JPH09504181A - 蛋白のディスプレー方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ピリンタンパク質又はその一部と異種のポリペプチド（標的タンパク質）とを含む、融合タンパク質に関する。好ましい一具体例においては、本発明は、線毛を形成する能力のある細菌宿主細胞の外表面に標的タンパク質を表示させるための方法に関する。ある具体例においては、線毛がバクテリオファージ吸着及び感染のための受容体であることが望ましい。Ｆ線毛が好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白のディスプレー方法 本発明は一般にはバクテリアの表面にポリペプチドおよび蛋白の輸出およびデ ィスプレーに関する。抗原的に活性な蛋白、特異性結合タンパクおよび酵素活性 タンパクを含む、タンパクのディスプレー、修飾、選択および精製のための方法 を提供する方法が提供される。本発明の背景 バクテリアおよびバクテリアファージの表面上のタンパクの発現は一部は組換 え抗体生産の関心のため数年の間追求されて来た。遺伝子工学的な全細胞吸着剤 の生産、ペプチドライブラリの構築、細胞結合酵素、そして抗体を発生する生ワ クチンまたは免疫原の使用を含む、多数の他の可能な応用が存在する。ＷＯ９２ ／０１０４７およびＷＯ９３／１０２１４を見よ。 バクテリアにおいては、表面発現異質タンパクを得る一つのアプローチは、異 質タンパクのための担体として天然膜タンパクの使用であった。一般にバクテリ ア表面上にタンパクを固定する方法を開発しようとする試みの大部分は、得られ るハイブリッドもやはり表面に局在化されるであろうとの希望をもって、所望の 組換えポリペプチドを通常細胞外側へ露出している天然タンパクへ融合すること に集中していた。しかしながら大部分の場合、異質タンパクは局在化を妨害し、 そのため融合タンパクは細胞表面へ到達できない。これらの融合は正確でない細 胞位置で終わるか、または周辺質に面す る分泌タンパクドメインと膜中でアンカーされるかである。Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：２７３６（１９９０） Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，８９：２７１３（１９９２）は外側膜の外側に露出したＣ末端を残したｏｍ ｐＡから得られた配列へ融合したｌｐｐＮ−末端標的配列によりなる表面発現ビ ヒクルの構築を報告した。これらの融合はβ−ラクタマーゼ、一本鎖Ｆｖ抗体お よびセルロース結合タンパクを含む多数の異質タンパクをＥ．ｃｏｌｉへ輸出す ることが報告されている。ＷＯ９３／１０２１４参照。加えて、Ｆｕｓｃｈｓ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９（１９９１）は、 Ｅ．ｃｏｌｉペプチドグリカン関連リボタンパク（ｐａｌ）とリゾチーム結合一 本鎖Ｆｖ抗体フラグメントの間の融合はバクテリアの表面で検出できたと報告し た。しかしなからこれらの系においては、ディスプレーされたタンパクは細胞へ 付着しており、そのため精製したタンパクを単離するためにはそのタンパクをコ ードするＤＮＡを他の系へサブクローンしなければならない。 抗原および抗体を含む組換えタンパクをフィラメント状バクテリオファージの 表面にディスプレーするためのシステムが開発された。ＷＯ９２／０１０４７を 見よ。これらシステムにおいては、組換えタンパクは遺伝子III（マイナーコー トタンパク）が遺伝子VIII（主コートタンパク）によって発現されるファージコ ートタンパクへ融合される。ディスプレーファージは組換えタンパクの結合タン パクによって選択的にエンリッチされることができる。加えて、ファー ジは組換えタンパク／遺伝子III融合の発現のためのベクターを担持し、ディス プレーファージの伝播を許容する。この系の一利益は、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆｖ 抗体フラグメントのような種々のタンパクの大きなライブラリをファージ上にデ ィスプレーでき、そしてその結合特性に基いて選定できることである。一つの不 利益はそのファージによってディスプレーされる異型タンパク分子の数が低く、 そのため選定プロセスを複雑化することである。ファージ系についての他の不利 益は、現在のバクテリア系と同様に、エンリッチないし富化プロセスがかなりの 量の結合タンパク、例えば抗原を必要とし、低い結合親和性を有する組換えタン パク、例えば一本鎖抗体の単離を発生し得る選定および再増幅の反復ラウンドを 含むことである。 バクテリアディスプレーおよびファージディスプレーを組合せるディスプレー 系は未だ開発されていない。そのような系は非常に望ましいであろう。 結合タンパクの富化および精製の必要性をなくすディスプレーおよび選定方法 を持つことが望ましいであろう。本発明の概要 本発明はピリンタンパクもしくはその一部分と異型ポリペプチド（標的タンパ ク）を含んでいる融合タンパクに関する。好ましい具体例において、本発明は毛 を形成することができるバクテリア宿主細胞の外表面上に標的タンパクをディス プレーする方法に関する。いくつかの具体例において毛はバクテリオファージ付 着および感染のためのレセプターであることが望ましい。Ｆ毛が好ましい。 融合タンパクは、融合タンパクの分泌を仲介することができるリ ーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメント、ピリンサブユニットをコー ドするＤＮＡセグメント例えばｔｒａＡ遺伝子生産物、および標的タンパクをコ ードするＤＮＡセグメントを有するキメラＤＮＡから発現される。加えて、高い 親和性結合タンパクをディスプレーするファージは低親和性結合タンパクをディ スプレーするファージよりも高い速度で感染し、複製する。このことは、これら のファージはディスプレーバクテリアの培養物中での継続成育と共に選択的に富 化されるため、潜在的な結合タンパクのライブラリーをディスプレーするファー ジが選択的に富化されることを許容する。特異的結合ペアのメンバーをコードす るＤＮＡをその後ディスプレーバクテリア宿主から単離することができる。 ここで使用するように、バクテリアファージは融合タンパクをコードするファ ージミドヘクターを担持するＥ．ｃｏｌｉ宿主から救出したファージを含む。そ のようなファージはディスプレーバクテリアを感染させることができるけれども 、それらは必要なファージ遺伝子を欠いているため再感染のための粒子を生産す ることができず、そのため再感染を望む方法には使用することができない。 一具体例において、特異性結合ペアのメンバーをコードするＤＮＡは、例えば 変異化株の使用によって変異され、そして本発明方法は変えられた親和性、例え ば増加した親和性を有する特異性結合ペアのメンバーを選定するために使用され る。他の具体例においては、化合物が特異性結合ペア相互作用に影響する、例え ば阻害または増強するそれらの能力についてテストされることができる。 本発明において有用な標的タンパクは、ペプチド、タンパク例えばホルモン、 酵素、阻害剤およびレセプター、抗原、抗体フラグメ ントを含む抗体、一本鎖抗体および特異性結合ペアのメンバーを含む。代わりに 、標的タンパクはそのようなタンパクの誘導体または類縁体でもよい。特異性結 合ペアはペアの一方が他の分子へ結合する区域を有する天然に得られる、もしく は合成によって製造した任意の一対の分子を含む。そのような特異性結合ペアの 例は、抗原と抗体、ホルモンとホルモンリセプター、リセプターとリガンド、酵 素と基質およびＩｇＧとタンパクＡを含む。 本発明のタンパクディスプレー方法の他の用途は、例えばエピトープマッピン グ、抗体ライブラリーのスクリーニング、および生バクテリアワクチンを含む。図面の簡単な説明 図１は、ｔｒａＡ発現ベクターｐＰＲ３５の特徴を示す図である。 図２は、ｐＰＲ３５の構造を説明する。 図３は、ＰＣＲ増幅およびベクター構築に使用されるオリゴヌクレオチド（配 列ＩＤ Ｎｏ．１−１６）を説明する。 図４は、ｐＰＲ３５ ｔｒａＡ融合タンパクのヌクレオチド（配列ＩＤ Ｎｏ ．１７）およびアミノ酸配列（配列ＩＤ Ｎｏ．１８）を説明する。 図５は、ｐＧＨ２１の構造を説明する。 図６は、コロニー免疫ブロッティングによるバクテリア宿主細胞表面上の抗原 の検出を示す。 図７は、細胞表面上の抗原標識発現を示すグラフである。 図８は、細胞表面上の組換え抗体発現う示すグラフである。 図９は、細胞表面の抗ＣＫ−ＭＢ活性の検出を示すコロニーブロ ックである。 図１０は、ｆｄ遺伝子IIIタンパク構造機能分析を示す。 図１１は、バクテリアファージ／ピリン相互作用系を図示する。 図１２は、組換えタンパク／遺伝子IIIｐΔＢＳ融区域を示す。 図１３は、π−タンパク遺伝子IIIｐΔＢＳディスプレーファージミド構成の ためのスキームを示す。 クローニングに使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。 図１４は、π−タンパク／遺伝子IIIｐΔＢＳディスプレーファージベクター の構造を示す。 図１５は、部分的に精製したＴＡ−１ ｓｃＦｖ／ＥＥ標識／ｔｒａＡ融合タ ンパクのウエスタンブロック分析を示す。ＸＬ１−Ｂ／ｐＧＨ２１細胞（１Ｌ） を発育させ、そしてＴＡ−１／ＥＥ標識 ／ｔｒａＡ融合タンパク発現を実施例２のようにＩＰＴＧで誘発した。バクテリ アピリンタンパクを、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｌｏｇｙ ，１４６（１）：２５１−２５９（１９８１）に記載されているように、細胞か ら毛を剪断し、ＰＥＧ沈澱することにより部分精製した。誘発した細胞（細胞溶 解質レーン）中および部分精製したタンパク（ＰＥＧ沈澱レーン）はプローブと して抗ＥＥ標識ｍＡｂ−ＨＲＰを使用してウエスタン分析によって検査された。 ＴＡ−１／ＥＥ標識／ｔｒａＡ融合タンパクに相当するバンドが示された。積み 重ねゲルのトップにある免疫反応性質は分解ゲル中へ入らない凝塊した融合タイ パクである。本発明の詳細な説明 Ｆ毛はＦプラスミドを担持する細胞表面上に見られるフィラメントである。そ れらはバクテリア接合の間適切な結合ペアを確立するために必須であり（Ｉｐｐ ｅｎ−Ｉｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｎｋｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２ ０：５９３−６２４（１９８６）を見よ）、そして３つのクラスのバクテリアフ ァージＲ１７，ＱＢおよびｆｄの結合部位である。Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈ，Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ．８５−１１ １（１９７５）参照。毛のトップは受容体細胞（結合ペア生成）または他のドナ ー細胞（表面排除）の認識に関与するものと考えられており、そしてフィラメン ト状ファージｆｄの結合部位である。毛の側部はＲ１７およびＱＢに代表される 球状ファージの二つのタイプの結合部位である。 Ｆ毛の合成はＦプラスミド上の転送区域によってコードされる１３以上の遺伝 子産物を必要とする。Ｉｐｐｅｎ−Ｉｈｌｅｒ ａｎ ｄ Ｍｉｎｋｌｅｙ前出参照。Ｆ毛はｔｒａＡ遺伝子によってコードされる７， ２００ダルトンの単一サブユニットより構成される。当初のｔｒａＡ遺伝子産物 は５１個アミノ酸リーダー配列を含んでいるプロピリン（１３，２００ダルトン ）である。ピリンサブユニットはアミノ末端でアセチル化され、そしてｔｒａＧ はこのプロセスに関与すると考えられている。Ｉｐｐｅｎ−Ｉｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｎｋｅｙ前出およびＷｉｌｌｅｔｔｓ ａｎｄ Ｓｋｕｒｒａｙ，Ａｍｅ ｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：１１１ ０−１１３３（１９８７）。 Ｆ様プラスミドは血清学的に（Ｌａｗｎ ａｎｄ Ｍｅｙｎｅｌｌ Ｊ．Ｈｙ ｇ．，６８：６８３−６９４（１９７８）：Ｍｙｎｅｌｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｉｌｉ，ｐｐ．２０７−２３４（１ ９７８））により、ファージ感受性パターンまたは表面排除により（Ｗｉｌｌｅ ｔｔｓ ａｎｄ Ｍａｕｌｅ，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．４７：１−１１（１９８６ ））区別することができる毛の既知の４タイプをコードする。これらの毛は受容 細胞表面上の異なるレセプターを認識するものと考えられている。Ｈａｖｅｋｅ ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５５：１８５−１８９（ １９７７）。４タイプからの典型的ピリン遺伝子が配列化され（Ｆｒｏｓｔ，ｅ ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６４：１２３８−１２４７（１９８ ５））、そしてタンパク配列の変化はアミノ末端に見られ（Ｆｉｎｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：３３１−３３５（１９８５））、 カルボキシ末端はそのタンパクの抗原性に影響する（Ｆｒｏｓｔ，ｅｔ ａｌ． 前出）。４タイプの毛はＦ 特異性ファージへ結合するそれらの能力において異なり（Ｍｅｙｎｅｌｌ前出） 、これはピリン配列の違いを反影する。しかしながらアミノ末端は、異なるアミ ノ末端もｆｄファージへ等しく結合するので（Ｆｒｏｓｔ，ｅｔ ａｌ．前出お よびＦｉｎｌａｙ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：９９０−９ ９８（１９８６））、ファージ結合に関与しないように見える。ファージ結合に 多分影響する配列の変化はタイプIVピリン（Ｒ１００−１プラスミドによって代 表される）中の残基１１と１４において、そしてタイプIIIピリン（Ｒ１−１９ プラスミドによって代表される）中のカルボキシ末端において起こる。ポリクロ ーナル抗血清（Ｗｏｒｏｂｅｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６ ７：６６０−６６５（１９８６））およびモノクローナル抗血清（Ｆｒｏｓｔｅ ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１９２−１９８（１９８６）） による研究は、アミノ末端の主要エピトープが毛の端部において先端特異的態様 に露出していることを示した。ピリンタンパクのカルボキシ末端に含まれるマイ ナーエピトープは毛の側部に露出している。 本発明方法はバクテリア宿主細胞の外表面上の異型ポリペプチド（標的タンパ ク）をディスプレーに関する。この方法は、ピリンタンパクまたはその一部分と 毛を形成し得るバクテリア宿主細胞中の標的タンパクを含んでいる融合タンパク の発現よりなる。融合タンパクは、融合タンパクの分泌を仲介することができる リーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメントと、ピリンタンパクをコー ドするＤＮＡセグメントと、そして標的タンパクをコードするＤＮＡセグメント を有するキメラＤＮＡから発現され、これらＤＮＡセ グメントは宿主細胞からその表面上に標的タンパクを発現するように作動的に連 結される。 毛を形成し得る任意のバクテリア株がキメラＤＮＡの発現のためのバクテリア 宿主細胞として使用できる。ＦまたはＦ様毛を生成し得る株が好ましい。そのよ うな株はＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｐｐｅｎ−Ｉｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ〔Ａｒｔｚ．Ｓ．Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，Ｄ． Ｂｌｕｍ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓｈａｎｄ，Ｒ．（１９８３）Ｇｅｎｅ ２６，１４ ７−１５８〕および他のＦ様プラスミドを担持する他のグラム陰性バクテリアを 含む。特に好ましいＥ．ｃｏｌｉ株はＸＬ１Ｂ（Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５，３７６−３７８）お よびＤ１＋５αＦ’（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，３４６９−３４７８）を含む。いく つかの具体例においては毛を過発現するＥ．ｃｏｌｉ株が好ましい。そのような 株は例えば抑制されたＦ様プラスミドｐＥＤ２０８を担持するもの（Ｆｒｏｓｔ Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４，１２３ ８−１２４７）を含む。 キメラＤＮＡの第１の成分は融合タンパクの分泌を仲介する、すなわち融合タ ンパクを外膜表面へ指向させることができるリーダーアミノ酸配列をコードする ＤＮＡセグメントである。そのような配列は、例えば、ｔｒａＡリーダー配列、 ｐｈｏＡリーダーまたはｐｅｌＢリーダーを含む。ｔｒａＡリーダー配列が好ま しい。ｔｒａＡリーダー配列はＦプラスミド鋳型からＰＣＲ増幅によって得るこ とができる。Ｆプラスミドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１Ｂの ようなバクテリア細胞から入手し得る。典型的なｔｒａＡリーダー配列が図４に 記載されている。 キメラＤＮＡの第２の成分は細胞表面上に標的タンパクをジィスプレーできる ピリンタンパクサブユニットもしくはその一部分である。変異分析はアミノ酸１ ８ないし６８間のピリンサブユニットの区域は毛アセンブリに必要なエレメント を含んでいることを示唆する。Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ ｅｎｅｔ．２１３：１３４−１３９（１９８８）。ｔｒａＡ遺伝子産物が好まし い。 Ｆ−ピリン水治法プロフィルは、その分子は４ドメインより組織されることを 示唆する。Ｐａｉｖａ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２６７，２６１９１−２６１９７。Ｎ末端ドメインに存在するアミノ酸 の数およびタイプの変動性が異なるＦ様ピリンタンパク中に観察され（Ｆｒｏｓ ｔ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．前出）、この領域は毛アセンブリおよび細胞表面上の ディスプレーに除外できることを示唆する。ＴｒａＡ遺伝子がクローンされ、Ｆ およびＣｏｌＢ２（グループII）、Ｒ１−１９（グループIII），Ｒ１００−１ （グループIV）およびｐＥＤ２０８（グループＶ）を含む多数の関連するＦ様プ ラスミドから配列化されている。Ｆｉｎｌａｙ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８ ４）Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．１６０：４０２−４０７；Ｆｒｏｓｔ．Ｌ．Ｓ．ｅ ｔ ａｌ（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０：３９５−４０１；Ｆｒ ｏｓｔ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）；Ｆｉｎｌａｙ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａ ｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：９９０−９９８。これら遺 伝子は相互に高い相同性を示 し、そして異なるＦ様プラスミドを担持する細胞によって混合毛の生成によって 強調されるように、形態的および機能的に類似の構造よりなるピリンタンパクを コードする。Ｌａｗｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９７１）Ａｎｎ．Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒｌ２０：３−８。種々のｔｒａＡ遺伝子の配列が入手し 得るので、ｔｒａＡ遺伝子産物をコードするＤＮＡは、例えばＦプラスミド鋳型 からのＰＣＲ増幅を含む多数のソースから容易に単離することができる。ＰＣＲ 増幅の詳細については実施例１を見よ。典型的なＦプラスミドｔｒａＡ遺伝子配 列は図４に記載されている。 キメラＤＮＡの第３成分によってコードされる標的タンパクは、ペプチド、タ ンパク例えばホルモン、酵素、阻害剤、レセプター、抗原、抗体フラグメント（ 例えばＦａｂ，Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂）を含む抗体、１本鎖抗体、およ び特異性結合ペアのメンバーを含むことができる。代わりに、標的タンパクはそ のようなタンパクのどれかの誘導体または類縁体でもよい。特異性結合ペアは天 然誘導または合成的に製造した分子の任意のペアを含む。そのような特異結合ペ アの例は、例えば抗原と抗体、ホルモンとホルモンレセプター、レセプターとリ ガンド、酵素と基質、およびＩｇＧとタンパクＡを含む。 多数の標的タンパクのヌクレオチド配列は多数のコンピューターデーターベー ス、例えばＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬおよびスイスＰｒｏｔを通じて容易に入手 し得る。これら情報を使用して、所望の標的タンパクをコードするＤＮＡ配列を 化学的に合成することができ、またはそのようなＤＮＡ配列はこの分野で日常的 な操作、例えはＰＣＲ増幅を使用して得ることができる。 ＤＮＡ配列は、融合タンパクの発現が細胞表面上の標的タンパクのディスプレ ーを招来し、“ディスプレーバクテリア”と称されるものを形成するように位置 決めされる。 標的タンパクは、細胞表面上に標的タンパクをディスプレーできるピリンタン パクの任意の部分へ融合することができる。ピリンタンパクのアミノ末端領域へ の融合が好ましい。 細胞表面上の標的タンパクの成功的ディスプレーは多数の方法を使用して検出 することができ、例えばもし標的ペプチドが膜を通って作用しない操作によって 特異的に標識できるならばその細胞表面ディスプレーを容易に示すことができる 。これはラクトペルオキシダーゼの存在下チロシル残基のヨード化（¹²⁵Ｉ）に よって実施することができる。Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．１２４：９２１−９２７（１９７１）；Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｓｗ ａｎｓｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：５７５−５８４（１９７８ ） 加えて、標的タンパクが外部からインタクトな細胞へ加えたプロテアーゼへア クセスできるかどうかを検査することができる。プロテアーゼの作用はＳＤＳ− ＰＡＧＥにポリペプチドの分裂を見ることにより、またはポリペプチドの他の性 質が影響されたかどうか（酵素活性、抗原性等）を調べることによってモニター することができる。 もし標的タンパクが酵素活性を示すならば、そのような活性を細胞表面ディス プレーの標示に使用することができる。これはもし外側膜を横切ることができな い基質が入手できれば可能である。ニトロセフィンはβ−ラクタマーゼに対する そのような基質である。Ｏ ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１： ９６３−９６９（１９７２）；Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ａｎｄ Ｐｕｇｓｌｅｙ， Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４（７）：１１０１−１１０９（１９９０）。 外側膜がハイブリッドタンパクが発現された時基質に対し真に不透過性であるこ とを確かめることが重要である。 標的タンパクに対する抗体も使用することができる。しかしながらこれらの方 法は制限がある。第１に融合タンパクは標的タンパクが使用した抗体によって検 出されないコンホメーション中に拘束され得る。Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ． ，Ｅｍｂｏ．Ｊ．，５：３０２９−３０３７（１９８６）；Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１９０５３−１９０５９ （１９８８）。第２に、もし抗体が標的内の短いペプチド（例えば１０残基以内 に含まれるエピトープ）へ標的されれば、結果はこのエピトープ上の情報を与え るのみであり、そのため陽性の結果はこの短いペプチドが露出していることのみ を指示し、他方陰性の結果は標的タンパクの何らかの他の部分は露出していない ことを意味しない、該エピトープ部分にはアクセスできないことを指示し得る。 バクテリアへの抗体の結合は多数の異なる技術で調べることができる。そのよ うな方法は、バクテリア凝集、免疫蛍光、インタクト細胞でのＥＬＩＳＡ，イン タクトセルでのＲＩＡ，免疫電子顕微鏡術，および補体の標的作用を含む。Ｍ． Ｈｏｆｍｕｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３４：７ ７（１９９１）を見よ。 キメラＤＮＡは宿主細胞染色体中に集積するか、またはベクター内に担持させ ることができる。ＤＮＡを宿主細胞内に集積するための方法は良く知られており 、そして例えば均質組換を含む。Ｗｉｎｏｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ．１６１：２１９−２２１（１９８５）を見よ。キメラＤＮＡは組換え ベクター例えばプラスミド中に担持させることができる。組換えベクターが好ま しい。 本発明の組換えベクターはベクター骨格とキメラＤＮＡを含む。組換えベクタ ーはキメラＤＮＡへ作動的に連結した誘発し得るプロモーターを含むことができ る。プロモーターはこの分野では良く知られ、融合タンパクの発現のためにどん な細胞タイプを使用すべきかに応じて容易に選ぶことができる。リーダーをコー ドするＤＮＡセグメントは好ましくはプロモーター配列の下流に配置される。ｔ ｒａＡリーダーが好ましい。標的ペプチドをコードするＤＮＡセグメントはリー ダー配列の下流に配置される。ｔｒａＡ遺伝子産物をコードするＤＮＡセグメン トは好ましくは標的ペプチドをコードするＤＮＡの下流に配置される。 ベクター骨格として有用なプラスミドは、宿主細胞と共存し得る種から得たレ ペリコンおよび制御配列を含んでいるプラスミドを含む。例えは、もしＥ．ｃｏ ｌｉを宿主細胞として使用すれは、ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１８またはｐＢＲ３２２ のようなプラスミドを使用し得る。 ＤＮＡセグメント間に標的タンパクをコードするＤＮＡの挿入またはＤＮＡラ イブラリの挿入を許容するように組入れたクローニング部位を持ったｔｒａＡ ＤＮＡセグメントとｔｒａＡリーダーＤ ＮＡよりなるベクターを構成することができる。このベクターは誘発し得るプロ モーターおよびマーカー遺伝子、例えば抗生物質抵抗性を含むことができる。 本発明の好ましい組換えベクターはプラスミドｐＰＲ３５である。このプラス ミドはｔｒａＡリーダーＤＮＡセグメントと、そしてｐＵＣ１９の誘発し得るｌ ａｃＺプロモーターの下流のｔｒａＡＤＮＡセグメントを含んでいる。Ｎｃｏｌ ，ＳｆｉｌおよびＮｏｔｌのためのクローニング部位がｔｒａＡリーダーおよび ｔｒａＡタンパク配列の間に組込まれ、標的ペプチドをコードするＤＮＡセグメ ントの挿入を許容する。加えて、ＥＥ標識抗原をコードするＤＮＡ配列がｔｒａ ＡリーダーおよびｔｒａＡタンパク配列の間に配置され、融合タンパクの検出お よび発現ディスプレー系の特徴化を許容する。 宿主細胞へキメラＤＮＡの導入は当業者に既知の任意の方法によって実施し得 る。例えば、ＤＮＡが組換えベクターに担持されていれば、ベクターは例えばト ランスフォーメーション、エレクトロポレーション、ファージトラスフェクショ ン等によって導入することができる。 上に述べた検出技術は本発明の方法が稼働すること、すなわち融合ピリンタン パクが発現され、バクテリア細胞表面へ輸送され、そして標的タンパクがアクセ スし得る、すなわちディスプレーされるように配向されることを検証するために 当初に使用することができる。 標的ディスプレーする細胞は、例えばアフィニティー分離技術を使用してディ スプレーしないものから分離することができる。その ような技術はアフィニティーカラムクロマトグラフィー、アフィニティーマトリ ックス材料からのバッチ溶出、および蛍光活性化細胞選別を含む。 本発明によって製造されるバクテリアディスプレーライブラリは、丁度ファー ジと同じようにアフィニティークロマトグラフィーによって分離することができ る。バクテリア細胞はもっと大きいので、カラム中の詰まりおよびバクテリアの 非特異性保持を防止するようにローディング中注意しなければならない。その後 細胞はカラムを通って遊離抗原を通すことにより、または低ｐＨによって溶出す ることができる。グラム陰性バクテリアはファージのように低ｐＨに対して抵抗 性ではないけれども、ｐＨ３．３において少なくとも１０分間は細胞生存の意味 ある減少はない。Ｍａｒｔｉｎｅｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，９：１７０（１９９１）。このため低ｐＨによる溶出および急速中和を 強い結合クローンの単離のために使用できる。 所望の標的タイプをディスプレーする宿主細胞（ディスプレーバクテリア）は 、その後さらに培養し、そして融合タンパクを得るために使用し得る。もし望む ならば、標的タンパクをピリンタンパクから分離し、当業者には良く知られたピ リン精製技術を使用してさらに精製することができる。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ．１４６（１）：２５１−２５９（１９８１） 一旦所望の標的タンパクがディスプレーされれば、異型ポリペプチドをコード するＤＮＡを例えば変異剤の使用によって変異させることができ、そして一つ以 上の標的へ結合するペプチドを同定し、選定するためのアフィニティー分離技術 を使用することができる。 本発明のディスプレー方法は組換えタンパクの検出および特徴化のために使用 することができる。例えば、この方法は以下の未特徴化エピトープをマップする ために使用することができる。（１）ランダムペプチドまたは（２）関心ある免 疫反応性タンパクから得られたペプチドのライブラリーをコードする配列は本発 明のｔｒａＡ発現ベクター，例えばｐＰＲ３５にクローニングすることができる 。Ｆ毛を形成することができるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（例えばＸＬ１Ｂ）は次に このベクターバンクで形質転換され、そしてペプチドライブラリーｔｒａＡ融合 タンパクはバクテリア細胞表面上にディスプレーされる。固相基質例えばナイロ ン膜上で成育後、得られたバクテリアは標識した抗体と反応する融合タンパクの 発現についてスクリーニングされる。反応性コロニーを次に取り出し、ベクター を単離することができる。ＤＮＡインサートの配列分析はとのクローンしたペプ チド配列が抗体によって認識されたエピトープへ対応したかを明らかにするであ ろう。 本発明のディスプレー方法は、組換えタンパク活性、例えば抗体の検出にも使 用することができる。例えば、この方法は組換え抗体−ｔｒａＡ融合タンパクの ライブラリーをスクリーニングするために容易に適用できる。これらのライブラ リーはヘビーおよびライト可変領域遺伝子の組合せ１本鎖遺伝子バンクか、また は特異性組換え抗体遺伝子の変異ライブラリーを含むことができる。（Ｗｈｉｔ ｌｏｗ，Ｍ ＆ Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｄ．（１９９１），Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃ ｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２： ９７−１０５）。α−ＣＫＭＢ ｓｃＦ ｖ−ｔｒａＡ融合タンパクが生物学的に活性なコンホメーションに重ねられたこ とを指示する実施例６および７に述べた結果を基にして、この方法はバクテリア 細胞コロニーの表面上にディスプレーされた組換えタンパク活性の検出に一般的 適用がある。検出すべき活性は結合活性、触媒活性、阻害活性および変化した構 造コンホメーションを含むことができよう。 本発明は一次クローニングシステムとして使用することもできる。例えばｃＤ ＮＡライブラリーを構築することができ、そして本発明のベクター中に挿入し、 ライブラリーをリガンドを結合する能力についてスクリーンすることができる。 このリガンド／結合分子組合せは相互に特異結合する能力を有する分子の任意の ペア、例えばリセプター／リガンド、酵素／基質（もしくは類縁体）、核酸結合 タンパク／核酸等を含むことができる。もし相補的ペアの一方が入手し得るなら ば、これはペアの他方のクローンを単離するための好ましい方法となり得る。 上に論じたように、バクテリア表面上のそれらのタンパクのディスプレーにつ いてクローンした遺伝子の集団の多様性を増すこと、または個々のヌクレオチド 配列を変異することがしばしば必要であろう。どちらの目的にもインビトロまた はインビボ変異技術を使用することができ、当業者には良く知られている。代わ りに変性剤株を使用することができる。変異剤株はその親ＤＮＡに関し変異すべ きその中に複製されたＤＮＡを生ずる遺伝子欠陥を含んでいる株である。そのよ うな株はＥＳ１５７８のようなｍｕｔＤ５変異を担持しているものを含む。それ 故もし遺伝子の集団がこれらの株に導入されれば、それはさらに多様化され、そ して所望によりディスプレ ーおよび選択のため非変異剤株へ移すことができる。 Ｆ毛はＲＮＡバクテリアファージおよびフィラメント状ＤＮＡファージのため のレセプターとして作用するので、本発明のディスプレー方法はファージゲノム をファージによって認識されるタンパクをディスプレーする特定のバクテリア細 胞へ標的するためのファージ上の結合タンパクを使用することができる。例えば 、ファージが細胞内へ入ることを許容する毛／バクテリオファージ相互作用を持 つ代わりに、バクテリオファージが毛と相互作用しそのため細胞中へ入ることを 許容するため抗原／抗体相互作用を使用することができる。フィラメント状ファ ージについては、遺伝子IIIの産物は結合タンパクとして作用し、毛タンパクの Ｎ末端近くの残基との相互作用によるものと信じられる。遺伝子IIIタンパクは 、図１０に示すように、ファージコート中へ組込みに含まれる特異性ドメイン、 ファージ形態、バクテリア毛との相互作用、およびバクテリア細胞内へ侵入によ って形成される。 フィラメント状バクテリオファージに加え、ＱＢ，ＮＳ２，ｆ２およびＲ１７ のようなＲＮＡバクテリアファージはＦ毛と特異的に相互作用し、そして細胞を 感染する。毛へ吸収する能力はビリオンあたり１コピーで存在する変異タンパク Ａ（またはＱβについてＡ₂）によって与えられる。Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈ，Ｗ ．（１９７５）ＲＮＡ Ｐｈａｇｅｓ，ｅｄ．Ｎ．Ｄ．Ｚｉｎｄｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ ｐ．８５−１１２。フィラメント状バクテリオファージの遺伝子IIIタンパクと 同様に、ＲＮＡファージ変異Ａタンパクを感染性に影響なく融合の形成に使用す ることができる。 この方法により、特異的結合ペアの一方のタンパクがディスプレーされ、そし てバクテリア感染のための天然レセプターに代わるディスプレーバクテリアが生 成される。バクテリアファージもまた、正常のピリン相互作用ドメインが特異的 結合ペアの他のメンバーで置換されるように変換される。これはピリン結合ドメ インをコードするファージ接合タンパク（例えばフィラメントファージの遺伝子 IIIタンパクまたはＲＮＡファージのＡタンパク）の領域の除去と、そしてその 場所へ特異性結合ペアの他のメンバーをコードするＤＮＡの挿入によって達成さ れる。キメラ遺伝子はファージゲノム中へまたは組換えファージミド発現ベクタ ー中へ組込むことができる。該遺伝子は次に適当な株例えばＥ．ｃｏｌｉ中に発 現され、そして融合タンパクおよび対応するファージ（またはファージミド）ゲ ノムはバクテリア粒子中にパッケージされる。ファージは次に標準条件下ディス プレーバクテリアと接触させられる。特異性結合ペアの一方のメンバーをディス プレーするファージは他方のメンバーをディスプレーされたタンパク間の相互作 用に基いて認識し、そして感染する。ファージゲノムは次にディスプレーバクテ リアにより内部化される。ファージゲノムで感染されたディスプレーバクテリア は例えばファージからディスプレーバクテリアヘ転移されたマーカー遺伝子例え ば抗生物質耐性の同定によって選択される。特異性結合ペアのメンバーをコード するＤＮＡは次にディスプレーバクテリア宿主から単離することができる。 例えばｆｄファージを使用し、ファージは正常ピリン相互作用ドメイン（例え ば遺伝子タンパクIIIのアミノIII１０７から１９７）が除去され、ディスプレー バクテリア上にディスプレーされた標的タ ンパクへ特異的に結合するポリペプチドによって置換されるように変換される。 このためディスプレーファージはディスプレーされた組換えタンパク間の相互作 用だけに基いてディスプレーバクテリアを認識し感染する。図１１はこの系の一 般的特徴を示す。ファージまたはファージミドゲノムは次に内部化されそして発 現される。転写、ほん訳および複製のための制御信号が存在し得る。もしファー ジまたはファージミドゲノムは所望の標的細胞の選択に有用な配列を含むならば それは特に有用である。有用な配列は、例えば標的細胞へ抗生物質耐性を与える ものである。 本発明の方法に有用なバクテリアファージはピリンタンパクをレセプターとし て利用するフィラメントファージおよびＲＮＡファージを含む。そのようなファ ージはＭＳ２，Ｑβ，Ｍ１３，ｆ１，ｆｄおよびｆｄ−ｔｅｔを含む。加えてそ のようなフィラメントファージから得たファージイミド発現ベクターも使用でき る。これらベクターはプラスミドおよび複製のファージ源および抗生物質耐性を 与える遺伝子を含み得る。好ましいファージはｆｄ−ｔｅｔである（Ｚａｃｈｅ ｒ，Ａ．Ｎ．，Ｓｔｏｃｋ，Ｃ．Ａ．，Ｇｏｌｄｅｎ Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｓｍｉ ｔｈ，Ｇ．Ｄ．（１９８０）Ｇｅｎｅ ９，１２７−１４０）好ましいファージ ミドはｐＢＣのようなｆ１ファージの誘導体である。 この方法の例として、ＥＥ標識抗原がバクテリオファージ表面上に組換えタン パクがディスプレーれるのを許容するように発達させたファージミド発現ベクタ ーを使用してｔｒａＡ融合としてバクテリア毛上にディスプレーされる。このシ ステムを使用し、抗ＥＥ標識ｓｃＦｖがピリン結合領域（アミノ酸１０７−１９ ７）を除去し た遺伝子IIIタンパク（このタンパクを図１０に示した遺伝子IIIｐΔＢＳと呼ぶ ）との融合物としてバクテリオファージ粒子表面上にディスプレーされる。抗Ｅ Ｅ標識抗体とＥＥ標識抗原間の相互作用はディスプレーファージのディスプレー バクテリアを感染する能力によって測定される。ディスプレーバクテリオファー ジを発生するそして感染を測定する特異性戦略は以下の実施例８に述べられてい る。 他の組換えタンパクもバクテリオファージおよびバクテリア表面上にディスプ レーし得る。これらはファージ上にディスプレーされたｓｃＦｖ遺伝子のライブ ラリーおよびディスプレーバクテリア上の特異性抗原ペプチドを含む。特異性ｓ ｃＦｖ抗原相互作用のスクリーニングは１）ｓｃＦｖディスプレーファージミド 粒子の救出および２）ファージと抗原ディスプレーバクテリアとの混合およびマ ーカー例えば抗生物質（クロラムフェニコール）含有寒天プレート上の生育上に よる感性の存在のテストを含む。本発明方法は抗原精製またはエンリッチメント の多数ラウンドおよびファージ増幅ステップを必要としない。 ファージまたはファージミドＤＮＡは得られた耐性コロニーから単離され、候 補ｓｃＦｖ遺伝子を配列化し得る。 バクテリオファージ系システムも組換えタンパクのディスプレーのために構築 できる。例えば発現ベクターは正常遺伝子IIIを抗ＥＥ標識遺伝子IIIｐΔＢＳ融 合遺伝子（図１３）で置換することによりｆｄ−ｔｅｔファージから構築できる 。 このシステムは特異性結合ペアに影響する化合物、例えば阻害剤または助因子 をスクリーンするために使用することができる。 実施例１細菌表面上タンパク質発現のためのｔｒａＡ融合タンパク質ベクターの構築 細菌表面のピリンタンパク質のアミノ末端に融合させたポリペプチドの誘導可 能な発現とディスプレーとを許容するために、システムを設計した。このシステ ムにおいては、関係ポリペプチドをコードする遺伝子がｔｒａＡベクター中にク ローンされそしてＦ⁺細菌株において発現された。ｔｒａＡ発現ベクターは図１ に示した特徴を有するマルチコピーｐＵＣ19ベクターに基づいている。ｔｒａＡ リーダー及びｔｒａＡタンパク質（ピリン）ＤＮＡフラグメントはこの誘導可能 なｐＵＣ19のｌａｃＺプロモーターの下流にクローンされた。ｔｒａＡリーダー は、ピリン融合タンパク質の正しい加工及びディスプレーを許容する。外来のＤ ＮＡ配列の挿入を許容するよう、ＮｃｏＩ，ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩのためのクロ ーニング部位は、ｔｒａＡリーダーとピロンポリペプチド配列との間に導入した 。加えて、融合タンパク質の検出と発現−ディスプレー系の特徴付けを許容する ために、ＥＥタッグ抗原をコードするＤＮＡ配列を、ｔｒａＡリーダーとｔｒａ Ａタンパク質配列との間にクローンした。 ｐＰＲ35ベクターを構築するに必要なステップは、図２に示されそして次に詳 述されている。ｔｒａＡリーダー及びｔｒａＡタンパク質遺伝子フラグメントは 、Ｆプラスミド鋳型からＰＣＲによって別々に増幅された。増幅に使用されたプ ライマーは、図２及び図３に示されている。典型的なＰＣＲ増幅反応（100μｌ ）は、鋳型ＤＮＡとしてのＦプラスミドを担持する１０⁵の煮沸ＸＬ１Ｂ細菌細 胞、１０ｐｍｏｌの適当なプライマー、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ、100 μＭのｄＮＴＰ，５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．３、１． ５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％のゼラチンを含んだ。鋳型は、９６℃にて５分 間の初期インキュベーションによって変性させ、その間Ｔａｑポリメラーゼを、 反応を熱開始させるために加えた。望みの産生物は、５５℃１分間、７０℃１分 間及び９６℃１分間の１０回の熱サイクルによって増幅され、つづいて７０℃１ 分間及び９６℃１分間の２０ステップのサイクルを行った。プライマーによる増 幅は、ＮｃｏＩの５’末端へのＥｃｏＲＩ部位の、及びｔｒａＡリーダーフラグ メントの３’末端へのＢａｎＨＩ部位の、及び５’へのＫａｓＩ部位の、及びｔ ｒａＡタンパク質フラグメントの３’末端へのＸｂａＩ部位の付加をもたらした 。５つの反応からのＰＣＲ産物をプールし、２倍液量のエタノール／０．３Ｍ酢 酸ナトリウムで沈殿させ、得られた産物（約０．２μｇのＤＮＡ）を水に再懸濁 した。ｔｒａＡリーダーＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ及びＢａｎＨＩで消化し、そ してｔｒａＡタンパク質ＰＣＲフラグメントはＢａｎＨＩ及びＸｂａＩで消化し た。消化したフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分け、アガロースゲルか らの溶出により精製した。これらのフラグメントをクローンするために、ＰＵＳ １８ＤＮＡをＫｓａＩで消化し、該部位をＫｌｅｎｏｗＤＮＡによってフィル・ インし、鈍端でリゲーションすることにより、ｐＰＲ５とよぶベクターを作った 。精製された消化されたＰＣＲ産物を次いでＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化したｐＰ Ｒ５にリゲーションした。このリゲーション混合物により形質転換された細菌を これら３つのフラグメントリゲーション上の産物について選別した 。図２にしめされているように、このベクターはｐＰＲ２と呼ばれる。最後に、 アニーリングされた、５’末端にＮｃｏＩ接着性末端及ひ３’末端にＫａｓＩ粘 着性末端を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドによって、ＥＥタッグリンカ ー配列が作られた。このアニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ＮｃｏＩ／ ＫａｓＩ消化されたｐＰＲ２にリゲーションされてｔｒａＡ融合ベクター、ｐＰ Ｒ３５を与えた。ｐＰＲ３５の配列は図４に示されている。 実施例２ 一本鎖抗体遺伝子の単離及びｔｒａＡ融合ベクター中へのクローニング ｔｒａＡ融合ベクターは、ＥＥ抗原のようなペプチド抗原並びに一本鎖抗体の ような他の組換えタンパク質の両方を発現するように設計された。この実施例の 目的のために、特定のモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域が柔軟なポリ ペプチドリンカーによって繋げられているものである、一本鎖抗体遺伝子が作ら れた。プロトロンビンポリペプチドＦ１．２に対するモノクローナル抗体（ＴＡ １）から、及びクレアチンキナーゼ−ＭＢ（α−ＣＫＭＢ）に対するモノクロー ナル抗体から、如何に記述されそして図５に概要がしめされているようにして、 一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子が作られた。ＴＡ１−ＳｃＦｖについては、最初 のステップは、製造業者の手順に従ってＦａｓｔ−ｔｒａｃｋＲＮＡ単離キット （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによるＴＡ１ハイブリドーマ細胞からの ポリ−Ａ単離を伴った。このＲＮＡ（単離されたｍＲＮＡの１／１０を用いた） は、製造業者の手順に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩ ＢＣＯ−ＢＲＬ）及びオリゴｄＴ特異的 プライミングを用いてｃＤＮＡへと変換された。ｃＤＮＡの２０μｌのうち２μ ｌをＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして使用した。ＴＡ１ｍＡＢのＨ鎖及びＬ鎖可 変領域遺伝子を増幅するためのこのＰＣＲプライマーは、図２に示されているよ うにそれぞれＪＳ１３５／ＪＳ１３４及びＪＳ１３３／ＪＳ１５３である。ＰＣ Ｒ緩衝液条件は、実施例１に示したのと^｜じである。鋳型は、最初に９６℃で５ 分間インキュベーションすることにより変性させ、その間Ｔａｇポリメラーゼが 反応を熱開始させるために加えられた。このイムノグロブリンの可変領域遺伝子 フラグメントは、４８℃１分間、７０℃１分間及び９６℃１分間の１０回の熱的 サイクルによって増幅され、これに７０℃１分かン及び９６℃１分間の２５ステ ップのサイクルが続いた。望みの産物（約２６０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳 動により分け、アガロースゲルから溶離させることにより精製した。これらのフ ラグメントは次いで、Ｈ鎖の３’末端及びＬ鎖可変領域遺伝子の５’末端に４５ 塩基対のリンカー配列を取り付けるために、ＰＣＲにおけるＤＮＡ鋳型として使 用され、該可変領域ポリペプチドに追加の柔軟な１５アミノ酸ペプチドリンカー をもたらした。リンカー取付けに用いたＰＣＲプライマーは、Ｈ鎖及びＬ鎖可変 領域フラグメントにつき、それぞれ、ＪＳ１３５／ＪＳ１３９及びＪＳ１３７／ ＪＳ１５３である。ＰＣＲ条件は、４８℃１分間、７０℃１分間及び９６℃１分 間の１０回の熱的サイクル及びこれに続く７０℃１分間及び９６℃１分間の２５ ステップのサイクルであった。アガロースゲル電気泳動による分離に続き、望み の産物（約４００ｂｐ）をアガロースゲルからの溶離により精製した。Ｈ鎖及び Ｌ鎖可変領域遺伝子フラグメントをリンクするために、先ずＨ鎖＋ Ｌ鎖可変領域＋リンカー遺伝子フラグメントを５２℃１分間、７０℃１分間及び ９６℃１分間のサイクルでアニーリングしそして延長することにより、配列重複 延長ＰＣＲ（sequence-overlap extenshon PCR）を使用した。リンクされたフラ グメントを次いで、ＪＳ１３５／ＪＳ１５３の添加及び７０℃１分、及び９６℃ １分の１５の追加のステップサイクルによって、増幅した。望みの産物（約７２ ０ｂｐ）を、上述のようにして精製した。最初に、ＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子フラグ メントをＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで消化し、そしてＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで消化した ｐＪＳ１０２クローニングベクター中にリゲーションした。それがＴＡ１ｓｃＦ ｖ遺伝子を含むことを検証するために、得られた構造を、配列決定した。次いで このｐＪＳ１０２３／ＴＡ１ｓｃＦｖプラスミドを、Ｌ鎖可変遺伝子の３’末端 にＮｃｏＩ部位を加えるためにＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをＰＣＲする ための鋳型ＤＮＡとして使用した。使用したプライマーはＪＳ１３５／ＪＳ１５ ３であり、ＰＣＲ条件は、４８℃１分、７０℃１分及び９６℃１分の１０回の熱 的サイクルに続き７０℃１分及び９６℃１分の２５ステップのサイクルであった 。望みの産物（約７２０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動で分け、アガロースゲ ルからの溶離により精製した。このＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントは、Ｎｃ ｏＩ及びＮｏｔＩで消化され、そしてＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化されたｐＰＲ３ ５ｔｒａＡ発現ベクター中にリゲーションされ、ＴＡ１ｓｃＦｖ／ＥＥタッグ／ ｔｒａＡ融合ベクター、ｐＧＨ２１をつくり出した。 Ｃｏｎａｎ α−ＣＫＭＢハイブリドーマ細胞株から可変領域遺伝子を単離す るため及びα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ遺伝子を構築するた めに、同じ戦略を用いた。対応するＨ鎖及びＬ鎖ＰＣＲプライマーは、図３に示 されている。配列重複発現ＰＣＲステップにより、α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ遺伝子 フラグメントをＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで消化しそしてＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで消化 したｐＧＨ２１ｔｒａＡ発現ベクター中にリゲーションし、これにより本質的に 、ＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子をα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ遺伝子と交換した。得られた構 造はｐα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡと呼ばれる。 実施例３ ｔｒａＡ融合タンパク質の製造 ｔｒａＡ発現系は、幾つかの仕方で特徴づけられた。第１にＴＡ１ｓｃＦｖ− ＥＥタッグ−ｔｒａＡ又はαＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タン パク質の細菌での発現が、イムノブロット分析により試験された。ｐＧＨ２１及 びｐα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡベクターが、Ｆプラスミドを担持するＸＬ １Ｂ細胞内へ形質転換された。正確な候補は、アルカリ性ＳＤＳミニプレップＤ ＮＡ制限分析により選別しそしてＤＮＡ配列決定により検証した。ｔｒａＡ融合 タンパク質の発現を誘導するために、３ｍｌの２ｘＬＢ培地、５０μｇ／ｍｌの アンピシリン、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンに摂取するのに、６０μｌの 終夜培養物を用いた。３６℃２時間のインキュベーションに続いて、イソプロピ ル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）が最終濃度２ｍＭで加えられ た。３７℃にて４時間の後、培養物のＯＤ₆₀₀が測定されそして培養物の２ｍｌ を５分間の微量遠心のための収穫した。細胞ペレットを−７０℃にて凍結し次い で冷ＴｘＴＢＳ（０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｃ−１００，１０ｍＭのトリス塩酸 、ｐＨ７．４，０．１５ｍ のＮａＣｌ）中に１０ＯＤ／ｍｌになるよう再懸濁させた。細胞を３乃至５分超 音波処理し、細胞残滓を４℃にて１０，０００×ｇ１０分間の微量遠心で除去し た。上澄（１０μｌ）をＳＤＳ／β−メルカプトエタノール負荷緩衝液と混合し 、タンパク質を変性させるため５分間煮沸した。サンプルを１２．５％のポリア クリルアミドゲル上においてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分 けた。ゲル中のこの材料を、半乾燥トランスブロット装置を用いてＰＶＤＦナイ ロン膜に移した。この膜を、２０ｍｌのブロック緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＮＰ −４０，０．５％脱脂粉乳）により４℃にて終夜ブロックし、そして、西洋ワサ ビペルオキシダーゼを接合した４３ｎｇ／ｍｌの抗ＥＥタッグモノクローナル抗 体（抗ＥＥｔａｂモノクローナル抗体−ＨＲＰ）の２０ｍｌでプローブした。こ の抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰは、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ ）によって検出された。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質に対す る信号は、予期した分子量である４０ｋＤに検出され、一方ＸＬ１Ｂ／ベクター のみからの溶解物はなんら信号を示さなかった。しかし、ＴＡ１ｓｃＦｖ−ｔｒ ａＡ融合タンパク質は４６ｋＤに移動し、ＴＡ１ｓｃＦｖタンパク質はＳＤＳ− ＰＡゲルを通って予想よりも大きい分子量まで移動した。ＴＡ１ｓｃＦｖ−ｔｒ ａＡ融合タンパク質はまた、増殖培地中にも検出され、これは、Ｆピリが細胞表 面から脱落して培地中に見いだされ得ることに合致する。 ＸＬ１−Ｂ／ｐＧＨ２１細胞（１Ｌ）は増殖し、そしてＴＡ１−１／ＥＥタッ グ／ｔｒａＡ融合タンパク質発現は、実施例２に記述したようにしてＩＰＴＧに よって誘導された。細菌の線毛ンタンパ ク質は、細胞から線毛を刈りＭｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．，〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌｏｇｙ，１４６（１）：２５１−２５９（１９８１）〕に記述されているよう にＰＥＧ沈殿することにより精製された。誘導された細胞中（細胞溶解物レーン ）に存在する融合タンパク質及び部分的に精製されたタンパク質（ＰＥＧｐｐｔ レーン）を、抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰをプローブとして用てウ エスタン分析により試験した。図１５を参照。ＴＡ−１／ＥＥタッグ／ｔｒａＡ 融合タンパク質に対応するバンドが示されている。積重ねゲルの最上部にある免 疫反応性の材料は、分離ゲル中に入らい凝集した融合タンパク質である。 実施例４ 組換えタンパク質の検出のための改善された方法を開発するためにｔｒａＡ発 現システムを用いた。抗原−ｔｒａＡ融合タンパク質が細菌細胞表面上にディス プレーされているか否かを試験するために、２つの簡単な検出方法を実施した。 第１は、ナイロン膜上で増殖した細菌のコロニーをスクリーニングするための免 疫検出法であった。ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タンパク質を発現してい るＸＬ１Ｂ株を、ナイロン膜上に播種し、膜を、ベクターとＸＬ１Ｂをそれぞれ 選択するために５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイ クリンを含有する２ｘＬＢ寒天プレート上に置いた。ｔｒａＡ融合遺伝子発現の 誘導のために、膜を予め１０ｍＭのＩＰＴＧで濡らした。３７℃にて終夜インキ ュベーションの後、膜をプレートから除去して冷イミダゾール緩衝食塩水（ＩＢ Ｓ−４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０，０．１５ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄し た。膜を０．５％のミルク−ＰＢＳで、４℃にて１時 間攪拌することによりブロックし、次いでＩＢＳ中４℃にて４３ｎｇ／ｍｌの抗 ＥＥタッグ−ＨＲＰと１乃至２時間インキュベートした。４℃にてＩＢＳで５回 洗浄した後、膜をＥＣＬ試薬と反応させそして免疫反応性の材料を検出した。こ のコロニーイムノブロット法により、抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰ がＩＰＴＧ誘導されたＸＬ１Ｂ／ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡコロニーを認識 したが、誘導されていないＸＬ１Ｂ／ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡコロニーは 認識しなかった。対照ベクターを有するＸＬ１Ｂ細胞（ＥＥタッグ−ｔｒａＡ不 含）は、いかなる信号をも与えなかった。細胞表面への抗ＥＥタッグモノクロー ナル抗体の結合の特異性もまた、該コロニー膜を、異なったペプチドのタッグ（ ＫＴ３）に対する抗体とインキュベートすることにより決定された。これらの膜 上には如何なる信号も検出されなかった。 細菌コロニー免疫検出法もまた、エピトープマッピング分析に適用された。こ の方法を試験するために、ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ又は対照ベクター（Ｅ Ｅタッグ−ｔｒａＡ不含）を担持するＸＬ１Ｂ細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピ シリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天プレート 上で終夜増殖させた。コロニーをナイロン膜上にレプリカ播種し、１０ｍＭのＩ ＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン を含有する２ｘＬＢ寒天プレート上に置いた。３７℃での増殖の後、膜上のコロ ニーを抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰにより上記と同様にしてプロー ブした。ＩＰＴＧ誘導されたサンプルにおいては、図６に示したように、単一の コロニーについての明確な信号が検出された。対応するコロニーは、特徴付けの ためにマスタープレートから採られ、ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡベクターを 担持することが見いだされた。 実施例５ 細菌表面に発現された抗原を検出するための全細胞ＥＬＩＳＡ 細菌表面上の抗原−ｔｒａＡ融合タンパク質のアクセス可能性を試験する第２ の方法は、無傷細胞によるＥＬＩＳＡ法であった。初期長期相まで増殖させた細 胞をＩＰＴＧにより３７℃で４時間誘導した。細胞を収穫して1.0 ＯＤ₅₉₅に冷 ＰＢＳに再懸濁させた。このステップは、培地中に存在する、該細胞に関連しな い如何なるｔｒａＡ融合タンパク質をも除去するであろう。マイクロタイタープ レートを、ウェルあたり１００μｌの細菌希釈液で被覆した。４℃で終夜インキ ュベーションの後、付着しなかった細胞は捨てられ、ウェルは１％の牛血清アル ブミンを含有するＰＢＳで４℃にて１時間ブロックされた。このブロッキング・ ステップに続いて、ウェルを１００μｌの０．３４μｇ／ｍｌの抗ＥＥタッグ抗 体ＨＲＰと共にインキュベートした。ＰＢＳによる５回の洗浄の後、抗原−抗体 複合体がＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ基質によって現像された（Ｈ₂Ｏ₂，ＡＢＴＳペルオ キシダーゼ基質）。反応値がＥＬＩＳＡリーダーによって記録された。ＯＤ₄₅₀ 読み取り値は、各ウェルに捕獲された抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰ 活性を示し、そして細胞表面上に発現されたＥＥタッグ融合タンパク質の量に相 関する。図７に示したように、誘導されたＸＬ１Ｂ／ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒ ａＡサンプルは、無誘導のサンプル又はＸＬ１Ｂ／対照ベクター（ＥＥタッグ− ｔｒａＡ不含）サンプルの６倍高い読み取り値を示し、このことはこの方法が細 胞表面上に存在する抗原を特異的に検 出するのに適用できることを示している。該結合反応に既知量のペプチド抗原及 び抗体をを加えることにより、この方法は、定量的抗体／抗原結合に使用できよ う。加えて、該ペプチドは、抗体／抗原−ｔｒａＡ融合タンパク質相互作用に対 する異なったペプチドの効果がが測定されるものである比較ＥＬＩＳＡアッセイ 方式において特徴付けることができよう。 実施例６ 細菌表面上にディスプレーされた組換え抗体の活性の検出のための全細胞ＥＬ ＩＳＡ 実施例４及び５からの結果は、ｔｒａＡに融合させた抗原が細菌表面上にディ スプレーされることができそして対応する抗体によって特異的に検出し得ること を示している。機能的組換えタンパク質が細菌表面上にディスプレーされ得るか 否かを判断するために、同様の実験が以下に記述するように行われた。細菌細胞 表面上にディスプレーされた組換え一本鎖抗ＣＫＭＢ抗体の活性を検出するため に、無傷の細胞を用いたＥＬＩＳＡ法が行われた。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥ タッグ−ｔｒａＡ融合ベクター又は対照ベクター（ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａ Ａ融合ベクター又は挿入体を有しないベクター）の何れかを担持した細胞を３７ ℃にて初期長期相まで増殖させた。その点において、融合タンパク質の発現が、 ０．２ｍＭのＩＰＴＧの３７℃４時間の添加によって誘導された。細胞が収穫さ れそして冷ＰＢＳ中に10.0ＯＤ₅₉₅／ｍｌに再懸濁された。マイクロタイタープ レートが、被覆緩衝液（０．１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ８．５）中の１００μｇ／ ｍｌの抗ＣＫ−ＢＢモノクローナル抗体によって被覆され、そして４℃にて終夜 インキュベーションされた 。付着しなかった抗ＣＫ−ＢＢモノクローナル抗体は捨てられ、ウェルは洗浄緩 衝液（０．１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７．４、１．０ＭのＮａＣｌ，０．１％Ｎａ Ｎ₃）で１回洗浄された。ウェルは、希釈緩衝液（０．０１Ｍトリス塩酸、０． １５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．３中、２％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で １００μｌの０．３μｇ／ｍｌのＣＫ−ＭＧとともに、室温にて１時間攪拌しつ つインキュベートされた。ウェルを濯ぎ緩衝液（０．０１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７ ．３、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０ ．２％ＮａＮ₃）で１回洗浄した。１００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、 プレートを室温にて１時間、攪拌しつつインキュベートした。付着しなかった細 胞を捨て、ウェルを濯ぎ緩衝液で２回洗浄した。ウェルを希釈緩衝液中において １００μｌの０．３４μｇ／ｍｆの抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰ接 合体と共に、室温で、攪拌しつつ１時間インキュベートした。ウェルを濯ぎ緩衝 液で２回洗浄した後、ＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ基質（Ｈ₂Ｏ₂、ＡＢＴＳペルオキシダ ーゼ基質）を加え、２０分間現像させた。ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにて 測定した発色の量は、ウェル中に検出されたｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融 合タンパク質に対応する。これらの値は、固定化されたＣＫ−ＭＧによって捕獲 された細胞の表面にディスプレーされた抗ＣＫＭＢｓｃＦｖ活性の量に相関する 。典型的な結果が図８に示されている。ＩＰＴＧ−誘導されたＸＬ１Ｂ／α−Ｃ ＫＭＢｓｃＦｖタッグ−ｔｒａＡプラスミドサンプルは、ＣＫ−ＭＢを認識しな い種々の組換え抗体を発現する無誘導のＸＬＩＢ／ＴＡＩ−ＥＥタッグ−ｔｒａ Ａ細胞に比して、捕獲されたα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ −ｔｒａＡ融合タンパク質の２９倍高いレベルを示した。対照ベクターを担持す るＸＬ１Ｂ細胞は、ＥＥタッグ−ｔｒａＡタンパク質を発現せず、このアッセイ において活性を示さなかった。 これらの実験の結果は、融合タンパク質のα−ＣＫＭＢｓｃＦｖドメインが、 生物学的に活性なコンフォメーションへと折り畳まれ、細胞の表面上にディスプ レーされていることを示している。同じディスプレーされるタンパク質上の一本 鎖抗体とＥＥ抗原タッグとのＴみ合わせは、ＥＬＩＳＡ方式の開発の多様性を許 容する。本実施例において用いられたサンドイッチ捕獲ＥＬＩＳＡ方式は、これ ら多くの可能性の１つであるに過ぎない。 実施例７コロニースクリーニングによる細菌表面の機能的一本鎖活性の検出 この実施例は、細菌細胞コロニーの表面に発現された組換えタンパク質活性の 成功裏の検出を実証する。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベ クターを担持するＸＬ１Ｂ株及びＴＡ１−３３タッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを 担持する株が、ナイロン膜上に均一に播種された。膜を、５０μｇ／ｍｌのアン ピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天上に置 き、３７℃にて、小さな細菌コロニーが出現するまでインキュベートした。この とき、マスター膜に新たな膜ヲ重ねることにより、レプリカ膜を作った。このレ プリカ膜を次いで除去し、半分に切断した。一方の半分を、１０ｍＭのＩＰＴＧ 、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有 する２ｘＬＢ寒天プレート上でインキュベートし、そして他の半分を５０μｇ／ ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンのみを 含有する２ｘＬＢ寒天プレート上でインキュベートとした。３７℃にて終夜イン キュベーションの後、ＩＰＴＧ誘導及び無誘導膜を除去してＩＢＳで３回洗浄し た。２０ｍｌの０．５％ミルク−ＩＢＳによって、４℃にて攪拌しつつ１時間ブ ロックし、次いで、希釈緩衝液中で２０ｍｌの０．３μｇ／ｍＥのＣＫＭＢと共 に４℃にて一時間インキュベートした。冷ＩＢＳによる３回の洗浄の後、膜を４ ℃にて１時間、そしてアルカリ性ホスファターゼに接合させた抗ＣＫ−ＢＢモノ クローナル抗体によりブロックした。冷ＩＢＳによる５回の洗浄の後、膜をＬｕ ｍｉｐｈｏｓ ５３（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ）と反応させた 。免疫反応性の材料は、フルオログラフィーにより検出され、典型的な結果を図 ９に示してある。単一のコロニーに対応する強い明確な信号が、ＰＩＴＧ誘導サ ンプル中に検出された。これらのコロニーがマスタープレートから採取され、α −ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡベクターを担持することが見いださ れた。フィルム上の陰性信号に対応するコロニーは、対照ベクターを含んだ。こ の結果は、α−ＣＩＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質が細菌表面上にディ スプレーされそして一本鎖抗体が生物学的に活性なコンフォメーションへと折り 畳まれていることを示している。 この方法は、組換え一本鎖抗体活性を検出するための容易且つ迅速な手順を提 供する。それは直ちに、組換え抗体ｔｒａＡ融合タンパク質のスクリーニングラ イブラリーに適用できよう。これらのライブラリーは、Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域の 組み合わせの一本鎖遺伝子バンク、又は特定の組換え抗体インキュベートの突然 変異ライブラリーを含むことができる。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タ ンパク質が生物学的に活性なコンフォメーションへと折り畳まれていることを示 すこの結果に基づいて、この方法は、細菌細胞コロニー表面上に発現された組換 えタンパク質活性の検出に一般的に適用できよう。検出される活性としては、結 合活性、触媒活性、阻害活性及び変化した構造的コンフォメーションが含まれよ う。 実施例８ バクテリオファージ／ピリン相互作用系 バクテリオファージ粒子の表面上のｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質の 発現及びディスプレーのために、ファージミド（phagemid）ベクターが設計され た。該ファージミドベクターは、図１２に示した特徴を有するｐＢＣファージミ ドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づく。このベクターは、プラスミド増 殖のためのＣｏＩＥ１転写オリジン、ヘルパーファージによる同時感染後のファ ージミドＤＮＡの回収のためのｆ１線状ファージ複製オリジン、及び抗生物質に よる選択のためのクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を担持する。ｐｅ１Ｂリー ダー及びｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳのＤＮＡフラグメントが、ｐＢＣの誘導可能ｌ ａｃＺプロモーターの下流にクローンされた。ｐｅ１Ｂリーダーは、適当な加工 とバクテリオファージ上への融合タンパク質の配列を許容するために消化された 。外来ＤＮＡ配列の挿入を許容するために、ＮｃｏＩ，ＳｆｉＩ，ＳｐｅＩ，及 びＮｏｔＩについてのクローニング部位を、ｐｅ１Ｂリーダー及びｇｅｎｅＩＩ ＩｐΔＢＳ配列の間に導入した。該ステップは、このベクター（ＬＥ２という） の構築に関わるステップは図１２に示されている。 抗ＥＥタッグｓｃＦｖ遺伝子が、実施例２に概説したようにして 、モノクローナルハイブリドーマｍＲＮＡより単離されＬＥ２の、ＮｏｔＩ及ひ ＳｅｐＩ部位に挿入された。３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する 培地中でこれらのベクターを増殖させるために、Ｆ’宿主株、ＤＨ５−αＦ’〔 Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｄ：Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ ．Ｒｅｓ．１７，３４６９−３４７８〕が使用された。 ファージミド粒子を救出するために、ファージミド発現ベクターを担持したＤ Ｈ５−αＦ’細胞を、テトラサイクリン耐性に関するｆＫＮ１６ファージＤＮＡ で形質転換した。このｆＫＮ１６ファージ誘導体は、ｇｅｎｅＩＩＩの５０７ｂ ｐセグメントを除去することによって、テトラサイクリン耐性ファージ，ｆｄ− ｔｅｔより構築した（Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０８ ：３３８−３５０（１９８１））。該ファージはｇｅｎｅＩＩＩ除去のために非 感染性であるが、ファージミド発現ベクターの複製及びパッケージングに必要な ヘルパーファージタンパク質を供給する。該ファージミド発現ベクターとｆＫＮ １６との両方を担持したＤＨ５−αＦ’細胞を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェ ニコール及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１００ｍｌの２ｘＹ Ｔ培地中で終夜増殖させた。細胞を遠心により除去し、培養培地中のファージ粒 子を５％ＰＥＧ及び０．５ＭＮａＣｌにより沈殿させることにより濃縮した。得 られたファージ粒子はｆＫＮ１６ファージ（ｔｅｔ^r）又はｇｅｌｅＩＩＩｐΔ ＢＳファージミドベクター（ｃｈｌ^r）の何れも担持している。欠損のあるｆＫ Ｎ１６遺伝子タンパク質及ひ抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融 合タンパク質の両方が、バクテリオファージ表面上に配列される。 救出されたファージは、ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを担持したＸＬ−１ Ｂ細胞を感染させるのに使用される。これらの細胞がその線毛上にＥＥタッグ抗 原を発現することから、抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タ ンパク質を配列したバクテリオファージは、ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タンパク 質と結合し、これらの細胞に感染して、ファージミド発現ベクターを担持したク ロラムフェニコール耐性クローンをもたらす。 バクテリオファージに基づく系はまた、組換えタンパク質の配列のために構築 することもできる。発現ベクターは、図１４に概説したように、通常のｇｅｎｅ ＩＩＩを抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質で置き 換えることにより、ｆｄ−ｔｅｔファージから構築することができる。ＤＨ５− αＦ’細胞は、該ファージ発現ベクターによってテトラサイクリン耐性へと形質 転換される。形質転換された細胞は、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有 する１００ｍｌの２ｘＹＴ培地中で終夜インキュベートされる。細胞は、遠心に よって除去されそして培養培地中のファージ粒子が、５％ＰＥＧ及び０．５ＭＮ ａＣｌによる沈殿によって濃縮されるであろう。得られるファージ粒子は、ｇｅ ｎｅＩＩＩｐΔＢＳファージベクターを担持し、抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎ ｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質をバクテリオファージ表面上に配列させている であろう。これらのファージ粒子は、ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを担持 したＤＨ５−αＦ’細胞を感染させるために使用されよう。 次いで、ファージミド系に関して記述したようにして、寒天プレート上におけ るテトラサイクリン耐性コロニー選択によって、感染 性を試験することができる。代わりとして、該発現ファージが複製可能でありＥ Ｅタッグを配列している細菌に再感染可能であることから、感染性は、この配列 させた細菌の芝の上のプラーク形成によって、又はこの配列させた細菌の液体培 地中におけるファージ増殖によって、特徴付けることができる。プラークサイズ 又は液体培地中のファージタイターは、ファージの感染性及び増殖を受け持つ組 換えタンパク質−タンパク質相互作用の強さの指標を提供する。換言すると、該 配列ファージと該配列細菌との間の最も強い親和性の組換えタンパク質−タンパ ク質相互作用は、最も強い感染率を与える。感染の特異性もまた、ＥＥタッグ抗 原を配列させない細胞を用いて試験することができる。 この系は、ｓｃＦｖのような組換えタンパク質のライブラリーをスクリーニン グするのに有用である。高親和性のｓｃＦｖを配列させるファージは、該抗原を 配列させる細菌に、低親和性ｓｃＦｖを配列させるファージに比して一層高率で 感染しその中で複製するであろう。こうして、高親和性のｓｃＦｖを配列させる ファージは、培地中における連続培養によって選択的に濃厚化されるであろう。 得られるファージＤＮＡは、単離され、そして候補ｓｃＦｖ遺伝子及びタンパク 質が配列決定及び親和性分析によりさらに特徴付けられることが出来よう。 ここに記述した実施例及び具体例が説明のみのためのものであり、それに照ら し種々の修正又は変更が当業者に示唆されているということを理解しなければな らない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 0276−2Ｊ 33/569 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スティンソン，ジェフェリー，アール アメリカ合衆国33331フロリダ、デイビー、 ダーハムレーン15030 (72)発明者 ウォン，ヒン，シー アメリカ合衆国33332フロリダ、フォート ローダーデイル、ウェントワース 2966

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 標的タンパク質を細菌宿主細胞上にディスプレーさせるための方法であっ て、 線毛を形成する能力のある細菌宿主中において、融合タンパク質であって、 当該融合タンパク質の分泌を媒介する能力のあるリーダーアミノ酸配列をコード するＤＮＡセグメントと、該線毛を形成する能力のあるピリンサブユニットをコ ードするＤＮＡセグメントと、そして該標的タンパク質をコードするＤＮＡセグ メントとを含むキメラ性ＤＮＡによってコードされており、該宿主細胞が該標的 タンパク質をその表面にディスプレーするようにこれらのＤＮＡセグメントが作 動可能に連結しているものである融合タンパク質を発現させることを含む方法。 ２． 該線毛がバクテリオファージの接着及び感染のためのレセプターである、 請求項１の方法。 ３． 該線毛がＦ線毛である、請求項２の方法。 ４． リーダーセグメントをコードしている該ＤＮＡセグメントがｔｒａＡリー ダー配列をコードしているものである、請求項３の方法。 ５． 該ピリンサブユニットをコードしている該ＤＮＡセグメントがｔｒａＡ遺 伝子産物をコードしているものである、請求項３の方法。 ６． 該標的タンパク質をコードしている該ＤＮＡセグメントが該リーダーをコ ードしているＤＮＡセグメントと該ピリンサブユニットをコードしているＤＮＡ 配列の５’末端との間に連結しているも のである、請求項１の方法。 ７． 該細菌宿主がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１の方法。 ８． 該キメラ性ＤＮＡがこれに作動可能に連結した誘導可能プロモーターを更 に含むものである、請求項１の方法。 ９． 該キメラ性ＤＮＡが組換えベクター内に担持されているものである、請求 項１の方法。 １０． 組換え標的タンパク質を該組換え標的タンパク質をコードするＤＮＡ含 んだＤＮＡライブラリーから選択するための方法であって （ａ）該ＤＮＡライブラリーによってコードされた該組換えタンパク質を請 求項１の方法によってディスプレーさせ、そして （ｂ）該望みの標的組換えタンパク質をディスプレーした細菌宿主細胞を選 択する ことを含む方法。 １１． 該細菌宿主が、該標的タンパク質中に遺伝子的多様性を導入するミュー テーター株である、請求項１又は１０の方法。 １２． 該標的タンパク質が抗原決定ポリペプチドである、請求項１０の方法。 １３． 該望みの標的組換えタンパク質をディスプレーしている該細菌宿主細胞 が、抗体に対する免疫反応性によって選択されるものである、請求項１０の方法 。 １４． 特異的結合対の一方のメンバーを単離するための方法であって、 （ａ）バクテリオファージの接着と感染のためのレセプターである線毛を形 成する能力のある細菌宿主中において、融合タンパク 質であって、当該融合タンパク質の分泌を媒介する能力のあるリーダーアミノ酸 配列をコードするＤＮＡセグメントと、該線毛を形成する能力のあるピリンサブ ユニットをコードするＤＮＡセグメントと、そして該メンバーをコードするＤＮ Ａセグメントとを含むキメラ性ＤＮＡによってコードされているものである融合 タンパク質を発現させ、 （ｂ）ステップ（ａ）の該細菌ホストを、該ピリン相互作用ドメインが該特 異的結合対の他方のメンバーをコードするＤＮＡで置換されたものであるピリン 相互作用ドメインを有する接着タンパク質をディスプレーしたバクテリオファー ジと接触させ、 （ｃ）該バクテリオファージによって認識される細菌宿主細胞を選択する ことを含む方法。 １５． 該線毛がＦ線毛である、請求項１４の方法。 １６． 該ファージが線状ファージ又はＲＮＡバクテリオファージである、請求 項１５の方法。 １７． 該ファージがｆｄファージである、請求項１６の方法。 １８． 該一方のメンバーをコードする該ＤＮＡがＤＮＡライブラリーからのも のである、請求項１４の方法。 １９． 該他方のメンバーをコードする該ＤＮＡがＤＮＡライブラリーからのも のである、請求項１４の方法。 ２０． 該一方のメンバーをコードするＤＮＡが抗原決定基をコードしそして該 他方のメンバーをコードする該ＤＮＡが抗体をコードするものである、請求項１ ４の方法。 ２１． 該一方のメンバーをコードする該ＤＮＡが抗体をコードし そして該他方のメンバーをコードする該ＤＮＡが抗原決定基をコードするもので ある、請求項１４の方法。 ２２． 該バクテリオファージ接着タンパク質がｇｅｎｅＩＩＩタンパク質であ る、請求項１７の方法。 ２３． 該ファージによって認識される該細菌宿主が該ファージから該宿主に移 転されたマーカー遺伝子の同定によって選択されるものである、請求項１４の方 法。 ２４． 該特異的結合対の一方のメンバーをコードする該ＤＮＡが突然変異化さ れておりそして増大した親和性を有する特異的結合対が選択されるものである、 請求項１４の方法。 ２５． 特異的結合対相互作用に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするため の方法であって、 （ａ）その表面上にディスプレーされた特異的結合対−ピリン融合タンパク 質を有する細菌細胞を、該ピリン相互作用ドメインが該特異的結合対の該他方の メンバーによって置換されるように変更されたバクテリオファージと接触させ、 （ｂ）試験化合物を加え、そして （ｃ）該ファージ／細菌細胞相互作用に対する該試験化合物の効果を測定す る ことを含む方法。 ２６． ファージ細菌細胞相互作用に対する該試験化合物の効果が該ディスプレ ーファージの感染性に対する該試験化合物の効果を測定することによって測定さ れるものである、請求項２５の方法。 ２７． 増大した結合親和性を有する特異的結合対の一方のメンバーについての スクリーニング方法であって、 （ａ）一方のピリン−特異的結合メンバー融合をディスプレーしたディスプ レー細菌を、正常なピリン結合ドメインが該特異的結合対の他方のメンバーを含 んだタンパク質のライブラリーで置換されているように変更されたバクテリオフ ァージとファージ感染を許容する条件下に接触させ、そして （ｂ）増大した感染頻度を有するバクテリオファージを同定することによっ て、増大した結合親和性を有する特異的結合対を同定する ことを含む方法。 ２８． 標的タンパク質−ピリン融合物をディスプレーしている細菌宿主細胞。 ２９． 該宿主がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２８の細菌宿主細胞。