JPH05500654A - クローン化透明帯遺伝子を基本とする避妊ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 クローン化透明帯遺伝子を基本とする 避妊ワクチン 発明の分野 本発明は、クローン化透明帯遺伝子（ｃｌｏｎｅｄ　ｚｏｎａｐｅｌｌｕｃｉｄ ａ　ｇｅｎｅ）を基本とする避妊ワクチンおよび透明帯ポリペプチドを用い、た 同種免疫法による実施計画に関連するものである。特に本発明は、精子による卵 母細胞の受精を阻止する抗体の結合に対して少なくとも１つのエピトープを示す ポリペプチドを含有する、哺乳類のメスに使用するための避妊ワクチンに関連す るものである。このエピトープは、上述のワクチンが使用される動物種の透明帯 蛋白質に由来するものである。さらに詳しくは、本発明は、透明帯蛋白質がマウ スのＺＰ３またはＺＰ２またはＺＰＩ蛋白質或いは他の哺乳類におけるこれらの 蛋白質の相同体のいずれかであるワクチンに関連するものである。さらに本発明 は、受精を阻止する抗体に対してエピトープを表面に表す合成べ１チド含有ワク チンも包含するものである。

加えて、本発明は、マウスのＺＰ３またはＺＰ２蛋白質あるいは人のＺＰ３Ｗ白 譬を各種にコード化するクローン化ＤＮＡセグメントに関連するものである。

発明の背景 現在、種々の哺乳類の個体数を調節するための安全かつ有効な避妊ワクチンの開 発に多大な関心が寄せられている０例えばネコやイヌなどのペット、畜生やブタ など農業に重要な家畜、ならびに人類において、頻繁に処置する必要がなく、比 較的長期間ではあるが永久的ではない避妊が望まれるある一定の環境下では、避 妊ワクチンが有用と考えられる。避妊ワクチンは、好ましくは、持続的かつ特異 性が高い作用が無ければならない、さらに、避妊に失敗した場合の先天的欠損症 の可能性を最小限にするため、発生初期の分裂に影響を与えて流産させるメカニ ズムによるのではなく、むしろイムノゲンとして選定する抗原が、精子による卵 の受精を阻止する避妊抗体を産生ずるものでなければならない。加えて、このワ クチンは、生殖機能の異常を来たすような細胞毒性反応を引き起こすことなしに 、避妊についての十分な有効性のある免疫反応を誘発するものであることが好ま しい。

哺乳類の透明帯は、成長中の卵母細胞および排卵された卵を取り巻いており、避 妊ワクチンのイムノゲンになる可能性があると考えられてきた（Ｃｌ、　Ｈｅｎ ｄｅｒｓｏｎら１９８８年、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　８３．　３２５ −３４３；　Ｂ、Ｓ、Ｄｕｎｂａｒ１９８３年、Ｍｅｃｈａｎｉｓｌｇｌｓ　ａ ｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｆｅｒｔｉｌｉ−ｚａｔｉｏｎ　 （動物の受胎の機序およびｉＮ　Ｗｆ　）　＋　Ｊ、Ｆ、Ｈａｒｔｍａｎｎｅｄ 、＋　ｐｐ、１４０−１７５．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ−二ｓ−ヨーク ；Ａ、Ｔ、５ａｃｃｏ、　１９８７年、ＡＩｌ、　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、　１５．１２２）。出生時に、マウス卵 巣には第一減数分裂前期の卵母細胞力月０．０００−１５，０００個入っている 。

これらの卯母細胞のコホート（１０−１５）が２週間成長期に入るお、透明帯蛋 白質を合成・分泌し、十分に成長した卯母細胞では厚さ７μｍに達する細胞外透 明帯を形成する。この透明帯は卵巣に特有で抗原性が高く、減数成熟および排卵 より前の２週間の卵巣内卵母細胞成長期の期間中、循環抗体に接近しやすい。

マウスまたはハムスターの抗透明帯血清による受動免疫は、明瞭な副作用なしに 可逆的な避妊を引き起こすことが明らかにされている。例えば、Ｇｗａｔｋｉｎ に対する合衆国特許第３．９９２．５２０号は、とりわけ、水に可溶化した異種 ドナーの透明帯を用いて動物を免疫化することにより得られた抗体を含有する、 短期受精能調節用抗血清組成を開示している。しかしこの方法には、比較的珍し い天然の抗原を大量に分離することが必要である。さらに、異なる種の（即ち“ 異種の”　（ｈｅｔｅｒｏ−１ｏｇｏｕｓ）　）抗体を長期投与すると、避妊抗 体の避妊作用を阻害する反応性抗体の誘導を招（。さらに、血清または血清から 分離した生成物の投与は、血液原性疾病が伝播するという固有の危険性を伴う。

透明帯の構造に関する情報は、ここ数年間入手できるようになってきた。例えば 、マウスの透明帯は、ＺＰｌ、ＺＰ２およびＺＰ３と呼ばれる３つの硫酸化した 糖蛋白質から成り（Ｊ、Ｄ、ＢＩｅｉｌら１９８０年、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ。

７６、　１８５；　Ｓ、Ｓｈｉｍｉｚｕら１９８３年、Ｊ、８ｉｏ１．　Ｃｈｅ ＲＩ、２５８゜５８５８）　、これらの糖質蛋白質は、受精および発生初期に重 要な役割を果たし、それぞれ２００，０００．１４０，０００．８５．０００の 平均Ｍ、Ｓをもつ。ＺＰ２およびＺＰ３は、構造的な一体性を与えている透明帯 基質内のＺＰＩにより架橋されている長い微細線維内に複合されていると思われ る。精子は５．０結合したオリゴ糖鎖により最初にＺＰ３に結合し、さらに、連 続した結合はＺＰ２を第２の精子受容体としで含む。続いてＺＰ３は、精子の透 明帯貫入に重要と考えられる（グリコシダーゼやプロテアーゼなどの）酵素を放 出する精子のアクロソームの溶解を惹起する。受精後、それ以上の精子の結合を 防止し、多精子受精に対する受精後妨害を容易にするため、ＺＰ２とＺＰ３の両 方が生化学的に修飾される。

マウス以外の透明帯は大きさが明らかな数種の異種のａｔ白質組成を包含するこ とが知られており、それゆえ、用語の呼称は、マウスＺＰＩ、ＺＰ２およびＺＰ ３と必ずしも一致しない。時によると、ブタなど、他の種にはそれ以外の蛋白質 （例えばＺＰ４と呼ばれる）が確認されているが、これがＺＰＩ、ＺＰ２または ＺＰ３に相当するものの分解産物を意味するがどうかはまだ決定されていない。

しかし、最近、ブタのＺＰ３垢蛋白質が、見かけ上の電気泳動的均一性にまで精 製されて、さらに分析が行われた（　Ｅ、Ｃ，Ｙｕｒｅｗｉｃｚら１９８７年、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋、、　２６２．５６４−５７１）　、総合すると、こ のデータは、ブタ卵母細胞透明帯の分子量５５．０００ＤａのＺＰ３抗原は、実 際上、構造的かつ免疫学的に異なる２つのラクトサミングリカン（ｌａｃｔｏｓ ａｍｉｎｏ−ｇｌｙｃａｎ）含有糖蛋白質に相当する、荷電異性体のオーバーラ ンプした同族体で構成されていることを示すものであると解釈された。

ネズミ透明帯の異なるポリペプチドＺＰＩ、ＺＰ２およびＺＰ３の同定を考慮し て、避妊抗体を用いた受動免疫に関する、さらに進んだ実験が実施されている。

特に、ラント抗マウスＺＰ２および抗マウスＺＰ３モノクローナル抗体をメスの マウスに注射すると、卵巣内の成長中の卵母細胞を取り巻いている透明帯に特異 的に結合した。排卵後も抗体は透明帯に結合したままで、これらの抗体が存在す ると精子の透明帯貫入が妨害され、受精が妨げられた。この避妊作用は長期にわ たり、マウス発情周期で約１５周期持続したが、最終的にはもとに戻った。受精 した胎児の出産までの成長に何等の悪影響も見られず、卵巣組織や機能の異常を 示す証拠も無かった。しかし、試験した異なる５種のラット抗ｌワスモノクロー ナル抗体により認識されたマウスＺＰ２およびマウスＺＰ３上の抗体結合部位（ すなわち［エピトープ」）は、他の哺乳類の透明帯に存在しなかった（７．８） 。この種に対する特異性は、避妊剤としてのこれらの特定の杭木の有用性を、本 質的にネズミ種に限定するものである。さらに、受精を阻止する類似したネズミ 抗ＺＰ２または抗ＺＰ３抗体が、非ネズミ種のＺＰ２またはＺＰ３を確認できる としても、上述の通り、異種抗体の反復投与による固有の副作用がある。

分離した透明帯製剤を俗書類の免疫化に使用した能動免疫に関する幾つかの研究 がなされてきた（　Ｃ，Ｊ、　Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　ら　１９８８　年、Ｊ、Ｒ ｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、８３．　３２５；　Ｒ。

Ｂ、Ｌ、Ｇｗａｔｋｉｎ　ら　１９７７　年、　Ｆｅｒｔ、　５ｔｅｒｉｌ　２ ９．　８７１）　。

さらに、上記引用のＧｗａｔｋｉｎに対する合衆国特許（合衆国第３，９９２． ５２０号）も、水性媒体中において６５〜１００°Ｃでは乳類の透明帯を加熱し て調製した、水可溶性化された透明帯の水溶液からなる雌のは乳類における受精 能調節の免疫学的調節用ワクチンを開示している。

その−例の中で、ヒトの使用を目的としたウシ抗原製剤について記述されている 。加えて、日本特許第６３゜１５０．２９９号は、８．５Ｍ尿素および２％の２ −ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ　を用いてブタの可溶性透明帯から抽出さ れうる分子量２０〜３０ｋＤａ　の糖蛋白質を特徴とする、ブタまたはヒト用避 妊ワクチンとして使用するブタ透明帯抗原を開示している。

実験条件下での結果が肯定的であるにもががわらず、特にヒトの場合は、抗原源 が限られており、しかもこのように定義が不十分なワクチンの品質管理は難しい ことから、もし商業的な実施が完全に非現実的でないとしても、天然の透明帯か らワクチンを調製するこれらの方法は、明らかに困難である。さらに、透明帯ま たは抽出抗原による能動免疫の後で、ウサギ、イヌおよび霊長類に広範囲に及ぶ 卵巣の＆ＩＩｍ変化およびｍ能不全が報告されている（例えばＲ，Ｂ、Ｌ、Ｇｗ ａｔｋｉｎら１９８０年、Ｇａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、　ｌ＋　１９；　Ａ、Ｔ、　 ５ａｃｃｏ、　１９７７年、　Ａｍ。

Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｉｍｍ＋ｕｎｏ１．旧ｃｒｏｂｉｏ１．１５．１２２） 　、いくつかの研究から、イムノゲンの投与量も純度も一因になることが示唆さ れるが、これらは、このように比較的に粗製の抗原製剤では管理が特に難しい２ つの特性である。

いくつかの研究では、透明帯抗原の遺伝子の起源が、受胎に対して特定の種を免 疫する能力に及ぼす影響を調査している９例えば、ブタおよびウサギの透明帯を 用いた避妊免疫の、ウサギにおける受精能に対する有効性を比較している。「同 種免疫（ａｌｌｏｉｍｎ＋ｕｎｉｚａｔｉｏｎ）　Ｊ（同じ種の抗原、即ち「同 種抗原（ａｌｌｏａｎ口ｇｅｎ）　」を用いる、厳密な意味で１自己免疫（ｓｅ ｌｆ−４ｍｍｕｎｉｚａ口。ｎ）Ｊ）による結果と、（別種の抗原、即ち［異種 の（ｈｅｔｅｒｏ−ｉｍ＊ｕｎｉｚａＬｉｏｎ）　Ｊ抗原を用いる）「異種免疫 ノの結果との比較（Ｄ、Ｍ、Ｗｏｏｄら、　１９８１年、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒ ｏｄ、　２５＋４３９−４５０）から、ブタ透明帯を用いたウサギの異種免疫は 、ウサギ透明帯を使用した同種免疫より受精能の低下に有効であると考えられて いる。免疫アフィニティーにより精製した透明帯に対する抗体を用いて、オスお よびメスのウサギ同種免疫における免疫反応を比較するための更に最近の研究に よれば、透明帯抗原による異種免疫による避妊のより高い有効性が支持されてい る。（Ｓ、Ｍ、　５ｋｉｎｎｅｒら、１９８７年、Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ５ ｖｅＩ１ｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２．８ｌ−９２）。　ある抗原に関連するワクチ ンを提供する別の一般的研究方法では、「抗イデイオタイプの（ａｎｔｉ−ｉｄ ｉｏｔｙｐｉｃ）　Ｊ抗体と呼ばれる特定のタイプの抗体を、動物の能動免疫の イムノゲンとして使用する。抗イデイオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合部位 に向けられた抗体である。したがって、抗イデイオタイプ抗体の結合部位は、他 の抗体が結合する抗原上の部位像によく似ているか、これを表している。Ｇｒｉ ｍｅｓらに対する合衆国特許第４，７９５，６３４号（−〇８７１０５．５１６ に相当する）は、透明帯抗原の像を発現する抗透明帯抗体に対する抗イデイオタ イプ抗体を包含するワクチンを開示している。抗イデイオタイプ抗体を、特にヒ トに適用する場合、ワクチンに使用するに十分な量と純度で調製するのは一般に 困難で高価であるという事実など、このワクチンには難点がある。さらに、他の 種からの抗体を包含する抗原による異種免疫化は、抗原結合部位という望ましい 標的以外の抗体上の部位に対する抗体を圧倒的に誘導するとも考えられる。換言 すれば、望み通りの抗原結合部位は、ワクチン蛋白質を産生じた種とは違う種の ワクチン抗体蛋白質に対する、「免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）　 Ｊ抗原部位（または「決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）　Ｊ　）の構成要素と はならない（免疫優性に基づいた考察は下記を参照のこと）。

当該技術分野に置いて一般に周知のもう１つのワクチン産生法は、標的組織の水 性抽出物を含む粗製の抗原製剤の代わりに、分離した特異的ポリペプチドを抗原 として用いるか、そのようなポリペプチドの一部を表しているペプチドを使用す る。したがって、５ｔｅｖｅｎｓに対するヨーロッパ特許ＥＰ−０１１７９３４ 号は、明記されていない透明帯由来の抗原、またはこの様な透明帯抗原配列の少 なくとも一部に相当する配列を有するペプチドを包含している受精能調節用の修 飾抗原を開示しているが、これらの抗原やペプチドは動物の体外で化学的に修飾 されたものである。修飾された抗原は、この抗原が誘導されたもとの修飾されて いない抗原より抗体誘導能が高い。明細書と請求の範囲によれば、このような修 飾は、その動物にとっては生化学的に外来で、しかも抗体反応を惹起するに十分 な大きさの適切な「担体」蛋白質に、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）結合に よるカップリングを含む。これまでに公表された限りでば７．この出願も関連出 潮も、特異的透明帯ポリペプチドまたは避妊ワクチンとしての使用に適したペプ チドに関する知識を与えるものではない。

上述の避妊ワクチン全ての複雑さ、困難、不確実性を考慮して、より簡単・安全 ・安価で、さらに限定された、しかも有効な避妊ワクチンが依然として必要であ る。この目的に向かって、本発明者および同僚は最近、マウス卵巣のｃＤＮＡク ローン発現ライブラリーおよび分離した２種のオーバーラツプするＺＰ３ｃＤＮ Ａクローンを作成したが（Ｍ、Ｊ、Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ　ら、　１９８６年、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．４３４１）　、 そのうちの１つは、抗ＺＰ３モノクローナル抗体により認識される融合蛋白質を 発現するものである（　１．Ｊ、　Ｅａｓｔら、１９８５年、Ｄｅｗ、　Ｂｉｏ ｌ、１０９．２６８）。

これらのクローンの同一性は、核酸配列の６０個のヌクレオチド列によりコード 化されたアミノ酸配列を、ＺＰ３蛋白質から分離した大きな内部フラグメントの 末端アミノ酸配列（アミノＭ２０個）七比較することにより確認された（Ｒｉｎ ｇｕｅｔｔｅ　ら、　１９８６年、上述）。

このフラグメントは、プロテアーゼ消化の後、抗ＺＰ３モノクローナル抗体を使 用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＺＰ３から分離さ れた。したがって、このフラグメントが避妊抗体に対するエピトープを発現でき ることは明白であったが、多数のアミノ酸残基内のエピトープの位置は明らかで はなかった。もっと重要なことは１．この蛍白質溶解性開裂フラグメントがワク チンにおけるイムノゲンとして作用する能力が知られておらず、その開裂フラグ メントの試験を進めるため、天然源から十分な物質を調製する実践方法もながっ たことである。

上述のクローン化マウスＺＰ３ｃＤＮＡをワクチン産生に利用する最初の試みは 不成功に終わった（Ｓ、Ｍ。

Ｃｈａｍｏｗ　ａｎｄ　Ｊ、Ｄｅａｎ　１９８７年、ａｂｓｔｒａｃｔ　ｏｆ　 ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｔｏ　ｔｈｅ　Ａｎｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　 ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ）。

ＺＰ３アミノ酸のほとんどとより多くの量のβ−ガラクトシダーゼを含み、固有 の免疫反応性を有する他の抗原をうまく産生じている遺伝子工学では周知の方法 に従って生成された、組み換え型ＺＰ３−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の試 験がなされた。しかし、この特別な融合蛋白質を用いた免疫化は、天然のＺＰ３ と反応する検出可能な抗体を誘導できず、ジスルフィド結合の還元および変性後 にのみ反応性が検出された。

ｃＤＮＡが明らかにそのような抗体と反応した蛍白質溶解性開裂フラグメントを コード化したという事実があるにもかかわらず、抗ＺＰ３避妊抗体の誘導に失敗 した根拠は、完全には明らかにされていない。免疫条件下で、避妊抗体エピトー プをコード化した融合蛋白質のその部分は、そのような抗体との反応に適した立 体配座をとらなかったと考えられる。換言すれば、融合蛋白質は、天然のＺＰ３ 蛋白質のエピトープを形成したアミノ酸を間違いなくコード化したが、この場合 にはそれらのアミノ酸がこのエピトープを示さなかった（即ち「表示」しなかっ た）のかも知れない。融合のβ−ガラクトシダーゼ部分にある、他の抗体のため のエピトープが避妊抗体エピトープより免疫優性なため、検出可能な反応を妨げ る可能性もある（下記の免疫優性に関する考察を参照）。最後に、これらの作１ 　用やその他の組み合わせが、はとんどのＺＰ３ポリペプチドを発現した組み換 え型ＤＮＡの融合産物に対する望み通りの避妊抗体反応の妨害を結びつけたとも 考えられる。これらの結果は、ポリペプチドが他の抗原に対していかに有効であ っても、特定の設定条件下ではそのポリペプチドの免疫原性を予測できないこと 、ならびにエピトープを表面に表（７、さらにそれに対する抗体を誘導するには 、エピトープをコード化するアミノ酸に必須の物理的形体（例えばポリペプチド の大きさや付着するアミノ酸配列の性質）の実験的決定が必要なことを、明らか に示すものである。

したがって本発明の目的は、哺乳類のメスに使用する避妊ワクチンを開発するた めに、透明帯蛋白質をコード化しているクローン化遺伝子および避妊抗体を使用 するための有効な方法を発見することにある。より具体的には、避妊抗体のため のエピトープを表わす能力により選ばれる特定されたアミノ酸配列を含有するポ リペプチドを包含するワクチンを提供することが本発明の目的である。

個々のＺＰポリペプチド構成要素の免疫学的分析を追加実施した。例えば、ブタ 透明帯の異なる抗原の限定に特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を 使用したところ、個々の透明帯の構成要素には独特の抗原決定基と共有する抗原 決定基の両者が存在するが、免疫優先決定基は各糖蛋白質に特有のようであるこ とが示唆された（Ｔ、Ｍ、Ｔｉｍｍｏｎｓ　ら１９８７年、１３ｉｏ１ｏｇｙｏ ｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　３６．１２７５−１２８７）　。

最後に、幾つかの種のＺＰ抗原上に確認された抗原基を認識する抗体を使用して 、ウサギＺＰ蛋白質の特異的抗原部位をコード化しているｃＤＮＡを分子的にク ローン発生させる研究報告がなされている（Ｐ、Ｃｈｅｕｎｇら１９８７年、第 ２７回アメリカ細胞生物学合憲例会発表要旨、ミズーリ州・セントルイス、１１ 月１６−２０日、Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５．　Ｎｏ、　４　ｐａｒｔ　２．３３４＾）。こ の要旨によれば、部分的には、次のような報告がされた。「これらの研究は、抗 体の種を横断するアフィニティー精製が哺乳類の異種間で共有される抗原を発現 するＣＤＮＡクローンの分離に有効な方法であることを立証した」。しかし、こ の要旨には特異的ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は公開されておらず、抗体の 潜在的避妊能も考察されていない。実際、避妊ワクチンに関する記載は全くなか った。「未来、　、（Ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ、、、）　Ｊと題する、ブタ透明帯 抗原からヒト避妊ワクチンを開発するための組み換え型Ｄ　Ｎ　Ａの使用および 合成ペプチド工学に間する展望的解説（Ｃ，Ｊ、　ＨｅｎｄｅｒＳｏｎら、　１ ９８８年、Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　８３．３２５）では、ブタの特 定のポリペプチド上の、避妊ワクチンに対するエピトープを表面に表しているア ミノ酸配列の同定は前もって実施されているが、このポリペプチド配列は全く公 開されていない。それにもかかわらず、この参考文献には、合成ペプチドやワク シニアウィルス発現へフタ−などの既知のワクチン技法とするヒトのワクチンが うまく提供されるだろうという仮説まで記されている。さらに、避妊作用を発揮 するこのペプチドに対するモノクローナル抗体は、［潜在的避妊能を有するエピ トープを明確にする際に極めて重要になる」と断言しているが、このポリペプチ ドと反応するモノクローナル抗体を獲得しているにもかかわらず、この報告も、 筆者らが「避妊作用を有するモノクローナル抗体の生成に失敗したが、これは公 表されている他の報告と一敗している０１．」としている。

一般に受け入れられているポリペプチドの免疫原性および抗原性の論拠に関する 完全な解説は本開示の範囲を越えているが、現在行われている技術の選択原理お よび用語を簡単に考察すると、本発明の理解を容易に深められよう。Ｃ本出願に おいては、あえて異なる明示の記載がなければ、「ポリペブチトコという用語の 使用は、複数のポリペプチドサブユニ・ントから成る蛋白質や、ペプチド結合に より結合された２またはそれ以上のアミノ酸からなるポリマー（すなわち、ジペ プチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド）をも包含するコ。したがっ て、特定の設定条件下での抗体誘導に必要かつ十分なポリペプチドの特性（例え ば特定の種に関する、またはある一定の形体における表現）は予測できないこと に先ず注目しなければならない。それにもかかわらず、この問題に関しては、今 までここに引用した技術に反映されたものよりはるかに多くのことが、過去１０ 年間に突きとめられており、有利な避妊ワクチンの設計のために、この情報の解 釈を活用することが、本発明のもう１つの目的である。

特に、ポリペプチドに対する免疫反応の本質および水準は、少なくとも２つの異 なるクラスの免疫系細胞、即ちＢ細胞およびＴ細胞とそのポリペプチド上の相互 作用に依存するという現在広く支持されている見解によって、本発明の理解が助 けられるであろう。簡単な言い方をすれば、免疫におけるＢ細胞の役割は、その 部位に向けて抗体が産生される高分子上の特異的な部位の認識として考えること ができる。非自己分子を免疫認識するための主な基礎を与えるＢ細胞エピトープ とも呼ばれるこのＢ細胞認識部位は、抗体上の抗原結合部位とほぼ一致する大き さで、一般にアミノ酸を約４〜６個含有するペプチドの長さに相当する直径を有 する。

［ここで、Ｂ細胞に対するエピトープと、関連抗体のそれとの間には形体上の相 違があることが注目されるであろう。換言すれば、Ｂ細胞による抗原上の特定部 位の認識と、結果として生じるその部位に対する抗体産生との間に介在する複雑 な往動学的メカニズムのため、最終的な抗体認識部位は最初に認識されたＢ細胞 エピトープと正確に同一ではないがもしれない。しかし、本論点に関しては、Ｂ 細胞エピトープは対応する抗体に対する結合部位と本質的に同一の構造と考えて もよい、１ 一方、Ｔ細胞の機能は、初めて抗原に暴露されたすぐ後のＢ細胞による抗体産生 の活性化促進および、その後、再度暴露された時の抗体反応の増強に（すなわち 、「免疫記憶」または「記憶喪失」反応に）大きく関係している。免疫において その役割を果たすためには、それに向けて抗体が産生される抗原上の特異的な部 位をＴ細胞も認識しなければならず、そのようなＴ細胞エピトープはＢ細胞エピ トープとほぼ同じ大きさである。

しかし、同じアミノ酸残基が特定のポリペプチド上のＢ細胞およびＴ細胞に含ま れている必要はない。事実、僅か半ダースのアミノ酸で構成されているペプチド でさえ、幾つかの異なるＢ細胞エピトープ（例えば、抗体上の相補的な構造に接 触する２〜４個の原子を含む）および、Ｂ細胞エピトープにも含まれている、ア ミノ酸の原子を含有するまたは含有しない１個またはそれ以上の異なるＴ細胞エ ピトープが同時に存在することもあるということは、分子レベルのペプチド免疫 学に関する現行の技術において通常の知識を持つ人達により理解されるであろう 。

大きな蛋白質に向けられた抗体にペプチドが結合する能力を十分に持っているに もかかわらず、抗体の誘導についてテストされた小さいペプチドの大部分が、そ れらが由来するより大きな蛋白質に比べて、かなり弱いイムノゲンである。ある 一定の化学的修飾をペプチドに加えると、特により大きな蛋白質の「担体Ｊにペ プチドをカップリングすると、一般に小さなペプチドに対する免疫反応が増大す る。

このような担体の役割は、あらゆる点でまだ十分に理解されていないが、実質的 な免疫反応の誘導には、ペプチドの最小限の大きさに関する特定の必要条件は一 般にないということが特に明白に確認されている。

むしろ担体の主な機能は、特定個体の免疫系により認識されるＴ細胞もＢ細胞も 統計的に含有しないと思われる短いペプチド上のＢ細胞エピトープと密接な関連 があるＴ細胞エピトープを提供することであると、現在では広く信じられている 。

ここで、１つの蛋白質から短いペプチドの形で得られたＴ細胞エピトープは、別 の蛋白質のＢ細胞エピトープを含む短いペプチドと結合することができ、各々の ペプチド単独の場・ａに比べてより完全でより高いレベルの免疫反応を誘発する 単一のペプチドを形成することが注目されるであろう。

より広く考えれば、特定のエピトープに対する免疫反応を開始する個々の能力は 、少数の原子の正確な配置により規定され、最終的ムこは、ＢＭＥ胞およびＴ細 胞による抗原認識の特異性を別々に調節する免疫系遺伝子の構造に依存すること が、現在では広く受入れられている。さらに、特定のＢ細胞エピトープが同種抗 体（即ちエピトープを認識する抗体）を誘導する能力も、結合したＴ細胞エピト ープおよび他のＢ細胞エピトープの両者に関して、そのエピトープが免疫系に現 れた状況に依存すると理解されている。後者の部位は、選定されたＢ細胞エピト ープに関する興味深い「免疫優性」と考えられる、即ち、それらは選定されたＢ 細胞エピトープより効果的に免疫系の注意を引き、それによってこの選定された エピトープに対する望み通りの反応の開始から系の限られた資源をそらす。換言 すれば、大きなポリペプチドに頻繁に生じる他の、いわゆる免疫優位なエピトー プの存在下で検出可能な抗体を誘発しないＢ細胞エピトープは、そのような免疫 優位な部位を欠く異なる状況、例えば短いペプチド上に存在する場合などには、 しばしば有意のレベルの同種抗体を誘導する。

結論として、上述のＢ細胞およびＴ細胞エピトープの特徴および両者間の差異に 関する様々な結論ならびにＴ細胞およびＢ細胞エピトープとして作用するアミノ 酸配列の予測法、さらに実際の検出法を活用することが本発明のもう一つの目的 である。

発明の要約 本発明による最近のマウスＺＰ３およびＺＰ２遺伝子をコード化しているＤＮＡ セグメントの分子クローニング、およびヒ１−ＺＰ３遺伝子の主要蛋白質、次に それらのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のヌクレオチド配列の特性化、お よびその中にコード化されるアミノ酸配列により１、新しい避妊薬の研究を可能 にする透明帯蛋白質分子の十分な詳細が提供されている。

このやり方は、精子による卵母細胞の受精を阻止する抗体の結合のための少なく とも１つのエピトープを表わすように選定されたアミノ酸配列を含有する透明帯 ポリペプチドによる能動同種免疫に基づいていた。

本発明者により、マウスＺＰ３メソセンジャーＲＮＡの完全なヌクレオチド配列 およびそれによりコード化されるアミノ酸配列が以前に発表されている（Ｍ、Ｊ 。

Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ　ら　１９８８　年　、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２７． 　２８７−２９６．　１９８８年６月１３日発行、その全内容は参考文献により ここに組み込まれている）。

本発明者およびその同僚も（Ｍ、　Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ　ら１９８７年、第２ ７回アメリカ細胞生物学合憲例会発表要旨、ミズーリ州・セントルイス、１１月 １６−２０　日、Ｊ、　Ｃｅ１ｌＢｉｏ＋、　１０５．　ｎｏ、　４　ｐａｒｔ 　２．３３４Ａ＞、ＺＰ３遺伝子のマウスゲノムクローンおよびＺＰ３遺伝子の ヒトゲノムＤＮＡクローンは、前に分離されたネズミＺＰ３　ｃＤＮＡに相応す るため、これを分離したと報告している。

しかしこの要旨は、マウスまたはヒトＤＮＡクローンの特定のアミノ酸配列また はヌクレオチドも公表しておらず、避妊ワクチンの概念に言及さえしていない。

さらに、マウスのＺＰ２ｃＤＮＡ配列も以前には公表されていない。

本発明者が公表した短いＺＰ３ｃＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドプロー ブで可能になったので（Ｒ４ｎｇｕｅｔｔｅ　ら１９８６年、上述）、完全なマ ウスＺＰ３ｃＤＮＡ配列の発表に続いて（Ｍ、Ｊ、Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ　ら１９ ８８年、Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２７．２８７−２９６）、他の研究者達もマ ウスＺＰ３遺伝子のゲノムＤＮＡクローンの分離および配列、ならびにその中に コード化されるアミノ酸配列を報告している（Ｒ，Ａ、Ｋ１ｎ１ｏｃｈ　ら１９ ８８年、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５．６４０９−６４１３　）。

透明帯抗原を基本とする避妊ワクチンに関する先行技術は、基本的に異種免疫に 焦点を合わせており、また依然とと２でそのままであるが、本発明はクローン化 透明帯遺伝子を基本とする避妊ワクチンおよび、避妊抗体に対するエピトープを 表面に表すために選定された、特定されたアミノ酸配列を含有するポリペプチド による同種免疫という実施方法に関連するものである。

このアプローチの利点は、偶然幾つかの種に保存されるかどうかとは関係無く、 受精の阻止に最も有効なり細胞エピトープを表わすこれらのイムノゲンを産生じ 、利用する能力を含む。さらに、このワクチン実施方法は、透明帯ポリペプチド 以外の分子上のエピトープとの有害な交差反応性を示す抗体を誘導する可能性を 最小限にする。最後に、たとえ透明帯抗原に結合しても受胎を遮断しない抗体を 産生ずるＢ細胞エピトープ数を減少させることにより、本発明は、ワクチンに対 する免疫反応の焦点を、抗体の避妊作用を促進する最も重要な位置にあるアミノ 酸に正確に合わせた。さらに、避妊用途には最も有用なエピトープに焦点を合わ せることにより、本発明は、臨界部位に対して免疫優性と考えられる外来エピト ープ由来の臨界避妊エピトープに対して有効な免疫の確立を妨害する可能性を最 小限にする。

本発明の実施においては、１つ以上の種の透明帯蛋白質に偶然保存されるエピト ープを使用してもよいと理解される。しかし、ワクチンに透明帯抗原を使用しよ うとする以前の試みにおいては、上述の文献に記載されているように、避妊抗体 を誘導する際に、そのようなエピトープの機能性を初めに考慮せず、異種抗原に おいて交差反応するエピトープを同定することにまず注意が払われていたが、こ れとは反対に、本発明においては、特定のワクチンを特徴とする特定の標的種で の避妊抗体の誘導に有効なエピトープを提供するという目的に対して、保存され たエピトープの使用が副次的なものであることが理解されるであろう。

したがって、本発明は精子による卵母細胞の受精を阻止する抗体の結合に対する エピトープを少なくとも１個以上の表面に表すように選定されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドを包含している哺乳類のメスに使用する避妊ワクチンに関 連するものである。本避妊抗体エピトープは、上記ワクチンが使用される種を起 源とする透明帯止に表された機能的相同体が存在するエピトープである。機能的 に相同なエピトープを都合よ（表面に表している透明帯蛋白質は、ＺＰ３１白譬 またはＺＰ２蛋白質またはＺＰＩ蛍白質である。

換言すれば、このワクチンのポリペプチドのアミノ酸配列と透明帯蛋白質の両方 が、精子による卵母細胞の受精を阻止する同一の抗体に結合することができると いう点で機能的に相同なエピトープを示す。しかし、本ワクチンポリペプチドも 透明帯蛋白質も同一抗体に対して機能的に相同な結合部位を表すという事実は、 これらの結合部位が各側で同一のアミノ酸配列によってコード化されていること を意味するものではない。

即ち、２個のエピトープを表面に表しているポリペプチドは、必ずしもエピトー プをコード化しているアミノ酸配列のレベルで構造的に相同ではない。

「起源とする」という句は、上記ワクチンが使用される種のゲノ１、に透明帯蛋 白質がコード化されることを意味している。

ＺＰＩ、ＺＰ２およびＺＰ３を包含している透明帯蛋白質という専門用語は、マ ウス系に限定されているので、他の動物系では他の専門用語が使用されることも 、専門用語が使用されないこともあるということが、前述の発明の背景から理解 される。しかし本発明者は、主なマウスの透明帯蛋白質（例えば、マウスのＺＰ ２およびＺＰ３蛋白質）のアミノ酸配列、そして遺伝子、ｍＲＮＡが種々の哺乳 類の種において高度に保存されていることを、明確に立証した（下記参照）。こ の構造上の高度な類似性を考慮すると、相応する位置の避妊抗体のエピトープと して作用する能力に関する、構造上の高度な相同性も予測される。したがって、 「ＺＰ３蛋白質」、ｒＺＰ２蛋白質」およびｒＺＰ１蛋白質」という用語は、高 度に保存される透明帯蛋白質のネズミ型のみならず、哺乳類の他種の相応する蛋 白質をも、そのような他の蛋白質の当該技術分野において周知のものとなった用 語にかかわりなく、意図している。

本発明の実施に適する避妊抗体を、発表されている様々な技法により、天然源の 透明帯抗体を使用して生成することができる。代わりに、本発明のＤＮＡセグメ ントを包含する組み換え型発現系で産生されるポリペプチドを使用して免疫化す ることにより、そのような抗体が有利に産生されうる。精子による卵母細胞の受 精を阻止する、モノクローナル抗体など、抗体を同定する様々な方法が発表され ている（例えばＩ、Ｊ、Ｅａｓｔら　１９８５　年、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏ＋、　 １０９．　２６８）　。

本発明のワクチンのポリペプチドにおいて、避妊抗体に対するエピトープを表面 に表すアミノ酸配列は、透明帯蛋白質上にある機能的に同一のエピトープを表す 原因となるアミノ酸配列と同じ配列の全部または一部を含有しているかもしれな い。ときには、特定の抗体を結合する１つのエピトープが、ポリペプチドの連続 的なアミノ酸配列を１個以上包含することもある（下記の「非連続的エピトープ 」の記載参照）ので、本発明は、ワクチンのポリペプチドは機能的に相同なエピ トープを表面に表す透明帯蛋白質のアミノ酸配列を少な（とも１つ含有すること が考えられる。

利用できる避妊抗体に対するエピトープを表面に表しているアミノ酸配列は、既 知の避妊抗体を使用して、透明帯蛋白質の全ての配列から選定される。例えば、 避妊抗体は、当該技術分野において周知のアフィニティークロマトグラフィーに より透明帯蛋白質の蛋白質分解性消化物から、そのエピトープを表面に表してい るペプチドを分離するのに使用されることもある。

かわりに、避妊抗体のためのエピトープを表わすアミノ酸の配列をコード化する ＤＮＡ配列を、標準的なな遺伝子操作法で分離することができる。この中には、 避妊抗体を結合するアミノ酸配列を発現する能力に関する、透明帯の遺伝子断片 のクローンのスクリーニングが含まれる。

避妊抗体のエピトープを表面に表すアミノ酸配列を同定するさらに別の方法は、 抗体エピトープを表面に表すと思われる各々異なるペプチドを化学的に合成する という既知の方法を用いる方法である。例えば、ある蛋白質の配列の中で連続的 に生じ、１つのアミノ酸でオーバーラツプするアミノ酸６個のペプチドすべてを 、迅速に合成し、その抗体反応性を試験する技術が市販されている。

本発明の本側面の別の実施例では、ワクチンの避妊抗体に対するエピトープを表 面に表すアミノ酸配列は、透明帯蛋白質上のエピトープのアミノ酸配列のある種 の類似体でありうる。

本実施例が包含する類似体の１種は、このような技術の発明者であるＨ、Ｍ、　 Ｇｅｙｓｅｎにより「ミモトーブ（ｍｉ＋５ｏｔｏｐｅ　）　Ｊとして知られて いる合成ペプチドを含む。この合成ペプチド用のキットが市販されている。

多数の例において、この合成エピトープ生成法は、特定の抗体に対する既知のエ ピトープの機能的類似体であるアミノ酸配列を作りだし、またこの類似体は選定 されたもとの抗体と同じエピトープを認識する他の抗体を誘導する。しかし、類 似体の配列は、通常は、選定されたエピトープを表面に表す天然のアミノ酸配列 中のアミノ酸を含有していない。したがって、この種の類似体の配列はエピトー プを表面に表す天然の構造に非常に似ており（ａ＋１ｍ１ｃｓ　）　、そこで［ ミモトープ」と名付けられた。本発明の本側面の本実施例の重要な特色は、望み 通りの避妊抗体のエピトープを表面に表している天然のアミノ酸配列を同定する 必要がないことである。実際、末法は、多くのアミノ酸によって分離された蛋白 質の異なる位置に見つけられるアミノ酸を包含する天然のエピトープの小さなペ プチド類似体を作り出すことができる（即ち、１個の短い連続したアミノ酸配列 にコード化されたこれらのエピトープに対する、いわゆる「非連続エピトープ」 ）。

「類似体（ａｎａｌｏｇ）　Ｊという用語においては、本発明の本側面もまた、 それ用の抗体をまだ入手できない選定された透明帯蛋白質の避妊抗体に対するエ ピトープを同定するために、蛋白質類の進化の間の配列保存に関する周知の原理 を応用することを含むものである。

この透明帯蛋白質のアミノ酸配列が別種に由来する関連蛋白質のそれと高度に一 致し、しかもそのような避妊抗体に対するエピトープが後者の蛋白質配列に限定 されていれば、２番目の蛋白質の既知のアミノ酸配列に類似している避妊抗体に 対するエピトープを表面に表す選定された蛋白質の配列を示すのに、２種の蛋白 質間の一般的な構造上の相同性が用いられる。

換言すれば、２本の短い、異なるアミノ酸配列が、２つの非常に類似した構造（ 即ち全体としてのアミノ酸配列および、その結果として３次元構造）の同一の位 置を占めることが明白なとき、２つの配列のうちの１つが特定の生物学的作用を 有する抗体に対するエピトープを表わす。本発明のこの側面によれば、避妊抗体 に対する既知のエピトープは、適当なエピトープを発現するためのクローン化Ｄ ＮＡのクローン化フラグメントをスクリーニングすることにより、マウスＺＰ３ 蛋白質中で同定されたアミノ酸配列によって具体化され、このアミノ酸配列の１ つの類似体は、ヒトＺＰ３蛋白質の相応する位置を占めるアミノ酸の配列により 具体化される。このマウスＺＰ３エピトープのヒト類似体（これも同エピトープ の「類似体」と考えられる）は勿論、本発明の同種免疫比の態様に従って、ヒト に使用するワクチンに組み込まれなければならない。

特に３０〜５０個或いはそれ以上のアミノ酸を包含するペプチドの合成は、今で はワクチンが目的の場合には十分な規模（例えば、１グラム以上のバッチ）で達 成できるため、化学的に合成されるペプチドを本発明のペプチドとして便利に使 用してもよいと理解される。そのような合成ペプチドは、下記のマウスＺＰ３ペ プチドにより具体化される。

本発明のポリペプチドはイディオタイプの抗体またはそのような抗体の大きな断 片を含むものではないことに特に注目しなければならないが、これは透明帯蛋白 質のエピトープを現すために、そのようなポリペプチドを使用することによる欠 点を、そのような抗体に関する先行技術を考慮して、上記発明の背景で考察して いるからである。しかし本発明は、もとの透明帯蛋白質エピトープの類似体を実 際に包含するイディオタイプの抗体のアミノ酸配列を主に包含している、より小 さなポリペプチドを含むものである。

さらに、「発明の背景」におけるポリペプチドの免疫原性に関する考察から認識 されるように、エビ）　−ブに対していっそう大きいアフィニティを示す避妊抗 体のより高い力価を高めるという点では、本発明のポリペプチドまたはペプチド の免疫原性、特に小さな（合成）ペプチドの免疫原性は、別のポリペプチドまた はペプチド、特にＴ細胞エピトープを表面に表している別のアミノ酸配列に共有 結合して有利に増強される。

加えて、ワクチンには通例のことであるが、本発明のポリペプチドは、薬学的に 許容できる媒体により服用される。本発明のワクチンは、一般的にイムノゲンに 対する免疫反応を増強することが知られている免疫学的アジュバント、特に小さ な合成ペプチドの免疫原性を増強するアジュバン■・の有効量を、有利に包含し ている。

もう１つの側面においては、本発明はさらに、マウスＺＰ３またはＺＰ２蛋白質 ならびにヒトＺＰ３蛋白質の少なくとも一部をコードする、ある一定のＤＮＡセ グメントに関する。本発明は、本発明のＤＮＡセグメントを含有している組み換 え型細胞の培養ならびに、本発明のポリペプチドおよびペプチドの合成および分 離法にも関する。

最後に、本発明は、本発明のＤＮＡセグメントを包含する組み換え型ＤＮＡ分子 およびヘクターにも関する３本発明の本側面の特別な実施例では、透明帯蛋白質 のすくなくとも一部をコード化しているＤＮＡ配列を発現しているワタシニアウ イルスヘクターを包含している、哺乳類のメスに使用する避妊ワクチンを含む。

本発明は、下記の具体例の詳細な説明ならびにそこに含まれる図の詳しい説明を 参考にすることによりもっと容易に理解されるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンを配列することにより決定され た、マウスＺＰ３のｍＲＮＡの完全なヌクレオチド配列および推定されたアミノ 酸配列を示す。

第２図は、マウスＺＰ３配列およびヌクレオチド間の高度の構造的相同性ならび にマウスＺＰ３蛋白質のヒト相同体主要蛋白質の推定されたアミノ酸配列を表す 。

第３図は、ｃＤＮＡを配列することにより決定された、マウスＺＰ２のｍ　ＲＮ 　Ａの完全なヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を示す。

第４図は、アミノ酸７個から成る避妊抗体に対するマウスＺＰ３エピトープの限 定を略述する。

実施例の説明 本発明は、ＺＰ３蛋白質をコード化する配列を有するＤＮＡセグメントに部分的 に関連するものである。

本発明の本側面の１つの実施例は、マウスＺＰ３のｍＲＮＡの完全なヌクレオチ ド配列の少なくとも一部をコードするｃＤＮＡクローン（すなわち、ｐＺＰ３゜ １またはｐＺＰ３．２）および、それによってコード化されるアミノ酸配列（第 １図参照）で、下記の実施例１に記述した様に、これは本発明者によって決定さ れ、発表されている（Ｍ、Ｊ、Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ　ら１９８８年、Ｄｅｖ。

Ｂｉｏｌ、　１２７．２８７−２９６　）　、第１図では、開始と終結のコドン を箱で囲い、ポリアデニル化の信号に上線をつけた。Ｉ２７２−ヌクレオチド（ ｎｔ）のオーブン読み取り枠１個が第２線のＺＰ３ポリペプチドに翻訳される。

指定された信号ペプチドを波線で、また信号ペプチダーゼ切断部位を矢印で示し ている。実験的に決定されたＺＰａＰａジペプチドミノ酸配列に相当する推定さ れたアミノ酸配列には破線で下線をつけ２Ｎ結合グリコシＩ／−ジョンの可能な ６つの部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／５ｅｒ）は、実線により下線をしである。ｍ ＲＮＡの大きさを具体化するために用いられる２個の合成オリゴヌクレオチドの マツプ位置は、点で示されている。

闇単に言えば、Ｚｒ２のｉｎ　ＲＮ　Ａは、比較的短い５゛および３′非翻訳領 域および、４６．３０７０ａの前駆蛋白質のためにコードするのに十分な読み取 り枠１個を含んでいる。種々の哺乳類のゲノムにはマウスＺＰ３のｍＲＮＡに類 似した配列が存在しており、長さではマウスＺＰ３のｍＲＮＡと区別できないポ リ（Ａ）ＲＮＡ転写を発現する。

本発明は、マウスＺＰ３遺伝子のゲノムクローンおよびエキソ７８個のうち少な くとも５個を包含しているヒトＺＰ３遺伝子のゲノムＤＮＡクローンを包含する 配列を持つＤＮＡセグメントに関する。これらのゲノムクローンは、前に分離さ れたマウスＺＰ３のｃＤＮＡの相同体であるため、技術上周知の標準的な遺伝子 操作法を用いて分離されている。

第２図は、マウスＺＰ３の配列と、ヌクレオチドと、ヒト遺伝子のエキソ７８個 のうちの５個に関連したマウスＺＰ３蛋白質のヒト相同体の一部の推論されたア ミノ酸配列と間の比較を示す。第２図において、パネルＡはヌクレオチド配列の 比較で、パネルＢは対応するアミノ酸配列を比較するものである。各パネルでは 、上段はヒトの配列を、下段はマウスの配列を表現している。１つの配列または もう１つの配列の空所は、もう１つの種と比較した１つの種の配列の挿入または 欠失を示している。上段のヌクレオチドまたはアミノ酸から下段の対応するもの への垂直の棒線は、その位置の２つの配列の正確な同一性を示している。２つの 配列において、対応するアミノ酸の間の一対の点は２つの配列の化学的［４Ｑ性 を示しているが、１つの点は進化的の類似性を示す（即ち、多くの種に交差して 保存されている蛋白質同族体の異なるメンバーにおいて、頻繁に置換される一対 のアミノ酸）。

第２図のデータは、マウスＺＰ３　ｃのＤＮＡとその他の様々な種の哺乳類に由 来するゲノムＤＮＡ間で観察される広範にわたる核酸雑種形成から予測されるよ うに（例１参照）、マウスおよびヒ）ＺＰ３配列の高度の相同性を明確に示して いる。この構造的相同性のデータおよびその標準的な分析（すなわち、第二次的 構造、水治療性或いは表面到達性の予想）から、マウスおよびヒ）ＺＰ３蛋白質 も、避妊抗体を誘導・結合することができる位置に関して、機能的相同性のきわ めて高い水準を、その配列全体にわたって示さなければならないことが、蛋白質 構造および免疫学の技術に平均的に熟練している者には明らかであろう。したが って、各蛍白買上の避妊抗体に対するエピトープは、２つの蛋白質間で正確に保 存されない短いアミノ酸配列を包含しうるが、マウスおよびヒトの抗体がそれぞ れの同種抗原を認識するだけであっても、マウス蛋白質上のそのようなエピトー プに相当するヒトの配列も機能的に相同な抗体を誘導すると予測される。

さらに本発明は、第３図に示した様に、完全なヌクレオチドの少なくとも一部お よびマウスＺＰ２蛋白質のｍＲＮＡの推定アミノ酸配列を包含するマウスＺＰ２ のｃＤＮＡ配列をコード化しているＤＮＡに関する。

もちろん、上記のＺＰ３およびＺＰ２配列は、［ヒトＺＰ３蛋白質」といった言 葉の使用によって１群にまとめられる様に、相当する透明帯蛋白質の免疫学的特 徴に著しい影響を与えずに、したがって本発明のＤＮＡの範囲からはずれること なく、マウス同系交配なら系毎に、異系交配では個体（例えばヒト１人）毎に僅 かに異なりうる（即ち変異する）ことは、遺伝子工学の技術に普通に熟練した人 には明白であろう。

本発明のＤＮＡセグメントは、本発明の主要側面の異なる実施例、即ち精子によ る卵母細胞の受精を阻止する抗体の結合に対するエピトープを少なくとも１つ表 すために選定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含している哺乳類のメ スに使用する避妊ワクチンを、様々に発展させることができる。この避妊抗体エ ピトープは、上述のワクチンが使用される種を起源とする透明帯蛋白質上に表さ れた機能的相同体があるエピトープである。機能的に相同なエピトープを有利に 表面に表している透明帯蛋白質は、ＺＰ３蛋白質またはＺＰ２蛋白質またはＺＰ Ｉ蛋白質である。本発明のこの側面における主要な実施例において、７個のアミ ノ酸の配列によりマウスＺＰ３蛋白質上に表された避妊抗体エピトープを同定し 、そのエピトープを表し−ている合成ペプチドワクチンが、そのようなエピトー プの同定・試験に便利なモデル系であるマウスに有効な避妊を提供することを明 らかにした。第４図は、避妊抗体に対する、このマウスＺＰ３エピトープの限定 を略述するもので、下記の実施例２に一段と詳しく記述されている。第４図では 、パネルＡは１３１７７ｎｔＺＰ３ｍＲＮＡの図解を示している。１２７２−　 ｎ　ｔオーブン読み取り枠１個を中空の棒線で示している。ｍＲＮＡより下の線 は、抗ＺＰ３モノクローナル抗体によってλｇｔｌｌのＺＰ３エピトープライブ ラリーから分離した実在のｃ　ＤＮＡを８個を表している（１．Ｊ。

Ｅａｓｔら１９８５年、Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１０９．２６８　）　、このク ローンをＺＰ３のｍＲＮＡ上に一列に並べてあり、斜線をつけた棒線は実在のク ローン全部に共通の配列を示している。３個のクローン（＊）は、エピトープの ５′および３゛末端を特定する。パネルＢは８つの実在のクローンの間でオーバ ーラツプする部分のＤＮＡ配列を示し、対応するアミノ酸配列を大文字で示しで ある。

エピトープの側面にあるさらに１個のＮ末端アミノ酸とさらに８個のＮ末端アミ ノ酸（小文字）が免疫化に使用したペプチドに含まれていたが、これらのアミノ 酸はどれも抗体結合に必要ではないことをエピトープクローン配列は明らかに示 している。パネルＣは、７つの残基の移動平均を用いて、Ｈｏｐｐおよび−ｏｏ ｄｓのアルゴリズムに従ってプロットした、推定したアミノ酸４２４個のマウス ＺＰ３蛋白質の親水性を表している。親水性プロントの下の中黒の水平の棒線は 、１１個の残基の移動平均を用いたＭａｒｇａｌｉｔのアルゴリズムによって予 測した両親媒性のαらせん状セグメントを示している。斑入りの垂直の棒線は、 実験動物の免疫化に使用したパネルＢに示したアミノ酸１６個ののペプチドを表 している。

ｉＭ潔に言えば、ＺＰ３をコード化しているｃＤＮＡを無作為にフラグメントに し、２００−５００ｂｐ　フラグメントを発現ベクターｇｔｌｌ内にクローン化 した。このエピトープのライブラリーは、前述の避妊抗体によ／）　スフＩＪ　 −７サｈ、抗体により認識されたアミノ酸７個のエピトープの地図作成に実在の クローンを使用した。メスのマウスをエピトープで免疫化した。その結果として 生じる循環抗ＺＰ３合成ペプチドは免疫された動物の卵母細胞に結合して、長期 間持続する避妊を引き起こした。

勿論、実施例２に記述した、ＺＰ３エピトープを表面に表すアミノ酸１６個の配 列の短い方の一部分も、本発明の有効なペプチドと考えられることは、合成ペプ チドワクチンの技術に熟練している人には明白であろう（特に、エピトープクロ ーンの共通の配列によってコード化されるアミノ酸７個のうちの５個が６個で本 質的に構成されている配列、しかも最初のアミノ酸８個または最後のＧｉｎを除 外する配列であって、合成ペプチドがワクチンとして機能するのに必要であると いう証拠も無しに、便利さのためにそれらの全てが加えられた）。ある一定の類 似体（例えば、技術上頻繁に実施されるような、荷電を中和させるために化学的 修飾を加えられた端部を有するこれらの配列）が本発明の実施に有効なペプチド を供給するかも知れない。

実施例２に記述した避妊作用の可逆性は、成長期に入ろうとして、ワクチンによ る免疫化が終結した後で低下すると思われる、低レベルの循環抗透明帯抗体の存 在下で透明帯を合成している休止卵母細胞により説明される。仮にこの卵母細胞 が排卵されるとすると、抗透明帯抗体で軽く被われ、受精することができること になる。

これらの研究は、マウスＺＰ３ペプチドーＫＬＨ複合体をメスのマウスに反復投 与すると、投与例の大部分は長期不妊となることを立証した。透明帯ペプチド自 身が抗原（同種抗原）であるという事実にもかかわらず、抗透明帯抗体の産生が 起きる。免疫寛容は発生の新生児期に起きると仮定されており、Ｂ細胞の機能的 不活性化にも自己抗原を認識するＴ細胞の欠失にも影響を与える。検出可能な透 明帯蛋白質が出産の２〜３日後まで卵巣内には存在しないこと、またはそれらが 成長している免疫系へ接近できないことが、少なくともＺＰ３エピトープを認識 できるリンパ球が存在し続ける理由である。

避妊免疫の最終的な可逆性に関しては、ＺＰ３−ＫＬＨ複合体に対する免疫反応 を備えているので、免疫系が内因性のＺＰ３蛋白質によって刺激され続けないと いうことは不思議である。下記の仮説によりこの現象の全てまたは一部分が説明 され、本発明の理解が助けられと思われるが、決してこれらの論理的説明が本発 明の範囲を制限するように解釈されてはならない。

それにもかかわらず、下記の項目の１つ以上が避妊免疫の可逆性に関与している と推測される。■）卵胞を包囲している基底膜以外の毛細管が欠如していること と関連がある卵巣に特有の透明帯の局在性は、リンパ球と透明帯との相互作用お よび透明帯によるリンパ球の刺激を物理的に妨げる。２）イムノゲンのアミノ酸 １６個のＺＰ３ペプチド部分はＢ細胞エピトープを提供するが、ヘルパーＴ細胞 機能を刺激するＴ細胞エピトープを含まないかもしれない（その代わり、ＫＬＨ 部分により提供される）。従って、同じＺＰ３ペプチドを含有しているにもかか わらず、内在性のＺＰ３蛋白質が、本仮説によれば抗ＺＰ３ペプチド反応の開始 に重要かもしれない担体蛋白質のＴ細胞を含有してない。３）卵巣は免疫学的に 保護された領域の一部であり、卵巣では（父親の、従って外来の抗原を含有して いる）胎児の免疫学的拒絶を抑制するメカニズムも働く　。

ＺＰ３ペプチドワクチンを用いた免疫化でマウス卵巣の構造的または機能的異常 をきたさなかった（即ち組織構造および、ワクチンを投与されたメスが、その後 、子を生む能力が正常である）ことに注目することは、特に重要である。勿論こ の点に関しては、ワクチンに合成ＺＰ３ペプチドを使用すると、他の卵巣イムノ ゲンの軽微な混入が起こる可能性が除かれる。加えて、卵胞基底膜の物理的障壁 および透明帯蛋白質の細胞外結合部位は、卵巣に免疫細胞傷害性反応の欠如に寄 与し得る。

このワクチン開発に使用したモノクローナル抗体により認識されるＺＰ３エピト ープは、ハムスター、モルモット、猫、犬の卵巣においては、免疫学的には検出 されない。従って、このＺＰ３ペプチドは、ヒトを含む哺乳類の他種で避妊薬と して作用することは期待できないが、この抗体がヒトＺＰ３蛋白質に結合する能 力はまだ試験されていない。しかし、実施例１に記述した動物間で透明帯遺伝子 が高度に保存される性質を利用すれば、「自己」の透明帯ペプチドを用いたワク チンを投与するという本発明の実施計画を、他の種にも適用することができる。

したがって、上記の通り、マウスＺＰ３遺伝子のヒト相同体を同定したところ、 ８個のエキソンのうち少なくとも６個は、マウスＺＰ３遺伝子のそれと８０％以 上類似していた。上記考察の通り、この高度の構造的相同性は、避妊抗体のエピ トープに関する機能的相同性が匹敵することを示している。

したがって、ヒトＺＰ３蛋白質の推定主要アミノ酸配列を使用し、過大な実験を せずに、本発明の実施によって、ポリペプチド構造および免疫学の技術に昔通に 熟練している者は、ヒトまたは他の哺乳類のＺＰ３蛋白質のにおける、ここに記 載したマウスＺＰ３のペプチドに相同の部分を同定することができる。がわりに 、このような熟練者は、イムノゲンになる可能性があるそれ以外のエピトープを 予測するために、コンピューターアルゴリズムを使用することができる［Ｔ、Ｐ 。

Ｈｏｐｐおよびに、Ｒ，ＩＡｏｏｄｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　７８．３Ｂ２４　（１９８１）；　Ｈ，Ｍａｒａｇａｌｉｔ、　Ｊ、 Ｌ、　Ｓｐｏｕｇｅ。

Ｊ、Ｌ、　Ｃｏｒｎｅｔｔｅ、　Ｋ、Ｂ、　Ｃｅａｓｅ＋　Ｃ，Ｄｅｌｉｓｉ、 　Ｊ、Ａ、　Ｂｅｒｚ。

ｆｓｋｙ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８．２２１３　（１９８７）；　Ｊ 、Ｂ、　Ｒｏｔｈｂａｒｄおよび一、Ｒ，Ｔａｙｌｏｒ、　ＥＭＢＯＪ、　７． ９３　（１９８８）］　、或いは周知の方法を用いて、避妊抗体のエピトープに 関するポリペプチド鎖を代表するペプチド類の大きな配列を試験してもよい［Ｈ ，Ｍ、　Ｇｅｙｓｅｎ＋　Ｒ，Ｈ，Ｍｅｌｏｅｎ　および　Ｓ、Ｊ、Ｂａｒｔｅ ｌｉｎｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ　８１＋３９９８ 　（１９８４）；　Ｒ，Ａ、　ｔ（ｏｕｇｈｔｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃ４゜ＵＳＡ　８２．５１３１　（１９８５）；　Ｈ，Ｍ、　 Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｊ、Ａ、　Ｔａ１ｎｅｒ、　Ｓ。

Ｊ、　Ｒｏｄｄａ、　Ｔ、Ｊ、　Ｍａｓｏｎ、　Ｈ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ｅ 、Ｄ、　Ｇｅｔｚｏｆｆ。

Ｒ，Ａ、Ｌ、　ＨｏｕｇｈｔｏｎおよびＲ，Ａ、　Ｌｅｒｎｅｒ、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３５＋１１８４　（１９Ｂ？）；　Ｅ、　Ｎｏｒｒｂｙ＋　Ｍ、Ａ、　 Ｍｕｆｓｏｎ、　Ｈ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ。

Ｒ，Ａ、）ｌｏｕｇｂｔｅｎ、Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８４．６５７２　（１９８７）］。

さらに、前述の通り、合成ペプチドワクチンの技術に熟練した者は、利用可能な 避妊ワクチンに対するエピトープの「ミモトーブ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ　）　Ｊを もまた開発することができる。この方法により、まず、蛋白質に自然に出現する アミノ酸２個の考えられるあらゆる配列に結合する、望み通りの抗体の能力を試 験した。検出可能な抗体の結合を示す一対のアミノ酸を同定したうえで、この２ 個のアミノ酸を包囲している配列を、自然に生じるアミノ酸および天然の蛋白質 にはみられない幾つかのアミノ酸のいずれかを含有することにより、抗体結合の 試験を続けて目的達成のために使用する選定された抗体に対して十分な親和性を 有するエピトープを表面に表している短いペプチドを同定するまで、次第に、ま た規則的に変化させる。

このように透明帯蛋白質のエピトープを用いた同種免疫という本発明の本方法は 、哺乳類の個体数を調節する今後の避妊ワクチンの設計に広く応用されることが 期待される。

Ｉ　ＺＰ３　の　とアミノ　１の ＺＰ３　ｍＲＮＡの 先の研究（Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅら、１９８６年、前述）は、全長１．３　ｋｂの マウスＺＰ３を表す二つの重複したｃＤＮＡの分離が報告されている。このノー ザンプロット分析によれば、ＺＰ３遺伝子が１．５−から１．６−ｋｂのポリア デニル化ｍＲＮＡとして転写されているのが分る。もとのλｇｔｌｌ卵巣ライブ ラリーの再スクリーニングを繰り返しても、もっと長いＺＰ３ｃＤＮＡクローン を同定することはできなかった。しかし二つの入手できるクローンの核酸配列は 、単一のオーブン読み取りフレームに対する開始コドンを欠いていた。従ってメ ツセージ全長のサイズを決めるのに、地図位置１５４−１７３に該当する２Ｏ− ｎｔオリゴヌクレオチドを合成して伸張研究のプライマーとして使用した。［地 図位置は一貫してＺＰ３全長の転写を基準とし、その転写の配列は二つのｃ　Ｄ ＮＡクローンと一つのゲノムクローンとから完全に解読された。コ 標識された２０−ｍａｒを６５°Ｃ（Ｔｄ、５°Ｃ）で卵巣ポリ（Ａ）”ＲＮＡ に焼付けた。これら条件は特に高度なハイブリッド形成を可能にしたが、Ｍ−Ｍ ＬＶ逆トランスクリブターゼを抑制した。従って逆転写の直前に温度を３７°Ｃ に下げ、逆トランスクリブターゼ活性に最適な緩衝条件とした。しかしこの温度 低下は、２０−ｍａｒの非相補的ＲＮＡ配列への非特異性結合をもたらした。こ れらの問題を避ける為、未標識のプライマーを焼付け、反応の温度低下直前に加 えた。未標識２０−ｍａｒが６６倍過剰だと、非標的部位プライマー伸張物から 得る信号を排除するのに効果的であった。結果は、肝［ＲＮＡを鋳型として使用 した時には見られない卵巣ポリ　（Ａ）”ＲＮＡに特異的な１７０〜１７５　ｎ ｔ伸張物を示した。

ＺＰ３ｍＲＮＡの大きさを更に実証する為に、リボヌクレアーゼＨを用いてメン センジャーＲＮＡをオリゴヌクレオチドに向けて切断させた。一つが地図位置１ ５４−１７３　、もう一つが地図位置２８７−３０３に該当する二つの合成オリ ゴヌクレオチドを別々にマウス卵巣ポリ（Ａ）”　ＲＮＡにアニールし、大腸菌 リボヌクレアーゼＨに消化させて、地図位置４７から１２７５の３２ｐ標識ＺＰ ３ｃＤＮＡを用いて調べた。切断はオリゴヌクレオチドがＲＮＡとハイブリッド した区域でのみ起こり、ＺＰ３ｍＲＮＡの観察された寸法が各々約１６０ｎｔと ３００ｎｔだけ小さくなった。この対応する小バンド（約１５５と２８５塩基） は、探索を繰り返し、長期露出を行ったにもかかわらず検出されなかった。オリ ゴヌクレオチドがなければリボヌクレアーゼＨは、ＺＰ３の分子量に影響を及ぼ さなかった。これらの結果により、２２３ｍＲＮＡは、二つのｃＤＮＡクローン の内の長い方よりも更に５°追加４６　ｎｔを伸張するとのプライマー伸張デー タを裏付けるものである。

マウスＺＰ３の　１と　ミノ　Ｉ ＺＰ３をコードする二つのｃＤＮＡの核酸配列を測定し、最近分離されたマウス ＺＰ３のゲノムクローンを、ｃＤＮＡクローン（第１図）に表示されていない残 りの４６の核酸残基を定義するのに用いた。ＺＰ３転写の長さは１３１７　ｂｐ であり、ｃ　ＤＮＡクローンは全長コピーの９７％を表す。この転写は比較的短 い２９−ｎｔ５”未翻訳区域があり、この後にを推動物に共通するＡＮＮＡＴＧ モチーフに組み込まれたＡＴＧと共に、開始コドンを作動させる１２７２　ｎｔ の単一オープン読み取りフレームが続いている。３′未翻訳区域もまた短＜　（ １６ｎｔ）　、ＴＡＡ終了コドンはポリ　（Ａ）尾部の始まりより１２　ｎｔだ け先行している規範的ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化信号の一部である。

オーブン読み取りフレームは、１２４のアミノ酸（９％酸性、７．３％塩基性、 ７．５％芳香族性、３１．４％疎水性）から成る分子量４６．３０７　Ｄａの蛋 白質へと翻訳する。ここには先に内部ＺＰ３ペプチド配列に比較した、またＺＰ ３ｃＤＮＡクローンの特性確認に用いられた２０のアミノ酸配列が含まれている 。国立生医学調査基礎蛋白質データバンク（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ 　Ｂａｎｋ　）を、ＦＡＳＴＰコンピュータプログラムを使用して、ＺＰ３蛋白 質と同様の配列について調査した。蛋白質の幾つかはＺＰ３のと類似したアミノ 酸配列を短区域に有しているのが分かったが、その類似性は統計上の有意性の判 断が分かれる所であり、同定された蛋白質はＺＰ３との明白な生物学的相関性は 全く無かった。核酸配列から翻訳されたＺＰ３蛋白質は、６個のＡｓｎ−Ｘ−３ ｅ　ｒ　／　Ｔ　ｈ　ｒ配列を有し、その各々がＮ結合したグリコジル化区画の 可能性がある。アミノ酸位置２７３のアスパラギンは、以前に誘導化されて示さ れており（Ｒ４ｎｇｕｅｔｔｅ　ら、１９８６年、前述）、グリコジル化部位の 一つを表しているものと思われるが、他の部位の状態は未知のままである。荷電 アミノ酸は、アミノおよびカルボキシル末端にある親水的部分の二つの主な区域 に存在しないのを除けば、ＺＰ３蛋白質に沿ってよく分布している。理論的には αらせん構造度が高い区域が６カ所あり、この内の２区域は末端の疎水性区域に ある。

全長蛋白質のアミノ末端の、最初の１７残基は、疎水性であり、最初の１１をβ ターンが続くαらせん構造へと成形できる。フォンハイネ（ｖａｎ　）Ｉｅｉｊ ｎｅ）のスライド窓／マトリックス記録法を使用して、２２番目のアミノ酸の後 の、ベブチターゼ切断部位の可能性のある部分を同定した。得られた分泌蛋白質 は、４３，９４３　Ｄａ分子量を有し、これはＺＰ３蛋白質として報告されてい る４４，０００　Ｄａ分子量と一致する。更に二つの実験をしたにもかかわらず 、この分ｍｚｐａ蛋白質のＮ末尾アミノ酸配列は、マイクロガス相配列法によっ ても同定できなかった。多分、化学的修飾により阻止されたためであろう。推定 ＺＰ３ポリペプチドのカルボキシル末尾の近（に、２６アミノ酸が構成する第２ の疎水性領域があり、その機能は不明である。この区域がヒトロバシー指数２． ２の残基１９個分の長さの切片を幾つか含み、この指数が内部球状蛋白質領域の ものより平均で１．０９〜０．２２超過していることは興味深い。成熟ＺＰ３蛋 白質が明らかに細胞外マトリックス蛋白質であるにもかかわらず、普通この様な 疎水性領域は、膜が張られる領域に見られる。この疎水性領域は、他の透明帯蛋 白質との、あるいは卵母細胞の膜との相互作用で何かの役割を果たすのかも知れ ない。

での マウスＺＰ３に類似した配列を有する遺伝子が、多様な哺乳類種のゲノム中に存 在することが報告されている（Ｌｉｎｇｕｅｔｔｅ　ら、１９８６年、前述）。

これらデータは、おそらく、異なる哺乳類種の細胞外の透明帯の共通構造と機能 とを反映している。これらの研究を、マウスｃ　ＤＮＡを用いて、進化の木にま たがるいくつかの動物から単離したゲノムＤＮＡを調べることへと発展させた。

ヒト、マウス、ラット、にわとりから採取したゲノム的に等量のＤＮＡをＢａｍ ＨＩにより消化させ、０゜８％アガロースゲル」二で電気泳動し、ニトロセルロ ース上にプロットを作り、ｐ　Ｚ　Ｐ３．２　ｃ　ＤＮＡからの′３２Ｐ標識挿 入を用いて調べた。Ｔ、、より２２°Ｃ低いの条件で洗浄後、７８％以上の類似 性を有する配列が検出され、ヒト（６，２ｋｂｐ）　、マウス（９，８および６ ．８　ｋｂｐ）　、ラット（７，９，２，６５，２，２５，１，７ｋｂｐ）のＤ ＮＡの限定切片で信号を検出した。驚いたことにＢ　ａ　ｍＨＩ　（７，９ｋｂ ｐ）またはＨｉｎｄＩｒｌ（５，９と０．９　ｋｂｐ）のどちらで切断しても、 にわとりゲノムＤ　Ｎ　Ａに弱いが再現可能な信号が認められた。遺伝子配列デ ータバンク（Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ；　Ｇ　 ｅ　ｎ−Ｂ　ａ　ｎ　ｋ　）での検索では、ＺＰ３ｃＤＮＡ（地図位置６０５〜 ６６７）のコードストランドの■短節を除いては、にわとりＤＮＡ配列中で配列 の類似性を認めなかった。そし、てこの１短節は、にわとりカルシウムプロテア ーゼのカルシウム結合の可能性のある領域の非コードストランドに７３％類似し ていた。しかし３２ｐ標識ＺＰ３ｃＤＮＡ挿入をにわとりから分離した脳、肝臓 、卵管、卵巣のＲＮＡを含有するノーザンブロンドにハイプリント化しても、信 号は認められなかった。従って、ゲノムにわとりＤＮＡのサザンブロントで得た 信号が、マウスＺＰ３ｃＤＮＡと同類の転写にわとり卵母細胞遺伝子に該当する とは思えない。

細胞外被膜が多数の非哺乳類種の卵母細胞を覆っている。従って、ＺＰ３に類似 の配列が多様な器官中に存在しているかどうか調べるのは興味深いことである。

Ｘ、Ｉａｅｖｉｓ、虹ます、Ｓ、　ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ　、　Ｄ、　ｍｅｌａ ｎｏｇａｓｔｅｒ。

および進化上の興味からＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから採取したＤＮＡとほぼ ゲノム的に同等なものを、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩに消化させて３２Ｐ標識のｐＺＰ３ ．２ｃＤＮＡ挿入とハイブリッドした。最小５６％の類似性が検出されるはずの 洗浄条件（Ｔ、より４４°Ｃ低い）で、非哨乳類種への交差ハイブリッド形成を 排除した。かくして、ＺＰ３遺伝子は、哺乳類ゲノム中にのみ見い出されるよう である。

他の哺乳類からのＺＰ３に配列として類似するゲノムの座が発現されるかどうか 調べるために、多様な噛乳類種（マウス、ラット、ラビット、犬、牛）がら単離 した卵巣ポリ（Ａ）’　ＲＮＡを、３２ｐ標識のｐｚｐ３．２ｃＤＮＡ挿入によ り調べた。全部の卵巣組織がＺＰ３転写を含んでいた。更に、マウス、ラット、 ラビットの三つの種からのＺＰ３転写のノーザンプロット分析によると、ＺＰ３ 転写が類似の分子量であることが判明した。この観察は、マウス／ラットまたは マウス／ラビットＲＮＡを混合後のノーザンブロソト上のたった一つの帯を検出 することで実証された。

、２　マウスＺＰ３Ｔビ　−プ　いた人　ペプチド）゛　る゛　クチン ＺＰ３　ｃＤＮＡか゛のエピトープ−イブ−■−のとスフ１−ニング 抗ＺＰ３モノクローナル抗体により確認した（Ｌｉｎｇｕｅｔｔｅ　ら、　１９ ８６年、前述）エピトープを含むことが分かっている１、ＯｋｂのｃＤＮＡを任 意の切片に切断して大きさを揃え（２００ｂｐ）　、ｇｔ　１１発現ベクトルに 組み入れた。さらに詳しくは、ＰＺＰ３．１のｃＤＮＡ挿入を１５ｍＭのＭ　ｇ 　Ｃ＋　２の存在下でＤＮａ　ｓ　ｅに消化させ、２００　ｂｐのサイズで選ん だ切片ＣＶ、　Ｍｅｈｒａ、　Ｄ。

Ｓｗｅｅ　ｔｅｒおよびＲ，Ａ、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、八ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳ八へ３．７０１３　（１９８６年）〕を、Ｌａｍｂｄａ　ＺＡＰ（Ｓ　ｔｒ ａ　ｔｅｇｅｎｅ　）に結合した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ　Ｂ　４細胞を未増幅エ ピトープライブラリーに感染させて、抗ＺＰ３モノクローナル抗体を用いて（１ ，Ｊ、　Ｅａｓｔ　ら、　１９８５年、Ｄｓｖ、　Ｂｊｏ＋、　１０９．２６８ ）選抜した（　Ｒ４ｎｇｕｅｔｔｅ　ら、１９８６年、前記）。陽性のクローン をプラーク精製し、挿入ＤＮＡの配列を分離したプラスミドＤＮＡから決定した （Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｎおよびＡ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３　（ １９７７年）〕。

゛　に・　るエピトープ　六　るＡ　ペブチヱ ８個の陽性クローンからのｃＤＮＡ挿大の核酸配列を決定した（第４図Ａ）。こ の８個のクローンに共通の２４個のヌクレオ千ドは、抗体により確認したエピト ープを含むはずの７個のアミノ酸ペプチドに対するコードを有する（第４図Ｂ） 。ペプチドは、ＺＰ３の最も親水性の部分に直接隣接しているアミノ酸３３６〜 ３４２を表し、両親媒性のαらせんを有する領域と一部重複している（第４図Ｃ ）。これら属性の両方が免疫優性エピトープに備わっている。

エピトープ（ＮＨ２−ｃｙｓ−ｓｅｒ−ａｓｎ　−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓ ｅｔ−ｇｌｎ−ＰＨＥ　−ＧＬＮ−Ｉ　ＬＥ−１（Ｉ　Ｓ−ＧＬＹ−ＰＲＣＩ− ＡＲＧ−ｇｌｎ−ＣＯＯＨ）を含む１Ｇアミノ酸ペプチド（ＺＰ３アミノ酸３２ ８〜３４３）を合成し、ＮＰ、未シスナインを通してキーホールリンベットヘモ シアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；　Ｋ　Ｌ　Ｈ ）に結合した。

１６アミノ酸ペプチドを応用バイオシステム固相合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）モデル４ ３０Ａ上で合成し［Ｒ，Ｂ、門ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｍｅｒ。

Ｓａｃ、、　８５．２１４９　（１９６３年）〕、脱保護し、１０％のアニソー ルと１０％のチオフェノールを含有する無水フッ化水素を用い、０°Ｃで２時間 、フェニルアセトアミドメチル樹脂から放出した。粗製ペプチドをＶｙｄａｃＣ ４カラム上でＨＰＬＣにより精製し、アミノ端末システィンをマレイミド結合を 通してＫＬＨに結合することでキーホールリンベットヘモシアニンに接合した（ Ｒ，Ａ、　Ｌｅｒｎｅｒ　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、　７Ｌ３４０３（１９８１年）〕。

ム　ペプチ゛　クチンの １６匹のＮＩＨ任意飼育スイスマウスを同量の完全フロインドアジュバント中の ＨＰ３ペプチド−ＫＬｆ（接合体（１，ｍｇ／ｎｌ　）　１００μｇを腹膜内に 入れて免疫化し、１０〜１４日毎に不完全フロインドアジュバント中の接合ペプ チド１００μｇを追加した。ＥＬＩＳＡ中の可溶化透明帯全体を使用して循環し ている抗透明帯抗体を検出した。柔軟なＥＬＩＳＡプレートを精製された酸可溶 化透明帯で［Ｊ、Ｄ、　ＢｌｅｉｌおよびＰ、Ｍ、　Ｗａｓｓｅｒｍａｎ、Ｊ、 　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋、、　１０２．１３６３　（１９８６年）〕、窪み当り１ ０１００ｎ：被覆し、Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７，５，０，１５モル゛　さ７３ 　Ｃｉ　Ｃ７Ｂ３　）中の１％牛血清アルブミ〕ノでブロックし、上記と同じ液 中で１：１０’に希釈した血清で培養した。プレートを７８３７１％　Ｔｗｅｅ ｎ−２０で数回洗浄し、ヤギ抗マウス抗体と接合したワサビペルオキシダーゼ（ ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；　ＨＲＰ）で培養し、以前 と同様に洗浄してから、ワサビペルオキシダーゼ基質キラ）　（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ ）を用いて現像した。この応答は４１４　ｎｍでの吸光度を測定して定量した。

平均応答の高原状レベルが、５回の免疫処理の後に得られた。循環している抗透 明帯抗体の量は動物により変動し、その応答の高低の差はほぼ６倍にも達するこ とは注目に値する。対照動物は、同一の処決でＫＬＨのみで免疫処理され、検出 可能な循環抗透明帯抗体はなかった。

個々の透明帯蛋白質による免疫化動物からの血清の反応性を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ から分離した精製透明帯のウェスタンプロット法により分析した。単離したマウ ス透明帯を酸可溶化し、１０％アクリルアミドを用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥにより 分離したＣＵ、に、　Ｌａｅ＋ｍｍ１ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０　（１９７０年）］。蛋白質をニトロセルロース に移しくＷ、Ｎ、　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋ 。

１１２．１９５　（１９８０年）〕、濾過物を７８３７１％、ＢＳＡ中に漬けた 。血清または抗体を７８３７１％、Ｂ５Ａ１０．１％、Ｔｗｅｅｎで希釈し、個 々のレーンを次のもの？、こより調べｔ＝、　：　］、　：　５０に希釈された 免疫化前の血清；１：５０に希釈されたＫＬＨ免疫化マウス（複）からの免疫血 清；１：５０に希釈したＺＰ３ペプチド−ＫＬＨ免疫化マウス（複）からの免疫 血清；１：５０に希釈したラット抗マウスＺＰ３モノクローナル抗体〔８〕　； および、１：５０に希釈したラビント抗マウスシナ透明ポリクローナル抗血清（ Ｅａｓ　ｔら、１９８５年、前述）。フィルターをＴＢＳｌｏ、１％　Ｔｗｅｅ ｎで洗浄し、ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ　１：　１０００に希釈した適当な特 異性のＨＲＰ標識第２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｔｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ） を使って培養した。

ニトロセルロース結合の抗体を、４−クロロ−１−ナツタノールで視覚化した。

ＺＰ３ペプチド−Ｋ　Ｌ　Ｈ接合体で免疫化した動物からの血清は、ＺＰ３と混 在している透明帯蛋白質の１つと反応した。免疫化前や対照血清の例には、透明 帯蛋白質のどれかとの反応も検出されなかった。

抗ペプチド抗体が、生来の状態で、また酸可溶化、５ＤＳ−変性処理状態で、透 明帯を識別するかどうか調べるために、本実験動物と対照動物とから採取した血 清をマウス卵巣の未固定冷凍部に染色させるのに使用した。卵巣を除去し、直ち にドライアイス上でＴｉ５ｓｕ　ｅ　−Ｔ　ｅ　ｋ　Ｏ、Ｃ、Ｔ　、化合物（Ｌ ａｂ−Ｔｅｋ製）中で冷凍した。

５μｍ断片をゼラチン被覆プレートにのせて２０°Ｃで１５分間ＰＢＳ中のＢ５ Ａｌ％で処理し、ＰＢＳ中でリンスした。免疫化マウスからの未希釈血清で断片 を１時間処理し、ＰＢＳ中でリンス後、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に１＝５０で希釈した Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｉｍｍｕｎｏｒｅｓ ｅａｒｃｂ　）で２０゛ｃで３０分間染色した。

ｌｒ片ヲＰ　Ｂ　Ｓでリンスし、フルオルマウント−３（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈ）にのせてエフタフローム２ｏｏフイルムを使って写真撮影した。フル オレセイン接合（ｆｌｕｏｒｅ−ｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　）の第２ 抗体を用いて、本実験マウスから採取したマウス抗体を発生中の卵母細胞を囲ん でいる透明帯に結合させ、循環抗透明帯抗体が生来のＺＰ３蛋白質と結合可能で あることが分かった。対照マウスからの血清で染色した断片には、検出可能な蛍 光は無かった。

循環抗ＺＰ３抗体が、本実験マウスの生長途中の卵母細胞を囲んでいる透明帯に 結合するに充分な力価を持っているかどうか調べるために、ＺＰ３−ＫＬＨ接合 体で免疫化された４匹のメスから分離した卵巣の断片を埋め込んだプラスチック を、抗マウス抗体に接合したワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で染色した。

解剖した卵巣を１％グルタルアルデヒド中で１時間固定し、ＰＢＳ中でリンスし てからＪＢ４プラスチックに埋め込んだ。内因性抗体を抗マウスストレプトアビ ジン−ＨＲＰキット（Ｚｙｍｅｄ）を用いて４μｍ断片中で検出した。

マウス抗透明帯抗体が、検査した断片中の卵母細胞の透明帯を被覆しているのが 観察された。４匹の対照マウス（ＫＬＨのみを注射された）から分離した卵巣中 に検出可能な抗透明帯抗体はなかった。処理動物と対照動物の両方からの卵巣断 片は、正常な濾胞のみを有し、また炎症や細胞毒性の痕跡のない細胞型のみであ った。ＺＰ３−ＫＬＨ免疫化動物の抗血清は、マウスの地組織、例えば脳、肝臓 、ｌｐＩ！臓、腎臓、心臓、肺、腸、精巣、筋肉等とは反応せず（データを掲載 せず）、このことはペプチド接合体による免疫化が透明帯に特異な応答を誘導す ることを意味する。

治」Ｌペブー巳上ユｊ（−７−９１■肱深−残っている１２匹の当実験用マウス と１２匹の対照マウスを証明済みのオスと繰り返しかけ合わせて受精をテストし た。最後の免疫化処理から２週間後、証明済みのオスを、木実験用と対照用のマ ウスと個々に１：１の割合で継続的にカゴに入れた。出産した動物のパーセント に対する継続的かけ合わせ期間を、ＺＰ３ペプチド−ＫＬＨおよびＫＬＨのみを 注射した動物と比較した。ＺＰ３ペプチド−Ｋ　Ｌ　Ｈ免疫化マウスの３グルー プの抗ＺＰ抗体の力価は、かけ合わせ期間の最初では平均していたが、平均力価 の上昇順序にならべて、次の通りであった：第１グループー１カ月以内に生んだ （３匹）；第２グループ−４〜７力月間に生んだ（３匹）；第３グループ−９力 月の研究期間中には生まなかった（６匹）。

要約づると、対照マウス（Ｋ　Ｌ　ｉ（のみを注射）のすべてがオスを入れてか ら３．５週間以内に妊娠したことになる。ＺＰ３ペプチド−ＫＬＨ注射マウスで ある本実験動物の３匹もこの期間内に出産している。これらは、かけ合わせ前の 抗透明帯抗体力価が最低だった（＜０．２　Ａａ＋ａ単位）ものの一部である。

本実験用マウスの残りのものには避妊効果が認められ、それは研究期間が終了す る１６〜３６週迄持続した。この動物の内の３匹が１６〜２４週後に妊娠し、こ れらの抗透明帯抗体力価は中間にあった。研究期間中に不妊のままだった残りの 動物の初期力価は最高値であり、最後の免疫化処理の９力月後でさえも循環して いる抗透明帯抗体が検出可能であった。

結局受精したＺ　Ｐ　３−　Ｋ　Ｌ　Ｈ処理動物の同腹子（ｌｉｔｔｅｒ）は、 １〜５匹（平均２．８）であり、一方ＫＩ７Ｈのみで処理したもののリターは１ 〜９匹（平均５．２）であった。両グループ共、正常な７〜１４匹（平均１０） より少なく、これは一部には、フロインドアジュバントを腹膜内に投与したこと が生殖力に悪影響を及ぼしたためと考えられる。更にＫ　Ｌ　Ｈ−Ｚ　Ｐ　３処 理動物のリターが他より小さいのは、循環している抗透明帯抗体が常に低レベル であった為と考えられ、その抗体の幾つかは卵巣内の卵母細胞を取り囲んでいる 透明帯に結合しているのが検出された。このような低レベルの抗透明帯抗体の存 在にもかかねねらず、これら動物を再度かけ合わせると３．５週以内に妊娠した 。

本発明の背景および開示をよく理解する目的で、公表された記事、特許および特 許出願をその出典を明確にして、本明細書中に引用した。

上述した様に、発明の趣旨を明確に理解させる為に、本発明の詳細な説明した。

本発明の範囲内で形式や内容を種々組み合わせるのが可能なことは言う迄もない 。

ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＴＣＣＴＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　Ｇ ＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅ ｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＧＴＧ　ＣＭ）　ＣＣＣＧＧＧ　ＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＴ 　ＧＧＣＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　ＣＣＣＶａｌ　Ｇｉｎ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

ＣＡＣＧＡＧ　ＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　 ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＣＴＧ　ＧＴＧＨｌｓ　ＧＩＬＩ　ＣＹＳ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　’ｒｈｒ　Ｌｙｓ　ＡｓＣ）　Ａｌａ 　Ｌｅｕ　Ｖａ１ＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧ　ＡＣＴ　ＡＡＣＣＧＴ　ＧＴＧ　 ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＣＣＡＴＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣＣＧＡＳｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ 　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ 　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ＡｒｑＴＧＧ　ＧＴＴ　ＣＣＣＴＴＣＡＧＡ　ＧＣＣＡＣＴ 　ＧＴＧ　ＴＣＣＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＧＣ丁Ｔｒｐ　Ｖ ａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒｃ＋　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧＣＴ　ＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣ ＴＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡＡＡ ｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｈ＋ｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｈａ　Ｇｌｕ丁Ｃ丁　ＧＡＧ　ＡＧＣＴＴＴ 　ＴＣＧ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＣＡＡ　ＧＴＣＣＣＣＡＧＡ　ＣＣＣＣＧＧ　ＣＣ Ａ　ＧＡＧＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ 　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＴＴＣＣＡＧ　Ａ ＴＣＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＣＣＣＧＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＴｈ　Ｇ ＴＴ　丁Ｃ丁　ＣＧＡＰｈｅ　Ｇｉｎ　ｌｉｅ　Ｈｉｓ　Ｇｉｙ　Ｐｒｏ　Ａｒ ｇ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｒｃ＋ユニ ４０ ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＴＴＣＣ７丁　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ　 ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＧＧＣＴＧＧＬｅｔ、ｌ　Ｉ　Ｉｅ　Ｐｉｅ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｏ　Ｇｉｎ　Ｔｉｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ 　Ｇａｙ　ＴｒｐＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＴＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＣ Ａ　ＧＣＴ　ＡＴＡ　ＧＴＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＣＡＣＣＴｈｒ　Ｖａｔ　Ａ ｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｌｌｅ　Ｖａｌ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｔ　ＴｈｒＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＡ　３’　ＦＩ Ｇ−１−２４１ＰＶＬＶＥＣＱＥＡＴＬＭＶＭＶＳＫＤＬＦＩＩ　Ｉｌｌ　ＩＩ 　１．１　１１　：１１＋４１　ＰＶＫＶＥＣＬＥＡＥＬＶＶＴＶＳＲＤＬＦ６ １　ＧＴＧＫＬ　工　ＲＡＡＤＬＴＬＧＰＥＡＣＥＰｌｌｌｌｌ、　１１１１１ 　１　１．１６１　ＧＴＧＫＬＶＱＰＧＤＬＴＬＧＳＥＧＣＱＰ８１　ＬＶＳＭ ＤＴＥＤＶＶＲＦＥＶＧＬＨＥＣＧｌｌ、１１　１１１１１　１１１＋ ８１　ＲＶＳＶＤＴ　ＤＶＶＲＦＮＡＱＬＨＥＣ５１０１Ｎ　Ｓ　Ｍ　Ｑ　Ｖ　 Ｔ　Ｄ　Ｄ　Ａ　Ｌ　Ｖ　Ｙ　Ｓ　Ｔ　Ｆ　Ｌ　Ｌ　ＨＤ　Ｐ、１．ｌ　１１１ １１１１１１１１１１１００　Ｓ　ＲＶ　Ｑ　Ｍ　Ｔ　Ｋ　Ｄ　Ａ　Ｌ　Ｖ　Ｙ 　Ｓ　Ｔ　Ｆ　Ｌ　Ｌ　ＨＤ　Ｐ１２１　ＲＰ　Ｖ　Ｇ　Ｎ　Ｌ　Ｓ　Ｘ　Ｖ　 ＲＴ　Ｎ　ＲＡ　Ｅ　Ｉ　Ｐ　工　Ｅ　Ｃｌ１１　１１１．１１１１　１１１１ ＋１２０　ＲＰ　Ｖ　Ｓ　Ｇ　Ｌ　Ｓ　Ｉ　Ｌ　ＲＴ　Ｎ　ＲＶ　Ｅ　Ｖ　Ｐ　 Ｉ　Ｅ　Ｃ１６１ＲＴ　Ｔ　Ｖ　Ｆ　Ｓ　Ｅ　Ｅ　Ｋ　Ｌ　Ｔ　Ｆ　Ｓ　Ｌ　Ｒ Ｌ　Ｍ　Ｅ　Ｅ　ＮＩ　ＩＩ　１１１１１　１１１１１１１１１１６０　ＲＡ　 Ｔ　Ｖ　Ｓ　Ｓ　Ｅ　Ｅ　Ｋ　Ｌ　Ａ　Ｆ　Ｓ　Ｌ　ＲＬ　Ｍ　Ｅ　Ｅ　Ｎ１８ １　Ｗ　Ｎ　Ａ　Ｅ　Ｋ　ＲＳ　Ｐ　Ｔ　Ｆ　ＨＬ　Ｇ　Ｄ　Ａ　Ａ　ＨＬ　Ｑ 　ＡＩＩ　ＩＩ　１１１１１１．　１１１１１１８０　Ｗ　Ｎ　Ｔ　Ｅ　Ｋ　Ｓ 　Ａ　Ｐ　Ｔ　Ｆ　ＨＬ　Ｇ　Ｅ　Ｖ　Ａ　ＨＬ　Ｑ　Ａ２３９ＣＬＶＤＧＬ丁 ＤＡＳＳＡＦＫＶＰＲＰＧＰ１１１１１１　・　Ｉｌｌ　１１１＋　１２４０　 ＣＬ　Ｖ　Ｄ　Ｇ　Ｌ　Ｓ　Ｅ　Ｓ　Ｆ　Ｓ　Ａ　Ｆ　Ｑ　Ｖ　Ｐ　ＲＰ　Ｒ？ ＦＩＧ、　２Ｂ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３　年１２月１１日−一 １、　国際出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０３０７５ λ　発明の名称 クローン化透明帯遺伝子を基本とする避妊ワクチン３、　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、２２１６１　ヴアージニア、スプリングフィールド、 ボート、ロイヤシ。ロード５２８５名　称　アメリカ合衆国 ４、代理人　〒１０７ （ほか２名） 請求の範囲（補正） ■、（訂正）哺乳類の雌用であって、精子による卵の受精を抑制する抗体の結合 用のエピトープを少なくとも一つ表示するように選んだアミノ酸配列を含むポリ ペプチドを含有する避妊用ワクチンにおいて、上記エピトープの機能的相同体が 透明帯蛋白質上に表示され、上記透明帯蛋白質が上記ワクチンを使用する種を起 源とするものであり、上記ワクチンが更に薬理学的に使用可能な賦形剤を含むこ とを特徴とする避妊用ワクチン。

２、（訂正）上記透明帯蛋白質が、ＺＰ３蛋白質およびＺＰ２Ｗ白質から成る群 から選ばれることを特徴とする請求項第１項記載の避妊用ワクチン。

３、上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、上記透明帯蛋白質のアミノ 酸配列を少なくとも一つ含むことを特徴とする請求項第１項記載の避妊用ワクチ ン。

４、上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、上記透明帯蛋白質のアミノ 酸配列の少なくとも一つに関する類似体を含むことを特徴とする請求項第１項記 載の避妊用ワクチン。

５、上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、マウスＺＰ３Ｗ白質のアミ ノ酸配列の少なくとも一つに関する類似体を含むことを特徴とする請求項第４項 記載の避妊用ワクチン。

６．上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、マウスＺＰ２蛋白質の少な くとも一つのアミノ酸配列に関する類似体を含むことを特徴とする請求項第４項 記載の避妊用ワクチン。

７、上記エピトープを表示する合成ペプチドを更に含む請求項第１項記載の避妊 用ワクチン。

８、上記合成ペプチドが、マウスＺＰ３アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−１１ｅ− Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｇｉｎを含むことを特徴とする請求項第７ 項記載の避妊用ワクチン。

９、上記合成ペプチドが、マウスＺＰ３アミノ酸配列Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ａｓｎ− ３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ　−５ｅｒ−Ｇｉｎを更に含むことを特徴とする請求項 第８項記載の避妊用ワクチン。

１０、上記合成ペプチドが、マウスＺＰ３アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ −Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

−Ａｒｇに関する類似体を含むことを特徴とする請求項第７項記載の避妊用ワク チン。

１１、上記合成ペプチドがマウスＺＰ３アミノ酸配列Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ａｓｎ− ３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ　−３ｅｒ−Ｇｌｎを更に含むことを特徴とする請求項 第８項記載の避妊用ワクチン。

１２、上記類似体が、マウス以外の動物からのＺＰ３蛋白質中の相同の位置に含 まれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項第１０項記載の避妊用ワクチ ン。

１３、上記ワクチンを使用する上記の哺乳類の雌が猫、犬、豚、牛、およびヒト 女性から成る群から選ばれることを特徴とする請求項第１項記載の避妊用ワクチ ン。

１４、上記避妊用ワクチンがそのワクチンを使用する種の上記エピトープへの避 妊抗体の応答性を高めるのに効果があるアミノ酸配列を更に含むことを特徴とす る請求項第１項記載の避妊用ワクチン。

１５、上記抗体の上記エピトープへの応答性を高める上記アミノ酸配列が、上記 エピトープを表示するポリペプチド中に含まれることを特徴とする請求項第１４ 項記載の避妊用ワクチン。

１６、上記抗体の上記エピトープへの応答性を高める上記アミノ酸配列が、上記 エピトープを表示するポリペプチドと共有結合により結合している第２のポリペ プチド中に含まれることを特徴とする請求項第１４項記載の避妊用ワクチン。

１７、上記抗体の上記エピトープへの応答性を高める上記アミノ酸配列が、少な くとも一つのＴ細胞エピトープを更に含むことを特徴とする請求項第１４項記載 の避妊用ワクチン。

１８、有効量のアジュバントを更に含む請求項第１項記載の避妊用ワクチン。

１９、（訂正）精子による哺乳類の卵の受精を抑制する抗体の結合のための少な くとも一つのエビドームを表示するように選ばれたアミノ酸配列を含むマウスＺ Ｐ３蛋白質の少なくとも一部をコード化しているＤＮＡセグメント。

２０、マウスＺＰ２蛋白質の少なくとも一部をコード化しているＤＮＡセグメン ト。

２１、ヒトＺＰ３蛋白質の少なくとも一部をコード化しているＤＮＡセグメント 。

２２、請求項第２１項記載のＤＮＡセグメントから成る、組換えＤＮＡ分子とヘ クター。

２３、請求項第２１項記載のＤＮＡセグメントにより組換えられた細胞のカルチ ャー。

２４、ヒトＺＰ３蛋白質の少な（とも一部を生成する方法において、上記蛋白質 を生成する条件のもとて請求項第２３項記載の細胞を培養し、当該蛋白質をこの 細胞から分離することから成る上記蛋白質の生成法。

２５、ヒトＺＰ３蛋白質の少なくとも一部のアミノ酸配列を有する蛋白質に対し て特異的な抗体。

２６、（訂正）上記抗体が精子によるヒトの卵の受精を抑制することを特徴とす る請求項第２５項記載の抗体。

国際調査報告 ｌｎｍＡｌ１１６ｆｆｉｊ１１１ｅｅ−□＋自”””ＰＣ”ｒ／ＵＳ９０／［’ ｌｌ（’＋７５

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類の雌用であって、精子による卵母細胞の受精を抑制する抗体の結合用 のエピトープを少なくとも１つ表示するように選んだアミノ酸配列を含むポリペ プチドを含有する避妊用ワクチンにおいて、上記エピトープの機能的相同体が透 明帯蛋白質上に表示され、上記透明帯蛋白質が上記ワクチンを使用する種を起源 とするものであり、上記ワクチンが更に薬理学的に使用可能な賦形剤を含むこと を特徴とする避妊用ワクチン。
2. ２．上記透明帯蛋白質が、ＺＰ３蛋白質、ＺＰ２蛋白質、およびＺＰ１蛋白質か ら成る群から選ばれることを特徴とする請求項第１項記載の避妊用ワクチン。
3. ３．上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、上記透明帯蛋白質のアミノ 酸配列を少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項第１項記載の避妊用ワクチ ン。
4. ４．上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、上記透明帯蛋白質のアミノ 酸配列の少なくとも１つに関する類似体を含むことを特徴とする請求項第１項記 載の避妊用ワクチン。
5. ５．上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、マウスＺＰ３蛋白質のアミ ノ酸配列の少なくとも１つに関する類似体を含むことを特徴とする請求項第４項 記載の避妊用ワクチン。
6. ６．上記エピトープを表示する上記アミノ酸配列が、マウスＺＰ２蛋白質の少な くとも一つのアミノ酸配列に関する類似体を含むことを特徴とする請求項第４項 記載の避妊用ワクチン。
7. ７．上記エピトープを表示する合成ペプチドを更に含む請求項第項１記載の避妊 用ワクチン。
8. ８．上記合成ペプチドが、マウスＺＰ３アミノ酸配列【配列があります】 を含むことを特徴とする請求項第７ 項記載の避妊用ワクチン。
9. ９．上記合成ペプチドが、マウスＺＰ３アミノ酸配列【配列があります】 を更に含むことを特徴とする請求項 第項８記載の避妊用ワクチン。
10. １０．上記合成ペプチドが、マウスＺＰ３アミノ酸配列【配列があります】 に関する類似体を含むことを特徴とする請求項第７項記載の避妊用ワクチン。
11. １１．上記合成ペプチドがマウスＺＰ３アミノ酸配列【配列があります】 を更に含むことを特徴とする請求項第 項８記載の避妊用ワクチン。
12. １２．上記類似体が、マウス以外の動物からのＺＰ３蛋白質中の相同の位置に含 まれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項第項１０記載の避妊用ワクチ ン。
13. １３．上記ワクチンを使用する上記の哺乳類の雌が猫、犬、豚、牛、およびヒト 女性から成る群から選ばれることを特徴とする請求項第項１記載の避妊用ワクチ ン。
14. １４．上記避妊用ワクチンがそのワクチンを使用する種の上記エピトープヘの避 妊抗体の応答性を高めるのに効果があるアミノ酸配列を更に含むことを特徴とす る請求項第項１記載の避妊用ワクチン。
15. １５．上記抗体の上記エピトープヘの応答性を高める上記アミノ酸配列が、上記 エピトープを表示するポリペプチド中に含まれることを特徴とする請求項第項１ ４記載の避妊用ワクチン。
16. １６．上記抗体の上記エピトープヘの応答性を高める上記アミノ酸配列が、上記 エピトープを表示するポリペプチドと共有結合により結合している第２のポリペ プチド中に含まれることを特徴とする請求項第項１４記載の避妊用ワクチン。
17. １７．上記抗体の上記エピトープへの応答性を高める上記アミノ酸配列が、少な くとも１つのＴ細胞エピトープを更に含むことを特徴とする請求項第項１４記載 の避妊用ワクチン。
18. １８．有効量のアジュバントを更に含む請求項第項１記載の避妊用ワクチン。
19. １９．マウスＺＰ３蛋白質の少なくとも１つの蛋白質をコード化しているＤＮＡ セグメント。
20. ２０．マウスＺＰ２蛋白質の少なくとも一つの蛋白質をコード化しているＤＮＡ セグメント。
21. ２１．ヒトＺＰ３蛋白質の少なくとも一つの蛋白質をコード化しているＤＮＡセ グメント。
22. ２２．請求項第項２１記載のＤＮＡセグメントから成る、組換えＤＮＡ分子とベ クター。
23. ２３．請求項第項２１記載のＤＮＡセグメントにより組換えられた細胞のカルチ ャー。
24. ２４．ヒトＺＰ３蛋白質の少なくとも一部を生成する方法において、上記蛋白質 を生成し、次に下記細胞からこの蛋白質を分離する条件下で請求項第項２３記載 の細胞を培養することから成る上記蛋白質の生成法。
25. ２５．ヒトＺＰ３蛋白質の少なくとも一部のアミノ酸配列を有する蛋白質に特異 的な抗体。
26. ２６．上記抗体が精子によるヒトの卵母細胞の受精を抑制することを特徴とする 請求項第２５項記載の抗体。