｐｓＢＢＧ３１Ｍを含有すルｓ、　ｘｙｔｏｓｕｓ　（＋）最初の処理後からの日数補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）特許庁長官　麻　生　渡　殿　平成５年１１月１２日１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＳＥ　９２１００３０４２、発明の名称　シグナルペプチド、選択的相互作用ポリペプチド及び膜固定配列をコードする組換えＤＮＡ配列３、特許出願人住　所　フランス国、エフ−９２１００・ブーローニュ、プラス・アベル・ガンス、４５名　称　ビニール・ファープル・メゾイカマン４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル６、添附書類の目録（１）補正書の翻訳文　１通請求の範囲１、ダラム陽性菌の表面上に天然では知見されず、且つ選択的相互作用し得る第２のアミノ酸配列をコードする第２のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合した、グラム陽性宿主中で操作可能なシグナルペプチドとして操作する第１のアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ配列であって、第２のＤＮＡフラグメントは、細胞壁拡張及び膜固定配列としてグラム陽性宿主中に操作可能な第３のアミノ酸配列をコードする第３のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合しており、第２のアミノ酸配列が抗原的な作用が可能であるかその抗体（免疫グロブリン）またはその活性フラグメントである、該組換えＤＮＡ配列。

２、前記第２のＤＮＡフラグメントがワクチン接種の目的または抗体産生に有用な免疫応答を誘引し得るアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１に記載の組換えＤＮＡ配列。

３、前記第３のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌タンパク質Ａまたは連鎖球菌タンパク質Ｇの細胞壁拡張及び膜固定領域をコードすることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ配列。

４、前記第１のＤＮＡフラグメントがグラム陽性菌細胞から由来することを特徴とする請求項１〜３のいずれが１項に記載の組換えＤＮＡ配列。

５、前記第３のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌タンパク質Ａの細胞壁拡張及び膜固定領域をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ配列。

６、前記第１のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌タンパク質Ａのシグナルペプチドをコードすることを特徴とする請求項５に記載の組換えＤＮＡ配列。

７、請求項１〜６のいずれか１項に記載であり、グラム陽性菌宿主中で複製可能である組換えＤＮＡ配列を含む発現ベクターまたはプラスミド。

８、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ配列を含有するか、請求項７に記載のベクターまたはプラスミドにより形質転換されたグラム陽性菌細胞。

９、一種の特異的な組換え表面レセプター構造体を保持する細胞を同定及び／または単離し得る特異的相互作用パートナ−で細胞の前記異種集団を相互作用させる段階を含む、種々の組換え表面レセプター構造体を保持する細胞の異種集団から請求項８に記載のグラム陽性菌細胞を選択的単離または同定するための方法。

１０、前記レセプター構造体が抗体またはその活性フラグメントから構築されることを特徴とする請求項９に記載の方法。

１１、固定形の前記相互作用パートナ−を前記特異的構造体を保持する細胞の単離に使用することを特徴とする請求項９または１ｏに記載の方法。

１２、前記相互作用パートナ−が固体支持体上で固定されていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。

国際調査報告＋＋ｍｎ内ｍｅ＋＋ｎｌ＾−＄１１−１＋−Ｎ−、ＰＣＴ／ＳＥ９２１００３０４国際調査報告：：、：ｍ’ニー；こ”：ｍ’＋ｒＺａ＊１Ｍ：ニー＝；°３°ｎ＋ｈ：−ン’ Ｚｎ：＋ｈＰ：ｌｅ”＋ｌ°゛；、ニア；：％Ｅ：１，７ｏAｔ、Ｗ７＋ｒｃｌｌ＋＋ｍ１ｐｔｈｅ＊ｍａ＋＊”７，１１７ｍ、１７°３２ｍｌ１ｎｅｔｌＩ＄＊１ｌｈｔｒｅｅｓｙｂ曙−ｍ＋ｍｌ＋ｈ〜ｌ＋’ｔｌａｌｌｉｅｓＩｎ１＋＋ｅ＋ｌＩＶｍｈｌｅＩ＋＜ｌｋＭｊｅｕＭｌｃｕ１ｍｍ＋ｈ＋ｃｈａｍｍ＋−イ P１１１＠＋ｖ＊＊１ｍ１ｍ５’Ｉ％Ｉｔｅｌｉｍｅ＋ｖｎｓｌｉｍフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１３ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｆ　９０１５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）（７２）発明者　ユーレン、マテイアススウェーデン国、ニス−７５２３９・ウプツサラ、クバルンボガータン・３０Ｉ（７２）発明者　ングエン、ティアン・ンゴツクフランス国、７４１６０・サン・ジュリアン、リュ・ジェネラル・バクトッド・２

Claims

【特許請求の範囲】

１．グラム陽性菌の表面上に天然では知見されず、且つ選択的相互作用し得る第２のアミノ酸配列をコードする第２のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合した、グラム陽性宿主中で操作可能なシグナルペプチドとして操作する第１のアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ配列であって、第２のＤＮＡフラグメントは、細胞壁拡張及び膜固定配列としてグラム陽性宿主中に操作可能な第３のアミノ酸配列をコードする第３のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合している該組換えＤＮＡ配列。
２．前記第２のアミノ酸配列が抗原的に作用し得ることを特徴とする請求項１に記載の組換えＤＮＡ配列。
３．前記第２のアミノ酸配列が抗体（免疫グロブリン）またはその活性フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の組換えＤＮＡ配列。
４．前記第３のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌タンパク質Ａまたは連鎖球菌タンパク質Ｇの細胞壁拡張及び膜固定領域をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ配列。
５．前記第１のＤＮＡフラグメントがグラム陽性菌細胞から由来することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ配列。
６．前記第３のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌タンパク質Ａの細胞壁拡張及び膜固定領域をコードすることを特徴とする請求項４または５に記載の組換えＤＮＡ配列。
７．前記第１のＤＮＡフラグメントがブドウ球菌タンパク質Ａのシグナルペプチドをコードすることを特徴とする請求項６に記載の組換えＤＮＡ配列。
８．前記第２のＤＮＡフラグメントガワクチン接種法または抗体の産生に有用な免疫応答を誘引し得るアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ配列。
９．請求項１〜８のいずれか１項に記載であり、グラム陽性菌宿主中で複製し得る組換えＤＮＡ配列を含む発現ベクターまたはプラスミド。
１０．請求項９のベクターまたはプラスミドにより形質転換されたか、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ配列を含有するグラム陽性菌細胞。
１１．一種の特異的な組換え表面レセプター構造体を保持する細胞を同定及び／または単離し得る特異的相互作用パートナーで細胞の前記異種集団を相互作用させる段階を含む、種々の組換え表面レセプター構造体を保持する細胞の異種集団から請求項１０に記載のグラム陽性菌細胞を選択的単離または同定するための方法。
１２．前記レセプター構造体が抗体またはその活性フラグメントにより構築されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
１３．前記特異的構造体を保持する細胞を単離するために固定形の前記相互作用パートナーを使用することを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
１４．前記相互作用パートナーが固相支持体上で固定されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。