JPH07503844A

JPH07503844A - 顆粒球コロニー刺激活性を有する新規なポリペプチド，それらの調製およびそれらを含有する医薬組成

Info

Publication number: JPH07503844A
Application number: JP5512987A
Authority: JP
Inventors: イー，パトリス
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1992-01-31
Filing date: 1993-01-28
Publication date: 1995-04-27
Also published as: WO1993015211A1; NO942858D0; FI943564A0; FI943564L; EP0624200A1; FR2686900A1; NO942858L; CA2125979A1; FI943564A7; FR2686900B1; US5665863A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト顆粒球コロニー刺激活性を有する新規なポリペプチド、それらの調製およびそれらを含有する医薬組成物に関する。

本発明は、特に、Ｇ−Ｃ３ＦもしくはＧ−Ｃ３Ｆ変異体の全てもしくは部分からなる生物学的活性部分から構成されるキメラポリペプチド、および新規な生物学的性質をそれに付与している本質的にタンパク質の安定化構造に関する。

ヒトＧ−Ｃ３Ｆは、分子量はぼ１８ｋＤを有するアミノ酸１７４個の分泌ポリペプチドである。それは、がん細胞系より初めて単離され（欧州特許第１６９．５６６号）、そしてその遺伝子は、クローン化され、塩基配列決定され、遺伝子工学技術によって異種の細胞宿主において発現されてきた（欧州特許第２１５．１２６号、欧州特許第２２０．５２０号）。さらに、アミノ酸１７７個を有するＧ −Ｃ３Ｆの形を潜在的にコードしているｍＲＮＡが、検出されている［Ｎａｇａｔａ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　５　（１９８６）　５７５−５８１３゜Ｇ−Ｃ３Ｆは、顆粒球への骨髄幹細胞の分化および増殖を刺激する機能を保持している。したがって、それは、多形核好中球の成長と成熟に至る分化を促進することによって、感染に対する生体の防御機能を刺激する能力を持っている。か（して、それは、生体の予防機能を活性化することができ、モして好中球の数が異常に低下するが、あるいは免疫系が強化されることを必要とする種々の病理学的状況において使用されてもよい。そのような状況は、例えば、がんの化学療法処置に続いて、移植、特に骨髄移植において、または白血球減少状態において生じる。

現在入手できるＧ−ＣＳＦの欠点の一つは、それが、一旦投与された生体によって、急速に分解されるという事実にある。このことは、Ｇ−Ｃ３Ｆが一般に低投与量で使用されるという事実のために一層注目されるべきことである。その上さらに、より高い投与量を使用しても、この分子の治療能を改善することはできず、反対に副作用を誘発することもある。それ故、これらの生体内での消失および分解現象は、現在では、Ｇ−Ｃ３Ｆの生物学的活性の医薬成分としての利用に対して障害となっている。

本発明は、これらの障害を取り除くことを可能とする。事実、本発明は、Ｇ−ＣＳ　Ｆの生物学的性質を、治療上の観点から最適に利用されることを可能にする新規な分子を提供する。実際に、本発明者は、Ｇ−Ｃ３Ｆが低投与量で長時間存在する場合に、最適のＧ−Ｃ８Ｆ活性が発揮されることを示した。今や、本発明者は、十分に長時間体内でＧ−Ｃ３Ｆ活性を維持できる分子を作出した。さらに、本発明者は、それが、Ｇ−Ｃ３Ｆの新規な薬動学的性質およびその望ましい生物学的性質を有する遺伝学的融合で作出されるキメラを、細胞宿主中に高レベルで発現することができることを示した。特に、本発明のハイブリッドポリペプチドは、Ｇ−Ｃ３Ｆ受容体に対するそれらの親和性を保持しており、増殖と細胞分化に導くために十分に機能する。さらに、本発明の分子は、その体内において特に好都合である分布と薬動学的性質を有する。

それ故、本発明の主題は、Ｇ−Ｃ３Ｆ、またはＧ−Ｃ３Ｆ変異体の全てもしくは部分からなる活性部分、および本質的にタンパク質の安定化構造を含有する組み換えポリペプチドに関する。

本発明の目的のために、用語Ｇ−Ｃ３Ｆ変異体は、図１に示された配列の残基Ｔｈｒ５８６およびＰｒｏ７５９の間に位置する配列の改変によって得られたいかなる分子をも表していて、それはＧ−Ｃ３Ｆ活性、すなわち、標的細胞の分化および顆粒球コロニーの形成を刺激する能力を持っている。この配列は、Ｎａｇａｔａらによって記載された成熟Ｇ−Ｃ３Ｆのそれに対応する［ＥＭＢＯＪ、旦（１９８６）　５７５−５８１］。改変は、いかなる変異、置換、欠落、付加、または遺伝学的および／または化学的性質の作用から生じる改変をも意味すると理解される。そのような変異体は、種々の目的、例えば、特に、Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するその分子の親和性を増大させる目的、その生産レベルを改良する目的、そのプロテアーゼ抵抗性を増大させる目的、その治療効果を増加させるかその副作用を低減させる目的、あるいは新しい薬動学的および／または生物学的性質をそれに付与する目的で作出されてもよい。

本発明の特に有用なポリペプチドは、その生物学的活性部分が＝　（ａ）図１に示された配列のＴｈｒ５８６およびＰｒｏ７５９残基の間に位置するペプチド配列、または（ｂ）　構造（ａ）の部分、または（Ｃ）構造的改変（１個もしくはそれ以上の残基の突然変異、付加置換および／または欠落）によ、て構造（ａ）もしくは（ｂ）から得られた構造を持ち、そして同一もしくは改変された生物学活性を有しているものである。この後者のポリペプチドのタイプは、例えば、いくつかのグリコジル化部位が、改変もしくは除去されている分子、ならびに１個、数個もしくは全てのンステイン残基が置換されている分子を含有する。それはまた、（ａ）もしくは（ｂ）から、活性にほとんどまたは全く関与しない領域、あるいは好ましくない活性に関与する領域を欠落させることによって得られた分子、および（ａ）もしくは（ｂ）に関して、例えば、Ｎ−末メチオニンもしくは分泌ソゲナルのような付加残基を含む分子を含有する。

さらに好ましくは、本発明のキメラポリペプチドは、タイプ（ａ）の活性部分を含有する。

本発明の分子の活性部分は、タンパク質の安定化構造に、直接もしくはペプチドリンカ−を通して結合されてもよい。その上、それは、その分子のＮ−末端もしくはＣ−末端を構成することもできる。好ましくは、本発明の分子において、活性部分は、キメラのＣ−末部分を構成する。

上述のように、本発明のポリペプチドの安定化構造は、本質的にタンパク質である。

好ましくは、この構造は、長い血漿中半減期を持つポリペプチドである。例えば、それは、アルブミン、アポリポタンパク質、免疫グロブリンまたは選択的にトランスフェリンでありてもよい。好適なペプチドは、また、そのようなタンパク質から構造的改変によって得られたもの、または長い血漿中半減期を持つ人工的もしくは半人工的に合成されたペプチドでもよい。さらに、使用される安定化構造は、より好ましくは、本発明のポリペプチドが使用される生物体に対して弱い免疫性があるか全く免疫性のないポリペプチドである。

本発明の特に有用な実施態様においては、安定化構造は、アルブミンもしくはアルブミンの変異体であり、例えばヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）である。アルブミンの変異体は、特定の同形のヒト血清アルブミンをコードしている遺伝子の遺伝子工学技術による改変（突然変異、欠落および／または付加）によって得られた長い血漿中半減期を有する全てのタンパク質、ならびに、そのような遺伝子によってコードされたタンパク質の試験管内改変によって得られた長い血漿中半減期を有する全ての高分子を意味すると理解される。アルブミンは、非常に多形性であるので、多くの天然の変異体が、既に同定されていて、３０種以上の異なる遺伝タイプが列挙されている［ｆｅｉｔｋａｍｐ　Ｌ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｈｕｍ。

例としては、Ｎ−末→Ｃ−末方向において、（ｉ）成熟Ｇ−Ｃ３Ｆ配列に直接結合された成熟Ｈ３Ａ配列（図１、参照）、または（ｉ　ｉ）成熟Ｉ　Ｓ　Ａ配列にペプチドリンカ−を通して結合された成熟Ｇ−ＣＳＦ配列を含有する本発明のポリペプチドを挙げることができる。

本発明のその他の主題は、上記のキメラ分子を調製する方法に関する。

より特別には、この方法は、望まれるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、真核もしくは原核生物細胞に発現させること、そして次に産生されたポリペプチドを収得することにある。

本発明の明細書において使用される真核生物宿主には、動物細胞、酵母もしくは真菌類が挙げられる。特に、酵母に関しては、サツ力ロミセ属の酵母が挙げられる。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ，Ｃ１２７、およびそれに類する細胞が挙げられる。本発明において使用するこ挙げられる。原核生物宿主としては、エンエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するような細菌を使用することが好ましい。

本発明の明細書中に使用されるヌクレオチド配列は、種々の方法で調製することができる。一般には、それらは、ポリペプチドの各機能的部分をコードしている配列を、リーディングフレーム中に組み立てることにより得られる。これらは、当業者の技術、例えば細胞内メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から直接、またはその生産物を作る細胞から単離された相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）のライブラリーからの再クローニングによって単離することができるし、さもなくば、問題のヌクレオチドは完全な合成ヌクレオチドであってもよい。さらに、そのヌクレオチド配列はまた、該配列の誘導体もしくは変異体を得るために、例えば遺伝子工学技術によって続いて改変されてもよいと理解される。

より好ましくは、本発明の方法において、そのヌクレオチド配列は、宿主細胞中で、その制御下に置かれ、そして本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を可能にする転写開始領域（プロモーター領域）を含んでなる発現カセットの要素を形成する。この領域は、使用される宿生細胞で強く発現され、その発現は構成的もしくは調節的である遺伝子のプロモーター領域から作出することができる。酵母ゲナーゼ（ＡＤＨ）およびそれに類するものの遺伝子のプロモーターであってもよい。細菌に関しては、そのプロモーターは、ノくクテリオファージλのライト（ｒ　ｉ　ｇｈ　ｔ）もしくはレフト（ｌｅｆｔ）遺伝子（ＰＬ、ＰＲ）のプロモーター、さもなくばトリプトファン（Ｐ、、、）もしくはラクトース（Ｐ、、りオペロンのプロモーターでもよい。加えて、この制御領域は、例えば試験管内の変異誘発、付加的な制御因子もしくは合成塩基配列の導入、または元の制御因子の欠落もしくは置換によって改変することができる。

発現カセットはまた、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の下流に隣接して置かれた、問題の宿主で機能する転写終止領域を含むこともできる。

好適な実施態様においては、本発明のポリペプチドは、真核もしくは原核生物宿主におけるヌクレオチド配列の発現および培養液中への該配列をもつ発現産物の分泌により生じる。事実、組み換え体性を用いて培養液中に直接、分子を得ることができることは、特に有用である。この場合、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、使用された宿主の分泌経路中に新生ポリペプチドを差し向けるリーダー配列（またはシグナル配列）が前に置かれる。このリーダー配列は、Ｇ−ＣＳＦの、または本来分泌されるタンパク質である場合のその安定化構造の本来の、シグナル配列であってもよいが、しかしそれは、またその他の機能性リーダー配列、もしくは人工的リーダー配列でもよい。これらのいずれを選択するかは、特に、使用される宿主によフて指示される。

機能性シグナル配列の例は、性フェロモンもしくは酵母のキラー毒素の遺伝子のそれを含む。

発現カセットに加えて、組み換え宿主の選択を可能にする１種以上のマーカー、例えば酵母Ｓ、セレビンエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子、またはゲネチシン（０４１８）のような抗生物質もしくはある種の金属イオンのようなその他いずれかの毒性化合物に対して耐性を付与する遺伝子が加えられてもよい。

発現カセットおよび選択マーカーからなる構築物は、問題の宿主細胞中に直接か、または機能性の自己複製ベクター中に予め挿入されてから導入され得る。最初の場合には、宿主細胞のゲノムに存在する領域と相同な塩基配列が、この構築物に加えられることが好ましい：次に、該配列が、相同組み換えによるその塩基配列の標的組み込みによって、宿主ゲノムへの構築物の組み込みの頻度を増大させるために、発現カセ、ットと選択遺伝子の各々の側に置かれる。その発現カセットが、複製系に挿入される場合には、クリヴエロミセス属の酵母の適切な複製系が、Ｋ。

ドロソフィラルム（Ｋ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）から最初に単離されたプラスミドｐＫＤ１から得られる。サツカロミセス属酵母の好適な複製系は、Ｓ　セレビシェの２μプラスミドから得られる。さらに、この発現プラスミドは、該複製系の全てもしくは部分を含有することもできるし、またプラスミドｐＫＤ１ならびに２μプラスミドに由来する因子を組み合わせることもできる。　加えて、その発現プラスミドは、エノエリヒア・コリのような細菌宿主と選ばれた宿主細胞との間のシャトルベクターでもよい。この場合には、細菌宿主で機能する複製の起点および選択マーカーが必要である。発現ベクター上の細菌の非反復配列を囲む制限部位を置くことも、また可能である・このことは、宿主細胞の形質転換前に、切断そして端を切り取ったベクターの試験管内での再連結によって、その配列を除去することを可能とし、それが該宿主における発現プラスミドのコピー数を増大し、安定性を高める結果となる。

例えば、そのような制限部位は、５’　−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ−３′（Ｓ１±Ｉ）もしくは５′−〇ＣＧＧＣＣＧＣ−３’　（Ｎ旦工Ｉ）のような配列に対応することができるが、その理由は、これらの部位は極端にまれであり、一般には発現ベクターには存在しないからである。

そのような発現ベクターもしくはカセットの構築後、これらは、文献記載の標準の技術に従って選択された宿主細胞中に導入される。これに関連して、外来ＤＮＡを細胞に導入させるいかなる方法も使用できる。

これには、特に、形質転換、エレクトロポレーション、接合またはその他の当業者に既知のいかなる方法も含まれる。酵母タイプの宿主の例として、使用される種々のクリヴエロミセス菌株が、Ｉｔｏらの技術に従って酢酸リチウムとポリエチレングリコールの存在において、全ての細胞を処理することによって形質転換された［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３　（１９８３）　１６３］。エチレングリコールおよびジメチルスルホキシドを用いるＤｕｒｒｅｎｓラニヨル記載の形質転換技術［Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８　（１９９０）　１’Ｊがまた使用された。Ｋａｒｕｂｅら記載の方法に従うエレクトロポレーションによって酵母ヲ形質転換スルコとも可能である［ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１８２　（１９８５）　９０１゜その他のプロトコールが、また次に挙げる実施例において詳細に記載される。

形質転換された細胞の選択の後、該ポリペプチドを発現する細胞が、接種され、そして該ポリペプチドの回収は、“連続”法での細胞増殖の間に、または“バッチ”培養の増殖末期に実施されてもよい。次いで、本発明の主題をなすポリペプチドは、それらの分子の、薬動学的、ならびに生物学的同定のために培養土清液から精製される。

本発明のポリペプチドのための好適な発現系は、宿主細胞としてクリヴエロミセス属の酵母を使用することにあり、その酵母は、Ｋ、マルキリコンｐＫＤｌから得られたあるベクターを用いて形質転換される。これらの酵母、特にに、ラクチス（Ｋ、］Ｂｃｔｉｓ）およびに、フラジリス（Ｋ、ｆ　ｒａｇｉ　］　ｉｓ）は、一般に該ベクターを安定に複製することができ、その上、ＧＲＡＳ　（一般に安全性が確認されている）生物のリストに含まれるという利点をも持っている。好適な酵母は、好ましくは、プラスミドｐＫＤ１由来の該プラスミドを安定的に複製することができ、そして選択マーカー、ならびに本発明のポリペプチドを高レベルに分泌できる発現カセットを挿入されたクリヴエロミセス属の工業的菌株である。

本発明は、また、前記キメラポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、ならびにそのような配列を含んでなる組み換え真核もしくは原核生物細胞に関する。

本発明は、また、本発明によるポリペプチドの医薬製品としての応用に関する。

より特別には、本発明の主題は、いずれか前記ポリペプチドの１種またはそれ以上を含んでなる医薬品組成である。より特別には、これらの組成は、顆粒球の数および／または活性が刺激されることを必要とする全ての病理学的状況において使用することができる。特に、それらは、白血球減少状態またはある種の白血病の予防もしくは治療のために、あるいは移植またはがん治療の場合において免疫系を強化もしくは回１夏させるために使用することができる。

本発明は、次に示す実施例によってより完全に説明されるであろうが、それは、例示として限定なしに考慮されるべきである。

図のリスト以下の図に示されるプラスミドの表示は、一定の比率で描かれているものではなく、実施されるクローニングの理解のために重要な制限部位のみが示されている。

図１＝　プラスミドｐＫＧ１２５９のＨｉｎｄｌｌｌ制限断片のヌクレオチド配列（キメラ　プレプロ−ＩＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆ）。実線の矢印ＳＦペプチド配列は、イタリックで示す（Ｔｈｒ５８６−Ｐｒｏ７５９；アミノ酸の数字は、成熟キメラタンパク質に対応する）。

図２：　ＨＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆタイプ（Ａ）およびＧ、Ｃ３Ｆ−ＨＳＡ（Ｂ）もしくはＧ、Ｃ３Ｆ−ＨＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆ　（Ｃ）タイプのキメラの図形表示。使用された略語：Ｍ／ＬＰ、翻訳開始メチオニン、その後に分泌シグナル配列が続くことが好ましい；ＨＳＡ、成熟ヒト血清アルブミンまたはその変異体のあるもの；ｃ、ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ３Ｆ由来で、同一もしくは改変された活性を有するペプチド。実線の矢印は、成熟タンパク質のＮ−末端を示す。

図３＝　プラスミドｐＫＧ１０５の制限酵素地図、および本発明のキメラタンパク質の発現のためのプラスミドの構築手法。使用された略語：Ｐ、転写プロモーター：Ｔ、転写ターミネータ−、ＩＲ，プラスミドｐＫＤ１の逆方向反復塩基配列、ＬＰ、、、Ａ、ＨＳＡ“プレプロ”領域；Ａｐ′およびＫｍ’は、それぞれ、アンピシリン（Ｅ、　コリ）およびＧ４１８（酵母）に対する耐性遺伝子を示す。

図４．　プラスミドｐＫＧ１２６６　（ＨＳＡ−Ｇ、Ｃ５Ｆタイプのキメラの発現のためのプラスミド）およびｐＫａｎ７０７　（対照プラスミド）によって形質転換された菌株ＣＢ５２９３．９１の４日間培養（エルレンマイヤー）後に分泌された物質の同定。この実験において、図形Ａ、ＢおよびＣの結果は、同じゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ８．５％）上で移動させ、次いで別々に処理された。

Ａ、クーマシーブルー染色；分子量スタンダード（列２）、ＹＰＬ培地−ｃ’プラスミドｐＫａｎ７０７　（列１）、またはＹＰＤ　Ｃ列３）もしくはＹＰＬ（列４）培地でｐＹＧ１２６６により形質転換された培養の１００　ｕ　Ｉ当量の上清液。

Ｂ、ヒトＧ−Ｃ３Ｆに対する１次抗体の使用後、分泌された物質の免疫学的同定　説明は八と同じ。

Ｃ，ヒトアルブミンに対する１次抗体の使用後、分泌された物質の免疫学的同定、説明は八と同じ。

図５・　プラスミドｐＹＧ１３０１のＨｉｎｄｌｌ＋制限断片のヌクレオチド配列（キメラＧ、Ｃ３Ｆ　ＧＩ　ｙ４　ＨＳＡ）。実線の矢印は、）Ｉ　Ｓ　Ａ“ ブレ”および“プロ”領域の端を示す。Δｐａｌ、Ｓｓ±Ｉ　（Ｓａｃｌ）およびＭｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ、制限部位は下線を施しである。Ｇ、Ｃ３Ｆ（１７４残基）およびＨＳＡ（５８５残基）ドメインは、合成リンカ−ＧＧＧＧによって分けられる。アミノ酸の数字は、成熟キメラＧ、Ｃ３Ｆ　ＧＩＹ４　Ｈ３Ａタンパク’ ！（７６３残基）に対応する。翻訳終止コドンおよびＨｉｎｄｌＩＩの間に位置するヌクレオチド配列は、欧州特許出願系３６１．９９１号に記載されているようにＨＳ　Ａ相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）に由来する。

図６：　５ＤＳ−ＰＡＧＥ８．５％ゲル上で移動させた後、プラスミドｐＹＧ１２６７　（キメラＨＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆ）　、ｐＹＧ１３０３　（キメラＧ、　ＣＳ　Ｆ　Ｇ　］　ｙ４　ＨＳＡ）およびｐＹＧ１３５２　（キメラＨ３Ａ−Ｇｌｙ４−Ｇ、Ｃ５Ｆ）によって形質転換された菌株ＣＢ５２９３．９１の４日間培養（エルレンマイヤー、ＹＰＤ培地で）後に分泌された物質の同定。

Ａ、クーマシーブルー染色、プラスミドｐＹＧ１３０３　（列１）、ｐＹＧ１２６７　（列２）もしくはｐＹＧ１３５２　（列３）により形質転換された培養の１００μｍ当量の上清液：分子量スタンダード（列４）。

Ｂ、ヒトＧ−ＣＳＦに対する１次抗体の使用後、分泌された物質の免疫学的同定：説明はＡと同じ。

図７：　マウス系統ＮＦＳ６０の試験管内細胞増殖に関する活性。培養６時間後に細胞核に取り込まれた放射能（［３Ｈ］チミジン）は、縦軸（ｃｐｍ）のように示される；横軸に示された生産物量は、モル濃度で表される（任意の単位）。

　図８＝　ラットにおける生体内の顆粒球形成に関する活性。好中球の数（動物７匹の平均値）は、時間の関数として縦軸に示される。試験された生産物は、キメラＨ３Ａ−Ｇ、Ｃ３Ｆ（ｐＹＧ１２６６．４〜４０ｍｇ／ラット／日）、対照欅準Ｇ−ＣＳＦ（１０ｍｇ／ラット／日）、クリヴエロミセス・ラクチス上演液から精製された組み換えＩＳＡ　（ｒＨＳＡ、３０ｍｇ／ラット／日、欧州特許第３６１．９９１号参照）もしくは生理食塩水である。

実施例一般的なりローニング技術分子生物学において通常使用される方法、例えばプラスミドＤＮＡの調製的抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム濃度勾配遠心、アガロースもしくはアクリルアミドのゲル電気泳動、エレクトロエル−ジョン（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によるＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムによるタンパク質抽出、食塩水におけるＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパツール沈殿、エソエリヒア・コリにおける形質転換、およびそれに類する方法は、当業者には周知であり、広く文献に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、“分子クローニング、実験室マニュアル”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、１９８２；　Ａｕ５ｕｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（ｅｄｓ）、　”分子生物学における最新プロトコール”、　Ｊ。

ｈｎ　１ｌｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８７］。

制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ　（ＢＲＬ）もしくはＡｍｅｒｓｈａａ＋によって供給され、供給先の指示に従って使用される。

１）ＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、およびＭ１３１００ファージは、市販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）。

連結反応のためには、ＤＮＡ断片が、アガロースもしくはアクリルアミド電気泳動によってそれらのサイズに従って分離され、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合液を用いて抽出され、エタノールを用いて沈殿され、次いで供給先の指示に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在でインキュベートされる。

５゛の突き出ている端の挿入は、供給先の指示に従ってＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）のフレノウ断片を用いて行われる。３°の突き出ている端の破壊は、供給先の指示に従って使用されるファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在で行われる。５゛の突き出ている端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼを用いるコントロール処理によって実施される。

合成オリゴヌクレオチドで導かれる試験管内変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒらにより開発された方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　（１９８５）　８７４９−８７６４１に従って、Ａａ＋ｅｒｓｈａｍ市販のキットを用いて実施される。

の酵素的増幅は、製造元の指示に従って、“ＤＮＡサーマルサイクラ−（ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）”　（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を用いて行われる。

ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒらにより開発された方法［ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　（１９７７）　５４６３− ５４６７１によって、Ａｍｅｒｓｈａｍ市販のキットを用いて実施される。

本発明のタンパク質の発現のためのプラスミドのＤＮＡを用いるＫ。

ラクチスの形質転換は、当業者に既知のいかなる技術によっても実施され、その実施例は本明細書中に示される。

別に述べられる場合以外は、使用される細菌菌株は、Ｅ、コリＭＣＩ使用される酵母菌株は、出芽酵母、そしてより特別には、クリヴ工ロミセス属酵母に属する。菌株に、ラクチスＭＷ９８−８Ｃ（且、且工旦９３．９１が、特に使用された。菌株ＭＷ９８−８Ｃのサンプルは、Ｂａａｒｎ（Ｎｅｔｈｅｒｌ、ａｎｄｓ）にあるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　（ＣＢＳ）に、１９８８年９月１６日に寄託され、それは寄託番号ＣＢ５５７９８８として登録された。

本発明のタンパク質をコードしている発現プラスミドを用いて形質転換された酵母菌株は、エルレンマイヤーもしくは２１容、＜イロ・ソトフアーメンター（ＳＥＴＲＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）中で、２８℃で定常的な撹拌をしつつ高栄ＩＩ培地（ＹＰＤ：酵母エキス１％、バクトペブトン２％、グルコース２％、またはＹＰＬ　酵母エキス１％、バクトベブトン２％、ラクトース２％）において培養される。

ヒトＧ−Ｃ３Ｆの成熟形を含むＭｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限断片が、例えば、次の手法に従って作出される　Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限断片が、最初に、鋳型として働くプラスミドＢＢＧ１３のプライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド５Ｑ２２９１　（５’−ＣへへＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣる。プラスミドＢＢＧ１３は、成熟ヒトＧ−ＣＳＦのＢ形（アミノ酸１７４個）をコードしている遺伝子を有するものであって、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄより得られる。次いで、ヌクレオチドはぼ５５０個の酵素的増幅産物は、制限酵素Ｋｐ旦Ｉおよび旦±ｎｄｌｌ＋で分解され、そして同じ酵素で切断されたベクターｐＵｃ１９中にクローン化され、その結果、組み換えプラスミドｐＹＧ１２５５を得る。このプラスミドは、ＭｓｔＩＴ−Ｈｉｎｄｒｌｌ制限断片の給源であり、その塩基配列は、図１の配列に含まれる。同じポリペプチドる対応するｃＤＮＡからＰＣＲ増幅技術によって作出されてもよい。これらのｃＤＮＡは、当業者の技術、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ販売のキットを用いて、Ｇ−Ｃ３Ｆを発現するヒト細胞系、例えばヒト腫瘍細胞系ＣＨＵ−例えば導入する部分の機能が良好に現れるために、Ｈ３Ａ部分とＧ−Ｃ３Ｆの間にペプチドリンカ−を挿入することも、また適切であり得る。

この特別なリンカ−のグリシン残基をコードするコドンは下線部）およびＳ　ｑ　２７４１　（５’−ＣＡｃｃＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣ八ＣＣＴ＾＾ＧＣＣ−３’）　ｌこよへ、図１配列に一致する。

（実施例２：ＩＳＡおよびヒトＧ−Ｃ３Ｆ間の翻訳イン・フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合）Ｅ、２．１．　ＩＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆタイプの翻訳融合プラスミドｐＹＧ４０４は、欧州特許出願第３６１．９９１号に記載されている。このプラスミドは、Ｓ　セレビシェのＰＧＫ遺伝子の翻訳開始ＡＴＧの上流に、本来隣接して存在する２１個のヌクレオチドによって先行されるブレプローＨＳＡ遺伝子をコードしているＨｉｎｄｌｌｌ制限断片を含有する。より特別には、この断片は、３個の最も多いＣ−末アミノ酸（ロインンーグリシンーロイシン残基）を除いて、ブレブローＨＡ分子のＣ−末端における遺伝的な翻訳イン・フレーム結合によって位オチド配列は、対応するキメラ（ＩＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆい図２、図形Ａ参照）のポリペプチドとともに図１に示される。

Ｍｓ±ＩＩ−Δｐａ＋断片を除いて同一であるＨｉｎｄｌｌｌ制限断片も、また容易に作出することができ、それは、成熟Ｇ−Ｃ３ＦのＢ形が、Ｉ（Ｓ　Ａ分子のＣ−末端および特定のペプチドリンカ−のＣ−末端において遺伝的な翻訳イン・フレーム結合によって位置されるキメラタンパク質をコードする。例えば、このリンカ−は、プラスミドｐＹＧ１３Ｅ、２．２．　Ｇ、Ｃ５Ｆ−Ｈ５Ａタイプの翻訳融合特殊な実施態様においては、導かれる変異誘発とＰＣＲ増幅を組合わせた技術が、シグナルペプチド（例えばＨ３Ａプレプロ領域）　、Ｇ−ＣＳＦ活性を有する遺伝子を含む配列、およびＩＳＡもしくはその分子変異体のひとつの成熟形、の間の翻訳結合の結果生じるキメラタンパク質（図２、図形Ｂ）をコードするハイブリッド遺伝子の構築を可能にする。

こららのハイプリント遺伝子は、好ましくは、Ｈｉｎｄｌｌｌ制限部位によって、翻訳開始ＡＴＧの５°末端および翻訳終止コドンの３゛末端において隣接される。例えば、オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ２３６９　（５’−ＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣ−ＡＧＣＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＡＣ＾＾ＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧ−３’、下線の残基（任意に）は、この特別なキメラにおいて、４個のグリシン残基よりなるペプチドリンカ−に対応する）は、プラスミドＢＢＧ１３のヒトＧ−Ｃ３Ｆ成熟形が、ＩＳＡの成熟形の上流に隣接して導かれる変異誘発によって配置されることを可能とし、その結果、中間体プラスミドＡを作出する。同様にして、オリゴデオキシヌクレオチドＳ　Ｑ　２３３８　［５’　−ＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＡＣＧＡ＾＾ＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣＣＧＡＧＣＴ−３’　（非コーディング鎖）、ヒトＧ−Ｃ３Ｆ（７）成熟形の最初のＮ−末残基をコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、下線部である］は、Ｈ３Ａプレプロ領域が、ヒトＧ−Ｃ３Ｆの成熟形の上流に隣接した翻訳リーディングフレームにおいて、導かれる変異誘発によって結合されることを可能とし、その結果、中間体プラスミドＢを作出する。次に、図５のＨｉｎｄｌｌｌ断片は、プラスミドＢの旦上ｎｄｌＴＩ−３ｓ±Ｉ断片（Ｈ３Ａプレプロ領域＋成熟Ｇ−Ｃ３Ｆの［成熟Ｇ−Ｃ３Ｆ−（グリシン）、４−成熟Ｈ３Ａ連結］とを組み合わせることによって作出される。プラスミドｐＹＧ１３０１は、ＨＳ　Ａプレプロ領域の下流に隣接して融合されたキメラＧ、Ｃ３Ｆ−Ｇ　ｌ　ｙ４　ＩＳＡをコードするこの特殊なＨｉｎｄｌｌ＋制限断片を含有する。

Ｅ、２．３．　Ｇ、Ｃ３Ｆ−ＩＳＡ−Ｇ、ＣＳＦタイプの翻訳融合これらの試験課内での導かれる変異誘発およびＤＮＡ増幅の技術は、Ｇ−Ｃ３Ｆ活性をコードする塩基配列が、ＩＳＡもしくはその分子変異体のひとつのＮ−およびＣ−末端に結合されているハイブリッド遺伝子の構築を可能とする（図２、図形Ｃ）。これらのハイブリッド遺伝子は、好ましくは、Ｈｉｎｄｌｌ＋制限部位によって、翻訳開始ＡＴＧの５゛末端および翻訳終止コドンの３°末端において隣接される。

（実施例３　発現プラスミドの構築）前記実施例のキメラタンパク質は、調節的もしくは構成的な機能性プロモーター、例えばプラスミドｐＹＧ１０５　（クリヴＬロミセス・ラフ第３６］、　９９１号に記載のプラスミドによって担持されるような／ｈイブリッドプロモーターから、酵母において発現させることができる。

化され、それによって発現プラスミドｐＹＧ１２６６　（図３）が作出される。

プラスミドｐＹＧ１０５は、欧州特許出願第３６１．９９１号に記載のＴＩ制限部位が導かれる変異誘発によって破壊されており（オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ１０５３：５’−ＧＡ＾八ＴへＣＡＴ＾＾ＧＣＴＣＴＴＧ−ＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧ−３’）、モしてＵＲＡ３遺伝子をコードしているそのＳａ±ｌ−３ａｃＩ断片は、旦Δ旦４プロモーター（旦見±ｌ−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片の形で）およびＳ、セレビシェのＰＧＫ遺伝子のターミネータ−（Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩＩ一旦且且Ｉ断片の形で）を含有する旦見±１一旦見旦■制限断片によって置換されている。プラスミドｐＹＧ１０５は、ゲネチシン（Ｇ４１８）の存在しない場合における分裂にも非常に安定であり、そして特に炭素源がラクトースである場合に、Ｋ、ラクチスの旦Δ且４プロモーターからキメラタンパク質を発現させることができる。その他の例示においては、プラスミドｐＹＧ１０６のＨｉｎｄｌ　ｌ　１部位中に、生産性の方向でのプラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄｌｌＩ制限断片のクローニングが、発現プラスミドｐＹＧ１２６７を作出する。プラスミドｐＹＧ１２６６およびｐＹＧ１２６７は、Ｋ、ラクチスのｐΔ且４プロモーター（プラスミドｐＹＧ１２６６）もしくはＳ、セレビシェの匹ベプｏモーター（ｐＹＧ１２６７）をコードするＳａ　］　ｌ−Ｈ１ｎｄ　ＩＩＩ制限断片を除いて、もう一方のものと同質遺伝子的である。

その他の例示においては、プラスミドｐＹＧ１０５およびｐＹＧｌｏＥ、２．　１、参照）のクローニングが、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３５１およびｐＹＧ１３５２を作出する。

ｄｌ１１制限断片（キメラＧ、Ｃ３Ｆ−Ｇｉｙ４　Ｈ５ＡＳＥ、２．２゜参照）のクローニングが、ぞれぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３０２およびｐＹＧ１３０３を作出する。

（実施例４．酵母の形質転換）クリヴエロミセス属の酵母、特にＫ　ラクチス菌株ＭＷ９８−８ＣおよびＣ１３Ｓ　２９３　、　９１の形質転換が、例えば、次のように応用された酢酸リチウムを用いる全細胞の処理の技術［Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５３　（１９８３）　１６３−１６８］によって実施される。細胞増殖は、２８°ＣでＹＩ）Ｄ培地５Ｑｍｌにおいて、撹拌しつつ、６００ｇｍにおける光学密度（ＯＤｅｏｏ）　ｏ、６〜０８まで行われ；その細胞を低速度の遠心によって回収し、生理ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣＩ　ｐＨ７，４：　１ｍＭＥＴ）ＴＡ）で洗浄し、酢酸リチウム（ＴＥ中０．１Ｍ）３〜４ｍｌにシ濁して、細胞密度約２ｘ１０８細胞／ｍｌとし、次いてゆっくり撹拌しつつ３０°Ｃで１時間インキュベート・する。得られた受容能のある細胞墾濁液のＱ、ｉｍｌを、ＤＮＡの存在下、そして道路濃度３５％のポリエチレングリコール（Ｐ　ＥＧ４０００．　Ｓｉｇｍａ）において３０８０１時間インキュベートする。４２°Ｃで５分の熱ショック後、その細胞を２回洗浄し、滅菌水０．２ｍｌにｖ濁し、ＹＰＤ培地培地２マｌ６時間２８°Ｃで培養して、Ｐｉｌプロモーターの制御下ての０ＲＦＩ−ＡＰＨ融合の表現型発現を発現させる：次に、その細胞ｖｆ！濁液２００μｍを選択培地ＹＰＤのンヤーレ（Ｇ４］、８．２００ｇｇ／ｍｌ）にプレートする。そのンヤーレを２８°Ｃて培養し、そして２〜３日の細胞増殖のｉ＆、形質転換株が出現する。

（実施例５　キメラの分泌）Ｇ４１８添加の高栄養培地での選択後、組み換えクローンが、ＨＳ　ＡとＧ−Ｃ３Ｆのキメラであるタンパク質の成熟形を分泌する能力について試験される。プラスミドｐＹＧ１２６６もしくはｐＹ０１２６７（ＩＳＡ−Ｇ、Ｃ３Ｆ）　、ｐＹＧ１３０２もしくはｐＹＧ１３０３　（Ｇ、Ｃ８Ｆ　ＧＩ　ｙ４　ＩＳＡ）　、あるいはまたｐＹＧ１３５ＦもしくはｐＹＧ１３５２　（Ｔ−１ｓＡ−Ｇｌｙ４　ｃ、Ｃ３Ｆ）によって形質転換されたに、　ラクチス菌株ＣＢ５２９３．９１に対応する数クローンが、２８℃で選択用完全液体培地で培養される。次に、その細胞上清液が、８５％アクリルアミドゲルでの電気泳動後、クーマン−ブルー（図４、図形Ａ）によるアクリルアミドゲルの染色によって直接に、あるいはヒトＧ−Ｃ８ＦもしくはＩ　Ｓ　Ａに対する特異的なウサギポリクローナル抗体を１次位体として用いるイムノブロッティングによって試験される。免疫的検出実験においては、ニトロセルロースフィルターが、最初に特異抗体の存在でインキュベートされ、数回洗浄され、ビオチン化ヒツジ抗ウサギ抗体の存在でインキュベートされ、次いでＶｅｃｔａｓｔａｉｎ　（Ｂｉｏｓｉｓ　Ｓ＾、、　Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）販売の”Ａ　Ｂ　Ｃキット”を用いてアビンンーペルオキシダーゼ複合体の存在でインキュベートされる。次に、免疫反応は、販売先の指示に従い、過酸化水素の存在下３．３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｐｒｏｌａｂｏ）を添加することによって視覚化される。図４の結果は、ｌ５Ａ−Ｇ、Ｃ３Ｆハイブリツドタンパク質が、ヒトアルブミン（図形Ｃ）およびヒトＧ−Ｃ３Ｆ　（図形Ｂ）に対して導かれた抗体によって、ともに認識されることを示している。図６の結果は、多分、Ｈ８Ａ８ＡとＧ−Ｃ３Ｆ部分の間のペプチドリンカ−の存在が、分泌経路中へのキメラの輸送におけるこれらの部分の独自の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）に一層都合がよいために、キメラＩ（Ｓ　Ａ　−Ｇｌ　ｙ　４　Ｇ、ＣＳ　Ｆ　（列３）が、クリヴエロミセス酵母によって特に良好に分泌されることを示している。その上さらに、Ｎ−未融合（Ｇ、Ｃ３Ｆ−Ｇ　Ｉ　ｙ４−ＩＳＡ）もまた、クリヴエロミセス酵母によって分泌される（図６、列１）。

（実施例６　分泌産物の精製および分子同定）実施例３による発現プラスミドを用いて形質転換された菌株ＣＢ５２９３．９１の培養の遠心分離後、その培養上清液を、０．２２ｍｍフィルター（ＭｉｌＦｐｏｒｅ）を通過させ、次いて分別点（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を３０　ｋ　Ｄ　ａに置（膜を用いる限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）によって濃縮される。次に、得られた濃縮液は、トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ（３）の１Ｍ保存液を用いて５０ｍＭｔ− リスーＨＣ１１１ｍ調整され、その後、同じバッファーで平衡にされたイオン交換カラム（５ｍｌ）　（Ｑ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に２０ −ｍ１画分て適用される。次いで、キメラタンパク質は、ＮａＣ１４度勾配（０〜」５Ｍ）を用いてそのカラムから溶出される。キメラタンパク質を含む両分が集められ、５ＱｍＭｌ・リス−１（ＣＩ溶液（ｐ　Ｉ−（６）に対して透析され、そして同じバッファーで平衡にされたＱ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（１１１１１）に再び適用される。そのカラムからの溶出後、タンパク質を含む両分が集められ、水に列して透析され、同定前に凍結乾燥される　同定においては、例えば、酵母ＣＢ５２９３．９１によって分泌されるｉ（５Ａ−Ｇ、Ｃ３Ｆタンパク質の配列決定（Δｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍ）は、ＨＳΔの期待されたＮ −未配列（Ａ　ｓ　ｐ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｈｉ　ｓ・・・）を示し、それは、ｌｌ５Ａの”ブ１フ”領域（図１）の二重のＡｒｇ−Ａｒｇ残基の隣接Ｃ−末側におけるキメラの正確な成熟を示している。

（実施例７　：　ＩＳＡおよび（、−Ｃ３Ｆ間のキメラの生物学的活性）Ｅ、７．　１．　試験管内の生物学的活性実施例６により精製されたキメラが、ＩＬ３ −依存マウス系ＮＦＳ６０の試験管内増殖を可能とするその能力について、本質的にＴｓｕｃｈｉｙａら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ八ｃａへ、　Ｓｃｊ、　（１９８６）　８３７６３３］の記載の方法によるトリチウムチミジンの取り込みを測定することによって試験される。各キメラについて、測定は、活性産物の量と標識チミジン（Ａｍａｒｓｈａｍ）の取り込みとの間の関係が直線である領域内の３点試験（その産物の３段階希釈）において３〜６回実施される。各ミクロタイトレーノヨンプレートにおいて、咄乳動物細胞で発現された組み換えヒトＧ−Ｃ８Ｆからなる参照標準産物の活性も、組織的に組み込まれる。図７の結果は、クリヴエロミセス酵母によって分泌されたキメラＨ３／ｌ−Ｇ、Ｃ３Ｆ　（ｐＹＧ１２６６）が、ＮＦＳ６０系の細胞増殖シグナルを試験管内で導入することができることを表している。この特別な場合においては、そのキメラの比活性（ｃｐｍ／質量モル濃度）は、参照標準Ｇ−Ｃ３Ｆ　（結合されてない）のほぼ１／７である。

Ｅ　７２．　生体内活性生体内顆粒球形成に関するＩＳＡ／（’、−Ｃ３Ｆキメラの刺激活性が、ラント（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ／ＣＤ、２５０−３００ｇ、８−９週）における皮下注射後に試験され、咄乳動物細胞から発現された参昭欅準Ｇ−ＣＳ　Ｆのそれと比較される。７動物を基本とし、試験される各生産物が、連続７日にわたり（Ｄ　Ｉ　−Ｄ　７）　１００ｍ　ｌ　ヲ！礎１ｍ、肩甲骨背城中に皮下注射される。血液５００ｍ１が、Ｂ　Ｉ）　−６、Ｄ２（第２回注射前）、Ｄ５（第５回注射前）およびＤ８に採取され、血球計算が実施される。この試験において、キメラＨＳＡ−Ｇ、Ｃ５Ｆ　（ｐＹＧ１２６６）の比活性（好中球形成ユニット／注射モル）は、参照標準Ｇ−Ｃ３Ｆのそれと同一である（図８）。この特別なキメラは、試験管内では参照標準Ｇ−Ｃ３Ｆのそれの１／７の比活性を有するので（図７）、したがって、Ｈ３Ａｊ、：Ｇ−ＣＳＦを遺伝的に結合させることが、その薬動学的性質を好適に改変することを示している。

配列番号＝１Ｇ二ＡＡＡＡＡＨＡ〒ＧＴ（ＴｒＣＸ：ＴＣＪ、丁ｃ＾ＧＴＣ＾ＧｃＴｃ＾＾入 λ丁〒Ｃ丁α為Ｃ＾Ａ入Ｔ；＾ＣｆｆＣＡ丁ＡＣＣＣＴＴＡｌａ　Ｋｌｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌｍ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ入１ａ　ｃｌｕ入ｓｎ　ｃｙｓ　〜ｑ　Ｌｙａ　Ｓｉｒ　Ｌａ普@Ｈｌ、ｓ　’ｒｈｒ　Ｌａｕ　６９人＾丁ＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴ’ｒＴＧ＾＾＾ＡＡＡＴｆｉＣＴ〒に丁Ａ丁ＧＡＡＡＴｒｏＣＩＣＡＱＡＡＱＡＣＡＴＣＣＴＴＮ：ＴＴＴ＾ＭｎｃｌｕＧｌｕＴｈＴｐｈ會Ｌａｕ（）／ｇＬｙｅＴ’ｙｒｌａｕテｙｒＣ１ｕ１１＠＾ｌａＡｒｇ＾ｒ菅石廖ＰｒｏテｙｒＰ？ｎ１４X Ｔ＾丁ＧＣＹ：ＣＣＧＧＡＡｌ：’ｒ（ｌｊＴＴＴＣＩＴｒ０人ＡＡＡ（Ｋ＋ＴＡ〒ＡＡ＾ＯｃＴ（ｆｆＴｍＡＣＡＧＭテＧＴテＧｃ’Ｐｙｒ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ｔＪｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　ＡＪａ　Ｌ、ｙｇ　＾ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｙｇ　Ａｌｍ　人１ａ　Ｆpｗ　’ｒｈｒ　Ｇｌｕ　ｃｙｓ　Ｃｙｓ　１６９Ｃ＾Ａｒ丁ＧＣＴＣ＆ＴＡＡＡＱ？ＴＣＣ’ＣＴｌ１ｒｃＴＣ〒テＧＣＣＡ＾為ＣＣテＣα＾丁Ｃ八＾ＣＴ〒＋ｍＣＪＴＧＡＡ’１１ｍ０１ｒ＋　Ａｌａ　Ａｉａ　Ｊｕｐ　Ｌ、ｙｓ　Ａｌａ　ＡＪａ　Ｃｙｓ　し劃」　しａ＋　Ｐｈｅ　ＬＶＩＩ　しＮ＾ｉｐ　Ｇｌｕ　１ｊ撃kｌ　＾ｒ口入１１Ｐ　Ｃｌｕ　Ｇｌｙ　１８９Ａ’ｌＧ　ＧＴ７℃ｒロτＣ議ＣＡＣ嶋μＩ」に覆Ｉど３ｍ　ＣＴＣＣ紡蟻１π工＾臥１絋＾＋ｙｓＡｌｅｓｉｒ５ｓｒ入１ａＬｙｇＧｉｎＡｒｇＬｅｕＬｙｓＣｙｓ＾１ａｓｅｒＬａｕＧｉｎしｙｓＰｈａＧｌｙＣ１ｕｕａ２０９Ｇ’ｌ’Ｔｆｆπ’　ＡＡＡ　ＯＦＡ篩ズ＾石＾ｒＩτ−城Ｃかωテｒ　Ｃ’ Ｃｅ　ＭＡ　ｅ　（λ口πτ＾入１ａ　Ｔ’ｈ豐　Ｌｙｉ　ＡＪａ　Ｔｒｐ　ＡＪａ　ν１１　＾１這　＾ｒロ　ムｍ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ｔ’ ｒｏ　Ｌｙ■@ＡＪａ　（：ｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｌｍ　２２９Ｇ入＾（ｍ’ｌ’１ｒＡＡＧＴｒＡＧＴＧＡ（ＡＧ＾丁ｃＴＴＡＱ：ＡＡＡｃＴｃＣＡＣＡＣＯＧ＾＾丁（（ＴｌｌｆＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧｌｕＶａｌＳｅｒＬｙｓＩｊｌｕＶａｌＴｈｒＡｓｐＬｅｕ丁ｈｒＬｙｓｖａｌＨ１ｓＴｈｒＧｌｕＣｙｘＣｙｓＨ１ｇにｌｙＭｐ２４９ｃｒｃｃｎＣＡＡ〒ＣＴｃｃｒｃｏにＡＣ＾０；ｃｃｃｃｉ＝ｃｒｒＣＣＣ入＾Ｇ丁ＡＴ＾丁ＣＷＧ＾Ａ入Ａ？ＣＡＡＣＪｋＴＬａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｃ’ｙｉ　＾］蟲　Ａｓｐ　Ｉ’ａｐ　〜１　Ａｌｍ　Ａｓｐ　ｔａｕ　Ａｌａ　しｙｘ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙ刀@Ｏｌｕ　Ａｉａ　Ｇｉｎ　八ｓｐ　２６９ＴＣＧ　ｋＴｃ　ＴＣＣＭＷ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＯｚｗＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣ７ＣＴＣ１’？Ｇ　Ｇｋｌ−ＡＡＡ　’ＫbＣｋ：　ＴＧＣＳＬＩｒ！ｌｅｓ＠ｒｋｒＬｙｘｌａｕＬｙｅＣ１ｕｃｙｔＣｙｇＧｌｕＬｙｇＰｒｏＬａｕＬａｖにｌｕＬ：１ｇｓｅｒＭｉｘＣｙｓ２Ｎ■ ＡτＴＣＣＣＣＡＡＣＷＧＣＡＡＡＡ−、ＧＡＴＧ＾ＧＡ’ｍＣＣｒＧＣＴＧＡＣ丁Ｔｌ１ｉＣＣＴＴＣ＾Ｔｒ＾ＧＣＴＧ：ＴＣＡＴＴｒＴｌｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　！１；ｌｕ　Ａｓｈ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｈｅｍ　Ｐｒｏ　Ａｉｍ　＾！ｐ　ｔａｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌiｕ　Ａｌａ　人１ａ　Ａｓｐ　Ｐ？＋ｅ　３０％Ｃ’ｒＴＣＡＡＡｌｌ；ＴＡＡＧＧＡＴＣＴＴ丁ｏｅＡＡＡＡＩｊＣ −、ＡＴＧＣ丁０ＡＧＧＣＡＡＡＧ（Ｊ、ＴＣｒｒＣＴｒＣＣｒＧＣＸw：ＡＴＯＶａｌＧｌｕ５ｅｒＬｙｉＭｐＶａｌＣｙ＊Ｌｙｉ＾５ｎＴｙｒ＾１ａＧ１ｕＡｌａＬｙｉ八５ｐＶａｌＰｈａＬａｕＧｌｙｌＩ％ｃコ２シＴ’ｎ’ｒＴｃＴＡＴ、（ＪＡＴＡＴＣＣＡｊｌ：ＡＡ！ＺＣＡ丁ＣＣＴＧ八〒丁ＡｃへＣＴＧＴ’ ＣＧ？＾ｃ’ｒｃｃＴｃｃＴｃ＾ｕｃｒs Ｐ９＠　１７１＋　Ｔｙｒ　Ｃ，ｕ　Ｔ＞丁　ＡＪａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ｊｌｉｌ　Ｐｒｏ　ｋｓｐ　ｔｙ：　Ｓｅｒνａｌ　Ｖａｌ　ｔａ普@Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　３４％ｒｉｇυｒ巳１（８）０ごごＡＡＧん：＾ＴＡＴＧ＾ＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧ＾＾ＧＴＧＣ〒ＣＴＯ！ＧＣＴＱＣ＾Ｇ＾↑ＣＣＴＩＪ？ｃ＾＾丁ン：＾１ａＬＨｃＴｈｒＴＹｒＧｌｕＴｈｒＴｈｒｌＪｕＧｌｕＬ４ＣｙｇＣｙｇ＾１１＾１１＾１ａ＾５ｐＰｒｏＨ１ｉＧｌｕＣ”７ｓ３６？ｒｉｑｕｒｅ　１（ｂ）（任意に）Ｆｉｇｕｒｅ　２Ｊ配列番号ＣＣＣＣＡＧ＾ＧＣＴｒＣＣＴＧＣ”ｌ”：入ＡＧテａｃＴＴｘｃ為ｃＣ＾入ｃ ’ｒｓ＾ｃｑλ＾ＧＡ↑ＣＣ入ＧＣ＆ＧＡ丁Ｇ２：（ｅ入Ｐｒｏｌｌ：ｌｎＳｅｒＰｈｅし會ｕＬａｕＬｙｚＣｙｓｌＪｕＣｌｕＧｉｎＶａｌ＾ｒｇＬｙｓｌｉｅＧｌｎａｌｙ＾ｓｐＯｌｙ八ｌｍ２X Ｃ入ＧＣＴ（：Ｇ；Ａ（ｆＴ＋：〒ＴＯ入ＧζＣ入＾Ｃ丁ＣＣ）丁八Ｇ；ａｃｅＣＴＴ丁Ｔｃｃｒｃ丁入ＣＣ＾Ｇａｚｃ↑ｃｃＴｃＧ］ｒ＋　ｌＪｕ　Ａｈａ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ｓｅ：　Ｇｉｎ　Ｌｃｕ　Ｎｉｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｔｙ秩@Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ｌＪｕ　Ｌａｕ　！１９ＣＡＧ　＋ｆｆ　４＋ａＡ　ｅλτＡ　ＴＣ（　ＣＣＣ　ＣＡｃ　Ｔ’ｍ　ｌ：．？ｒ　Ｃ（Ｃ　Ａ（Ｃ　Ｔｍ　ＧＡＣ　ＡＣＡ　ＣＴＣ　bＡＧ　Ｃ’ｍ　ＧＡＣＣｊｎＡｕｇＩＪ＝Ｃ；ｌｕＧ】ｙコ１ｅＳｅｒＰｒｏＧｌｕＬｅｕＧｌｙＰｒｏ丁ｈｒＬａｕ＾ｓｐ丁ｈｒレｅｕＧｉｎレｆｌ入ｓｐ１０P ｒｉｑｕｒｅ　５（１）（ＣＧ　ＧＡＡ　ＣＴＣ　Ｃ＋ｒＴ　′Ｔ′ｒｌ７７ＩＴ　ＧＣＴ　ＭＡ　ＡＯＧ↑＾Ｔ　ＡＡＡ　Ｇ−Ｙα７　ＴＴＴ　ＡＣ＾ＧＪｔＪｔ@Ｔｆｆｌ　’ｒＧＣ　ＣＡＭ　ＯＣＴ＋ＴｏＧｌｕｌａｕＬｊ９ｕＰｈ守Ｐｈｅ＾ｌａしｙ８＾ｒ９Ｔｌ／ｒＬ７！＾１ａ＾ｌａＰｈ嗜丁ｈｒＧｌｕＣｙｓＣｙｍＧｌｎ＾Ｉｓ３S＝ＧＣＴａｘ丁＾＾＾ｅＧｃｅ〒ＯＣＣ丁ＧＴ丁ＧＣＴｈＡ＾ａｔ’ｙａ＾↑Ｃ＾＾Ｃ？’丁ＣＯコＧ＾ＴＱＡ＾ＧＸＩＩ八［（ＸＴＡｌａＡｓｐＬｙｉＡｌａＡｌａＣｙａしＱｕＬｅｕＰｒｏＬｙｅしｅｕ＾ｉｐＧｌｕしｅｕ＾ｒ９＾ｓＣ）ＧｌｕＣｉｌｙＬｙｅ＾ｌａ３U９ π℃πゴαてＭ講ＣＡＧ　ＡＱＡ　ｃ罠ＡＪ１ｆｆππαＩＭ庁ａ℃Ｃ紡ＡＡＡ　ｍ　α請ＧＡＡＡＯＡαテＴＴＣＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　（ｉｌｈ　Ａｒｇ　ｔａｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　ｔｈｅ　Ｇｌ凵@Ｇｌｕ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｐｈｉ　３８９ＡＡＡ　１１）：Ａ πｔτ＾σ＾αゴα（　ｃｉ’ａ　，ｗ　ｃ鳩＾儲ｉテα℃黒αゴυ心ｉゴα滴賜笛しｙｓＡｉｍＴｒｐＡｌａＶａｔＡｌａＡｒｇｌｊｌｌ！ＡｒＧｌｎ＾ｒｇＰｈｅＰｒｏＬｙｓ＾ｌａＧｌｕＰｈ＠＾ｌａＧｌｕＶａｌ４０X ＴＣ（　ＡＡＣＴ’ｒＡ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＣＴｒ　Ａｃｅ　ＪＩＡＡ　（ｍ：　ＣＡＣ　Ａｃｅ　（ＪＡπｔπ）Ｃ　ＣＡＴ　Ｏ普@ＯＡＴ　ｌ？Ｉｌｌ２　ＣＴｒＳ＠ｒＬｙｉＬａｕＶａ１丁ｈ．入ｓｐＬｅｕＴｈｒＬｙｉＶａｌＨｌｓＴｈｒＯｌｕＣｙｓＣｙ息ＨｉｓＯｌｙ＾ｓｐＬａｖしｅｕ４２９Ｇ八＾〒Ｃ丁（ＸＩＴＱＡ〒ＧＫＡＯＧＧＣＧＧ＾ＣＣ’ｒｒＧＣＣ入八Ｇ丁＾丁＾ＴＣ丁ｃＴａ入＾八＾〒Ｃ八ＡＧ八↑ＴＣＧＡＴＣＧｌｕｃｙｓＡｌａＡｓｐＡｓｐＡｒ９＾１ａＡｊＩｐＬｅｕ＾λａＬｙｅ丁ｙｒＩｌｅＣｙｓＧｌｕ＾ＭｎＧｉｎ＾ｓｐＳｅｒｌｉｅ４４X ＴＣＣ　Ｊ１７ｒ　ＡＡＡ　Ｃ’ｌ’Ｇ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　Ｔｆｆ　Ｗ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　Ｃｍ　ＴｒＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＴＣＣ@ＣＡｅ　ＴＯＯ　ＡＴＴ　Ｏ！ ’ｙｅｒ　ｋｒ　Ｌｙｓ　Ｌ＃ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＬＶｓ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　１４ｎ　ｋｒ　gｌａ　Ｃｙｓ　Ｉｒｅ＾ｌａ　４６９ＷαＧ　ＯＡＡ　ＭＴ　ＯＡＴ　Ｇ紹Ａ司αゴαゴＧＡＣ　ＴｒＣｉαゴπ）宵＾αゴσゴ艶Ｔη了ｒ男ＧｌｕＶａｌＣｌｕ八ｉｎＡｓｐＧ１ｕＭｅｔｌｉｒａ＾ｌａＡｉｐｍＰｒｅｋｒＬａｕ＾ｌａ＾ｌａ＾！ｐＰｈ＊ＶａｌＧｌｕ４８９＾．ＧＴ　ＡＡＧ　ＯＡＴ　（Ｔｒ　ＴｏｃＡＭ　ＡＡＣ　ＴＡ〒α７　ＧＡＣ，　ＯＣＡ　ＡＡＯ　ＣＪ？　Ｇ＋ＴＣ　Ｔｒｅ　ｅ”Ｉ’f　ｌ））：’　ＡＴＯ　ＴＩＴ　ｍＳｅｔＬｙｓ＾ｓｐＶａｌＣｙｓＬｙｉＡｓｎＴｙｒＡｌａＧｌｕＡｌａしｙｓ＾Ｊｌ９Ｖ蟲ＩＰｈｅＬｎｕＧｌｙ１４ｅｔＰｈｉＬｅｕ５O９丁＾↑Ｇ＾＾Ｔ＾↑ＧＣ＾＾ＧＡ　Ａ（Ｃ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＯＡ７丁＾Ｃ〒ＣＴ　ｃＴｃＣＴＡ　ＣＴＣ　ＣＴＣ　ｃｒＧＡＧＡ　ＣｒＴiＸＩＩＣ　ＡＡＧＴｙｒＧｌｕ〒ｙｒ＾ｌａＡｒｇ＾ｒｇＨｎｐｒｏ入１１９ｔｙｒｓｉｒνａｌ νａｋＬａｕし電リしｅｕ八ｒｇｂｕＡｌａＬｙｓ５２９〜ＣＡＴ＾丁Ｇ＾＾＾ＣＣＡＣ’ｒＣＴＡＧ為Ｇ八ＡＧ丁ｏｒｔａｒａｃｅａｃテ（１：ＡＧ＾ＴＣｆｆＴＣ＾ＴＧＡＡ丁ＱＣＴＭＯＣＣＴｈｒＴｙｒＧｌｕＴｈｒＴｈｒ１７ＫＩＧｌｕＬｙｅＣｙｓＣｙａＡｌａ＾ｌ６＾１ａ＾ａｐＰｒｏｌ１１ｓＧｌｕＣンｓＴｙｒ＾ｌａ５S９＾＾＾σＴＣｉＴｃＯＡＴＧＭＴＴＴＡＡＡＣｃＴＣ↑ＴＯ丁Ｃａ八＾Ｇ＾Ｇｃｃ丁Ｃ＾Ｇ＾＾Ｔ〒ＴＡＡＴＣ八＾＾（Ｊ＾八＾丁Ｌｙｓ　ｖａｌ　ｈｋｐＧｌｕ〜Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ｃｌｕ　Ｃｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｉｎ　ｔａｕ　ｌｉｅ　Ｌｉｙｍ@Ｇｌｎ　ｍｎ　’１６９Ｗ　ＧＡＧ　（Ｗ　Ｔ〒Ｔ　ｌｊ＋ｏ　ＣＡＯ　Ｃ丁丁ＯＧＡＧＡＯ　丁ＡＣ　ＡＭ　〒Ｔｅ　ＣＡＯ　ｋｋＴ　ＯｃｃＣＴＡ　テＴＡ　（eｒ　ＣσＴ丁Ｍ：ＣｙｓＧｌｕＬａｕＰｈｅＧｌｕＧｉｎＬｅｕＣｌｙＧｌｕ〒ｙｒＬｙｓＰｈｅＧｉｎｕｎ＾ＩｓｔａｕＬａｕＶａｌ入ｒ９↑ｙｒＳ［ｌ９ＡＣＣ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ｇｉ’ｒＡ　ＣＣｅ　ＣＡＡ　ＧＴＧ　’ｒｃＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＧＡＩ：＋　ＣＴb　ＴＣＡ　ＡＱＡ　ＡＡＣσＡ（Ｋ＋Ａ丁ｈｒＬｙｓＬｙｅνａ】ＰｒｏＧｌｎＶａｌ３ｅｒＴｈｒＰｒｏ丁ｈｒＬａｕｖａｌＧｌｕＶａｔ３ｅｒＡｒｇ＾ｓｎＬｅｕＧｌｙ６０９ＭＡｃ’ｒｃα疋Ｎ℃ＡＡＡ宜π賀πＡＡＡＣ＾Ｔαテ男匡＾υ講κ請＾Ｎα℃ππ■＾ＧＡＡＣＡＣＬｙｓ　Ｖａｌ　ＧＩｙ　５ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｉ　｝１１ｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｌｙｔ　Ａｒｇ　ｈａｔ　Ｐｒｏ@Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｏｌｕ　Ａｓｐ　６２９↑＾Ｔ　ＣＴＡ　ＴｃｃＣＴＣ　Ｇ２　Ｃ’ｌ℃ＡＡＣ　ｅＡｏ　ＴｔＡ　’Ｎ７ｒ　（ＦＴＧ　ＴＴＣｒ　ＣＡＴ　ＱＮＱ　ＡＡＡ　ＡＣf　ＣＣＡ　１７ｒＡ　Ｘ７ｒ　ＧＡＧＴｙｒ　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　νａ１　νａｌ　ｌｅｕ　Ａｓｎ　０１ｎ　レｍ　Ｃｙｍ　Ｖａｌ　ｔａｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　oｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｕｒ　入ｍｐ　６４９ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＴＯＣ　ＡＣＡ　ＣＴＴＴＣＴ　ＧＫＡＡＧ　ＧＭｊ　ＡＱＡ　ＣＡＡ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　Ｍゴａｅｘ　■窒秩@ａｒｒ　ａｘ＾ｓｐｌｉｅＣｙｓＴｈｒＬ＃ｕ５ｅｒＯｌｕ（．ｙｓＧｌｕ＾ｒｇＧｉｎ１１＊ムｙａＬｙｓＧＩｎＴｔ＋ｒ＾１ａム＊ｕＶａｌＧｌｕ１O９Ｆｉｇｕｒｅ　５（ｂｌ国際調査報告　ＰＣＴ／ＦＲ９３１０００８６ＰＣＴ／ＦＲ９３１０００８６フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４１５３５　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／１９　７２３６−４Ｂ１／２１　７２３６−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：６４５）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：６４５）ＩＡ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＢ

Claims

【特許請求の範囲】

１．本質的にタンパク質の安定化構造に結合された、Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ変異体の全てもしくは部分からなる活性部分を含有する組み換えポリペプチド。
２．活性部分が：（ａ）図１に示された配列のＴｈｒ５８６−Ｐｒｏ７５９残基の間に位置するペプチド配列、（ｂ）Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性を保持したペプチド構造（ａ）の部分、および（ｃ）構造的改変（１個もしくはそれ以上の残基の突然変異、置換、付加および／または欠落）によって構造（ａ）もしくは（ｂ）から得られる構造、から選ばれる構造を有することを特徴とし、そしてＧ−ＣＳＦの生物学的活性、もしくは改変された活性を保持した請求の範囲１記載のポリペプチド。
３．活性部分が安定化構造のＮ−末端に結合されることを特徴とする請求の範囲１もしくは２記載のポリペプチド。
４．活性部分が安定化構造のＣ−末端に結合されることを特徴とする請求の範囲１、２もしくは３記載のポリペプチド。
５．安定化構造が、長い血漿中半減期を持つポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲１ないし４の一つに記載のポリペプチド。
６．長い血漿中半減期をもつポリペプチドが、アルブミン、アポリボタンパク質、免疫グロブリンさもなくばトランスフェリンのようなタンパク質であることを特徴とする請求の範囲５記載のポリペプチド。
７．長い血漿中半減期をもつポリペプチドが、請求の範囲６記載のタンパク質の構造的改変（１個もしくはそれ以上の残基の突然変異、置換、付加および／または欠落、化学的改変）によって得られることを特徴とする請求の範囲５記載のポリペプチド。
８．安定化構造が、それが使用される生物体に対して弱い免疫性があるか全く免疫性のないポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲５ないし７の一つに記載のポリペプチド。
９．安定化構造が、アルブミンもしくはアルブミンの変異体であることを特徴とする請求の範囲５記載のポリペプチド。
１０．請求の範囲１ないし９のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド。
１１．発現されるポリペプチドの分泌を可能とするリーダー配列を含有することを特徴とする請求の範囲１０記載のヌクレオチド。
１２．転写開始領域および任意に転写終止領域の制御下における請求の範囲１０および１１のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含んでなる発現カセット。
１３．請求の範囲１２記載の発現力セットを含んでなる自己複製プラスミド。
１４．請求の範囲１０および１１のいずれかに記載のヌクレオチド配列、または請求の範囲１２記載の発現力セット、または請求の範囲１３記載のプラスミドを挿入された組み換え真核もしくは原核生物細胞。
１５．酵母、動物細胞、真菌類もしくは細菌であることを特徴とする請求の範囲１４記載の組み換え細胞。
１６．酵母であることを特徴とする請求の範囲１５記載の組み換え細胞。
１７．サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母であることを特徴とする請求の範囲１６記載の組み換え細胞。
１８．請求の範囲１ないし９の一つで定義されたポリペプチドを調製する方法であって、請求の範囲１４ないし１７の一つに記載の組み換え細胞が、発現の条件下で培養され、そして生産されたポリペプチドが回収されることを特徴とする方法。
１９．請求の範囲１ないし９のいずれか一つに記載のポリペプチドを１個もしくはそれ以上含んでなる医薬組成物。
２０．顆粒球の数および／または活性が刺激されることを必要とする全ての病理学的状況における使用のために意図された請求の範囲１９記載の医薬組成物。
２１．白血球減少状態またはある種の白血病の予防もしくは治療のために意図された請求の範囲２０記載の医薬組成物。
２２．移植またはがん治療の場合において、免疫系を回復させるために使用される請求の範囲２０記載の医薬組成物。