JPH07503073A - ポリテトラフルオロエチレン担体に固定されたタンパク質の配列決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ボリテトラフルオロエチ−，１／ど組体に固定されたター４任ダ質ｐ配列迭定本 発明はナショナル　インスチチュート　オブ　ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金策ＧＭ４６０２ ２号としての政府の支援をうけて行われたものである。政府は本発明にある一定 の権利を有する。 ｇ唄の分野 本発明は好ましくは多孔質ポリテトラフルオロエチレン担体に固定されたペプチ ドの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に関する。さらに詳しくは、本発明はゲ ルから多孔質ポリテトラフルオロエチレン担体上にプロットされたペプチドのＣ 末端とＮ末端との自動化配列決定に関する。 ｇ叫の背景 ペプチドのＮ末端とＣ末端との配列決定のための種々な方法が知られている。 固体担体に共有結合されたペプチドへのこの化学の適用が自動化を促進している 。 固体担体にペプチド又はタンパク質を共有的に（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ）固定す ることの認められている利点には、サンプル洗い流しの除去によって初期収率と 反復収率とが高いこと、誘導体化と洗浄のために最適の試薬と溶媒を用いること ができること、及びチオヒダントイン形成に起因する反応副生成物を除去するた めにサンプルを効果的に洗浄することができ、それによって化学的バックグラウ ンドを低下させる可能性か生ずることか挙げられる。 Ｎ末端のエドマン化学（Ｅｄｍａｎ　Ｃｈｅ目１ｓｊｒｙ）のための同相配列決 定の概念はラウルセン（Ｌａｕｒｓｅｎ）のＥｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、λＯ ：　８９−１０２　（１９７１）によって提案され、それ以来、幾つかのグルー プによってエドマン分解に対して上首尾に用いられている［ラウルセン等、ＦＥ Ｉ３Ｓ　Ｌｅｔｔ、２１：６７−７０　（１９７２）；エル°　イタリエン（Ｌ ’　Ｉｔａｌｉｃｏ）等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈブリー、ノエイ　イー、　（Ｓ ｈｉｖｅｌｙ、Ｊ、Ｅ、）編集）、２７９−３１４ｍ、フマナ　ブレス社（ＦＪ ｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　）　（１９８６）フ。 Ｎ末端配列決定のためのポリペプチドサンプルの共有的固定用に数種類の機能的 （ｆｌＩｎｃ　ｔ　１ｏｎａ　ｌ　）担体か開示されている。これらには、ポリ スチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、及びアミノアルキル又はアミノフェニ ル基によって置換されたガラスピーズかある。ラウルセン等のＭｅｔｈｏｄｓ　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　へ几旦ｊ、２６　：　２０１−２８４　＜１．９８０）を参 照のこと。 チオシアネ−１・化学を用いた共イｆ結合ペプチドからのＣ末端配列決定の初期 の試みか幾つかのグループによってなされた。ウィリアムス（ｆｉｌＨａｍｓ） 等、ｌ”　Ｅ　１３互−１，ｃ　ｔ　＋−，５４−：　３５３−３５７　（］　 ９７５）は、ペプチジルチオヒダントインの開裂のために１２Ｎ　ＩＩｃＩを用 いて、Ｎ−ヒドロキジスクシンイミト活性化ガラスピーズに共（Ｔ結合したペプ チド（１１１ｍｏｌ）に対して１〜３サイクルを実施することかできた。この同 し方法を用いて、ランガランセン（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ）等、［３ｉ一旦■− ｅ　ｍ−去　上且ユ　３０７−３１６　（１９７６）は、ガラスピーズに共ｆＪ ′結合したりボヌクレアーゼ（１μｍｏｌ）に対して、５〜６時間のサイクル時 間によって、６ザイクルを実施することかできた。放出されたアミノ酸チオヒダ ントインを１−１　［）　Ｌ　Ｃ同定した、上４尾な３サイクルか、モイス（Ｍ ｃｕｔｈ）等、Ｈ−Ｌｐ」−ｅ皿　λ上　３７５０−３７５７　（１９８２）に よって、カルボニルジイミダゾール活性化アミノプロピルガラスに共を結合した ２２−アミノ酸ポリヘフチト（３５０頁ｍｏｌ）に対して実施された。これらの 著者はペプチジルチオヒダントインへの誘導体化のためにチオンアン酸を、開裂 のためにアセトヒドロ４−ザメートを用いて、サイクルあたりの時間を３時間に さらに短縮した。 より最近の、イングリス（Ｉｎｇｌ　ｉｓ）等によるレポート、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｐ−ｒｎ；ｔｃＬカー　Ｓ−ｒ；ｑｕ」ソリとｅ−Δ旦ｌ−シーｙｓ− Ｌ、ｓ（ウイットマンーレボルドヒー　（Ｗｉ　ｆＬｅａｎ−１ｅｂｏｌｄ、　 Ｂ）Ｗ集）１３７−１４４頁、シュプリンゲル−フェルラグ（Ｓｐｒｉｎｇｃｒ −ｖｅｒｌａｇ）　（１９８９）は、４８分間のサイクル時間による、ガラスピ ーズに共白結合した合成デカペプチドＣ３Ｃ５０ｎ　Ｉ）がらの９残基の逐次分 解を報告している。しかし、実験の詳細は記載されていない。さらに最近の研究 ニハ、カルホン酸修飾ＰＶＤＦ　［５不旦不郵且に戸等工左ル歩±２米瀾Ｎ列迭 λシ□−−丁１−カイＦ、ＪｐＱ間１１ＲＩ”−（７）ＡＬＵ（Ｃａｒｂｏｘ　 ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｅ　ｕｃｎｃｉｎ　：Ａｕｔｏｍａｔ奄純香@ａｎｄ　ｇ ２ １ｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｏｌｄ　ｈａｓｅ）。Ｉ　ｎ　Ｔ　ｃ　ｃ 　ｈ　ｎ　−し主片、ｅ　ｓ−ユ」−肛９−↓ｃｉｎ　Ｃｈｃ＋ｙＢユｊ」シに ｌ　＋−（ビランカ、シエイ、シエイ（Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ。 Ｊ、　Ｊ、　）Ｎ集）１１５−１２９　（アカデミツク　プレス社（＾ｃａｄｃ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、））（１９９１）］、カルボン酸修飾ポリエチレ ン［シェノイ（ＳｈｃｎｏＹ）等、Ｐｒｏｔｃｉｎ　５ｃｉｅｎｃｅ　１：５８ −６７　（１９９２）］、及びシスクシンアミトイル　カーボネート　ポリアミ ド樹脂［ホーク（Ｉｌａｗｋ）等、￥ｅｔ、Ｐｒｏ↓−見ｉｎ　Ｓｅ且ｕｅｎｃ ｅ　Δｎ且↓Ｌｌｉ　ｓ　（ンヨーンバル／ホーグ／グスタブッソン（Ｊｏｒｎ ｖａｌ　１／１１ｏｏｇ／Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ）ＩＱ集）３５−４５頁、ハー クハウセル−フェルラグ（Ｂｉｒｋｂａｕｓｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　）、ハーゼ ル（１９９１）］がある。 現在、ＰＶＤＦがＮ末端配列決定のために及び、例えばＳＤＳゲルのような、ゲ ルからの精製タンパク質のプロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）のために好まし い担体である。しかし、Ｃ末端の配列決定操作において、ＰＶＤＦは黒変（ｔｕ ｒｎ　ｂｌａｃｋ）　Ｌ、溶解し、一部のＣ末端の配列決定操作をしばしば一回 に限定する。 先行技術の担体か有するこれらの問題の他に、共有結合か必要であることか固有 にサンプル損失を生ずる。この理由から、現在では、Ｎ末端配列決定のためにタ ンパク質をＰＶＤＦ上にプロットしている。しかし、Ｃ末端の配列決定のために は、タンパク質サンプルをＰＶＤＦから溶離して、異なる担体に付着させなけれ ばならない。 ｇ灰の庫犬 本発明の１態様によると、ポリテトラフルオロエチレン担体（好ましくは多孔質 ）をゲルからのタンパク質のプロッティングと、Ｎ末端及びＣ末端の配列決定と のために提供する。本究明によって提供する担体は化学的に不活性であるので、 Ｎ末端又はＣ末端の配列決定の条件下で分解［７ない。タンパク質はポリテトラ フルオロエチレン担体に強く付着して、例えばメタノール、ジメチルホルムアミ ド、酢酸エチル及びアセトニトリルのような、配列決定に典型的に用いられる溶 剤によって洗い流されない。共有結合は必要ではない。 区面の説明 図１は本発明の実施に有用なＣ末端ノークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）の概 略図であ図２はポリテトラフルオロエチレン担体に非共有的に付着したβ−ラク トグロブリン（３５０ｐｍｏｌ）の図１のシークエンサーにおけるＣ末端配列決 定の４サイクルの各々の結果を示すクロマトグラムを表す。 図３はポリテトラフルオロエチレン担体に非共有的に付着したスーパーオキシド ジスムターゼ（５，２ｎｍｏ　Ｉ）の図１のシークエンサーにおけるＣ末端配列 決定の４サイクルの各々の結果を示すクロマトグラムを表す。 図１のＣ末端シークエンサーの説明 図１に示すンークエンサーの全体的デザインはカレイヵイ（Ｃａ　ｌ　ａｙｃａ ｙ　）等のへ旦ｑ」−１３ｊｏｃ上尤Ｕ、Ｌクユ　２３−３１　（１９９１）が 述べている気相Ｎ末端シークエンサーに、幾つかの点で、類似している。 図１に描写した機器に付随する試薬瓶と溶剤瓶を示す。次の実施例によって示す ように、本発明の実施には試薬瓶５本（ＲＩ　Ｒｓ）と溶剤瓶５本（ＳＩ　Ｓｓ ）が用いられる。瓶Ｒ＋　Ｒｓからの試薬と瓶５１−８．がらの溶剤とを連続流 反応器（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｆｌｏｗ　ｒｅａｃｔｏｒ）　（ＣＦ　Ｒ）に 供給する。瓶Ｒ６がらの試薬と瓶ｓ５からの溶剤とを転化フラスコ（ｃｏｎｖｅ ｒｓｉｏｎ　ｆｌａｓｋ）　（ＣＦ）に供給する。Ｎ末端配列決定では、このＣ Ｆは開裂したアミノ酸のＡＴＺ誘導体をＨＰ　１．、　Ｃの分析直前に１’ＴＩ Ｔ（フェニルチオヒダントイン）に転化させるために役立つ。Ｃ末端配列決定で は、このＣＦは開裂したチオヒダントインアミノ酸をＩＩ　Ｐ　Ｉ−Ｃに注入す る直ｉ；Ｉに維持するための場所として役立つ。 試薬と溶剤の組成を表１に記載する。 表土 試遠２ｊ汀町２阻戊 Ｒ１メタノール中１０％トリエチルアミンＲ２アセトニトリル中シフェニルホス ホロイソチオシアナチデート（３，０Ｍ） Ｒ３５０％メタノール、５０％

【−ブチルアルコール中０．ＩＯＭナトリウムト リメチルシラノラート Ｒ４ピリジン Ｒ５水中２．０％トリフルオロ酢酸 Ｓ３　ジメチルホルムアミド Ｓ６　−ｍ−−−−−− ＣＦＲに種々な試薬と溶剤とを供給するために、緩和な圧力（１，５気圧）のア ルゴンを６瓶に加える。アルゴンはその化学的不活性のために選択した。他の適 当な不活性ガスとしては、ヘリウムと窒素とを挙げることができる。全体で５個 の圧力レギュレータ（Ｐｌ−Ｒ５）か存在する。Ｐｌは５Ｌ−３４用であり、Ｒ ２はＳｓ、Ｓ６、Ｒ５及びＲ６用であり、Ｒ３はＲ２とＲ３用であり、Ｒ４はＲ １とＲ４用であり、Ｒ５はブローアウト（ｂｌｏｗ　ｏｕｔ）機能とアルゴン供 給機能（乾燥等）のためである。試薬（例えば、Ｒ１）を供給すべき時間になる と、アルゴンを弁に通して瓶（Ｒ１）に供給するために、Ｒ４のソレノイド作動 弁か開く。 ６瓶は密封されるので、アルゴンの圧力か６瓶の底部のラインを通して弁ブロッ ク（この場合にはＱ２）まで溶剤を押圧する。そこで、Ｑ２のソレノイド作動弁 とＳＷｌの弁＜ｖ＃出用）とか開いて、溶剤を弁ブロック（Ｑ２）中と、ＣＦＲ 中に流入させる。ＣＦ　Ｒがひと度充満すると、弁を閉じて流れを停止させ、反 応を所望の長さの時間、続けさせる。反応後に、アンガー（Ａｎｇａｒ）弁（Ｂ ＯＩ）と５Ｗｌ（廃棄物用）とを開いて、アルゴンを弁ブロックＱ１とＱ２に通 させる。これはＣＦＲ中の試薬又は溶剤をＣＦＲ直後の三方切り換え弁でどちら のソレノイドか始動されるかに依存して、廃棄物又はＣＦへ押し出す。それ故、 配列決定のプログラムは種々な時間にソレノイド作動弁を開閉することのみから 成る。 図】に示すンークエンサーを用いるＣ末端配列決定のプログラムの概要を表２に 記載する。 表又 Ｃ末端シークエンサー ズ９グプム概要 連続流反応器　転化フラスコ　時間 （、Ｃ，−１４”　Ｒラ−−−−仄−４Ｌ←にλ−−、−，−（ρ−１−−℃づ −−うど℃ΣＬ−−□−−−（秒）（１）加圧Ｒ１３ （２）供給Ｒ１５ （３）Ｒ１反応　３０ （４）ブ［Ｊ−アウトｌン１　６０ （５）加圧Ｒ２３ （６）供給Ｒ２２ （７）Ｒ２反応　１８０ （８）ブローアウトＲ２１５ （９）Ｓｌ加圧　３ （１０）ＳＬ供給　１０ （１１）ブローアウトＳ１　１５ （１，２）Ｒ４加圧　３ （１３）Ｒ４供給　６０ （１４）ブローアウトＲ４６０ （１５）Ｓ３加圧　３ （１６）Ｓ３供給　３０ （１７）ブローアウトＳ３　３０ （１８）Ｓ２加圧　３ （１９）Ｓ２供給　２４０ （２０）ブローアウトＳ２　１０ （２１）Ｓ３加圧　３ （２２）Ｓ３すすぎ洗い　１８０ （２３）５３ブローアウト　２０ （２４）Ｓ４加圧　３ （２５）Ｓ４供給　１２０ （２６）ブローアウトＳ４　３０ （２７）Ｓ３加圧　３ （２８）Ｓ３すすぎ洗い　２４０ （２９）Ｓ３ブローアウト　２０ （３０）Ｓ２加圧　３ （３１）Ｓ２供給　１２０ （３２）休止　５ （３３）Ｓ２からＣＦへ　２０ （３４）休止　５ （３５）ＣＦから廃棄物へ　６０ （３６）Ｓ２供給　１２０ （３７）ブローアウトＳ２　４５ （３８）Ｒ３加圧　３ （３９）Ｒ３供給　２ （４０）Ｒ３反応　６００ （４１）Ｒ３からＣＦへ　２゜ （４２）ＣＦにおいて乾燥　６００ （４３）Ｒ５加圧　３ （４４）回路へＲ５供給　４ （４５）回路からＣＦへ　８ （４６）Ｒ５加圧　３ （４７）回路へＲ５供給　４ （４８）回路からＣＦへ　８ （４９）ＣＦ排出　３ （５０）ＣＦから夏（ＰＬＣへ　１５ （５１）休止　６０ （５２）加圧Ｓ５　３ （５３）供給３５　１．５ （５４）ＣＦを空にし、ＣＦＲを乾燥する　１８０このプログラム概要における 最初の４操作は試薬Ｒ１を含む。これらの工程は特定サンプルのために１回のみ 実施され、配列決定実験の開始時のみに存在する。 “加圧Ｒ１”工程は、Ｒ１の圧力弁を開き、Ｒ１瓶をアルゴンによって３０秒間 加圧することを意味する。 第２工程（供給Ｒ１，）では、Ｒ１に対応するＲ４の弁をまだ開いたままで、Ｒ １への圧力を維持するが、Ｒ１への試薬ブロックのソレノイドも開いて、Ｒ１を ＣＦＲ中へ流入させる。さらに、閉鎖系中の圧力の平衡を可能にし、全ての溢流 を廃棄物瓶に流動させるために、三方切り換え弁（ＳＷＩ）のソレノイドを開い く。この流れを５秒間維持する。５秒間の最後に、ソレノイド作動弁の全てを閉 し、Ｒ１試薬（この場合には、メタノール中１０％トリエチルアミン）をタンパ ク質サンプルと３０秒間反応させる。 ブローアウトＲ１工程を達成するために、ＢＯＩ弁を開いて、アルゴンを試薬瓶 ブロック（ＱｌとＱ２）中に流入させる。ＣＦＲ直後の廃棄物弁（ＳＷＩ）をも 開く。これはアルゴンかＣＦＲの内容物を廃棄物方向へ押し出すことを可能にす る。この場合には、アルゴンをＣＦＨに通して６０秒間押し進め、その後に全て の弁を閉じる。 第２グループの４操作は試薬Ｒ２を含む。これらの工程はＲ１に関して述べた同 じ方法で実施される。従って、Ｒ１のための弁を開放する代わりに、Ｒ２、Ｓｌ 、Ｒ４及びＳ３のための対応弁を用いる。 説明したように、ホスホリルイソチオシアネート樹脂（Ｒ２）によるタンパク質 サンプルの処理、ヘプタン（Ｓｌ）によるすすぎ洗い、気相ピリジン（Ｒ４）に よる処理及びＤＭＦ　（Ｓ３）によるすすぎ洗いを必要とする、この４イベント 順序を２回より多く繰り返して、平衡をチオヒダントイン形成方向にまで押し進 める。 この段階において、タンパク質Ｃ末端アミノ酸の９０％以上がチオヒダントイン に誘導体化される。しかし、ＣＦＲ中又は種々なライン中にはまだ若干のイソチ オシアネート試薬とピリジンが存在して、ＵＶ吸収性不純物を放出チオヒダント インアミノ酸のＨＰＬＣクロマトグラムに加えることになる。 次の工程（１８）〜（３７）はメタノール、ＤＭＦ、ヘプタン、ＤＭＦ、メタノ ールによるンテックス（Ｚｉｔｃｘ）担体付きペプチドサンプルのすすぎ洗いを 含む。 最後のメタノール洗浄工程（３２）の途中で、ＣＦをＣＦＲ中のメタノールによ って洗浄する。次に、ＣＦ中のメタノールを工程（３５）によって示すように廃 棄物に送り、残留メタノールを工程（３７）においてブローアウトする。この目 的のために、他の数種類の溶剤を用いることもできる。 工程（３８）〜（４２）において開裂か達成される。Ｒ３（メタノールとｔ−ブ タノール中のナトリウムトリメチルシラノシート）をＣＦＲ中に供給して、１２ ０秒間反応させる。次に、ＣＦＲの内容物をＣＦ中に押し進める。ひと度ＣＦ中 に入ったならば、チオヒダントイン含有アルコール溶液はアルゴン流をその」二 にブローすることによって６００秒間乾燥される。これはＣＦ下の弁（ＳＷ２と ５ｗ３）並びに、ＣＦを排出する弁を開くことによって達成される。 この時点において、ＣＦ中の乾燥チオヒダントインアミノ酸を、Ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｌ 　Ｃへの注入のために、溶剤（例えば２．０％トリフルオロ酢酸＞　（Ｒ５）中 に溶解しなければならない。注入のための適当量を供給するためにＲ５を２回供 給する（５５μＩを２回供給）。工程（４３）〜（４９）を参照のこと。 ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ中への注入はＣＦにアルゴン圧力を加えることによって達成さ れる。 これはＣＦの直接上の弁（ＢＯ２）を開き、ＣＦの内容物を１００μＩＨＰＬＣ 注入回路中に押し進めることによって達成される。ＨＰ　Ｌ　Ｃ注入回路の内容 物をＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム上に進めるために、休止工程Ｓ１は６０秒間長さで ある。最後の工程は、系を清浄化するために、メタノールによるＣＦのすすぎ洗 いと、アルゴンによるＣＦＲとＣＦの両方の１８０秒間の７ラツシング（ｆｌａ ｓｈｉｎｇ）とを含む。 工程（５２）〜（５４）を参照のこと。次に、全サイクルを必要な回数繰り返す 。 注入はラスナク（Ｒｕｓｎａｋ）の米国特許第５．１３７．６９５号に述へられ ている光学検出Ｐ５（ｏｐｔｊｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）によって制御される 。 プログラム全体のサイクル時間は約１時間を要する。 ポリテトラフルオロエチレン一体の説明本発明の担体は商業的に入手可能なポリ テトラフルオロエチレンフィルム又はシートから製造することができる。好まし くは、約０．００２インチ〜００３０インチの厚さを有するフィルム又はシート か用いられる。ポリテトラフルオロエチレンか多孔質であることも好ましい。例 えば、１〜１０ミクロンの孔度か適当である。 適当な厚さ及び孔度の多孔質ポリテトラフルオロエチレン又は“テフロン”は、 商品名ンテノクスでノルトン　プラスチックス　カン厄−（Ｎｏｒｔｏｎ　Ｐｌ ａｓｔｉｃｓ　Ｃｏｗ＋ｐａｎｙ）から入手可能である。例えば、種々なシテッ クスＧ製品を説明し、関連する物理的性質を記載する、ノルトノ　カンパニーか ら入手可能な“Ｎｏｒｔｏｎ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｃ　ｒ’１ａｓＬｉｃｓ” 　（１９８７）を参照のこと。ンテノクスＧ　、−１１０と確認されるノルトン 製品か好ましく、下記の実施例において用いｔこ。 世男云１すλフルオロエチ１２担体へのゲル精製タンパク質のプロンティング種 々な担体へＳＤＳゲル精製精製タンパクジロッティングする方法は知られている 。例えば、トウビン、エッチ　（Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｉｌ、　）等のＰｒｏｃ、Ｎ ａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７６：４３５０−４３５４　（１９７９）；マツ ダイラ、ピー、（Ｍａｔｓｕｄａｉ　ｒａ、　Ｐ、　）等のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、２６２：１００３５−１００３８　（１９８７）；及びエバーソルド、ア ール、エッチ、　（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｒ，Ｉｌ、）等のＪ、Ｂｉｏｌ、ｃｈ ｅｍ、Ｒ６１：　４２２９−４２３８　（１９８６）を参照のこと。同様な方法 を用いて、ＳＤＳゲル又は同様なゲルからのタンパク質サンプルを本発明の担体 上にプロットすることができる。 本発明の実施に用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク リルアミドケル電気泳動）系は、レムリ、ニー　ケイ、　（１，ａｅｍｃｌｉ、 　Ｕ−Ｋ、　）のハエｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−６８５　（１ ９７０）によって最初に述へられたものである。 この方法の詳細はガーンン、ディ　イー、　（Ｇａｒｄｉｎ、Ｄ、Ｅ、）によっ て、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　１８２：４２５−４４１　（１ ９９０）に詳述されている。 実施ｔμｍ ポリテトラフルオロエチレン一体へのＶ製タンパク−のブロッティング５ＤＳ− ＰＡＧＥサンプル」二に存在するβ−ラクトグロブリンＡサンプルを孔度１〜２ ミクロン、細孔容積（ｐｏｒｏｕｓ　ｖｏｌｕｍｅ）　４０％及び厚さ０゜０１ ０インチを有する多孔質ポリテトラフルオロエチレン担体（ンテックスＧ−１１ ０）上にプロットした。 シテックスをメタノール中に浸漬することによって予め濡らした後に、サンプル を含む分離ポリアクリルアミドゲルの頂部に載せた。このアセンブリを次に該ゲ ル下の３層のホワソトマン（Ｗｂａｔｍａｎ）！紙とシテックス頂部上の３層の ポワットマノ濾紙との間に挟んだ。このアセンブリ全体を２個のスコッチ−ブラ イト（Ｓｃｏｔｃｈ−Ｂｒｊ　ｔｅ）バットの間に挿入し、エレクトロトランス フｙ　−（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）装置に入れた。エレクトロトラン スファー緩衝液は０．０２５Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、０１９２Ｍグリシン（ｐＨ８， ３）であった。転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は３０ミリアンペアの定常電流によっ て３時間で達成された。タンパク質染色はンテックス担体を９５％メタノール、 ５％酢酸中の０．　１％アミドブラック（＾ｍ１ｄｏ　Ｂｌａｃｋ）　（Ｗ／　 Ｖ）の溶液中に１５分間入れることによって達成された。脱染色（ｄｅｓｔａｉ ｎｉｎｇ）はシテツクス担体を９５％メタノール、５％酢酸中に５分間浸漬する ことによって達成された。染色と脱染色は室温（２２℃）において実施した。 実施例±↓ ？テヱ久と叶俸上−ＯＸ二之久トゲロブリンＡのＣ末端配ダ決定ンテックス担体 付きβ−ラクトグロブリンＡサンプル（３５０ｐｍｏ　ｌ）に対して、図１に示 した機器と、表２に記載したプログラムと、ベイレイとシブリー（Ｂａｉｌｅｙ 　ａｎｄ　５ｈｉｖｅｌｙ）の同時係属米国特許出願第０７／８０１．９４４号 に述へられた化学とを用いて、上述したやり方でＣ末端配列決定を実施した。４ サイクルを通しての結果は図２に示す。 実施り■」↓ ２ｉ１タ３■体工１−ぎ丞７バーオキ２亙２各１９二±ｐ」ｌ屏ＥＣ木爛配列決 定スーパーオキノドジスムターゼ（５，２ｎｍｏｌ）を含むジテックス担体と、 実施例ＩＩに述べた機器及びプログラムとを用いた。 サンプルを配列決定の直前に酢酸によって処理して、リジンのイプシロン−アミ ノ基をアセチル化して、チオヒダントインリシン誘導体かチオヒダントイン−ｐ ｈｃ誘導体と同時溶離されることを防止した。４ザイクルを通しての結果は図３ のり［Ｊマドグラムによって示す。 共通に譲渡された出願人の同時係属特許出願筒０７／８０１．９４４号は、ペプ チド又はポリペプチドのカルボキシ末端配列決定方法を述べており、この方法で はペプチドのカルボキシ末端アミノ酸をホスホロイソチオシアナチデートとピリ ノンとの混合物と反応させて、チオヒダントイン誘導体を形成する。ピリノンの 代わりに、トリアジン、イミダゾール又はテトラゾールを用いて、チオヒダント イン誘導体を形成することかできる。 気相で実施された、同時係属米国特許出願第０７／８０１．９４４号に記載の化 学によってポリテトラフルオロエチレン担体付きペプチドを、ポリテトラフルオ ロエチレン担体から→Ｊ゛ンブルを洗い流さない溶剤と共に用いて、タンパク質 のｎｍｏ　１未満のサンプルを複数回のサイクルによってＣ末端配列決定するこ とが初めて可能になる。 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　７ 保持時間（分）　保持時間（分） ４１　″　忰　￥　１′冊、ｚ　’　＝÷　：う后　チア　−？　（ぞう・］・ 保持時間（分）　保持時間（分） 保持時間６分）　保持時間（分） 手続補正書（５ベノ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．その片面にタンパク質サンプルを有するポリテトラフルオロエチレンシート 。
2. ２．その片面に配置されたタンパク質サンプルを有する多孔質ポリテトラフルオ ロエチレンシート。
3. ３．４０％〜６０％の細孔容積を有する請求項２記載の多孔質ポリテトラフルオ ロエチレンシート。
4. ４．前記タンパク質サンプルがゲルからのプロッティングによって前記シートの 前記片面に配置された請求項２記載の多孔質ポリテトラフルオロエチレンシート 。
5. ５．担体付きペプチドサンプルのＮ末端又はＣ末端の配列決定方法において、ポ リテトラフルオロエチレン表面に支持されたペプチドサンプルの配列決定するこ とを含む改良方法。
6. ６．ポリテトラフルオロエチレン表面に支持されたタンパク質サンプルのカルボ キシ末端の配列決定することを含む方法。
7. ７．次の工程： （ｉ）ＳＤＳゲル上で電気泳動によって精製されたペプチドサンプルをプロッテ ィングによって、前記サンプルのための多孔質ポリテトラフルオロエチレン担体 に直接移す工程と； （ｉｉ）前記移されたサンプルを含む前記担体をＮ末端又はＣ末端シークエンサ ーに入れる工程と を含む方法。
8. ８．（ｉｉｉ）前記サンプルを配列決定する工程をさらに含む請求項７記載の方 法。