JPH07503142A - 免疫避妊剤及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４０、請求項２１ないし２９のいずれかのＤＮＡ配列の原核または真核宿主細胞 内における発現生成物。

４１、適当な栄養条件下に、請求項３０ないし３７のいずれかのＤＮＡベクター により形質転換またはトランスフェクトした原核または真核宿主細胞を成長させ 、該ベクターの発現生成物から所望のポリペプチドを分離することよりなる、哺 乳動物の組替え透明体蛋白質またはその断片を製造する方法。

４２、対象哺乳動物（ヒトを除（）に、透明帯蛋白質に対するアンチ−ＺＰＡ抗 体及びアンチ−ＺＰＢ抗体よりなる群から選択した避妊有効量の抗体を投与する ことからなる避妊方法。

４３、対象哺乳動物（ヒトを除く）に、透明帯蛋白質に対する避妊有効量のｚＰ Ｃ抗体を投与することからなる避妊方法。

明　細　書 免疫避妊剤及び方法 発明の詳細な説明 発明の分野 本発明は広くは透明体蛋白質の製造とその用途に関し、より具体的には透明帯蛋 白をコードするＤＮＡ配列、このような蛋白質を製造する組替え物質と方法、天 然及び組替えの透明体蛋白質の使用により哺乳動物の一時的または永久的不妊状 態を生じさせる避妊剤に関する。

発明の背景 本発明は哺乳動物内でその卵母細胞の透明帯中に存在する蛋白質に対する抗体を 誘発させることにより哺乳動物に反復可能な一時的不妊状態を誘起させる避妊剤 に関する。

本発明はまた、各種の哺乳動物から得られ、ここに”２ＰＡ”、　”ＺＰＢ”、 ”ｚＰＣ”　と呼ぶ透明帯をコードする精製分離されたＤＮＡ配列に関する。

本発明は更に対象哺乳動物に抗体の産生な誘起することができる薬剤に関する。

透明帯（ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ　（ＺＰ）　）は卵母細胞により分泌さ れる糖蛋白から形成されて哺乳動物の卵母細胞を取り囲んでいる複合体である。

透明帯糖蛋白は各種の作用を行う。例えばマウスのＺＰ蛋白質のＺＰ２とＺＰ３ は複合されて長い繊維となりそれらはＺＰマトリックス中のＺＰＩにより交差結 合され、マトリックスに対して構造的に一体化される（　Ｗａｓｓａｒｍａｎ、 Ｐ、Ｍ、、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５７：４１５−４４２　（ １９８８）　）　、この構造上の役割のほかに、マウスのＺＰ３はＺＰ基質中で 精子受容体となることが示された（　Ｂｌｅｉｌ、Ｊ、Ｐ、ａｎｄＷａｓｓａｒ ｍａｎ。

Ｐ、Ｍ、、Ｃｅ１ｌ　２０：　８７３−８８２　（１９８０）　）、精子のｚｐ ３への結合とその後の２２表面での精子光体反応に続いて、ＺＰ２は卵に結合す る精子を維持するために必要な第２精子受容体として作用する（　Ｂｌｅｉｌ外 、Ｄｅｖ、Ｂｉ。

１、　１２８：　３７６−３８５　（１９８８））。卵母細胞の維持及び精子− 卵母相互作用におけるその役割のために、ＺＰは妊娠過程に干渉する避妊剤の提 供の目標となる。

多くの研究者がＺＰの作用に干渉する試みの中で免疫学的な研究を行い、それに より免疫処理した哺乳動物の妊娠を抑制する研究を行っている（例えばＤｕｎｂ ａｒ外。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉ ｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ。

Ｔ、Ｗｅｇｍａｎ及びＴ、　Ｇｌｌｌｓ編Ｌｏｎｄｏｎ：　０ｘｆｏｒｄ　Ｐｒ ｅｓｓ。

ｐｐ、　５０５−５２８　（１９８３）　、及びＤｕｎｂａｒ外、　Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍｓａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａ ｔｉｏｎ、Ｊ、Ｈａｒｔｍａｎ編Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　ｐｐ、１３９−１６６（１９８３））　ａこれらの研究によると、卵 巣のホモジネートによる哺乳動物の活性免疫は妊娠を抑制することが分かる。し かし、このようなホモジネート中の大多数の成分は妊娠の抑制の原因である抗原 の同定をほとんど不可能にする。その上、このような複雑な混合物を使用すると 望ましくない副作用を生じる可能性がある。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）や高圧液体クロマトグラフ 法（ＨＰＬＣ）等のクロマトグラフ法による研究では、種々の哺乳動物から多数 の透明帯蛋白質の同定が行われた。Ｔｉａ＋ａ＋ｏｎｓ及びＤｕｎｂａｒらのま とめたデータ（Ｔｉｍｅｏｎｓ及び　［１ｕｎｂａｒ　：　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉ ｖｅｓｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉ。

ｎ、　ｐｐ、　２４２−２＋１０．　Ｍａｔｈｕｒ、　Ｓ、及びＦｒｅｄｅｒｉ ｃｋｓ、　Ｃ，Ｍ、編：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｈｅｍ１ｓｐｈｅｒｅ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ　（１９８８））には、以下に述べるように特性が分かっ た透明帯蛋白質の例が示されている。

ブタから単離された透明帯蛋白質には次のものがある、ＰＺｌ、　４０−１１０ 　ｋＤ蛋白質（Ｄｕｎｂａｒ外、　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ、　２４：１１１１ 　（１９８１）　）　、　ＰＺＩＩ、７０−１１０　ｋＤ　蛋白質、ＰＺＩＩＩ 、　９５−１１８　ｋＤ蛋白質及びＰＺＩＶ、　１ｇ−２５ｋＤ蛋白質（いずれ もＤｕｎｂａｒ外、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　３２：６１９　（１０５） 　）　、　９０に、　８９−１１９　ｋＤ蛋白質、６５に、　６１−８３　ｋＤ 蛋白質、５５に、　４７−６６　ｋＤ蛋白質、及び２５に、１８−２６　ｋＤ蛋 白質くいずれも）Ｉｅｄｒｉｃｋ、　Ｊ、Ｌ、及び　Ｗａｒｄｒｉｐ、　Ｎ、Ｊ 、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５７：　６３　（１９８６）、ＺＰＩ、　８２−１１ ８　ｋＤ蛋白質、ＺＰ２．５８−９６　ｋＤ蛋白質、ＺＰ３（ＰＰＺＡ）、　４ ０−７４　ｋＤ蛋白質、及びＺＰ４．２１　ｋＤ蛋白質（いずれも　Ｓｕｂｒａ ｍａｎｉａｎ外、　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、２４：９３３　（１９８１）；　 ８７Ｋ　（ＺＰ　１／ＺＰ２）、　７７−９７　ｋＤ蛋白質、５８に、　４０− ７０　ｋＤ蛋白質（いずれもＹｕｒｅｗｉｃｚ外、　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ、 ２９：　５１１　（１９８３）　）　、脱グリコジル化ＰＺＩ、　３５　ｋＤ蛋 白質、ＰＺＩｌ、　５５　ｋＤ蛋白質、及びＰＺＩＩＩ、　８０　ｋＤ蛋白質（ いずれも　５ｋｉｎｎｅｒ及びＤｕｎｂａｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ａｐｐｒｏａｅｈｅｓ　ｔｏ　Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　 Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、Ｇ、Ｐ、Ｔａｌｗａｒ　ｊ！ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｐｌｅｎｕｍ　ｐｐ、　２５１−２６８　（１９８６ ））　、及び分子量４５ｋＤ（７）脱グリコジル化ＺＰ３　（Ｓａｃｃｏ外、　 Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔｉｌ、　７６：５７５　（１９８６）　）。

ウサギから単離された透明帯蛋白質には次のものがある０分子量がそれぞれ６８ −１２５　ｋＤ、８０−１００．５　ｋＤ、及び１００−１３２　ｋＤの　ＲＺ Ｉ、　ＲＺＩＩ及びＲＺＩＩＩ（いずれも　Ｄｕｎｂａｒ　ｅｔａｌ、、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　２４：１ｌ１１　（１９８６）））、分子量がそれぞ れ１００−１１８　ｋＤ、８３−１１０　ｋＤ及び８０−９２　ｋＤ（７）ＺＰ Ｉ、　Ｚｒ２及びＺｒ３　（いずれも５ａｃｃｏ外、　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　 Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、　１６７：３１８　（１９８１））、分子量がそれぞれ６５　ｋＤ及び ８０ｋＤの脱グリコジル化ＲＺＩ及びＲＺＩＩ（いずれも５ｋｉｎｎｅｒ及びＤ ｕｎｂａｒ、　Ｉａｖ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　 Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｔｉ ｌｔｙ、Ｇ、Ｐ、　Ｔａｌｗａｒ編、ＮｅｗＹｏｒｋ：　Ｐｌｅｎｕｍ、　＋） ｐ、　２５１−２６８　（１９８６）　）　、及び９０　ｋＤの脱グリコジル化 ＲＺＩＩＩ　（Ｔｉｍｍｏｎｓ及びＤｕｎｂａｒ、Ｂｉｏｌ。

Ｒｅｐｒｏｄ、　３６：　１２７５　（１９８７））。

多数のマウスの透明帯蛋白質が単離されたがそれらには次のものが含まれる。分 子量がそれぞれ２００　ｋＤ　、　１２０　ｋＤ及び８３　ｋＤ　ＺＰＩ、Ｚｒ ２及びＺｒ３　（いずれもＢｌｅｉｌ及び　Ｗａｓｓａｒｍａｎ　Ｄｅｖ、Ｂｉ ｏｌ、７６：１８５　（１９８０））及び分子量がそれぞれ１１Ｂ−１２２ｋＤ 及び９０−９２　ｋＤのｚｐｒ及びＺｒ２　（いずれも　５ａｃｃｏ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、ヒｘｐ、Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　１６７：　３１８ 　（１９８１））　、Ｂｌｅｉｌ及び５ａｃｃｏ外が報告したマウスのＺＰｌ及 びＺｒ２の分子量の差はＢｌｅｉｌが非還元条件下の２Ｏ−ＰＡＧＥを使用した こと、５ａｃｃｏが還元条件下の２Ｄ−ＰＡＧＥを使用したことが原因と思われ る。

垣離されたネコの透明帯蛋白質には分子量がそれぞれ５０−１１０　ｋＤ及び９ ０−１１０　ｋＤのＣＺＩ及びＣＺＩ　Ｉがある（Ｍａｒｅｓｈ及び　Ｄｕｎｂ ａｒ　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｚｏｏｌ、２４４：２９９　（１９８７）　）。

Ｍａｒｅｓｈ及びＤｕｎｂａｒ　（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｚｏｏｌ、２４４：２９９ 　（１９８７）　）はまたイヌの透明帯蛋白質ＤＺＩ、　ＤＺＩＩ及びＤＺＩＩ Ｉを単離したが、それぞれの分子量は５０−１１０　ｋＤ、７〇−９５ｋＤ及び ９０−１００　ｋＤである。

５ａｃｃｏｅｔａｌ（Ｐｒｏｃ、Ｓａｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、１６７： ３１８　（１９８１））はリスザルの分子＠　６３−７８　ｋＤ　、　６３−７ ０　ｋＤ、４７−５１　ｋＤ　及び４３−４７　ｋＤ　ノＺＰ　１．　Ｚｒ２． 　Ｚｒ３、及びＺｒ４を単離した。

また５ａｃｃｏ　ｅｔ　ａｌ　（同論文）は分子量８０−１２０　ｋＤ、７３ｋ Ｄ、及び５９−６５　ｋＤ　（７）ヒトＺＰ１．ＺＰ２、及びＺｒ３を単離した 。

現在までのところ、少数の哺乳動物の透明帯遺伝子または蛋白質が単離され配列 決定された程度である。しかし、有効な免疫避妊剤を製造するために成功裏に使 用されたものはない。各種の晴乳動物の透明帯中に存在する蛋白質の数及び特性 （例えば分子量）に関して当技術分野の技術者の間に一致した見解はな（、また これらの重質のグリコジル化した蛋白質の精製が困難なために透明帯蛋白質を利 用して予見可能な作用を有する効果的な免疫避妊剤の製造を行うことが阻害され ている。

多数の研究者が種々の晴乳動物の透明帯蛋白質をコード化するｃＤＮＡまたは遺 伝子をクローニングすることに成功している。

Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ外（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、、１２７：２８７−２９５　（１ ９８８））及びＬｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌｌ 、　１０：　１５０７−１５１５　（１９９０））はマウスの透明帯蛋白質ＺＰ ３及びＺｒ２をそれぞれコード化するマウスＤＮＡのクローニングを報告してい る。これらのクローンはマウスのｃＤＮＡライブラリをアンチ−Ｚｒ３及びアン チ−ＺＰ２抗体でスクリーニングしたものである。マウスのＺｒ３とＺｒ２の間 に配列の相同性がないことが見いだされた。

Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ外（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ 。

８３：４３４１−４３４５（１９８６））はマウス、ラット、イヌ、ウシ、及び ヒトの全体の染色体と交雑したマウスＺＰ３に対する部分的なｃＤＮＡの単離を 報告しているが、ブタまたウサギの染色体ｃＤＮＡとの交雑は、交雑が非常に低 いストリンジエンシーで行わない限り起きない。Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ　Ｄｅｖ、 Ｂｉｏｌ、１２７：２８７−２９５（１９８８）で記述されている完全な長さの Ｚｒ３　ｃＤＮＡは比較的短い５°及び３゛末端翻訳領域と約１３１７個のヌク レオチドのオーブン読み取りフレームと、追加の２００〜３００個のヌクレオチ ドポリＡテイルを有する生殖系統ｍＲＮＡであるｅ　Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅはまた ラット、ウサギ、イヌ、及びウシの卵巣がマウスＺＰ３　ｃＤＮＡに交雑された ｍＲＮＡを転写すること、このＺＰ３転写物が同様な分子量を有することを発見 している。Ｌｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　 １０：　１５０７−１５１５　（１９９０））はＺｒ２の核酸及び推定されたア ミノ酸配列が、５゛及び３°非翻訳領域の短い同一モチーフを存するけれども、 　Ｚｒ３のそれとは明確に異なることを記載している。Ｚｒ２　ｍＲＮＡは７１ ３個のアミノ酸を表す８０２１３ダルトンのポリペプチドをコード化する２１３ ９個のヌクレオチドの単一のオーブン読み取りフレームを有すると報告されてい るＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ及び　Ｄｅａｎ（Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、１３１：２０７− ２１４　（１９８９））及びＫ１ｎ１ｏｃｈ、　Ｒ，Ａ、他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８５：６４０９−６４１３　（１９８８））はマウスＺｒ３ノクローニ ングを報告している。このマウスＺｒ３遺伝子は８．６ｋｂｐの転写単位に８個 のエクソンと７個のイントロンを含んでいると報告されている。

Ｋ１ｎ１ｏｃｈ外（Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、　１４２：４１４−４２１　（１９９０ ））はプローブとしてマウスのＺｒ３　ＤＮＡを用いてスクリーンしたハムスタ ーの染色体ＤＮＡライブラリーからハムスターの染色体ＺＰ３　ＤＮＡをクロー ニングすることを報告している。ハムスターＺｒ３遺伝子は７９００個のヌクレ オチドの転写単位を有し、イントロン７個及びエクソン８個を有すると報告して いる。ハムスターのＺＰ３蛋白質はマウスのＺＰ３蛋白質と約８１％相同である 。ハムスターの転写体には１２６６個のヌクレオチドが含まれていたが、これは マウスのＺＰ３　ｍＲＮＡよりも６個少ない。　Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ及びＤ ｅａｎ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：６０ １４−６０１８（１９９０））はプローブとしテマウス（１）　ＺＰ３　ｃＤＮ Ａを使用してヒト染色体ＤＮＡライブラリーからヒト染色体ＺＰ３をクローニン グしている。ヒト　ＺＰ３遺伝子は１８．３ｋｂｐの転写単位中の８個のエクソ ンから構成される。

これらのエクソンはマウスのＺＰ３の８個のエクソンとほとんど同じ寸法を有し またコーディング領域のヌクレオチド配列の７４％が相同である。ヒト　ＺＰ３ 転写体はマウスのＺＰ３　ｍＲＮＡに非常に似ている。両者ともに５°及び３゛ 非翻訳領域を有し、また４２４個のアミノ酸蛋白質をコード化する１２７２個の ヌクレオチドの単一オーブン読み取りフレームを有する。

Ｄｕｎｂａｒの米国特許第４９９６２９７号は、スクリーニングプローブとして アンチＺＰＩ及びアンチＺＰ２抗体を使用してウサギのＺＰＩ及びＺＰ２蛋白質 をコード化する３種のウサギ透明帯クローンを単離することを報告している。同 特許の第４図にＰｉ及びＰ２と記載されている配列がウサギの８１２個及び１７ ０５個のヌクレオチドをそれぞれ含むウサギＺＰ　ｃＤＮＡｓを表している。

Ｓｃｈｗｏｅｂｅｌ外（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ：ｈｅｍ、　２６６：７２１４− ７２１９　（１９９１）は、交差種親和性の精製抗血清を使用して５５−ｋＤの ウサギ透明帯をコードする全体のｃＤＮＡ　（ｒ　ｃ　５５で指定される）を単 離しかつ特徴付けた。このｃＤＮＡによりコード化される蛋白質はＬｉａｎｇに より記述されたマウスのＺＰ２蛋白質にある程度類似している。しかし、ｒｃ　 ５５とマウスのＺＰ２蛋白質を比較すると、相同性がないことが分かった・ クローン化したＺＰ　ＤＮＡとそれらのコード化した蛋白質の基本的な作用は充 分に解明されていないし、またその免疫避妊剤としての使用の可能性も示されて いない。

妊娠を抑制するために使用する有用な透明帯製品、特にワクチン形式の製品を開 発するためには、対象動物種からの透明帯蛋白質を生成単離しそして特性を決定 することが高度に望まれる。ワクチン製造に必要なこうした蛋白質の純度、高い コスト及び精製に関連して生じる多くの問題のために、特定の対象種の透明帯蛋 白質のＤＮＡとアミノ酸配列を決定することが非常に望ましい、これらの単離さ れ特徴付けられた透明帯蛋白質が入手できれば、各透明帯蛋白質の作用は理解で き、また妊娠抑制製品は特定の透明帯蛋白質の特定の作用特性に基づいて特定の 哺乳動物種のために設計することができる。

一時的または永久的不妊の再現性の良い特定の効果を有する妊娠抑制製品の開発 を可能にするような単離され、精製され、配列決定され、かつ特徴付けられた組 み替λ透明帯で組み替え透明帯を提供することは極めて有用でありまた望ましい 、このような製品は一時的な不妊な発現させるために使用する場合には、不妊を 持続させるために投与すべき免疫避妊剤の投与回数を減じるには持続的効果を有 することが好ましい。

発明の概要 本発明は、ヒトも含めて哺乳動物に反復可能な一時的なまたは永久的不妊効果を 発現させる新規な物質を提供する。この物質は相同な及び／又は非相同な哺乳動 物種のＺＰ蛋白質、又は以下にＺＰＡ　、　ＺＰＳ及びＺＰＣと呼ぶその免疫避 妊活性を有する断片を選択的に投与することにより効果を生じる。ここに「反復 可能」とは従来のＺＰ蛋白質（かかる蛋白質の混合物）の投与により一時的な不 妊を発現させる試みとは違い、本発明では一時的な不妊状態の期間が調整可能で 、しかも調整自在な及び／又は予見可能な態様で切替（妊娠可能状態と不妊状態 ）できる形態のＺＰＡ及び／又はＺＰＢを投与することにより、一時的な不妊効 果を生じることを意味する。これは主として高純度のＺＰＡ及び／又はＺＰＢ蛋 白質、又はその免疫活性断片例えば組替え体からなり、従ってｚＰＣの実質的に 存在しないものを投与することにより達成される。また免疫避妊活性断片とは、 不妊を発現することができるＺＰ断片を意味する。

哺乳動物（ヒトを除く）に反復可能な一時的な不妊状態を誘起させる本発明の方 法は、雌の哺乳動物に、そのＺＰＡ　、　ＺＰＢ蛋白質及びそれらの組替え体よ りなる群より選択した透明帯蛋白質（又はその断片）を、当該哺乳動物中に当該 哺乳動物のＺＰＡ　、　ＺＰＢ蛋白質を認識する抗体の産生を刺激するのに有効 な量で投与することよりなる。この方法に使用する哺乳動物の好ましいＺＰＡ及 びＺＰＢは対象晴乳物と同一種の哺乳動物から誘導したものであることが好まし いが、相同でない哺乳動物種の蛋白質の使用も可能である０組替え法で製造した 蛋白質の使用が最も好ましいことが予想される。

哺乳動物（ヒトを除く）に反復可能な永久的不妊状態を誘起させる本発明の方法 は、対象晴乳物の雌に実質的にＺＰＡ及び／又はＺＰＢが存在しない形態の組替 えＺＰｃ蛋白質（又はその断片）を、当該哺乳動物中に当該哺乳動物のＺＰＣ蛋 白質を認識する抗体の産生を刺激するのに有効な量で投与することよりなる。一 時的不妊状態の誘起の場合と同様に、種ｚＰＣが好ましいが、必須ではなく、こ の蛋白質は天然の供給源から又は組替え法により生成することができる。変性し たｚＰＣ蛋白質には、バルミチル化及びキトサン変性蛋白質も含まれるが、本発 明はそれに限らない。

一時的不妊状態を誘起する方法な獣動物に応用するために現在好ましいＺＰＡ、 　ＺＰＢ、及び　ＺＰＣ蛋白質にはブタ科、ウサギ科、イヌ科、ネコ科、ウシが 、及びジノモルゲスサルのＺＰ蛋白質がある。

本発明はまた、一時的に哺乳動物の雌（ヒトを含む）に反復可能な不妊状態を誘 起するのに使用する薬剤組成物（避妊剤）を提供するもので、この薬剤組成物は 哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ　（実質的にＺＰＣを含まない）よりなる群より選 択された透明帯蛋白質（又はその断片）の有効量を、薬学的に許容し得る一種以 上の担体、稀釈剤、及び助剤と組み合わせてなる。変性ＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質 （例えばパルミチル化した又はチトサン変性蛋白質）も本発明に使用できる。

本発明は更に、新規な、精製され且つ単離されたＤＮＡ配列を提供する。この配 列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５，１，３，５に記載されているＤＮＡ配列により例示 されるＺＰＡ、　ＺＰＢ、　ＺＰＣをコードする。また本発明により次のものを コードする精製単離されたＤＮＡ配列が提供される。ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７に 記載されているＤＮＡ配列により例示されるようなウサギＺＰＣ、ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯＳ、　９及び１１に記載されているＤＮＡ配列により例示されるようなイ ヌＺＰＡ及びＺＰＣ，５ＥＱＩＤ　ＮＯ３，１３，１５，１７に記載されている ＤＮＡ配列により例示されるようなネ：Ｉ　ＺＰＡ、ＺＰＢ、及びＺＰＣ、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ３，１９，２１，２３に記載されているＤＮＡ配列により例示さ れるようなウシＺＰＡ、ＺＰＢ、ＺＰＣ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　４２．４０に 記載されているＤＮＡ配列により例示されるようなヒト　ＺＰＡ、　ＺＰＢ、ラ ムダファージクローンＡｌ及びＡ４のヒトＤＮＡ挿入体、及びラムダファージク ローン１−１及び４−９　（ＺＰＢ）のヒトＤＮＡ挿入体。

本発明のポリヌクレオチド配列は組替え法によるＺＰＡ。

ＺＰＢ及びｚＰＣ蛋白質の製造に有用であり、また交雑により対応する透明帯蛋 白質をコードする異種ポリヌクレオチドの単離を行うプローブとして有用である 。

本発明は更に、ｚＰ蛋白質（またはその免疫学的に有意な断片）の発現を許容す るように本発明のポリヌクレオチドで安定に形質転換された宿主細胞（特に単細 胞真核または原核細胞）を提供する。

適当な培養媒体中で成長させる時、ｚＰ生成物を発現する宿主細胞は特に大量生 産において有用であり、所望のポリペプチド生成物は細胞またはそれが成長する 培地からグリコジル化または非グリコジル化形態で単離される本発明で提供され る組み替えポリペプチドはグリコジル化及び非グリコジル化形態、変種を含めて ＺＰＡ、　ＺＰＢ及びｚＰＣ及びかかる透明帯蛋白質のすべての均等物、及び免 疫学的に活性なそれらの断片であって実質的に生理学的な活性を有するもの、す なわち、ここで議論する少な（とも透明帯蛋白質の生理学的な活性の少なくとも 一つ（例えば、哺乳動物に投与した時にここに議論している抗体の生成を刺激す る能力）を有するものを含む。

かかる免疫学的に活性な断片は晴乳動物に投与した時に本発明にしたがって抗体 の生成を刺激するのに有効な少なくとも一個のエピトープ（抗原決定基）を含む ものと定義できる。　本発明は更に興味のある哺乳動物種に由来するｃＤＮＡま たはＤＮＡライブラリーに対する非相同ＺＰＡ、　ＺＰＢ及び／またはｚｐｃプ ローブの厳しい（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下に交雑を行うことにより他の晴乳 動物のＺ’ＰＡ、ＺＰＢ及びＺＰＣ蛋白質をコードする核酸配列の単離を行う方 法を提供する。

より具体的には本発明は非相同種からのＺＰＡ及び／またはＺＰＢプローブをコ ードする配列の厳しい条件下に交雑を行うことによりヒト　ＺＰＡ及び／または ＺＰＢ蛋白質をコードする核酸配列の単離を行う方法を提供する。

本発明の他の特徴及び作用効果は以下の実施例の説明により明らかになろう。

図面の簡単な説明 図１はプラスミドベクトルｐＺ９ｏの図式図である。

図２はプラスミドベクトルｐＺ９８の図式図である。

図３はプラスミドベクトルｐＺ１５Ｂの図式図である。

図４はヒトＺＰＢをコードするＥｃｏ　ＲＩ断片の配列を示す図である。

図５はプラスミドベクトルｐＺ１６９の図式図である。

図６はプラスミドベクトルｐＺ１４５の図式図である。

発明の詳細な説明 本発明は主に次の３つの群ＺＰＡ、　ＺＰＢ、　ＺＰＣにより特徴づけられる晴 乳動物の透明帯（ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄ　）に関する。これらの群は各種 の晴乳動物の卵巣ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング（ふるい分け）及び３ つの明確な群（ここでは　ＺＰＡ、ＺＰＢ及びＺＰＣと呼ぶ）の充分な相同性を 示す蛋白質をコードするクローンの回収により得ることができる。

動物種間のＺＰＡ、　ＺＰＢ及びｚｐｃをコードするＤＮＡ配列の間には類似性 があるが、個々の種のＺＰＡ、　ＺＰＢ及び２ＰＣの間にはごくわずかの相同性 しかない。

各種のは乳動物種ｚＰに対する透明帯蛋白質Ａ、　Ｂ、　ＣをコードするＤＮＡ 配列とそれらから推定されるアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３，１−２４に 提示されている。特定の動物のＤＮＡ配列は対立形質の変動現象により若干変動 することがある。動物間のＤＮＡ配列のわずかな違いによりあるが、本発明はこ のような変動も含む。

上記の透明帯ＤＮＡ配列は特定の透明帯抗体又は既知の透明帯ＤＮＡブロ一部に よりスクリーンされた卵巣ｃＤＮＡライブラリーから得られた。単離された配列 を既知の蛋白質またはＤＮＡ配列及び他のクローンに対比して上記のようにクロ ーンを分類及び同定した。

ここに「透明帯蛋白質」とはＺＰＡ、　ＺＰＢ、　ＺＰＣの全長の蛋白質のみな らず、それらの変異体及びそれらに含まれている免疫学的に活性な断片またはポ リペプチドをも意味する。

ここに「透明帯ＤＮＡＪとは透明帯蛋白質またそれらの断片をコードする核酸配 列を意味する。

晴乳動物の透明帯蛋白質の３つの主要群は各種の晴乳動物種のＺＰ蛋白質をコー ドするＤＮＡの中にある相同性を基準にして決定された。ＺＰＡは前記の文献に ＺＰＩ、　ＺＰ２．　ＺＰ４として記載されているペプチドを含み、またＺＰＢ はＺＰ３０１及びｒｃ　５５として記載されているベブチドを含み、更にＺＰＣ はＺＰ３０及びＺＰ３として記載されているペプチドを含む、。

各種の透明帯蛋白質であって各編（ｃｌａｓｓｌ内の共通配列と比較した相同性 は表１に示す、共通配列はＭｉｃｒｏｇｅｎｉｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌ ｙｓｉｓ　Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｉｎｃ、５ｐｉｎｃｏＤｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）と題 するプログラムを使用して決定した。共通配列内に含まれるべき残基に対する所 定位置に同一の残基な持たなければならないような整列した配列の最小割合は５ ０％であった。

ＺＰＡ、　ＺＰＢ及びＺＰＣ蛋白質に対するアミノ酸の共通配列に対応したＤＮ Ａ配列はそれぞれＳＥＱ　１０　ＮＯ３２５、２６及び２７に記載されてる。

表１ ＺＰ蛋白質アミノ酸の相同性 ＺＰＡ　ＺＰＢ　ＺＰＣ イヌ　７８．９％　７７．３％ ネコ　７８．４％　７０．９％　７７．５％ウシ　７７．２％　８０．４％　７ ７．２％ブタ　７３．０％　７７．８％　７９．０％ウサギ　７０．１％　７４ ．６％　７１．３％マウス　６１．６％　６９．６％ ヒト　７６．９％ ハムスタ　−　７０．５％ 透明帯蛋白質の決定された各種の種のアミノ酸配列はＺＰＡ、　ＺＰＢ及びｚＰ Ｃ蛋白質に対してグリコジル化しない分子量がそれぞれほぼ７５　ｋＤ、　５５ 　ｋＤ、及び４５　ｋＤであることを示唆する０両ＤＮＡ相同性のより詳細な分 析は実施例１３．１４．１５に示しである。

特定の透明帯蛋白質の特定の綱を宿主動物に投与する　・と意外なことに特異的 な免疫避妊効果が得られること、及び投与のために適当なＺＰ蛋白質を選択する と所望の一時的不妊または永久的不妊に関して所望の免疫避妊結果を誘発するこ とが分かった。例えば、動物に透明帯蛋白質Ｃのワクチン投与を行うとその動物 に内生的なＺＰｃ抗体の濃度増加を誘起して動物の卵巣から卵細胞の喪失を生じ させ、それにより永久的な不妊を生じさせる。これに対して、透明帯蛋白質Ａ、 Ｂまたはそれらの混合物で動物をワクチン処理すると、ＺＰｃは認識しないがＺ ＰＡ及び／又はＺＰＢは認識する抗体の濃度増加が生じる。

これは、アンチＺＰＡ及び／又はアンチＺＰＢ抗体の濃度が高い間だけ動物を不 妊化するというサイクルを生じる。

このような抗体の濃度が減少すると、不妊効果は消失し、動物は妊娠能力を回復 する。生成し単離し特性化したＺＰＡ、　ＺＰＢ、又はｚＰＣ蛋白質は、もしも 自己免疫応答（発生した自己免疫抗体が、免疫された動物自身に特異の透明帯蛋 白質を特異的に認識する）が誘起されたならば、免疫された動物に対して特異的 な作用を及ぼす。本発明に従って誘起される抗体に対する自己認識は相同種の透 明帯蛋白質上に存在する少なくとも１つのエピトープを認識する血清抗体の能力 により定義されまた特徴付けられる。

本発明の好ましい方法においては、動物は組み替え２ＰＡ、　ＺＰＢ、またはＺ ＰＣまたはそれらの断片で免疫される。

組替え蛋白質またはペプチドは相同種でも良いし、あるいは共通の抗原決定基を 有するものから誘導される非相同種の透明帯であっても良い。ただし、このよう な共通の抗原決定基は所望の自己免疫応答を誘起する作用があるものとする。

組み替え蛋白質又はペプチド断片はＫｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン （ＫＬＨ）及びＭｕｒａｍｙｌジペプチド　（ＭＤＰ）のような免疫増強剤に化 学的に共役結合しても良いし、あるいは例えばアミノ及び／またはカルボキシ末 端で異種蛋白質等で融合蛋白質の形にしても良い。本発明の蛋白質断片の投与に より抗体の産生を刺激する方法は周知の従来法による。同様に例えばアンチＺＰ Ａ、アンチＺＰＢ、アンチｚＰＣ抗体あるいはそれらの断片を本発明の透明帯蛋 白質または断片に投与することを含む受動免疫法も周知な方法による。詳細はＤ ｅａｎ、　ＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／１５６２４に記載されているのでそちらを 参照されたい。

従って、イヌに対して永久的不妊を誘起するには、活性なイヌ　ｚＰＣ蛋白質が 保存されていて抗原提示細胞に対して相互作用することができるような細菌融合 蛋白質（または免疫増強剤と複合したもの）として発現される組替えイヌ　ＺＰ Ｃが使用できる０発現された蛋白質は次に宿主イヌに投与されて自己免疫反応を 誘起し、生成した抗体がイヌの透明帯蛋白質Ｃを認識する。イヌのｚＰｃ蛋白質 またはその集合体を特異的に認識するこの自己免疫作用はワクチン処理されたイ ヌに永久的不妊を誘導する。

このような不妊はイヌの卵巣から卵母細胞が喪失することと関連している。

別法として、イヌＺＰＣと交差反応を行う組替えブタｚＰＣのような非相同種Ｚ ＰＣをイヌに投与して同様な不妊化効果を得ても良い。しかし、不妊化効果は宿 主自身の生得の透明帯を認識できる抗体が誘導される場合（または受動免疫にお いて投与される場合）にのみ得られる。

本発明の他の例では、宿主種自身のＡ及び／または８群の透明帯蛋白質、または 宿主のＺＰＡ及び／またはＺＰＢＰｃ蛋白質する抗体を誘導する他の種からの関 連したＡ及び／またはＢ蛋白質を投与すると、２２０群の抗原から生じた不妊効 果とは異なった不妊効果が生じる。ＺＰＡ及び／またはＺＰＢＰｃ蛋白質るワク チン処理の生理学的効果は一時的である。ここに「一時的不妊性」とは自己透明 帯蛋白質に対する抗体が宿主動物の循環系に避妊有効濃度（例えばイヌにおいて は約１　：　２５０の濃度）で維持されている時に持続し、この抗体が避妊有効 濃度下限よりも低い濃度に落ちた時に不妊性が消失するような不妊性であると定 義される。自己透明帯に対する抗体が減少すると、卵巣に目立った生理学的な変 化を生じることな（妊娠能力を回復する。典型的には、抗体濃度の減少は哺乳動 物宿主の自然の経過により生じるが、抗体濃度を減少させる他の方法を使用して も良い。

不妊性を持続させるのに必要な自己透明帯蛋白質Ａ、Ｂに対する抗体の避妊有効 量はワクチン処理すべき動物の種のみならず、投与される組替えＺＰＡまたはＺ ＰＢペプチドの種にも依存するが、これらは例えば一群の所望動物種を種々の量 の特定抗原で処理し、次いでアンチ自己抗体の誘導された濃度を公知のＥＬＩＳ Ａ技術により測定し、得られた濃度を再現指示剤、例えばホルモン量等により検 量することにより容易に決定できる。一般に１：２５０以上の抗体濃度は避妊有 効量である。

アミノ酸配列相同体に基づくと、特定群のすべての透明帯蛋白質は哺乳動物種の 間で交差反応する機能的な抗原決定基を含むことが期待される。しかし、かかる 機能的な交差反応性抗原決定基の特性化及び同定がなければ、好ましい選択的な 避妊剤は相同透明帯蛋白質またはそれに対する抗体である。

本発明は次の実施例により更に完全に理解されるであろう。この場合に、実施例 １はブタＺＰＡ、　ＺＰＢ及びＺＰＣをコードするＤＮＡの単離に関しており、 実施例２はウサギＺＰＣの単離に関しており、実施例３はイヌＺＰＡ及びＺＰＢ をコードするＤＮＡの単離に関しており、実施例４はネコＺＰＡ、　ＺＰＢ及び ｚＰＣをコードするＤＮＡの単離に関しており、実施例６〜７はイヌを天然のブ タ透明帯蛋白質で免疫避妊処理することに関しており、実施例８は実施例６〜７ において処理した動物に対する血清化学的な検討に関しており、実施例９〜１０ はイヌＺＰｃ融合蛋白質の組替え体の製造とそのイヌに対する免疫避妊に関して おり、実施例１１はヒトＺＰＡ及びＺＰＢをコードするＤＮＡの単離に関してお り、実施例１２はジノモルゲスサルＺＰＡ、　ＺＰＢ及びＺＰＣをコードするＤ ＮＡの単離と配列決定に関しており、実施例１３〜１５は晴乳動物ノＺＰＡ、　 ＺＰＢ及びｚｐｃのＤＮＡとそれらの推定したアミノ酸配列の比較に関連してお り、実施例１６はジノモルゲスサルをＨ３ＰＺ及びその分画であるＨ２ＰＣを使 用した免疫処理に関しており、実施例１７は哺乳動物の透明帯蛋白質の抗原決定 基のマツピングに関しており、実施例１９はウシとネコを組替えｚＰ蛋白質によ りワクチン処理することに関している。

実施例１ ブタ透明帯蛋白質ＺＰＡ、　ＺＰＢ　及びＺＰＣをコードするＤＮＡ配列の単離 １４週の年齢のブタから分離した卵巣から、λｇｌｌ中のＤＮＡライブラリーな Ｃ１ｏｎｅ　Ｔｅｃｈ　（米国Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）により調製し、次 いでＥ、Ｃ，Ｙｕｒｅｗｉｃｚから得たアンチＺＰ３０抗体を使用してにｅｅｎ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、。

４４：１５０−１５６　（１９９１）の方法によりスクリーン（分離）した。８ 種の候補クローンを同定した。

Ｙｕｒｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２：５ ６４−５７１．　（１９８７）に記載されたＮ末端ブタＺＰ３０の短い部分のす べての可能な配列を表すように同義（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）　ＤＮＡオリゴヌ クレオチドプローブ（１９ｂｐｓ）を構成した。同義プローブ配列はＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ。２８に記載されている。　同義ＤＮＡオリゴペプチドプローブによる 発現スクリーンにより単離された８種の候補クローンの５ｏｕｔ１１ｅｒｎ分析 により、８種の候補のうち２つに交雑が生じた。同義プローブにより認識した２ つのクローンは次にｐＢＳ　ＫＳ−プラスミド（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にサブクローン化し て５ＥＱＵＥＮＡＳＥ　Ｍａｎｕａｌ（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｃａ１． 米国Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）に記載されている配列酵素及びプロトコール を使用して配列分析を行った。１つのクローンＢ−８は約１２００塩基対の装入 寸法を有し、これには以前にＲｉｎｇｕｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌｌ、Ｄｅｖ、　Ｂ ｉｏｌ、、　１２７：２８７−２９５．　（１９８８）、によって同定されたマ ウスＺＰ３のＮ末端配列に相同の配列を含んでいた。残りのクローンＢ−６は約 １０００塩基対の挿入寸法を有していた。この領域のマウスＺＰ３遺伝子に対す る相同性の欠如から示唆されるように、交雑クローンは遺伝子のＣ末端を含んで いなかった。

年齢１４週のブタの卵巣ライブラリを次にＤＮＡ交雑法により再スクリーンした 。約１５０，０００　ＰＦＵをＥ、　ｃｏｌｉＹ１０９０とともに寒天プレート に延ばした。３７℃で一夜インキユベートしたのち、プラークのナイロン膜（フ ィルタ）リフトを作製し、次いでＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　２８に記載の同義ＤＮ Ａオリゴペプチドプローブによる発現スクリーンにより単離されたＢ６及びＢ８ クローンによるスクリーンで単離を行った。

フィルタをあらかじめ５ｘ塩水、りん酸ソーダ、ＥＤＴＡ緩衝液　（ＳＳＰＥ） 　、　５ＸをＤｅｎｈａｒｄｔ試薬、１００毎ｕｇ／ｍ１のサケ精液ＤＮＡ　、 ３０％のホルムアミド、及び０．５％のＳＯ３を含む溶液中で、４２℃で３時間 予備交雑した。約５０ｍ１のこの予備交雑溶液を１２個のフィルタ（１３２ｍｍ ）に使用した。予備交雑の後に、３０％のホルムアミドと５Ｘの５ＳＰＥ中の新 規な放射線標識下ＤＮＡプローブ１０ｎｇを添加した。プローブは９５℃で３〜 ５分間熱変性し、ＤＮＡプローブによる交雑を４２℃で一夜継続した。交雑処理 したフィルタをｌｏｏｍｌの５Ｘ　５ＳＰＥで５５℃にて約１時間図津２回洗浄 した。フィルタを次に２５０ｍ１の５Ｘ　５ＳＰＥで室温にて洗浄し、空気乾燥 した。乾燥したフィルタは増感スクリーンを使用してＸ線フィルムに一７０℃で 少なくとも８時間露出し、そしてフィルムは可視分析のために現像した。

分離された他のクローン中にはブタＺＰ３β遺伝子のＣ末端部分を含む２つのク ローンが含まれた。一方のクローンん５−１はプラスミドｐｕｓ　ＫＳ中にサブ クローンとして組み込まれ、スクリーンされた。このプラスミドはｐＺ５７と呼 ばれ、１２６６個の塩基対を有するＺＰ　ＤＮＡ挿入体を含んでおり、既知のマ ウスＺＰ３に比較すると、ブタＺＰ３βのアミノ酸配列の全長をコードしている ように思われる。Ｙｕｒｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｗ、、　２６２：５６４−５７１　（１９８７）により報告されたＺＰ３βの既 知のＮ末端アミノ酸配列に対してこのクローンの推定されたアミノ酸配列を整列 させ、またＥ、Ｃ，Ｙｕｒｅｗｉｃｚにより提供されたアミノ酸２５５−２７４ に対応するＺｒ３λの内部ペプチド配列に対比して、ブタＺＰ３βをコードする このクローンを同定した。

ブタｚＰＣと称するこのクローンのＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤＮ００５に記述さ れており、またその推定されたアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　６に記述 されている。

上記の１４週のブタ卵巣ｃＤＮＡライブラリーをウサギ透明帯ｒｃ　５５　ｃＤ ＮＡ　（Ｓｃｈｗｏｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　 ２６６：７２１４−７２１９．　（１９９１））をプローブとしてスクリーンし た。

約１７００塩基対よりなる１つの候補クローンλ２−１を単離して配列決定プラ スミドｐＢＳ　ＫＳに組み込んだ。

ブタＤＮＡ挿入体のＤＮＡ配列及び推定されたアミノ酸配列を上記の５ＥＱＵＥ ＮＡＳＥ　ｍａｎｕａｌ　（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ）の方法により決定した。配列決定した クローンは１６２０個の塩基対とブタＺＰ３αの全長コピーを含んでいた。これ は推定されたアミノ酸配列をＥ、Ｃ，Ｙｕｒｅｗｉｃｚにより提供された既知の ブタＺＰ３αとアミノ酸２０６−１ｌｌ、　２７１−２７９．及び３２８−３４ ４の間で比較することにより決定された。このクローン緒ＤＮＡ配列はブタＺＰ Ｂと呼ばれ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３に記述され、またアミノ酸配列はＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ、　４に記述されている。

上記の１４週のブタ卵巣ライブラリーを上記の方法によりイヌＺＰＡ蛋白質（実 施例３により得たものでＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　９　）をコードするＤＮＡプロ ーブを使用して更にスクリーンした。はぼ１３３塩基対を有する単一クローンλ ３−５が得られた。このものはＬｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

ＭｏＬ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０：　１５０７−１５１５　（１９９０） によりマウス、Ｄｕｎｂａｒ、米国特許第４，９９６，２９７号によりウサギ、 及びイヌ（実施例３参照）がら単離されたＺｒ２に関連付けて決定したクローン の寸法から評価して理論的なブタＺＰＡのＮ末端の６０％を代表している。

このクローンを使用してブタの卵巣ライブラリーを再スクリーンした。３種の他 のクローンが得られ、２つの小クローン及び全配列を含むに充分な大きさの１つ のクローンよりなっていた。大きい方のクローンλＢは約２２００塩基対を有す るものとして配列決定され、データによるとこのクローンはマウスＺＰ２遺伝子 及び実施例３に記載のイヌＺＰＡ遺伝子に整列さた場合にＡＴＧ開始コドンを含 むわずかに数個の塩基対を欠く以外は完全な長さの配列有した。ブタＺＰＡと呼 ぶこのクローンのＤＮＡ配列はＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　１に、また導出されたア ミノ酸配列はＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　２に記述されている。

この単離されたブタクローンは刊行物に記載の３種の透明帯蛋白質ＺＰＩ　（８ ０ｋＤ）、　Ｚｒ２　（６２ｋＤ）　（Ｄｕｎｂａｒ　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ 　Ｎｏ、　４，９９６，２９７　）、ＺＰＡ　（２１ｋＤ）（Ｈａｓｅｇａｗａ 　ｅｔａｌ、、Ａｂｓｔ、Ｎｏ、３８２．　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ｓａｃ、　５ｔｕ ｄｙＲｅｐｒ。

ｄ、Ｊｕｌｙ、　１９９１）に対応した配列を有する。これらの結果は単一クロ ーンが以前には３種の蛋白質すなわちＺＰＩ、　Ｚｒ２及びＺＰＡとして存在す ると考えられていた単一の透明帯蛋白質をコードすることを示している。これは 更に３個の主要ブタ透明帯遺伝子のみがＺＰＡ、　ＺＰＢ及びｚＰＣと呼ばれる ３種の主要な透明帯蛋白質をコードすることを示している。ＺＰＡはＺＰＩ、　 Ｚｒ２．及びＺＰＡと従来呼ばれた蛋白質を含み、ＺＰＢはＺｒ３αに対応し、 ｚＰＣは以前にＺｒ３　β　（Ｙｕｒｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍｉ、、　２６２　二５６４−５７１．　（１９８７）　）と呼ば れていたのもに対応する。

実施例２ ウサギｚＰＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の単離及び精製年齢５週のウサギか らＦａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ分離キット（商品名）を使用し且つＦａｓｔ 丁ｒａｃｋ指示マニュアル第３版カタログＮｏ、　Ｋ１５９３−０２　（米国Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡ）に従って卵巣を分離したｅ　Ｌａｍｂｄａ　Ｌｉｂｒａｒｉａｎキット（ 米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を使用してｃＤＮ Ａを調製し、それらをλｇ　ｔｌＯにクローン化した。約１５０，０００　ＰＦ ＵをＥ、　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０と共に寒天プレート上に延ばした。３７℃で一 夜インキユベートしたのち、プラークのナイロン膜（フィルタ）リフトを作製し 、次い実施例１で述べたスクリーニング法を使用してブタＺＰＣＤＮＡプローブ によりスクリーニングを行い分離した。使用したプローブはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、　５に記述されたブタＺＰＣ配列を有していた。

２つの正クローンλＸＲ４及び、ｔＲ５はブタＺＰＣＤＮＡと交雑した。各クロ ーンの寸法とアガロースゲルで評価して約１３００塩基対であった。λＸＲ及び λＲ５の配列を実施例１の方法で決定した０両開列はλＲ５が５°末端に４個の 追加のヌクレオチドを含んでいる他は同一であった。

配列決定したＤＮＡ配列はブタＺＰＣをコードするＤＮＡ配列に対して約７０％ が相同であった。

ウサギｚｐｃ蛋白質をコードするＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

、７に記述され、またその導出されたアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏに記述 されている。

ウサギＺＰＡ及およびＺＰＢ蛋白質はすでにＤｕｎｂａｒ米国特許第４，９９６ ，２９７号にそれぞれＰ２及びＰ３として同定されている。

実施例３ イヌＺＰＡ及びＺＰＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の単離及び精製 年齢１６週のイヌ卵巣ｃＤＮ＾を発現するλｇｔｌ　１中のライブラリーをＣ１ ｏｎｅ　Ｔｅｃｈ（米国Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）により実施例１の方法によ り調製した。イヌ卵巣ｃＤＮＡを発現するんｇｔｌ　ｌ中のライブラリーを、熱 安定化したイヌ透明帯に対して成育した抗体を使用してスクリーンした。

ここに熱安定化したイヌ透明帯（Ｈ２Ｏ２）はｎ　Ｄｕｎｂａｒ　ｅｔａｌ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９：３５６−３６５．（１９８０）に記載された 手順により調製した。ただし卵巣を細分するのに一組に揃えたかみそり刃を使用 した。

ウサギを２５０μｇのＨＳＤＺと２５０μｇのＭＤＰで免疫した。追加投与を約 ２週間隔で行った。得られたウサギ血清を使用してイヌの卵巣ｃＤＮＡ表現ライ ブラリをスクリーンした。６種の候補クローンを得た０次ぎのようにして５ｏｕ ｔｈｅｒｎプロット分析により交差交雑実験を行った。最大の約１３００塩基対 を有するクローンであるん２６−１をまず５ｏｕｔｈｅｒｎプロツト中で他のす べてのクローンに対してプローブとして使用した。他の３種のクローンが同定さ れた。残りの最大のクローンλ２０−１及びん７−１　（それぞれ約８００塩基 対と１０００塩基対を有する）を次に５ｏｕｔｈｅｒｎプロツト中でプローブと して使用した。これらのプローブには他のクローンはなかった。これらの７種の 候補クローンを互いに交雑分析してこれらのうち４種が互いに関連付けられた０ 例えば４種のクローンは交雑してん２６−１とされ、残りの３種のクローンはλ ｚｏ−ｉ、λ７−１及びえ１９独立であった。

４種の関連づけたクローンの最大のものλ２６−１は実施例１に記載した方法で 配列分析するためにプラスミドｐｓＳ　ＫＳにサブクローンされた。分析した配 列は約４２６個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする１２７８塩基対よりなる 長いオーブン読み出しフレームの存在を示した。このクローンの推定されたアミ ノ酸配列を既知の透明帯蛋白質の配列と比較して、このクローンがＲｉｎｇｕｅ ｔｔｅｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２７：２８７−２９５　（１ ９８８）に報告されたマウスＺＰ３（ＺＰＣ）　、　Ｋ１ｎ１ｏｃｈ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、、　１４２：４１４−４２１　（１９９０）に報 告されたハムスターＺＰ３　、Ｃｈａａ＋ｂｅｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：６０１４−６０１８　（１９ ９０）に報告されたヒト　ＺＰ３、及び実施例１のブタＺＰＣに関連した蛋白質 をコードしていることが分かった。

このクローンのＤＮＡ配列はイヌｚＰｃと名づけられＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１ １に、またそのアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１２に記述されている。

残りの３種の独立した候補クローンは上記のようにして配列分析するためにプラ スミドｐＢＳ　ＫＳにサブクローンされた。決定された８００塩基対からなるク ローンえ２゜−１を計算機を使用して上述のようにして既知のＺＰ配列と比較し たところＬｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１ ０：１５０７−１５１５　（１９９０））に報告されたマウスＺＰ２　（ＺＰＡ ）及び実施例１のブタＺＰＡに関連していることが分かった。

λ２０−１からの８００塩基対断片を交雑プローブとして使用してイヌ　ｃＤＮ Ａライブラリを再スクリーンするのに使用した。２種の追加のクローンを同定し た。そのうち大きい方はλ７Ａで、約２８００塩基対を有しており、これをｐＢ ｓ　ＫＳプラスミドにサブクローンして配列分析を行った。この配列を透明帯蛋 白質をコードする既知の配列と比較することにより、この候補え７ＡがＺＰＡ前 長の配列を有すること、しかし実施例１において言及した既知のマウスＺＰ２及 びウサギＺＰＡ配列と整列させることにより決定した時、例えば追加の６００塩 基対を含む不正確なＮ末端配列を有することが示唆された。約１００塩基対を有 する第２の候補クローンλ９−２を次にｐＢＳ　ＫＳプラスミドにサブクローン して配列分析を行った。この配列を透明帯蛋白質をコードする既知の配列と比較 することにより第２クローンの配列は正確なＮ末端の存在を示したが、既知のマ ウスＺＰ２及びウサギＺＰＡ配列と整列させることにより決定した時、クローン 全長のほぼＮ末端４０％を含んでいるだけであった。しかし、２種のｃＤＮＡを 重畳させることにより全長の配列が決定された。

各クローンの適当な量を次のようにしてサブクローンして、はぼ６７６個のアミ ノ酸をコードする２０２８塩基対のオーブン読み取りフレームを含む正確な全長 の透明帯クローンを得た。Ｌ　７　Ａ　ＤＮＡをＥｃｏ　ＲＩで消化して２種の 挿入断片（２０００ｂｐｓ及び８００ｂｐｓ）を生成した。これらの２種の断片 を各々　ｐＢＳ　ＫＳにサブクローンしてそれぞれプラスミドｐＺ３６及びｐＺ ３７を生成した。プラスミドｐＺ３７はこの配列のＣ末端を有していた。λ９− ２　ＤＮＡ挿入体はえベクターから除去され、ついでｐＢＳ　ＫＳにサブクロー ンしてｐＺ３８を生成した。プラスミドｐＺ３６をＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、 λ７Ａ遺伝子（約８５０ｂｐｓの無意味なりＮＡを５００ｂｐｓのコード配列） のＮ末端の約１３５０ｐｂｓを除去した。この消化はまたＥｃｏ　ＲＩ挿入体端 部の一方を除去し、単一のＥｃｏ　ＲＩサイトを残した。ｐＺ３７　Ｅｃｏ　Ｒ Ｉ挿入体を次に変性ｐＺ３６　（ｐＺ３６Δ１）の単一の残留したＥｃｏ　ＲＩ 部位に移動し、λ７Ａ挿人体中に存在する相対的なりＮＡ構造配向を再確立した 　（１４５０／２８００　ｂｐｓ）、この接合したプラスミドを次に）ｆｉｎｄ 　ＩＩＩにより開いてＮ末端ＺＰ　ＤＮＡを有するｐＺ３８からのＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩ断片を挿入してプラスミドｐＺ３９を作製した。このプラスミドはイヌＺＰ Ａ配列の全長を有するｐＢＳ　ＫＳである。このイヌＺＰＡのＤＮＡ配列はＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、　９に記述されており、またその導出されたアミノ酸配列はＳ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　ｔｏに記述されている。

実施例４ ネコ透明帯蛋白質ＺＰＡ、　ＺＰＢ及びｚＰＣをコードするＤＮＡ配列の単離 年齢４〜５力月の５匹のネコから卵巣を分離した。Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲ ＮＡ分離キット　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡ、　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、　Ｋ１５９３−０２）を使用し且つキットに付 属の方法により６つの卵巣からｌｌｌＲＮＡを単離した。　ｃＤＮＡは実施例２ の方法に従いんｇｔｌｏに組込みクローン化した。

約１５０．０００　ＰＦＵをＥ、　ｃｏｌｔ　Ｙ１０９０と共に寒天プレート上 に延ばした。３７℃で一夜インキユベートしたのち、プラークのナイロン膜（フ ィルタ）リフトを作製し、次いでブタＺＰＡ、　ＺＰＢ及びＺＰＣ蛋白質をコー ドするＤＮＡプローブ混合物と実施例２で述べた交雑方法を使用してスクリーニ ングを行い分離した。全体で８１種のポジティブクローンを同定した。このうち １２種をプラーク生成した。ブタ　ＺＰＡ、　ＺＰＢ及びｚＰＣのＤＮＡをプロ ーブとして使用してこれらのクローンの５ｏｕｔｈｅｒｎ分析を行ったところ、 これらのクローンのうち７種はＺＰＣ蛋白質をコードし、また１つはＺＰＡ蛋白 質をコードすることが分かった。またこれらのうち４種はＥｃｏ　ＲＩによる消 化では分離しない挿入体を含んでいた。

ｚｐｃクローンのうち４種は１２００〜１３５０塩基対を有した。約１３５０塩 基対を有する１種のクローンλＧ−１１２をすでに述べた方法でＤＮＡ配列及び 導出されたアミノ酸配列を決定したところ、実施例３で得られたイヌｚＰＣ蛋白 質に対して約７０％相同であることが分かった。このネコＺＰＣクローンの配列 はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，１７にまたその導出されたアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ、１８に記述されている。

単一ネコＺＰＡクローンλＧ−１１６の配列決定したところ、約２２１５塩基対 の長さを有することが分かった。導出されたアミノ酸配列は実施例３で同定した イヌ　ＺＰＡ蛋白質に対して約７５％相同であった。このネコＺＰＡクローンの ＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１３に記述され、またそれから導出される アミノ酸配列はＳＦ、（ｌ　ＩＤ　Ｎｏ、　１４に記述されている。

残りの６９のポジティブクローンはブタＺＰＢのＤＮＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、　３１をプローブとして使用して再スクリーンした。１０種のポジティブクロ ーンが得られた。

最大のクローンλＧ−１はアガロースゲル電気泳動法により１．７に塩基対を有 することが分かった。このクローンの配列と、その導出されたアミノ酸の配列を 決定したところ、実施例１に記載したブタ透明帯蛋白質と約８０％相同であった 。このネコクローンのＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤＮ０．１５に、また導出された アミノ酸配列はＳＥＱ　１０　Ｎｏ、１６に記述されている。

実施例５ ウシ透明帯蛋白質ＺＰＡ、　ＺＰＢ及びＺＰｃをコードするＤＮＡ配列の単離 実施例２に記載した方法により年齢５力月のウシの卵巣からｃＤＮＡのライブラ リを構成した。ウシの卵巣ライブラリを、実施例２に記載したようにして、ＺＰ Ａ　（ＳＥＱ　ＩＤＮ０．　ｌ）　、ＺＰＢ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３）及 びＺＰＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　８０．５）蛋白質をコードするブタＤＮＡの等量混合 物を用いた透明帯蛋白質の各群を代表するＤＮＡ交雑プローブにより、実施例１ に記載した手順に従ってスクリーンした。初期スクリーンで３種の候補クローン が得られた。これらのクローンを初期スクリーニングに使用したブタＺＰＡ、　 ＺＰＢ及びｚｐｃのＤＮＡプローブを使用して５ｏｕｔｈｅｒｎ分析したところ 、約６５０塩基対を有する１つのクローンλＢ２はＺＰＡをコードしていること が分かった。約１０００塩基対を有する第２のクローンλＢ−１はＺＰＢをコー ドしていることが分かった。約１２００塩基対を有する第３のクローンλＢ１４ はｚＰＣをコードしていることが分かった。

ウシの卵巣ライブラリをブタＺＰ　ＤＮＡ混合プローブでスクリーンした。追加 の２種のクローンが得られ、５ｏｕｔｈｅｒｎ分析により　ＺＰＣをコードして いることが分がったＺＰＡ、　ＺＰＢ、及び最大のｚｐｃクローンのＥｃｏ　Ｒ １１種体をサブクローンしそれらのＤＮＡの配列を分析した。これらのウシＺＰ Ａ、　ＺＰＢ及びＺＰＣ断片をコードする配列は５ＥＱＩＤ　ＮＯ３，１９に、 またそれらの導出アミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３，２０，２２及び２４に それぞれ記述されている。

実施例６ 熱可溶化した分画ブタ透明帯によるイヌの免疫処理可溶化したブタ透明帯（Ｈ３ ＰＺ）をＤｕｎｂａｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９：３ ５６−３６５．　（１９８０）に記載された方法に従って調整した。ただしそこ に記載のＺｏｎａｍａｔｉｃ粉砕器の代わりに手動肉挽器を使用した。分離に続 いて透明帯蛋白質をＯ，１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）中で可溶化 し、６Ｍ尿素に対して広範囲に透析した。得られた溶液である約１２μｇのＨ３ ＰＺを含む２〜３ｍｌを次の方法によりＢＩＯＲＡＤ　Ｒｏｔｏｔｏｒ等電位集 束室中で等電位集束処理に欠けた。等電位勾配は３〜ｌＯのｐＩ範囲を有する１ ％両性電解質を使用して形成した。透明帯蛋白質を中間範囲室（ｐＩ７．０）に 入れ、約４℃で約４時間または電圧が安定化するまで集束させた。

２０個の等電位集束処理した部分を集め、ブタ透明帯蛋白質に対してＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥによる分析及びＷｅｓｔｅｒｎプロット分析を行った。約３．５〜５゜５ のｐＩ範囲を有しブタ透明帯蛋白質を含む酸性部分を合併した。これらの部分は Ｏ，ＩＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）に入れて透析し、濃縮して約３ｍｇ／ｍ ｔにした。この抗原調整物は下記のようにして動物のワクチン処理に使用した。

２次元ゲル泳動法によりこの抗原調整物を分析したところ、　ＺＰＡ及びＺＰＨ の存在を示した。しがしＺＰｃは存在しなかった。

このＨ５ＰＺ抗原調整物を１投与あたり２５０μｇのＭＤＰを含有する不完全な Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ） と共に５０１５０水油エマルジヨンに添加した。１ｍｌのこのエマルジョンは０ ．４２５ｍ１のパラフィン油、０．０７５ｍ１のモノオレイン酸マンニド、及び ２５０μｇのトレオニルＭ　Ｄ　Ｐ　（ＳＹＮＴＥＸ　Ｃｏｒｐ。

ｒａｔｉｏｎ製）と表３に記載の量のＨ３ＰＺを含有しする０゜５ｍｌのＰＢＳ を含有していた。

年齢１０〜１２週のランダムに飼育したイヌを表２に記載した初期（ｐｒｉｍｅ ）及び追加（ｂｏｏｓｔ）処方でＨ５ＰＺによるワクチン処理を行った。

表２ １皿ユ１）　」Σ１エユ１） 初期　ｏ　ｏ、ｉ 追加　＃１　４　１．０ 追加　＃２　８　０．２５ 追加　＄３　１２　０．２ 追加　１４　１６　１．０ 追加　８５　３６　１．０ これらの動物により生成された抗血清はＥＬＩＳＡ法にょり監視した。１７週ま でに、自己だとλばイヌ透明帯蛋白質に対する抗体濃度は最大値（ＥＬＩＳＡで ８〜１６ｋ）に達し、その後は減少し始めた。

３６週では１匹の動物は片側の卵巣破壊を生じ、また除去された卵巣を切除して 周期的な駿シッフ染色（ＰＡＳ）を行い組織検査をした。卵巣はすべての発達段 階で卵胞が存在したことから正常であった。５２週では４匹の試験動物のうち２ 匹は発情行動を示した。残りの２匹の動物は第１の２匹の試験動物が第２発情を 経験した約１年半径に発情行動を示した。すべての試験動物は能力のある雄と一 緒に繰り返して飼育し、人工的受精したが妊娠しなかった。この同一の期間中に 自己濃度が得られないような各種の試験食の動物は実施例１Ｏのように雄との交 接または人工受精により妊娠した。

飼育期間に続く２週間例えば５４週では、初期の２匹の動物は片側の卵巣破壊を 起こし、除去された卵巣の組織検査のために切除した。卵巣は機能的不妊が観察 されたにも拘らず卵胞活動期には正常に見えた。

実施例７ ブタ　ＺＰＣによるワクチン処理 Ｅ、　Ｙｕｒｅｗｉｃｚ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２：５６４−５７１ ．（１９８７）に記載の方法で精製したＺＰＣ蛋白質（Ｚｒ２Ｏ）を得た。ワク チンの調製は１６７μｇの精製したブタ透明帯蛋白質（Ｚｒ２Ｏ）を５０１５０ 水−油エマルジョンに、初期投与に対しては完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバント （Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、　Ｆ５８８１、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）と共に、ま たは追加投与に対してはＭＤＰを含有する実施例６に示したように不完全なＦｒ ｅｕｎｄのアジュバント　（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、　Ｆ５５０６．　Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ、　ＮＯ）と共に添加することにより行った。

年齢約１１〜１２週の５匹のランダムに育成したイヌに表３に記載した処方で上 記のｚＰＣワクチン調製物を注射した。

表３ 肌澗ＡＪ！ｉｌ−Ｚ五−１邦） 初期　０　０．１６７ 追加　３　０．１６７ 追加　６　０．１６７ 追加　２８　０．１６７ 各動物の自己透明帯蛋白質、例えばイヌ透明帯蛋白質に対する抗体濃度をＤｕｎ ｂａｒ、　Ｔｗｏ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ ｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｏｏｎｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　 １９８７に記載された方法を使用してＥＬＩＳＡにより監視した。ＥＬＩＳＡマ イクロリッタープレートに抗原被覆用緩衝液Ｈ３ＤＺ（０，１Ｍの炭酸ナトリウ ム、ｐＨ９，６）を塗布した。ビオチニル化したウサギ−アンチイヌＩｇＧを第 ２抗体として使用した。ＡＢＣ試薬（アビジン−ビオチニル化ペルオキド複合体 ）と０−フェニレンジアミンジヒドロクロライドをペルオキシド基質と共に使用 して可視化した。ただ２匹の動物が自己対抗体において４週までに１６にの自己 抗体濃度ピークを達成した。他の３匹の動物は自己抗体濃度を生じなかったが、 ブタ透明帯蛋白質に対して４にのピーク抗体濃度を達成した。２０週から３６週 の間では、すべてのイヌは発情行動と示した。動物は能力が確認された雄と反復 飼育された。自己透明帯蛋白質に対する抗体濃度を有する２匹の動物のみが不妊 に留まった。試験したすべての他の動物は妊娠した。

発情期の２週間、２匹の自己抗体濃度を示す不妊のイヌを飼育したら、片側で卵 巣破壊を起こし、除去した卵巣を切断し、組織検査のためにＰＡＳで染色した。

組織検査では不妊のイヌの卵巣に異常形態が見られた。卵胞発生の進行の証拠は 見られなかったし、卵巣は卵母細胞を含んでいる卵胞は消失していた。その上、 原始卵母細胞は見られなかった。

実施例８ ワクチン処理した動物により精製された抗血清のＷｅｓｔｅｒｎ分析 実施例６〜７に記載された実験で得られた免疫反応並びに異なった生理学的効果 をより良（理解するために、各試験群で調製した抗血清を、天然のブタＺＰＣ１ 熱可溶化したイヌ透明帯（Ｈ２Ｏ２）　、組替えイヌＺＰＡ及びＺＰＣ５及び組 替えブタ　ＺＰＣを含む各種の抗原に対してＷｅｓｔｅｒｎ分析法により分析し た。Ｗｅｓｔｅｒｎプロットを実施例６の試験動物（例えば等電位集束され熱可 溶化されたブタ透明帯により免疫した動物）から得た抗血清、または実施例７の 試験動物（自己透明帯に対する抗体を含むもの）から得た抗血清によりプローブ した。

データは、ＰＡＧＥ分析により示すことができるＺＰＣを含んでいない熱可溶化 したブタ透明帯で免疫した、不妊であるが循環するイヌからの抗血清によっては 組替えブタまたはイヌｚＰＣは認識できないことを示したが、天然のＺＰＣ，Ｈ ２Ｏ２及び組替えイヌＺＰＡは認識された。これに対して、卵母細胞が喪失した 不妊のイヌから得た抗血清は組替えｚＰＣ蛋白質、つまりポリペプチド骨格を認 識した抗原の抗体認識における重要な違いは、卵母細胞を喪失した卵巣を有する イヌから得た抗血清だけが組替えイヌ　ＺＰＣ抗原を認識することである。抗血 清が天然のｚＰｃ、　Ｈ５ＤＺ及び組替えイヌＺＰＡを強（認識する不妊イヌは 組替えイヌＺＰＣを認識しないことを示した。

自己免疫が避妊効果に対して重要であるとすれば、これらのデータは組織学的に 明白な卵巣不全なしのイヌの不妊性はイヌＺＰＡ抗原に対する自己免疫反応によ り得ることができることを示している。これに対して、永久不妊を招（組織学的 に確認された卵巣不全（つまり卵母細胞の喪失）は相同種のｚＰＣ蛋白質を特異 的に認識する抗体の生成を必要とする。

実施例９ 組替えｚｐ蛋白質の表現 １、表現ベクターの構成 図１に示したｐＺ９０のプラスミドベクターをプラスミドｐＵｃ９断片　ｆＶｉ ｅｒｒａ　＆　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８　（１９８ ２１１及びｐβｇａ１２（Ｑｕｅｅｎ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐ、Ｇｅｎ、２：１ −１０　（１９８３））から構成した。ｐＢｇａ１２に存在する単−Ｐｖｕ　Ｉ Ｉ制限部位はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、より購入した５ａＩＩ ポリリンカーアダプタを使用してＳａｌ　Ｉ部位に変換した。新たなＳａｌ　Ｉ 部位と前に存在したＳａｌ　Ｉの間のＤＮＡ配列はＳａｌ　Ｉによる消化により 削除し、再接合し、縮小寸法のプラスミドのためのスクリーンを行った。

λＣＩリプレッサ遺伝子、λＸｐＲプロモータ、及びＬａｃ２遺伝子（βガラク トシダーゼ）を担持している変性ｐβｇａプラスミドのＣ１ａ　１−　Ｎｄｅ　 Ｉ断片を、Ａｃｃ　Ｉ及びＮｄｅ　Ｉ制限部位の間のｐＵｃ９に挿入した。ｐＵ ｃ９プラスミドはプラスミドをＥ、　ｃｏｌｉ細胞中に維持するにの必要なアン ピシリン抵抗（Ａａ＋ｐｌ遺伝子とｃａｌ　ＥＩ複製原点（ｏｒｉ）を有する。

接合プラスミドは更に変性されてＡＴＧ開始コドン（ＡＴＧＧＡＴＣＣＮ　）の Ｂａｍ　ＨＩ部位３°をＡＴＧ開始コドン（ＡＧＡＴＣＴＡＴＧ）のＢｇｌ　Ｉ Ｉ　５’　に変換した。これはプラスミドをＲｓａ　Ｉで部分的に消化すること により行った。数個の消化点の１つはＢａｍ旧制限部位の約２０ｂｐｓ５°であ った。部分的に消化したプラスミドがＢａｍ旧で消化される時、生成したプラス ミドの若干はほぼ全長を有した、合成オリゴマー（ＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡ ＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、　２９１　は除去された配列（ ＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、 　３０１に置き換わって製造された。この置換による正味の効果はＢｇｌ　ＩＩ 制限部位を生成する３　ｂｐｓの置換であった。

Ｌａｃ　Ｚ遺伝子の約３０００塩基対を含むＤＮＡ断片を次にＢｇｌ　Ｉ及びＢ ａｎ　ＩＩにより制限消化することにより切断し、次いでＢａｍ　）ＩＩ部位を 含む合成オリゴマーの挿入を行った。プラスミドをＢｇｌ　Ｉ及びＢａｎ　ＩＩ で切断し、次いでヌクレアーゼＳｌで処理してプラント端部を形成した。Ｂａｍ 旧リンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を上記の消化したプラ スミドのプラント端部に挿入した。

次に、λＣＩリブレサー遺伝子及びｏｒｉ配列の間のＰｖｕ　ＩＩ制限部位を合 成リンカ−を使用して）ｆｉｎｄ　ＩＩＩ部位に変換した。Ｐｖｕ　ＩＩ制限部 位なＰｖｕ　ＩＩで切断し、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を　プラント端部に接続した。残りのｌａｃ　Ｚ　配列は 天然の配列の最初の８コドンを欠いていたので、これらの８コドンはＢｇｌ　１ １部位で始まりｌａｃ　Ｚ野生型遺伝子生成物（βｇａｌ）Ｎ末端配列をコード する合成オリゴマーを合成することにより置き換えた。

合成オリゴマーはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３１　（オリゴマー１１．　ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ、３２（オリゴマー２１．　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３３　（オリゴ マー３）、及びＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３４　（オリゴマー　４）に記述した４ 種のオリゴマーを合成することにより調整される。オリゴマー２．３はキナーゼ 及びＡＴＰで処理することによりフォスフォリル化されて、りん酸塩を５゛末端 を加えた。オリゴマー１．２は次に２００μＭのＮａＣ１中で１００℃でのイン キュベーションとそれに続く徐冷によりオリゴマー３．４にそれぞれハイブリダ イズ（交雑）された。得られたオリゴマーはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３５に記載 された配列を有した。この合成オリゴマーはＢｇｌ　ＩＩ−Ｐｖｕ　ＩＩ端を有 し。またプラスミドの制限消化とオリゴマーによる接合によりプラスミドのＢｇ ｌ　ＩＩ−Ｐｖｕ　ＩＩに置換した。

得られたプラスミドはｐＺ９０と名づけられ、図１に示されている。このプラス ミドｐＺ９０は熱不安定なえＣＩリプレッサを使用して熱誘導することにより組 替え蛋白質を表現するのに使用することができる。ｐＺ９０の熱誘導性のりブレ ッサ及びプロモータは次に化学的に誘導し得るｐｔａｃ（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｇｅｎｅ　２５：１６７−１７８（１９８３））と置換された。このｐ ｔａｃ　プロモータはＪａｃ　Ｉ遺伝子（Ｆａｒａｂａｕｇｈ、　Ｎａｔｕｒｅ 　２７９ニア６５−７６９　（１９７８））の産物であるｌａｃ　Ｉリプレッサ により制御される。このｌａｃ　Ｉ遺伝子はＩｎｎ１ｓ　ａｎｄ　Ｇｅ１ｆａｎ ｄｎ、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓａ ｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｉｎｎ１ｓ、　Ｍ、Ａ、及びＧｅ１ｆａｎ ｄ、　Ｄ、Ｈ，。

５ｎｉｎｓｋｙ、　Ｊ、Ｊ、及びＷｈｉｔｅ、　Ｔ、Ｊ、編Ｐ、１−１２．　Ａ ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ、　８ 　（１９８３））に記載されたＰＣＲ法を使用してｐＭＣ９（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅ ｔ　ａｔ、、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３：３１１７−３１２１　（ １９８４））から得られた。使用されたプライマは一端でＬａｃ　Ｉプロモータ と相補的であり、反対端にＬａｃ　Ｉ遺伝子終端コドンを有した。Ｎ末端プライ マは旧ｎｄ　１１１部位を有し、Ｃ末端プライマはｔａｃプロモータ配列とそれ に続＜　Ｂｇｌ　１１部位を有した。Ｎ末端プライマはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　 ３６に記載した配列を有した。Ｃ末端プライマはＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　３７に 記載した配列を有し、５−ＣＡＣＡＡＴＧＴＧ−３°を有するＤｒａ　３部位を 含む。得られた両端にＨｉｎｄ　ＩＩＩとＢｇｌ　ＩＩ制限部位を有するＪａｃ 　Ｉ　−ｐｔａｃ　ＤＮＡ断片を使用して、次にＬＣＩリプレッサとλｐＲプロ モータを有するｐＺ９０のＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｂｇｌ　Ｉ工断片を置換した。

この置換は図２のプラスミドｐＺ９８を生成したＩＣ組替えＺＰ　ＤＮＡの挿入 蛋白質ＺＰＣをコードするＤＮＡ配列は上記のＰＣＲ法　（Ｉｎｎｉｓ　＆　Ｇ ｅ１ｆａｎｄ）を使用して実施例１で調整したプラスミドｐｚ５７から調整した 。このプラスミドは実施例１で記載したλｇｔｌ　１クローン５−１から得た全 長のＺＰｃ配列を有していた。ＰＣＲ法を実行している間に、ブタＺＰｃ遺伝子 は先導配列及び疎水性末端を含んでいないＮ末端プライマを使用することにより 変性された。このＮ末端プライマはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３８に記述された配 列を有した。このプライマは配列５°−ＧＧＡＴＣＣ−３°を有する内部Ｂａｍ 旧制限部位を有した。使用されたＣ末端プライマはＳＥＱ　ＩＤ　８０゜３９に 記述されており、配列５−ＣＴＣＧＡＧ−３’を有する内部ＳＡＬ　Ｉ制限部位 と、配列５°−ＣＴＣＧＡＧ−３°を有する内部Ｘｈ。

■制限部位を有した。変性されたＺＰｃ遺伝子はブタアミノ酸ＺＰＣ１−３５０ をコードする塩基対ｌｏ５〜１１５４を有した。

変性されたブタｚＰＣ遺伝子の５°末端にはＢａａ＋　ＨＩ制限部位を付加し、 ３°末端にはＸｈｏ　Ｉ及びＨｅｘａ−ＣＡＴコドン配列（ＣＡＴ）　６、終止 コドン、及びＳａｌ　Ｉ制限部位を付加した。この変性したブタｚＰＣ遺伝子は ９２９ｇのＢａａ　ＨＩ−Ｓａｌ工制限部位に挿入されて図３に示すｚＰＣ表現 ベクタであるプラスミドｐＺ１５６を生成した。（ＣＡＴ）　６Ｍ列は、アフィ ニティークロマトグラフ中で固定された金属による融合蛋白質の生成を可能にす る組替え融合蛋白質中において、Ｃ末端ヘキサヘスチジン（ＨｉＳ６）アミノ酸 配列を生成する。

上に述べたと同様な方法により、プラスミドｐＺ１５６はＢａｍ　ＨＩ及びＸｈ ｏ　Ｉにより消化した時、他の組替えｚＰ遺伝子または遺伝子断片を受け取って 金属イオンクロマトグラフ法により生成できるβｇａｌ融合蛋白質としての表現 を行い得る。

Ｉｆｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ中のブタｚｐｃ融合蛋白質の表現図３の表現ベクタｐＺ １５６をＣｈｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：　２１７２−２１７５　（１９８９）に記載の方法に よりｌＥ、ｃｏｌｉ株Ｔｏｐ　ＩＯＦ’　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　 Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）に取り込んだ。この形質転換したＥ、　ｃａｌｆ細胞系統 はＺＩ　１５６株と呼ばれ、組み替えブタｚＰＣ−βｇａｌ融合蛋白質を表現す るのに使用された。

ＺＩ　１５６の細菌培養を、ｌｏｏμｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬｕｒ ｉａ　Ｂｒｏｔｈ　（ＬＢ）中３００℃で、細胞密度が約１．５のＯＤ”’に達 するまで行った。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトブラノシド　（ｒＰＴＧ） 　（１００ｍＭ／　１溶液）の３ｍｌを添加してｔａｃプロモータから表現を誘 起させ、細胞を更に３０℃で２〜３時間培養した。細胞は遠心分離で回収し、得 られた細胞ベレットを一７０℃で凍結した。

凍結細胞ベレットを１０ｍＭのＥＤＴＡ　（Ｉｇ／２−２．５　ｍｌ）中に懸濁 させ、５０％動力で３分間音波処理にかけ、各超音波処理の間では水浴中で冷却 した。得られた溶菌液を３３００ｘｇで１時間行い、そして固いベレットを得た 。

この固定ベレットを使用して溶菌処理を反復した。残留しているＥＤＰＡを除去 するために最終的に得られた制帽ベレットを音波の短いパルスを印加して少量の 水に分散させ、得られた懸濁液を遠心分離にかけ、上澄みを捨てた。こうして洗 浄したベレットを緩衝液Ａ（元の細胞ベレットの１ｇにつき、６Ｍの水素塩化ガ ニジン（ＧｕＨＣＩ）、　１００ｍＭのＮａ　Ｈ２ＰＯ４，１０ｍＭ　のＴＲｌ ５．　ｐＨ８を約０．５１１１１　）中に完全に分散した。懸濁液を１０，００ ０　ｘｇで４５秒間遠心分離し、次いで上澄み液を保持し、ベレットを捨てた。

残留した上澄みをＮｉカラム（緩衝液Ａ中）に装入し、カラムをｌＯカラム分の 量の緩衝液Ａで洗浄した。次いで、カラムを５容積分の各緩衝液Ｂ、Ｃ，Ｄで洗 浄した。ここにこれらの緩衝液は８Ｍの尿素、ｌｏｏｍＭのＮａＨ、ｐｏ、、及 び１０　ｍＭのＴＲｌ５よりなり、緩衝液Ｂ、Ｃ，Ｄに対してそれぞれｐＨ８， ６，３及び５．９を有した。

ｐＨ４，５の緩衝液Ｅで溶出した組替えｐｚｐｃ−βｇａｌ融合蛋白質はウサギ のアンチＨ３ＤＺ及びアンチＨ３ＰＺをプローブとするＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏ ｔ分析によりスクリーンして分離した。更に緩衝液Ｆ　（ｐＨ２，５）　（８Ｍ 　ＧｕＨＣ１＊　ＺＯＯｍＭ酢酸）を使用して更に溶出することができる。

この方法により得られた融合蛋白質は宿主動物に注射するための最終投与量にな るように最終の体積を８Ｍ尿素中０．５ｍｌにし、それをすでに述べたように０ ゜１５ｍ１のアジュバントに添加した。各投与量は試験動物に皮下注射した。

実施例１０ 組替えＺＰＣ−βｇａｌ融合蛋白質によるイヌのワクチン処理 熱可溶化したブタ透明帯またはクロマトグラフで精製したブタＺＰ３０とアジュ バントとしてのバイオポリマーと薬剤放出媒体との混合物で年齢約２か月の時に 予め注射した試験動物から年齢約５〜６か月の１１個の雑種イヌをランダムに選 択した。最初の注射後の６週間後、すなわち３か月半径に、すべての試験動物は ＥＬＩＳＡで測定して２〜１６にの範囲のＩ（ＳＰＺに対する抗体１度を達成し た。しかし、どの試験動物も自己抗原例えばＨ２Ｏ２に対する抗体濃度を達成で きなかった。

５〜６か月の年齢で、試験動物のうちの５匹に実施例９の様に調製したブタＺＰ Ｃ−βｇａｌ融合蛋白質の負荷量を注射した。　実施例９で製造した組替えＺＰ Ｃ−βｇａｌ融合蛋白質を０．５ｍｌの８Ｍ尿素及び０．５ｍｌのアジュバント よりなる最終量の所望投与量に調製した。アジュバントはＮ−アセチル−Ｄ−グ ルコサミニル−β（１，４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソ グルタミン（ＧＭＤＰ）であり、その２５０μｇを０．４２ｍ１鉱油、０．１５ ７ｍ１のＬ−１２１ブロック重合体（商品名）、及び０．０２ｍ１のＴｗｅｅｎ ８０　（商品名）よりなる媒体中に分散した。各投与量は皮下注射により５匹の 試験動物に投与した。残りの６匹の動物はそのまま対照とした。

２〜３週間の間隔で全部で４回注射した後、自己抗原例えばＨ２Ｏ２に対する抗 体濃度をすべての試験動物において測定したが、ＥＬＩＳＡ法による測定で２〜 ８にの範囲にピークを有した。

対照動物のうち若干のものは、年齢約９が月から発情サイクルを始め、１１か月 までに４〜６対照動物が最初の発情を経験した。これに対して、組替えＺＰＣ− βｇａｌ融合蛋白質を投与された５匹の動物は同じ期間に発情しなかった。しか し、第１発情は試験動物の場合に数カ月遅延したが、結局は発情サイクルを始め た。注射した５匹のイヌのうち２匹は第２発情期に妊娠したが、第３のイヌは第 ２発情期に妊娠した。しかし、残りの２匹の試験動物はほとんど２年にわたり不 妊のままであった。

実施例１１ ヒト透明帯蛋白質ＺＰＡ及びＺＰＢをコードするヒトＤＮＡ配列の単離 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ、　９４６２０３）より購入した ヒト染包体ライブラリを使用して、ヒト透明帯蛋白質ＺＰをコードするＤＮＡ配 列を分離した。ライブラリはＬａｏ＋ｂｄａ　ＦｉｘＩＩベクタ（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）ヘクローンしたヒトＤＮＡ　（男子コウカシアンの胎盤組織から得た もの）の９〜２３ｋｂ挿入体よりなっていた。はぼ４００００ｐｆｕをＳｔｒａ ｔａｇｅｎｅマニュアルに従って）Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＬＥ　３９２　（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ、　ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ、　２００２６６）上に置いたが、Ｍｇ ５ＯａをＭｇＣｌ２と置換した。−夜インキユベートした後、プラークをナイロ ン膜へ載せたもの（リフト）を作り、それを実施例２に記載したようにして３２ Ｐラベル蛋白質ＺＰＡ　ＣＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　ｌ）及びｓａｐミル ラベル質ＺＰＢＣＤＮＡ　（ＳＥＱ　ＩＤＮ０．３）でスクリーンした。

３種０）　りｏ　−ン１−１．２−２．及び４−９はブタ　ＺＰＢ　ＣＤＮＡ（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３）に交雑することが分かった。クローンｌ−１及び　 ４−９はＴｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉ。

ｎ（ＡＴＣＣ）　（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に１９９３年１月２７日にＡＴＣＣ寄託番号第７ ５４０６及び７５４０５としてそれぞれ寄託された。ヒト　ＤＮＡ挿入体はこれ らのクローンから単離され、実施例１に記載のようにＥｃｏ　ＲＩによる制限エ ンドヌクレアーゼ消化及び５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析に欠けられた。表４ はこれらのクローンのＥｃｏ　ＲＩ消化による結果を示す。

表４ ヒト染色体ＺＰＢ　ＥｃｏＲＩ 挿入体 断片　１−１　２−２　４−９ Ａ　２．８ｋｂ　２．８　ｋｂ Ｂ　２．２　ｋｂ ｃ　２．Ｏｋｂ Ｄ　１．５　ｋｂ　１．５　ｋｂ Ｅ　Ｏ，２ｋｂ　０．２　ｋｂ Ｆ　３．２　ｋｂ　３．２ｋｂ　３．２　ｋｂＧ　Ｏ，７ｋｂ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析により４種のＥｃｏ　ＲＩ断片はブタＺＰＢ　 ＣＤＮＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３）に対する交雑に基づいてＺＰＢコード 配列を有することが分かった。クローン１−Ｉ　ＤＮＡハソノヨウニ交’ａ　Ｌ 　タ２．２　ｋｂ、２．　Ｏｋｂ、及び１．５　ｋｂのＥｃｏ　Ｒ１断片を有し た。クローン２−２　ＤＮＡは２．８　ｋｂのＥｃｏ　ＲＩ交雑断片を有した。

クローン４−９　ＤＮＡはブタ　ＺＰＢｃＤＮＡプローブに交雑した２、８　ｋ ｂ及び１．５　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１断片を有した。すべての挿入体は更に３．２ 　ｋｂの非交雑Ｅｃ。

Ｒ１断片を有した、クローン１−１及び４−９からの挿入体は０．２　ｋｂの非 交雑断片を有し、クローンｌ−１は更に０．７ｋｂの非交雑断片を有した。

更に制限分析したところ図４に示した断片整列が見いだされた。断片（Ａ−Ｆ） の内６個は実施例１に示したようにして配列分析のためにｐＢＳＫＳにサブクロ ーンされた。

予備的な配列分析により図４の断片整列配列が確認され、ヒトＺＰＢ遺伝子の完 全なコード配列はクローン　ｌ−１及び４−９よりなることを示唆した。これは 挿入体のヌクレオチド配列分析し、また、配列をネコＺＰＢ配列（ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０．１５）及びブタＺＰＢ配列　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３）と対比して確 認された。このヒトＺＰＢに対するＤＮＡ配列並びに推定されたアミノ酸配列は それぞれＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　４０及び４１に記述されている。

実施例１に記載して条件下にブタＺＰＡ　ｃＤＮＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　 １）に交雑するクローンも単離した。２種のポジティブクローンＡｌ及びＡ４が 同定された。これらのクローンはＴｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ 、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に１９９３年１月２ ７日にＡＴＣＣ寄託番号７５４０４及び７５４０３　Ｔそれぞれ寄託された。５ ｏｕｔｈｅｒｎプロット分析によるとこれらのクローンがヒト　ＺＰＡ遺伝子の 全部または一部を含むことが分かった。　ＤＮＡをこれらのクローンから単離し 、実施例１のようにしてＢｇｌ　ＩＩ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、及びＮｏｔ　Ｉ制 限エンドヌクレオチド消化により並びに５ｏｕｔｈｅｒｎプロット分析により分 析された。

Ａ１クローンＤＮＡ挿入体の大きさはほぼ１１．６　ｋｂであり、またＡ４クロ ーンのそれは約１３．２　ｋｂであった。ブタＺＰＡ　ｃＤＮＡ　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯｌ）と交雑したＢｇｌ　ＩＩ断片は、配列分析のために実施例１に記載 した六方法でＰＢＳＫＳにサブクローンされた。配列分析しまたブタＺＰＡ　ｃ ＤＮＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，ｌ）及びイ、２　ＺＰＡ　ｃＤＮＡ　（ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ、　１１）　と比較したところ、Ａｌ及びＡ４は一緒になってヒト ＺＰＡ遺伝子をコードすることが分かった。完全なりＮＡ配列とそのアミノ酸配 列はそれぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３４２及び４３に記述されている。

実施例１２ ジノモルゲスサルＺＰＡ、　ＺＰＢ、及びｚｐｃをコードするＤＮＡの単離と配 列決定 ジノモルゲスサルのｃ　ＤＮＡライブラリを下記のλｇｔｌＯ中に構成した。簡 単に述べるに、年齢ｌ、５年及び２年の２匹の雌ジノモルゲスサルから卵巣を集 めた。また年齢３．４及び１４年の３匹の雌ジノモルゲスサルから第２組の卵巣 を集めた。ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ分離キットを使用し、 そのマニュアルに従って分離した。ｃＤＮＡをＬａｍｂｄａ　Ｌｉｂｒａｒｉａ ｎキット（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社。

実施例２の方法）を使用して調製した。Ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ　（商品名、Ｐｒ ｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）λｇｔｌＯＥｃｏＲ１アーム及びＰａｃ ｋａｇｅｎｅ　（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）ラムダＤＮＡ封入装置にそのマニ ュアルに従って、このｃＤＮＡをλファージの頭部に封入した。この手順は一般 に１　ｘ　１０’　ｐｆｕ／＋１より大きい濃度のライブラリを作る。サルｃＤ ＮＡライブラリを次に実施例１において述べたようなブタｃＤＮＡがら分離した ブタ　ＺＰＡ、　ＺＰＢ、及びｚＰｃプローブを使用してスクリーンした。スク リーンはＮｙｔｒａｎナイロンフィルタ（孔径０．２μｍ）を使用した２つのプ ラークリフトを製作することにより行った。フィルターは５ｘ　５ＳＰＥ　（４ ３，８３ｇ／ｌのＮａＣ１，６，９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ，、Ｈ，０，１，８５ ｇ／ｌのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，４）、　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ　Ｒｅａｇｅ ｎｔ　（Ｉｇ／ｌのＦｉｃｏｌ１　［ｔｙｐｅ　４００］、　１　ｇ／ｌのポリ ビニルピロリドン、及び１ｇ／ｌウシ血清アルブミン）、１００μｇ／ａｌの音 波処理され変性されたサケ血清テストＤＮＡ　、　３０％ホルムアルデヒド、オ ヨビ０．５％ＳＤＤの溶液中で、４２℃にて３時間予備交雑された。放射線ラベ ルしたプローブ［α−ｚｉｐ］−ｄＡＴＰとＰｒＬａ＋ｅ−ａ−Ｇｅｎｅ　（商 品名、　Ｐｒｏｍｅｇａ社）ラベル装置を使用して調製した。予備交雑の後に、 １ｏｎＨの新規に放射線標識したプローブを９５℃で５分間５０％フォルムアル デヒド及びｌＯＯμｇ　／　ｍ　１の音波処理変性サケテスト中で変性し、次い でフィルタに加えた。交雑を４２℃で１５〜２４分間行った。交雑したフィルタ を５５℃で１００ｍ１の５Ｘ　５ＳＰＥで各１時間ずつ２回洗浄した。フィルタ を次に２５０ｍ１の５Ｘ　５ＳＰＥでゆすぎ、次いで空気乾燥した。乾燥したフ ィルタを増感スクリーン　（Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴＩＣ）を使用してＸ線フ ィルム（ＫｏｄａｋＸＡＲ５，Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔ ｅｒ　ＮＹ）に−７０℃の温度で８時間以上露出させた。このフィルムを可視分 析のために現像した。

ジノモルゲスサルの卵巣ｃＤＮＡのライブラリをすべてのブタプローブを使用し て徹底的にスクリーンしたところ、１２種の候補クローンが得られた。５ｏｕｔ ｈｅｒｎ交雑法によりこれらのクローンのうち唯一のもの（ん（：Ｍ４−２）が ブタ　ＺＰＡプローブに交雑したことが分かった。　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｇ　Ｖ ｅｒｓｉｏｎ　２キツト（ｌＪ、ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖ ｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ）を使用しそのマニュアルを使用して挿入体の配列決定 を行った。配列決定によると、　５６０　ｂｐ挿大人体他のヒトＺＰＡ遺伝子の ３°端に相同であることが分かった。この５６０　ｂｐ断片は全長配列の２５％ 以下を代表しているに過ぎず、１６４個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする ４９２　ｂｐのオーブン読み取りフレームを含んでいた。ジノモルゲスサルＺＰ Ａ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列とそれから推定されるアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ 　１０　ＮＯ５，４４及び４５として記述されている。

ブタ　ＺＰＢプローブによるジノモルゲスサルの卵巣ｃＤＮＡのライブラリのス クリーニングは８６６　ｂｐの挿入体を有する単一のＺＰＢクローンを与えた。

配列分析は挿入体が予想される全長配列のＣ末端の５０％を含むことを示唆する 。ＤＮＡ配列とそれから推定されるアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ３，４６及びび４７で記述されている。サルの卵巣のｃＤＮＡライブラリをブタ 　ＺＰＣＤＮＡプローブでスクリーンすると、部分的なＺＰＣクローンが得られ た。その最長のもの（えＣＭＩ−１）は既知のＺＰＣクローン（特にヒトＺＰＣ クローン）と比較により全長配列のＣ末端部の約５０％強を含むことが分かった 。このクローンは２２４個のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする６７２　ｂｐ のオーブン読み取りフレームを含む。このクローンはまたすべての３個の読み取 りフレームにおけるコード配列の５°に直接停止コドンを有する。このジノモル ゲスサルＺＰＣクローンのＤＮＡ配列とそのアミノ酸配列はそれぞれＩＤ　ＮＯ Ｓ　４ｇａｎｄ　４９に記述されている。

実施例１３ 晴乳動物のＺＰＡのＤＮＡとそれから推定されたアミノ酸配列の比較 表５は晴乳動物のＺＰＡのＤＮＡとそれから推定されたアミノ酸配列の比較を示 す。

データはＺＰＡ蛋白質配列と　ＤＮＡ配列を比較する。蛋白質の比較は対角線の 右上に示し、ＤＮＡ配列は対角線のに下に記載されている。ＺＰＡ　ＤＮＡ及び 誘導されたアミノ酸は高度に相同であった。相同性は晴乳類綱の同−目のメンバ ー間で最も高い１例えばヒトとジノモルゲスサル（ｐｒｉｍａｔａ）　、ブタと ウシ　（ｕｎｇｕｌａｔａ）　、ネコとイヌ　（ｅａｒｎｉｖｏｒａ）の配列は それぞれ最も近似している。　ＺＰＡ遺伝子間、及びＺＰＢ　（実施例１４）と ＺＰＣ（実施例１５）遺伝子間の高度の相同性は、これらの種のＺＰの構造的な 高い類似性を示唆している。しかし、グリコジル化等のポスト翻訳変性の差は変 種源を示す可能性がある。

蛋白質処理部位は蛋白質のＣ末端近（のフリン開裂部位（Ｒ−Ｘ−Ｒ／に−Ｒ； 　Ｈｏ５ａｋａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋、　２６６：１ ２１２７　（１９９１））である。実際、若干の例外を除けば、すべてのＺＰ蛋 白質はＣ末端にフリン処理部位を有する。このフリン処理部位は、処理済蛋白質 が、生長しているＺＰ層の外縁部に向けて移動することを許容するような膜アン カー配列を開裂するのに役立ち得る。

ヒト　ＺＰＡはジノモルゲスサルＺＰＡ配列には存在するが他の種からのＺＰＡ 遺伝子には存在しない３°端に近接したエクソンを含む。この余分のエクソンは フリン処理部位の後に生じるアミノ酸配列をコードする。これはフリン開裂によ り生じるＣ末端断片が２２層の作用または卵母細胞にある程度重要なことを示唆 している。各全長ＺＰＡ配列には２０個の保存されたシスティン残基が存在し、 また１〜２個の非保存システィン残基が存在する。非保存システィン残基はＮ末 端先導配列領域または極端Ｃ末端領域のいずれかに存在し、そこではＺＰＡ配列 の間に大量の変性が生じる。高度の相同性及び多数の保存システィン残基はＺＰ Ａ蛋白質の３次構造が類似していることを示している。

以前にＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質の間に相同領域が存在することが注目されている （Ｓｃｈｗｏｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、、　２６６ ：７２１４　（１９９１）；　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌ ｌ＋、２６８：　１２４１２　（１９９３）；　Ｙｕｒｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１１７４：２１１　（１９９３））　、ヒト　Ｚ ＰＡ染色体構造をヒト　ＺＰＢ染色体構造と比較すると、これらの領域がヒトＺ ＰＡ遺伝子のエクソン１２．１３及び１４及びヒトｚＰＢ遺伝子のエクソン５． ６．及び７に限定されていることが分かる。これは、この相同性が部分的に祖先 の遺伝子の複写であることを示唆している。ＺＰＢ蛋白質は２１個の保存された シスチン残渣を有する。これらのうち最初の１１個はＺＰＡ蛋白質と整列しない が、最後の１０個は良く整列する。これは相同性を約２７０個のアミノ酸に延長 し、ＺＰＡ遺伝子のエクソン１１〜１６をカバーし、ＺＰＢ遺伝子のエクソン４ 〜９をカバーする。しかし、拡張した領域の全体的な相同性は若干低い（約４３ ％）である。ＺＰＡ及びＺＰＢ遺伝子の残りは互いにほとんど相同性を示さず、 またＺＰＣ遺伝子もＺＰＡに対する広範囲な相同性を示さなかった。更に、ＺＰ Ａ遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ及び５ｗ１ｓｓＰｒｏｔデータバンクの非ＺＰ核酸及 び蛋白質配列に対する広範囲な類似性を示さなかった。

実施例１４ ＺＰＢ　ＤＮＡ配列及び導出されるアミノ酸配列の比較表６は６種の既知のＺＰ Ｂ　ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の比較を示す。ただしウシ及びジノモルゲスサ ルｃＤＮＡ断片は他の全長ＺＰＢ配列と比較した。

データはＺＰＢ蛋白質配列と　ＤＮＡ配列を比較する。蛋白質配列の比較は対角 線の右上に示し、ＤＮＡ配列の比較は対角線の左下に記載されている。

ＺＰＢのＤＮＡ及び誘導されたアミノ酸はかなりの程度に相同であった。相同性 は晴乳類綱の同−目のメンバー間で最も高い。例えばヒトとジノモルゲスサル（ ｐｒｉｍａｔａ）、ブタとウシ　（ｕｎｇｕｌａｔａ）の配列はそれぞれ最も相 同である。若干の例外の除いて（下記）、ＺＰＢ配列はＧｅｎＢａｎｋまたは５ ｗ１ｓｓＰｒｏｔデータベースの他のＤＮＡまたは蛋白質配列に対して相同でな かった。交雑実験によりＺＰＢ転写は卵巣特異的であることが示唆される。

ＺＰＢクローンの推定されたアミノ酸配列を比較すると、ＺＰＡと　ＺＰＣの群 よりもＺＰＢの群の方が際が大きいことが分かる。ウサギ　ＺＰＢとブタのＺＰ Ｂを比較すると、配列が優先的に共直線的（７４％相同）であることが分かる。

ただし、ウサギは追加の上流側ＡＴＧコドンを有し、にのコドンをウサギの配列 に付加している。

ネコＺＰＢ配列は、遺伝子の最初の４分の１において全体で３８個の追加のコド ンがブタ及びウサギの配列に整列する追加の２個のアミノ酸挿入体を有する。両 挿入体はシスティン残基のの直後に生じるが、これは若しもシスティンがジスル フィドブリッジに含まれるならばこれらの領域が抗原決定基を形成できることを 示唆している。しかし、ネコ遺伝子はブタ遺伝子に対して７３％相同であり、ウ サギ遺伝子に対して７０％相同である。

ヒト遺伝子はネコ遺伝子配列の挿入体の第１のものに対して相同であり、第２の ものに対しては相同でない。

しかし、ヒト遺伝子配列のこの余剰領域に近接して一致スプライス部位ドナー及 びアクセプタ配列が存在する。

この配列は使用されるとフレーム中にこのコード配列を残すであろう。従って、 エクソン２を表示する配列は実際には小さいイントロン　（８４ｂｐ）により分 離される２つの小さいエクソン（１２２ａｎｄ　１０３　ｂｐ）であり得る。こ れはこの領域のヒト配列をブタ配列と同一にする。ネコ配列の第１の余剰領域は またスプライス部位にドナー及びアクセプタ信号に隣接している。若しもこの余 剰領域がネコ配列から除去されると、単一アミノ酸だけでブタ配列を違うことに なる。しかし、ネコ配列は完全に活性化（ｐｒｏｃｅｓｓ　）されると思われる ｍＲＮＡがらがら作られるｃＲＮＡクローンから得られた。ネコ配列中の余剰領 域はフレームスプライス部位にドナー及びアクセプタ信号を含まないので、おそ ら（は活性化されないイントロンの存在によるものではないであろう。

ジノモルゲスサル及びヒト配列は、他のＺＰＢと比較すると、Ｃ末端に追加の７ 個のコドンを有することが分かる。ジノモルゲスサルでは、これは２塩基対の消 去に起因するもので、これによりフレームシフト変異が起きて他の種により使用 される終止コドンをフレームがら外す。ヒト配列もまたこの消去を含むが、これ に加えて、更にこの終止コドンを消去する塩基変化が存在する。

ＺＰＢ蛋白質には２１個の保存されたシスティン残渣が存在し、その最後の１０ 個はＺＰＡ蛋白質に相同の流域に生じる。この相同性はすでに知られている（上 記Ｓｃｈｗｏｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、；上記Ｌｅｅｅｔ　ａｌ、　１９９３；　 上記Ｙｕｒｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、　１９９３）が、ヒトＺＰＡ及びＺＰＢ遺 伝子の染色体構造の検討により相同性が約２７０アミノ酸に延長した。この相同 性は部分的な先祖遺伝子の複製によるものであり得る。保存されたシスティン残 渣の他に、ブタＺＰＢ蛋白質は推定リーグ配列に更に追加の一つのシスティン残 基を有し、またヒト配列は４個の追加のシスティン残渣を有する。これらのうち の第１のものは推定リーグ配列中にあり（ブタとは違った箇所）、第２のものは 追加の挿入体を有する領域にあり、最後の２つは変異した終止コドンより引き起 こされるＣ末端延長部にある。これらの２つの余剰システィン残基はシノモイグ スサル配列中に保存されている。

ｚＰ蛋白質のすべてはＣ末端近（に推定的なトランスメンプレイン領域を含む。

しかし、すべてのＺＰＡ及びＺＰＣのトランスメンプレイン領域の直前に起きる 正規のフリン蛋白質分解プロセッシング信号（Ｒ−Ｘ−Ｒ／に−Ｒ，Ｈｏ５ａｋ ａｅｔ　ａｌ、上記、　１９９１）は、ヒト　（Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）　、シノモイ グスサル　（Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｎ）及びウサギ　（Ｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）　ＺＰＢ配列中 では変化している。この意味は知られていないが、これらの蛋白質が２または３ 塩基に対する特異性を有する関連した系により活性化処理されることを示してい る可能性がある。なぜなら推定的なトランスベンプレイン領域の放出がｚＰＮの 成長につれてＺＰＢたんばくを移動させるのに必要だからである。ブタＺＰＡ及 びＺＰＢ蛋白質（Ｙｕｒｅｗｉｃｚ　ｅｔａｌ、上記）の大量の蛋白質加水分解 プロセシング（活性化）が存在するである。ネコ、ウシ、ジノモルゲスサル、及 びヒトのＺＰＢ蛋白質のポスト翻訳変性に関するデータは存在しない。この活性 化の生理学的な意味は知られていないが、異なったプロセッシングは高度に保存 されたＺＰ蛋白質の棟内の変性の重要な手段を提供するであろう。

ヒトは実際にＺＰＢ遺伝子を転写するがと言う問題がある。回収されるヒト卵巣 ｍＲＮＡの量は余りにも少ないので、　ｃＤＮＡライブラリの構築とＮｏｒｔｈ ｅｒｎ分析を実行するには充分でなかった。しかし、ジノモルゲスサルはＺＰＢ を転写するので、それと高度に相同なヒトＺＰＢ遺伝子も転写する確率が高い。

イヌｃＤＮＡライブラリにおいてはＺＰＢ　ｃＤＮＡが明らかに欠けていること は他の疑問である。透明帯遺伝子を含んだすべての分離したライブラリはイヌを 除いてすべての３種の遺伝子を含んでいた。しかし、６が月のイヌの卵巣から単 離したｍＲＮＡ　（ライブラリは４が月のイヌより作成した）はＮｏｒｔｈｅｒ ｎプロット上でブタ及びジノモルゲスサルＺＰＢ　ｍＲＮＡと一緒に移動するＺ ＰＢ　ｍＲＮＡを含んでいる。イヌＺＰＢ　ｍＲＮＡが欠けていることを説明す る一つの可能性は、３種のＺＰ遺伝子の転写タイミングが拡がっていること、ラ イブラリを作成するために使用した卵巣が若かったこと、ＺＰＢ遺伝子の転写が ＺＰＡ及びｚＰＣ遺伝子よりも遅く起きること　（Ａｎｄｅｒｓｅｎ　ａｎｄ　 Ｓｉｍｐｓｏｎ、　１９７３）である。

実施例１５ ＺＰＣＤＮＡ配列と推定されたアミノ酸配列の比較表７はすべてのＺＰＣｃＤＮ ＡのＤＮＡ配列と推定されたアミノ酸配列の比較を示す。

データはＺＰＢ蛋白質配列と　ＤＮＡ配列を比較する。蛋白質配列の比較は対角 線の右上に示し、ＤＮＡ配列の比較は対角線の左下に記載されている。

ＺＰＣのＤＮＡ及び誘導されたアミノ酸はＺＰＡ及びＺＰＢ　ＤＮＡよりも高度 に相同であった。ＺＰＡ及びＺＰＢの場合と同様に、同−晴乳動物の網内の同− 口内で最も相同性が高かった。例えばヒトとジノモルゲスサル（ｐｒｉｍａｔａ ）　、イヌとネコ（ｃａｒｎｉｖｏｒａ）、ブタとウシ　（ｕｎｇｕｌａｔａ） 　、マウスとハムスター（ｒｏｄｅｎｔａ）の配列はそれぞれ最も相同である。

ｚＰＣ転写はＮｏｒｔｈｅｒｎ部ロット分析によると卵巣特異性である。Ｇｅｎ Ｂａｎｋ及び５ｗ１ｓｓＰｒｏｔｐｅｃｉｆｉｃデータベースの配列と比較する と、有意な非ＺＰ相同体は検出しない。既知のＺＰＣ遺伝子のアミノ酸配列と比 較すると、多数の非一致配列を有する３つの領域が検出される。これらの領域は 推定リーグ配列と成熟蛋白質の第１の２０−２５アミノ酸、マウスの精子結合領 域として同定されたペプチドを含む領域（Ｍｉｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２１６：９３５−９３８　（１９８９））、及びフリンブロセッシング 部位（下に述べる）で成熟蛋白質から除去できるＣ末端領域である。

推定精子結合部位として同定された抗原決定基　（Ｍｉｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ、 上記、　１９８９）はフリン蛋白質加水分解開裂部位の直前に生じる（Ｍｉｌｌ ａｒ　ｅｔ　ａｌ、上記、　１９８９）　、フリン部位　（Ｒ−Ｘ−Ｒ／に−Ｒ ）はすべてのＺＰＣ配列で高度に保存されている。しかし、イヌｚＰＣ配列は第 ２のフリン部位を有し、第１のフリン部位より１９アミノ酸だけ上流にある。ま たＺＰＡ及びＺＰＢの場合のように、ｚＰＣ蛋白質のフリンによる開裂は推定メ ンプレインアンカー配列を除去しくに１ｅｉｎａ１．、１９８５）、処理された ｚｐｃが拡張卵母細胞の外層に向けて移動させるであろう。従って、この精子結 合部位はおそら（成熟蛋白質のＣ末端を表すであろう。しかしこの抗原決定部位 に対応するＺＰＣの領域にはほとんど相同性がない（マウスとハムスター間にも ）、これはこの領域が精子−卵子結合の種特異性に資することを表しているであ ろう。

ｚＰＣ蛋白質のＣ末端に見られる変動は推定トランスメンプレイン領域に生じる 。この変動は、リーグ配列に見られる相同性の欠如のように、このアミノ酸配列 がこの領域のアミノ酸の全体的な疎水性よりも重要でないことを示しているであ ろう。しかし、この変動はこの領域の種特異的な機能を意味している可能性もあ る。

ｚＰＣ配列は１４個の保存されたシスティン残基を含むが、各配列はまた一つま たは数個の他の配列とだけ共有する１個ないし２個の余剰システィン残基も有す る。これらの余剰システィン残基は、蛋白質のＮまたはＣ末端の近傍にあり、そ こでは最大の配列変動が存在する。しかし、多数の保存されたシスティン残基は おそらくこれらの蛋白質のすべての中央芯部の全体の構造が相当に保存されてい ることを示す。

実施例１６ ジノモルゲスサルのＨＳＰＺによる免疫処理性的に成熟したジノモルゲスサルを ＨＳＰＺで免疫してＨＳＰＺの不妊誘起能力を検査した。ＨＳＰＺは実施例６に より調整した。　ＨＳＰＺを次のＧＭＤＰ／油アジュバントと混合した。　ＧＭ ＤＰ／油アジュバントは、５０部ｇのＧＭＤＰ　（Ｎ−アセチル−Ｄ−グリコサ ミニル−（βｌ−４１−Ｎ−アセチルムラミル−〇−イソグルタミン）　（（Ｃ Ｃ，Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｐｏｗａｙ、　ＣＡ）　、　４２．１％の鉱油、１５． ８％のｐｌｕｒｏｎｉｃ　ＶＣ−１２１（商品名。ＢＡＳＦ−Ｗｙａｎｄｏｔｔ ｅ、　Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、　ＮＪ製のブロックポリマーポリオール）よりな った。動物はＧＭＤＰ／油アジュバント中ＧＭＤＰの各１ｍｇを、初期投与、そ れに続（４週間後の追加投与、それに続く２回の５週間置きの追加投与、及びそ の後６週間後の最終投与で皮下注射した。この投与処方は１（ＳＰＺに対して説 明したようにして調整されたジノモルゲスサルの熱可溶化した透明帯に対する抗 体濃度を有する無排卵のサルを生じた。ジノモルゲスサルのＨＳＰＺに対するピ ーク抗体濃度はｌ：８０００−１：１６，０００であった。

実質的に天然のブタＺＰＡ及びＺＰＢである）ＩｓＰＺの分画は実施例１に記載 したようにして等電気集束により調製し、ジノモルゲスサルにＧＭＤＰ／油アジ ュバント中分画ＨＳＰＺの各１ｍｇを、初期投与、それに続く約６週間後の追加 投与、それに続＜１１週間後の最終投与で皮下注射により行った。免疫されたサ ル熱可溶化した透明帯に対するピーク抗体濃度は　１：４，０００−１：８，０ ００であったが、一方では排卵サイクルを維持した。しかし、正規の排卵サイク ルを維持したにも拘らず、サルは免疫されたサル熱可溶化した透明帯に対するピ ーク抗体濃度抗体濃度が１：５００に低下するまでは不妊に留まり、その後は妊 娠した。

ジノモルゲスサルを組替えバクロウィルスで製造したイヌ　ＺＰＣ及びブタＺＰ Ｃ（実施例１８の方法で製造）で免疫したところ、熱可溶化したサル透明帯に対 する抗体産生を誘起したにも拘らず不妊を誘起しなかった。これに対する可能な 説明は、バクロウィルス系内で製造したＺＰ蛋白質のグリコジル化パターンが不 妊を誘起する抗原決定基の認識を妨げたためである。

細菌を使用して製造した上記のブタＺＰＡ、　ＺＰＢ、及び２ＰＣをジノモルゲ スサルに投与したところ、抗原に対する抗体濃度が得られたにも拘らず、熱可溶 化したジノモルゲスサルの透明帯に対する検出可能な抗体濃度は得られなかった 。

実施例１７ 晴乳動物の透明帯蛋白質の抗原決定基（エピトープ）のマツピング Ｐｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｅｐｉｔｏｐｅ　Ｓｃａｎｎｉｎｇキット　（ ＣｈｉｒｏｎＭｉｍｏｔｏｐｅｓ　Ｕ、Ｓ、、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ 　（Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、　ＰＴ−０２−２００００Ａ）を使用して透明帯蛋 白質中の抗原決定基のマツピングを作成した。キットに付属のマニュアルの方法 に従ったが、ＥＬＩＳＡ試験法（下記）の修正を行った。

簡単に説明すると、Ｐｉｎ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのソフトをＵｎｉｔｅｄ　Ｂ ｕｓｉｎｅｓｓ　Ｍａｃｈｉｎｅｓ　４８６／３３コンピユータにインストール した。蛋白質配列をコンピュータブラダラムに入れ、所望のペプチド長さ、及び ペプチド間の重畳度を選択し、活性化され保護されたアミノ酸誘導体とカップリ ングトレイのウェル中のそれらの位置の毎日の条件を含む手順をプリントした。

使用に先立って、ビンをジメチルホルムアルデヒド　（ＤＭＦ）で一度洗浄し、 次いでメタノールで３回洗浄した。

各洗浄は２分間継続した。ビンブロックを空気乾燥し、ビンをピリジンのＤＭＦ 中２０％溶液に室温で３０分間攪拌することによって脱保護した。ビンを再び上 記の様にして洗浄したが、各洗浄は５分間とした。次にビンブロックを空気乾燥 した。所要のアミノ酸誘導体溶液を調製してこのサイクルのための手順にしたが って合成トレイのウェルに分注した。乾燥したミモトーブビンをＤＭＦ中で再度 ５分間洗浄し、次いで、合成トレイのウェルに適宜に位置付けた。このアッセン ブリを次にプラスチックバッグに入れて計量し、次いでほぼ２２時間３０℃でイ ンキュベートした。ｉ欠の日に、ビンブロックをカップリングトレイから取り出 し、次いで上に述べた様にして同一の洗浄、脱保護、及びカップリングを行った 。しかし、上記のアミノ酸誘導体と次のサイクルに適当なトレイ位置を使用した 。前サイクルの洗浄、脱保護、洗浄、及びカップリングをペプチド配列が完了す るまで反復した。ペプチドの端末アミノ酸をカップリングした後、上記の様にビ ンブロックを洗浄し、空気乾燥し、脱保護し、洗浄し、空気乾燥した。ペプチド の末端アミノ基を、次にビンをＤＭＦ　５部、無水酢酸２部、及びトリエチルア ミン１部（体積）の混合物中に浸漬することによりアセチル化し、ポリプロピレ ン製のカップリングトレイのウェル中に分注し、３０℃で９０分間インキュベー トした。

ビンブロックを取り出し、上記の様にして更に他の洗浄工程にかけ、空気乾燥し た。

ポリペプチドの側鎖の脱保護はビンブロックを９５部の三フッ化酢酸と２．５部 のアニソール、及び２．５部のエタンジオール（体積）の混合物中、室温で４時 間かき混ぜることにより行った。ビンブロックは次に約１゜分間乾燥し、メタノ ールと脱イオン水を等量（体積）含む混合物に０．１％の塩酸を含有している浴 中で１５分間音波処理し、最後に空気乾燥した。

ＥＬＩＳＡ試験に先立ち、ビンを３９部の二水素正りん駿ナトリウム、２５部の ドデシルりん酸ナトリウム、０゜１部の２−メルカプトエタノール、及び２５０ ０部の脱イオン水（重量）の混合物よりなり、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７， ２に調製した浴中で音波処理にかけた。

音波処理は５５〜６０℃で約４５分間行った。ビンブロックを次にゆっくりと攪 拌しながら６０℃の脱イオン水の引き続（３つの浴中で各３分間ずつ洗浄した。

最後にビンブロックを静かに沸騰しているメタノール中に４分間浸漬し、次いで 空気乾燥した。

良１１且］１ 透明帯蛋白質に対抗する抗血清を、適当な動物を適当な透明帯蛋白質で、公知の 方法であるＥ、　Ｈａｒｌｏｗ及びり。

Ｌａｎｅ　ｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、　Ｃｈａｐｔｅｒ５、　（：ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８に記載の方法により処理して調製した。ビオチニ ル化した抗血清をＨａｒｌｏｗ　（上掲第３１４頁）に記載の方法による変性で 調製した。簡単に述べると、ｐＨ７，２の生理水入りりん酸塩緩衝液　（ＰＢＳ Ｉに１ｍｌ当たり１〜３ｍｇの選択した抗体１ｇＧフラクションを含有する溶液 に、ジメチルスルフオキシド中にビオチンアミドカプロエート、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル　（Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｔ　Ｎｏ、Ｂ２６４３）の２０ 〜２５０　ｕ　ｇを含有する溶液を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。混合物を 充分に混合し、次に室温で４時間インクベートした。２５０μｇのビオチンエス テル当たり２０μｌに相当する量の塩化アンモニウム１モル溶液を添加し、得ら れた混合物を室温で１０分間インキュベートした。未反応のビオチンエステルを Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（商品名）マイクロ濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉｖ ｉｓｉｏｎ、Ｗ。

Ｒ，Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、　Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）を使用して ＰＢＳにより透析処理をすることにより除去した。得られた複合体の稀釈率は適 当な天然蛋白質に対してＥＬＩＳＡ試験することにより決定した。

ＥＬＩＳＡ試験 Ｅｐｉｔｏｐｅ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｋｉｔマニュアルに記載の方法を修正して 使用した。

分解の後、ミモトーブビンを「スーパーカクテル」　（ＩＬの１０ｇの卵アルブ ミン、１０ｇのウシ血清アルブミン、及び１ｍｌのＴｗｅｅｎ　２０洗剤）を使 用して、室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。これを更に 適当に稀釈したビオチニル化抗血清で室温で１時間インキュベートした。ビンを ０．５％のＴｗｅｅｎ　２０を含有するＰＢＳ　（以下ＰＢＳＴ）で室温で各１ ｏ分間づつ攪拌しながら４回洗浄した。

これらのビンを、二次抗体、ホースラディッシュペロキシダーゼーストレブタビ ジン複合体（Ｚｙａ＋ｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、５ｏｕｔｈ 　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）をＰＢＳＴに１　：　２５００に稀釈し たもので室温１時間かけてインキュベートした。ビンは更に上記のようにして洗 浄した。

基質緩衝液を、１００ｍ１の１．ＯＭオルトリン酸酸水素ナナトリウム溶液１６ ０ｍ１の１．０Ｍクエン酸溶液と混合し、この混合物を１６４０ｍ１の脱イオン 水で稀釈し、更にクエン酸または水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ４，０に 調整することにより準備した。基質溶液を、１０ｍｇの２，２°−アジノービス （３−エチルベンズチアゾリン−６−スルフォン酸）ジアンモニウム塩を２０ｍ １の基質緩衝液に溶解し、次いで６μｌの３０％過酸化水素を加えて調製した。

前記のミモトーブビンを、ｌウェル当たり１５０μｍを含むマイクロリッタープ レートを使用し、室温でこの基質溶液を用いてインキュベー　トした。色がＥＬ ＩＳＡプレートリーグによる測定に適当である程度になった時、ビンブロックを 取り出し、プレートを４５０ｎｍの波長で読んだ。ビンブロックを次で上記の方 法で分解した。

データをＰｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙコンピュータに入れて、統計分析を行い 、評価を行い、そして最も強い結合エピトープを同定する結果をプリントアウト した。簡単に述べると、最低の光学読み取りを有する２５％のウェルは各実験の 背景を表すものとみなした。これらの読みの平均値及び標準偏差を計算した。抗 血清のペプチドの有意な認識は背景の平均と平均からの３標準偏差の合計よりも 大きい吸収を示すウェルに対応するビンに帰した。

ヒトＺＰＡ抗原決定基は、上述のようにして調製されたマウスのアンチヒト　ｚ Ｐ抗血清との反応性を検査された。長さ１５アミノ酸のペプチドをＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ、　４３に例示されているアミノ酸番号ｌから開始して合成した。ペプチ ド列の先行するペプチドと７アミノ酸重畳を有する後続のペプチドが合成された 。次のペプチドがマウスのアンチヒト　ｚＰ抗血清に結合することが示された。

１、−１５．９−２３．２５−３９．３３−４７．６５−７９．８１−９５．８ ９−１０３゜９７−１１１．１０５−１１９．１１３−１２７，１２１−１３５ ．１２９−１４３．１４５−１５９．１５３−１６７、１６１−１７５．１９３ −２ｆ１７．２０９−２２３．２１７−２３１．２２５−２３９．２４１−２５ ５．２４９−２６３．２７３−２８７．２８１−２９５．２８９−３０３、３０ ５−３１９．３１３−３２７．３２１−３３５．３２９−３４３．３３７−３５ １．３４５−３５９．３８５−３９９．３９３−４０７．４０１−４１５．４０ ９−４２３．４１７−４３１゜４２５−４３９．　４４１−４５５．　４４９− ４６３．　４５７−４７１．　４８１−４９５．　４８９−５０３、　４９７− ５１１．　５０５−５１９．　５１３−５２７．　５２１−５３５．　５３７− ５５１゜５４５−５５９．　５６１−５７５．　５６９−５８３．　５７７−５ ９１．　５８５−５９９．　６０１−６１５、　６０９−６２３．　６１７−６ ３１．　６２５−６３９．　６３３−６４７．　６４１−６５５゜６６５−６７ ９．６９７−７１１．７０５−７１９．７１３−７２７．７２１−７３５．及び ７２９−７４３゜ 同様に、ヒト　ＺＰＨの抗原決定基（エピトープ）をマウスのアンチヒトｚＰ抗 血清を使用してマツプ化した。これらの実験で、１５個アミノ酸ペプチドをＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ。

４１に記載のアミノ酸番号１より開始して合成した。引き続くペプチドの間の重 畳はこの例では９個のアミノ酸であった。次のペプチドはマウスのアンチヒト　 ｚＰ抗血清に結合することが示された。

７−２１．２５−３９．３１−４５．４９−６３．６７−８１．７３−８７．７ ９−９３．９１−１０５．１０３−１１７．１２１−１３５．１９３−２０７， ２０５−２１９．２１１−２２５゜２１７−２３１．２２３−２３７．２２９− ２４３．２５３−２６７、２５９−２７３．２６５−２７９、２８３−２９７． ２８９−３０３．２９５−３０９．３０１−３１５．３０７−３２１．３１３− ３２７．３１９−３３３．３４３−３５７．３４９−３６３．３５５−３６９． ３６７−３８１、３７３−３８７．３７９−３９３．３８５−３９９．４０３− ４１７．４０９−４２３．４１５−４２９．４２１−４３５．４３３−４４７． ４３９−４５３．　４４５−４５９．　４５１−４６５、４８１−４９５．４８ ７−５０１．４９９−５１３．５０５−５１９．５１１−５２５．５２３−５３ ７．５２９−５４３．及び５４７−５６１゜ヒトＺＰＣ抗原決定基をマウスのア ンチヒトＺＰ抗血清を使用してマツプ化した。これらの実験で、１５個アミノ酸 ペプチドをＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：６０１４−６０１８　（１９９０）に記載ノ アミノ酸番号ｌより開始して合成した。引き続くペプチドの間の重畳はこの例で は１０個のアミノ酸であった０次のペプチドはマウスのアンチヒト　ｚＰ抗血清 に結合することが示された。２１−３５．５１−６５．１１６−１３０．１４６ −１６０．１５１−１６５．１８１−１９５．２４１−２５５．２５１−２６５ ．２７１−２８５．２９６−３１０．３２１−３３５、４０１−４１５．　及び ４１１−４２５゜イヌ　ＺＰＣ抗原決定基をウサギアンチイヌＺＰ抗血清を使用 してマツプ化した。これらの実験で、１５個アミノ酸ペプチドをＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ、　１０に記載のアミノ酸番号ｌより開始して合成した。引き続くペプチド の間の重畳はこの例では５個のアミノ酸であった。次のペプチドはウサギのアン チイヌｚＰ抗血清に結合することが示された、５１−６５．　６１−７５．　８ １−９５．　１３１−１４５．１８１−１９５．及び３０１−３１５゜ ネコｚＰＣ抗原決定基をウサギアンチネコＺＰ抗血清を使用してマツプ化した。

これらの実験で、１５個アミノ酸ペプチドをＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，１８に記載の アミノ酸番号１より開始して合成した。引き続くペプチドの間の重畳は５個のア ミノ酸であった。次のペプチドはウサギのアンチネコ　ＺＰ抗血清に結合するこ とが示された。　３６−５０．４６−６０．　５６−７０．　７６−９０．　９ ６−１１０，１０６−１２０．　１１６−１３０．　１２６−１４０、１３６− １５０．１４６−１６０．１５６−１７０．１８６−２００．１９６−２１０． ２４６−２６０．２６６−２８０．２７６−２９０．２８６−３００．２９６− ３１０．３１６−３３０、３２６−３４０．３３６−３５０．３４６−３６０． ３７６−３９０．３（＋６−４１０．及び４０６−４２０゜ ウシｚＰＣ抗原決定基をウサギアンチウシＺＰ抗血清を使用してマツプ化した。

これらの実験で、１５個アミノ酸ペプチドをＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２４に記載の アミノ酸番号１より開始して合成した。引き続くペプチドの間の重畳は１０個の アミノ酸であった。次のペプチドはウサギのアンチウシｚＰ抗血清に結合するこ とが示された。１−１５．３１−４５．５１−６５．５６−７０．６１−７５． ７６−９０．１０６−１２０．１１１−１２５、１１６−１３０．１２１−１３ ５．１３１−１４５．１３６−１５０．１４１−１５５．１４６−１６０．１５ １−１６５．１６１−１７５．１８１−１９５．１８６−２００．１９１−２０ ５゜１９６−２１０．２０１−２１５．２０６−２２０．２１６−２３０．２２ ６−２４０．２４１−２５５、２４６−２６０．２６１−２７５．２６６−２８ ０．２７１−２８５．２７６−２９０゜２９１−３０５．２９６−３１０．３０ １−３１５．３１６−３３０．３２１−３３５．３２６−３４０、３３１−３４ ５．３３６−３５０．３４１−３５５．３５６−３７０．３６１−３７５．３７ ６−３９０．３８１−３９５．３８６−４００．３９６−４１０．４０１−４１ ５．及び４０６−４２０゜ 実施例１８ 組替えｚＰＣ蛋白質によるイヌの免疫処理イヌを各種の組替えイヌＺＰｃにより 免疫処理した。プラスミドル２１６９表現ベクター（図５）次のように構成した 。ペアレントベクターｐ２９８　（実施例９に記載）を制限酵素Ｐｖｕｌ及びＢ ａｍ　ＨＩにより消化し、大きい断片をゲルＭ製した。このベクターに次のオリ ゴヌクレオチドをアニールすることにより得られた断片を接合した。

５°ＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧ ＧＧ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５０）；及び ５°　ＧＡＴＣＣ，ＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣ：ＡＧＴＴＧ ＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴ　３’ （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５１） これらのオリゴヌクレオチドはＰｖｕｌ及びＢａｍＨＩ端部を有する断片を生成 し、ヘキサペプチド配列Ｈｉｓａをコードする。この中間ベクターを制限酵素Ｂ ａｍＨ１およびＥｃｏＲＩで消化し、大きい断片をゲル精製した。このベクター にこのベクターに次のオリゴヌクレオチドをアニールすることにより得られた断 片を接合した。

５°ＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧ　３゜ （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　５２）；及び５°ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴ ＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧ　３゜（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　５３）。

これらのオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ端部と、　ＢａｍＨＩ 部位のすぐ下流にＸｈｏ１部位を有する断片を生成し、ヘキサペプチド配列Ｈｉ ｓｓをコードする。この新しいベクターをｐＺ８８と呼ぶ。このベクターはＢａ ｍＨｌとＸｈｏｌクローニング部位を２個のＨｉｓｓ配列の間に有する。ｐＺ１ ６９を生成するために、ｐＺ８８ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消 化し、大きい断片をゲル精製した。このベクターに次のオリゴヌクレオチドを使 用してイヌ　２ＰＣｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによ り得られた断片を接合した。

５’　ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＡＧ　３ ゜（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　５４）；及び５’　ＧＣＧ（：ＴＣＧＡＧＧＧＣＡ ＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＧ　３゜（ＳＥＱ　１０　ＮＯ，５５）。

この　ＰＣＲ４ｉ′ＢａｍＨＩ端と　ＸｈｏＩ端とを有し、イヌｚｐｃ配列のア ミノ酸２３−２０７を有する断片である。この新しいベクターはｐＺ１６９　（ 図５）と呼ばれ、Ｅ、　ｃｏｌｔβ−ガラクトシダーゼ配列のアミノ酸１−５６ 　、　Ｈｉｓｓ、イヌＺＰｃ配列のアミノ酸２３−２０７、Ｅ、　ｃｏｌｔβ− ガラクトシダーゼ配列のアミノ酸１００６−１０２３　を含む蛋白質を生成する 。この蛋白質はＮ末端イヌ　ＺＰｃと呼ばれる。図５において、ｐＴＡＣ：はす でに述べたｔａｃプロモータを指し、ＡｍｐＲはアシンビシリン抵抗性マーカを 指し、ａｒｔは複写配列のＥ、　ｃｏｌｉ原点を指し、そしてｐＬａｃＩはＬａ ｃＩ遺伝子の表現を駆動する１ａｃｌプロモータを指す。

実施例９に示すようにしてイヌｚＰｃを生成し、精製した。バクロウィルス表現 ベクターｐＺ１４５を次のようにして構成した。ペアレントベクターｐＢ１ｕｅ Ｂａｃ２　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅ ｇｏ、ＣＡより購入）を制限酵素Ｎｈｅｌ及びＢａｍＨＩで消化し、大きい断片 をゲル精製した。このベクターに次のオリゴヌクレオチドを使用してブタ　ＺＰ ＣｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）を行うことにより得られた断片を 接合した。

５’　ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧ ＴＴＣ３゜（ＳＥ口ＩＤ　Ｎｏ、　５６）；及び ５　’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧ ＡＣＴＡＧＴＯＧＡＣＣ（、ＴＴＣＣＡ　３゜ （ＳＥｏ　１０　Ｎｏ、５７）。

この　ＰＣＢにより、ＮｈｅＩ端と　ＢａｍＨＩ端と、ブタｚｐｃ配列のアミノ 酸２７−３５０と、５ｐｅＩ部位と、ヘキサペプチドＨｉｓ６とを有する断片を 生成した。この新しいベクターはｐＺ１４７と呼ばれる。ｐＺ１４５ベクターを 生成するために、ｐＺ１４７をＮｈｅＩと　５ｐｅＩＥで消化し、大きい断片を ゲル生成した（これはブタのｚＰＣ配列を除去する）、このベクターに次のヌク レオチドを使用してイヌＺＰＣｃＤＮＡのポリメラーゼ連反応（ＰＣＲ）を行っ て断片を接合した。

５°ＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡ ＴＴＴＴＣ３゜（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　５８）；　ａｎｄ５’　ＣＧＣ：ＡＣ ＴＡＧＴＴＧＡＣＣＣＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＡ　３゜（ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ。５９）。

このＰＣＲにより　ＮｈｅＩ端及び５ｐｅＩ端と、イヌ配列のアミノ酸１−３７ ９を有する断片が生成された。この接合の形質転換体をスクリーンして正しい配 向の挿入ＮｈｅＩ／Ｓｐｅ■断片（ＮｈｅＩと５ｐｅＩの接着末端は同一なので ）を得た。この新しいベクターはｐＺ１４５（図６）と称され、　ＤＺＰＣ配列 のアミノ酸１−３７９とそれにつづ＜　Ｈｉｓｓを含む蛋白質を生成する。この 蛋白質はバクロイヌＺＰＣと呼ばれる。図６においてｐＰはバクロウィルスプロ ヘトリンプロモータを指し、ＡｏｐＲはアンピシリン抵抗性マーカを指し、Ｌａ ｃＺはβガラクトシダーゼに対する遺伝子を指し、ｐＥはＬａｃＺの表現を駆動 する構成プロモータを指し、またａｒｔはＥ、　ｃｏｌｉ原点を指す。

組替えバクロウィルス誘導イヌＺＰＣを、昆虫のＳＦ９細胞をＩ）２１４５及び Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重膜核多角形ウィルス（ ｍｕｌｔｉｐｌｙ　ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏ ｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　（ＡｃＭＮＰＶ）　）で共トランスフェクトさせることに より生成した。それには、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ Ａより購入したＭＡＸＢＡＣ（商品名）キットの説明書に記載の周知の方法にし たがった。昆虫のＳＦ９約９細胞中造した組替えイヌｚＰＣは共トランスフェク トさせたＳＦ９から次のようにして調製した。製造した。共トランスフェクトさ せた細胞を採取し、遠心分離によりペレット化し、実施例９で述べた方法により 組替えイヌＺＰＣを精製した。組替えイヌＺＰＣはまた実施例９に説明したよう に培養媒体から分離し、Ｎｉカラム上で精製しても良い各種の制御手順の下にヌ クレオチド配列をコードする透明帯を表現できる他のベクターも本発明で使用で き、周知の方法を使用して容易に構成できる。

組替え透明帯蛋白質はまた各種の方法により潜在的な抗原性を増すことにより変 性できる。例えば、バルミチル化により変性した組替えイヌ　ｚＰＣは次のよう にして調製した。すでに述べた方法でプラスミドｐＺ１６９を使用して精製した 組替えイヌＺＰＣの１ｍｇを８Ｍ尿素の最終濃度にした。次にパルミチル溶液（ Ｐｌ’２０／ＴＥＡ）を次に無水バルミチン酸をトリエチルアミンに添加し、ト リエチルアミン中２０　ｍｇ／ｍｌの無水パルミチル酸溶液を得ることにより調 製した。

約ｆｏμｌのＰ１２０／ＴＥＡ用役を１ｍｇの８Ｍ尿素中のＺＰＣ（上記）に添 加した。この混合物を室温で少なくとも２時間放置し、得られた調製物をＧＭＤ Ｐ／油アジエバントと混合す。

キトサン変性もイヌｚＰＣの有用な変性である。簡単に述べると、１．５ｍｌの 殺菌した鉱油を、プラスミドｐＺ１６９を使用して前述ようように調製した１、 ５ｍｌの組替えイヌ　ｚｐｃ溶液（２ｍｌ／ｍｌのＺＰＣ，３ｍｇ全量、８Ｍ尿 素中）を５滴のＡｒ１ａｃｅｌ　Ａ　（マンニドモノオレエート、Ｓｉｇｍａ、 　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）と混合した。次に０．７５ｍ１のキトサン（２％ ｗｔ／ｖｏ１．０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＰ５）を添加し、混合物を１０〜２ ０秒間音波処理し、０．０４５ｍ１の５０％ＮＡＯＨを加え、更に１０〜２０秒 間音波処理した。最後に、１０μｍの１０ｍｇ／ｍｌのＧＭＤＰ／８Ｍ尿素を添 加した。

３匹のイヌを各１か目間隔で５回、１上記のように調製したキトサン添加で変性 した１ｍｇのＮ末端イヌＺＰＣで免疫処理した。免疫処理したイヌは熱可溶化イ ヌ透明帯に対して１：８０００−１：　１６０００の抗体濃度（自己免疫濃度） を生じた。自己免疫濃度（５ｅｌｆ−ｔｉｔｅｒ）を生じたイヌは無排卵であり 、発情サイクルは遅延した（通常のイヌの１０日〜１４日の代わりに、４〜６週 ）。免疫処理した３匹のイヌのうち、２匹は初期発情を経験したが、そうちの１ 匹は第１回免疫処理から６か月後に発情し、繁殖飼育したが不妊であった。２番 目のイヌは発情をしたが、最初の免疫処理から９か月間不妊であった。３番目の イヌ免疫処理後９か月収上でも発情しなかった。

他の４匹のイヌをＧＭＤＰ／油アジュバント中に溶解した１ｍｇのバルミチル化 したイヌＺＰＣ（上記のように調製したもの）を使用して１か月間各で３回皮下 注射で免疫処理した。これらのイヌは自己免疫濃度１：４０００−１：８０００ を生じた（熱可溶かイヌ透明帯に対し）、免疫処理の後約７か月後に、２匹は発 情したが不妊状態であり、残りの２匹は発情しなかった。

更に他のイヌの組を、　ｐ２１６６　（ｐＺ１６９に類似であるがイヌＺＰＣ蛋 白質のアミノ酸２３−３７９をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド）を使用 して精製した組替えイヌＺＰＣの１ｍｇをＧＭＤＰ／油アジュバント中に溶解し たもので１か目間隔で３回皮下注射して免疫処理した。これらのイヌは自己免疫 濃度を達成せず、繁殖飼育で妊娠した。同様にバクロウィルスを使用して調製し たイヌｚＰＣで免疫処理したイヌも不妊を誘発しなかった。

実施例１９ 組替え透明帯蛋白質によるウシとネコの免疫処理ウシとネコの不妊を誘起するた めの組み替え透明帯蛋白質の能力を評価するために予備研究を行った。ウシに図 ５のプラスミドｐＺ１６９を使用して調整したイヌＺＰＣを含むイヌ及びブタ源 からの組替えＺＰＣ蛋白質変種１ｍｇ（ＧＭＤＰ　（２５０ｕｇ）　／油アジュ バント中）を３回以上注射した０組替え蛋白質を変性しない形、バルミチル化変 性した形、及びキトサン変性した形で投与した。どのｚＰ蛋白質調整物も自己免 疫濃度または不妊を誘起しなかった。

同様に、ネコを次の組替え透明体蛋白質で免疫処理した０組替えネコ　ＺＰＡ、 　ＺＰＢ、及びｚｐｃ　、上述のようにして図３のプラスミドｐＺ１５６を使用 して製造したブタｚｐｃ、及びプラスミドｐＺ１６９を使用して営造したイヌｚ ｐｃ、これらのＺＰ蛋白質を使用して免疫処理したネコはそれらの投与蛋白質に 対する抗体を生成したが、自己免疫濃度は生ぜず、結局は妊娠した。

上記実施例から、本発明の範囲内で多くの変形例があり得ることは明らかであろ う。実施例は本発明を例示するものであって、発明を限定するものではない。

配列リスト （１）配列数　５９ １２１　１ＮｒＱＲＨＡＴ１ＯＮ　ＦＯＲ５ＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：ｌ：（ｉｉｌ　 ＨＯＬＥＣＩＪＬＥ　ＴＹＰＥ：　ｅＤＮＡｆｉｉｉｌ　ＨＹＰＯ丁ＨＥＴＩＣ ＡＬ＋　Ｎ。

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Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｑνａｌ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｙ　Ｈｌｓ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔτｈｔ　ｌ１ｅ八ｒｑ　Ｌａｕ　Ｘｌｅ 　Ａｓｐ　ｘｓｐ　ｘｓｎ　Ａｌａ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ａｒ９　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ 　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　ＴｙｒＨ１ｓ　１１ｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　Ｍｅｔ　ＧＬｙ　ＡＬａ　ＧＬｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　 ＨＬｓ　５ｅｒにｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　ＣｙＩ！　１４ｅｔ　Ｌｙｓ 　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｈｅｔ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ａｓｎ　Ｐ■■ ｌｌｏ　１１５　１２０ Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａ＋＋ｎ　Ｖａｌ 　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｅ　Ｇ１■ １２５　１コ０　１３５　１４０ 、　Ａｒｇ　Ｍｌ！ｔ　ＧＩＹ　ＴｒＰ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＶａＩＧＩ Ｙ　ＡＳＰ　ＧＡＹ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ａｌ−９Ｔｈ■ Ａｒｇ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　）ｌｉｅ　Ｌｅｕ 　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｐｔｏ　１．、ａｕ　Ｌｙｓ　kａｕ Ｌｙｓ　ＨＬｔＩＶａ↓５＊ｒ　Ｈｉｍ　ｃｌｙ　Ｇｉｎ　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ｚ ｌｅ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｂａｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ＺｌａＣｙｍ　Ｖａｌ　Ａｌ ａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａａｎ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ２２５　２コｏ　２コ５ Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　）Ｉｉｓ　Ｇｉｎ 　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌｙ■ ２Ｂ５　２９０　２９５　３００ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｔａ　ＨＬｓ　ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｘ１ｔａ　’ｒｙｒＰ秩B ３０５　３１０　コ１５ Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｃｙａ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ＣｙｓＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐ ｈｅ　Ｌｙｓ　八ｌａ　Ｐｒｏ　八ｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　に ｉｎｎ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　ｌｉ＠　ＰｒB ３６５　３７０　コア５　３８０ Ｌａｕ　Ａｇｒ＋　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｏｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＨＬａ　Ｌｙｓ 　Ｐｈｅ　ＬｙＩＩＡｓｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＶａｌＩｌａＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌ ｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

八ｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｔ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｖａｎ４６５　４７０　４ フ５ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃ１ｎ　Ｐｒｏ　ＩＬｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 ＧＬｕ　ＶａＬ　Ａｒｇ　ｒｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＡｒｇＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｐ ｒｏ　Ａｇｎ　ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｃｙ ｍ　丁ｒｐ　Ａｌａ　丁ｈｒ　５ｅｒ４９５　５００　５０Ｓ 丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　（ｉｎｎ 　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｌ■ ５ユＱ　５１５　５２０ ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ｒｙｒ　Ａ１１ｌｌ　Ｌａｕ　ＡＩＩＰ　Ａｓｎ　ｓｌｓ　Ａ ｒｇ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ＨＬｍ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　fｌｙ ５２５　Ｓ３０　Ｓコ５　５４゜ Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｖａｌτｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａａｎ　Ｈ４＋＋　ＨＬｓ　 にｉｎｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｔｈ■ Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＨｉｓ　Ｃｙｌｌ　Ｓ ｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｉｌａ　Ｃｙｔｌ　Ａｇｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　５ｅｒ　Ｌ■■ ５７５　５ｉｌｏ　５８５ Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｉ　）ｌｉｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　５＠ｒ 　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　ＧＬ■ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅセ　Ｉｌ＠　Ｖａｌ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　工Ｌ＠　ＬｅｕＬｅｕ　Ｌｅｕ　ｓ ｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　八ｌａ　Ｖ ａｌ　Ａｓｎ　５ｅｒ　Ｌｙｒ＋　Ｇｌ■ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｉｍ　Ｐｈｓ　 Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍｅ仁　Ｖａ１八Ｌａ　Ｓｅｒ　Ａ ｌａ　Ｇｌｙ　ＸＬｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｌａｕ　工 １ｅ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ（ＡＩ　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （８１ＬＯＣ八τへＯＮ：　３Ｂ、、λ６４８ＣＡＣＡＣＴ　ＴＴＴ　ＧＴＣＣ ＴＣＴＴＣＣＧＧ　ＴＴＴ　ＣＣＡ　丁ＴＴ　ＡＣＴ　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＧＧ　 ＡＣＴ　Ｇ（Ｊ　７７５Ｈｉｍτｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｐｈｓ　Ａｒ ｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌ ａ９５　ｌｏｏ　１０５　１１０ ＡＡＡ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＡＡＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　τ ＡＴ　ＧＡＡ　ｋＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　W２３ Ｌｙｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　丁ｈｔ　Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｔｙｒ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ１５　ユ２０　１２ ５ ＾ＴＣＴＴＣＡＧＧ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＴＧＴ　ＡＴＣＴＡＣＴ ＣＴ　ＧＴＡ　ＡＧＴ　ＡＧＣＡＧＴ　ＧＣＴ　９１９１１＠　Ｐｈｓ　Ａｒｇ 　Ｌｓｕ　入ｒｇ　Ｖａｌ　ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｘｌａ　丁ｙｒ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ 　Ｓ＠ｔ　Ｓ＠ｔ　Ｓｅｒ　Ａ１ｍ１４５　１５０　Ａｓ５ Ｉ：＋ｒＣＣＣＡ　ＧＴＴ　八ＡＣＡＴＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＴＴＣへＣ丁　ＣＴ ＣＣＣＡ　ＣＣＡ　ＣＣＣＣ７丁　ＣＣＧ　ＣＡＧ　９６７Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ　Ａｇｎ　Ｘｌｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ＾ＣＣＣＡＣＣＣＴ　ＧにＡ　ＣＣＴ　 ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＡＴＴ　ＧＣＣＡＡＡ　Ｃ ＡＴ　ＧＡＡ　１０P５ Ｔｈｒ　ＨＬｍ　Ｐｒｏ　（ｉｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ 　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　１１＠＾ｌａ　ＬｙＩＩＡｓｐ　Ｇｌｕｌ）５　ユ８０　、 、　１８５　１９０丁ＡＣＡＣＴ　ＧＧｋ　ＧＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧ　Ａｃｅ 　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＣＴ　ＣＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＣ１２５５丁ｙ ｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｇｎ　Ｔｙｒ　ＣＬｎ　Ｔｈｒ　ＬｙＩＩ　Ｌ ｅｕ　Ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　ＡｌａＴＴＣＡ（ｉ丁　ＴｉＴ 　ＧＴＧ　ＧＡＣＴＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＭＧ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＡ Ｇ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　１コTＩ Ｐｈ＊　Ｓａｒ　Ｐｈ＠　Ｖａｌ　Ａｓｐ　５ｅｒ　Ｖａｌ　八ｌａ　Ｌｙｇ　 Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　Ｖａ１２９０　２９５　コ ０Ｏ ＡＧＧ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＡＣＴＣＣＣＡＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＴＧ Ｇ　ＧＴＣＧＣＴ　ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＧＡ　１５９１＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒ ｏ　Ｖａｌ　八ｆｉｐ　Ｓｅｒ　ＨＬｍ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌ■ コア０　３７５　３８０ Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ｓｅｒ　ｌｅ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｃ ｙｓ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＡｌｍＬａｕ　Ｐｒｏ　ＧＬ ｙ　Ｇｉｎ　５ａｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙ＠　Ａｌｍ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓ ｐ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　＋、＊■ Ｔｙｒ　Ｃｙｍ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｈｅ　ＨＬｍ　Ｐｈａ　 Ｓａｒ　ＩＩｓ　Ａｇｎ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　ＧｌｎＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ａ ｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃ１ｙ　ＡｒｇＬｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉ ｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｖａ ｌ　Ｈｌｓ　ＬｙｍＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｓａｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ 　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙｍ　Ｔｙｒ −５５−５ｏ　−４５ Ｖａｌτｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　）ｌｉｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｉｌａ　Ｃ１ｙ　Ｌ、ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌ■ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　）Ｉｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙ■ −２０−１ｓ　−１０ Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＣｙｓＡｓｐ　Ａ１１ｌ　 ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａ１１ｐ　Ａｒｇ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｍ 　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｘ戟■ ユＯ１５２０ Ｔｈｒ　ＧＬｈ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　 Ｃｙｍ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ２５　３０　、　３ ５　４０ Ｖａｌ　ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｍ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｎ４５　Ｓｏ　５５ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　５ｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｔ　 Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　丁ｒｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　５＠ｒ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＬｓｕ　ｖｉａ　Ａ ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　ＴｙＨＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｙ ；　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＬｌｌｕＳｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｍｅ ｔ　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓａ ｒ　Ｓｅｒ　ＧＬｕ３４５　コ５ｏ　コ５５　コロ。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲＩ （７２）発明者　ボトルスキー、ジョゼフ　ニス。

アメリカ合衆国　７７３８１　テキサス、ザウッドランズ、ペブル　ホロウ　コ ート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．対象哺乳動物（ヒトを除く）に、哺乳動物のＺＰＡ蛋白質、ＺＰＢ蛋白質、 またはそれらの組合せよりなる群より選択され且つ対象哺乳動物中で前記ＺＰＡ 蛋白質またはＺＰＢ蛋白質を認識する抗体の産生を刺激するのに有効な量の透明 体蛋白質またはその断片を投与することよりなる、対象哺乳動物に反復可能な一 時的な不妊を誘起する方法。 ２．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、対象哺乳動物と同一種に由来するも のである請求項１の方法。 ３．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、対象哺乳動物とは異種に由来するも のである請求項１の方法。 ４．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、シノモル グスサル、及びヒトＺＰＡ蛋白質よりなる群から選択される請求項１の方法。 ５．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、実質的にＺＰＣを欠いている請求項 １の方法。 ６．透明体蛋白質は実質的にＺＰＡ蛋白質単独からなる請求項１の方法。 ７．透明体蛋白質は実質的にＺＰＢ蛋白質単独からなる請求項１の方法。 ８．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は組替えＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質である 請求項１の方法。 ９．抗体濃度は少なくとも１：２５０である請求項１の方法。 １０．対象哺乳動物（ヒトを除く）に、対象哺乳動物中で前記ＺＰＣ蛋白質を認 識する抗体の産生を刺激するのに有効な量の哺乳動物の組替えＺＰＣ透明体蛋白 質またはその断片を投与することを特徴とする、対象哺乳動物に永久的な不妊を 誘起する方法。 １１．哺乳動物の組替えＺＰＣ透明体蛋白質は対象哺乳動物と同一種に由来する ものである請求項１０の方法。 １２．哺乳動物の組替えＺＰＣ透明体蛋白質は、対象哺乳動物とは異種に由来す るものである請求項１０の方法。 １３．哺乳動物の組替えＺＰＣ透明体蛋白質は、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、シ ノモルグスサル及びウシＺＰＣ蛋白質よりなる群から選択される請求項１０の方 法。 １４．哺乳動物の組替えＺＰＣ透明体蛋白質は実質的にＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質 を欠いている請求項１０の方法。 １５．組替えＺＰＣ蛋白質またはその免疫避妊活性の断片の避妊有効量を含有す る避妊剤。 １６．哺乳動物のＺＰＡ蛋白質、ＺＰＢ蛋白質、またはそれらの組合せよりなる 群より選択された透明体蛋白質またはその断片の避妊有効量と、必要に応じて薬 理的に許容し得る担体、稀釈剤及びアジュバントを含む避妊剤。 １７．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、対象哺乳動物と同一種に由来する ものである請求項１６の避妊剤。 １８．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、シノモ ルダスサル、及びヒトＺＰＡ蛋白質よりなる群から選択される請求項１６の避妊 剤。 １９．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、実質的にＺＰＣを欠いている請求 項１６の避妊剤。 ２０．哺乳動物のＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質は、組替えＺＰＡ及びＺＰＢ蛋白質で ある請求項１６の避妊剤。 ２１．ＳＥＱＩＤＮＯＳ，１，３，及び５に記述されたＤＮＡ配列を有するブタ ＺＰＡ、ＺＰＢ、ＺＰＣ蛋白質またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生 成されたＤＮＡ配列。 ２２．ＳＥＱＩＤＮＯ．７に記述されたＤＮＡ配列を有するウサギＺＰＣ蛋白質 、またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤＮＡ配列。 ２３．ＳＥＱＩＤＮＯＳ．９及び１１に記述されたＤＮＡ配列を有するイヌＺＰ Ａ、ＺＰＣ蛋白質、またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤ ＮＡ配列。 ２４．ＳＥＱＩＤＮＯＳ．１３、１５、及び１７に記述されたＤＮＡ配列を有す るネコＺＰＡ、ＺＰＡ、ＺＰＣ蛋白質、またはその免疫避妊活性断片をコードす る単離生成されたＤＮＡ配列２５．ＳＥＱＩＤＮＯＳ．１９、２１、及び２３に 記述されたＤＮＡ配列を有するウシＺＰＡ、ＺＰＡ、ＺＰＣ蛋白質、またはその 免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤＮＡ配列。 ２６．ラムダファージクローンＡ１（ＡＴＣＣＮｏ．７５４０４）及びＡ４（Ａ ＴＣＣＮｏ．７５４０３）のヒトＤＮＡ挿入体に存在するＤＮＡを含むヒトＺＰ Ａ蛋白質、またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤＮＡ配列 。 ２７．ＳＥＱＩＤＮＯ．４２に記述されたＤＮＡ配列を有するヒトＺＰＡ蛋白質 、またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤＮＡ配列。 ２８．ラムダファージクローン１−１（ＡＴＣＣＮｏ．７５４０６）及び４−９ （ＡＴＣＣＮｏ．７５４０５）のヒトＤＮＡ挿入体に存在するＤＮＡを含むヒト ＺＰＢ蛋白質、またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤＮＡ 配列。 ２９．ＳＥＱＩＤＮＯ．４０に記述されたＤＮＡ配列を有するヒトＺＰＢ蛋白質 、またはその免疫避妊活性断片をコードする単離生成されたＤＭ配列。 ３０．請求項２１のＤＮＡ配列を有するベクター。 ３１．請求項２２のＤＮＡ配列を有するベクター．３２．請求項２３のＤＮＡ配 列を有するベクター。 ３３．請求項２４のＤＮＡ配列を有するベクター。 ３４．請求項２５のＤＮＡ配列を有するベクター。 ３５．請求項２６のＤＮＡ配列を有するベクター。 ３６．請求項２７のＤＭＡ配列を有するベクター。 ３７．請求項２８のＤＮＡ配列を有するベクター。 ３８．請求項２９のＤＮＡ配列を有するベクター．３９．請求項３０ないし３８ のいずれかのベクターにより安定に形質転換またはトランスフェクトした原核ま たは真核宿主細胞。 ４０．請求項２１ないし２９のいずれかのＤＮＡ配列の原核または真核宿主細胞 内における発現生成物。 ４１．適当な栄養条件下に、請求項３０ないし３７のいずれかのＤＮＡベクター により形質転換またはトランスフェクトした原核または真核宿主細胞を成長させ 、該ベクターの発現生成物から所望のポリペプチドを分離することよりなる、哺 乳動物の組替え透明体蛋白質またはその断片を製造する方法。 ４２．対象哺乳動物（ヒトを除く）に、透明帯蛋白質に対するアンチ−ＺＰＡ抗 体及びアンチ−ＺＰＢ抗体よりなる群がら選択した避妊有効量の抗体を投与する ことからなる避妊方法。 ４３．対象哺乳動物（ヒトを除く）に、透明帯蛋白質に対する避妊有効量のＺＰ Ｃ抗体を投与することからなる避妊方法。