JPS5951793A - 新規クロ−ニングビヒクル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換え遺伝学の分野に関するものであり、史に
詳しくは、形質置換された細菌宿主において外来性偵伝
子を発現させることのできるプラスミドクローニングビ
ヒクルに関する。

本発明に係るプラスミドクローニングビヒクルば、グラ
ム陰性菌の外膜蛋白質ｄ（へ子山東の少なくとも１（車
の機１屯フラグメントをＩＩ）７１．ｊ、　、、−ヒし
てい６第１ＤＩ’ＪＡｉ当己夕１１であって、（コ１）
誘導性ゾロモータを暗号化している：ｌ；　２　Ｄ　Ｎ
Ａ配列、および （１））少なくとも１種のポリペプチドのアミノ酸１１
（１−列を暗号化［７ている第３１）　Ｎ　Ａ配・し１
］、または解１読相においてＩｌｌ　１ｄｌｅコドンと
連１１’１％　シており該第３１〕ＮＡ配列を受は入れ
るのに適した挿入サイト、と１「）イ読相において連結
している第１　ｌ）　Ｎ　７〜配列ン・陰み、史に、核
誘・薄１生プロモータ１′言号と絆ｊ介“ｊ−ることか
できそこからのＩ摸写を選択的に阻害するリプレッサ蛋
白質のアミノ酸配列を暗号化１〜ている第４ＤＮＡ配列
イｃも含有し２てなる組換えプラスミドである。

本発明に保る組換えプラスミドは、グラム１会１生閑の
外膜蛋白質遺云子由来の少なくとも１種の１幾能フラグ
メントを暗号化している第１１）　Ｎ　、Ａ配列を、 （ａ）誘導性プロモータを暗号化している第２１）ＮＡ
ＩＩ！ｌ己タリ、および （１」）少なくとも１種のポリペプチドのアミノ酸配列
を暗号化している第３１）ＮＡ配列、またーは解読相に
おいて翻Ｍｉ＋！コドンと連結しており該第３ＤＮＡ配
列゛ｒ受は入れるのに通した挿入サイト、および該透導
１生プロモ一タ信号と結合することができそこからの転
写を選択的に阻害するリプレッサ蛋白質のアミノ酸配列
イ辷暗号化している瀉４１）　Ｎ　Ａ配列と、解読相に
おいて連結することにより調製きれる。

更に本発明は、ポリペプチドの製造法であって、（＝リ
フラム１会性菌の外）換蛋白質遺伝子由来の少なくとも
１種の機能フラグメントラ暗号化している第１１）ＮＡ
配列であって、国誘導性プロモータを暗号化している第
２１）　Ｎ’　Ａ配列、および（１１）少なくとも１種
の該ポリペプチドのアミノ酸配列、を暗号化している第
３　ｌ）　Ｎ　Ａ自己列、と解読相において連結してい
る第１１）ＮＡ配列）Ｃ含み、更に、該誘導性プロモー
タ浦号と結合することができそこからの転写を選択的に
ｌ汎害−Ｔるリプレッサ蛋白質のアミノ酸配列を暗号化
している第４１）ＮＡ配列七セも含んでいる組換えプラ
スミドで、ｈ（＋　ｔｒｉ宿七を形質１区探し、 （ｂ）該泊■閑宿主を単１雛、培養して多量の該１削１
１：１宿主を生産し、 （Ｃ）該卸１閑宿尼ｎＴ′、にリプレッサ蛋白質と結１
キしぞ）るインジューサ（誘発物質）を加えて請人・、
Ｑ□：ごＬプロモータ信号から該リプレッサ蛋白質を除
去し、（ｄ）該創閑宿尼群に１該ポリペプヂドを生産せ
しめる工程からなる、形質転換細菌宿り中でのポリペプ
チドの製造法に関する。

本発明はまだ、組換えプラスミドをａ有する形質転換体
に関する。

周知の如く、ｌ責伝情報は、その中でｉ）　Ｎ　Ａ　１
ｉ７−沙鎖がその繰り返しのヌクレオチド成分の特数的
な塩基を現わしている配列に従っ−Ｃ１二木梢テオギシ
リポ核酸（１）　Ｎ　Ａ　）分子（偵仏子）上にｌＨ〒
杉化されている。Ｄ　Ｎ　Ａヌクレオチドの２本の鎖に
’Ｊ、’＋徴づけている４個の含窒Ａ塩屑は相補ＩＬＡ
Ｉ、（χｊとなって水素結合によって結合されており、
ｌ）　Ｎ　Ａの二重らせん（ヘリックス）を形成してい
る。即ちアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と結合し、グア
ニン（Ｇ）はシトシンＣＣ）と結合している。暗号化さ
れた情報の「発Ｉ見」には２つの過程が含まれる。遺伝
子のある調節領域の命令により、酵素（１−ＲＮＡポリ
メラービ」）が１）ＮＡ暗号鎖に沿って移動し、「転写
」と呼ばれる喝程でメツセンジャー（伝令）リボ核酸（
「ｍ艮ＮＡＪ　）を６成する。通常、Ｉ）　Ｎ　Ａ暗号
鎖には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写
開始および転写終了のだめの信号が含゛まれでいる。次
の「翻訳」段階では、細胞のりボゾームが、トランスフ
ァー（運搬）　ＲＮ　Ａと一諸になってこのＲＮＡの「
メツセージ（伝言）」を、細胞の形や機能を決定する蛋
白質またはポリペプチド類に変換する。ＤＮＡからｒｎ
　ｌ（Ｎ　Ａによって転写きれる情報には、リボゾーム
の翻！訳を開始まだは終了させる信号、並びにポリペプ
チドを構成するアミノ酸の種類および配列を決める信号
が含まれている。

１）　Ｎ　Ａ暗号鎖は「コドン−またはコードン」と呼
ばれるヌクレオチドトリプレット（三連子）の長い配列
からなっており、それぞれのトリプレット、即ちコドン
中の特徴的な塩１１（が特定の情報ビット（単位）を暗
号化している。例えば、Ａ　Ｔ　Ｇ　（アデニン−チミ
ン−グアニン）と読まれる三個のヌクレオチドは、「９
Ａ訳はじめ」と解読される＋１】ＲＮ　Ａの信号となり
、一方、終止コドンである１”ＡＣ，ＴＡＡおよびＴＧ
Ａは「酔ＦＪ（終了せよ」と解読される。開始コドンと
終止コドンとの間には、究極的に８１１訳されるアミノ
酸配列を決定するコドン、いわゆる「構造遺伝チ」が存
在する。この決定は、種々のアミノ酸の為のコドンを決
定した、良くまとめ上げられた「遺伝暗号」に従って行
なわれる（例えばＷａ　ｔ　ｓ　ｏｎ　、　Ｊ　、Ｄ、
、Ｍｏ　ｌ　ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　Ｔｌ
ｘｅ　Ｇｅｎｅ、第３版〔Ｎｅｗ　ＹｏｒＪ％ＡＪ、Ａ
、Ｂｅｎ　ｉａ＋ｎ　ｉｎ。

Ｉｎｃ、、１９７６　〕参ｊ４α）。コドンの配列には
６４通りの可能性があるか、既知のアミノ酸は僅か２０
であるので、異なったコドンが同じアミノ酸を生産する
という意味でこの遺伝暗号は「縮退」である。しかしこ
の暗号は、そＪＬぞれのアミノ酸に対して少なくとも１
個のコドンが存在し、そして、それぞれのコドンは１個
のアミノ酸を生産し、その他の物は生産しないという点
で正確である。即ち、例えばＴＴＴ、ＴＴＣ，ＴＴＡお
よびＴＴＧというコドンは全て、その様に読まれるとセ
リンを暗号化しており、他のアミノ酸を暗号化すること
はない。究極的に生産されるポリペプチドの適切なアミ
ノ酸配列を得るには、翻訳中適当な解読相または解読枠
（わく）（読み取りフレーム）か保持されなければなら
ないことは明らかであろう。

転写開始の仲立ちをする遺伝子の調節領戦内のＤＮＡ配
列は遺伝子の「プロモータ」と呼ばれ、一方構造遺伝子
の後に続く転写が終了する位置のＤＮＡに暗号化される
特定の信号は「転写終了サイト」と呼ばれている。転写
の開始および終了をつかさどる機構は完全にわかってい
ないが、プロモータが、転写を開始するためにＲＮＡポ
リメラーゼが結合しなければならない結合ナイトを提供
すると考えられており、また、特定のプロモータまたは
ターミネータ信号の効果、即ち「強さ」は、ＲＮＡポリ
メラーゼがこれらの信号全認識し、相互作用することの
できる効率によって決まると信じられている。そしてこ
れは、これらの結合サイトのあるいは・その近くのＩ）
　Ｎ　ＡのＩ特定の１桟配列に依存するところ大である
（例えばＲｏｓｃｎｂｅｒｇ。

Ｍ、ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、、１９７９　　
１３　３１９〜３５３参１１α）。

ある種の遺伝子の調節領峡には、あるエフェクター分子
によって認識され得るＤＮＡ配列１バ含まれていること
がある。このエフェクターの作用１ｄ、ＲＮＡボリメラ
−セとＤ　Ｎ　Ａ　ノ＋＋１ｒｉ、１乍用に正または負
の影ｇを与えることができ、これによって虹に、転写の
段階での遺伝子の発現が調節される。

この様な遺伝子による遺伝情報の発現は、例えば、特定
の物質が存在しない場合に阻害されるので、「誘導（性
）　Ｊ　（１ｎｄｕｃｉｌ）ｌｅ）と呼ばれている。

一方、その調節領域がエフェクター分チによって影響を
受けない遺伝子も存在１−る〔例えばクラム陰性菌であ
る大腸菌（Ｅｓｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（［Ｅ。

Ｃｏ１１Ｊ））のリポプロティン遺伝子〕。この様な遺
伝子による遺伝情報の発現は、細胞の生存期間中不変で
あり、「構成（性）　Ｊ　（ｃｏｎｓＬｉｔｕｔｉｖｅ
）と呼ばれる。この様な遺伝子の調節領域は、一般に、
転写されるｌ）　Ｎ　Ａ配列のそれぞれ直前および直後
にプロモータ信号およびターミネータ信号だけを含んで
いる。

調節領域により、プロモータの、あるいはその近くに存
在する「転写開始ナイト」でｍ　ＲＮ　Ａの合成か誘発
され、転写終了サイトに達するまで合成が進行し、転写
されたＤＮＡの塩基配列上相補関係にある１嘉Ｊ占配列
を持った一定の長さのＩｌｌ　ＲＮＡ分Ｐが生産される
。これら２点間のＩ）　Ｎ　Ａ配列には、そのコドンが
胴］訳されて究極的にポリペプチドを発現する構造遺伝
子のみならず、この構造遺伝子の両側の「非翻訳」領欧
も含まれている。

従って、通常転写によつ−Ｃ１２個所の非１訳領域の間
に位置する翻訳可能なＲＮ　Ａ配列分持ったｍ　−ＲＮ
　Ａができる。構造配列の前の非翻訳領域は「５′−非
翻訳領域」として、構造信号の後の領ｌＺ＆ｆｄｒ３’
−非翻訳“：ｆｊ域」として知られている。後に詳述す
る様に、これらの非翻訳１１１１戦のためのＩ〕ＮＡ暗
号配列は、ある１貴伝子のだめのプロモータ信号および
ターミネ−り信号を具現化している１〕ＮＡ暗号ｌ配列
と同様（不明１．ｌＩｌ書においては、これらは全て、
個々に、あるいは集合的に、これらの遺伝子の「機能フ
ラグメント」と呼ぶ）、本発明の新規なりローニングビ
ヒクルの装置告に効果的にイ吏用することができる。

ここで「クローニングビヒクル」なる用語は、単利１胞
生物中に置かれた時、「形質１１広換」と呼ばれる過程
で複製され得る「プラスミド」の形の非染色体性二本鎖
１）　Ｎ　Ａ分チを５は味する。この様にして形質転換
きれた生物は「形質転換体」と呼ばれる。この目的のだ
めの「プラスミド」は、ウィルスまたは細菌から得られ
る環状非染ｆハ体訃二本鎖］）Ｎ、Ａ分チであり、細菌
からの場合は「細菌性プラスミド」と呼ばれる。

生化学の最近の進歩により、例えばプラスミドに外来性
Ｄ　Ｎ　Ａを含ませた「＃４換え型」クローニングビヒ
ク）Ｖｆ製造することができる様になった。

具体的な例を挙げると、この組換え型プラスミドは、組
換え型ビヒクルによって形質転換し得る生物によって通
常は生産されないポリペプチドを暗号化しているＩ）　
Ｎ　Ａ　ｆ含んでいることができ、この様な外来性１）
　Ｎ　Ａは、ある場合には、ヒトの遺伝物質を含んでい
ることもある。通常、プラスミドを開裂すると、連結し
得る末端を持った線状Ｉ）ＮＡが得られる。これを、連
結し得る末端を持った外来性貨伝子と結合すると、所、
望の表現型特性ケ持った生物学的機能体が得られる。こ
の組換え部分を形質転換によって微生物に挿入し、形質
転換１４８：を弔ＦＡ［シてクローンすると、この新た
な遺伝情報を発現することかできる多量の微生物を得る
ことができる。組換えクローニングビヒクルを製造する
方法および手段、それで微生物を形質転換する方法及び
手段は広く文献に記載されているが、−膜化されだ論述
はＣｏｈｅｎ　、　Ｓ　、のＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍ
ｅｒｉｃａｎ　２３３　２４−３３　（１９７５年７月
）およびＣｉ　Ｉ　ｂｅ　ｒ　ｔ　、Ｗ、らの５ｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ２４２７４〜９４（１
９８０年４月）に記載されている。

別々のＩ）　Ｎ　Ａフラグメントの隣接本１温を、連結
全促進するだめに、色々な方法で修理“Ｊ−る種々の方
法をＩ）　Ｎ　Ａの組換えに使用することができる。

この連結という用語は、Ｔ　４１）　Ｎ　Ａリガーゼの
（手な触媒的酵素によって、隣接するヌクレオチド間に
燐酸ジエステル結合を形成きせるこ七をいう。

例えば、［鈍感末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）Ｊを持った
Ｄ　ＴＪＡフラグメントは直接連結される。あるいは、
その隣接末端に相補性一本鎖を含んでいるフラグメント
は、その後に行なわれる連結のだめにそれぞれの末端を
位置づける水素納会によって、結合は材料に行なわれる
。「相補末端」と呼ばれるこの様な一本鎖は、末端伝移
酵素（クーミナルトランス７．１．　ラーゼ）　ｆ用い
て鈍感末端にヌクレオチドを付加するか、あるいは場合
により、入−エキソヌクレアーゼの如き酵素を用いてｐ
屯感末端の一木の鎖を破啜する（かみ砕く）ことによっ
て形成することかできる。しかし最も普通には、この様
な一本鎖は、長さが約４ないし６の塩基ペア（７１）の
特定のヌクレオチド配列の内部および周囲の燐酸ジエス
テル結合を開裂する制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素
とも呼ばれる）によって形成させることができる。多く
の制限エンドヌクレアーゼおよびそれらの認識配列が知
られており、いわゆるｌｉ　ｃ　ｏ　　Ｒ■　　エンド
ヌクレアーゼは最も広く使用されているものの１つであ
る。二本鎖ＤＮＡを、回転対物の回文［回帰点Ｊ　（ｐ
ａｌ　ｉｎｄｒｏｍｅｓ　）で開’Ｒｆる制限エンドヌ
クレアーゼは相補末端を残す。

従って、プラスミドまだは池のクローニングビヒク）Ｖ
ｆ開裂して、それぞれ制限エンドヌクレアーゼ認識サイ
トの半分からなる末端を残すことができる。同じ制限エ
ンドヌクレアーゼによって得だ外来性ＤＮＡの開裂生成
物は、そのプラスミド末端のそれらと相補性の末端を有
することになる。

あるいＱままた、後記する様に、相補末樺を含有する合
成ＩＪ　Ｎ　Ａ　ｆ、この開裂したビヒクルに挿入する
こともできる。外来性ＤＮＡを挿入するまで、ビヒクル
の相補末端か再結合するのを阻止するために、この末端
をアルカリ性ホスファターゼで消グメントの混入を終結
きせるだめの分子選択が行なわれる。ビヒクルのその曲
の方向に苅して」内切な方向へのフラグメントの挿入は
、このフラグメント力、２個の異なっだ制（恨エンドヌ
クレアーゼによって除去きれたビヒク）ｖ　り　Ｎ　Ａ
にとってかわり、そのフラグメント自身が、それぞれ、
その同じ２種の異なったエンドヌクレアーゼの認識配列
の半分を構成している末端を有している場合に増強され
る。

組み換えＤＮＡの研究に関する最近の広範囲の菜噴の結
果、インシュリン、ソマトスフチンおよびヒト並びに動
物の成長ホルモンなどの機能的ポリペプチド生産物を発
現させるだめの計μ１１が成功し工業的に実行可能とな
って来たが、本発明はこれらの計画の１つの改良に関す
るものである。

解読相において、グラム陰性菌の外＋ｊ＜５（ｏｕｔｅ
ｒｍｅｍｂ　ｒ　ａｎ　ｅ　）蛋白質遺伝子由来の１佃
またはそれ以上の機能フラグメントと結合（連結）した
、所望のポリペプチドを暗号化している１）へへ挿入フ
ラクメントヲ含有している、形質転換された細菌宿主中
で外来遺伝′ｆｋ発現するだめの、一連の組換え細菌プ
ラスミドクローニングビヒクルハ開示されている。好ま
しい態様では、外来性１）　Ｎ　Ａは哺乳類のホルモン
類、酵素類または免疫原（ｉ＋ｎ＋ｎｕｎｏｇｃｎ　ｉ
ｃ　）蛋白質類（またはそれらの中間体）　ｋ　ＩＩｆ
￥号化しており、機能フラグメントはＥ’、ｃｏｌ　ｉ
（大腸菌）のリポプロティン（蛋白質）遺伝子由来のも
のであり、所望のポリペプチドは大腸、菌形質転換体で
発現される。より好ましい態様では、所望の蛋白質を暗
号化しているＤＮＡ配列は大腸菌のリポプロティン遺伝
子と関連している４つの特異な機能フラグメント、即ち
プロモータ、５′−非袖５）り領域、３′−非翻訳領域
およびこの遺伝子の転写終了サイトと１土続しており、
−緒に発現される。

これらの発現プラスミドは第２のプロモータ、好ましく
は誘導性プロモータ、最も好ましくはＥ。

ｃｏｔ　ｉ　　β−ガラクトシダーゼまたは「１ａｃＪ
プロモータをも含んでおり、これは、外来性ＤＮＡが「
ラクトースインジューナ」が存在する時だけ発現する様
に、リポプロティンブロモ−りのすぐ下流に挿入する。

誘発（誘導）されると、所望のポリペプチドを暗号化し
ているＩ）　Ｎ　Ａは両方のプロモータから転写され、
従って所望生成物の収量か増大する。従って、構成遺伝
子発現および誘−８遺伝子発現の両方が達成され得る。

しかし、この誘導クローニングビヒクルを用いる場合は
、形質転換体と１〜で用いるのに特別のＥ。

ｃｏｌ　ｉ４株、具体的にはラクトースリプレッサ分子
を過剰生産するものが好ましい。野性型Ｅ、ｃｏｌｉ細
胞では、一時期に、細胞中にはラクトースリプレッサ分
子の約１０コピーが保持されてりるに輪ぎない。これは
、細胞に通常含まれている１　（１＾１の１ａｃＺを抑
え、その発現を阻止するのに丁度十分な量でるる。しか
しこれは、誘心発呪プラスミド中にクローンきれた外来
ＤＮＡの発現を＋ｉＩ：Ｌ止するには不十分である。と
いうのは、一時期に、各細胞には、それぞれが活性１ａ
ｃプロモータを含有しているクローニングビヒクルの１
０〜２０コピーが（”ｒ−在するからである。従って、
もつと多量のラクトースリプレッサが必要であり、この
為、形質転換に使用をれる株は、突然変異１ａｃＩｑ偵
１云子を持った特別のＥ、ｃｏｌｉ株、１Ａ２２１／ｌ
”Ｉａｃ４９Ｉ　ａ　Ｃ−’−１）　ｒ　ｏ＋テあるこ
とか好ましい。コノＩａｃＩＱ１貫伝子は、ラクトース
リプレッサを暗号化しているｌ−１Ｔ：、常なＪ　ａ伝
子、１ａｃｅ：の突然変異体である。

この突然変異１ｄ伝−１′−はラクトースリプレッサを
渦刺に生産し、一時期に約１００〜１５０分子／細）泡
を生産づ−る。ｌａＣＩｑ遺伝子は、このＪ乙、ｃｏｌ
　１（ｑ３のプラスミドドープライムにのつかつている
。

所望のポリペプチドを、プラスミドドプライムを含有し
ている形質転換体中で発現烙せなけれはならないこの方
法には、２．３の欠点がある。先ず第１に、誘導発現プ
ラスミドの受容菌は、本来的に、ＩａｃＪ’ｌ潰仏子を
持ったＥ、　ｃｏ　Ｉ　ｉ　　株に限定されるという点
である。何故なら、この遺伝子を持たない株は十分な石
のラクトースリプレッサを生１２Ｃシないだろうし、従
って、絶えず所望の発ｌ見生成物ケ生成するであろうか
ら。

第２の欠点は、Ｆ−プライムプラスミドは性因子でめり
、これはＥ　、ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　ＡＩＩＩＪ、、！１ヶ
接合させ、その結＄　１？−プライムプラスミドは一力
のポ１１１胞から他の利１胞へ移動するという点である
。この因子を持ったＥ、ｃｏｌｉ　株゛２真核遺伝子用
に使用することは複雑であり、この方法の利用性を音し
く減じることになる。

最後に、１細胞（約１００〜１５０のラクト−スリプレ
ッサ分子を保有している）中に通常１゛−プライムの２
甘たは３コピーか存在し、各利１胞はの比は刹１胞によ
って非常に異なり、ある場合には、所望の発現生成物の
完全な抑＋ｒｌＩを達成しない。

本発明の目的は、かかる欠点のない新規なプラスミドク
ローニングビヒク／Ｖを提供することにある。

本発明の目的に従い、形質転換卸［閑宿王中で外来性遺
伝子を発現するだめの一連の組換え細菌ブラスミドクロ
ーニングビヒク）Ｌ／ｆ　４１１み立てた。この各プラ
スミドは、クラム１会性菌の外膜蛋白質１貴伝手出來の
１棟またはそれ以上の機能フラグメントと連結しており
、さらに、解読相で誘心プロモークフラクメントとも結
合している、所望のポリペプチドを暗号化しているＤ　
Ｎ　Ａ　押入フラグメントを含んでおり、更にこのプラ
スミドは寸だ、籾導プロモータフラクメントと結合する
ことができ、従って、そこからの転写を抑制するこ吉か
できる蛋〔１貿をｉｊ、４号化しているＩ）　Ｎ　Ａ　
ｉ配列を含んでいるものである。好ましい態様では、機
能フラグメントはＥ、ｃｏｌｉ　　のリポ蛋白質遺伝子
由来のものであり、透心プロモータフラクメントｔｄ−
１！：、　ｃｏｌ　１Ｉａｃプロモータであり、リプレ
ッサのだめの１〕へＡ配列は完全な機能的Ｅ、ｃｏｌｉ
　　１ａｃＩ眞伝子を含んでおり、所望のポリペプチド
はＥ、ｃｏｌ　ｉ　　形質転換体中で発現される。

３１１ｉ’ｉｌのザブクラスブラスミドヲ組み立てた。

この各サブクラスのメンバーは、三者択一の挿入サイト
（部位）の１つを含んでいる。遺伝子発現のだめの・特
定のプラスミドまたは特定のサブクラスプラスミドを選
択することによって、発現生成物を見つけ出し、収集す
ることかできる最終的な１９′置に影響を与えることか
できる。例えば、これらの挿入サイトの１つ奢使用する
と、所望のポリペ　　−プチドを、ｌ框、ｃｏｌｉ　　
リポ蛋白質の（Ｒ−号ペブチトを含イｊするアミノ末端
に位置しているリーダー配列と共に発現きせることかで
き、かくして所望の生成物は細胞質膜全通して分圧・き
れ、この信号ペプチドは、形質転換体固自°の作用で生
体内（１ｎｖｉｖｏ）で除去され、かくして外来ＩｙＪ
′、遺１云子生成物か得られる。残りの２つのπ１１人
サイトのいずれかを使用づ−れば、発現生成物をこの利
１胞のＡ＜＋＋胞質内あるいは泊ＩＩ胞１傳内に見い出
せると期待することかできる。

各サブクラスのプラスミドは共通の挿入サイトを持って
いるが、個々の解読枠か互いに異なっている。即ち１．
各サブクラスは、実際の解読僅か１塩基対異なっている
３個のプラスミドからなり、各挿入サイトの為の所望の
解読枠を選択することができ、それによって広範囲のＤ
ＮＡ挿入フックメンｌ−ｋ、その解読枠を何ら直接的に
改変する必要もなく、本発明に使用することができる。

所望のポリペプチドを暗号化している外来性ＤＮＡは、
ラクトースインジューサの存在する時だけ本発明のプラ
スミドで発現される。しかし、ラクトースインジューサ
が存在しないと、宿主細胞中に存在する発現プラスミド
の各コピーにはＩａｃ■遺伝子が存在する為、クローン
された遺伝子の転写は完全に抑制される。従って、本発
明に係るクローニングビヒクルを使った誘導遺伝子発現
は、Ｆ−プライム因子を持った形質転換体を使用するこ
となく、行なうことができる。本発明に係るクローニン
グビヒクルでの遺伝情報の発現は、各プラスミド内部で
調節されるので、この遺伝子発現は［自己調節Ｊ　（ａ
ｕｔｏ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）−と呼ばれる。

ヒトインシュリンの様な遺伝子生産物’＆Ｎ菌形買転換
体で発現させるだめの本発明に係る組換え細菌プラスミ
ドの構造および機能を、添付の図面を参照しながら以下
に例示、説明する。

第１図はＥ、ｃｏｌ、ｉ　　＋１ポ蛋白質遺伝子を含む
８１４哩基対ＤＮＡ配列の模式図であり、転写開始およ
び停止サイトが矢印（ム）で示しである。捷だ、Ｉ）　
Ｎ　Ａ配列から推論さＪｔろプロリポ蛋白質の７８アミ
ノ酸配列を、そのＩ）　Ｎ　Ａ暗号鎖の相当するコドン
の下に示した。

第２図はＥ、ｃｏｌ　ｉ　　のリポ蛋白質口１ＲＮ　Ａ
の完全な３２２ヌクレオチド配列を示しており、ｍ　Ｒ
ＮＡ配列から推定されるプロリポ蛋白質のアミノ酸配列
を、そのヌクレオチド配列の相当するコドンの下に示し
である。

第３図１４Ｅ、ｃｏｌｉ　　リポ蛋白質ｍ　ＲＮ　Ａ　
（７）　２次構造（案）を示して計り、＠訳開始コドン
を箱で囲んである。

第４図は、本発明のりａ−ニングビヒク／Ｌ”ｋ　Ｉ史
つて真核蛋白質または所望のポリペプチドを発現させる
ための方法を概略的に示す模式図であり、転写開始およ
び停止サイトラ矢印（ム）で、翻訳開始および停止サイ
トｉ矢印（△）で示しである。

第５〜２７図は、組換えプラスミドクローニングビヒク
ルの好ましい組みヴて法を例示する模式図であり、各種
の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の相対向な位置が示
しである。図中、Ｍ♂および′ｒＣはそれぞれアンピシ
リンおよびテトラ−サイタリン耐性遺伝子を示している
。

第２８図および第２９図は、第５〜２７図に示した組み
立て法によるプラスミドを改変して、それに相当′Ｔる
本発明のプラスミドを得る為の好ましい方法を例示する
模式図である。

最近の研究により、一般的にグラム陰性菌の主要な外膜
蛋白質がそれぞれの細菌細胞中にかなシ多量存在するこ
とがわかった。例えば最も良く研究されている嘆蛋白質
の１つであるＥ、ｃｏｌｉ＋］ボブロチイン（蛋白質）
も細胞中の最も豊富な蛋白質であシ、分子の数でｄえば
昶１胞当たり約７００゜０００〜７５０．０００個のリ
ポプロティン分子が存在することがわかった。Ｅ、ｃｏ
ｌ　ｉ　のリポプロティンのだめの構造遺伝子は１個し
か存在しないことも明らかにされているので、転写およ
び翻訳の両レベルに於いて、リポプロティン遺伝子の発
現は極めて効率のよい仕組み（機械装置）であることが
わかる。リポプロティン遺伝子は、リボゾーム蛋白質の
遺伝子より少なくとも１０倍効率よく発現されると思わ
れる。Ｅ、ｃｏｌｉ　　には匹１敢する量のその池の主
安な外膜蛋白質、例えばｏ　ｍ　ｐ　Ａ蛋白質が存在し
、またその他のグラム、Ｓ性閑にも、匹敵する量の主要
な外膜蛋白質、例えばＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃ
ｅｎｓのリポプロティンが存在することから、これらの
糸にも遺伝子発現に関して非常＋Ｃ効率の良い仕組みが
存在することがわかる。従って、本明細書では主として
Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　　のリポプロティン糸について述べ
るけれども、本発明はこの糸に限定されるものではなく
、全てのグラム陰性菌のあらゆる外膜蛋白質遺伝子に関
連する遺伝子発現の仕組みを利用した組換えクローニン
グビヒクルを包合するものであると理解すべきである。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　＋１ボブロチイン遺伝子の極めて４ｊ
率の良い発現を説明できる機構はまだ完全に解明されて
いないが、細菌則胞中にリポプロティン分子−か豊富に
存在する事実にば２．３の因子が貢獄しているものと考
えられる。第１図に示した様に、１５ｃｏｌｉ　　の１
）ボブロチイン直伝子のｌ）　Ｎ　Ａヌクレオチド配列
か最近決定され、その分析の結果、この遺伝子の発現に
関係している多くの特徴的な性質が明らかにされた。

特に、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｉ貢伝子の曲の既知のプロモー
タ配列と比較して、リポプロティンプロモータ領誠は非
常にきわだつた特徴′ｆ：有することがわかった。即ち
、Ａ−Ｔ＠量が極めて高く、これがリポプロティン遺伝
子の極めて効率の良い転写に必須なのではないかと考え
られている。転写開始サイトの前の２６１塩基対（ｒｂ
ｐＪと記す）からなるセグメント（第１図において一２
６１位から一１位まで）は、Ａ−Ｔ含量が７０％であり
、これは、３２２の塩基対（＋１位から＋３２２位）の
転写狽吠（またはｍ　ＲＮ　Ａ順或）のＡ−Ｔ含量が５
３％であり、転写終了サイトの後の１２６　ｂｐ上セグ
メント＋３２３位から＋４４９位）の八−Ｔ＠量が４４
％であり−Ｅ、ｃｏｌｉ　　クロモシームの平均Ａ　−
Ｔ含量が４９％であることと比較すると、（ｊめて高い
。リポプロティン（ｒ　］　＋１ｌ）ｌ　）と記ス）プ
ロモータのヌクレオチド１記列が存在すると思われる一
４５位から一１位のセグメントの八−Ｔ＠喰ｒｒｉ粕に
高く（８０％）、この様にはるかに遠くまで配列してい
るＥ、ｃｏｌｉ　　プロモータ１ｊＪ−１域中で最も高
いと思われる。プロモータ配列に八−１′か跋冨に存在
するとＤＮＡのヘリックス構造が不安定になり、そのた
め、転写の開始に必要な、ＲＮＡポリメラーゼによって
醍介される鎖の巻き戻しが促Ｉ焦されると考えられる。

−１Ａ−Ｔ含量とは別に、ＩＰｌ）プロモータは、−膜
化きれた「プリブナウボックス（Ｐｒｉｌｊｎｏｗ　ｂ
ｏｘ）」に一致Ｌ２だ、−１５位〜−９位（転写開始ナ
イトから僅か８個の１急凧対だけ１４１１れている）に
位置するヘプタヌクレオチド配列を含んでいる様であり
、また、−膜化烙れたＪ　ＲＮ　ＡポＩ）メラーゼ認識
サイト」に一致した。−３８位〜−２７位に位置するド
デカヌクレオチド配列を含んでいると思われる。これら
の配列の一致は、ＩＰＰプロモータのプリブナウボック
ス配列は一般化された配列と不一致の塩基を１個だけ有
し、一方、認識サイト配列は一般化された配列の１２の
塩基の内、僅か５個だけ不一致を示す点できわたったも
のである。

これらのナイトにおけるこの様な特異な塩基配列が効率
的な転写にとって重要であるということは、増強された
プロモータ効率を持ったミュータント（突然変異体）に
おいて、これらの領域と一般化された配列との一致が増
加していることからよく説明される。

第１図のＩ）　Ｎ　Ａ配列を史に分析した結果、リポプ
ロティンａ　伝子は非常に「強い」プロモータを持って
いることのほかに、これまで研究された池の全てのＥ、
ｃｏｌｉ　転写開始サイトと少なくとも同じだけ効率的
なオリゴ−Ｔ転写終了信号−ｚ　＋３１６位および＋３
２２位の間に持っていることがわかつ１と。この因子は
、ｍ　ＲＮ　Ａ生産速度を早め、ＤＮＡから転写される
ｍ　ＲＮ　Ａ分子の大きさを制限することによって、全
体としての転写効率に寄与するものと考えられる。

第２図に示した様に、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｌボブロチイン
ｍ　ｌ（Ｎ　Ａの完全なヌクレオチド配列も決定され、
それによってｍ　ＲＮ　Ａは、ｍ艮ＮＡ１云１１体の効
率的な翻訳に重要であると思われるいくつかの特異な特
徴をその構造の中に持っていることがわかった。このｍ
　ＲＮ　Ａは３２２個のヌクレオチドからなっており、
その内３８個は５′−非翻訳領誠にあり、その内５０個
は３′−非翻訳順誠にあり、残りの２３４個がリポプロ
ティン前駆体またはプロリポプロティンを暗号化してい
る翻訳領域に存在している。第２図のｍ　ＲＮ　Ａ配列
は第１図のＩ）　Ｎ　Ａ配列と相補的である。ただし例
外的に、ＲＮ　Ａ配列（法）によって決定された第２図
の３１３位のヌクレオチドはＣと書かれているが、これ
は第１図に於て示されているＤＮＡ配列（法）によって
決定されたＡと異なっている。この違いの理由は現在の
所、わかっていない。

リポプロティンｔｎ　ＲＮ　Ａは極めて安定であること
がわかったが、この安定性は分子内で広範囲の二次構ａ
ｋ形成するためではないかと考えられている。第３図に
示した様に、ｍ　ＲＮ　Ａは９個の安定な「ヘアピン」
ステム−アンド−ループ［造（ローマ数字１〜■で示す
）を形成することができ、その最も安定なもの（Ｉ）は
３′−非翻訳領域にある。

これらの二次構造のために、他の１！、　、ＣＯｌ　ｉ
　ｍＲＮＡ群と比較してリポプロティンｍ　、ＲＮ　Ａ
の機能半減期が長くなり、これによってリボゾーム翻訳
に利用さ九る率か増大すると考えられる。

をらに、ｍ　ＲＮ　Ａ分子の全ヌクレオチドの６８％が
第３図に示しだヘアペン構造の形成に関与するが、５′
末端から最初の６４個のヌクレオチドの中には安定なヘ
アピン構造は存在せず、一方６５番目のヌクレオチドと
３′末端の間では、８５％のヌクレオチドかヘアピン構
造の形成に関与していることに注目すべきである。この
ことは重要な意味−２持っている。何故なら、５′−非
楠訳領域（＋１位から＋３８位捷で）には、この領域に
二次構造が形成されるのを阻害すると考えられる２個の
広範囲に渡るヌクレオチドの反転（ｒｅｖｅｒｔｅｄ　
）くり返し配列が存在すると考えられるからである。

即ち、これによってこのセグメント中のりボゾーム結合
サイトが冗全にリボゾームに晒らきれ、かくして翻訳の
開始か促進されるからである。さらに、翻訳開始速度は
、分子のこの領域内にリボゾーム結合サイトが２個存在
するｉｊＪ能性かあることからさらに促進されるのでは
ないかと考えられる。

最後に、ｍ　ＲＮ　Ａの３′−非翻訳領域に３個の屈１
択終了コドンが存在すること（ＵＡＡが＋２７３位から
＋２７５位に、ＵＡＧが＋２７６位から＋２７８位に、
そしてＵＧＡが＋２８５イ立から＋２８７位に存在する
。第２図参照）、およびこれらの全てがｍ　ＲＮ　Ａの
翻訳可能順戦、即ち「暗号」領域と同じ解読わく内に存
在することか、縦列り一ミネーター（終了１１旨号）の
特異７ｉ：「バックアップ」配列となり、「シフじりな
く」翻訳を適切に終了することによって、全体として・
畦ｊｒｊ＜効率に寄与していると考えられる。

これらの、聡合された効果およびリポプロティンｍ　Ｒ
ＩＮ　Ａのその他の特異な特徴によって、１ζ、ｃｏｌ
ｉ細胞中でこのｉ伝情報が非常に効率よ＜　’ＩＪＩ　
ａ７ｔ！されるもあと考えられる。

発現の効率性とは別に、Ｅ、ｃｏｌｉ　　＋）ボブロチ
インのもう１つの重要な点は、それが「分泌」蛋白質で
あるということ、即ち、それは前駆体から製造されると
いうこと、そして前駆体は小胞体を通過してリポプロテ
ィンに加工されるということである。即ち、リポプロテ
ィンｍ　ＲＮ　Ａ転写体の翻訳によって実際にはプロリ
ポプロティンと呼ばれるこのｂ１■駆体が生産されるの
であり、これは、リポプロティンの既知の５８個のアミ
ノ酸配列に続いて、その配列が決定されている２０個の
アミノ酸残部からなるペプチド延長部、即ち信号ペプチ
ドを、そのアミン末端に持っている。この分泌過程に関
与する機構はまだ十分に理解されていないが、この信号
ペプチドが、生体内でのプロリポプロティンの小胞体通
過移動を方向づけでおり、この過程でそのペプチド延長
部自体が除去され、熟成リポプロティンが得られるもの
と考えられる。

全てのグラム陰性菌の主要り外膜蛋白質の生産において
も、同様の同化過程が存在するものと考えられる。例え
ば５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　（Ｓ。

ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）リポプロティン遺伝子のＩ）　
Ｎ　、Ａ配列をＥ、ｃｏｌｉ　ＩＰＩ）遺伝子のそＪ’
Ｌと比較、分析することによってプロモータ領域に８４
％、５′−非翻訳領域に９５％のきわたった一致がみら
れた。さらに、Ｓ＋ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓリポプロティ
ン遺伝子のプロモータ領域内のＡ　−Ｔ含量は、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　　ＩＩボブロチイン遺伝子の場合（８０％）と
同様、非常に高い（７８％）。さらにまた、Ｓ９ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓのプロリポプロティンのペプチド延長部
を暗号ｒヒしているＤＮＡ配列はＥ、ｃｏｌ　ｉのもの
とは若干異なるが、その結果としてのアミノ酸配列にお
ける相違によって、Ｅ、ｃｏｌｉプロリポプロティンや
その他の和１閑性分泌蛋白質について提案されている信
号ペプチドの基本的な性質が変わることはない。

さらに、そ（７）ＤＮＡ配列から推論されるＳ、ｍａｒ
ｃｃｓｃｃｎｓのリポプロティン■ｎｋＮＡは、７個の
安定なヘアピンステム−アンド−ループ構造を形成する
ことができると考えられる。リポプロティンは、多くの
異なった属のグラム陰性菌に存在していることか確認さ
れ、また、Ｅ、ｃｏｌｉ　リポプロティンｍＲＮＡは、
Ｓ、＋ｎａｒｃｅｓｃｅｎｓのほかに少なくとも以下の
７種のＥｎＬｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の細菌
からの１）　Ｎ　Ａと交雑することがわかった。即ちそ
れらの細菌ばＳｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｃｅｒｉａ
ｅ、　Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ％
Ｃ１Ｌｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ　。

Ｋｌｅｂｓｉｅ口ａ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　、　　Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｃｎｅｓ　、　Ｅｄｗ
ａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａ　　およびＥｒｗｉｎ
ｉａ　ａｍｙｌｏｖｏｒａであり、このことによって、
１・７．ｃｏｌｉと能のグラム陰性菌との間のリポプロ
ティンの同一性の程度が確認された。これらのことから
、またその他の知見から、本発明が、あらゆるグラム陰
性１菊から導かれる、類似した極めて効率の良い遺伝子
発現の仕組（装置）を利用した組換えプラスミドクロー
ニングビヒクルにまで及ぶのが正当であると理解されよ
う。

」二記］７た様なグラム陰性菌の外膜蛋白質の特異な生
合成および組立てにより、これらのｆ１１１菌のリポプ
ロティン遺伝子およびその池の主要な外膜蛋白質遺伝子
は、形質転換菌中で外来性ＤＮＡ挿入フラグメントの発
［ｒ−コントロールする」二で（１脣ろて魅力的なビヒ
クルとなった。不明ａ’ｌｌ　苔で１／ｉ、いくつかの
これらのクローニングビヒクルの構造と機能について説
明する。

既述したことから明らかな様に、Ｉ！、、ｃｏｌｉのリ
ポプロティン遺伝子の効率的な転写および叫１Ｊ（に貢
献していると思われる大部分の特徴は貨１八その機能フ
ラグメント、即ちプロモータ、５′−非、ＩＨ訳領戦、
３′−非翻訳領域および転写終了サイトに存在している
。これらは全て、第４図のａ）に示した様に、ＩＰＰ構
造遺伝子の口上流」または「下流」に位置している。従
って、真核性蛋白Ｖ捷たはその曲の所望のポリペプチド
の構造ｌ責仏子ｋ　曲記の機能フラグメントを種々の組
合せで含んでいる発現プラスミドに挿入することにより
、そしてａｌ　１ｎｌ宿主をそのプラスミドで形質＋＋
＝　４’Ａすることにより、その構造！貴１ム子の転写
およびそれに１読〈仰ｉ４１＜　ｋこれらの機能フラグ
メントのコントロール下にイ１わせることかできる。

当業者には明らかである理由により、単一の発現プラス
ミドに互いに縦列になっている上記の全ての機能フラグ
メントを利用するのが特に好ましく、好都合である。所
望のポリペプチドの構造遺伝子ケ、その５′末端で、Ｅ
、ｃｏｌｉ　ｌｐｐ遺伝子のプロモータと５′−非翻訳
領域の両者を含むＤＮＡ配列（最も好ましくは、このＩ
）　Ｎ　Ａ配列、′ｒｉ転写開始サイトのｎｉＪに、全
ての２６０　ｂｐのＡ−Ｔに富んだｌ）　Ｎ　Ａセグメ
ントも含んでいる）に融合させることにより、最も強力
な細菌プロモータの１つ−に利用することによって効率
の高い転写が達成され、また、最も効果的なりボゾーム
結合サイトを含んでおり、翻訳開始を促進する特徴点を
暗号化していることのあるＩ）　Ｎ　Ａ配列を利用する
ことによって極めて効率的な４…訳が達成される。さら
に、この構造遺伝子をその３′−木端で、Ｅ、ｃｏｌ　
ｉ　ｌｐρ遺伝子の３′−非翻訳頑１或および転写終了
信号を含むＩ）　Ｎ　Ａ配列にｆｆｌＵｉ合させること
により、転写の際の「全読み取り」（即ち、ｍ　ＲＮ’
　Ａにおいて、不必゛要に長い３′−非４Ｉ４訳領峡が
６成されること）が避けられ、σらに重要なことに口Ｉ
ＲＮ　Ａ生産速度が促進されて、転写効率は一層増強き
れると考えられる・丑だ、ｍ　ＲＮ　Ａ分子の安定性は
、３′−非翻訳領域の二次構造の形成によって増強され
る。

以下に詳細に述べる様に、リポプロティンの分泌特性は
、真核性蛋白質またはその曲の所望のポリペプチドの発
現のその他の面、即ち、発す＾生成物を見つけることか
できるとＪν」待される場所をコントロールするのに利
用することができる。外来性１）　Ｎ　Ａ　ｉ挿入する
のに選ばれた１ｐｐａ伝子内の位置（ｌてよって、発現
された生成物を形質転換体の（（１１１泡質、外賓空間
（ｐｅｒｉｐｌａｓ＋ｎｉｃ　５ｐａｃｅ）ｉたばａｌ
胞の外膜のいづれかに蓄積させるように１υＪ待１−る
ことかできる。

第４図は上記の計画に従って、形質転換菌に天然の真核
蛋白質を発現きせる方法を模式的に示したものである。

第４図に示した特定の実施１焦（子では、真核プロティ
ンの構造；貢仏子は、帽」訳開始コドンより数個の％％
対の後であって、通常リポプロティン遺伝子と連結して
いるある１幾能フックメント（即ち、プロモータと５′
−非翻訳領域）の下流にあるＩＰＰ遺伝子の信号ペプチ
ド内に挿入される。第４図のａ）とｂ）を比較すれば理
解される様に、これらの機能フラグメントの位置は、リ
ボプロティン遺伝子中のこれらの要素の天然の位置と同
じであるが、一方、外来性ＤＮＡ挿入フラグメントは、
信号ペプチドの大部分およびリボプロティン遺伝子の構
造領域の一部に取って代っている。

第４図ｂ）では、外来性遺伝子はその３′末端で余分の
（ｅｘｔｒａ）ｉ訳終止コドンに結合しており、これは
、今度はリポプロティン構造心伝子の残りと結合してい
る。これはきらに、下流でｌｐｐ＠仏子の３′−非翻訳
領域とＩＦ常に結合しており、そのｌｐｐ遺伝子は転写
終了サイトで終っている。再゛び第４図のａ）とｂ）を
比較すればわかる様に、ＤＮＡ挿入フラグメントに続く
機能フラグメントは、通常リボプロティン遺伝子中に存
在するものと基本的に同一である。

Ｉｐｐａ仏子から導かれる３′−非・帽訳領戦は、第３
図のローマ数字工で示したステム−アンドールｍ　ＲＮ
　Ａ中の最も安定な二次構造である）を形成し得るｔｎ
　ＲｆＮ　Ａ配列ケ暗号化している。しかし第４図ｂ）
に模式的に表わした組換えｌ）　Ｎ　、！〜配列は、＋
１６８位（この位置は＠３図に於て矢印（ム）で示しで
ある）から始まる１　０５１４に４Ｎ対からなるリポプ
ロティン構造値伝子の末端部分音も含んでいる。このＶ
ｉ吠は、生成されるｍ　ＲＮ−Ａ分子の大きさが不当に
増大することなく、さらに４個のステム−アンド−ルー
プ構造（第３図においてローマ数字１■、１１［、■お
よび■で示したもの）を含ませることによってｍ　ＲＮ
　Ａ転写体の安定性をさらに増す様に選ばれる。しかし
、以下に１ホベる様に、この上載は究極的には翻訳され
ない。

第４図ｂ）に示した組換え１）　Ｎ　Ａ配９１１の転写
によって第４図りに模式的に示しだｍ　ＲＩＮ　Ａ配列
が生産される。この配列には、両者とも正常な状１１に
おいてリボプロティンの生産に関与する５′−非翻訳領
域と３′−非翻訳領域が含まれている。しかしこのｒｎ
　ＲＮ　Ａはまた、プロリボプロティンの信号ペプチド
の短いセグメントを暗号化している領域の後であって、
リポプロティンのセグメントを暗号化している別の領域
の前に、真核蛋白質を暗号化している領域を含んでいる
。しかし、リポプロティンを暗号化している領域は、真
核性構造遺伝子の３′末端における終止コドンの挿入（
第４図ｂ）およびＣ）において矢印（△）で示しである
）によって、究極的には翻訳されないだろう。翻訳の結
果、所望の真核蛋白質のアミノ酸配列と、その前に、い
くつかの異質アミノ酸残渣を含んだポリペプチドが生産
される（第４図ｄ）参照）。この結合発現生成物は、細
胞質内に蓄積されると考えることができる。何故なら、
完全な信号ペプチドが存在しないと分泌できないからで
ある。しかし、ある蛋白質に関しては、その発現生成物
を既知の方法で細胞質から純化することができ、既知の
方法で余分の蛋白質フラグメンＩｆ天然の蛋白質生成物
から分離除去することができ（第４図Ｃ）参照）この様
にして将来の使用に備えて貯蔵できる所望のポリペプチ
ドを得ることができる。

あるいは、異質アミノ酸を暗号化しているＩ）　ＮＡ副
配列、細菌宿主に形質転換するｒ’ｔ’＋Ｊに、既知の
方法で発現プラスミドから切り取ることもでき、かくし
て発現生成物は正確に所望の外来性蛋白質と一致するこ
ととなり、これを既知の方法で精製することができる。

前記計画を実施するだめの別の方法では、同じ機能フラ
グメントを使用するか所望のポリペプチドを暗号化して
いるＤＮＡ配列をもつと下流、即ち信号ペプチドの最後
のコドンの次に（即ち、信号ペプチド開裂部位またはそ
の１斤〈に）挿入する。

この方法でも機能フラグメントの位置は、リボプロティ
ン遺伝子中のこれらの要素の天然の位置と同じであり、
それらによる効率的な転写および翻訳を完全に利用する
ことができ、嘔らに、既述した様に４個のステム−アン
ド−ル−プ構造を挿入することによってｍ　ＲＮ　Ａ　
転写体の安定性を増強することができる。

この様な組換えＤＮＡ配列は、前記した様に、そして第
４図に示した様に転写され、究極的に翻訳されるが、た
だし、翻訳によって、所望の真核蛋白質のアミノ酸配列
か後についた、プロリポプロティンの信号ペプチドに相
当する信号ペプチドを含むポリペプチドが生産きれる。

この前駆体生成物は１．ｈ号ペプチドのコントロール下
で＋ｉ＃ＩＩ胞質膜（小胞体、ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ
　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通過して分泌され、この過程で
ペプチド延長部自体はＥ。

ｃｏｌｉ　形質転換細胞固有の酵素作用によって認識さ
れ、切り離され、かくして、多分アミン末端にいくつか
の異質アミノ酸残渣（これは前記した様に除去すること
かできる）をもった天然の真核蛋白質からなる生成物が
生産される。この生成物は当初外賓空間に蓄積されるが
、以下に詳述する様に、ある種のＥ、ｃｏｌｉ形質転換
味を使用するき、最終的には細胞の外膜を通過し、培養
培地に吊て来る。

この方法を用いれば、多量の発現生成物が細胞内に蓄積
しても、具核蛋白質力柚：］胞にとって天然の信号ペプ
チドと結合しているだめ、細胞の成畏をさほどｌ５１１
害しないように思われる。烙らに、信号ペプチドが存在
するので、細胞内でこの外・Ｋ性蛋白質は分解作用から
保護さｉ９．る。も（〜そうでろ。

ければ、分解によって蛋白質収量が低下し、また、この
外来性蛋白質はそれ自体の異質りｔ解生成物によって汚
染きれることものるので、Ｖ’ｉｔｉ製か困・Ｉｌ、ｌ
ｆＶこ　、な　イ５゜ 先に述べた計画を実施するだめの史にもう１つの具体的
方法は、同じ機能フラグメントを円ひ使用し、所望のポ
リペプチド’（ｉ＝　Ｉｌηグ化しているＩ）　ＮＡ配
列をσらにもつと下流に、例えば本明細、１１で例示し
た様に、倍−号ペプチド１」１１裂部位から８番［・Ｉ
彼のアミノ酸残渣のコドンの後に挿入する。この方法で
もまた、機能フラグメントの位置はリポプロティン１貴
云子中のこれらの要素の天然の位置と同じであり、それ
らによる効率的な）転写および）ｉＨ訳を完全に利用す
るこ七ができ、きらに、既１ホした様に４個のステム−
アンド−ループ構８を挿入することによってｍ　ＲＮ　
Ａ転写体の安定性全増強することができることは当業者
には明らかであろう。

この様な組換えｆ）　Ｎ　Ａ配列の転写および究極的な
翻訳は、前記した様に、そして第４図に示しだ様に孔付
するが、翻訳によって、所望の真核蛋白質のアミノ酸配
列の前に、熟成リポプロティンの最初の８個のアミノ酸
残渣に相当する８個のアミノ酸残渣が後に付いた、プロ
リポプロティンの信号ペプチドに相当する２０個のアミ
ノ酸残渣の信号ペプチドを含んでいるポリペプチドが生
産される。既述した先の態様と同じ様に、この前駆体生
成物は当然小胞体を通過移動し、この過程で信号ペプチ
ドは認識され除去され得る。しかし、この生成物は外賓
空間に蓄積されず、その代り、リポプロティンに相当す
る８個のアミノ酸が認識されることができ、次いで発現
生成物はさらに加工され、正常な状態でのリポプロティ
ンの外！漢への侵入と同じ様に細胞の外１模に入ってい
く。期待される様に、発現生成物の、リポプロティンに
相当する最初の８個のアミノ酸残渣だけが外膜に実際に
結合するのであれば、真核蛋白質または他の所望のポリ
ペプチドのアミノ酸配列からなる発現生成物の残りの１
，１５分け、外膜から突き出ることになる。。

従って、上記した様な３個の挿入サイトの１ン１しくば
それ以上を持ったブラスミドクローニングビヒク／Ｖを
組み立て、このプラスミドを使って外来性遺伝子生成物
を発現させることにより、その生成物の所在場所をかな
りの程度の正確さで予見することができ、それによって
その生成物を単ｌｉ’ｊｌｌ精製するだめの適切な方法
を考えることができる。

挿入サイトの選択は、所望のポリペプチド自体の１生質
および構造によって指示されることが多く、その生成物
の最も適切な精製法か知られているり５合には持（ｌて
そうである。

本究明のクローニングビヒク／ｖｆ用いて広り・１シ囲
の外来゛１４　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントの光υｉ！を史
に促「１←するために、Ｅｃｏ　ＲＩ、　ｌ−１ｉｎｄ
　ＪＩＩおよびＢａｍ　Ｉ−１■ｌ川沢酵素の認識部位
を含む短いポリヌクレオチド配列をそれぞれの発現プラ
スミドの挿入部位に入れることができる。これによって
、６つの異なったタイプの制限フラグメントを、簡単な
、上記のよく知られた方法に従って、それぞれのプラス
ミドに挿入することができるという柔軟性が更に増加す
る。即ち、本発明において、以下のいづれかの相補末端
のペアＣ対）を持つように修復したＤＮＡ挿入フラグメ
ントと好適に使用することかできる：　Ｅｃｏ　ＲＩ−
Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｈｉｎｄ　Ｊ［［−Ｂｉｎｄ　［、Ｂａ
＋ｎ　ＩＩ　■−Ｂａｍ　ＩＩ　■、Ｅｃｏ　Ｒ■−Ｈ
ｉｎｄ　ｌ［、Ｅｃ。

ＲＩ　−Ｂａｍ　１−Ｉ　Ｉおよび川ｎｄ　ｌ［−Ｂａ
ｍ　Ｌｌ　：［。

既述した様に、ある種の分子が存在しない場合に転写が
開始されなければ、遺伝情報の発現は誘導性であると呼
ばれる。誘導性の遺伝子発現の例は、自然界では、ラク
トース消化に重要な酵素であるβ−ガラクトシダーゼの
生産をコントロールしているＥ、ｃｏｌｉ　Ｉａｃプロ
モーターオペレータに見られる。通常、この遺伝子の発
現は、ｌａ’ｃプロモーターオヘレータに結合してＲＮ
Ａポリメラーゼとプロモータ配列との相互作用を阻害し
、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の転写（ひいてはそ
の後の翻訳）を阻止するラクトースリプレッサが存在す
ると「スイッチ・オフ」の状態になる。しかしラクト−
スが存在すると、このリプレッサ分子はＤＮＡから取り
除かれ、この遺伝子は「スイッチ・オン」されてラクト
ースを消化するのに十分な量のβ−ガラクトシダーゼ酵
素が生産されるまで転写が進行し、その後再びリプレツ
リーがこの遺伝子を「スイッチ・オフ」の状態にする。

前Ｅの構成ＩＰＰ遺伝子クロ〜ニングビヒクルは、ｌｐ
ｐプロモータの下ｉ’ＪｆＥであって、外来性１）　Ｎ
　Ａ挿入フラグメントの上流に、ｌａｃプロモータヲ挿
入することにより、誘導性にすることができる。

この配置に於いては、いずれかのプロモータからの外来
性ＤＮＡの転写は、リプレッサ分子により阻止烙れ、そ
してまだ「ラクトース・インジューサ」と呼ばれる物質
が存在しなければ進行することができない。この物質と
は、本発明の目的においては、ラクトース・リプレッサ
分子と反応してこれを変化させ、このリプレッサ分子が
Ｉａｃプロモーターオペレーターと結合し得なくする分
子である。ラクトースまたは合成インジューサ、例えば
ＩＩ）ＴＧで誘導すると、外来性ＤＮＡをＩＰＰおよび
ｌａｃプロモータの両者で、個々独立に転写させること
ができ、Ｓａｃプロモータだけを使用した場合と比較し
て約５倍、発現を高めることができる・各プラスミドの
内部に機能的Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌａｃ■遺伝子を挿入する
ことにより、この誘導１ｐｐ直伝子クローニングビヒク
ルを自己調整型に改良することができる。この様にすれ
ば、野性型Ｅ、ｃｏｌ　ｉ細胞において通常存在するラ
クトース・リプレッサ遺伝子とｌａｃプロモータとの１
＝１の比を、所望のポリペプチドを発現するために選択
した形質転換体において維持することができる。従って
この様な形質転換体は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌａｃ■遺伝子
を含伺していない発現プラスミドで形質転換した微生物
による所望生成物の発現を抑制するのに必要であると考
えられており、しかし十分ではないことがわかっている
Ｆ−プライム因子を保持している必要がなく、従ってこ
れを与える必要もない。

構成性の、および誘導性の１ｐｐｉｆｔ伝子発現プラス
ミドに関する上記の好ましい特徴は全て、本発明に係る
自己調整誘導ＩＰＰ遺伝子発現プラスミドに挿入するこ
とができ、同じ長所を発揮させることができることが理
解されるであろう。これらの特徴には、通常、ＩＰＰ遺
伝子の４つの特定の機能フラグメントに関係している転
写および翻訳の効率化、リポプロティン構造遺伝子の末
端部の１１１　ＲＮＡ転写体に関・する、４つの［ステ
ム−アンド−ループＪ構造の挿入によるｍ　ＲＮ　Ａ転
写体の強化された安定性、発現生成物を見つけることの
できる場所をコントロールするだめの、外来ＤＮＡの３
つの異なった挿入サイトの供給、および広範囲の種々の
ＤＮＡ挿入フラグメントの発現を促進するだめの、各プ
ラスミドにおける、外来性ＤＮＡ挿入サイトへの１！、
ｃｏ　ＲＩ、１°１ｉｎｄＪＩＩおよびＢａｍ　Ｒｉ制
限酵素認識配列の挿入などが含まれる。

本発明の組換えプラスミドを使用すれば、呻乳動物及び
ヒトのホルモン類、酵素類および免疫原性蛋白質類（ま
たはその中間体）などを包含する所望のポリペプチドを
暗号化しているあらゆる構造改伝子を実際に発現するこ
とかできることが理解されるはずである。この様な蛋白
質としてインシュリンのＡ鎖、Ｂ鎖、プロインシュリン
、生長ホルモン、ソマトスタチン、インターフェロンお
よびトリパノゾーム抗原などを例示することができるが
、本発明はこれらの例示しだ生成物に制限されるもので
はない。

３、形質転換体 所望の真核蛋白質まだは池のポリペプチドの１貴伝子を
含んだ自己調整誘導組換えクローニングビヒクルは、ク
ローニングし次いで蛋白質を生産するだめの宿主として
、特殊なＥ、ｃｏｌ　ｉ株を形質転換するのに使用する
のが好ましい。使用されるこの宿主細胞株は、その宿主
細胞がリポプロティンを生産できない様にするため、Ｉ
ＰＰ遺伝子における「欠失突然変異体」を持つ様に選ぶ
。この欠失突然変異株を形質転換体として使用すること
により、外来性蛋白質の生産が促進されると考えられる
。さらに、１１ボブロチインのだめに使用されるはずの
膜中の分泌サイトが、外来性蛋白質の分泌に利用される
ので、ＩＩ）Ｐの欠如した宿主細、ｉ抱においては小胞
体を通猫１−．ての外来性蛋白質の分泌が促進される。

ＩＰＰ欠失細胞を使用することは、外来性蛋白質を暗号
化している遺伝子ヲ１）ボブロチインの信号ペプチド開
裂部位捷だはその近くに挿入するときは、特に都合が良
い。これは、この様な細胞は「漏出１生」であること、
即ち、この細胞の小胞体を通して分泌された蛋白質が、
究極的に細胞の外膜を通向して培養培地中に漏出するこ
とか知られているからである。所望の外来性蛋白質が培
養培地中に放出されることは、ある場合には、それが細
胞内に留まる場合より単離および精製が容易になるとい
う点で、またそればかりではなく、外来性蛋白質が外貿
空間に蓄積されると正常な細胞活動捷たは細胞の増殖が
阻害されることになるという点でも、好ましいことであ
る。所望の真核性遺伝子生成物が細胞の外に分泌される
と、通常細胞内に存在する蛋白質分解酵素によって、そ
の生成物か小さなフラグメントに分解されてし丑うこ七
を避けることもできる。

４、実験 以上述べた技術と戦略を用いて本発明の組換え細菌性プ
ラスミドクローニングビヒク／Ｖを実験により組み立て
だ。完全を期すために、構成性および誘心性１ｐｐｉ！
伝子クローニングビヒク／１／ヲ組み立てる為の個々の
実験凸程を完全に記へし、次いで本発明に係るプラスミ
ドの１つを組み立てる為の実験渦程を記載する。２・つ
のタイプの、即ち２つの「ファミリー」のビヒクルが記
載されており、１つは構成遺伝子発現用（ｒｐＩＮ−Ｉ
Ｊ　　タイプという）、もう１つは誘導遺伝子発現用（
ｐＩＮ−１１」タイプという）である。本発明に係る自
己調整誘導発現プラスミドは、以降、ひとまとめにして
、「ｌ）’Ｉ　Ｎ　−ＩＩＩ　Ｊタイプまたはシリーズ
という。

以下の記載において、プロリポプロティン徊号ペプチド
を暗号化１〜でいるＤＮＡ配列内に存在する挿入サイト
ヲ込」サイトと、この信号ペプチドの最後のコドンの後
に存在する挿入サイトを印」サイトと、そして熟成（完
全な）リポプロティン０８４目のアミノ酸残７査のコド
ンの後に存在する挿入サイトラ囚」サイトと呼ぶことに
する（第５図参照）。それぞ１１のサイトについて３つ
のプラスミドが製造され得るので（１つか３つの５ｆ能
な解読枠のそれぞれに対応する）、各シリーズにおいて
、全部で９１１１！ｉｌの発現プラスミドかつくられる
。

それらをＡ−１、Ａ−２、Ａ−３，１１−１，１１−２
、Ｂ−３、ｃ−１、Ｃ−２および（，３と呼ぶ。

本発明に於いて使用した制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓおよびＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｌｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、Ｔ　
４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼは特に指揃しない限りＪ３ｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓから、Ｓ１ヌクレアーゼはＭｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓから入手した。

Ａ、Ａサイトプラスミド（ｐｌＮ−Ｉ）の組み立て第６
図〜第１５図は、Ａ挿入サイトを含んだ組換えプラスミ
ドを組み立てる方法を示しだものであシ、これらを参照
しながら以下に詳細な１況明治二行なう。

ＡサイトｌＰＰ遺伝子クローニングビヒクルの組立ての
第１段階は、以下の諸工程においてＩＰＰ遺伝子成分源
として役立つプラスミドを組み立てることであった。こ
の目的のため、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｉｐｐ遺伝遺伝子全入れ
るのに選ばれたプラスミドは、抗生物質テトラサイクリ
ン（Ｔｃ）に抵抗性を示す〔貞仏子を持った小さな（分
子量約５．８メガダルトン）プラスミド、ｐｓｃｌｏｌ
　であった（　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ。

Ｎ、らＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３２７３４〜７３
７（１９７７年））。＠６図の１００に見られる様に、
ｐｓｃｌｏｌ　はテトラサイクリン耐性伍伝子の５′末
端に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１：の開裂部
位を有する。このプラスミドｐｓｃ１０１　はＥ。

０ｎｔｓｕｂｏ　　ｌ専士（１）ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　
　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

５ｔａｔｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉＬｙ　ｏｆ　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ　ａｔ　５ｔｏｎｙＢｒｏｏｋ　）から入手した
。

＠６図１０１に示した様に、１００ｍＭ）＋ｌスス：ｌ
ｌＣｌ　（ｐＨ７，５）　、７５ｍＭ　Ｎａｃｌ　、　
５ｒｎＭ　ＭｇＣｌ２．５ｔｎＭ　　β−メルカプトエ
タノールおよび１００μＱ／ｍｌの牛血清アルブミン（
以下［Ｂ　Ｓ　ＡＪ以下［Ｅｃｏ　ＲＩ　ｔｈｉｌｉｉ
Ｉ夜Ｊ　（！：　イう）＋７）５０μ＃中、制限エンド
ヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１：　　２単位を用い、３７°
Ｃで６０分間、プラスミドＰＳＣＩＯＩ　　Ｉ）ＮＡ２
μＱｆ完全に消化した。このＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ処理した
ＰＳＣＩＯＩ　　ＤＮＡの自己連結を＋Ｋ１１止するた
めに、バクテリアアルカリホスファタービ（以下「Ｂ　
Ａ　ｌ）　Ｊという）を加え（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
　ＢＡＰＰの、１単位）、３７°Ｃで６０分間インキュ
ベートした。反ルニヲフェノール抽出によって終了させ
、線状化したＩ）　Ｎ　Ａをエタノール沈殿により回収
した。

第６図１０２に示す様に、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌｐｐ遺云
子を含儒する２、８キロベース（「Ｉ＜ｂ」）のり、Ｎ
ＡフラグメンＩ−を、Ｊ！：、ｃｏｌ　ｉ　Ｉ　ｐｐ遺
伝子を持った／１イブリッドχファージ（χ１ｐｐＥｃ
−１という）から別に誘導した。このＩＰＰ遺伝子は、
以下に述べる様に、予めλフアージベクター、λ５４０
中にクローンした（　Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｍｕｒｒ
ａｙ　、　　ＪｏＭｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　９８．５５１〜５６４Ｃ１９７５，１））
。即ち、Ｉｐｐｍ（Ｅ子について部分二倍体（ｍｅｒｏ
ｄｉｐｌｏｉｄ）の１！、、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株か
ら分離した全ＤＮＡ（２００μｇ）　（Ｊ　Ｅ５５１９
／Ｆ５０６ＣＭｏｖｖａ　、Ｎ、Ｒ。

ら、Ｊ、ｌ５ａｃＬｅｒｉｏｌ、　　１３３　８１〜８
４　（１９７８年）〕殖制限酵素１１ｉｎｄ　ｍ　２０
０単位で消化した。

Ｌ）ＮＡフラグメントをプレパラテイブアガロースゲル
上で分離し、南方雑種形成法（５ｏｕｔｈｅｒｎｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｃｌｔｎｉｑｕｅ；ＪｌＭ
ｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、９３５０３〜５１７）を用いて　
５／　　３２Ｐ−リポプロティン＋ｎ　ＩＣＮ　Ａと正
の雑種形成を示す約Ｉ　ＱＫｂのＤＮＡフラグメントの
分画を集めた。ＩＱＫｂＨｉ　ｎ　ｄ　Ｊｌ）フラグメ
ント（約２０倍濃縮されたもの）と１−１ｉｎｄＪ［−
開裂λ５４０ベクターＤＮＡの混合物ｉ’ｌ’４ＤＮＡ
ｌｌガーゼと共に反応させた。

連結したＤＮＡを使ってＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　８０２、Ｎ
ＲＲｌ、　　Ｂ　−１５０１６ＣＦ、Ｒ，Ｂｌａｔｔｎ
ｅｒ博士［Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ−Ｍｅｄｉｓｏｎ　’：ｌより入手）をトランスフェ
クションした。この菌株は、ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｕ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
、Ｉ’ｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、の永久コレクションから誰でも人手するこ
とができる。ＩＰＰ遺伝子を持った組換え７アージを　
ｓｒ　＋　３２　ｐ−リボプロティンｔｎ　ＲＮ　Ａを
便い、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓのン”ｊｉ　Ｗ１
斑（プラーク）雑種形成技？ＩＩｊＪ（５ｃｉｅｎｃｅ
　１９６１８０〜１８２　［１９７７年〕）によってふ
るいわけた。試験した、正の雑種形成を示したプラーク
の１つは完全に機能的なＩＰＰ遺伝子ヲ含んでいること
かわかった。

これはχ１　ｐ　ｐ　　Ｉ！、　ｃ−１と名づけられた
。

（５ｍ　Ｍ　ト’＋　７．　：　ｌ−ｌＣｌ　（ｐＨ７
，５）、５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ　２．５ｍＭ　　ＮａＣ
１、５ｍＭ　　β−メ／Ｌ／カプトエタノールおよび１
００μｇ／−〇ＢＳＡを舎利する反応混合物（この反応
混合物を以下「■ＩａｅｌｌＩ緩衝液」キイう）の５０
０　ｐ、ｌ中、制限酵素１１　ａ　ｅ　ｆｆｌ　２００
単位を用いて、３７°Ｃで２時間、２００μｇのλｌｐ
ｐ　　Ｅｃ−１１）ＮＡ′（ｉｌ−完全に消化し、Ｅ、
ｃｏｌｉｌｐｐｉｉｌ伝千を持った２、３Ｋｂ　Ｈａｅ
　　ＩＩＩフラグメントを、以下に述べる方法により、
５％ポリアクリルアミドゲル上で分画することによって
精製した。つ即ち、反応混合物をまずフェノールで抽出
し、次いでＤＮＡフラグメントを２．５容量のエタノー
ルで沈殿させ、減圧乾燥し、５％のグリセリン、２０璽
ｎＭのＥ　Ｉ）ＴＡ、　　Ｑ、Ｑ　５％のフ゛ロモフエ
ノールフ゛ルーおよび０．０５％のキシレンシアノ−）
ｖ（ｘｙｌｅｎｅｃｙａｎｏｌ　）からなる緩嘆液（こ
の混合物を以下「ゲル緩衝液」という）２００μＡＫ溶
解し、次いで５％ポリアクリルアミドゲル上で分画した
。２．８Ｋｂの位置まで移動したＤＮＡのバンド（帯）
をゲルから切り取り、そのＤＮＡフラグメンｌ−ｅ電気
泳ｊ助によってゲルから溶出した。ゲル中のＩ）ＮＡバ
ンドの位置づけに使用したエチジウムプロミド色素（Ｅ
ｉｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　ｄｙｅ）を、フェノ
ール抽出によってＩ）　Ｎ　Ａフラグメントから除去し
た。

ＤＮＡフラグメントヲ２．５容量のエタノールで沈殿さ
せ、遠心分離し、０．３Ｍの酢酸ナトＩ］ウム２００μ
ｌに溶解し、０．５　ｍｌのエタノールで再沈殿させ、
減圧下で再び乾燥した。約１０μｇの精製された２、８
　Ｋｂ　　Ｈａｅ　ｌ［フラグメントが回収された。

２、Ｂｘｂ　　ｌ−１ａｅ　ｌｌ［フラグメントｔＰｓ
ｃ１０１　　にクローンするため、第６図１０３に図示
した様に、合成「Ｊ！、ｃｏＲＩ　リンカ−」分子をこ
の２，８　Ｋ　ｂｌ（ａｅＪ［フラグメントの末端に結
合させた。このＥｃｏＲＩ　　リンカ−（ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣ３’；Ｃｏ１１ａ−５′ ｂｏｒａｔｉｖｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手）は、こ
のリンカ−３モル、６６ｍＭ）リス：　１−ＩＣＩ　（
ｐＨ７，５）、ｌ　ＱｍＭ　　ＭｇＣｌ２、ＩＱｌｎＭ
　　β−メルカプトエタノール、６　Ｑ　μＭ　Ａ−ｒ
Ｐ　オヨび１０単位＋７）Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを含有する反応混合物５０μβ中、Ａ　Ｔ　ｌ）と共
にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ、Ｌ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　から人手）によってリン酸化１〜だ。

この混合物を３７°Ｃで；３０分間インキュベートした
後、６０°Ｃで１０分間加熱し、３７°Ｃに冷却した。

０．１　Ｍのβ−メルカプトエタノール５μでとＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ１０単位をこの混合物に加え、
３７°Ｃで３０分間反応を続行した。この混合物をドラ
イアイス−エタノール浴につけて凍結させることにより
、反応を終了させた。

２．８　Ｋｂ　　Ｉ−Ｉａｅ　Ｊ［フラグメント（２ｐ
−ｆｌ　）　ｋｌｓ。

２モルのリン酸化Ｅｃｏ　ＲＩ　　リンカ−と混合し、
６６ｍＭ）リス：　ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
ＭｇＣ１２、ｌＱｍ、Ｍジチオトレイット（この混合物
を以下「リガーゼ緩衝液」という）およびＱ、　５　ｍ
Ｍ　ΔＴＰを含有する反応混合物１２．５μＥ中、Ｔ４
１）ＮＡクリガーゼ単位で、１２．５°Ｃで１５分間処
理した。この混合物をＥｃｏ　　ＲＩ　緩衝液で２０倍
に希釈し、その混合物を６０°Ｃで１０分間加熱して反
応を終了させた。制限酵素ＥｃｏＲ■３０単位を添加し
、この混合物を３７°Ｃで１時間インキュベートしてＥ
ｃｏＲ■相補末端をつくった。６０°Ｃで１０分間加熱
して反応を終了さすた、この髄にして得た混合物を予め
線状化したプラスミドｐｓｃ１０１　１）　Ｎ　Ａ　２
μ！に加え、フェノール抽出を行なった。エーテル抽出
した後ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、減圧下で乾柔し
、リガーゼ緩衝液１００μＥに溶解した。この混合物を
３７°Ｃで５分間加熱し、ＥｃｏＲＪ−相補末端を、４
°Ｃで１６時間、次いでＯ′Ｃで１時間インキュベート
することによりアニーリングした。Ａ　ＴＰ　（最終０
゜４　ｍ　Ｍ　）およびＴ４　１）　Ｎ　Ａ　Ｉ＋ガー
ゼを添加した後、この混合物’！ｚ１２．５°Ｃで７時
間インキュベートした。

この連結混合物の１／４を用いて、Ｙ、ｆＩｉｒｏｔａ
博士（ＮａＬｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｍｉｓｈｉｍａ。

Ｊａｐａｎ）から入手したＥ、ｃｏｌｉ　ＩＰＩ）欠失
突然変異株ＪＥ５５２７、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５Ｑ１２（
Ｆ−ｍａｎ。

Ｉｐｐ−２，ｐｐｓ、ｔｈｉ、１ｌｉｓ、ｒｐｓＬ、ｇ
ｙｒＡ、ｒｅｃＡｌ（Ｈｉｒｏｔａ、Ｙ、　ら、Ｐｒｏ
ｃ、ＮａＬＩ　、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４　１４１７〜１４２０（１９
７７年）〕を形質転換した。この菌株は、ＮＯｒＬｌｌ
ｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ、Ｉ）ｃｐａｒｔｍｃｎｔｏｆ　
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏ
ｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、ノ永久コレクションから誰でも入手
することができる。Ｃｏ１ｘｅｎ、Ｓ、Ｎ、らの方法（
１’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、６９２１１０〜２１１４（１９７
２年））に従って形質転換を行ない、テトラザイクリン
１０μｆｉｌ’／ｍｌ？：含有するＬブゝロスプレート
の表面に置いたワットフッ３ＭＭ瀘紙上で−夜テトラサ
イタリン耐性形質転換体を増殖させ、コロニー雑種形成
によりｌＰＰクローンをふるい分けた（Ｇｅｒｇｅｎ、
Ｊ、ｌ’、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
７２１１５〜２１３６Ｃ１９７９））。Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ。

′ｒ、らの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ　、ＩＪ、Ｓ、Ａ。

７２１１８４〜１１８８（１９７５年））に従ってＩＰ
Ｐ遺伝子を含むλ１ｐｐＥｃ−１の０．９５ＫｂＭｓｐ
■　フラグメントを〔α−３２ＰｌｄＡＴＰおよびＣａ
　−３”Ｐ　）　ｄ　ＣＴＰでニック（ｎｉｃｋ）　ｖ
Ａ訳し、３２ｐ−プローブとして使用した。正の雑種形
成をしだ形質置換体の１つは第６図１０４に示した構造
のプラスミドを含有することがわかった。

これはｐ　ＫＥＮＩ　１１　　と命名された。このプラ
スミドは、へｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ。

Ｉｌｌ　１ｎｏｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、の永久コレクション
から誰でも人手することができるＥ、ｃｏｌｉ　ＣＣ６
２０／ＰＫＥＮ１１１　、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１１か
ら常法に従って得ることができる。

２、プラスミドｐＫＥＮ　００８の組み立て本発明のｔ
ｐｐ遺伝子発現プラスミドを組みケでるために選ばれた
親のプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Ａｍｐ）お
よびテトラサイクリン（ｒｃ）に対する抵抗性を与える
遺伝子を含有している１）ＢＲ３２２（分丑量約２．６
メガダルトン）であった（　ｌ３ｏ１ｉｖａｒ、Ｆ、ら
、Ｇｅｎｅ　　２　９５〜１１３　Ｃ１９７７年〕）。

第７図に示す様に、ｐＢＲ３２２はテトラサイクリン耐
性遺伝子の５′末端にＥｃ。

Ｒ工開裂部位を、テトラサイク１）ン耐性遺伝子のプロ
モータ内部に１−１　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ開裂部位を、
そしてアンピシリン耐性遺伝子内部にＰｖｕＩ−開裂部
位を持っている。このプラスミドｐ　ＢＲ３２２はＮ、
Ａｒｎｂｃｉｍ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ　ｏｆ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｔ　５ｔｏｎｙ　Ｂ
ｒｏｏｋ）から人手したが、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されて
いる。

第５図にＩＰＰ直伝子の種々の成分を記号または描影法
により模式的に示した。文字ｒａＪで示した影をつけた
セグメントは、ＩＰＰプロモータを含有する、転写開始
サイトの前に存在する約２６０塩基対の、Ａ　−Ｔリッ
チな（魁富な）領域を示している。５′−非翻訳領域は
文字ｒｂＪで示しだ円印のあるセグメントである。プロ
リポプロティンの信号ペプチド領域は、対角線のハンチ
ングを付けた「Ｃ」で示されるセグメントである、ＩＰ
Ｐ遺伝子の構造遺伝子は対角線でハツチングして文字「
ｄ」で示しだ。３′−非翻訳領域および転写終了サイト
は斑点を付し、文字「ｅｊで示したセグメントである。

この様な記号および描影法は、第７〜１１．１５．１７
．１８．２１〜２３、および２６〜２９図に於て、１ｐ
Ｐｉｆｔ伝子の同じ機能フラグメントラ示すのに使用し
た。

第７図はＩＰＰ遺伝子のプロモータおよび５′−非翻訳
領域を持ったフラグメントをｐ　ＢＲ３２２に挿入する
だめの方法を示している。この目的に選ばれたフラグメ
ントは−ｐＫＥＮ１１１の４６２　ｂｐ　Ａｌｕｌフラ
グメントである。これは第５図１０５Ａに示した様に、
ｌＰＰｆｔ伝子のプコモータ配列および５′−非翻訳領
域（それぞれ−４５位〜−１位および＋１位〜＋３９位
）ばかりではなく、プロモータ配列の前の全ての非常に
八−Ｔリッチなセグメントをも含んでいる。

ｐＢＲ３２２中、ＩＰＰプロモータ領域を含む４６２ｂ
ｐＡｌｕ■　フラグメントをクローンするだめに、先づ
ｐＢＲ３２２のＥＣ０１（■オよびＨｉ　ｎ　ｄ　ＪＩ
Ｉ開裂サイトの間に存在するＤ　Ｎ　Ａフラグメントを
以下の方法で、第１図１０６に図示した様に除去する：
１０ｍＭトリス：　ｌ−ＩＣＩ　（ｐｔｌ　　７．５　
）、１０ｍ　Ｍ　　ＭｇＣｌ　２、５　ＱｍＭＮａｃｌ
、５ｆｎＭβ−メルカプトエタノールおよび１００μｇ
／ｒｎｌの１３　Ｓ　Ａを含有する反応混合物（この反
応混合物を以下［１１ｉｎｄ　ｌ［緩衝液］という）　
２００　ｔｔ＃を中、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２プラスミドＤＮ
Ａ　ｌ　ｌ　μｆ／　ｆ　ｌ−１ｉｎｄ　ＩＩＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ１１単位で、３７°Ｃで１時間消化し
た。消化を終了した後ＤＮＡ１エタノール沈殿法により
回収した。　　　□ Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｌ［相捕末端を除去する為に、このＤＮ
Ａを、３Ｑ＋ｎＭ酢酸ナトリ’７ム（ｐｌ−１４，２ｓ
　）、０゜３ＭＮａＣ１および４　ｍ　Ｍ　　Ｚｎ　Ｓ
Ｏ４を含む緩、衡液（以下ｒｓ１緩衝液」という）（最
終容量３００μｌ）中、２０°Ｃで１時間、Ｓ】ヌクレ
アーゼ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａ１）ｏｒａｔｏｒｉｃｓ）ｌ
、　５　μｌで処理した。５ＱＱｍＭ）リス：　ＨＣＩ
　（ｐＨ８，０）　３０　ｐａｔ　　オよび２５０　ｍ
Ｍ　　Ｅｌ）ＴＡ　　３０　ｌＬｌ　ｋ添加して反応を
終了さぜ、次いでフェノール抽出を行なった。

フェノールを除去するためにこの混合物をエーテルで抽
出し、０．０１ＸＳＳＣ（ＳＳＣ＝Ｏ８１５ＭＮａＣ１
＋　ｆ）、　０１５　Ｍ　り−ｒ−ン酸−，ｌ−１−リ
ウム）ＫｉＪ’して４°Ｃで一夜透析し、Ｉ）　Ｎ　Ａ
をエタノール沈殿により回収した。

次いでリン酸化Ｅｃｏ　ＲＩリンカ−（２００Ｐモ）ｖ
　）　ｆ添加し、この混合物を、Ｑ、６ｍＭ　　Ａ−１
−Ｐを含むリガーゼＨｋｒ液１２．５７Ｊ中、−ｆ４Ｄ
ＮＡリガーゼ４単位で、１２．５°Ｃで１６時間処理し
た。

１ｉｃｏ　Ｒ■緩衝液７５μβ中のＥｃｏ　Ｒ１：制限
酵素３０単位全３７°Ｃで２時間添加することにより、
Ｅｃ。

１（１相補末端をつくった。フェノール抽出によって反
応を終了させ、ｌ）　Ｎ　Ａをエタノール沈殿により回
収した。

１’：ｃｏ　ＲＩ相補末端を連結し、それにより、０．
４ｍ　Ｍ　　Ａ　Ｔ　Ｐを含有するりガーゼ緩衝液２０
μβ中のＴ４＋）ＮＡリガーゼ０３単位を用いて１２．
５°Ｃで７時間処理することにより、プラスミドを再閉
環した。この連結したＩ）　ＮＡの０．５μｇを１吏っ
てＥ、ｃｏｌｉ　株Ｊ　Ｅ　５５　］−９、ＮＲ，ＲＩ
−Ｂ−１５０１３（１”、ａｒｏ＋）、ｍａｎ、ａｒｇ
Ｅ、ｌａｃ、ｇａｌ　、ｒｐｓＬ。

ｇ　ｙ　ｒＡ　、　ｒ　ｃ　ｃＡ　Ｉ　；　Ｙ、Ｉｌｉ
　ｒｏ［ａ博士、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕ［ｅ
　　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｉｓｈｉｍａ、Ｊａｐ
ａｎ、　から入手）を形質転換し、１０個のアンピシリ
ン耐性、テトラサイクＩ】ン１盛受性の形質転換体を５
０ｐ　９　／ｍＡ’のアンピシリンを含む１−フロス１
　ｍノ中で一夜増殖させた。この菌株は、ｒ　ｒ　Ｌ　
ｂｅ　ｒｎ　ｌ支ｅｇｉｏｎａ１１（ｃｓｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ、Ｉ）ｅｐａｒｔｍｃｎ
ｔ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１
ｌｉｎｏｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、の永久コレクションから誰
でも人手することかできる。

Ｂｉ　ｒｎｂｏｉｍ、＋（、Ｃ，およびｎｏｌｙ、Ｊ、
の迅速アルカリ変性法（Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ　へ
ｅｓ　７　１５］　３　（１９７９））によりプラスミ
ドＤ　Ｎ　Ａ　ｉ　０．５　ｄの培養培地から分離し、
制限酵素地図作成（で上り分４１丁した。このプラスミ
ドの１つ（ｌｉ第７図の１．０７に示した構造に有し、
ＰＫ１！、Ｎ００５と名付けられた。

第７図１０８に示した様に、ＩＰＰプロモータを含有す
る４　６２　ｂｐ　Ａｌｕ■フラグメントは次の様にし
て得た。ｌ）　Ｋ　ＥＮ　１１１プラスミドＤＮＡＩＱ
ＱμＱ　ｋ、３７°Ｃで３時間、１０ｍＭトリス：■Ｉ
Ｃ１（ｐ１４７．５）、Ｉ　ＱｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５
　ｍ　Ｍ　ＫＣ１１ｔｎＭジチオトレイットおよび１０
０μｇ／ｒｎｌのＢＳＡを含む緩＃液（この混合物は以
下「Ｈｐａ■緩衝液」という）６００μβ中、Ｍｓｐｌ
、制限酵素で消化した（ｐＫＥＮｌｌｌは多数のＭｓｐ
■開裂部位を有するが、第７図１０９には問題となる２
つだけを示した）。フェノールで抽出した後、ＤＮＡフ
ラグメントｆ　２．５　容量のエタノールで沈殿させ、
減圧下で乾燥し、ゲル緩衝液１００μβに溶解し、５％
ポリアクリルアミドゲル上で分画した。

分離したＤＮＡフラグメント全ゲルから溶出した後、純
化した０、９５　Ｋｂ　Ｍｓｐ　Ｉ　フラグメントを約
６μｇ回収した。次いで純ｆヒしだこのＱ、９５Ｋｌ）
Ｍｓ　ｌ）Ｉ　７　ラグメント約６μｆをＨｉｎｄｕ緩
衝液４００１Ｌ７１中のΔＩ　ｕ　工制御９エンドヌク
レアーゼを用いて３７°Ｃで２時間消化し、４６２　ｂ
ｐ　、ＡＩｕＩフラグメントを得、これをゲル′、−■
気Ｉｋ動法により精製した。

４６２ｂＰｌｕ丁フラグメント１μｇ＆リン酸化１うｃ
ｏＲ■　リンカ−１５０Ｐモルと混合し、次いで１２．
５°Ｃで１６時間、Ｑ、　６Ｉｎ　Ｍ　ノＡ　’、ｒ　
Ｐを含有する１）ガーゼ緩１町液１０μβ中のＴ４＋）
ＮＡリガーゼ４単位で処理した。この連結しだＩ）ＮＡ
を、Ｅｃｏ　ＲＩ緩衝液１００μβ中、３７°ＣでＥｃ
。

ＲＩ制限酵素４０単位で１時間消化し、ＥｃｏＲＪ相補
末端をつくった。この混合物を６０°Ｃで１０分間加熱
して消化を終了させ、この混合物にＥｃ。

１（１−消化ｐＫＥＮＱＱ５　　プラスミド］）ＮＡｏ
、６７ｚｇを加え、フェノール抽出を行なった。１３Ｎ
八をエタノール沈殿により回収し、１２．５°Ｃで７時
間、Ｑ、　４　ｍ　ＭのＡ　ＴＰを含有するりガーゼ緩
衝液２０μβ中のＴ　４１）　Ｎ　Ａ　ＩＩガーゼ０．
４単位で処理することにより、Ｅｃｏ　Ｒ■相袖末端を
結合させた５、連結したＤＮＡを便ってＥ、ｃｏｌｉ株
Ｊ　Ｅ　５５１９、ＮＲＲＬ　Ｉ木−１５０１３を形質
転換し、形質転換体を、テトラサイタリン１２．５μ／
Ｉ７ろｄを含有するしブロスプレート上、テトラサイク
リン耐性によって選択した。テトラサイクリン耐性形質
転換体から分面１したプラスミドＤＮＡを迅速アルカリ
変性法により分析した結果、第７図１１０に示しだ様に
ｐＫｌｉＮＯ０５のＥｃｏ　　ｌｔ■サイトに４６２　
ｂｐＡ１ｕ■フラグメントが挿入されていることがわか
った。

この様にして得たプラスミドの１つ−ｉ　ｐＫＥＮＱ　
Ｑ　８と命名した。

３、プラスミドｐＫＥＮＯ１０の組み立てＡサイトＩＰ
Ｐ遺伝子クローニングビヒクルの組み立ての次の段階は
、ｐＫＥＮＯＯ８の２個のＥｃ。

Ｊ開裂部位の１つを除去することであった。これは、ク
ローンするために選ばれた外来遺伝子がＩＰＰ遺伝子プ
ロモータおよび５′−非翻訳領域を含んでいる４６２ｂ
ｐ　ＡｌｕＩ　７ラグメント（今ではＥｃｏ　　ＲＩフ
ラグメント）のすぐ下流に来る様に、唯一の挿入位置だ
けが用意されていることを確保するため（で必要であっ
た。第８図はＩＰＰ遺伝子プロモータから離れたＥＣＯ
Ｒエサイトを除去この目的を達成するために以下の操作
をイ１なった。ＥｃｏＲ■−消化Ｐ　ＢＲ３２２プラス
ミド１）ＮＡ４１ｇを先づＳ１ヌクレアーゼで処理して
ｉ！、ｃ。

Ｊ相補末端を除去し、次いでＢＡＰで処理して自己連結
を防止した。＠８図の１１１に模式的（Ｃ示した様に、
Ｉ）　Ｎ　Ａを、純ｒヒした４　６２　ｂｐ　Ａｌｕエ
フラグメント（第７図に関して１１１１記した様に、ｐ
ＫＥＮｌｌｌからＰ［Ｌだ）Ｏ，’７６μ９と混合し、
Ａ感末端を、Ｑ、６ｍＭのＡ　Ｔ　Ｐを含有するりガー
ゼ緩衝液１０μβ中、−ｆ４ＤＮＡリガーゼ２．４単位
を用いて１２．５°Ｃで１６時間連結した。連結したＤ
　Ｎ　Ａの半分を使ってＥ、ｃｏｌｉ株Ｊ　Ｅ　５５１
９、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１３を形質転換した。形質転
換体の１つは、第８図１１２に示す様な構造のプラスミ
ドを含有することがわかった。このプラスミドはｐＫＥ
ＮＯＯ２と命名された。ｐＫＥＮＯＯ２ブーｙスミドＤ
ＮＡ２５μｇ’ｚ、６　ｍ　Ｍ　トＵ　ス：　ＨＣＩ　
（ｐｌ’１７．９）、５　ｍ　Ｍ　　Ｍｇ　Ｃｌ　２、
　ｌ　５　Ｑ　ｍＭ　　Ｎａ１ｌ。

５ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１ｏｏＩＬｇ／
ｒｎｌのＪ３　Ｓ　Ａからなる緩衝液（この混合物は以
下、「Ｉｓａｍ　ＩＩＩ　緩衝液」という）　５００　
ｔｔ＃Ｊ中、３７°Ｃで１時間、Ｐｖｕ　■およびＸｂ
ａＪ　制限酵素で消化した後、１．０４　Ｋｂ　　Ｐｖ
ｕ　■−Ｘｂａ　　ｌ：　ＤＮＡフラグメント（第８図
の１−１３　）をゲル電気泳動法で精製した。

第８図１１２ｎ ２４ｂｐ　　Ｘｂａ　　Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩ　ＤＮＡ７
ラグ）Ｉｓ／トをｐＫＥＮＱＱ３から誘導した。ｐＫＥ
ＮＱＱ８プラスミドＩ）ＮＡ２５ｇｇをＥｃｏ　Ｒｉ制
限酵素で消化し、４７　Ｑ　ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩフラグ
メントをゲル電気泳動法によシ精製した。次いでこの４
７　Ｑ　ｂｐ　Ｅｃｏ’Ｒ■フラグメント１μｇをＸｂ
ａＩ　制御膜酵素で消化し、先に得た１、Ｑ　４　Ｋｂ
　　Ｐｖｕ　　■−Ｘｂａ　Ｉ　ＤＮＡフラグメント１
μｇおよび予めＰｖｕ　■およびＪｉ　ｃ　ｏ　Ｒ］：
　制限酵素で消化したｐＫＥＮＱＱ５　プラスミドＤ　
Ｎ　Ａ　（第８図１１５）０．７５μｙと混合した。こ
のＤＮＡ混合物を、１２，５°Ｃで７時間、Ｑ、４　ｍ
　ＭのＡ’ｒＰを含むリガーゼ緩衝液５０μ４、中、Ｔ
４１）ＮＡリガーゼ０．８単位で処理した。この連結し
たＤＮＡの半分を使ってＥ、ＣＯ旨株ＪＥ５５１９、Ｎ
ｉｌ、ＲＬ　Ｂ−１５０１３を形質転換し、形質転換体
をテトラサイクリン耐性によシ選択した。

テトラサイクリン耐性形質転換体の培養物０．５　ｒｎ
ｌから得たプラスミドＤＮＡを迅速アルカル変性法によ
り分析した結果、このプラスミドの１つが第８図１１６
に示す構造を有することがわかった。

このプラスミドはｐＫＥＮＯｌｏと命名された。

４、プラスミドｐＫＥＮ０１８の組み立て第９図はＩＰ
Ｐ遺伝子の３１−非翻訳領域及び転写終了サイトを含有
するＤＮＡフラグメントをクローンする方法を示したも
のである。この目的に選ばれたフラグメントは、第５図
１０５Ｄに示しだｐＫＥＮｌｌｌの０．９５　Ｋｂ　　
Ｐｖｕ　ＪＩ−）Ｉｐａ　Ｉ　７　ラグメントであった
。Ｐｖｕ　’Ｊｌ制限酵素はＩＰＰ遺伝子配列の＋１６
７位と＋１６８位の間（ｉ−切断するので、このフラグ
メントは少なくとも、ｌｐｐ！仏子のほぼ後半分を含ん
でいる（第１図および第５図参照）。このフラグメント
をプロモータフラグメントと同じ方向でクローニングビ
ヒクルに挿入するだめに、Ｂ２ｍＨＩ　　リンカ−およ
びＳａｌ　　■リンカーをそれぞれＰｖｕ　’ｆｌおよ
びＩ（ｐａ　：［開裂部位にとりつけだ。

＠９図１１７に示しだ様に、ｐＫＥＮｌｌｌプラスミド
Ｉ）　Ｎ　Ａから、Ｅｃｏ　　Ｒ１：　制限酵素で消化
し、ポリアクリルアミドゲル上で分画することによシ２
、Ｂｘｂ　　Ｅｃｏ　　Ｒ１：フラグメントを得、この
純化したフラグメント１０μｇを、Ｔ−Ｉａｅｌ［緩衝
液５００ｙｂｌｌ中、Ｐｖｕ［制限エンドヌクレアーゼ
を用いて３７°Ｃで１時間、完全に消化した。フェノー
ル抽出によシ反応を停止させ、混合物をエーテルで抽出
した。２．５容量のエタノールでＤＮＡフラグメントを
沈殿させ、遠心分離し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム２００
μｌに再溶解し、エタノール０゜５ｍｌで再沈殿させた
。Ｐｖｕ　ＩＩ−消化２，８　Ｋｂ　Ｅｃ。

Ｉζ■フラグメント５μｇをリン酸化Ｂａｍ　ＨＩ　　
リンカ−３９０Ｐモルと混合し、Ｑ、　５　ｍ　ＭのＡ
　Ｔ　Ｐを含んでいろりガーゼ緩衝液２５μβ中、１２
．５°Ｃで１６時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６単位を用い
て鈍感末端を連結した。この反応混合物：１Ｈａｅｌ［
緩衝液で１５０μｌまで希釈し、６０８Ｃで１０分間加
熱してＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを不活性化した。

Ｈａｅｌ［制限酵素６０単位を添加した後、この混合物
を３７℃で１時間インキュベートした。

ここで使用された１３ａｍ　Ｉ−１■ｌＪンカー（Ｃｏ
ｌ　１ａｌ）ｏｒａｔ　１ｖｃＲｅｓｅａｒｃｈから入
手し、ＥｃｏＲＩ　　リンカ−について既述した方法で
リン酸化した）は、！５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ　３’
なる塩基配列を持っているので、制限即ち、Ｂａｍ　Ｈ
Ｉ　ｌ）７カ一連結ＰｖｕＪＪ’７ラグメント（このフ
ラグメントは内部に１−［ａｅ　ＩＩＩ開裂部位を持た
ない）を消化するために」二記のＨａｅ　ＪＩ［制限酵
素を開用してＰｖｕ　■末端に結合した余分の多数のＢ
　ａ　ｍ　Ｉ−１１リンカ−フラグメントを除去し、そ
の末端に直接結合した唯一つのリンカ−フラグメントを
残した。この方法により、以下に述べる様に、ｌＰＰ遺
１云子の３′末端を含んだＩ）　Ｎ　７〜フラグメント
の精製が非常に簡単になった。

反応混合物ｆ：６０°Ｃで１０分間加熱してＨａｃ■酵
素を不活性化した後、ＤＮＡフラグメントを１−１ｐａ
　　ｌ：緩衝液中、３７°Ｃで２時間、Ｉ（ｐａ　　Ｉ
制限酵素で完全に消化した。反応混合物をフェノールで
抽出し、Ｉ）ＮＡフラグメントをエタノールで沈殿させ
、減圧下で乾燥し、ゲル緩衝液１００μβに溶ＩＶ（シ
、５％ポリアクリルアミトゲｐ上で分画した。０．９５
Ｋｂの位置１で移動したＤＮＡバンドをゲルから切り取
り、ＤＮＡフラグメントを電気泳動によってゲルから溶
出した。フェノール抽出によってエチジウムプロミド色
素を除去した後、２．５容量のエタノールでＤＮＡフラ
グメントを沈殿さ亡、遠心分犀し、０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウム２００μβに溶解し、エタノ−／Ｌ’　０．５　ｍ
ｌで再沈殿させ、再び減圧下で乾燥した。純化１７だＱ
、９５Ｋｂ）−１ａｅ　、ｌｌ［−Ｈｐａ　Ｉフラグメ
ント（第９１１１１ｇで示したもの）約１μｇを得だ。

１２０Ｐモルのリン酸化Ｓａｌ　　■リンカー（Ｃｏｌ
ｌａｂｏｒａｖｉｖｅ　Ｒｃｓｅａｒｃｂから入手し、
前記した様にリン酸化したもの：　５’ＧＧＴＣＧＡＣ
Ｃ３′）を純化０，９５　Ｋｂ　Ｈａｅ　　ｍ−Ｈｐａ
　Ｉフラグメント０，７５ＩＪ、’；ｌ　と、昆合し、
Ｑ、　６ｒｎ　Ｍ　（７）　Ａ　’ｒＰ　−ｆ　”；’
＋　偵するリガーゼ緩１斬液２５　ｐＨ中、１２．５°
Ｃで１６時間、Ｔ４　ＤＮＡ　ＩＪ　カーーｈ３．５単
位に用イテ、ａｌｊｊ・、ｐ末；６：１’ｊ　’１連結
した。この反応混合物を１−分なＩＳａ＋ｎ　ＩＩＩｊ
、ｉ衝液で希釈して最終容量３００μｂとし、６０°Ｃ
で１０分間加熱した。十分な量の１３　ａ　ｍ　Ｉ　（
Ｔｉ　　およびＳ、ａｌ　　Ｉ制限酵素を添加し、この
混合物上３７°Ｃで２時間インキュベートし、それぞれ
Ｐｖ　ｕ　　−ｉｌおよびＩ（ｐａ　　Ｉ末端に付着し
ているＢ：ｉｍ　ＩｌＩ　およびＳａｌ　　Ｉリン）ｙ
−を開裂することによって相補末端を作成し、０．９５
Ｋｂ　　Ｂａｍ　ｔＩ■−５ａｌ　　１−７ラグメント
を得た（＠９図１１９に示しプこ）。

６０°Ｃで１０分間加熱することにより、制［！Ｉ〈エ
ンドヌクレアーゼ消化を終了させた。

この段階で、０．９５　Ｋｂ　　Ｂａｍ　ｌｌｌ−３ａ
ｌ　　’、Ｉ　７ラグノント約０．３８μｇｆｆ：含有
するｉＦｂ合物の半分（１５０μＡ）ｉ、予めＢａｒｎ
　ｌｆｆ１Ｊおよび５ａｊｌ制限酵素で消化しＢＡＰで
処理したＰｌ（１“−Ｎ０１４プラスミドＤＮＡ（第９
図１２０に示した）１／Ｌ／／と混合した。プラスミド
ｐＫ、ＥＮＯ１４は、Ｐ旧く３２２から２４６　ｂｐ　
Ｈｉｎｄ　ｌ［−Ｂａｍ　ＨＩ７　ラグメント（テトラ
サイクリン耐性遺伝子の大部分を含む）を除去すること
により予め調製した。このフラグメントは、発現プラス
ミドの大きさを最小限（約５Ｋｂ）に保つだめに除いた
。このフラグメントの除去は、第９図１２１に示した様
に、Ｉ（ｉｎｄｌ［消化、２０°Ｃにおける１時間の５
１ヌクレアーゼ処理、Ｂａｍ　ｆｉｌ：　ＩＪ　ンカー
付着、Ｂａｍ　ＨＩ　完全消化、Ｔ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　！
Ｊガーゼによる再閉環およびテトラサイクリン感受性形
質転換体の選択によって行なった。

線状化したｐＫＥＮ０１４プラスミドＤＮＡと０．９５
Ｋｂ　　Ｂａｍ　ｌ−１１ニーＳａｌ　　Ｉ’７ラグメ
ントの混合物をフェノールで抽出し、ＤＮＡを２．５容
量のエタノールで沈殿させ、遠心分離し、０．３Ｍ酢酸
ナトリウム２００μｌに溶解した。ＤＮＡをエタノ−／
Ｖ　Ｏ，５ｍｌで再沈殿させ、遠心分離し、減圧で乾燥
した。Ｑ、　４　ｍ　ＭのＡ　−ｒ　Ｐを含有するりガ
ーゼ緩衝液中、１）ＮＡフラグメントの相補末端ｉ−Ｉ
”４ＤＮＡリガーゼ０．４単位を用いて１２．５°Ｃで
７時間アニーリングした。この連結した混合物１２μ４
　を使ってＥ、ｃｏｌｉ　　株ＪＥ５５１９、ＮＲＲＬ
　Ｂ　−１５０１３を形質転換し、アンピシリン耐性形
質転換体１２個を、５０μｇ／−のアンピシリンを含む
Ｌブロス１−中で一夜増殖させた。プラスミド１）ＮＡ
を培養物０．５　Ｊから、迅速アルカリ変性法で分離し
、アガロ−スゲ／Ｌ／電気永動（（よって分析した。５
個のプラスミドＤＮＡは０．９５　Ｋｂ　　ＢａｍＨｌ
ニーＳａｌ　　Ｉフラグメントを含んでおり、これらの
プラスミドの内１間はｐＫＥＮＱｌ　８と命名された。

ｐＫＥＮＱ１３プラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列は、第９
図［２２に示した構造を有・することがわかった。

子 特に、Ｂ　ａ　ｍ　Ｉ−１１リンカ−は、１ｐｐａ伝内
のＰｖｕ△ ■サイトに、正しい方向で結合していることがわかった
。

５、プラスミ°ドＰＫＥＮＯ２１の組み立てＡサイトｌ
ｐｐ遺コモクローニングビヒクル組み立ての次の段階数
１ｐｐプロモータフラグメントを同じ方向で転写ターミ
ネータフラグメントと結合させることであった。この工
程は、ｐＫＥＮＱｌ８の６３　Ｑ　ｂｐ　　Ｐｖｕ　　
■−Ｅｃｏ　　ＲＩフラグメントをｐＫＥＮＱＩＱの１
．Ｉ　Ｋｂ　　Ｐｖｕ　　ニーＥｃｏ　　Ｋｌ：フラグ
メントで置き換えることであった（第１０図参照）。

この目的の為、ｐＫＥＮＱＩＱプラスミドＤＮＡ２０ｔ
ｈｙを、Ｂａｍ　ｆｉｌ：緩衝液１００％Ｎ中、Ｐｖｕ
■制限エンドヌクレアーゼを用いて３７°Ｃで１．５時
間消化した。反応混合物を６０°Ｃで１０分間加熱して
Ｉ’ｖｕ：［“酵素を不活性化した後、水５２μｌ、０
．５Ｍ）リス：　ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）４０μＥ、０
．１ＭＭｇＣＩ２　４μｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素４
０単位を添加した。この反応混合物を３７°Ｃで１時間
インキュベートし、フェノール抽出によって消化を終了
させた。エタノールを２．５容量加えてＤＮＡフラグメ
ントを沈殿させ、減圧で乾燥し、ゲ）ｖＭ衝液液１００
μｌ溶解し、５％ポリアクリルアミドゲル上で分画した
。分離したＤＮＡフラグメントをゲルから溶出して、純
化１．　Ｉ　Ｋｂ　ＰｖｕＩ　−１！、ＣＯＲＩ　フラ
グメント４μｌを得た。

純化したフラグメント（０，７５μｇ）を、予めＰｖｕ
　　■およびＥＣＯＲＩ　制限酵素で二重に消化１７、
次いでＢＡＰで処理した（第１０図１２４参照）ＰＫＥ
ＮＯ１８プラスミドＩ）　Ｎ　Ａ　Ｏ，６Ｍｇと混合し
た。Ｐｖｕ　　■およびＥｃｏＲＩ相補末’ＡＶ　’ｊ
！：　、０−４ｍＭのＡＴＰを含有するりガーゼ＠衝液
５０μ４中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．４単位を用いて１
２．５°Ｃで７時間処理することにより連結した。この
連結したｉ昆合物２５μｌをｆ吏ってＥ、ｃｏｌｉ（朱
ＪＥ５５１９、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１３を形質転換し
、この形質転換体をアンピシリン耐性によつ−Ｃ選択し
たー。

プラスミドＩ）　Ｎ　Ａをアンピシリン耐性形質転換体
から璽離し、アガロ−スゲ／Ｖ　眠気泳動法により分析
した。制限酵素地図作成により、このプラスミドの１個
が第１０図１２５に示す構造を持っていることがわかっ
た。このプラスミドはｐＫＥＮＯ２１と命名された。

６、プラスミドｐＫＥＮＯ３７０組み立て第１１図は第
１番のＡサイトＩＰＰ遺コモ発現プラスミド組み立ての
最終工程を示す。第１１図１２６に示す様に、ｐＫＥＮ
Ｏ２１は、ｐＢＲ３２２から心かれるＣ由来する）　３
２　ｂｐフラグメントによって隔てられているＩＰＩ）
プロモータフラグメントとｌＰＰＰＰ転写ターミネータ
フラグメント有している。３２ｂＰフラグメントを除去
し、所望のポリペプチドを暗号化しているＤＮＡ配列を
挿入することによシ、所望のポリペプチドを発現するだ
めの機能体を得る。しかし、３２　ｂｐ≠叶呻フラグメ
ントの末端部にＥｃｏＲ工およびＢａｍＨＩ開裂ザイト
があるので、プラスミドｐＫＥＮＯ２１の構造には、１
”、ｃｏ　ＲＩ−ＥＣＯＲＩ、　Ｂａｍ　ＩｊＩ−Ｂａ
ｍ１（Ｉ　ｉ　′にはＩ！、ｃ　ｏ　Ｒ■−Ｂ　ａ　ｍ
　Ｉ−Ｉ　■相補末端を持った外来Ｄ　Ｎ　Ａ挿入フラ
グメントだけしか挿入することができない。従って、他
の相補末端の組み合せで修腹されたものを含む挿入可能
な外来性遺伝子の種類を広げるだめに、この領吠のＩ）
　Ｎ　Ａ配列を修正変四して、既存のＥｃｏＲ］：　サ
イトおよびＢａｍ　Ｆ［サイトの間に１−１　ｉ　ｎ　
ｄ　ｊｌｌ開裂サイトを付加した。

この目的全達成する為に、以下に述べる方法により、ｐ
ＫｒｉＮＱ２１の２００　ｂｐ　　Ｉ（ｉｎｄ　　ｌ［
−Ｃ１ａ■フラクメントを除去することによってまずプ
ラスミドの大きさを減少ざすることが′！４″！、シい
ことであった。ｐＫＥＮＯ２１プラスミドＩ）　Ｎ　Ａ
　５　ｐ、！　を、１０ｍＭト！Ｊス：Ｉ（ＣＩ（ｐｔ
ｌ　　８．０　）、ｌＱｍＭ■νＩｇＣ１２および１０
０μＱ　／＋＋＋ｊ！のＢ　Ｓ　Ａを含む反応混合物１
００μ＃中、３７°Ｃで１時間、Ｃ１ａ　　Ｔ制限酵素
１単位を用いて部分的に消化した。フェノール抽出及び
エタノール沈殿の彼、Ｓ１綴ｆ垣液２００μβ中、２０
℃で１時間、Ｓ１ヌクレア一ゼ６００単位で処理するこ
とによりＣＩａ　　■相補末端を除去した。０．５Ｍト
リス：　ＨＣＩ　（ｐａｌ　８．　Ｑ）２０μ看および
０１２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　２０μｍを加えて反応を終結
した。この混合物をフェノールで抽出し、０．０ＩＸＳ
ＳＣに対して４時間透析した。

２．５容量のエタノールでＩ）　Ｎ　Ａを沈殿さぜ、遠
心分離し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム１００μｌに再１１
イ濁した。２５０μ召のエタノールでＤ　Ｎ’　Ａを（
Ｊｌ：沈殿させ、遠心分１１［：して減圧下で乾燥した
。

Ｓｌ−処理ＤＮＡ１μｇを７０１）モルのリン酸化しだ
Ｈｉｎｄ　　■　リフカー（ＣＣＡＡＧＣＴ’ｒにＧ３
’：５′ Ｇｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈがら入
手し、前記と同様にしてリン酸化したもの）と混合し、
０．６ｍＭのＡ　Ｔ　Ｐを含有するりガーゼ、緩衝液２
゜Ｉｂｌ中、１２．５°Ｃ−ｒ６時間、−１”４　Ｄ　
ＮＡ　リカー上４単位を用いて、鈍感末端を連結した。

この混合物６　ＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　Ｍｆ’ｌｉ
液テ１００１ｂｌ）になるまで希釈し、６０°Ｃで１０
分間加＄Ｉ　した。Ｉ（ｉｎｄ■制限エンドヌクレアー
ゼ２０単位を添加し、この混合物を３７°Ｃで１時間イ
ンキュベートして余分のリンカ−分ｐを除去し、Ｉ−］
１ｎｄｌ［相補末端を作成した。

この反応混合物をフェノールで抽出し、ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させた。Ｑ、４　ｍ　ＭのＡＴＩ）を含有す
るりガーゼ緩衝液１５μβ中、１２．５°Ｃで７時間、
−ｒ４ＤＮＡＩＪガーゼ０．８単位で処理してプラスミ
ｆ’−１）ＮＡ　（０，５μｇ）を再閉環した。この連
結混合物ＢＩＬＥ−ｆ使ってＥ、ｃｏｌｉ株ＪＡ２１１
、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５Ｑｌ　４　（ｒｅｃＡ−ｊｈｒ−
、ｈ＋、△ｔｒｐＥ５゜ｔｈｒ、ｌｃｕ、Ｅｈｉ　、１
ｃｃＹ−：Ｊ、Ｃａｒｂｏｎ博士（Ｄｅｐｔ、ｏｆＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ　ｏｆｃＬｌｉｆｏｒｎｉａ。

５ａｎＬａ　１ｓａｒｂａｒａ　）がら入手）を形質転
換した。

この菌株は、Ｎｏｒｔｌ〕ｅｒｎ　Ｒｃｇｉｏｎａｌ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ＋Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ。

Ｐｃｏｒｉａ、ＩＩ　１１ｎｏｉｓ　、Ｕ、Ｓ、Ａ、の
永久フレクションから誰でも入手することができろ。ア
ンピシリン耐性形質転換体から純化したプラスミドＩ）
　Ｎ　Ａ。

中の１つは第１１図１２７に示す構造を持ってい７・Ｆ
ｏ　このプラスミドはｐＫＥＮＱ３Ｑとａ汀名された。

ｐＫＥＮ３０のｌ１ｉｎｄｌｆｆ　　開裂部位え除去す
るために、ＰＫＥＮＯ３０７’ラスミドＤＮ−Ａ２．５
　ｌＬ９　’？：、１１ｉｎｄｌ［緩衝液５０μｌｌ中
、ｌｌ１ｎｄｌｌＬ制限酵素５単位を用いて、３７°Ｃ
で１時間油化ｌ−た。フェノール抽出およびエタノール
沈殿の後、Ｓ１緩衝液２００μβ中、２０℃で１時間、
Ｓ１ヌクレア一ゼ４００単位で処理することによ］ｌｌ
１ｎｄｌＴＩ相補末端を除去した。ＤＮＡを回収した後
、このＳｌ−処理プラスミドＤＮＡ０．７５７Ｌｇを、
Ｑ、　６ｍ　ＭのＡＴＰを含有するりガーゼ緩Ｎ液１０
μｌ中、１２．５°Ｃで１６時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
２弔位で処理することによって再閉環し／ｃｏ連結混合
物３μｌを使ってＥ、ｃｏｌ　ｉ株ＪＡ２２１、ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１５０１４を形質転換した。アンピシリン耐
性形質転換体から分離したプラスミドの１つは第１１図
１２８に示す構造を有することがわかった。

ｐＫＥＮＯ３３と命名されたこのプラスミドはＨｉｎｄ
ＪＩＩ開裂部位を含んでいなかった。

第１１図１２９およびより詳細には第１２図に示しだ様
に、以下に述べる方法で、プラスミドＰＫＥＮＱ３３　
のＤＮＡ配列を修理変更し、Ｅｃｏ　ＲＩ　サイトおよ
びＢａｍ　Ｉ−Ｉ工ｔイトの間にｌｌ１ｎｄｌＩ開裂ザ
イトを作成した。ｐＫＥＮＯ３３プラスミドＤＮＡ（第
１２図、ａ）に示したＤＮＡ配列を持っている）５ｐ、
９を、ＢａｍＨＩ緩衝液５０　ｐ、ｌ中、３７°Ｃで・
１時間、Ｂ　ａ　ｍ　Ｉ−Ｉ　Ｉ　ｆｌｔｌＪ限エンド
ヌクレアーゼ１０単位で消化した。反応混合物を６０°
Ｃで１０分間加熱することによシ、Ｂａｍ　Ｈ■酵素を
不活性化した後、この線状化したＤＮＡフラグメントを
、ＥｃｏＲｌ：　緩衝液１００μβ中、３７°Ｃで１時
間、ＥｃｏＲｌ：酵素１０単位で更に消化した（第１２
図、１〕））。フェノール抽出及びエタノール沈殿を行
なった後、ＤＮＡ（３，６μｇ）をＴ４　ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｂｅｔｂｅｓｄａ艮ｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）　３単泣で、５　Ｑ　ｍへ１トリス：
　ｌｌＣｌ　（ｐＨ８，０）、１００　ｍ　Ｍ　　ＫＣ
Ｉ　、　５　ｍ　−ｔｘ（ＭｇＣｌ２．、および５ｍＭ
ジチオトレイットヲ含有する反応混合物（この反応混合
物１は以下「ポリメラーゼ緩衝液」という）２ＯＰｅ中
、それぞれＱ、　ｌ　ｔｎＭｏｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰおよ０．ｄＴ’ｒｌ’　の存在下、１２．５°Ｃ
で４５分間処理した。この操作（ＩてよりＢ　ａ　ｍ　
ｔｌ　■およびＥｃｏＲＩ　の「粘着末端」は、第１２
図、Ｃ）に示す様に完全にふさがれた。

ＤＮＡを回収した後、リン酸化Ｈｉ　ｎ　ｄ　］［］リ
ンカー３００ＰモＶを添加し、Ｑ、　（３ｍ　Ｍのｌ〜
Ｔ　Ｉ）をＳ膏する！ＪガーセＨｊ衡１８　ｓ　５　ｐ
＃中、Ｔ４１）ＮＡリガーゼ４単単位用用て、１２，５
°Ｃで１６時間、鈍感末端を連結した。次いでこの混合
物を川ｎｄ】■緩衝液で１００μＡに希釈し、Ｈｉ　ｎ
　ｄｌ［制限酵素１００単位で消化した。この混合物を
３７°Ｃで１時間インギュベートして余分のりイカ−分
子を除去し、Ｈｉｎｄｌ［相補末端を作成した（第１２
図、ｄ））。この相補末端は、９．４　ｍ　ＭのＡＴＰ
を含有するりガーゼ緩衝液２０７１６中のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．４単位で、１２．５°Ｃで７時間、このＤＮ
Ａ０．８μ７を処理することによ多結合させた（これに
よってどのプラスミドＤＮＡは再閉環する）。

この連結混合物の１部を用いてＥ、ｃｏｌ　ｉ株ＪＡ２
２１、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１４を形質転換した後、ア
ンピシリン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを分離し
た。それらの内の１つは第１１図１３０に示した構造を
持っておシ、ｐＫＥＮＯ３７と命名された。ｐＫＥＮＯ
３７（７）　ＤＮＡヌクレオチド配列を分析した結果、
第１２図ｅ）に示したＤＮＡ配列を有することがわかっ
た。これは１つのＧ−Ｃ対がＨｉｎｄ■およびＢａｍ　
Ｉ［開裂サイト間で欠如している（その理由は現在の所
不明である）。ｐＫＥＮＯ３７は構成性Ａ−１クローニ
ングビヒクルであることが確認された。

７、プラスミドｐＫＥＮＯ３９およびｐＫＦＮＯ４０の
組み１ １）　Ｎ　Ａ挿入フラグメントにｐＫＥＮＱ３７のもの
とは異なる解読枠を付与するために、ＥＣ，Ｒ１ｇ開裂
部位でｐＫＥＮＱ３Ｑの解読枠を調節することによって
、Ａ−２およびＡ−３ｔＰＰ遺伝子クローニングビヒク
）ｖ２組み立てた。＠１３図のａ）および第１４図のａ
）は、両者とも、ｐＫＥＮｌｌｌにおけるプロリボプロ
ティンの翻訳開始サイトの周囲のＤＮＡ配列を示してい
る。図示した様に、この配列には＋４５と＋４６位の間
にＡｌｕＩ開裂部位がよまれている。プラスミドｐＫＥ
ＮＯＯ８の作成に２いて、ＥｃｏＲｌ　リンカ−をＡｌ
ｕ　　Ｉ　末端にとり付け、プラスミドｐＫＥＮＱＱ８
、ｐＫＥＮＯｌｏ、　ｐ　Ｊ（Ｅ　Ｎ０２１およびｐＫ
ＥＮＯ３０において、第１３図１））および第１４図ｂ
）に示す様なりＮＡ配列を作成し、＋４７位および＋４
８位にＥｃｏ　ＲＩ開裂部位をつくった。ｐＫＥＮＱ３
ＱのＪ）　Ｎ　、Ａ凸己列をＥｃｏＲｉサイトで修正し
、第１３図Ｃ）および第１４図Ｃ）に示す様に、解読枠
をそれぞれ１塩基および２塩基シフトさせた。

最初のケースでは、この目的を達成するために、Ａ−２
解読枠を持ったプラスミドを作成する目的で、ＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液１００　Ｐｇ中、３７°Ｃで６０分間、Ｅｃｏ
　　］支１制限酵素を用いてｐ　Ｋ　Ｅ　Ｎ　Ｑ３０プ
ラスミドＤＮＡ５μｇを完全に消化１７だ。

フェノール抽出とエタノール沈殿の後、Ｑ、ｌｍＭｄ　
ＧＴ　ｌ）およびＱ、　ｌ　ｍ　Ｍ　ｄＡＴｌ’　ノ存
在下、ポリメラーゼ緩衝液３０μβ中のＴ４ＤＮＡポリ
メラ〜ゼ３単位を用いて、１２．５°Ｃで４５分間、Ｄ
ＮＡを処理した。最終濃度が２５ｍＭと女る様にＥＤＴ
Ａを加えて反応を終了させ、フェノール抽出を行なった
。この操作でＥｃｏ　ＲＩ　　ｒ粘着末端」の半分は２
個のＡｓ渣で満たされた。残りの２個の一本鎖Ａ残渣は
、Ｓ１緩衝液２００μｌ中、２０°Ｃで１時間、Ｓ１ヌ
クレアーゼで処理することにより除去した。０．５　Ｍ
　）リス：　ｌ−１ｃＩ　（ｐｉ−１８，０）２０μｌ
および０．２５　Ｍ　　ＥＤＴＡ　２０μｌｆｆ：加え
て反応を終了させた。この混合物をフェノールで抽出し
、０．０ＩＸＳＳＣに対して一夜透析した。

２．５答量のエタノールでＤＮＡを沈殿させ、遠心分離
し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム１００μＡＫ懸濁した。２
５０１ＬβのエタノールでＤＮＡを沈殿さす、遠・ＵＯ
離し、減圧で乾葉した。

Ｅｃｏ　Ｋｌ：　開裂部位を復元するプこめに、ＳＩＬ
処理ＤＮＡ１μｇを先づ、リン酸（ヒＥｃｏＲ■　リン
カ−７Ｑｐ％＃と混合し、０．６ｍＭのＡ　−ｆ　Ｐ　
ｉ含有しているリガーゼ緩衝液１１μβ中、′Ｊ”４１
〕ＮＡリガーゼ３，２単位を用い、１２．５°Ｃで１６
時間、鈍感末端を連結した。この混合物を１！：ＣＯ１
ζ■緩衝液で５０μＢまで希釈し、６０°Ｃで１０分間
加熱した。Ｅｃｏ　　Ｒ１：制限エンドヌクレアーゼ２
０単位を添加し、この混合物を１時間：３７°Ｃでイン
キュベートし、余分のリンカ−分子を除去して］！、Ｃ
０ＲＩ相補末端を作成した。この反応混合物をフェノー
ルで抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。プラス
ミドＤ　ＮＡ　（Ｑ、　５μｇ）を、０、４　ｍ　Ｍの
ＡＴＰを含有しているりガーゼ緩衝液１５μｌ中、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ０．８単位で７時間、１２．５°Ｃで処
理するこ七により再閉環した。

この連結した混合物８μｌを用いてＪ！、、ｃｏｌｉ　
株ＪＡ２２１、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１４を形質転換し
た。

アンピシリン５０μｇ／−を含有するしブロス１００ｍ
Ｚ中で１夜増殖させた３個のアンピシリン耐性形質転換
体からプラスミドＤＮＡを純化し、そのＥｃｏＲ■開裂
部位のＤＮＡ配列を決定した。

この内の１つは第１３図Ｃ）に示した配列を有すること
がわかった。これはｐＫＥＮＯ２４（Ａ−２）と命名さ
れた。

Ａ−３解読枠を有するプラスミドを組み立てる為に、ｐ
ＫＥＮＯ３０プラスミドＤＮＡ５μｇを、Ｅｃ。

ｋ■緩衝液１００μ！中、Ｅｃｏ　　ＲＩ制限酵素で６
０分間、３７°Ｃで完全に消化した。フェノール抽出お
よびエタノール沈殿の後、このＤＮＡ（４゜４μｇ）を
Ｓ１緩衝液１５０μβ中、Ｓ１ヌクレア一ゼ５００単位
で１時間、２０°Ｃで処理することにより、ｌ乙ｃｏ　
ＲＩ　　「粘着末端」を除去した。０゜５Ｍ）リス：　
ｌ−ｌＣｌ　（ｐＨ８，０）　１５μｌおよび０゜２５
Ｍ　　ＥＤＴＡ１５μｌを加えて反応を終了させた。こ
のｊ見合物をフェノールで抽出し、０．０１−　Ｘ５Ｓ
Ｃに列して４時間透析した。２．５容量のエタノ−）Ｖ
ｆ加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心会同（トし、０．３酢
酸ナトＩＪウム１００μβに再懸濁した。ＤＮＡを、エ
タノール２５０μｌを加えて再沈殿させ、遠心分離し、
減圧下で乾燥した。

ＥＣＯＲＩ開裂部位を復元するために、先づＳｌ−処理
ＤＮＡＩμｇをリン酸化ＥｃｏＲＩ　　リンカ−２４０
Ｐモルと混合し、Ｑ、　６ｍ　ＭのＡ−ｒＰ−ｉ含有す
るりガーゼ緩市液中、−ｒ４１）　Ｎ　Ａ　リガーゼ４
単位を用いて１２．５°Ｃで１６時間、鈍感末端を連結
した。この混合物をＥｃｏＲＩ　緩衝液で２５０μｌに
希釈し、６０°Ｃで１０分間加熱した。

ＥＣＯＲＩ　制限エンドヌクレアーゼ１００単位全添加
し、その混合物を３７°Ｃで１時間インキュベートして
余分のリンカ−分子を除去し、ＥｃｏＲＩ相補末端を作
成した。次いで反応混合物をフェノールで抽出し、エタ
ノールでＤ　Ｎ　Ａ　ｆ沈殿させた。

プラスミドＤＮＡ、（０，３１７）を、０．４　ｍ　Ｍ
のΔ′［Ｐを含有しているりガーゼ緩＠液１５μβ中、
■”４ＤＮＡリガーゼ０．８単位を用い、１２．５°Ｃ
で７［１，ｌｉ間処理することにより再閉環した。この
連（（ｉ’ｌした混合物８μｌを用いてＩ！、、Ｃ０１
ｉ　抹ＪＡ２２］、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１４を形質転
換した。５０　ＩＬＬ／ｍｌのアンピシリンを含有する
しブロス１００ｄ中で−夜増り白させた３つのアンピシ
リン耐性形質転換体からプラスミドＤＮＡを純化し、そ
のＥｃｏＲ■開裂部位に於けるｌ）　Ｎ　Ａ配列−に決
定した。その内の１つは第１４図りに示す配列を有する
ことがわかり、これはｐＫＥＮ０３６（Ａ　３）と命名
された、ｐＫＥＮＯ３７（Ａ−１’）の翻訳解読枠を曲
の２（ＵｌｆＩの解読枠（Ａ−２およびＡ−３）に変え
るために、ｐＫＥＮｏａ７の小さい方のＸｂａ　　ｌニ
ーＥｃｏ　Ｒ１：フラグメンｌ−ｋ、第１５図に示す様
に、以下の手法で、ＰＭ（ＥＮ０２４（Ａ−２）または
ｐＫＥＮｏ　３６　（八−３）からの小さい方のＸｂａ
　　Ｉ−Ｅｃｏ　ＲＪ　７ラグメントで置き換えだ。第
１５図１３１に示す様に、Ｂａｍ　Ｈ４緩１町液５０　
μｉ中、Ｘｂａ　　■制限酵素６単位を用いて、３７°
Ｃで１時間、３μ７のｐＫＥへ０３７を先づ消化し、Ｘ
ｂａ　ｌ酵素を不活性化しに後、線状化したこのＤＮＡ
フラグメントを、Ｅｃｏ　’ＲＪ　緩衝液１００μβ中
、ＥｃｏＲ］：　制限酵素６単位を用いて、３７°Ｃで
１時間、更に消ｒヒした。大きい方のＸｂａ　　■−Ｅ
ｃｏ　　ＲＩフラグメントを、小さい方のフラグメント
から、ゲル電気Ａフラグメントをエチノウムブロミド（
１μ！　／、ｎｌ）で着色し、大きい方のフラグメント
に相当する帯を切り取った。この帯中のＤＮＡフラグメ
ントを、凍結後ゲルから溶出した。エチジウムプロミド
分、フェノール抽出によってＤＮＡフラグメントから除
去し、エタノール沈殿１でよってＤ　Ｎ　Ａを回収した
。

乾燥したＤＮＡフラグメントを水２０μ４に溶解し、こ
のｐｌ（ＥＩＮＱ３７　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメント混合物
（ｒ）１ｐ＃、’ｆ、それぞれｐＫＦ、ＮＱ２４　まだ
ハＩ）　Ｋ　ＥＮ０３Ｇから、ＸｂａＩおよびＥｃｏ　
　ＲＩ　制限酵素で二重消化し、ゲル精製する事によっ
て予め得だ（＠１５図１３３参照）、小きい力のＸｂａ
　■−Ｅｃ。

ＲＩ’［ｌｊ限フラグメント（第１５図１３２に示す）
のそれぞれ０．１μｙと混合した。このＸｂａＴ−Ｅｃ
ｏＲ■フラグメントの「粘着末端」を、０．４ｍＭのＡ
ＴＰを含有するりガーゼ緩＃液２０μβ中、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０．２単位を用いて１２．５°Ｃで７時間処理
することにより結合させ、この連結混合物のＬ部を使用
してＥ、ｃｏｌｉ　株ＪＡ２２１、Ｎｌ＞、ＲＬ　Ｂ−
１５Ｑ１４を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換
体の中からＡ−２およびＡ　−３解読枠を持ったプラス
ミドＤＮＡを得た。これらはそれぞれｐＫＥＮＯ３９お
よびＰＫＥＮＯ４０と命名された。その構造を第１５図
１３４に示した。

以上１本べたのは、プラスミドｐＫＥＮ０３９（Ａ−２
）およびｐＫＥＮＱ４Ｑ　（Ａ　−３）を組み立てるた
めに使用される最初の例としての実験操作である。

しかし、これらのプラスミドを組み立てる別法が存在す
ることは、当業者には容易に理解されるであろう。具体
的に言えば、プラスミドｐＫＥＮＯ３７（Ａ−１）のＥ
ＣＯＲ■開裂部位の近辺のＤＮＡ配列自体を、第１３図
ｂ）およびＣ）まだは第１４図ｂ）およびＣ）に示しだ
手順に従って変更し、それぞれプラスミドｐＫＥＮＯ３
９（Ａ−２）−またはｐＫＥＮ０４０（Ａ−３）の構造
を直接生産することができる。

１３、Ｂサイトプラスミド（ｐｌＮ−Ｉ）の組み立て第
１６図〜第２１図はＢ挿入サイトを含んだ組み換えプラ
スミドを組み立てる方法を摸大的に示したものであり、
これらの図を参照しながらこの組み立てを以下に詳細に
説明する。

１、プラスミドｐＫＥＮ２２１の組み立てＢサイト発現
プラスミドを組み立てる最初の段階は、信号ペプチド開
裂サイトに、あるいはその近くに制限酵素開裂サイトラ
持った、ＩＰＰ遺伝子フラグメント源として役立つプラ
スミドを組み立てることであった。選ばれた遺伝子は、
Ｓ。

ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのリボプロティンを暗号化してお
り、信号ペプチドの３′末端にＦｎｕ４Ｉｌ−Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼ認識配列を持っている。コノＳ。

ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　　ｌｐｐ遺伝子を受は入れる為
に選ばれたプラスミドはｐＢＲ３２２であった。

第１６図１３５に示す様に、Ｂａｒｎ　Ｈ，Ｉ緩ｉ！１
ｆＪ　１Ｍ５０μＢ中、制限エンドヌクレアーゼＢ　ａ
　ｍ　Ｉ−１ｉ２２単を用い、３７°Ｃで６０分間、プ
ラスミド１）ＢＲ３２２ＤＮＡ２μｇを完全に消化した
。１０′Ｊす間６０°Ｃで加熱してＢａｍ　Ｉ−（ｌ酵
素を不活性化した後、Ｅｃｏ　ＲＪ　　２単位オＪ：　
０：　ＥＣ−Ｑ　ＲＩＭ衝液１００　ｐβを添加した。

この混合物を更に３７°（ｊで６０分間インキュベート
し、フェノール抽出して反応を終了させ、エタノール沈
殿によって線状化ＤＮＡフラグメントを回収しプζ。

Ｓ、ｍａｒｃｃｓｃｅｎｓ　ｌｐｐ　’１３伝子を含ん
でいる８、５ＫｂＤＮＡフラグメントば、＠１６図１３
６に示した様に、Ｓ、ｍａｒｃｃｓｃｅｎｓ　ｔＰＰ　
漬云子を含んでいるハイブリッド（雑種）λファージ（
χｌｐｐｓｍ−１と呼ばれる）から別に誘導した。この
ＩＰＰ遺伝子は、以下に述べる様にして、χファージベ
クター、Ｃｈａｒｏｎ　ｌ　４　（Ｂｌａｔｔｎｅｒ、
Ｆ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ１９６．１６１〜１６９Ｃ１９
７７〕）に予めクローンした。Ｓｌｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ｓから分離した全ＤＮＡ（２００μりを、制限酵素Ｅｃ
ｏ　’ＲＩ　　２００単位で消化した。プレパラテイブ
アガロースゲル上、ＤＮＡフラグメントを分離°シ、５
′３２Ｐ−リポプロティンｍ　ＲＮ　Ａと正の雑種形成
を示しだ約３，５Ｋｂのｌ）　Ｎ　Ａフラグメントのフ
ラクション全南方雑種形成法を使って集めた。８，５Ｋ
ｂ　Ｅｃｏ　ＲＩフラグメント（約２０倍濃縮されたも
の）とＦ、ｃｏＲ■−開裂Ｃｈａｒｏｎ　１４ベクター
　１）　Ｎ　Ａの混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼと共に反
応させン辻。連結したＤＮＡを使ってＥ、ｃｏｌｉ　　
Ｋ２Ｏ２、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１６ｋ）ランスフエク
トした。ＩＰＰｔｔ、ｔ　コモを持った組み換えファー
ジを、５１−　５）−１Ｊボブロチインｍ　ＲＮ　、Ａ
　ｆ　１′史って、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓのプ
ラーり雑種形成法によりふるいわけた。検査され、正の
雑種形成を示したプラークの１つはλｌｐｐｓｍ−１と
命名された。

ｐＢ技３２２の線状化について上述１〜だ方法と同じ方
法で、λｌ　ｐｐＳｍ−１］）　Ｎ　Ａ　２　μｇ　を
制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　およびＥｃｏ　　Ｒ１：　
で完全に・消化し、リガーゼ緩衝’Ｉ＆４０μｌ中、χ
ｌｐｐｓｍ−ＩＤＮＡフラグメント０．５μｙを、予め
線状化したプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５
１ｂｇとン昆合した。この？昆り物を３７°Ｃで５分間
加熱し、４°Ｃで１６時間、次いでＯ′Ｃで１時間イン
キュベートすることにより７＝−リ：／’７−した。Ａ
　−１−Ｐ　（最終０．４　ｍ　Ｍ　）およびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ０．４単位を添加した後、この混合物’！ｚ
１２．５°Ｃで７時間インキュベートした。

この連結混合物の１／４を使って、”Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌ
ｐｐ欠失突然賃異株ＪＥ５５２７、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５
０１２を形質転換した。形質転換ば、Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、
Ｎ、らの１’ｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
、Ｓ、Ａ、　６９　２１　ｌ　Ｑ　〜２１１４（１９７
２）に記載された方法に従って行ない、アンピシリン耐
性形質転換体を、５０μｙ／ｎＩノのアンピシリンを含
有するＬブロスプレートの表面に置いたワット７７３Ｍ
Ｍ７Ｆ紙上で一夜増殖させ、コロニー雑種形成によりＩ
ＰＰクローンをふるいわけた。ＩＰＰ遺伝子を含んでい
るχ１ｐｐＥｃ＝１のＱ、９５　Ｋｂ　Ｍｓｐ　Ｉ　　
フラグメントを、ＭａｎｉａＬｉｓ　、Ｔ、らノＰｒｏ
ｃ　、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　、Ｕ、Ｓ。

Ａ、７２．１１８４〜１１８８（１９７５）に記ｉ戊の
方法で、〔α−３２Ｐ）ｄＡＴＰおよび〔α−３２１）
〕ｄＣＴＩ’とニック（ｎｉｃｋ）　９１訳し、　　Ｐ
−プローベとして使用した。正の雑種形成を示した形質
転換体の１つは、第１６図１３７に図示した構造のプラ
スミドを含んでいることがわかった。このプラスミドは
、ｐＫＥＮ２２１と命名された。

２、プラスミドｐＫＥへ００９の組み立てＢ　サイトク
ローニングヒ゛ヒクル（Ｌ−ｆｆＪｉみ立てるン３に、
甘ず、Ｓ、＋ｎａｒｃｅｓｃｃｎｓ石１バ子の活号ペプ
チド領戦、並びにｌ　１）Ｉ）プロモータ及び５′−卯
月ＪＩ訳１・工ＩＩ或ｆ：＠む３２９　ｂｐ　　Ｆｎｕ
４１１−Ｉフラグメント（このフラグメントは第５図の
１０５Ｂに図示した）を、以下に記載する方法で、第１
７図１３８に示した様に、ｐＫＥＮＯＯ５でクローンし
た。ｐＫ　Ｉ’、Ｎ２２１プラスミドＤＮＡ８０／ｄ”
ｅ、Ｉ−１ａ　ｃ　ＩＩ緩衝液４００　ＩＬＩＩ中、制
御堰エンドヌクレフ　−セ’　１’　ｎ　ｕ　４１１−
１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｌ）ｓ）　　
ｌ　Ｑ　Ｑｒ−ｉ４位で完全に消化し、３２４　ｂｐ　
　Ｆｎｕ　　４Ｈ−Ｉ　７　ラグメントをアクリルアミ
トゲ／Ｉ／電気永動法により純化した。

Ｆ　ｎ　ｕ　　４Ｉ−Ｉ−］：制限酵素による消化で両
端に「粘着末端」を持ったフラグメントか生成するので
、これらの粘着末端（ｓｔｉｃｋｙｃｎｄｓ）ｆ、ｌ−
４１）ＮＡポリメラーゼを用いて埋めてｊＡｉ盛末＊ｉ
ｉｖ　（ｂｌｕｎｔｅｎｄｓ）を形成させて修復した。

純化した３　２４　ＩＩＩ）Ｆｎｕ４１−１−■フラグ
メント２１ＬＱ’、、ｄＡＴＰ％ｃｌＧＴｌ’。

ｄＣＴＰおよびｄ　Ｔ’ｒ　ＰそれぞれＱ、　ｌ　＋ｎ
　Ｍの存在下、ポリメラーゼ緩衝液２０μｌ中、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ３単位で、１２．５°Ｃで４５分間処
理した。

フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、この１）　
Ｎ　Ａフラグメントをリン酸化ＥｃｏＲ■　リンカ−４
００Ｐモルと混合し、Ｑ、　５　ｍ　ＭのＡ　ＴＰ　’
ｉ金含有ているリガーゼ［ｍ液２０μＡ中、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ４単位を用いて、１２．５°Ｃで１６時間処］
２Ｉ！シだ。この混合物をＥｃｏＲＩ緩衝液で３００１
Ｌｉ、に希釈し、ＥｃｏＲ■制限酵素１５０単位で消化
し、Ｅｃｏ　ＲＩ相補末端を作成した。

次いでＥ（：０ＲＩ−消化フラグメント１μゾをＥｃ。

ＲＪ−消化ｐＫＥＮＯＯ５プラスミドＩ）　Ｎ　Ａ　Ｏ
，５μｙと混合し、Ｑ、　６ｍ　ＭのＡＴＰを含有する
りガーゼ緩繭液４０μβ中、１’４ＤＮＡリガーゼ０．
４単位で１６時間、１２．５°Ｃで処理した。この連結
しだど昆合物２０μｌを用いてＥ、ｃｏｌｉ株ＪＥ５５
１９、ＮＲＲＬ　ｌ５−１５０１３　　を形質転換した
。迅速アルカリ父性法により、テトラサイクリン耐性形
質転換体から得たプラスミドＤＮＡを制限酵素分析した
結果、プラスミドの１つは３２９　ｂｐ　　Ｆｎｕ４Ｉ
−１−Ｉフラグメントから誘導した３　３４　ｂｐ　　
］！：ＣＯＲエフラグメントを含有していることかわか
った。

このプラスミド（＠１７図１３９）はｐＫＥＮＯＯ９と
命名した。ｐＫ、ＥＮＯＯ９プラスミドＤＮＡのＩ）　
ＮＡヌクレオチド配列全分析した結果、ｐＫＥＮＯＯ９
のＥｃｏ　　ＲＩ　サイトはＢ挿入サイトに存在し、１
３−１解読粋に符号することがわかった。このプラスミ
ドは、第１９図ｂ）および第２０図ｂ）に示しだＤＮＡ
配列を持っていた。三個の塩基対が一←９０位の領吠に
挿入されており（従って、この位置に１つの余分のアミ
ノ酸残渣か付加された）、また、余分のＧ−Ｃ″Ａが＋
９９位に挿入されていた。

この理由は現在の所、不明である。これらの変換の驚く
べき累積的効果により、ｆｌ”；°ペプチド開裂部位領
吠のアミノ酸配列は、Ｓｏｍａｒｃｅｓｃｃｎｓ　Ｉｐ
ｐ遺伝子のものから、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｌｐｐ遺伝子の
ものへと変換されたのであった。

Ｂ−２およびＢ−３解読枠に相当するＢサイト発現プラ
スミドを組み立てる為に、先ず、ｐ　Ｋ　Ｅ　Ｉ”Ｊ０
０９の２個のＥｃｏＲｌ：開裂部位の１つを除去するこ
とが必要であった。ＩＰＰプロモータの上流に位置する
］！、　ｃ　ｏ　Ｒ■　サイトラ除去する方法を第１８
図に示した。この方法は、ｐＫＥＮＯＯ９からの８０ｂ
ｐ　Ｘｌ）ａ　、Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩ　７ラグメント（
Ｓ。

ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　Ｉｐｐ　　ｉｌｌ伝子コモ′−
非翻、訳領域の１部および信号ペプチドを含んでいる）
をｐＫＥＮｏｌｏのＸｂａ　　Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩ４Ｊ
−イトに移すことからなる。

この目的を達成するために、先ず、ｐＫＥＮＱ１０プラ
スミドＤＮＡ５　μｇを、ＢａｍＨ■緩衝液５０μｇ中
、Ｘｂａ　　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ５単位で消化し
、次いでＥｃｏ　ＲＩ緩訴液１００μｌ中、Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉ　制限酵素５単位で消化した。次いで線状化したこの
ＤＮＡ’（ｉ＝、１０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐｌ−１８
，０）およびＱ、ｌ　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｉ　
Ｑ　０ＩＬｌ中、３７°Ｃで３０分間、ＢＡＰ５μｌで
処理した。

プラスミドＩ）　Ｎ　Ａ　ｆ：フェノールで抽出し、エ
タノ−歩で沈殿させ、このＤＮＡＱ、５μｍをｓｏｂρ
Ｘｂａ　　Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩフラグメント（これは予
め、ｐＫＥＮＯＯ９プラスミドＤＮＡ５ｏ／ＬｇをＥｃ
ｏＲｌおよびＸｂａＪ制限酢制限酢化し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって得た）０．２μ７と混合し
た。このＤＮＡ混合物を、Ｑ、４ｍＭのＡ　ＴＰを含む
リガーゼ緩顛液４０　Ｉｔ、　ｌ　中、−１７４１）Ｎ
Ａリガーゼ０．４単位を用いて１２．５°Ｃで１６時間
処理した。連結しだ；毘合物２０１Ｌｌを使ってＥ、ｃ
ｏｌｉ株ＪＥ５５１９、Ｎ−ＲＲＬ　１３−１５０１３
を形質転換り、り。迅速アルカリ父性法によってアンピ
シリン耐性形質転換体から得たプラスミドＤＮＡの制限
酵素分析を行なうことにょシ、１個のプラスミドは、第
１８図１４０に示した様に、Ｂ−１解読枠中にＳｏｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎｓ　ｌｐｐ遺伝子の信号ヘプテｌ−”領
域を持づた所望の８Ｑ　ｂｐ　Ｘｂａ　　］ニーＥｃｏ
　Ｒ■フラグメントを含有していることかわかった。こ
のプラスミドはｐＫＥＮＯ１７と命名された。

次いで、ｐＫＥＮＯ１７のＢ挿入サイトにおける解読枠
を、先に述べたＡ−１解読枠“２Ａ−２またはＡ−３解
読枠にそれぞれ変化させた方法に従って修復し、Ｂ−２
およびＢ−３解読枠に和尚するプラスミドを作成した。

これらの方法を第１８図の１４１および１４２に図示し
、対応するＥｃｏ　　Ｒ■開裂部位の周囲のＤ　Ｎ　Ａ
配列の変更修復を＠１９図および第２（〕図に示した。

プラスミドｐ　Ｋ　Ｅ　Ｎ０３０（Ａ−１）からプラス
ミドｐＫＥＮ０２４（Ａ−２）およびｐＫＪ乙ＮＯ３６
（Ａ−３）と誘導するのに使用した方法と同じ方、去を
、プラスミドｐＫＥＮ０１７（Ｂ−１）からプラスミド
ＰＫＥＮＯ２６（１３−３）およびｐＫＥＮＯ２７（Ｂ
−２）を導くのに使用することができることが理解され
るであろう。

第２１図はＩ３サイトクローニングビヒクルの組み立て
の最終段階を模式化したものであり、これは、ｐＫＥＮ
０１７、ｐＫＥＮＯ２６およびＰＫＩ！、Ｎ０２７の３
つの異なったＸｂａ　　Ｉ−Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｂサイトフ
ラグメントのそれぞれで、ｐＫＥＮＯ３７のＸｂａｌニ
ーＥｃｏ　　Ｒ１：　　Ａサイトフラグメントを置換す
ることからなる。これ１ｄ、外来性ＤＮＡ挿入サイトに
於て、Ａサイトプラスミドに含まれているものと同じＥ
ｃｏ　　Ｒ１：、Ｈｉｎｄ］１丁およびＢ　ａ　ｍ　Ｈ
Ｊ制限酵素認識配列をＢサイトプラスミドに与える為に
必要であった。第２１図１４３に示す様に、ｌ）Ｋ　Ｅ
　Ｎ０１７、ｐＫＥＮＯ２６お、Ｊ：びｐＫＥＮＯ２７
から％’ｊ　！される３つのＢサイトフラグメントのそ
れぞれは、Ｓ。

ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　Ｉｐｐ遺伝子のＦｎｕ４■■−
１７ラグメントから得られた信号ペプチドを含有するＩ
）　Ｎ　Ａ配列を含んでいる。

この目的を達成する為に、第１５図ｊＦ１ついて既述し
たものと同じ方法を使って、大きい方のプラスミドｐＫ
ＥＮＯ３７のＸｂａ　　ｌニーＥｃｏ　　ＲＩ　７ラグ
メントを得た。水性のこのｐＫ　ＥＮｏ３７　＋）　Ｎ
　Ａ　−７ラ／７”メント混合物の１μｌｆ、予め、そ
れぞれＰＫＪ尤Ｎ０１７、ｐＫＥＮＯ２６およびｐＫＥ
ＮＱ２７ｉＸｂａ　　■　およびＥｃｏＲｌ：制限酵素
で二重消化し、次いでゲル精製することによって得た種
々の小さい方のＸｂａ　　■−Ｅｃｏ　ＲＩ７ラグメン
ト（それぞれ約０゜１μｇ）と各々混合した。それぞれ
のＩ）　Ｎ　Ａ混合物を、Ｑ、　４　ｍ　ＭのＡＴＰを
含有するりガーゼ緩衝液２０１Ｌｌ中、Ｔ４　ＤＮＡ　
！Ｊ　カーゼ０．２単位’ｅ用いて１２．５°にで１６
時間処理した。この連結１〜だ混合物のそれぞれ１０μ
ｌ’ｚ使ってＥ、ｃｏｌｉ株ＪＡ２２１、ＮＲＲＬ　１
３−１５０１４　を形質転換した。アンピシリン耐性形
質転換体の中から、Ｂ−１、Ｂ−２および１３−３解読
枠を持ったプラスミドＤＮＡ１純化し、これらをそれぞ
れｐＫＥＮＯ４１、ｐＫＥＮ０４７およびＰＫＥＮＯ４
８と命名した。それぞれ＠２１図１４４に示す構造を有
する。

Ｃ０Ｃザイトプラスミド（ｐｌＮ−Ｉ）の組み立て’ｉ
６２２図〜第２６図は、Ｃ挿入サイトを持った組み換え
プラスミドを組み立てる方法を模式的に示しだものであ
る。これらの図を参照しながら組み立ての方法を以下に
詳述する。

１、プラスミドｐＫＥＮＱＱ６の組み立てＣサイトクロ
ーニングビヒク／Ｌ／を組み立てるたメニ、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　ｌｐｐ遺伝子の最初の８個の構造コドンと１μ号
ペプチド領域、並びに５′−非翻訳碩域とＩＰＰプロモ
ータを含何する１　９３　ｂｐ　５ａｕ３Ａフラグメン
ト（このフラグメントは第５図１０５Ｃに模式的に示し
である）を、以下に述べる様に、第２２図１４５に示し
た様にｐ　Ｋ　ＪらＮ００５にまずクローンした。１０
　ｍＭ　Ｉ−ＩＪ　７．　：　ＬＩＣＩ　（ｐＨ７，５
）、ｌ　Ｑ　ｍＭ　　ＶｇＣＩ２．５ＱｍＭ　　ＮａＣ
１および１００μｇ／ｄのＢＳＡからなる反応混合物４
００７ｒｅ中、３７°Ｃで１時間、Ｓａｕ　　３Ａ　制
御Ｎ、　エンドヌクレアーゼ２００単位ヲ用いて、Ｅ、
ｃｏｌｉ、ＣＣ６２０／ＰＫＥＮＩＩＩ、ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５０１１から常法によシ得られたｐＫＥＮ１１１プ
ラスミドＤＮＡ２００μｇを完全に消化した。消化か終
了しだらフェノール抽出を行ない、エタノール沈殿でＩ
）ＮＡを回収し、アクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て１９３ｂｐ　　Ｓａｕ　　３Ａ−７ラグメントを７古
製した。

Ｓａｕ　　３Ａ制限酵素による消化で両石；ンに「粘着
末端」を持ったフラグメントが生産されるので、これら
の粘着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで埋めて修復し、
鈍感末端を作成した。純化した１９３ｂｐ　　Ｓａｕ　
　３Ａ７７グメント２μ／／を、ｄＡＴｌ’　、ｄＧＴ
ｌ）、ｄＣＴＰおよびｄ　Ｔ’ｒ　Ｐそれぞれ０．１ｍ
Ｍの存在下、ポリメラーゼ緩Ｗ１ｚ夜２Ｏｐｅ中、１２
．５°Ｃで４５分間、Ｔ４１）ＮＡポリメラーゼ３単位
で処理した。フェノール抽出およびエタノール沈殿の後
、このＤＮＡフラグメントをリン酸化Ｅｃ。

ＪＩＪンカー４００ｐモＡｚと混合し、０．６ｍＭ（７
）ＡＴＰｆ：＠何するリガーゼ緩衝液２０μｌ中、１２
．５°Ｃで１６時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４単位で処理
した。この混合物をＥｃｏＲ■緩衝液で３００μｌに希
釈し、ｌ１ｃｏ　ａ■　制限酵素１５０単位で消化し、
Ｅｃｏ　ＲＩ相補末端を作成した。

次いでＥＣＯＲ■−消化フラグメント１μｇをＥｃｏＲ
１ニー消化ｐＫＥＮＯＯ５プラスミドＤＮＡ０．５μｇ
と混合し、Ｑ、　５　ｍ　ＭのＡＴＰｉ含有するりガー
ゼ緩衝液４０μｌ中、１２．５°Ｃで１６時間、Ｔ４１
）ＮＡリガーゼ０．４単位で処理した。この連結した混
合物２０μ７！を使ってＥ、ｃｏｌ　ｉ　株ＪＥ５５１
９、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１３を形質転換した。高速ア
ルカリ変性法によってテトラサイタリン耐性形質転換体
から得たプラスミド］）ＮＡを制限酵素分析にかけるこ
とによシ、プラスミドの工つば１９３ｂｐ　　Ｓａｕ　
　３Ａ　フラグメントから誘導されるＥｃｏＲ］：　フ
ラグメントを持っていることがわかつプヒ。このプラス
ミド（第２２図１４６に示した）はｐＫＥＮＯＯ６と命
名された。このｐＫＥＮＯＯ６プラスミドＤＮＡのＤＮ
Ａヌクレオチド配列分ｖ７により、ｐＫＥＮＱ（１６の
ＥｃｏＲ■　サイトはＣ挿入サイトに存在し、Ｃ−１解
読枠に相当することがわかつンｔ０ ｃｍ２およびｃ−３解読枠に相当するＣサイト発現プラ
スミドを組み立てる為には、先づ、ｐＫＥＮ００６の２
つのＥｃｏ　ＲＩ開裂部位の１つを除去することが必要
であった。第゛２３図は、ｌＰＰプロモータの上流に位
置するＦ、　ｃ　ｏ　、Ｒ■　サイトを除去する手順を
模式的に示したものである。この方法は、ｐＫＥＮＱＱ
５からの１０６　ｂｐ　Ｘｂａ　　■−Ｅｃ。

Ｒ■フラグメント（Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｌｐｐ遺伝子の描
造配列の１部、５′−非′＠訳領域の１部およびイ１」
号ペプチドを含んでいる）を、ｐＫＥＮＱＩＱのｘｂａ
■−Ｅｃｏ　　ＲＩ　サイトに導入することからなる。

この目的を達成する為、ｐＫＥＮＱＩＱプラスミドＤＮ
Ａ５μｇ’ｔ、まず、Ｂ　ａ　ｍ　Ｉ−１■緩衝液５０
μｍ中、Ｘｂａ　　■制限エンドヌクレアーゼ５単位で
消化し、次いでＥｃｏＲ工緩衝液１００μβ中、Ｅｃｏ
　Ｒ１制限酵素５単位で消化した。次いで線状化したＤ
ＮＡを、ｌＱｍＭのトリス：　ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）
およびＱ、　ｌ　ｍ　ＭのＥｏＴＡ１００ｐＡ中、３７
°Ｃで３０分間、ＢＡＰ５μｌで処理した。プラスミド
ＤＮＡ１フエノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、
このＤ　Ｎ　Ａ　Ｑ、　５μｇを、ｐＫＥＮＱ０６プラ
スミドＤＮＡ５０μｇをＥｃｏ　　ＲＩおよびＸｂａ　
■制限酵素で消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけて得だ１０６ｂｐ　Ｘｂａ　　■−Ｅｃｏ　　Ｒ
１：　　フラグメント０．２μｇ　と混合した。

このＤＮＡ混合物を、０．４ｍＭ　　ＡＴＰを含有する
りガーゼ緩衝液４０μβ中、１２．５°Ｃで７時間、Ｔ
４１）ＮＡ！Ｊガーゼ０．４単位で処理した。この連結
した混合物２０μｌを使ってＥ、ｃｏｌｉ株ＪＥ５５１
９、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０１３を形質転換した。

迅速アルカリ変性法によりアンピシリン耐性形質転換体
から得たプラスミドＤＮＡ１制限酵素で分析することに
より、１つのプラスミドは、第２３図１４７に示す様に
、ｃ−１解読枠内にＥ、ｃｏｌ　１ＩＰＰ遺伝子の信号
ペプチド頭載を含んでいる所望（７）１０６ｂｐ　Ｘｂ
ａ　　Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩフラグメントを含んでいるこ
とがわかった。このプラスミドはｐＫＥＮＯＯ７と命名
された。

ｐＫＥＮＯＯ７のＣ挿入サイトにおける解読枠を、既述
したＡ−１解読枠をそれぞれＡ−２またはＡ−３解読枠
に変更する方法に従って女史修正し、ｃ−２およびｃ−
３解読伜に相当するプラスミドを生産した。これらの方
法を第２３図の１４８および１４９に模式的に示し、Ｅ
ｃｏ　Ｒ■開裂部泣の周囲のＤ　Ｎ　Ａ配列の相当する
変更１で正を第２４図および＠２５図に示した。第１３
図および尤１４図に関連して述べたプラスミドＰＫＥＮ
Ｏ２４（Ａ−２）およびｐＫＥＮ０３６（Ａ−３）をプ
ラスミド１）ＫＥＮＯ３０（Ａ−１）から誘導する方法
と同じ方法で、ブー７スミドｐＫＥＮＯＯ７（Ｃ−１）
からプラスミドｐＫＩＥＮＯ４６（Ｃ−２）　オヨびｐ
ＫＥＮＯ１９（Ｃ−３）を誘導することができることは
容易に理解されるであろう。

Ｃサイト発現プラスミドを組み立てる最終段階は、第２
６図に示しだ様に、１）■（ＩｉＮＯ３７）Ｘｂ　ａ　
Ｉ−Ｅｃｏ　　ＲＩ　Ａ−＋ｊイト７　ラグメントラ、
ｐ　Ｋ　Ｉ礼Ｎ　Ｑ０７、ｐＫＥＮＱ４６およびＰＫＩ
！、Ｎｏ　１９　（７）　３　つの異なったＸｂａ　　
ｌ：　−Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｃサイトフラグメントのそれぞ
れで置換することであった。こｈ（ｄ、、Ｃサイトプラ
スミドが、ＡサイトおよびＢサイトプラスミドに含′ま
れているのと同じＥｃｏ　　Ｒ１：　、１１ｉｎｄＪＩ
ＩおよびＢａｍ　ｔｌＩ　　制御奴酵素認識！！記列を
外来性１）　Ｎ　Ａ挿入サイト）で含む様に行なった。

第２６図１５０に示した様に、ｐＫＥＮＯＯ７、ｐＫＥ
ＮＯ４６およびｐ　Ｋ　ＥＮ　ｏｌ　９から導かれる３
個のＣサイトフラグメントの各々は、Ｅ、ｃｏｌｉ　　
１ｐｐｉ伝子のＳａｕ　　３Ａ　フラグメントから得ら
れる信号ペプチドを含むＩ）　Ｎ　Ａ配列を含んでいる
。

この目的を達成する為、第１５図に関連して既述した方
法と同じ方法を使って大きい力のＩ）　Ｋ　、ｌｉ　Ｎ
０３７のＸｂａ　　１−Ｅｃｏ　　Ｒ１ニア−７グメン
トヲ得た。

水性のこのｐＫＥＮＱ　３７１）　Ｎ　Ａフラグメント
混合物ｌｐＨを、それぞれｐＫＥＮＯＯ７、Ｉ）　Ｋ　
ＥＮ　０４６およびｐＫＥＮＱｌｇから、Ｘｂａ　　ｆ
およびＥｃｏＲＪ制限酵素によって二重に消化し、次い
でケル３’４ｉ　：１！ジすることによって予め調製し
た種々の小てい方のＸ、ｂａ　　ｌニーＥｃｏ　　Ｒ１
：　７ラグメンｌ”　（２勺０．ｌｐ、／／づつ）とそ
れぞれ１１尼合し／ζ。それぞれのＤ　Ｎ　Ａ　ｊｆ４
合物を、Ｑ、　４　ｍ　ＭのＡ　Ｔ　ｌ）を含有してい
るりガーゼ緩ｔｅＭ　２０　μｍ１中、１２．５°Ｃで
１−６時間、−１−４１）ＮＡリカーゼ０．２単位で処
理した。この連Ａ：＋！ｉ混合物のそれぞれ１０μＢを
１史ってＪｉ、ｃｏｌｉｌ朱Ｊ　Ａ２２１、ＮＲＲＩ−
Ｂ−１５０１４を形質転換した。このｒンピシリン耐性
形質置換汁の中がらｃ−１、ｃ−２およびｃ−３解読枠
を持ったプラスミドをり、誘導性発現（ｐＩＮ−ＩＩ）
プラスミドの組み立て 第２７図は、Ａ−１解読枠にＡ挿入サイトを備えた（そ
して構成プラスミドｐＫＥＮＯ３７に相当する〕誘導性
プラスミドクローニングビヒクルの組み立てを模式的に
描いたものである。ＪａｃＵＶ５プロモーターオペレー
タはプラスミドｐＯＩ’２０３−３　（Ｆ　、Ｆｕｌ　
Ｉ　ｅｒ博士、Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、
　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）か
ら得た。このｅａＣＵ■５プロモーターオペレータは、
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ＋Ｉ）ｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ。

Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、の永久
コレクションから誰でも入手することができるＥ、ｃｏ
ｌｉ　４２８８ｒ　ｅ　ｃ　Ａ／　ｐ　Ｋ　Ｍ　Ｑ　Ｑ
　６、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５０１７から得ることかでき
る。ｊ２ａｃＵＶ５プロモーターオペレータは、プラス
ミドＰＫＭＯＯ６の９５ｂｐ　Ｘｂａ　Ｉ　　フラグメ
ントにのっている。このプラスミドは、ＮＲＲＬ　Ｂ−
１５０１７から常法により得ることができ、次いで９５
　１）Ｐ　Ｘｂａ　Ｉ　フラグメントを既知の方法で単
離することができる。

ｌａｃ　ＵＶ５プロモーターオペレーターを、以下に述
べる方法で、ｐＫｅｎ０３７（７）Ｘｂａ　Ｉ開裂サイ
ト（Ｊｐｐ遺伝子の５′−非翻訳領域内）に挿入した：
ＰＯＰ２０３−３プラスミドｌ）　Ｎ　Ａ　２００μグ
を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　　緩衝液４００　μ（３中、Ａ
ＪｕＩ　制限酵素２００単位で完全に消化し、ｅａｃｌ
ＪＶ５　プロモータおよびオペレータ領域（第２７図の
１５２において、交叉斜線でハツチングしたセグメント
）を持った９５　　ｂｐ　Ａｊ２ｕ　　Ｉ　　フラグメ
ントをポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した
。

９５ｂｐＡｅｕｌフラグメント１μｍを燐酸化ＸｂａＩ
リンカ−（５’　ＣＴＣＴＡＧＡＧ　３’　；　Ｃ：ｏ
ｌ　ｌ　ａｂｏｒａ　ｔ　１ｖｃＲｅｓｅａｒｃｈから
入手し、前記と同様に燐酸化した４００Ｐモルと混合し
、０．５　ｍＭ　ｃ７）　Ａ　Ｔ　１．’を含有するり
ガーゼ緩衝液２０μｅ中、Ｔ４１）ＮＡ　＋）ガーゼ５
単位を用い、１２．５°Ｃで１６時間、鈍感末端連結を
行なった。連結した混合物をＢａｍＨＩ緩衝液で３００
μｌに希釈し、６０°Ｃで１０分間加熱した。次いでこ
の混合物をＸｂａｌ制限酵宋１００単位で、３７°Ｃで
１時間処理してＸｂａＩ　　相補末端を生成せしめた。

混合物をフェノール抽出し、次いでエタノール沈殿させ
て凍結乾燥した。ＤＮＡフラグメントを水１０μｌに溶
解し、この様にして得たＪａｃフラグメント０３μｇを
、予めＸｂａｌ制限酵素で消化したｐＫＥＮ０３７プラ
スミドＤＮＡ０１５μグと混合した。この混合物を（１
４ｍＭのＡＴＰを含有するりガーゼ緩衝液２０μｌ中、
１”４　　ＤＮＡリガーゼ０４単位を用いて１２５°Ｃ
で１６時間処理してＸｂａｌ　　相補末端をアニーリン
グすることにより、プラスミドを再び環化させた。

この連結（結紮）混合物１０μｌを用いて、Ｅ。

ｃｏｊ３　ｉ　株ＪＡ２２１、ＮＲＲＬ　　−８−１５
０１４にＸ９０／Ｆ’Ｊａｃ１ｑＪａｃ”　ｐｒＯ＋　
からのＦ’ｌｌ子（Ｊ。

Ｂｅｃｋｗｉｔｈ博士、Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手
〕を移入することによって組み立てたＥ、ｃｏｅｉ　Ｊ
Ａ２２１／Ｆ’　１ａｃｌ’ｌ、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０
１５を形質転換した。Ｅ　、　ｃｏＪｉ株ＪＡ２２１／
Ｆ２ｅａｃ１９は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａ
ｌ　Ｒｅ５ｅ−ａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ
、ＤｅｐａｒＬ＋ｎｃｎｔ　　ｏｆ　Ａｇｒｉ−ｃｕｌ
　ｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ　１ｎｏｉｓ　、Ｕ
、Ｓ、Ａ、の永久コレクションから誰でも入手すること
ができる。

高速アルカリ変性法によりアンピシリン耐性形質転換体
から単離したプラスミドＩ）　Ｎ　Ａの制限酵素分析に
より、それらの１つは、第２７図１５３に示す様に、ｐ
ＫＥＮＯ３７のＸｂａＩサイトに正しい方向で挿入され
た９５ｂｐＡｊ？ｕｌフラグメントの１コピーを含んで
いることかわかった。このプラスミドはｐＫＥＮＯ３８
と命名された。

ＢおよびＣ挿入サイトを含んでいる誘導プラスミドの組
み立てを簡単にする為に、まず、ｌａｃプロモーターオ
ペレータフラグメントを囲んでいるｐｌ（ＥＮ０３８　
　の２個のＸｂａｌ　　開裂サイトの一方を除去する必
要があった。ｇａｃプロモーターオペレータフラグメン
トの上流に位置するＸｂａｌ　　開裂サイトを、第２７
図の１５４に模式的に示した様にして除去した。これは
、前のパラグラフで記載した様に、Ｘｂａｌリンカ−を
９５　ｂｐＪａｃプロモーターオペレータフラグメント
に付着させると、ｌａｃプロモータの上流末端だけに新
しい５ｓｔｌ開裂サイトができ、下流末端にはできない
という事実を利用して行なった。第２７図１５５に示す
様に、５ｓｔＩ　制限酵素の認識配列は、Ｘｂａｌ酵素
のそれと重なり合っている。従って、Ｓ１ヌクレアーゼ
を用いて５ｓｔｌ開裂サイトの４−塩基「粘着末端」を
削除すると、同時にＸｂａＩ　認識配列の一部が削除さ
れることとなり、効率よくＸｂａ　Ｉ　　開裂サイトが
除かれる。

これを実施するために、ｐＫＥＮＱ３８プラスミドＤＮ
Ａ５μｐを１３　ａ　ｍｌ−Ｉ　Ｉ緩衝液５０μｌ中、
５ｓｔｌ制限工ンドヌクレアーゼ１０単位で消化し、Ｓ
１緩衝液２００μｌ中、Ｓ１ヌクレア一ゼ５００単位で
、２０８Ｃで１時間処理した。（１５ｍＭ　（１）　Ａ
ＴＰを含有しているリガーゼ緩衝液１０μｌ中、Ｓ１処
理ＤＭＡ　０．５　ｆｉｆｌをＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ
Ｊガーゼ５単位で、１２゜５°Ｃで１６時間処理するこ
とにより鈍感末端を結合した。結合した混合物５μｌを
用いてＥ、ｃｏｊ）ｉ株ＪＡ２２１／Ｆ’　Ｊａｃ　Ｂ
ｑ　、　ＮＲＲＬ　Ｂ　−１５０１５を形質転換した。

高速アルカリ変性法による、アンピシリン耐性形質転換
体から得たプラスミドＤＮＡの制限酵素分析の後、第２
７図１５６に模式的に示した構造を有するプラスミドを
単離した。このプラスミドはｐＫＥＮＱ４５（ｐＩＮ−
■Ａ−１）と命名した。

Ａ−２およびＡ−３解読枠に相当するｐＩＮ−ｕプラス
ミドを組み立てるには、いくつかの方法がある。ｐｌＮ
−ＩＡ−２およびＡ−３プラスミドの利用性を考えると
、１つの方法は、ｊ７ａｃ　　プロモーターオペレータ
フラグメントを、第２７図に示した様に、そしてプラス
ミドｐＫＥＮＯ３７について既述した様に、プラスミド
ｐＫＥＮＯ３９およびｐＫＥＮＱ４Ｑに挿入することで
ある。もう１つの、そして好ましい方法は、第１５図に
ついて既述した方法と同様に、ｐＫＥＮＯ３９およびｐ
　Ｋ　ＩらＮ０４０の小さい方のＸｂａ　Ｉ−Ｅｃｏ　
　ＲＩフラグメントをｐＫＥＮＯ４５のＸｂａＩ−Ｅｃ
ｏＲｌ　サイトに挿入するだけであり、プラスミドｐＫ
ＥＮＱ４９（ｐｌＮ−Ｍ、Ａ−２〕およびｐＫＥＮ０５
　Ｑ　（ｐ　ｌＮ−１［、Ａ−３）が得られる。

一方、もし相当する構成プラスミドがまだ組み立てられ
ていなかったら、誘導プラスミドｐＫＥＮ０４９（Ａ−
２）およびｐＫＥＮＯ５０（Ａ　　３　）をプラスミド
ｐＫＥＮＯ４５（Ａ　　１　）から直接誘導することが
できる。具体的には、ｐＫＥＮＯ４５のＥｃ。

ＲＩ開裂サイトの近くのＤＮＡ配列自体を、第１３図、
ｂおよびＣに示した図式、または第１４図、ｂおよびＣ
に示した図式に従って改変し、それぞれプラスミドＰＫ
ＥＮＯ４９（Ａ−２）またはｐＫＥＮ０５０（Ａ−３）
の構造を直接得ることができる。

この方法は、前提条件として、相当する誘導プラスミド
の組み立てを必要としないので、これらのプラスミドの
最も好ましい組み立て法である。

ＢおよびＣ挿入サイトを備えたｐＩＮ−１［プラスミド
を組み立てるにも２，３の方法がある。相当するｐｌＮ
−Ｉプラスミドが既に組み立てられていたら、それらを
第２７図の方法に従って、Ｊａｃプロモーターオペレー
タフラグメントを挿入する様に改良することができ、ま
た、もつと好ましいのは、ｐＫＥＮＯ４５（ＰＩＮ−■
、Ａ−１）の小さい万のＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ　　フ
ラグメントを、構成りサイトおよびＣサイトプラスミド
のそれぞれからの小さい方のＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフ
ラグメントで引き続き置き換えることができ、いずれの
場合も以下の表１のｐＩＮ−ＩＩプラスミドが得られる
。

表１ しかし、最も好ましいのは、まず相当するｐｌＮ−１プ
ラスミドを作るということをせず、ｐｌＮ−夏発現プラ
スミドを組み立てることである。Ｂ挿入サイトの場合、
プラスミドｐＫＥＮＱ５１（ＰＩＮ　−ｊＢ−１）はプ
ラスミドＰＫＥＮ２２１から導くことができる。即ち、
まずＰＫＥＮ２２１プラスミドＤＮＡをＦｎｕ４Ｈ−１
制限酵素で消化し、次いで、得られたフラグメントの末
端に、ＥｃｏＲ１相補末端を既述した方法および第１７
図１３８に図式化して例示した方法でとりつける。この
様にして得たＥｃｏＲＩフラグメントをＸｂａＩ　　制
限酵素で消化し、５′非翻訳領域内に存在するＸｂａＩ
　　開裂サイトでこのフラグメントを２つに分割するこ
とができる。この様にして得た小さい方のＸｂａＩ−Ｅ
ｃｏＲ１フラグメントを精製し、ｐＫＥＮＯ４５（ｐ　
ＩＮ−ＩＩ　、　Ａ　−１）　０：）小さい方（ｙ）Ｘ
ｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントをこれで置き換える
ことにより、Ｂ−１誘導性クローニングビヒクルを得る
ことができる。得られたプラスミド、ｐＫＥＮＯ５１（
ＰＩＮ−Ｉｔ％Ｂ−１）は、第１８図の１４１および第
１９図に模式的に例示した方法または第１８図の１４２
および第２０図に模式的に例示した方法に従って更に改
変し、それぞれＢ−２およびＢ−３解読枠に相当するｐ
ｌＮ−１プラスミド、ｐＫＥＮＯ５２およびｐＫＥＮＱ
５３を得ることができる。

同様の方法で、最初に相当するｐＩＮ−Ｉプラスミドを
組み立てることなく、直接ｐｌＮ−１１０サイ　　゛ド
ブラスミドを得ることができる。具体的には、ｐＫＥＮ
１１１プラスミドＤＮＡを５ａｕ３Ａ制限酵素で消化し
、得られたフラグメントの末端にＥｃ。

ＲＩ相補末端を取りつけた後（これは既述の方法および
第２２図１４５に例示した方法で行なう〕、得うれたＥ
ｃｏＲＩフラグメントをＸｂａＩ　　制限酵素で消化し
、このフラグメントをＸｂａｌ　　開裂サイト（５′−
非翻訳領威内に存在する〕で２つに分割することができ
る。信号ペプチド領域を持ったこのＸｂａｌＲ１７ラグ
メントをＰＫＥＮＯ４５のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ　サイ
トに挿入することかでき、プラスミドｐＫＥＮＯ５４（
ＰＩＮ　”、Ｃ−１）を得ることができる。第２３図の
１４８および第２４図に図式的に示した方法、または第
２３図の１４９および第２５図に図式的に例示した方法
に従ってｐＫＥＮＱ５４ＤＮＡを更に改変すると、それ
ぞれｃ−２およびｃ−３解読枠に相当するｐ　Ｉ　Ｎ　
−ＩＩプラスミド、ｐＫＥＮＯ５５およびｐＫＥＮＱ５
６　　が得られる。

Ｅ、自己調整誘導性発現（ｐＩＮ−ｍ）　　プラスミド
の組み立て ｐｌＮ−ＩＩ系列の誘導性Ａ−１プラスミドクローニン
グビヒクルにｊ７ａｃｌ遺伝子を付加し、ｐＩＮ−■系
列の相当する自己調整誘導発現プラスミドを製造する方
法を第２８図および第２９図に模式的に例示した。この
方法について以下に詳述する。

ｌ、プラスミドｌ］ＹＭＯ５１の組み立てｐｌＮ−ｆｆ
ｌ系列のＡ−１発現プラスミドの組み立ての第１工程は
、／ａｃｌ遺伝子をｐＢＲ３２２にクローンすることで
あった。この目的を達成するため、まずプラスミドｐＦ
Ｂ１４０（Ｍｏｎｉｃａ　Ｒ１１ｅｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｉ
）ｅｐａｒｔｍｃｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒ
ｙ、５ｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏＥ　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ、５ｔｏｎｙ　Ｂｒｏｏｋから入手）からｌａ
ｃ　１　　遺伝子含有５．１　ｋｂ　ＤＮＡフラグメン
トを、以下の如くして取得した。ｐＦＢ１４０プラスミ
ドＤＮＡ１５μｍをＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ緩衝液２００μｅ
中、ＥｃｏＲＩ制限酵素８０単位で、３７°Ｇで２時間
消化した。反応混合物をフェノールで抽出し、２５容量
のエタノールでＤＮＡフラグメントを沈殿させ、減圧下
で乾燥した。このＤＮＡを、６ｍＭ　トリス；Ｈｃｌ　
（ｐＨ７，５）、５１１１Ｍ　ＭｇＣｊ’２．５ＱｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭ　　β−メルカプトエタノールおよび
１００μ！／ｒｎｌ　　のＢＳＡを含有する反応混合物
（この反応体を以降「Ｐｓｔ緩衝液」という）３００μ
ｌ中、ＰＳＬＩ制限エンドヌクレアーゼ１２単位を用い
て完全に消化した。／ａｃ　ｌ遺伝子を持った５、　ｌ
　ｋｂ　Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ　　フラグメント（
第２８図の１５７に図式的に例示した）をアガロースゲ
ル電気泳動により精製した：アガロースゲル中のｆ）　
Ｎ　Ａフラグメントをエチジウムプロミド（１μグ／ｒ
ｎｌ）で染色し、５．ｌｋｂ　フラグメント′−に相当
するバンド（帯）を切り取った。このバンド中のＤ　Ｎ
　Ａフラグメントを、冷凍後ゲルから溶出した。フェノ
ール抽出によってエチジウムプロミドをＤＮＡフラグメ
ントから除去し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。

ＪａｃＩ遺伝子を含有している５、　ｌ　ｋｂ　Ｐｓｔ
　１−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＢＲ３２２にクロー
ンするために、まず、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩおよびＥ
ｃ。

ＲＩ開裂サイトの間に存在する小さい方のＤＮＡフラグ
メントを、第２８図の１５８に図式化した様に、以下の
方法で削除した：　ＰＢＲ３２２ＤＮＡＩＱμｍをＰｓ
ｔＩ緩衝液ｉｏｏμｌ中、ＰｓｔＩ制限酵素２単位を用
い、３７°Ｃで３時間消化した：フェノール抽出および
エタノール沈殿の後、ＤＮＡを減圧下で乾燥し、全量２
００μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中、３７°Ｃで２時間、Ｅ
ｃｏＲ１制限酵素８０単位で消化した。約３，７ｋｂか
らなる大きい方のＰｓｔＩ−Ｅｃｏフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動法により精製した。

精製したフラグメント（０，０７μｍ〕を先に得た５、
１　ｋｂ　　ＰＦＢ１４０フラグメント０．１μグと混
合し、０．４８　ｍＭのＡＴＰを含有しているリガーゼ
緩衝液２　Ｓ　Ｉｌｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手）２０単位を
用イテ、１２．５°Ｃで１６時間、ＰｓｔＩおよびＥｃ
ｏＲＩ相補末端を結紮した。この結紮した混合物１５μ
ｅを用いてＥ、Ｃ０ｅｉ株Ｗ６２０　　ｒｅｃＡ％ＮＲ
ＲＬ　Ｂ−ｙ１５０２４（Ｆ−、ｔｌｌｉ　−１、ｐｙ
ｒ　Ｄ３６　、　ｇｊ）’ｔ　Ａ６　。

ｇａｊ２に３０．ｓＬｒＡ１２ｇλ−，５ｕｐＥ４４）
を形質転換した。この菌株は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅ
ｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｕ、Ｓ、Ｉ）ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＡｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、Ｕ
、Ｓ、Ａ、の永久コレクションから誰でも入手すること
カでキ、Ｄｅ’ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ［ＬＩｕｍａｎ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｙａｌｅ　Ｕｎｉ　−ｖｅｒｓｉｔ
ｙ、５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手し
たＥ、ｃｏＪｉ株Ｗ６２０から導かれたものである。テ
トラサイクリン耐性形質転換体から純化したプラスミド
ＤＮＡの１つは、第２８図の１５０に示した構造を持っ
ていた。このプラスミドは、ｐＹＭＯ！５ｉ、Ｎｔｔｔ
ｔＬＢ−ｘｓｏ２’ｓと命名され、Ｎｏｒｔｌｌｃｒｎ
　Ｒｅ　−ｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ、Ｉ）ｅｐａｒｔ　−ｍｅｎＬｏ
ｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ、１ｌｌｉ
ｎｏｉｓ、Ｕ。

Ｓ、Ａ、の永久コレクションから誰でも入手することが
できる。このプラスミドは、ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０２５
から、常法に従って得ることができる。

２、プラスミドｐＹＭＯ５２およびｐＹＭＯ５３の組み
立て プラスミドｐＹＭＯ５１は、／ａｃｌ遺伝子のみならず
、ＪａｃＺ遺伝子の実質的な部分をも含有している５、
　ｌ　ｋｂ　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ−Ｅｃｏ　ＲＩ　ＤＮＡフ
ラグメントを持っている。第２８図の１６０に示した様
に、このフラグメントは１ａｃＩ遺伝子の近くに３個の
１１ｉＨｃＩＩ開裂サイトを持っており、その内２個は
Ｊａｃｌ遺伝子を取り囲んでおり（即ち「ブラッキト」
シており）、残りの１個はＪａｃｌ遺伝子自体の内にあ
る。後の使用のため、この５．１ｋｂＤＮＡフラグメン
トを短かくし、同時に、ＪａｃＩ遺伝子を無傷のまま残
す為に、以下の方法を採用した二ＰＹＭＯ５１プラスミ
ドＤＮＡ５μｐを、ｌ−１ｉｎｄｌ［［緩衝液７５μｌ
中、ｌｌ１ｎｃｕ制限酵素０３２単位を用いて３７°Ｃ
で１時間部分消化した。フェノール抽出およびエタノー
ル沈殿の後、ＤＮＡを減圧下で乾燥した。この方法で長
さの異なるＤＮＡフラグメント群が得られ、その内の１
つ（長さ１．７ｋｂ、第２８図の１６０に、垂直および
平行線による交叉ハツチングして示しである）は無傷の
ＪａｃＩ遺伝子を含んでいた。

１ａｃＩ遺伝子を持った短いＤＮＡフラグメントと命名
されたプラスミドを組み立てた。このプラスミドは、Ｎ
ｏｒｔｌｌｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｌｌＬａ　−ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ。

Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、ｃ７）
永久コレクションから誰でも入手することができるＥ、
ｃｏ／ｉ　　ＪＡ２２１／Ｆ’１ａｃＩＱ／ｐＹＭｌｌ
ｌ、ＮＲＲＬＢ−１５０３８から得ることができる。こ
のプラスミドは、常法によりＮＲＲＬ　Ｂ−１５０３８
から得ることができる。

第２８図の１６１に図式化して示した様に、ＰＹＭＩＩ
Ｉ　　は、２個のＥｃｏＲＩ開裂サイトに、比較的極〈
接近して囲まれているｌ−１ｐ　ａ　１開裂サイトを持
っている。このプラスミドは、以下の特徴を持ったプラ
スミド群の１つであるので、１ａＣ１遺伝子フラグメン
トを受は入れ得る受容体である：即ち、（１）好ましく
は鈍感末端を生じる、ＩＩｐａＩ、Ｈｉｎｃｌｌまたは
ＰｖｕＩ［の様な特異な制限酵素開裂サイト（即ち、プ
ラスミド内で１つだけ存在するサイト〕を持っているこ
と、（２）ＰＢＲ３２２由来のものでなく、そしてこの
特異な開裂サイトはプラスミド自体の複製に必要なりＮ
Ａ配列内に存在しないこと、（３）この特異な開裂サイ
トを囲んでおり、その特異な開裂サイトの約４００〜７
００塩基対の範囲内に存在している２個の開裂サイトを
含んでおり、その２個の囲っている開裂サイトは、好ま
しくは同じ容易に入手し得る制限酵素、例えばＥｃｏＲ
Ｉ、ｌｌ１ｎｄｌｌ、ＢａｍＨＩまたはＰｓｔｌによっ
て認識され得るものであるが、ただし、この２個の囲っ
ている開裂サイトのいずれも、／ａＣＩ遺伝子内に於い
ては繰り返されていない（存在しない）こと。

プラスミドｐＹＭ１１１　　は、４００〜７００塩基対
の範囲内で２個のＥｃｏＲ１開裂サイトにより囲まれて
いる唯一の［−１ｐ　ａ　Ｉ開裂サイトを持っており、
また、ｊｇａｃ　ｌ遺伝子自体はＥｃｏＲＩ開裂サイト
を含んでいないので、好適である。しかし、上記の特徴
を有するプラスミドは全て、Ｊａｃｌ遺伝子フラグメン
トを受は入れるのに使用することができ、以下の工程に
おいてそのフラグメントのソースとして役立て得ると理
解すべきである。

ｊ２ａｃ　Ｉ遺伝子を持ったＤＮ’Ａフラグメントを、
以下の手法で、第２８図の１６２に図式的に示す様に、
プラスミドｐＹＭ１１１　　に挿入した：　ｐＹＭプラ
スミドＤＮＡ　４μグを、総量５０μｌのｌ１ｐａＩ緩
衝液中、ｔｌｐａｌルミ制限エンドヌクレアーゼを用い
て３７°Ｃで１時間消化した。フェノール抽出した後、
エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、減圧乾燥した。Ｈｐ
ａＩで処理されたＩ）　Ｎ　Ａフラグメントの自己結紮
（結合〕を防ぐために、乾燥したＤＮＡを、ｌＱｔｎＭ
）リス：　ＩＩｃＪ　（ｐＩ（３，Ｑ　）およびＱ、　
ｌ　ｍ　Ｍ　ＥＬ）ＴＡ　からなる反応混合物（この反
応混合物は以下「ＢＡＰ緩衝液」と呼ぶ）、全量１００
　ｔｔ１３中、０．１５単位の’ＢＡＰを用イテ３７°
Ｇで４５分間処理した。フェノール抽出を３回行なって
’ＢＡＩ’　　を完全に除去し、次いでエタノール沈殿
によってＤＮＡを回収し、減圧下で乾燥した。

無傷の／ａｃｌ遺伝子を持ツタ１．７　ｋｂ　Ｉ）ＮＡ
　　７ラグメントをｐＹＭｌｌｌ　　に挿入するため、
ＩＩｐａｌで処理したｐＹＭｌ　１１　　プラスミドＤ
　Ｎ　Ａ　（ｌ　ｌμｇを、ｐＹＭＯ５１のＨｉｎｃｌ
［部分消化によって得たＤＮＡフラグメント０２７５μ
グと混合し、これら（７）　Ｉ）　Ｎ　Ａを、Ｑ、　５
　ｍ　ＭのＡＴＰを含有しているりガーゼ緩衝液（全量
２０μで）中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏ’１ａｂｓから入手〕３２０単位を用い
て１２５°Ｃで１６時間結紮させた。この結紮混合物の
半分を使ってＥ、ｃｏｇｉ　株Ｗ６２０　ｒｅｃＡ、Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１５０２４を形質転換し、５０μｍ／−の
アンピシリンおよび４０μｍ／−の５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以
下ｒＸ−ｇａ、／？Ｊ　　という）を含有しているＬ−
プレートの表面にこの形質転換体を植えつけた。白いコ
ロニーを形成する形質転換体（これは、無傷のＪａｃ　
Ｉ遺伝子を持った。７ｋｂ　ｌ１ｉｎｃ　Ｉ［７ラグメ
ントのプラスミドＰＹＭＩＩＩへの挿入を示している）
を選択しこの形質転換によって、２つの異なった配向で
ｇａｃ　Ｉ遺伝子を持つプラスミドが得られ、それらは
ｐＹＭＯ５２およびＰＹＭＯ５３と命名された。これら
のプラスミドの構造を第２８図の１６３に示した。

３、プラスミドｐＹＭ０５８　の組み立て発現プラスミ
ドのサイズを更に制限し、そして、まだプラスミドに残
っている／ａｃＺ遺伝子の小部分に起因するｌａｃ　Ｉ
遺伝子発現に及ぼす阻止効果の可能性を除くために、１
ａｃＩ遺伝子をそのま＼確保しながら１ａｃＺ遺伝子フ
ラグメントを削除した。プラスミドＰＹＭＯ５３からこ
のフラグメントを除去する方法を第２９図に図式化して
示した。

第２９図の１６４に、プラスミドｐＹＭＱ　５３　の２
個のＥｃｏＲＩ開裂サイトの間の、ｅａｃＩ遺伝子を含
有している領域の部分的制限酵素開裂地図を示した。こ
の領域は、第２８図について前記した、そして第２８図
の１５７および１６０に示した３つのＨｉｎｃｎ開裂サ
イトを含んでいる。第２９図に示した様に、これらのＨ
ｉｎｃＴｉ開裂サイトの２つもＩ−１ｐ　ａ　Ｉ　制限
エンドヌクレアーゼで認識される。

更に、第２９図により詳細に記載されている様に、この
領域には３つのＭｓｐｌ開裂サイトがあり、この内２つ
はＪａｃ７−遺伝子フラグメントの内部に存在し、１つ
はｌａｃ　Ｉ遺伝子の３沫端と／ａｃＺ遺伝子フラグメ
ントの５′末端とを分離しているＩ）　Ｎ　Ａ配列内に
存在している。

上記の配置により、２個のＨｐａｌルミｌ開裂サイト存
在している７８９ｂＰフラグメントを簡単に単離するこ
とができる。このフラグメントを更に分割し、Ｍ　ｓ　
ｐ　１フラグメントの混合物を得ることができ、その内
の１つはＪａｃ　Ｉ遺伝子の３′領域を含んでいるが、
Ｊａｃ　Ｚ遺伝子部分は含んでいない。

このフラグメントを適切な方向に挿入し、無傷の７７ａ
ｃ　Ｉ遺伝子を再構成することができる。

これを達成するために、ｐＹＭＯ５３プラスミドＤＮＡ
　Ｚｏｏ、ｃｌを、ＨｐａＩ　緩衝液ｓ　ｏ　ｏ　ｔｔ
ｅ中、ＩＩｐａＩ　制限酵素６０単位を用いて３７°Ｃ
で２時間消化した。７８９１）　ｐフラグメントを５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した：ポリ
アクリルアミドゲル中のＤＮＡフラグメントをエチジウ
ムプロミド（１μＰ／ｒｎ／）で染色し、７８９ｂＰフ
ラグメントに相当する帯を切り取った。この帯のＩ）　
Ｎ　Ａフラグメントを、電気泳動を使ってゲルから溶離
した。フェノール抽出によってＤＮＡフラグメントから
エチジウムプロミドをＤＮＡフラグメントから除き、［
）ＮＡをエタノール沈殿によって回収した。

次いで精製した７８９ｂｐｌ）ＮＡフラグメント（１，
１，１）をＨｐａＩ　緩衝液７５μｌ中、ＭｓｐＬ制限
酵素１２単位を用いて３７°Ｃで１時間消化した。フェ
ノール抽出を行ない、次いでエタノール沈殿によってＤ
ＮＡを回収し、減圧下で乾燥した。

次いてこのＤＮＡフラグメントを、総量１５０μｅの５
１緩衝液中、Ｓ１ヌクレア一ゼ２０００単位トリス：　
ｆ−１’４’　ＣＰ）１８．０　）　１５μ外３加えて
反応を停止させ、次いでフェノール抽出を行なった。フ
ェノールおよび亜鉛イオンを除去する為、この混合物を
エーテルで抽出し、０．０１ＸＳＳＣに対して４°Ｃで
１．５時間透析しく２回）、次いでエタノール沈殿によ
ってＤＮＡを回収した。

別に、ｐＹＭＯ５３プラスミドＤＮＡＩＱμｍを、Ｈｐ
ａＩ　緩衝液１００μｌ中、Ｈｐａ　制限酵素１２単位
を用いて３７°Ｇで１時間牲消化した。８ｋｂフラグメ
ントを０．７チアガロースゲル電気泳動により精製し、
このＤＮＡ（１，１ｔｔＹ　）を、Ｉ−１ｐ　ａ　Ｉ鈍
感末端の自己結合を避ける為に、ＢＡＰ緩衝液？５ｔｔ
１３中、ＢＡＰ（１１２単位を用イテ３７８Ｃ″ｃ１時
間処１゛ｅシた。フェノール抽出を３回行なってＣＡＰ
を完全に除去し、エタノール沈殿によってＤＮＡを回収
し、減圧乾燥した。

ＰＹＭＯ５３から誘導した８ｋｂ　Ｈｐａ　Ｉ　７　ラ
クメント（０，４μｙ）を、ｐＹＭｏ　５３　由来の７
８９　ｂｐフラグメントのＭｓｐＩ消化によって得られ
たＤＮＡフラグメント０．０５μｇと混合し、このＤＮ
Ａを、（１８ｍＭのＡ　１’　Ｐを含有しているりガー
ゼ緩衝液中（総ｆｆ１１５　μｌ　）　、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入
手）４００単位を用いて結合させた。この結合混合物１
０μｌを使ってＥ、ｃｏｅｉ株Ｗ６２０　ｒｅｃＡ　、
ＮＲＲＬＢ−１５０２４を形質転換し、この形質転換体
を、５０μグ／−のアンピシリンおよび４０μり／ｍｌ
のＸ　−ｇ　ａ　７３　を含むＬ−プレートの表面に植
え付けた。白色コロニーを形成した、無傷の４２ａｃｌ
遺伝子が再び組み立てられたことを示すアンピシリン耐
性形質転換体を選択した。選択された形質転換体から精
製したプラスミドＤＮＡの１つは第２９図の１６５に示
した構造を持っており、このプラスミドはｐＹＭ０５８
　と命名された。

ｐｌＮ−ＩＩＩ　系の最初の自己調整誘導発現プラスミ
ド組み立ての最後の工程はＪａｃｉ遺伝子をｐＫＩｉＮ
０４５　（ＰＩＮ−ｎ、Ａ−１＞に挿入することであっ
た。この目的を達成するため、以下の操作を行なった：
Ｉ）ＹＭＯ５８プラスミドｔ）ＮＡ３Ｑμ７をＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液２５０μｌ中、Ｅｃｏ　ＲＩ制限酵素１００単
位を用いて、３７°Ｃて１．５時間消化した。っ２．４
　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　　フラグメントをアガロースゲル
電気泳動により、上記の方法と同様にして精製した。次
いでＤＮ、３フラグメント（２，０μｇ）を、総量１５
０μｌの５１緩衝液中、Ｓ１ヌクレア一ゼ６００単位を
用い、２０°Ｃで１時間処理した。

５００ｍＭトリ：ｘ、　：　Ｉ−ＩＣｊ７　（ｐＩ−１
８，０）　１５μｅおよび２５　ＱｍＭ　ＥＤＴ、Ａ　
Ｉ　Ｆｙ　μｌ　　を添加して反応を停止させ、フェノ
ール抽出を行なった。フェノールおよび亜鉛イオンを除
く為、この混合物をエーテルで抽出し、０．０１ｘＳＳ
ｃに対して４６Ｃで１．５時間透析しく２回）、エタノ
ール沈殿によりＤ　ＮＡを回収した。

ｐＫＥＮＱ４５プラスミドＤＮＡ１０μｐを、Ｈｉｎｄ
■　緩衝液７５１　ｔｔｅ中、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素１
単位を用いて３７°Ｃで３０分間部分消化した。第２９
図の１６６に図式化して示した様に、ｐＫＥＮＯ４５は
２個のＩＩｉ　１１　ＣＩＩｌ開裂サイト含んでおり、
その内の１つはＳａ、ｇ　ｌ開裂サイトでもある。ｌ−
１ｉｎｃＩｌ制限酵素で部分消化すると直線状ＤＮＡフ
ラグメントの混合物が得られ、その最も長いものは、た
だ１つの１−１ｉｎｃＩＩサイトで開裂されていた。こ
れらのフラグメント（各々約５．Ｑｋｂの長さ）を、前
記と同様に０．７％アガロースゲル電気泳動により単離
し゛た。

次いで線状のＤＮＡ（２，５μグ〕をＢＡＰ緩衝液５０
μ（３中、ＢＡＰｏ、１５単位ヲ用イテ３７°Ｃで１時
間処理し、ｌ−１ｉｎｃＩＩ鈍感末端の自己結合を防止
した。フェノール抽出を３回１１なっ−７−Ｉｓ　Ａ　
Ｐを完全に除去した。エタノール沈殿にょすＩ）　Ｎ　
Ａを回収し、減圧乾燥した。

ＰＹＭＯ５８由来の２，４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ７５グメ
ント（０，１５μＳ’）をｓ、ｏ　ｋｂ　ｐＫＥＮＱ４
５７　ラグメント０．３μｍと混合し、Ｑ、８ｍＭのＡ
ＴＰを含有しているリガーゼ緩衝液１５μｌ中、Ｔ　４
　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋）ガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｂｉｏｌａｂｓから入手）４００単位を用いて１２５°
Ｃで１６時間処理した。この結合混合物１０　ｐｉを用
イーｃ　Ｅ、　ｃｏｌｉ株Ｗ６２０ｒｅｃＡ、ＮＲＲＬ
Ｂ−１５０２４を形質転換し、前記した様にＸ　−ｇ　
ａ　ｌを使ってアンピシリン耐性形質転換体を選択した
。白色コロニーは、ｌＡｍｐｒ遺伝子の下流のＨｉｎｃ
ｌｌサイトにＪａｃ　Ｉ遺伝子が挿入されていることが
確認された。この形質転換によって、２つの方向の異な
るｊ７ａｃＩ遺伝子を持ったプラスミドが得られ、その
内の１つの構造を第２９図の１６７に示した。この構造
のプラスミドを、ｐＹＭＱ５１（ｐＩＮ−ｍ、Ａ−１）
と命名した。

Ａ−２およびＡ−３解読枠に相当するＰ　Ｉ　Ｎ　］プ
ラスミドを組み立てるには、２，３の方法がある。ｐＩ
Ｎ−１およびｐｌＮ−ＩＩ系の対応するＡ−２およびＡ
−３プラスミドを利用することができるなら、１つの方
法は、第２９図に示した方法と同様にして、そしてプラ
スミドｐＫＥＮＱ４５　　に関して前記した様に、プラ
スミドｐＫＥＮＯ４９（ＰＩＮ−ＩＩ、Ａ−２）および
ＰＫＥＮＯ５０（ｐｌＮ−ＩＩ、Ａ−３）にＪａｃ　Ｉ
遺伝子フラグメントを挿入することである。もう１つの
、そして好ましい方法は、単に、第１５図に関して既述
した方法と同様にして、ｐＹＭＯ６１（７）小さい方の
Ｘｂ　ａ　Ｉ　−Ｅｃｏ　ＲＩ　　フラグメントの代り
に、ｐＫＥＮＯ４９およびｐＫＥＮ０５０（あるいはＰ
ＫＥＮＯ３９（ＰＩＮ−Ｉ、Ａ−２）およびＰＫＥＮＯ
４０（ＰＩＮ−１，Ａ−３）＞の小さい方のＸｂａ　Ｉ
　−Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントを使用することであり、
ｐＩＮ−Ｎ系のＡ−２およびＡ−３プラスミドが得られ
る。

一方、相当する構成（ｐｌＮ−Ｉ）および誘導（ｐｌＮ
　　ｎ）プラスミドが未だ組み立てられていない場合は
、自己調整誘導Ａ−２およびＡ−３プラスミドをプラス
ミドＰＹＭＯ６１（Ａ−１）　　から直接誘導すること
ができる。具体的には、ｐＹＭＯ６１のＥｃｏ　ＲＩ開
裂サイトの近くのｌ）　Ｎ　Ａ配列自体を、第１３図の
ｂおよびＣ１または第１４図のｂおよびＣに示した如く
に改変して、それぞれｐＩＮ　−ＴＪｉのＡ−２および
Ａ−３プラスミドの構造を直接得ることができる。この
方法は、前提条件としての相当するｐｌＮ−Ｉおよびｐ
ｌＮ−ＩＩプラスミドの、組み立てを必要としないので
、これらのプラスミドを組み立てるための最良の方法で
ある。

ＢおよびＣ挿入サイトを持ったｐＩＮ−１プラスミドを
組み立てるためにも、２，３の方法が利用できる。この
場合もまた、相当するｐＩＮ−ＩおよびｐＩＮ−ＩＩプ
ラスミドが既に組み立てられていたら、それぞれ、第２
９図の方法に従って、／ａｃ　１遺伝子を挿入する様に
改変するか、あるいはより好ましくは、ＰＹＭＯ６１（
ＰＩＮ−ＩＩ、Ａ−１）の小さい方のＸｂ　ａ　Ｉ　−
Ｅｃｏ　Ｒ１フラグメントを、構成または誘導Ｂサイト
およびＣサイトプラスミドのそれぞれからの小さい方の
ＸｂａＩ−ＥＣＯＲＩフラグメントで次々に置き換える
ことができ、いずれの場合も、ｐＩＮ−１１１Ｂサイト
およびＣサイトプラスミドを得ることができる。

しかし最も好ましいのは、このｐＩＮ−ｍ発現プラスミ
ドは、まず相当するｐＩＮ−１またはｐｌＮ−１１プラ
スミドを作成することなく組み立てることである。Ｂ挿
入サイトの場合は、既述した方法に従い、および第１７
図の１３８に図式化した様に、ＰＫＥＮ２２１プラスミ
ドＤＮＡをＦｎｕ４Ｈ−１制限酵素でまず消化し、次い
で得られたフラグメントの末端にＥｃｏＲＩ相補末端お
取り付けることにより、プラスミドｐＫＥＮ２２１から
Ｂ−１ｐＩＮ−１１プラスミドを導くことができる。こ
の様にして得たＥｃ。

ＲＩ　　フラグメントをＸｂａｌ　　制限酵素で消化し
、このフラグメントを５′−非翻訳領域内に存在するＸ
ｂａｌ　開裂サイトで２つに分裂させることができる。

この様にして得た小さい方−のＸｂａ　Ｉ　−Ｅｃ。

Ｒ１フラグメントを精製し、これをｐＹＭＱ６１　の小
さい方のＸｂａ　１−Ｅｃｏ　ＲＩ　７　ラグｙｌ　７
　）　（ｐＩＮ−■、Ａ−１）と置き換えることにより
、Ｂ−１自己調整誘導クローニングビヒクルを得ること
ができる。得られたプラスミドを、第１８図の１４１お
よび第１９図に図示した方法、または第１８図の１４２
および第２０図に示した方法によって更に改変すること
ができ、それぞれＢ−２およびＢ−３解読枠に相当する
ｐＩＮ−Ｉｌｌプラスミドを得ることができる。

同様の方法で、相当するｐＩＮ−１またはｐｌＮ−■プ
ラスミドを組み立てることなく、ｐ　Ｉ　Ｎ　−１［Ｃ
サイトプラスミドを直接得ることができる。具体的には
、ｐＫＥＮ１１１プラスミドＩ）　Ｎ　ＡをＳａｕ　３
Ａ制限酵素で消化し、得られたフラグメントの末端にＥ
ｃｏ　ＲＩ相補末端を取り付けることにより（前述の方
法および第２２図の１４５に図示した方法により〕、こ
のＥｃｏ’ＲＩ　　フラグメントをＸｂａｌ制限酵素で
消化し、５′−非翻訳領域に存在するＸｂａＩ開裂サイ
トでこのフラグメントを２つに分割することができる。

信号ペプチド領域を持ったこのＸｂａ　Ｉ　−Ｅｃｏ　
ＲＩ　７ラグメントをＰＹＭ０６１　のＸＩ）ａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ　サイトに挿入することができ、Ｉ）ＩＮ−ｍ
のｃ−１プラスミドを得ることができる。第２３図の１
４８および第２４図に示した方法により、あるいは第２
３図の１４９および第２５図に示した方法によってこの
プラスミドＤＮＡを更に改変すれば、それぞれｃ−２お
よびｃ−３解読枠に相当するｐＩＮ　−ＩＩＩプラスミ
ドが得られる。

本発明に係る方法によって組み立てられた組換えプラス
ミドクローニングビヒクルを使って、ヒトのホルモンま
たはその他の所望のポリペプチドを暗号化している構造
遺伝子を形質転換細菌宿主中で発現させることができ、
所望のポリペプチドを多量に生産することができる。し
かし、本明細書に記載された具体的な態様は単なる例示
に過ぎず、何ら本発明を限定するものではなく、外来遺
伝子を発現させ得るその他の組換えプラスミドクローニ
ングビヒクルも、本発明において使用し得ることは当業
者には容易に理解されるはずである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥ、ｃｏＪｉ！Ｊボブロチイン遺伝子を含む８
１４塩基対ＤＮＡ配列の模式図、第２図はＥｈレオチド
配列を示す模式図、第３図はＥ、ｃｏＪｉリポプロティ
ンｍＲＮＡの二次構造を示Ｔ模式図、第４図は本発明に
係るクローニングビヒクルを使って真核蛋白質またはポ
リペプチドを発現させるための方法を概略的に示す模式
図、第５〜第２７図は組換えプラスミドクローニングビ
ヒクルの好ましい組み立て法を例示する模式図、第２８
図および第２９図は第５〜２７図に示した組み立て法に
よるプラスミドを改変して、それに相当する本発明のプ
ラスミドを得る為の好ましい方法を例示する模式図であ
る。 特許出願人　ザ・リサーチ・ファウンデーションｑ′つ
゛・ステイト・ユニウ゛アーシテイ・オウ゛・ニューヨ
ーク代理人　　弁理士　青　山　　葆　　　外１名ＦＩ
Ｇ、／　　　　“ ＪＩＬ１ｖＶｉｌｋ軸Ｇｌｙ＾、ｇｒｗ＊　＋　＋　＋
　山＋ＣＩＦＩｅ＋＋Ｔｈｎ身ｕＬｌｕＡ　１　ｉｓ％
ｙ（＋ｔ＋＋’＋＋ｓ＋ａｕ＾１＋Ｌｙ＋ｌ１曲！ｌａ
Ｌ、７１＋ｒｌ暑＋４ｔ＋ｌａｍ＾マーＣ【−＋ａＡ１
１Ｌｙ＋Ｔｉ１１ｔｅＧｌａＬ°ｕｌｌｌＡＩＩＡＩＩ
°１１　ＡＩ　ＩＡ　Ｉ　ＩＮＩ　ｌＡ１９１１１Ａｌ
ｌｌＩ　１ｃ１１ＡＩ　ＩＡ　ｌ　１ＪＩＡ、１ＩＡｌ
ｌＡ　ｌ°Ａｌ＋ａｒ１ｍｌ＋ＡｔｎＧｌｓＡｒｇｋ°
ｗ％％ＴＡ１１冒−−リーーーｖｖｖ−１ｖ１冒−ｔ−
「リマ□−ｈす１−シーソー瞥す角す角−リ角〜―〜−
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１１−一−−−−一−曜−１−一一一ｐＫＥＮＯＯ８ ３− 一μ四県 ｐＫＥＮＯＩ。 ｐ”ｕ；、　ｔ。 Ｆｌに、／？ Ｈｉｎｄｌｌ［ ＦｌＧ、Ｂ ロ　　　　　　　　　　　　　り　　　　　　　　　　
　　　　　　υＱ年ＮＯ＋７＋８−１） ｐＫＥＮＯＯ６（Ｃ−１） ＦＩＧ、２３ Ｆ／θ、２？ ｐＹＭＯ５２，ｐＹＭＯ５３ 第１頁の続き ０発　明　者　中村研三 町田市成瀬２−１３−３番ポプラ 豊中市春日町５−７−１−３０５ 手続補正書彷則 昭和５８年　９月２７日 特許庁長官　　殿 １事件の表示 昭和５８年特許願第　　　０８４８８０　　　号２発明
の名称 新規クローニングビヒクル ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国ニューヨーク州、シティ・オヴ・
アルバニイ、ユニウ゛アーシテイ・プラザ（番地の表示
なし） 名称　ザ・リサーチ・ファウンデーション・オヴ・ステ
イト・ユニヴアーシティ・オヴ・ニューヨーク４、代理
人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、形質伝換された細菌宿主中で少なくとも１種のポリ
   ペプチドを発現させる為のクローニングビヒクルとして
   好適、に使用される組換えプラスミドであって、グフム
   陰性菌の外膜蛋白質遺伝子由来の少なくとも１種の機能
   フラグメントを暗号化しており、 （ａ）誘導性プロモータを暗号化している第２１）ＮＡ
   配列、および ［ｂｌ少なくとも１棟の該ポリペプチドのアミノ酸配列
   金暗号化している第３　ＤＮＡ配列、または解読相にお
   いて翻訳コドンと連結しており該第３ＤＮＡ配列を受は
   入れるのに適した挿入サイト、と解読相において連結し
   ている＠ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含み、史に、該誘導性プ
   ロモータ信号と結合することかできそこからの転写を選
   択的に阻害するリプレッサ蛋白質のアミノ酸配列を暗号
   化している第４１）　Ｎ　Ａ配列をも含有していること
   を特攻とする組換えプラスミド。 ２、少なくとも１種のＨ能フラグメントがプロモータ信
   号を含有している第１項に記載のプラスミド。 ３、少なくとも１種の機能フラグメントかプロモータお
   よび５′−非翻訳領域に３ンんでいる４１５２項に記載
   のプラスミド。 ４、少なくとも１　ｆｌｉの機能フラグメントが３７−
   非翻訳領域および転写終了信号を含んでいる第１項〜第
   ３項のいずｈかに記載のプラスミド。 ５、構成性プロモータを含有している第１項〜第４項の
   いずれかにｉ￥８誠のプラスミド。 ６、誘導性プロモータ信号が構成性プロモータ信号の下
   流に存在している第５項にｉ上域のプラスミド。 ７、第３１）Ｎ、〜配列が構成性プロモータ信号の下流
   、誘導性プロモータ信号の下流ら・よび５′−非翻訳頒
   鍼の下流であって、３′−非翻：Ｊｅ頭誠の」二流およ
   び転写終了信号の」二流に存在する第６項に記・賎のプ
   ラスミド。 ８．該挿入サイトが構成性プロモータ信号の下流、誘導
   性プロモータ信号の下流および５′−非翻訳領軟の下流
   であって、３′−非翻訳領呟の上流および転写終了信号
   の上流に存在する第６項に記Ｉ賎のプラスミド。 ９、第１ＤＮＡ配列が、該少なくとも１種のポリペプチ
   ドを細菌宿主の細胞質１換を横切って移動させ得るペプ
   チド延長部を更に暗号化している第７項または第８項に
   記載のプラスミド。 １０、第３ＤＮＡ配列′または挿入サイトが、ペプチド
   延長部を暗号化しているＤＮＡ配列内に存在している第
   ９項に記載のプラスミド。 １１、’？ｆ＜　３１）　Ｎ　Ａ配列または挿入サイト
   が、ペプチド延長部を暗号化しているＤＮＡ配列の３′
   末端に存在している第９項に記載のグラスミド。 １２、ｍ　ｌ　Ｉ）　Ｎ　Ａ配列が、多くともグラム陰
   性菌の外膜蛋白質の全アミノ酸配列３ｔさらに暗号化し
   ているものでめる（倉９項にぎ己載のプラスミド。 １３、第３１）ＮＡＡ配列たは挿入サイトが、多くとも
   グラム陰性菌の外膜蛋白質の全アミノ酸配列を暗号化し
   ている１）ＮＡ配列内に存在している第１２項にＨ己１
   戊のプラスミド。 １４、グラム１陰性菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
   ａ　ｃｏｌ　ｉ　）である第１項〜第１３項のいずれか
   に記載のプラスミド。 １５、外１１蛋白質遺伝子が大腸菌のリポプロティン遺
   伝子からなり、外１摸蛋白質が大腸菌のリポプロティン
   からなる・８１３項にＪ己山曳のプラスミド。 １６、第２１）ＮＡＡ配列大腸菌のｌａｃプロモーター
   オペレータを暗号化している第１４項まだは第１５項に
   記載のプラスミド。 １７、第４ＤＮＡ配列が大腸菌の１ａｃＩ偵仏子を暗号
   化している第１４項〜第１６項のいずれかに記載のプラ
   スミド。 １８、該１中入サイトかＥｃｏＲｉ、ＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ
   　ＪＩＪおよび勲１１１１１Ｉ制御奴エンドヌクレアー
   ゼの認識配列を含有しているＤ　Ｎ’　Ａ配列からなる
   第１７項に記載のプラスミド。 １９、少なくとも１棟のポリペプチドがｐｉ　ｔし動物
   ホルモンである第１８項に記載のプラスミド。 ２０．１ラスミドルＹＭｏ６１゜ ２１、形質転換された細菌宿主中でポリペプチドｒ生産
   する方法であって、 （ａｉミグラム性閑の外１蛋白質遺伝子由宋の少なくと
   も１種の機能フラグメントを暗号化している第１１）Ｎ
   ＡＡ配列るって、（１）誘導性プロモータを暗号化して
   いる第２ＤＮＡ配列、および（１１）少なくとも１種の
   該ポリペプチドのアミノ酸配列を暗号化している第３−
   　Ｄ　Ｎ　Ａ配列と解読相において連結している第１Ｉ
   ）ＮＡＡ配列含み、更に、該誘導性プロモータ信号と結
   合することかできそこからのり層厚を１巽捩的に阻害す
   るリプレッサ蛋白質のアミノ酸配列を暗号化している第
   ８．４　Ｄ　Ｎ　Ａ配列をも含んでいる組換えプラスミ
   ドで＃１菌宿主を形質転換し、 凹該細菌宿主を単離、培養して多量の該細菌宿主を牛産
   し、 （０１該細菌宿主ｉｎ・にリプレッサ蛋白質と結合し得
   るインジューサを加えて該誘導性プロモータ信号から該
   リプレッサ蛋白質を除去し、 （ｄ）該細菌宿主群に該ポリペプチドを生産せしめる工
   程からなる、形質ｊ（云換細菌宿主中でのポリペプチド
   の製造法。 ２２、少なくとも１種の機能フラグメントがプロモータ
   信号を含有している第２１項に記載の製造法。 ２３、少なくとも１種の機能フラグメントか構成性プロ
   モータ信号、５′−非４１．Ｉ訳領ｊ或、３′−非・翻
   訳領域および転写終了信号を゛含有している第２１項ま
   たは第２２項に記載の製造法。 ２４、　Ｄ　Ｎ　Ａ　！ｉ！列が大腸菌のＩａｃプ（］
   モーターオペレータを暗号化しており、該第２１）　Ｎ
   　Ａ配列は構成性プロモータ信号の下流に存在し、該第
   ４ＤＮＡ配列が大腸菌の１ａｃＩ’ｆｔ伝子を暗号化し
   ており、該（Ｃ）工程が細菌群にラクトースインンユー
   サを添加゛３−ることからなる＠２１項〜第２３項のい
   ずれかに記載の製造法。 ２５、グラム陰性菌が大腸菌であり、外膜蛋白質遺伝子
   が大腸菌のリポプロティン遺伝子からなる第２１項〜第
   ２４項のいずれかに記載の製造法。 ２６、イｆｓ１項〜第２０項のいずれかに記載のプラス
   ミド′ｆ：、ｅｊ、有する形質転換体。 ２７、腸バクテリア（Ｉｉｎｔｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
   ｃｅａｅ）科のグラム陰性菌である第２６頃に記載の形
   質転換体。 ２８、大腸菌である第２６項または・第２７項に記載の
   形質転換体。 ２９、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｗ６２０　ｒｅｃ　　Ａ／ｐＹ
   ＭＯ６１である第２８項に記載の形質転換体。 ３０、同化し得る仄素源、窒素源および無機物質、並ひ
   にリプレッサ蛋白質と結合し該リプレッサ蛋白質を誘導
   性プロモータ信号から除去し得るインジューサ、を含有
   する水性栄養培地中で発酵によりポリペプチドを産生ず
   ることができる第２６項〜第２９項のいずれかに記載の
   形質ｌ置換体。