JPH07502643A - 組換免疫毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５、前記細胞が原核細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。

６、前記原核細胞がエッシエリヒア　ユ県である、請求項５に記載の宿主細胞。

７、毒素タンパク質又はその一部と、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のＦｖ 領領域より成る、組換的に生産された免疫毒素。

８、前記毒素がシュードモナス外毒素である、請求項７に記載の免疫毒素。

９、前記モノクローナル抗体がＭＡｂ　Ｂ３である、請求項７に記載の免疫毒素 。

ＩＯ１請求項７に記載の免疫毒素と、薬理学的に許容される担体とを含んで成る 組成物。

１１、患者の癌を処置する方法であって、前記患者に前記処置を施すのに十分な 量の請求項１０に記載の組成物を投与することを含んで成る方法。

１２、免疫毒素を生産する方法であって：（ｉ）モノクローナル抗体の重鎮及び 軽鎖の両方のＦｖ領領域コードするＤＮＡ配列をベクターの中にクローニングし くこのベクターは細菌毒素の変異体又はこの毒素の一部をコードする遺伝子を含 んで成る）；次いて （ｉｉ）段階（ｉ）で得られたベクターで宿主細胞を形質転換させ、それにより 免疫毒素の発現を行う。

段階を含んで成る方法。

１３、前記モノクローナル抗体がＭＡｂ　Ｂ３である、請求項１２に記載の方法 。

１４、前記モノクローナル抗体がヒト腫瘍に優先的に反応する、請求項１２に記 載の方法。

１５、前記免疫毒素が８３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０及びＢ　３　（Ｆｖ）　−Ｐ Ｅ３８ＫＤＥＬより成る群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。

１６、前記免疫毒素が８３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０又はＢ　３　（Ｆｖ）　−Ｐ Ｅ３８ＫＤＥＬの誘導体である、請求項１２に記載の方法。

１７、段階（ｉ）の前記ベクターがｐＵＬＩｌ、　ｐＵＬ１３、又はその誘導体 である、請求項１２に記載の方法。

１８、前記細菌毒素がシュードモナス外毒素（ＰＥ）である、請求項１２に記載 の方法。

明細書 組換免疫毒素 本願は１９９０年１０月１２日提出の米国特許出願筒０７１５９６．２８９号の 一部係属出願であり、そしてその全体内容は引用することで本明細書に組入れて いる。

発明の背景 技術分野 本発明は組換免疫毒素及びその用途に関する。特に、本発明は哺乳動物の癌の処 置において利用されうるＢ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０及びＢ３（ＦＶ）　−Ｐ Ｅ３８ＫＤＥＬと呼ぶ２つの免疫毒素に関する。

背景情報 モノクローナル抗体Ｂ　３　（ＭＡｂ　Ｂ３）は近年単離されたネズミ抗体であ り、これは１．Ｅ科における炭水化物抗原に特異的である（Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：３３５８−６２（１９９１）） 。この抗原は結腸、胃、卵巣、乳、肺の数多くのムチン癌の表層及び一部の上皮 癌の表層上で見い出せる。それは限られた正常組織としか反応しないため、ＭＡ ｂ　Ｂ３は癌の処置及び診断にとって理想的な候補である。細胞障害剤を作るた めに、ＭＡｂ　Ｂ３は既に２種類の異なる形状のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）に化学結合されている（米国特許第４、５４５．９ ８５号）。そのうちの一方は全長毒素（ＰＥ）であり、そして他方は短縮誘導体 （ＰＥ４０）である（Ｋｏｎｄｏら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３　 ：９４７０−７５　（１９８８）及びＰａｉら前掲）。これらの免疫毒素は共に 表層上にＢ３抗原を含む腫瘍細胞に対して特異的に細胞毒性であることが示され 、そしてこれらの免疫毒素はヒト腫瘍異種移植片を有するマウスにおいて完全腫 瘍退化を引き起こすことも示されている（Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：３３５８−６２（１９９１））。このような第一 世代免疫毒素は、それらが癌の処置のための薬剤として更に開発されるべきであ ることを示唆する特性を有するが、化学コンジュゲーション法により作られた免 疫毒素はいくつかの所望されない特性を有している。例えば、その化学修飾はこ の抗体を変質させ、そして抗原に対するその結合性に影響を及ぼしうる。更に、 精製免疫毒素は、抗体と毒素上の様々な位置を介して互いに連結された抗体−毒 素分子の不均質な混合物である。従って、ＰＥは抗体の軽鎖又は重鎖のいづれに も複合させることがあり、更にこれらの鎖それぞれにおける様々な位置において 複合されていることがある。

第二世代免疫毒素が、細菌の中で、組換抗体Ｆｖ融合タンパク質として作られて いる。抗体の重鎮と軽鎖とのＦｖ領領域り成る、ポリペプチドリンカ−によって 合体した一本鎖抗原結合性タンパク質（ｓｃＡＢ、　５ｃＦｖ）はその全長二本 鎖対応物と同じ結合特性を有しうるに、毒素に連結された５ｃＡＢより成る融合 タンパク質は５ｃＡＢの結合能力及び毒素の活性を保持している（Ｃｈａｕｄｈ ａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：　３９４有効な一本鎖免疫毒素が、インター ロイキン２レセプター（Ｃｈａｕ−−４９（１９８９））に向けられた抗体のＦ ｖドメインを、ＰＥ又はジフテリア毒素の短縮形態（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：９４９１−９４　（１９ ９０））に融合することによって既に作られている。レセプターはしばしば良好 な免疫毒素標的をなし、なぜならそれらは迅速に取込まれうる細胞表層タンパク 質であるからであり、従って毒素は細胞を殺すために取込まれるものでなくては ならない。

定の抗原又はレセプターを保有する細胞に対して細胞障害作用を有することが示 されている。

本明細書に記載されている免疫毒素はＢ３抗原を抱える培養哺乳動物腫瘍細胞に 対して特異的に細胞障害性であり、そして生体内で哺乳動物腫瘍の退化をもたら す。これらの免疫毒素を下記に説明する。

＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 本明細書で挙げている全ての米国特許及び公開物は引用することで本明細書に組 入れる。

発明の概要 本発明は哺乳動物の癌の処置のために利用されうる２種類の新規の免疫毒素に関 する。

詳しくは、本発明は組換ＤＮＡ分子てあって：（ｉ）モノクローナル抗体の軽鎖 及び重鎮の両者のＦｖ領領域コードするＤＮＡセグメント；並びに （ｉｉ）該ＤＮＡセグメントを宿主細胞に導入するためのベクター（このベクタ ーは細菌毒素の変異体又はこの毒素の一部をコードする遺伝子を含んで成る）； を含んで成るものを包括している。この毒素の変異体は転移（トランスロケーシ ョン）及び酵素活性を保持している。

更に、該組換分子を作り上げるうえで利用するベクターは例えばｐＵＬｌｌ、　 ｐＵＬＩ３、これらのプラスミドの両者の誘導体、又は微生物の中での組換タン パク質の発現を可能とする任意のその他のベクターであってよい。上記した細菌 毒素はシュードモナス外毒素である。

プラスミド又は遺伝子の誘導体は、プラスミド又は遺伝子それぞれのＤＮＡ配列 における変化を含んでおり、それらはＦｖフラグメントの抗原結合性又は毒素の 転位及び酵素活性のいづれをも失わせるものではない。

本発明は、該組換ＤＮＡ分子によりコードされる免疫毒素の発現を可能とするよ うな状況において組換ＤＮＡ分子により安定的に形質転換された宿主細胞も含む 。この宿主細胞は原核細胞、例えばエッシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏｌ＋）細胞であってよい。

更に、本発明は毒素タンパク質又はその一部と、モノクローナル抗体の軽鎖及び 重鎖のＦｖ領領域より成る組換的に生産した免疫毒素にも関連する。もう一度繰 り返すが、使用した毒素はシュードモナス外毒素である。使用したモノクローナ ル抗体はＭＡｂ　Ｂ３である。

本発明は、上記の免疫毒素と薬理学的に許容される担体とを含んで成る組成物を 包括する。

本発明はまた、患者の癌を処置する方法であって、この患者に、この処置を施す のに十分な量の上記の組成物を投与することを含んで成る方法も含む。

本発明の免疫毒素は： （ｉ）モノクローナル抗体の重鎮及び軽鎖の両方のＦｖ領領域コードするＤＮＡ 配列をベクターの中にクローニングしくこのベクターは細菌毒素の変異体又はこ の毒素の一部をコードする遺伝子を含んで成る）９次いて （ｉｉ）段階（ｉ）で得られたベクターで宿主細胞を形質転換させ、それにより 免疫毒素の発現を行う； ことにより作り上げられる。

繰り返すが、この毒素の変異体は転移及び酵素活性を保持している。

免疫毒素の生産に利用されうるモノクローナル抗体はＭＡｂ　８３である。この モノクローナル抗体はヒト腫瘍に優先的に反応する。

生産されうる免疫毒素はＢ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０及びＢ　３　（Ｆｖ）　 −ＰＥ３８ＫＤＥＬ、又はそれらの誘導体より成る群から選ばれる。例えば、Ｂ ３（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬはＢ　３　（Ｆｖ）−ＰＥ４０の誘導体として 、Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＥ４０のｒｂドメインにおける配列を欠失させることにより 、及びこの分子の細胞障害性を高めるようそのカルボキシ末端を変えることによ り作り上げられる。更に、このような２段階及び／又はその他の変更を、その他 の誘導体の生成において実施できる。

免疫毒素を生成する方法において使用されるベクターは例えばｐＵＬｌｌ、　ｐ ＵＬＩ３、これらのプラスミドの両方の誘導体、又は微生物の中で組換タンパク 質を発現させることが可能な任意のその他のベク注目すべきことは、本発明に先 行して、どの−水路免疫毒素も哺乳動物において抗腫瘍作用を有することが示さ れていないことにある。更に、本免疫毒素の抗腫瘍作用はかなりめざましく、な ぜならほんの数日で完全腫瘍退化が示され、そしてほんの少量の関連の免疫毒素 が必要とされるからである。かかる結果は、腫瘍に侵入でき、腫瘍細胞に有効に 結合でき、そしてその後これらの細胞を殺すことができるような分子を必要とす る。従って、この分子は腫瘍細胞の内部にまで侵入しなくてはならない。本発明 の免疫毒素は今まで認められていなかった、かかる能力又はかがる有意義な抗腫 瘍作用を有している。

図面の簡単な説明 図１は、ＭＡｂ　Ｂ３の重鎖及び軽鎖Ｆｖ遺伝子のクローニングのための手法、 並びに８３（Ｆｖ）免疫毒素の発現のための発現ベクター（例えばプラスミド） の構築を示す。このクローニング手法は先行手法（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７　：　１０６６−７０　（１ ９９０））の変更である。重鎖及び軽鎖のＦｖ領域由来の免疫毒素の構築のため のベクターとして利用したプラスミドｐｖｃ　３８Ｈは、ＰＥ４０遺伝子（Ｃｈ ａｕ−ｄｈａｒｙら、前掲（１９９０））の前方にあるＮｄｅ　Ｉ及び旧ｎｄＩ ＩＩ認識配列を含む。ＰＣＲプライマーの配列を実施例Ｉに示す。（★）はＰＣ Ｒ作製突然変異を示し、そして部位特異的突然変異誘発により修復しである；　 （Ｌ）は（ＧＩｙｔＳｅｒ）、リンカ−であって、免疫毒素の重鎮と軽鎖とを連 結するのに働くものをコードする領域を示す。

図２はＭＡｂ　Ｂ３の重鎖及び軽鎖Ｆｖ領領域コードするヌクレオチド配列を示 す。（ａ）−位置３０〜３８３に広がる重鎖Ｆｖコード領域、位置４３３〜７６ ６に広がる軽鎖Ｆｖ遺伝子、及び３８２〜４３２のリンカ−０推定アミノ酸配列 を平字（ｐｌａｉｎ　１ｅｔｔｅｒ）で示す；その下のイタリック字は抗体のエ ドマン配列決定により決定したタンパク質配列である。クローン化重鎖Ｆｖ遺伝 子によりコードされる第１アミノ酸は、オリゴヌクレオチドプライマーを利用し たためＧｌｕの代りにＡｓｐであり、位置４５６〜４６５においては、ＰＣＲク ローニング人工物を修復した領域である。この配列はオリジナルのＢ３軽鎖遺伝 子と同じアミノ酸をコードするが、しかし別のコドンを利用している。Ｂ３軽鎖 に最も相同性であるＰＡＣＩ　Ｉｇカッパー鎖の既知のヌクレオチド配列（Ｔａ ｕｂら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：　２５９−６５　（１９８９）） に対する相同対比は、オリジナル配列が最も可能としてＴＴＧＡＧＴＴＴＡの代 りにＣＴＣＴＣＣＣＴＧであることを示唆している。従って、天然のＢ３軽鎖遺 伝子は位置４４５と４６５との間に配列反復５’　（ＣＣＡＧＴＣＴ［ＣＣ］Ａ ＣＴＣＴＣＣ）　３’を有し、それはＰＣＲにおける正しくないプライマーアニ ーリングの原因となる。（ｂ）−一本鎖Ｂ３（Ｆｖ）のみの発現のための軽鎖の ３′末端においての配列。（ＳＤ）−シャイン　ダノガルノ共通配列：（★）− 翻訳停止シグナル。（Ｔｅｒｍ）−転写ターミネータ−。

図３は細胞封入体由来の組換Ｂ３（Ｆｖ）及びＢ３（Ｆｖ）免疫毒素を示す。５ ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２４）（１２，５％）は、（ａ）−重鎖Ｂ３（Ｆｖ）を生産 する誘発細菌の全細胞タンパク質：　（ｂ）　Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０を 生産する細胞の全タンパク質；　（ｃ、ｄ）（ｃ）　Ｂ３　（Ｆｖ）又は（ｄ） Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０を生産する高波処理細胞の上清液；　（ｅ）Ｂ３ （Ｆｖ）を含む封入体：　（ｆ　）　Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０を含む封入 体：　（ｇ）ゲル濾過の後の精製Ｂ３（Ｆｖ）〜ＰＥ４０タンパク質。ＭＷ１分 子量標準品。

図４　（ａ）は様々な細胞系に及ぼすＢ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３ＢＫＤＥＬの 毒性を示す。細胞障害アッセイは実施例■に記載の通りに実施した。

（ｂ）：ＭＡｂＢ３によるＢ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬの細胞障害の 阻害。

ＭＡｂ　Ｂ３による競争は実施例■に記載の通りＡ４３１細胞に基ついて行った 。

図５はマウス中の８３　（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬの血液レベルを示す。バル ブ／　Ｃ７ウスに１０μｇの８３　（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬをｉ、ｖ、注射 し、そして免疫毒素レベルを様々な経過時間において測定した。棒は標準偏差を 示す。

図６はヌードマウスにおけるＡ４３１腫瘍の増殖に及はすＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ３ ８ＫＤＥＬの作用を示す。マウスに０日目にて３Ｘ１０６のＡ４３１細胞に注射 し、そして４日目に開始してｉ、　Ｖ、注射により１２ｈ「毎に６回処置した。

Ａ・　（○）未処理；　（・）　１０μｇの８３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥ Ｌ；Ｂ・　（ロ）２．５μｇのＢ３；（■）５μｇの８３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３ ８ＫＤＥＩ、；Ｃ：　（△）２．５μｇの抗−丁ａｃ（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤ ＥＬ　；　（ム）２．５μｇのＢ３（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬ；　（−〇− ）０．５μｇのＢ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬ　；　Ｄ　ニア口重から 開始してｉ、ｖ、注射で１２ｈｒ毎に８回処置。（０）未処理、（■）５μｇの ８３　（Ｆｖ）−ＰＨ３８ＫＤ［！Ｌ０棒＝標準偏差。

発明の詳細な説明 本発明の免疫毒素を調製するため、ネズミモノクローナル抗体Ｂ３の重鎖及び軽 鎖Ｆｖドメインをコードする配列をまずクローンする。前記した通り、このＭＡ ｂは数多くの癌細胞上に存在している抗原を認識し、従って様々なタイプの癌の 処置にとって有用でありうる（Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　８８：　２３３５８−６２　（１９９１））。

ＭＡｂ　８３の重鎖と軽鎖との領域を次に、重鎖Ｆｖドメインのカルボキン末端 にて開始し、そして軽鎖Ｆｖドメインのアミノ末端にて終結するフレキシブルリ ンカ−（ＧｌｙｔＳｅｒ）＋により接続する。得られる遺伝子は一本鎖抗原結合 性タンパク質の形態におけるＢ３（Ｆｖ）　ドメインをコードする。このＢ３（ Ｆｖ）遺伝子を次に、ＰＥ分子の２種類の短縮形態をコードする配列に融合させ て一本鎖Ｂ３（Ｆｖ）免疫毒素を得る。これらの組換免疫毒素はコントロール細 胞に影響を及ぼすことなくＢ３抗原含有癌細胞を殺すことができる。組換Ｂ３（ Ｆｖ）−ＰＥ！４０の細胞障害性はＢ３とＰＥ４０との化学コンジュゲート（Ｂ ３−ＬｙｓＰＥ４０）（Ｐａ　ｉら、前掲（＋９９１））と類似するが、しかし Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬは活性か５倍高い（表１参照のこと）。従って 、患者に少なめの物質を投与するだけでよく、これはより優れた抗腫瘍作用、最 少限の副作用、及び組換毒素に対する中和抗体の低い生産性をもたらす。更に、 Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬはＢ　３−ＬｙｓＰＥ４０よりサイズが かなり小さいため、それはより効果的に腫瘍に浸透するであろう。

更に、Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬは免疫欠陥マウスにおけるＡ４３ １腫瘍増殖の完全退化をもたらす。これは、Ｂ３（Ｆｖ）誘導型−重鎖免疫毒素 か、Ｂ３化学コンジュゲートの有望の代替品となる、及び固化腫瘍の処置にとっ て可能な第二世代免疫毒素となるようにする。例えば、この免疫毒素は、広がっ た癌に対して静脈内的に投与するか、又は局所的にも（即ち、膀胱癌の処置にお いて利用するために膀胱の中に、又は卵巣癌の処置において利用するために腹膜 腔の中に）投与してよい。この免疫毒素は例えば７〜ｌＯ日間付与してよい。こ の処置は必要なたけ繰り返してよい。

クローン化ＤＮＡフラグメントの信頼性はＢ３重鎖と軽鎖のアミノ末端タンパク 質配列を、クローン化遺伝子の解読枠から推定したアミノ酸配列（図２）と比較 することによって証明されうる。クローン化Ｆｖコード領域の配列を図２に示す 。

Ｂ３−免疫毒素の細胞障害性の分析は、化学コンジュゲートに対するのと同じ、 組換免疫毒素に対する様々な細胞系の感受性パターンを示した。これらの免疫毒 素は全て、その表層上にＢ抗原を発現する癌細胞、例えばＭＣＦ７　（乳）、Ａ ４３１（類表皮）　、ＣＲＬ１７３９（胃）及びＬＮＣａＰ（前立腺）に対して 非常に細胞障害性であった。従って、これらの細胞系全て、及び数多くのその他 のものは、Ｂ３反応性抗体と反応する（下記の表１参照のこと）。

表１＝様々な細胞系に対するＢ３免疫毒素の活性細胞障害性（ＩＤｓｏ）　ｎｇ ／ｍｌ（ｐＭ）細胞系　癌のタイプ　８３　Ｂ３（Ｆｖ）−８３（Ｆｖ）−Ｂ３ −ＬｙｓＰＥ４０抗原　ＰＶ！、４０　ＰＥ３８ＫＤＥＬＭＣＦ７　乳　＋＋　 ａ　（５０）　０．２　（３，２）　３　（１６）ＣＲＬ１７３９　胃　＋＋　 ３　（５０）　０．３　（５）　３　（１６）Ａ４３１　類表皮外陰　＋　３　 （５０）　０．８　（１，３）　８　（４２）ＬＮＣａＰ　前立腺　＋　４０　 （１３３０）　２０　（３２５）　８５　（４６０）ＫＨ２−］　類表皮頚　− ＞１０００　＞１０００　＞１０００また、組換−水路Ｂ３−Ｆｖ免疫毒素はＢ ３抗原−陰性コントロール細胞に影響を及ぼさなかった。組換Ｂ　３　（Ｆｖ） 　−ＰＥ４０の細胞障害性（ＩＤ、、＝５０ｐＭ；　３．Ｏｎｇ／ｍｌ）は化学 連結型Ｂ３−免疫コンジュゲート（！Ｄ５ｏ　＝　４２ｐｌＪ　；　８　ｎｇ／ 　ｍｌ　）と類似し、一方、Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬは化学コン ノユゲ−１・よりはるかに活性が高かった（ＩＤ５．＝１３ｐＭ　；　０．８μ ｇ／　ｍｌ）。これは−重鎖免疫毒素が分子当り１個の抗原結合性部位しか有さ す、そして化学コンジュゲートが２個を有する事実にもかかわりなかった（下記 の表２を参照のこと）。

表２二Ｂ３免疫毒素の構造及びＡ４３１細胞に対する活性免疫毒素　毒素部分　 Ｃ−末端　結合性　ＩＤ６゜Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬはＢ　３　 （Ｆｖ）　−ＰＥ４０と区別される２つの特徴を有する。その一つは、アミノ３ ６５〜３８０を包括するドメインＩｂの領域が欠失していることである。このこ とは、位置３７２と３７９のシスティン残基間で形成されるジスルフィド結合を 排除する。これらの残基は再生過程の際に他方のシスティンとジスルフィド結合 を形成して、不活性なキメラ毒素の生成をもたらしつるのである。

第二の特徴はこの毒素のカルボキシル末端がオリジナル配列のＲ［！［ｌＬにか らＫＤＥＬへと変化していることである。ジスルフィド結合を別の分子において 排除したとき、活性の上昇は小さかった。例えば、ＴＧＦα−ＰＥ３８はＴＧＦ 　ａ　−ＰＥ４０より５０％しか活性が高くなかった（Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ、 ｏｆ　［１ｉｏ１．Ｃｈｃｍ、２Ｇ４：　１４２５６−６１　（１９８９））、 　ｌＬ６　ＰＥ３８は　ｌＬ６−ＰＥ４０より活性が高くない。ＲＥＤＬＫをＫ ＤＥＬに変えることは通常キメラ毒素の活性の２〜３倍の上昇しかもたらさない 。

Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬをＡ４３１腫瘍を抱えるヌードマウスに おいてその抗腫瘍作用について試験した。Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥ Ｌが循環系において短い寿命（１５〜２０ｍ１ｎ）を有している事実にもかかわ らず、腫瘍の完全退化が、マウスが２．５μｇ、５μｇ又はｌＯμｇのキーラ毒 素を日に２回、３日間にわたって受容したときに観察された。

Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬは直径約１ｃｍの腫瘍の完全退化ももた らした。

尚、化学コンジュゲートが血液中ではるかに長い寿命（４ｈｒ）を有する事実に もかかわらず、Ｂａ及びＰＩ！４０より成る化学コンジュゲートの投与は５日間 にわたり日当り７５μｇにてさえも、大型の腫瘍の部分的退化しかもたらさない ことが見い出されている。該組換分子はおそらくマウスモデルにおいてより高い 抗腫瘍活性を有しており、その理由は腫瘍細胞に対するより良い接近を可能とす るその小さなサイズにある。

本発明を下記の限定でない実施例により例示することができる。

実施例■ ＭＡｂ　Ｂａの重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング クローニング実験及びプラスミドの増殖はＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌ　１）ＨＢＩ ＯＩの中で一般的に実施した（Ｂｏｙｅｒら、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、 　４１　：　４５９−７２（１９６９））。ＭＡｂ　Ｂａの重鎖及び軽鎖のＦｖ 領領域コードするＤＮＡフラグメントは、ＭＡｂ　Ｂａ生産性ハイブリドーマ細 胞系由来のｍＲＮＡのランダムプライム化逆転写によって合成した一本鎖ＤＮＡ の（ＰＣＲ−）増幅により得た。ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３９　：　４８７−９１　（１９８８））はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍ ｅｒ　ＧｅｎｅＡｍｐキット及びＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーモ サイクラ−を利用して、既に述べられている条件（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７　：　１０６６−７０　（１ ９９０））のもとて実施した。重鎖Ｆｖコード領域の増幅のためには、本発明は プライマーペアー８３−Ｈｌ（５’　ＴＡＡＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＴＡ ＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ３’　）ＧＡＴＣＴＧＧ ＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ３’　 ）と８３（２（５’　ＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＴ［Ｇ ／Ｔ］Ａ［Ｇ／Ｔ］［Ｔ／Ｃ］ＴＣＣＡＧＣＴＴ［Ｔ／Ｇ］ＧＴ［Ｇ／Ｃ］ＣＣ ３’　）とを選んだ。これらのオリゴヌクレオチドはマウスのＦｖ　ＤＮへの最 初及び最後に見い出せる定常配列をその３′末端において有している。その５′ 末端には、図１に示す通りのＰＣＲ生成物のクローニングのために制限エンドヌ クレアーゼ認識部位（Ｎｄｅ　Ｉ　。

ＢａｍＨＩ　、　Ｔｌ１ｎｄｎｌ　）を有している。重鎖及び軽鎖のＦｖ　ＤＮ Ａフラグメントの増殖の生成物は３５０〜４００ｂｐのＤＮＡフラグメントであ ることがアカロースゲル電気泳動によって同定された。それらをゲルから精製し 、ＢａｍＨＩ又は旧ｎｄＩＩＩで切り（図１）、次いて第２ゲルでの精製を経て 、ｌ１ｉｎｄＩＩ［−又はＢａｍＨＩ−線状化及び脱リン酸化ｐＢＲ３２２ベク ター（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　２　：９５−１１３　（１９７７））にリ ゲートさせた。

ＭＡｂ　Ｂａの軽鎖及び重鎖Ｆｖコード領域のヌクレオチド配列を二本鎖プラス こドＤＮＡから、ｐＢＲ３２２のＢａｍｔｌ　Ｉ又は旧ｎｄ１１１部位に隣接す る配列決定プライマー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＴ７ポ リメラーゼ配列決定試薬キット（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ）を用いて決定した。

実施例■ Ｂａ（Ｆｖ）及びＢａ（Ｆｖ）−免疫毒素の発現のためのプラスミドの構築 発現プラスミドｐｖｃ　３Ｂ）１は、Ｔ７プロモーター（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：　１０６６−７０　 （１９９０））の制御下にある免疫毒素ＴＧＦα−ＰＥ４０由来の遺伝子、ＰＥ ４０コード領域の３′末端でのＴφ転写ターミネータ−１及び−重鎖複製起点Ｆ ゛を、（Ｍ１３）へルバーファージによる共トランスフェクションによって一重 鎖ファーンＤＮＡを作り」二げるため、所望するならば部位特異的突然変異誘発 によってプラスミドの誘導体を作り上げるために含んでいる。

ｐｖｃ　３８＋１におけるＴＧＦαコード領域はその５′末端においてＮｄｅ　 １制限部位を、そしてＰＥ４０をコードするＤＮＡへの接続点においてｔｌｉｎ ｄｌ１１部位を有している。免疫毒素Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ４０の発現のた めのプラスミド（ｐＵＬＥＥ３）を作り上げるため、重鎮コード領域のＮｄｅ　 １／　Ｂａｍ１ｌ　Ｉフラグメント及び軽鎖ＦｖをコードするＢａｍＨＩ　／Ｈ ｉｎｄＩ［フラグメントを用いる３−フラグメントリゲーノヨンにおいて、ＴＧ Ｆα遺伝子を除去してＢａ（Ｆｖ）遺伝子に交換した（図１）。配列分析は、Ｐ ＣＲプライマーアニール領域における配列反復に起因して軽鎖Ｆ〜・遺伝−ｒの ５′末端において突然変異（欠失及びフレームンフト）を示したため、部位特異 的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

畢丈き只四易　８２　・１８８−９２　（１９８５））を、突然変異誘発鋳型と してウリノン一体型−末鎖ファージミドＤＮＡ　（ｐＵＬＥＥ３）を用いて行っ た。

得られるプラスミド（ｐＵＬｌｌ）において、ＭＡｂ　Ｂａの部分タンパク質配 列決定により確立されたＢａ軽鎖の正しいアミノ末端が再構成された。

別のＢａ（Ｆｖ）免疫毒素、Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＤＫＥＬを作るため 、ＰＥ４０コード領域をｐＵＬ　ｌ　１より、）ＩｉｎｄＩ［１部位からＰＥ４ ０遺伝子をすぐ超えて位置するＥｃｏＲ１部に至るまで排除し、そしてドメイン Ｉａ（アミノ酸１〜２５２）及びドメインＩｂの一部（アミノ酸３６５〜３８０ ）を欠き、且つ改変カルボキシル末端配列ＫＤＥＬ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８７：　３０８−１２　（１９９０））をも含む ＰＥ変異体ＰＥ３８ＫＤＥＬをコードするｐＲＫ　７９に由来の旧ｎｄ　ＩＩＩ 　／　ＥｃｏＲＩフラグメントに置き換えこれをプライマーペアーＢ３−Ｌ３＋ Ｂ３−Ｌ４による軽鎖Ｆｖコード配列の増幅により得られたＰＣＲフラグメント に置き代えることによって構築した。プライマーＢ　３−　Ｌ　３　（５’　Ｔ ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡ３　’　）は、ｃＤ ＮＡからの軽鎖Ｆｖのクローニングのために用いたＢａ−Ｌｌに類似し、そして Ｂ　３−　Ｌ　４　（’　ＡＧＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＣ ＣＡＧＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣＧＡＣ３’　）はＰＣＲをプライムするための３′ 部においてはＢａ−Ｌ２と同一であるが、ＰＥ−配列への融合のための旧ｎｄＩ ［１部位の５′末端においては翻訳停止コドン、それに続くＥｃｏＲＩ認識配列 て置き代えられている。

プラスミドを発現宿主Ｅ、コリＢＬ２１　（λＤＥ３）に形質転換させた（Ｓｔ ｕｄｉｅｒら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８９：　１１３−３０（１９８６）） 。細菌を、２％のグルコース、０．０５％のＭｇ５Ｏ，及び１００μｇ／ｍｌの アンピシリンを含む超培地の中で増殖させ、３０の０Ｄ６００ての対数期におい てＩｍＭのＩＰＴＧで誘発せしめ、そして９０分後に回収した。この誘発培養物 の総タンパク質のうちの約３０％が組換発現生成物であり、それは封入体の中に 蓄積していた。精製した封入体はほぼ純粋な組換タンパク質を含み、これは−重 鎖免疫毒素についての約６７ｋＤａの予測サイズを有していた（図３）。この組 換免疫毒素分子を溶解し、再折りたたみに付し、精製し、そしてそのタンパク質 を既に記載の通りタンパク質合成の阻害を測定するアッセイは既に述べられてい る９６穴プレートの中で行い、各ウェルは２００ｍ１の培地の中に１．６Ｘ１０ ’の細胞を含んでいた。組換免疫毒素の特異性を証明するためにデザインされた 競合アッセイのため、培地を交換し、そして免疫毒素の添加の１５ｍ１ｎ前に５ ０μｇ／ウェルの抗体を加えた。

図４及び表１に示す通り、Ｂ３とＰＥの短縮形態との化学コンシュＢ３抗原を発 現する細胞中のタンパク質合成を阻害したが、非発現細胞においては阻害しなか った。化学コンジュゲートと一本鎖免疫毒素との相対能力は４種の抗原陽性細胞 系ＭＣＦ−７，ＣＲＬ１７３９．　Ａ４３１及びＬＮＣａＰに対してほぼ同して あった。最も活性な試薬はＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤＩ）しＣあった。ｌ３３ （Ｆｖ）−免疫毒素の細胞障害性が特異的であるかを分析するため、過剰のＭＡ ｂ　Ｂ３によって競合実験を行った。

図４ｂにおけるデーターは、Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬによるＡ４ ３１癌細胞の衰弱はＢ３抗原に対する特異的結合性によることを示しており、な ぜならその細胞障害性は過剰のＭＡｂ　Ｂ３によりブロックされるが、これらの 細胞上のトランスフェリンレセプターを認識するＭＡｂ　ＨＢ２１（ｌ（ｏｙｎ ｅｓら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２７：　３４７−５１　（１９８１））によ ってブロックされなかったからである。細胞障害性をなくすのに大過剰量のＭＡ ｂＢ３が必要とされ、その理由はＡ４３１細胞の表層上に大量のＢ３抗原が生後 ６週間の雌のバルブ／Ｃマウス（１９〜２０ｇｍ）に、尾部の血管においてｌＯ μｇの８３　（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥｌ、を注射した。様々なインターバルで 血液を採取し、そしてその血清をＡ４３１細胞とインキュベートし、次いてタン パク質合成の阻害を測定することによって免疫毒素のレベルを測定した。純粋な り　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬにより標準曲線を作り、そしてこの曲線 を利用して免疫毒素の血液レベルを算定した（これを図５に示す）。

０日間にて、雌のヌードマウス（生後４〜６週、１８〜２０ｇｍ）にＡ４３１細 胞（３Ｘ　１０’）を皮下注射した。一般に４日で現れる５ｍｍＸ５ｍｍの腫瘍 を有するマウスを８３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬ、又はコントロールとし てのＭＡｂ　Ｂ３もしくは抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬ（Ｃｈａｕ ｄｈａｒｙら、Ｂ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬの寿命カ月５〜２０ｍ１ ｎにすきないことか認められたため（図５）、尾部の血管の中に、腫瘍移植の４ 日後にて開始して、１２時間毎に６回の注射を付与した。各処置グループは５匹 の動物より構成される。腫瘍の容積は〔腫瘍容積（ａｍ”）−長さＸ幅２Ｘ０． ４：ｌ　により算定した。

図６に示す通り、日に２回の２．５　、　５又は１０μｇのいづれかての注射は 完全腫瘍退化をもたらした。０．５μｇのみの注射を施したときに部分退化か認 められた。これらの投与量において毒性は観察されなかった。更に、直径約１ｃ ｍの大型の腫瘍を有するマウスを日に２回、４日間にわたって５μｇで処置した とき、約５ＸＩＯ’細胞を含むこのような大型腫瘍の完全退化が迅速に起きた（ 図６Ｄ）。

ＭＣＦ−７腫瘍（乳癌）の退化しＢ　３　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬを毎日 ２回、５μｇによって認められた。コントロール実験においては、マウスをＭＡ ｂ又は抗Ｔａｃ　（Ｆｖ）　−ＰＥ３８ＫＤＥＬのいづれかで処置し、これらは ｌｌ７２レセプターを有する細胞に対しては細胞障害性であったがＡ４３１細胞 に対してそうではなく　（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、前掲（１９８９））、そして 抗腫瘍作用は認められなかった。

ＡＬＴＡ−特異的突だ変異誘発 ＦＩ＆、／。

＋８１ＴＴＡ［；ＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＣＡ ＧＡＣＡＣ丁ＧＴＡＡＡＧＧｆ；ＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡ丁bＴ２４０ ＳＮＤＤＳＳ　＾　＾　ＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳ２４１　ＣＣＡＧＡＧＡＣＡ ＡＴＧＣＣＡＧＩ；ＡＡＣＡＣＣＣＴｃＴＡｃ（ＴＧＣＡＡ＾τＧＡＧＣＣＧＴ ＣＴにＡＡＧＴＧＴＧＡＧ（、`Ｃ八　３００ ＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＲＬＫＳＥＤＴ３０１　ＣＡＧＣＣ＾■＾■＾ＴＴ ＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＣＣＴＧ［、ＧＧＡＧＣＣＴＧＧ丁ＴＴ ＧＣＴＴＡＣ丁ＧＧＧＧbＣ３６０ ＡＩＹＳＣＡＲＧしＡＷＧＡｗＦＡＹＷ（，０ＦＩＧ　２Ａ。

ＦＩＧ、４Ａ。

ＦＩＧ、４Ｂ。

注射後の分 ＦＩＧ、５゜ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／ＣＣ１２Ｎ　１／２ １ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　フィッツジェラルド、デビットアメリカ合衆国、メリーランド 　２０９０２゜シルバー　スプリング、ラット　ストリート　１７３１ Ｉ （７２）発明者　ブリンクマン、ユーリアメリカ合衆国、メリーランド　２０８ １４゜ベセスダ、ナンバー　３２．バッテリー　レーン　４８７１ （７２）発明者　パイ、り一 アメリカ合衆国、メリーランド　２０９０６゜シルバー　スプリング、ティポリ 　レイクストリート　漏

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．組換ＤＮＡ分子であって： （ｉ）モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の両者のＦｖ領域をコードするＤＮＡ セグメント；並びに （ｉｉ）該ＤＮＡセグメントを宿主細胞に導入するためのベクター（このベクタ ーは細菌毒素の変異体又はこの毒素の一部をコードする遺伝子を含んで成る）； を含んで成る組換ＤＮＡ分子。
2. ２．前記ベクターがｐＵＬＨ、ｐＵＬＨ３、又はそれらの誘導体である、請求項 １に記載の組換ＤＮＡ分子。
3. ３．記細菌毒素がシユードモナス外毒素である、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分 子。
4. ４．前記組換ＤＮＡ分子によりコードされる免疫毒素の発現が可能となるように 請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子によって形質転換された宿主細胞。
5. ５．前記細胞が原核細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
6. ６．前記原核細胞がエシェリヒアコリである、請求項５に記載の宿主細胞。
7. ７．毒素タンパク質又はその一部と、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のＦｖ 領域とより成る、組換的に生産された免疫毒素。
8. ８．前記毒素がシユードモナス外毒素である、請求項７に記載の免疫毒素。
9. ９．前記モノクローナル抗体がＭＡｂＢ３である、請求項７に記載の免疫毒素。
10. １０．請求項７に記載の免疫毒素と、薬理学的に許容される担体とを含んで成る 組成物。
11. １１．患者の癌を処直する方法であって、前記患者に前記処置を施すのに十分な 量の請求項１０に記載の組成物を投与することを含んで成る方法。
12. １２．免疫毒素を生産する方法であって：（ｉ）モノクローナル抗体の重鎖及び 軽鎖の両方の円領域をコードするＤＮＡ配列をベクターの中にクローニングし（ このベクターは細菌毒素の変異体又はこの毒素の一部をコードする遺伝子を含ん で成る）；次いで （ｉｉ）段階（ｉ）で得られたベクターで宿主細胞を形質転換させ、それにより 免疫毒素の発現を行う； 段階を含んで成る方法。
13. １３．前記モノクローナル抗体がＭＡｂＢ３である、請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記モノクローナル抗体がヒト腫瘍に優先的に反応する、請求項１２に記 載の方法。
15. １５．前記免疫毒素がＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ４０及びＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤ ＥＬより成る群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
16. １６．前記免疫毒素がＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ４０又はＢ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８ＫＤ ＥＬの誘導体である、請求項１２に記載の方法。
17. １７．段階（ｉ）の前記ベクターがｐＵＬＨ１、ｐＵＬＨ３、又はその誘導体で ある、請求項１２に記載の方法。
18. １８．前記細菌毒素がシュードモナス外毒素（ＰＥ）である、請求項１２に記載 の方法。