JPH07504083A - 新規なサイトカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に関する。より具体的には 、本発明は、ヒトＣＤ４０に結合し、アゴニスト及びアンタゴニスト活性の両方 を有する可溶性で膜結合型のマウス及びヒトサイトカインのクローニングに関す る。

発明の背景 “インターロイキン”の呼称を有するサイトカインは、免疫エフェクター細胞に 影響を及ぼすタンパク質因子である。インターロイキン−１からインターロイキ ン−１２までで呼ばれているサイトカインが報告されており、インターロイキン と命名されている。他の既知のサイトカインには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆 粒球−マ知ファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）　、顆粒球コロニー刺激 因子（Ｇ−Ｃ５Ｆ）　、−ｖスト細胞成長因子（ＭＧ　Ｆ）　、表皮成長［（Ｅ 　Ｇ　Ｆ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、神経成長因子（ＮＧＦ）　、 エリスロポイエチン（ＥＰＯ）　、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）等が含 まれる。

２種の異なるＴＮＦレセプター（タイプＩ及びタイプＩＩ）のＤＮＡがクローン 化されている（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８＋１０１９ ．１９９０　；及びン＋　ル（ＳＣｈａｌｌ）ら、　Ｃｅ１ｌ　６１：３６１． １９９０）。両方の型のＴＮＦレセプターは互いに関連していて、そのメンバー に神経成長因子レセプター（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら。

Ｃｅ１ｌ　４７：５４５．　１９８６）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０　（スタメンコビ ック（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ）ら、　ＥＭＢＯＪ、　８：１４０３．１９８９ ）　、Ｔ細胞抗原０Ｘ４０（マレット（Ｍａｌｌｅｔｔ）ら。

ＥｉｌＢＯＪ、　９：１．０６３．　１９９０）　、ヒトＦａｓ抗原（イトウ（ Ｉｔｏｈ）ら、　Ｃｅ１ｌ　６６：２３３゜１９９１）及びマウス４−ＩＢＢレ セプター（クオン（Ｋｖｏｎ）ら、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２１：４１ ４．１．９８９　ＣクオンらＩ〕及びクオンら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６：１９６３、１９８９　ＣクオンらＨＥ　）が含 まれるレセプターのファミリーに属している。

ヒトＣＤ４０タンパク質（ＣＤ４０）は、３０．６００の分子量、及び疎水性ア ミノ酸を王として含む１９アミノ酸分泌シグナルペプチドを有する２７７アミノ 酸のペプチドである（スタメンコビックら）。成熟ヒトＣＤ４０タンパク質の分 子量（グリコジル化は除く）は２８，３００である。ヒトＣＤ４０をコードする ＣＤＮＡは、バーキットリンパ腫細胞系ラージから調製されたｃＤＮＡライブラ リーから単離された。ＣＤ４０ｃＤＮＡによりコードされる推定上のタンパク質 は、推定上のリーダー配列、膜貫通ドメイン及び膜結合レセプタータンパク質に 共通の幾つかの他の特徴を含む。ＣＤ４０は、Ｂリン８球、上皮細胞及び幾つか のカルチノーマ（ｃ　ａ　ｒ　ｃ　ｉ　ｎｏｍａ）細胞系上で発現されることが 見出されている。

ＣＤ４０に対して向けられたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトＢ細胞の種 々の機能的作用を媒介することが示されている。これら作用には＝（ａ）同型付 着（ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら、Ｊ、Ｉｍｏｕｎｏｌ、　１４０：１４２５． １９８８　ＣゴートンらＩ〕）；（ｂ）細胞の大きさの増加（ゴートンらＩ及び バージ（ｖａｌｌｅ）ら、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９：１４６３．１９８９）　：　（ｃ）抗ＩｇＭ、抗ＣＤ ２０ｍＡｂ、ニアｔルポールエステル単独（クラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：４４９４．１９８ ６：及びパウリ−（Ｐａｕｌｉｅ）ら、　Ｊ、　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｏ１．１４２： ５９０．１９８９）、又はインターロイキン−４と組み合わせたフォルボールエ ステル（ゴートンら、　Ｅｕｒ、　ＪＩｍｍｕｎｏｌ、　１７：１５３５．１９ ８７　［ゴートンらＩＩ）　）で活性化されたＢ細胞の増殖；及び（ｄ）インタ ーロイキン−４（ＩＬ−４）刺激Ｔ−除去培養物からのＩｇＥ（ジャバラ（Ｊａ ｂａｒａ）ら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７２：１８６１．１９９０；ザ ング（Ｚｈａｎｇ）ら、　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏＬ　１４６：１８３６．１９９ １）及びＩｇＭ（ガスカン（Ｇａｓｃａｎ）ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４ ７：８゜１９９１）の産生が含まれる。

パンチニレイア（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）ら、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　３：８．１９９１　（バンチニレイアらＩ〕によりｍＡｂ ８９と呼ばれるかかる抗体の１つが、比較的低い抗体濃度（３０ｎｇ／ｍ＋又は 約１０１０−１ＣでヒトＢ細胞増殖を誘発することが見出されている。増殖は２ 〜３週間続いて１０倍に拡大したヒトＢ細胞個体群が得られた。ＣＤ４０表面分 子がｒｇＭにより架橋された場合は、Ｂ細胞の最高の刺激が起こった。もう１つ の抗ＣＤ４０ｍへすのＦａｂ断片は、弱い増殖応答を誘発しただけであった。更 に、パンチニレイアら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５１ニア０．１９９１〔パンチニ レイアらＩＩ）は、ヒトＦｃレセプターで形質移入したマウス線維芽細胞のＬｔ ｋ−細胞系及びヒトＣＤ４０に特異的なモノクローナル抗体の両方と共にインキ ュベートすると、休止期のヒトＢ細胞が持続した増殖の状態に入ることを報告し た。パンチニレイアらＩＩは、架橋ＣＤ４０がＢ細胞のクローン拡大に必要であ ることを見出した。

ＣＤ２３は、Ｔ細胞ではなく殆どのｌ　ｇＭ−／ｌ　ｇＤ−成熟Ｂ細胞上で発現 されることが見出されている低親和性ＩｇＥレセプターである。ＣＤ２３は配列 決定されており、その配列はキクタニ（Ｋｉｋｕｔａｎｉ）ら、　Ｃｅ１ｌ　４ ７：６５７．１９８６に記載されている。可溶性ＣＤ２３　（ｓＣＤ２３）は、 ウサギにおいて発熱反応を誘発し、この反応はヒトＩｇＥの投与によって阻害さ れることが見出された（ガーデリ（Ｇｈａｄｅｒｉ）ら、　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏ ｇｙ　７３：５１０．１９９１）。従って、ＣＤ２３は可溶性ＣＤ４０又はＣＤ ４０−Ｌ作用の適切なマーカーであると言える。

本発明がなされる以前にＣＤ４０のリガンドは知られていない。従って、当該技 術分野において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０−Ｌ）を同定しかつその特性を明 らかにする必要が存在する。

発明の概要 新規なサイトカイン（以下”ＣＤ４０−Ｌ“という）を単離してその特性を明ら かにした。代表的なマウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定ア ミノ酸配列を配列番号＝１及び図１に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号：２ に掲げる。代表的なヒトＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミ ノ酸配列を配列番号＝１１及び図２に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号：１ ２に掲げる。本発明は、更に、温和な又は苛酷なストリンジェント条件下（Ｕｎ 、ｄｅｒ　ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｏｒ　５ｅｖｅｒｅ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃ ｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で、配列番号：１１によって規定されるプローブ（ヒトＣ Ｄ４０−Ｌのコーディング領域）に、配列番号　１１のヌクレオチド４６からヌ クレオチド８２８までに及ぶ該配列の断片に、又は図２（配列番号＝１１）に相 補的なりＮＡ又はＲＮＡ配列又はそれらの断片にハイブリダイズするヌクレオチ ド配列によってコードされる他のＣＤ４０−Ｌポリペプチドも含む。本発明は、 更に、遺伝子コードの縮重により、上記の核酸配列によってコードされるポリペ プチドに実質的に同−又は実質的に類似のポリペプチドをコードする核酸配列、 及びそれらに相補的な配列を含む。

ＣＤ４０−Ｌは、そのＣ−末端で細胞外領域を有し、Ｎ−末端で膜貫通領域と細 胞内領域を有するタイプＩＩ膜ポリペプチドである。マウスＣＤ４０−Ｌの可溶 体は、ＥＬ−４細胞からの上澄み液の中に見出されており、ＥＬ−４細胞は、こ こに記載したビオチニル化ＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質に基づいて選別したも のである。可溶性ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌの細胞外領域又はその断片を含 む。マウスＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列は図１及び配列番号＝２に記載されて おり、ヒトＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列は図２及び配列番号＝１２に記載され ている。マウスＣＤ４０−Ｌの細胞外領域は、図１及び配列番号：２のアミノ酸 ４７からアミノ酸２６０に及んでおり、ヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域は、図２ 及び配列番号、１２のアミノ酸４７からアミノ酸２６１に及んでいる。ＣＤ４０ −りの生物活性は、このサイトカインのＣＤ４０との結合によって媒介されてお り、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌を含む抗体分泌を含む。

本発明は、更に、配列番号：１及び配列番号：１１に及び図１及び２に記載した ＣＤ４０−Ｌのヌクレオチド配列又はＣＤ４０−Ｌの該ヌクレオチド配列に相補 的なりＮＡ又はＲＮＡ配列から選ばれる少なくとも約１２ヌクレオチドの配列に 対応するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチ ド又はリボヌクレオチド）を提供する。かかるアンチセンス又はセンスオリゴヌ クレオチドは、ＣＤ４０−ＬｍＲＮＡの転写又はポリペプチドの翻訳を阻止する 。

より更には、本発明は、ＣＤ４０−Ｌ免疫原に特異的な抗体を生ずる免疫原とし て働くことのできる、配列番号：１又は配列番号：１１によりコードされるアミ ノ酸配列から選ばれる少なくとも１０アミノ酸のタンパク質配列に対応するＣＤ ４０−Ｌペプチド断片を提供する。かかるＣＤ４０−Ｌ免疫原断片は、ＣＤ４０ −Ｌに特異的なモノクローナル抗体を供給する際に、抗原決定基として役立ち得 る。

本発明は、また、ヒトＣＤ４０の細胞外領域を含むヒトＣＤ４０／ＦＣ融合タン パク質及び可溶性ＣＤ４０タンパク質（ｓｃＤ４０）も提供する。５ｃＤ４０及 びＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質の両方は、ＣＤ４．０−Ｌ又は抗ＣＤ４０ｍＡ ｂ誘導Ｂ細胞刺激、Ｂ細胞内でのＩＬ−４誘導ＩｇＥ刺激及びＩＬ−４誘導ＣＤ ２３誘発を阻害することができる。

図面の簡単な説明 図１は、マウスＣＤ４０−Ｌに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

このタンパク質は、その細胞内ドメインとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫通 領域、及び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ドメインを有するタイプＩ Ｉポリペプチドである。細胞内ドメイン及び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞 外ドメインは、１つのＮ結合グリコジル化部位及び４つのシスティン（Ｃｙｓ） 残基から見て２つのジスルフィド結合を含有し得る。

図２は、ヒトＣＤ４０−Ｌに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

このタンパク質は、その細胞内ドメインとしてそのＮ−末端、それに続（膜貫通 領域、及び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ドメインを有するタイプＩ Ｉポリペプチドである。細胞内ドメイン及び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞 外ドメインは、１つのＮ結合グリコジル化部位及び５つのシスティン（Ｃｙｓ） 残基から見て２つのジスルフィド結合を含有し得る。

図３は、アミノ酸レベルで７７７％相同性を示すヒト及びマウスＣＤ４０−Ｌの タンパク質配列の比較を示す。

図４は、完全長マウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡ　（配列番号、１）で形質移入した ＣＶＩ細胞と共にインキュベーションすることによって生じたＴ細胞除去ヒト末 梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を示す。このＣＶ１細胞は、空ベクター（ＷＡ ＶＥＯ）で形質移入したＣＶＩ細胞と比較した場合に結合型ＣＤ４０−Ｌ　（Ｃ Ｄ４０−Ｌ”　ＣＶＩ細胞）を発現するが結合型マウスＣＤ４０−Ｌを発現しな い。

７日増殖結果は、ＣＤ４０−Ｌ”　ＣＶＩ細胞が、インターロイキン−４（ＩＬ −４）の存在下又は不存在下で、Ｔ細胞除去ＰＢＭＣの増殖を有意に高めること を示している。

図５は、結合型マウスＣＤ４０−Ｌ及び１０ｎｇ／ｍ１のＩＬ−４を添加したＴ 細胞除去ＰＢＭＣ増殖の二次測定値を示す。これらデータは、ＩＬ−４は協同分 裂促進作用（ｃｏ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）がないが、結合型ＣＤ ４０−Ｌは強力な分裂促進作用を維持することを示している。

図６は、結合型ＣＤ４０−ＬがＩｇＥ分泌を増加させることを示す。

図７は、ＩＬ−４の存在下で膜結合ＣＤ４０−ＬがＣＤ２３脱落を刺激すること を示す。

図８は、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌ又はヘルパーＴ細胞クローンである７Ａ１細 胞により生ずるマウス牌臓Ｂ細胞の増殖を示す。

図９は、抗ヒツジ赤血球（ＳＣＢＣ）によるプラーク形成細胞（ＰＦＣ）により 示される抗原特異性応答の誘発についてのマウスＥＬ−４０，９細胞、つまりマ ウスＣＤ４０−Ｌの発現に基づいて選別した選別細胞系とＴ細胞７Ａ１との比較 を示す。

図１０は、膜結合ＣＤ４０−Ｌと、異なるｃＤＮＡで形質移入された他の細胞タ イプとのＢ細胞増殖活性の比較を示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌは、ヘルパー細胞ク ローン又は他のコントロール細胞よりも有意に大きいＢ細胞増殖活性を示した。

図１１は、７Ｃ２細胞（ヘルパーＴ細胞クローン）及びマウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤ ＮＡで形質移入されたＣ■１細胞が、抗５ＣＢＣプラーク形成細胞を誘発するこ とを示す。

図１２は、マウスＢ細胞増殖の誘発についての、２つのヘルパーＴ細胞クローン と膜結合ＣＤ４０−Ｌを発現する細胞との比較を示す。

図１３は、添加したインターロイキン−２（ＩＩ、−２）の存在下又は不存在下 での膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びヘルパーＴ細胞クローンによる抗原特異性プラーク 形成細胞の誘発を示す。

図１４は、Ｂ細胞増殖及びｒｇＥ分泌を刺激する膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用を示 す。膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用はＴＮＦレセプターによってではなくＣＤ４０レ セプターによって阻害された。

発明の詳細な説明 マウス及びヒトＣＤ４０のリガンドとして働くことのできる新規なポリペプチド を単離して配列決定した。より詳しくは、これらリガンドをコードするｃＤＮＡ をクローン化して配列決定した。更に、組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現 方法も提供する。ＣＤ４０−Ｌポリペプチドには、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌ の誘導体又は類縁体の如き、他の型の哺乳動物ＣＤ４０−Ｌが含まれる。マウス 及びヒトＣＤ４０−Ｌは、完全長のＣ−末端においてそれぞれ２１４及び２１５ アミノ酸細胞外領域、つまり膜結合ポリペプチドを含む。該細胞外領域は、ＣＤ ４０に結合するドメインを含有する。マウス及びヒトＣＤ４０−Ｌは、更に、い ずれかの側に荷電したアミノ酸により描写される相同な疎水性２４アミノ酸膜貫 通領域及びそれらのＮ−末端において２２アミノ酸細胞内領域を含む。本発明は 、更に、該細胞外領域の全部若しくは一部分又は該細胞外領域の誘導体を含む完 全長ＣＤ４’０−Ｌポリペプチド又はその断片、及びマウス又はヒトＣＤ４０− ＬをコードするｃＤＮＡで形質移入され、膜結合タンパク質としてヒト又はマウ スＣＤ４０−Ｌを発現する哺乳動物細胞を包含する。

本発明は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列及びか かる単離されたＤＮＡ配列に相補的なりＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。該単離され たＤＮＡ配列及びそれらの相補体は、（ａ）図２（配列番号：１１）に記載した ＤＮＡ配列のヌクレオチド１８４から８２８、ヌクレオチド１９３から８２８又 はヌクレオチド１９３から７６２及びそれらの相補体、（ｂ）　温和なストリン ジェント条件下で、（ａ）のＤＮＡ配列又はそれらの相補体とハイブリダイズし 、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド、その類縁体又は誘導体をコードするＤＮＡ配列、 及び（ｃ）遺伝子コードの縮重により、前述のＤＮＡ配列又はそれらの相補体の いずれかによってコードされるＣＤ４０−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列からなる群から選ばれる。加えて、本発明は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド及び その類縁体をコードするＤＮＡ配列を含むベクター、及びかかるベクターで形質 移入された宿主細胞を包含する。

ここに開示した新規なサイトカインは、ＣＤ４０、つまりＴＮＦレセプタースー パーファミリーのメンバーであるレセプター、のリガンドである。従って、ＣＤ ４０−Ｌは、例えば、Ｂリンパ球によって発現されることが知られている、ＣＤ 　４．０を介するシグナルの変換を司っているようである。完全長ＣＤ４０−Ｌ は、そのＣ−末端において細胞外領域、膜貫通領域、及びそのＮ−末端において 細胞内領域を有する膜結合ポリペプチドである。ＣＤ４０−Ｌの可溶体は、該細 胞外領域又はその断片から作ることができ、可溶性ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０− Ｌの膜結合体を発現する細胞からの培養上澄み液中に見出された。マウスＣＤ４ ０−Ｌの細胞外領域のタンパク質配列は、図１及び配列番号＝２のアミノ酸４７ からアミノ酸２６０に及ぶ。ヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域のタンパク質配列は 、図２及び配列番号＝１２のアミノ酸４７からアミノ酸２６１に及ぶ。ＣＤ４０ −Ｌの生物活性は、ＣＤ４０又はその種特異的同族体と結合することによって媒 介され、Ｂ細胞の増殖及び活性化Ｂ細胞のからのイムノグロブリン分泌の誘発を 含む。

ＣＤ４０−Ｌ　（可溶性モノマー型及びオリゴマー型並びに膜結合型を含む）は 、添加ＩＬ−４の存在なしにＢ細胞増殖及びイムノグロブリン分泌（ＩｇＥ分泌 は除く）をもたらすことができ、活性を媒介するためにＩＬ−４及び架橋を必要 とする抗ＣＤ４０抗体とは対照的である。

ＣＤ４０−Ｌとは、ＣＤ４０又はＣＤ４０の哺乳動物同族体に結合することので きるポリペプチドのことをいう。ここで用いる場合、“ＣＤ４０−Ｌ”という用 語には、膜貫通及び細胞内領域を欠く可溶性ＣＤ４０−Ｌポリペプチド、ヒトＣ Ｄ４０−Ｌの哺乳動物同族体、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの類縁体、又はヒト 又はマウスＣＤ４０−Ｌの誘導体が含まれる。

ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ　４０−１−ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 の突然変異によっても得ることができる。ここで言うＣＤ４０−Ｌ類縁体は、ヒ ト又はマウスＣＤ　４．０−　Ｌの配列に実質的に相同性のポリペプチドである が、１又は２以上の欠失、挿入又は置換の故に、天然配列のＣＤ４０−Ｌ　（ヒ ト又はマウス種）ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する。ＣＤ４０−Ｌ の類縁体は、オリゴヌクレオチド合成及び連結により又は部位特異的突然変異誘 発により調製したＤＮＡ構築体から合成することができる。

グリコノル基、脂質、リン酸、アセチル基等の如き他の化学部分と共有結合性又 は集合性複合体を形成することによって、又はアミノ酸配列突然変異体を作り出 すことによって、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの一次アミノ酸構造を修飾し、Ｃ Ｄ４０−Ｌ誘導体を作り出すことができる。ＣＤ４０−Ｌの共有結合性誘導体は 、特定の官能基をＣＤ４０−Ｌアミノ酸側鎖又はＣＤ４０−ＬポリペプチドのＮ −末端若しくはＣ−末端又はその細胞外ドメインに連結することによって調製す る。本発明の範囲に入るＣＤ４０−Ｌの他の誘導体には、例えば、Ｎ−末端又は Ｃ−末端融合のような組換え培養物中での合成によるＣＤ４０−Ｌと他のタンパ ク質又はポリペプチドとの共有結合性又は集合性複合体又はその断片が含まれる 。例えば、該複合体は、翻訳と同時に又は翻訳後に該複合体の移動をその合成部 位から細胞膜若しくは細胞壁の内側若しくは外側へと行う、ＣＤ４０−Ｌポリペ プチドのＮ−末端領域又はＣ−末端領域におけるシグナル又はリーダーポリペプ チド配列を含んでもよい（例えば、サツカロミセス属のα−因子リーダー）。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチド融合体は、ＣＤ４０−Ｌの精製及び同定を容易にする ために付加したポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈ１ｓ）を含んでもよく、又、新 規な多官能性存在物を提供するために他のサイトカインとの融合体を含んでもよ い。他のサイトカインには、例えば、インターロイキン−１から１３までのいず れか、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球−マクロファージコ ロニー刺激因子）　、Ｇ−ＣＳＦ　（顆粒球コロニー刺激因子）、ＭＧＦ（マス ト細胞成長因子）　、ＥＧＦ　（表皮成長因子）　、ＰＤＧＦ　（血小板由来成 長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）　、ＥＰＯ（エリスロポイエチン）、γ−Ｉ ＦＮ（γ−インターフェロン）、４−ＩＢＢ−Ｌ　（４−ＩＢＢリガンド）及び 免疫細胞成長、分化又は機能に影響を及ぼす他のサイトカインが含まれる。

本発明の範囲内の核酸配列には、温和な又は苛酷なストリンジェント条件下で、 配列番号：１又は配列番号：１１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするＤＮ Ａ及び／又はＲＮＡ配列又は相補的な配列が含まれる。温和にストリンジェント なハイブリダイゼーション条件とは、例えば、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ）ら、　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ、 ２　ｅｄ、　Ｖｏｌ、　１．　ｐｐ、　１．１０１−１０４D　ＣｏｌｄＳｐｒ ｉｎｇ　１ｌａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　（１９８９） に記載されている条件をいう。サムブルーフらによって定義された温和でストリ ンジェントな条件には、５ＸＳＳＣ，０゜５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　 （ｐＨ８，０）の予備洗浄溶液の使用及び５０°Ｃで一晩の５ｘＳＳＣでのハイ ブリダイゼーションが含まれる。苛酷でストリンジェントな条件には、より高温 でのハイブリダイゼーション及び洗浄が含まれる。

ＣＤ４０−Ｌの生物活性は、例えば、ＣＤ４０のリガンド結合ドメインへの結合 の競合により測定することができる（即ち、競合結合測定法）。マウスＣＤ４０ −Ｌ及びヒトＣＤ４０−Ｌの両方がヒトＣＤ４０に結合する。ヒトＣＤ４０につ いてのマウスＣＤ４０−Ｌ　（選別したマウスＥＬ−４０，９細胞上で発現した もの）の結合親和性は、約１．７４Ｘ１０’Ｍ−’であった。同じく、ヒトＣＤ ４０についてのマウスＣＤ４０−Ｌ　（選別していないマウスＥＬ−４６．１細 胞上で発現したもの）の結合親和性は、約２．３Ｘ１０’Ｍ−１であった。両方 の結合親和性測定値は、サイトカイン／サイトカインレセプター結合の通常の範 囲内である。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチドについての競合結合測定法の１つの形は、放射標識し た可溶性の図１（配列番号：１）によるマウスＣＤ４０−Ｌ又は図２（配列番号 ＝１１）によるヒトＣＤ４０−Ｌ、及びＣＤ４０を発現する無傷細胞（例えば、 ヒトＢ細胞）を用いる。無傷細胞の代わりに、プロティンＡ又はプロティンＧ相 互作用を介してそのＦｃ領域で固相に結合した（ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンノくり 質の如き）可溶性ＣＤ４０と置き換えてもよい。競合結合測定法の第２の形は、 ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の如き放射標識した可溶性ＣＤ４０．及びＣＤ４ ０−Ｌを発現する無傷細胞を用いる。また、可溶性ＣＤ４０−Ｌを固相に結合し てもよい。

競合結合測定法は、標準的な方法を用いて行うことができる。例えば、放射標識 マウスＣＤ４０−Ｌを用いて推定上のＣＤ４０−Ｌ同族体と競合させ、表面結合 ＣＤ４０に対する結合活性を測定することができる。競合的オートラジオグラフ プレート結合測定法により定量的結果を得ることができ、又定量的結果を得るた めにスキャッチャードプロットを用いることもできる。

ＣＤ４０を発現する無傷細胞での競合結合測定法は、２つの方法で行うことがで きる。第１の方法では、懸濁液中で又は組織培養プレートへの粘着によるかのい ずれかでＢ細胞を成育させる。粘着細胞は、３７°Ｃで１０分間、５ｍＭＥＤＴ Ａで処理することによって剥がすことができる。第２の方法では、膜結合ＣＤ４ ０を発現する形質移入ＣＯ８細胞を用いることができる。ＣＯ８細胞又は他の哺 乳動物細胞を適当なベクター中のヒトｃＤ４０ｃＤＮＡで形質移入して、細胞外 領域を有する完全長ＣＤ４０を細胞外に発現させることができる。

また、可溶性ＣＤ４０を、カラムクロマトグラフィーマトリックス、又は試験管 又は１２５Ｔの如き検出可能な部分の存在についての分析に適する類似の支持体 の如き固相に結合してもよい。固相への結合は、例えば、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タ ンパク質を得て、それをプロティンＡ又はプロティン６表面に結合させることに よって行うことができる。

ＣＤ４０−Ｌ及びその同族体の生物活性を測定する他の手段は、複合化した可溶 性ＣＤ４０　（例えば、”ｌ−ＣＤ４０／Ｆｃ）を上記と類似の競合測定法にお いて用いることである。しかしながら、この場合は、ＣＤ４０−Ｌを発現する無 傷細胞、又は固体支持体に結合した可溶性ＣＤ４０−Ｌを用いて、推定上のＣＤ ４０同族体を含有するサンプルに複合化した可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０−Ｌへの 結合についての競合を測定する。

ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖検定法で生物活性を測定することによって分析して もよい。ヒトＢ細胞は、デフランス（Ｄｅｆｒａｎｃｅ）ら、　Ｊ、　Ｉａ＋ｍ ｕｎｏ１．１３９：１１３５．１９８７により記載された陰性選択法及びパーコ ール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度沈降法による精製により、ヒト扁桃腺から得ること ができる。バーキットリンパ腫細胞系を用いて、ＣＤ４０−Ｌに応答する細胞増 殖を測定してもよい。バーキットリンパ腫細胞系の例には、例えば、ラージ（Ａ ＴＣＣＣＣＬ８６）、ダウン（Ｄａｕｄｉ）（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）及びナマ ルヮ（Ｎａｍａｌｗａ）（ＡＴＣＣＣＲＬ１４３２）が含まれる。膜結合ＣＤ４ ０−ＬはＢ細胞増殖を刺激した。オリゴマー、好ましくはダイマーのＣＤ４０− Ｌは、Ｂ細胞増殖を刺激することができる。ＣＤ４０（レセプター）は、Ｂ細胞 のＣＤ４０−Ｌ増殖に対抗する。

ＣＤ４０−Ｌ生物活性を測定するための他の分析法は、ＣＤ４０−Ｌ又はその誘 導体又は類縁体による活性化に応答してＢ細胞により産生されるイムノグロブリ ンを測定することである。例えば、培養液中５Ｘ１０’細胞／ｍｌのＢ細胞と共 に少なくとも７日間インキュベートすることによって、ポリクローナルイムノグ ロブリン分泌を測定することができる。イムノグロブリン（Ｉｇ）産生は、マリ スゼウスキー（Ｍａｌｉｓｚｅｖｓｋｉ）ら、　Ｊ、　ｒｏ＋ｍｕｎｏ１．１４ ４＋３０２８．　１９９０　（？リスゼウスキーらＩ〕又はマリスゼウスキーら 、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０：１７３５．１９９０　（マリス ゼウスキーらＩＩに記載された如きＥＬＩＳＡ分析法により測定することができ る。マウスＢ細胞は、例えば、マウスから採取して、グラブシュタイン（Ｇｒａ ｂｓｔｅｉｎ）ら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６３：１４０５．１９８６ 　〔グラブシュタインら■〕、マリスゼウスキーらＩ及びマリスゼウスキーらＩ Ｉに記載された操作に従って培養することによって得ることができる。

ＣＤ４０−Ｌを、ＣＤ４０を発現する細胞を検出するための結合分析に用いるこ ともできる。例えば、図１（配列番号：１）によるマウスＣＤ４０−Ｌ若しくは 図２（配列番号：１１）によるヒトＣＤ４０−Ｌ、又はその細胞外ドメイン又は 断片を、＋′Ｉの如き検出可能部分と複合化させることができる。ｌ２ＳＩでの 放射標識は、高い特異的活性に標識された機能性＋２５１−ＣＤ４０−Ｌ分子を 生成する多くの標準的方法のいずれかにより行うことができる。また、比色定量 又は蛍光定量反応を触媒することのできる酵素の如き他の検出可能部分、ビオチ ン又はアビジンを用いてもよい。ＣＤ４０を発現する細胞を複合化ＣＤ４０−Ｌ と接触させることができる。インキュベーション後に未結合複合化ＣＤ４０−Ｌ を除いて、検出可能部分を用いて結合を測定する。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、ダイマー又はトリマーの如きオリゴマーとして存 在してもよい。オリゴマーは、異なるＣＤ４０−Ｌポリペプチド上のシスティン 残基間で形成されるジスルフィド結合により連結される。また、２つの可溶性Ｃ Ｄ４０−ＬドメインをＧＩｙ４ＳｅｒＧＩｙ、Ｓｅｒリンカ−配列、又は米国特 許第５．０７３．６２７号に記載された他のリンカ−配列で連結することができ る。

なお、米国特許第５，０７３，６２７号は参照によりここに組み入れられるもの とする。ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質について記載したようにして、可溶性Ｃ Ｄ４Ｑ−Ｌ（７）Ｃ−末端（細胞外ドメイン）をｒｇＧｌのＦｃ領域（例えば、 配列番号、３）に融合させることによって、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを作り出 してもよい。ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質は、その組み立てが抗体分子の Ｈ鎖に非常に似ており、二価のＣＤ４０−Ｌを形成している。融合タンパク質が 抗体のＨ鎖とＬ鎮の両方でできているなら、４つのＣＤ４０−Ｌ細胞外ドメイン だけでＣＤ４０−Ｌオリゴマーを形成することが可能である。

融合タンパク質は、望ましい配列からの断片の酵素切断及び連結の慣用技術を用 いて調製してもよい。合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法を用いて目的の 断片を調製及び／又は増幅することができる。目的の配列に該当する合成オリゴ ヌクレオチドのオーバーラッピングを使用して、融合タンパク質をコードするＤ ＮＡ構築体を調製することもできる。融合タンパク質は、ＣＤ４０−Ｌと、リー ダー（又はシグナルペプチド）配列、Ｆｃ領域、リンカ−配列、及び融合タンパ ク質を容易に精製できかつ速やかに検出できる手段を提供する高度に抗原性の部 分をコードする配列を含む２又は３以上の付加的な配列を含むこともできる。

シグナルペプチドは、細胞からのタンパク質の分泌を促進する。代表的はソゲナ ルペプチドは、ヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７＋グツドウイン（Ｇｏｏｄ ｗｉ口）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６ ：３０２．１９８９　；図２Ｂ）のリーダー配列のアミノ末端２５アミノ酸であ る。他のソゲナルペプチドを用いてもよい。例えば、１１−７リーダー配列内の 一定のヌクレオチドを、アミノ酸配列を変化させることなく変化させることがで きる。更に、ＩＬ−７配列がリーダー配列として働く能力に影響を及ぼさないア ミノ酸変化を行うことができる。

Ｆｌａｇ（登録商標）オクタペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓ ｐ−Ａｓｐ−Ａ、５ｐ−Ｌｙｓ）は、融合タンパク質の生物活性を変化させず、 高度に抗原性であって特異的モノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピ トープを提供し、発現された融合タンパク質の検出と迅速にしかつ精製を容易に する。Ｆｌａｇ（登録商標）配列も、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対合の直後の残基において ウノ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に切断され、このペプチドでキャップさ れた融合タンパク質は、大腸菌内での細胞内分解に対して抵抗性であり得る。Ｆ ｌａｇ（登録商標）配列に結合するマウスモノクローナル抗体を、受託番号ＨＢ ９２５９でＡＴＣＣに寄託した。Ｆｌａｇ（登録商標）配列を含む融合タンパク 質の精製において該抗体を使用する方法は、米国特許第５．０１１．９１２号に 記載されており、参照によってここに組み入れられるものとする。

適当なＦｃ領域は、プロティンＡ又はプロティンＧに結合でき、また別に、該Ｆ ｃ領域を含む融合タンパク質の精製又は検出に用いることのできる抗体によって 認識されるＦｃ領域として定義される。好ましいＦｃ領域には、ヒトＩｇＧ。

又はマウスＩ　ｇＧ、のＦｃ領域が含まれる。１つの例は、配列番号：３に示し たヒトＩｇＧ、Ｆｃ領域であり、もう１つの例は、鋳型としてヒトｃＤＮＡを用 いる、配列番号・９及び配列番号＝１０からのオリゴヌクレオチドブライマーか らのＰＣＲにより得られるｃＤＮＡによりコードされるＦｃ領域である。適当な ＦＣ領域の一部分も用いることができ、例えば、プロティンＡへの結合を司って いるアミノ酸の配列を欠失した結果、生じたＦｃ領域がプロティンＡにではな（ プロティンＧに結合するようになったヒトＩｇＧ、のＦｃ領域がある。

［Ｇｌｙ、Ｓｅｒ］３繰り返し配列は、ＣＤ４０−Ｌがその第二及び第三構造に 正確に折り重なるのを確実にするのに充分な距離だけ、ＣＤ４０−Ｌの細胞外領 域を融合タンパク質のＦｃ部分から離すリンカ−配列を提供する。適するリンカ −配列は、（１）柔軟に延びたコンフォメーションに適合し、（２）融合タンパ ク質の機能性ドメインと相互作用するおそれのある整然とした第二構造を形成し ようとする傾向を示さず、そして（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用 を助長するおそれのある疎水性又は荷電性が最小のものであろう。柔軟なタンパ ク質領域内の典型的な表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが含まれる 。

事実上、ＧｌｙＳＡｓｎ及びＳｅｒを含有するアミノ酸配列のあらゆる組み合わ せが、リンカ−配列についての上の規準を満足すると考えられる。Ｔｈｒ及びＡ ｌａの如き他の殆ど中性のアミノ酸をリンカ−配列に用いてもよい。リンカ−配 列の長さは多様に変化してもよいが、該融合タンパク質の生物活性に有意な影響 を与えてはならない。融合したタンパク質が、機能性ドメインを離して立体的干 渉を防ぐのに用いることのできる必須ではないＮ−又はＣ−末端アミノ酸領域を 有する場合は、リンカ−配列は不要である。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、図１（配列番号＝１）及び図２（配列番号＝１− 　１）に示したＣＤ４０−Ｌの細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドとして 又はマウス及びヒト配列についてそれぞれ図１（配列番号＝１）及び図２（配列 番号：１１）に示した該細胞外ドメイン、膜貫通領域及び短い細胞内ドメインを 含む膜結合ポリペプチドとして存在してもよい。更に、本発明は、ジスルフィド 相互作用により連結されるか、又はスペーサーアミノ酸連結基を有するか若しく は有しない融合ポリマーとして発現されるＣＤ４０−Ｌ細胞外ドメインのオリゴ マー又はその断片を包含する。例えば、ダイマーＣＤ４０−Ｌ分子は、ＩｇＧＦ Ｃ領域連結基により連結され得る。

理論に拘束されることないが、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ　４．０ −Ｌは、従来はＩＬ−４の存在下で架橋抗ＣＤ４０抗体によって達成されたに過 ぎなかったｒｇ影形成びＢ細胞の増殖を刺激する活性をもたらすことができる。

更に、ＣＤ４０−Ｌの細胞外ドメインだけを含み、ＣＤ４０レセプターに結合で きるモノマー可溶性ＣＤ４０−Ｌは、膜結合及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌ及び／ 又は架橋抗ＣＤ４０抗体の活性に対抗するのに役立つと考えられる。更に、膜結 合ＣＤ４０−ＬとＣＤ４０との相互作用が、抗原特異性抗体産生及びポリクロー ナルＩｇ分泌の両方へのＢ細胞成長及び分化のＴ細胞接触依存性誘発を司る主要 な分子相互作用であると考えられる。この点で、完全長ＣＤ４Ｏ−Ｌ（即ち、膜 結合性であり、細胞内ドメイン、膜貫通領域及び細胞外ドメイン又はそれらの断 片を有する）をコードするｃＤＮＡで形質移入された哺乳動物細胞は、Ｂ細胞成 長、分化及び抗原特異性抗体産生の刺激を誘発するＴ細胞の能力に関し、Ｔ細胞 を真似ることができる。オリゴマー可溶性ＣＤ　４０−　Ｌ、好ましくは細胞外 領域のダイマーの活性は、膜結合ＣＤ４Ｃ１−Ｌの生物活性を真似ることができ ると考えられる。更に、可溶性モノマーＣＤ４（ＩＬ　（該細胞外ドメイン又は その断片を含む）は、ＣＤ４０レセプターに結合してＴ細胞とＢ細胞の相互作用 を阻止し、従って、それ自体上ツマー型又はオリゴマー型であってもよいＣＤ４ ０　（レセプター）細胞外ドメインに類似する活性を有することができる。また 、ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞成長、分化及び抗原特異性抗体産生の刺激を誘発でき る可溶性因子として働くために、オリゴマー（好ましくはダイマー）であること ができる。従って、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４ ０アゴニストとして働く一方で、可溶性（モノマー）ＣＤ４．０−Ｌ及び可溶性 ＣＤ４０は、シグナルを有意に伝達することなくＣＤ４０レセプター部位を遮断 することにより又はＢ細胞及び他の標的細胞上のＣＤ４０部位にＣＤ４０−Ｌが 結合するを阻止することにより、ＣＤ４０アンタゴニストとしても働くと考えら れる。

ＣＤ４０アゴニスト及びＣＤ４０アンタゴニストの両方は有用な治療活性を有す るであろう。例えば、ＣＤ４０アゴニスト（即ち、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリ ゴマー〇Ｄ４０−Ｌ）は、ワクチンアジュバントとして及びハイブリドーマ細胞 からのｍＡｂ産生を刺激するのに有用である。ＣＤ４０アンタゴニスト（即ち、 ＣＤ４０レセプター、ＣＤ４０／ＦＣ及びできるだけ可溶性のモノマーＣＤ４Ｑ −Ｌ）は、アレルギー、狼庸、慢性間接リウマチ、インシュリン依存真性糖尿病 （ＩＤＤＭ）、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）等の如き高レベルの抗原抗体複合 体の存在を特徴とする自己免疫疾患の治療に有用である。

ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌は、Ｔ細胞存在下でＩＬ−４により誘発され得る（ ベルセリ（Ｖｅ　ｒｃｅ　Ｌ　Ｌ　ｉ　）ら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１ ６９：１２９５．１９８９）。更に、ＩｇＥ産生は、抗ＣＤ４０ｍＡｂの添加に よって、Ｔ細胞除去ＰＢＭ（末梢血単核細胞）から誘発され得る（ジャバラら、 　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１７２：１８６１．１９９０及びザングら、Ｊ。

ＴＩＩ＋ｍｕｎｏ１．１４６：１ｇ３６．１９９１）、本発明は、更に、Ｔ細胞 存在下のＩＬ−４により又はＣＤ４０−Ｌ　（好ましくは、膜結合ＣＤ４Ｏ−Ｌ ）により活性化された活性化Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を阻害する方法であって、 ここに記載したＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質又は配列番号：３に記載したｃＤ ＮＡ配列によりコードされる可溶性ＣＤ４０を有効量投与することを含む方法を 包含する。同様に、ＣＤ４０レセプター及びできるだけ可溶性のＣＤ４０−Ｌ　 （モノマーだけ）も、他の抗体アイソタイプの分泌を遮断することができる。

本発明は、更に、天然パターンのグリコジル化を伴うか又は伴わないＣＤ４０− Ｌポリペプチドを包含する。酵母又は哺乳動物発現系（例えば、Ｃ０８−７細胞 ）内で発現されたＣＤ４０−Ｌは、何を発現系に選ぶかに依存して、分子量及び グリコジル化パターンに関し、天然ＣＤ４０−Ｌポリペプチドと類似していても 有意に異なっていてもよい。大腸菌の如き細菌発現系でのＣＤ４０−Ｌポリペプ チドの発現により、グリコジル化されていない分子が得られる。

生物活性又は結合に必要ではない、アミノ酸残基若しくは配列の種々の付加体若 しくは置換体、又は末端若しくは内部残基若しくは配列の欠失体をコードするＤ ＮＡ構築体を調製することができる。例えば、細胞外ＣＤ４０−Ｌ　Ｎ−グリコ ジル化部位を修飾してグリコジル化を前もって排除し、酵母発現系を用いて同種 の炭水化物減少類縁体を発現させることができる。真核性ポリペプチドにおける Ｎ−グリコジル化部位は、アミノ酸三連体Ａｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられる 。ここで、ＸはＰｒｏを除くいずれかのアミノ酸であり、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒ である。この三連体をコードするヌクレオチド配列を適当に修飾すると、Ａｓｎ 側鎖における炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加又は欠失をもたらすであろ う。他の例では、タンパク質の復元の際の正しくない分子内ジスルフィド橋の形 成を防ぎながら、Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させて、Ｃｙｓ残基を欠失 又は他のアミノ酸と置換させることができる。ヒトＣＤ４０−Ｌは、その細胞外 ドメイン内に５つのＣｙｓ残基を含む。かくして、タンパク質三次構造又はジス ルフィド結合形成に影響を及ぼさずに、該５つのＣｙｓ残基のうち少なくとも１ つを他のアミノ酸で置換するか又は欠失させることができる。

突然変異誘発への他のアプローチは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母 系における発現を増進するために二塩基性アミノ酸残基をコードする配列の修飾 を包含する。末端又は内部残基又は配列をコードする配列を欠失させることによ り、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドのサブユニットを構築してもよい。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、多エクソン遺伝子によりコードされる。本発明は 、更に、転写後の異なるｍＲＮＡスプライシングを原因とすることができる別の ｍＲＮＡ構築体、及びここに開示したｃＤＮＡと同−性又は類似性を有する領域 を共有する別のｍＲＮＡ構築体を包含する。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＣＤ４０−ＬｍＲＮＡ（セ ンス）又はＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ　（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核 酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含む。本発明によるアンチセンス又は センスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１若しくは配列番号；１１の、又は配 列番号：１若しくは配列番号：１１に相補的なりＮＡ又はＲＮＡの断片を含む。

かかる断片は、少なくとも約１４のヌクレオチドを含む。好ましくは、ががる断 片は、約１４〜約３０のヌクレオチドを含む。ＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡ配列に基 づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作り出す能力は、例えば、 ンユタイン（Ｓｔｅｉｎ）及びコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、　４８：２６５９．１９８８及びファン・デル・クロール（Ｖａｎ　ｄｅｒ 　Ｋｒｏｌ）ら、　ｌ１ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８．１９８８に記 載されている。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合により、二 重鎖の形成がもたらされ、この二重鎖形成が、該二重鎖の分解の増進、転写又は 翻訳の早期終結を含む幾つかの手段のうちの１つ又は他の手段により翻訳（ＲＮ Ａ）又は転写（ＤＮＡ）を遮断する。適するポリメラーゼプロモーターには、あ らゆるＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーター、又はあらゆるＤＮＡポリメ ラーゼについてのプロモーターが含まれる。アンチセンス又はセンスオリゴヌク レオチドは、更に、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖（又はＷＯ９１１０６ ６２９に記載されたものの如き他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含む 。この場合、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を有 するかかるオリゴヌクレオチドは、ｉｎ　ｖｉｖｏで安定である（即ち、酵素分 解に対して抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保 持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、Ｖ１０ ９０／１０４４８に記載されたものの如き有機部分、及びポリ（Ｌ−リジン）の 如き標的核酸配列についての該オリゴヌクレオチドの親和性を高める他の部分に 共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリブチンン（ｅｌｌ ｉｐｔｉｃｉｎｅ）の如き挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ） 、及びアルギル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド に付けて、標的ヌクレオチド配列に対する該アンチセンス又はセンスオリゴヌク レオチドの結合特異性を変えてもよい。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ，媒介ＤＮＡ 形質移入、エレクトロポレーションを含むあらゆる遺伝子移入法、又はエプスタ イン・バー・ウィルスの如き他の遺伝子移入ベクターによって標的核酸配列を含 有する細胞の中に導入することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレ オチドは、好ましくは、該アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適当な レトロウィルスベクターの中に挿入し、次いで、細胞と該挿入した配列を含有す るレトロウィルスベクターをｉｎ　ｖｉｖｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏのいずれかで接 触させることによって、標的核酸配列を含有する細胞の中に導入される。適する レトロウィルスベクターには、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２　（Ｍ −ＭｕＬＶ由来のレトロウィルス）、又はＤＣＴ５ＡＳＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５ Ｃ（ＰＣＴ出願ＵＳ９０１０２６５６を参照のこと）と呼称される二重コピーベ クターが含まれるがこれらに限定されない。また、他のプロモーター配列を用い て該オリゴヌクレオチドを発現してもよい。

センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、ＷＯ９１１０４７５３に 記載されたようなリガンド結合分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレ オチド配列を含有する細胞の中に導入してもよい。適するリガンド結合分子には 、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプター に結合する他のリガンドが含まれるがこれらに限定されない。リガンド結合分子 の複合化が、該リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する 能力を実質的に妨害しないか、又は該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチ ド若しくはその複合体が細胞の中に入り込むのを遮断しないのが好ましい。

また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９０／１０４４８に 記載されたようなオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成によって、標 的核酸配列を含有する細胞の中に導入してもよい。該センス又はアンチセンスオ リゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは内因性リパーゼによって 細胞内で解離される。

マウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡの配列を直接発現法によって得た。ヒトＣＤ４０− Ｌの配列は、マウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡをプローブとして用いて種間交叉ハイ ブリダイゼーション法によって得た。

本発明者らは、まず、スタメンコビック（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ）らに公表さ れた配列（配列番号：４）に基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）法により、ヒトＣＤ４０の細胞外領域のクローン（そのレセプター）を 得ることによってマウスＣＤ４０−Ｌをクローン化した。上流のオリゴヌクレオ チドブライマー５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣ −３’（配列番号＝５）が、ＣＤ４０のイニシエーターメチオニンから上流に５ ａｌｌ部位を導入し、下流のオリゴヌクレオチドブライマー５°−ＣＣＧＴＣＧ ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧ−３’　（配列番号二６）は、 ＣＤ４０のアミノ酸１９２の後ろに終結コドンを挿入し、そのあとにＸｂａｌ及 び５ａｌｌ部位が続く。増幅したｃＤＮＡを５ａｌｌで消化し、ｐＤＣ４０６（ マクマハン（Ｍｃｉｌａｈａｎ）ら、　ＥＭＢＯＪ、　１０：２８２１．１９９ １）にクローン化してｐＤｃ４０６／５ＣＤ４０を構築した。

第２のＣＤ４０レセプター断片（配列番号：４）を、ヒトＩｇＧ１（配列番号、 ３）のＦｃドメインへの融合用にＰＣＲ法により得た。簡単に説明すると、上流 のオリゴヌクレオチドブライマー（配列番号：５）及び融合鋳型（配列番号：４ ）は前と同じであった。下流のオリゴヌクレオチドブライマーは、ＣＤ４０のア ミノ酸１９３の後ろにアミノ酸Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　（配 列番号・８）を挿入する５’−ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＴ ＣＴＣＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣ−３°　（配列番号ニア）であった。

Ｇｌｕ及びＰｒｏは、ヒトＩｇＧ１の蝶番部の最初の２つのアミノ酸であり、そ のあとにＢｇｌ　ＩＩ制限部位が続く。該Ｂｇｌ　ＩＩ制限部位は、ＣＤ４０の 細胞外ドメインをヒトＩｇＧＩＦｃ領域の残りに融合するのに用いた。

池のレセプターからのリガンド結合ドメインを含む他の融合タンノくり質は、レ セプターのりガント結合ドメインのＤＮＡ配列を得て、プロティンＡ若しくはプ ロティンＧ１又はアフィニテイ精製のできる他のポリペプチド、例えば、アビジ ン又はストレプトアビジンに結合する抗体分子のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配 列にこの配列を融合させることによって作ることができる。得られる遺伝子構築 体を哺乳動物細胞の中に導入して、融合タンパク質の一過性発現を行うことがで きる。レセプター／Ｆｃ融合タンパク質は、プロティンＡ又はプロティンＧアフ イニチイ精製により精製することができる。レセプター／アビジン融合タンノ（ り質は、ビオチンアフイニテイクロマトグラフイーにより精製することができる 。その後、高１度の塩溶液又は他の適当な緩衝液で溶出することによって、該融 合タンパク質をカラムから分離することができる。

本発明者らは、ヒトの細胞からのｃＤＮＡを鋳型として用い、上流のオリゴヌク レオチドブライマー５’−ＴＡＴＴＡＡＴＣΔＴＴＣＡＧＴＡＧＧＧＣＣＣＡＧ ＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’　（配列番号・９）及び下流の オリゴヌクレオチドブライマー５’−ＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴ ＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡ−３’　（配列番号、１０）を用いる ＰＣＲ増幅法により、ヒトｒｇＧＩＦｃ領域をコードするｃＤＮＡを得た。該Ｐ ＣＲ増幅ｃＤＮＡは、蝶番部の開始部位の近くにＢｇｌ　ＩＩを導入した。これ は、ＣＤ４０の細胞外ドメインを連結して５ｃＤ４０／Ｆｃ融合ｃＤＮＡを構築 するのに用い、この融合ｃＤＮＡは、ｐＤｃ４０６内に連結してｐＤｃ４０６／ ＣＤ４０／Ｆｃを構築した。他の適するＦｃ領域は、高い親和性でプロティンＡ 又はプロティンＧと結合できるあらゆる領域として定義され、ヒトＩｇＧ１又は マウスＩｇＧ１のＦｃ領域が含まれる。１つの例は、配列番号＝３に示したヒト ＩｇＧＩＦｃ領域又はヒトｃＤＮＡを鋳型として配列番号：９及び配列番号：１ ０からのオリゴヌクレオチドブライマーからのＰＣＲにより得られるｃＤＮＡで ある。

レセプター／Ｆｃ融合分子は、好ましくは、組換え哺乳動物細胞の培養で合成さ れる。というのは、それらは原核細胞発現法により合成するには一般にあまりに 太き（かつ複雑過ぎるからである。レセプター／　Ｆ　ｃ融合タンパク質の発現 に適−１フル％乳動ｕ細胞（’ｌ’１１．：ｌ；ｉ、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣＣ ＣＬ７０）　及びＣＯ３−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）が含まれ、両方共 サルの腎臓由来のものである。

ＤＮＡ構築体ｐＤｃ４０６／ＣＤ４０／Ｆｃをザ、＋Ｌ％Ｆ臓細胞系ＣＶ−１／ ＥＢＮＡ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤｃ４０６プラ スミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）　、及びエプスタイン・ ノく−・ウィルス（ＥＢＶ）由来の調節配列を含む。ｃｖ−１／ＥＢＮＡ細胞系 は、エプスタイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ヒ トＣＭＶ即時−初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）　１ンハンサー／プロ モーター由来のＥＢＮＡ−１を構成的に発現する遺伝子でＣＶ−１細胞系を形質 移入することにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤＣ４０６の如きＥＢ Ｖ複製起点を含有する発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。

ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を発現する形質移入体は、初めに、ドツトプロッ ト法又はウェスタンプロット法を用いて同定される。次いで、上澄み液をドツト プロット又はゲル電気泳動に付してから、Ｇ２８−５ｍＡｂ　（ヒトＣＤ４０レ セプターに結合する抗体）と結合させるために該電気泳動したタンパク質を移す 。

次いで、プロットしたタンパク質を放射標識１２６１−プロティン八と共にイン キュベートし、洗浄して未結合標識を除き、そしてＦｃの発現について検査した 。モツクローナル抗体Ｇ２８−５は、クラーク（Ｃ１ａｒｋ）らの前記文献に従 って作った。

該融合構築体を発現する細胞を同定したので、形質移入細胞の大規模培養を行っ て、ＣＤ４０／Ｆｃを発現する細胞からの上澄み液を蓄積した。上澄み液中のＣ Ｄ４０／Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に説明す ると、哺乳動物細胞上澄み液を（例えば、０．４５μフイルターで）濾過し、濾 液をプロティンＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（シュライバー（Ｓｃｈｌｅｉｃ ｈｅｒ）及びシュエル（Ｓｃｈｕｅｌ、ｌ）、キーン（Ｋｅｅｎｅ）、　ＮＨ） に４℃で１．５　ｃｍＸ　１２．　Ｑ　ｃｍカラムについて８０ｍ１／ｈの流速 で適用することによって、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する１リツター の培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなく なるまで、カラムをＰＢＳ中の０．５ＭＮａＣ１で洗浄した。最後に、ＰＢＳで カラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ２，８の２５ｍＭクエン酸緩 衝液でカラムから溶出させ、ｐＨ９，１の５００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ ７にした。該溶出したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルにより 、〉９８％純度であることが分かった。

ここに記載したようにして、可溶性ＣＤ４０　（ｓｃＤ４０）及びＣＤ４０／Ｆ ｃ融合タンパク質を作った。形質移入ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞により発現された ５ｃＤ４０をアフィニティ精製するために、該上澄み液をＧ２８−５　Ｃ抗ＣＤ ４ＱｍＡｂ）アフィニティカラムに通して精製した。タンパク質含有画分をプー ルし、０２８−５結合測定及び還元剤として１ｍＭジチオスレイトールの存在下 での５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ナトリウムドデシルサルフェート・ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動）による分析のためにアリコートを取った。分子量２８．１００ ダルトンの１本のバンドが見られた。還元剤なしでは、５ｃＤ４０のＳ　Ｄ　Ｓ 　−Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅ分析は２本のバンドを示し、大きいバンドの分子量は５６ ，０００であり、小さい方のバンドの分子量は２８，０００であった。該バンデ ィングパターンは、５ＣＤ４０の大部分は溶液中でジスルフィド結合ホモダイマ ーとして存在することを示している。２８．０００のバンドはフリーのモノマー である。

銀染色によりＣＤ４０タンパク質を可視化した。サンプルタンパク質濃度は、超 純粋ウシ血清アルブミンをスタンダードとするマイクロＢＣＡ測定法（ピアス（ Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて測定した。可溶性ＣＤ４０純度及びタンパク質濃度は 、アミノ酸分析により確認した。精製した可溶性ＣＤ４０をＰＶＤＦベーノく− に吸収させ、アプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａタンパク質配列分 析装置で、Ｎ−末端タンパク質配列分析についてのメーカーの説明書に従って、 該ペーパーを自動エドマン分解に付した。この操作は、５ｃＤ４０のタンノくり 質配列を点検した。

可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ　（Ｇ ２８−５）の不存在下でヒトＢ細胞応答を調節することができた。精製した扁桃 腺Ｂ細胞を抗ＩｇＭ及びヒトＩＬ−４と一緒に培養して、５ｃＤ４０又はＣＤ４ ０／Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを添加した。どの型のＣＤ４０も、（トリチ ウム標識チミジン取り込みにより測定して）Ｂ細胞増殖への阻害作用を有さなか った。対照的に、ＩＬ−４レセプターは、濃度に依存して、ＩＬ−４誘導Ｂ細胞 増殖を阻害した。

２ドナ−ＭＬＣ（混合リンパ球培養）系でＩＬ−４誘導１ｇＥ分泌を阻害する能 力について可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを試験した。３実験において、Ｃ Ｄ４０の濃度が増加するにつれて、ＩｇＥ産生のレベルが減少した。１０μｇ／ ｍｌの濃度で添加した可溶性ＣＤ４０は、アレルギーのこのモデルにおけるＩｇ Ｅ分泌を完全に阻害することができた。更に、ＣＤ４０／Ｆｃもその可溶性等個 物と類似の作用を有した。しかしながら、ＩＬ−７レセプター・Ｆｃ融合タンパ ク質（公表されたＩＬ−７１７セプター配列で類似の操作により作った）の添加 は、このモデルにおけるＩｇＥの分泌に影響を及ぼさなかった。

ＣＤ２３のレベルも５ｃＤ４０又はＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に対応して同 じＭＬＣで測定した。可溶性ＣＤ　４．０は、ｒＬ−４単独で刺激した培養物に 比較して、６日目で小さいが再現性よ（ｓＣ０２３レベルを低下させたが、１２ 日目に同じ培養物においてより強い阻害作用を示した。ＩＬ−４刺激Ｔ除去ＰＢ Ｍ（末梢血マクロファージ）Ｅ−細胞による可溶性ＣＤ２３の誘発も５ｃＤ４０ の添加により同じく影響を受け、６日目で５ＣＤ２３レベルが小さく低下し、１ ２日目でより著しい阻害作用を示した。各培養系において、ＣＤ４０／Ｆｃ融合 タンパク質での結果は、５ｃＤ４０での結果と実質的に同じであった。

ＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡを単離するために、市販の固相剤（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ。

ピアス）を用いて、精製したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を１２５Ｉで放射標 識した。この操作において、５μｇのｌ０ＤＯ−ＧＥＮを１０１０Ｘ７５ガラス 試験管の底にプレートし、７５μｍの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４） 及び２０μＩ　（２ｍＣｉ）Ｎａ”Ｉと共に４℃で２０分間インキュベートした 。次いで、４５μＩＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）中に５μｇのＣＤ４０／Ｆｃを含 有する第２ガラス試験管に該溶液を移して、この反応混合液を４℃で２０分間イ ンキュベートした。２ｍｌ充填容盟０セファデックス（登録商標）Ｇ−２５（シ グマ）でゲル濾過することによってこの反応混合物を分画してから、２．５％（ Ｖ／Ｖ）ウノ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０．２％（Ｖ／Ｖ）ナトリウムアジ ド及びｐＨ７゜４の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ結合培地を含有するＲＰＭ１１６４０ 培地中で平衡化した。最終プールの１２５１ＣＤ４０／Ｆｃを結合培地中ｌＸｌ ０−’Ｍの作業ストック溶液に希釈して、レセプター結合活性の検出し得る損失 なしに４℃で１力月まで貯蔵した。

ビオチニル化ＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質の結合に基づいて、ＦＡＣＳ　（蛍 光活性化細胞分離）により選別したＥＬ−４細胞系からｃＤＮＡライブラリーを 調製した。選別したＥＬ−４細胞によるＣＤ４０のリガンドの発現に基づ（蛍光 強度の有意な変化があるまで、細胞を５回選別した。該５回選別細胞をＥＬ−４ ０，５細胞と呼び、ＥＬ−４０，５ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーを作成 するためにこれら細胞を培養した。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを合成し、空の ｐＤＣ４０６ベクターの中に挿入して大腸菌に中に形質転換した。形質転換体を プールし、該プールからのＤＮＡを単離し、ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞の中に形質移 入して発現クローニングライブラリーを作成した。形質移入ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細 胞をスライド上で３日間培養してＣＤ４０−Ｌを一過性発現させた。次いで、該 形質移入細胞を含有するスライドを放射標識ＣＤ４０／Ｆｃと一緒にインキュベ ートし、洗浄して未結合ＣＤ４０／Ｆｃを除き、そしてグルタルアルデヒドで定 着した。該定着スライドを液状写真乳剤に漬けて暗所で露光した。該スライドを 現像した後、顕微鏡でそれらを別々に検査して、明るいバックグランドに対する オートラジオグラフの銀粒子の存在によりＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を同定し た。

ＥＬ−４０，５細胞からの発現クローニングライブラリーをスクリーニングし、 約２０００の別々のクローンを含有する１つのプールを、＋２５１標識ＣＤ４０ ／Ｆｃ融合タンパク質との結合について陽性であると同定した。このプールを約 ２００コロニーのより小さなプールに分割した。該小さなプールを上記のように してスクリーニングした。該小さなプールのうちの１つがＣＤ４０−Ｌについて 陽性であった。

１つのクローンを単離して標準法により配列決定し、図１及び配列番号：１に示 したマウスＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を得た。

ヒト同族ＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡを種間交叉／％イブリダイゼーション法により見 出した。簡単に説明すると、ＣＤ３　（Ｌｏｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン −２（ＩＬ−２，１０ｎｇ／ｍｌ）に結合する０ＫＴ３抗体（ＡＴＣＣ，ｏ、、 クビル、ＭＤ）で６日間処理した末梢血リンパ球から、ヒト末梢血リンノく球（ ＰＢＬ）ｃＤＮＡライブラリーを作った。該ＰＢＬ細胞を洗浄し、次いで１０　 ｎ　ｇ／ｍ　ＩＰＭＡ　（フォルボールミリステートアセテート、シグマ、セン トルイス）及び５ＱＱｎｇ／ｍｌイオノマイシン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉ ｏｃｈｅＵａ））で４時間刺激した。刺激したＰＢＬ細胞からｍＲＮＡを単離し 、ｃＤＮＡを生成させてｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカ−に連結した。連結したｃ ＤＮＡを、メーカーの説明書に従って、λｇｔｌｏファージクローニングビヒク ル（ギガパック（登録商標）ストラタジーン、サンディエゴ、ＣＡ）のＥｃｏＲ ｒ部位に挿入した。ファージを増幅し、１．５ｃｍプレート当たり約２０．００ ０フアージの密度でプレートして、マニアチスＱｌａｎｉａｔｉｓ）ら、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ、　 １９８２．　ｐｐ、３１６−３２８に記載されているようにして、ファージリフ トを行った。配列番号、１及び図１のヌクレオチド１３からヌクレオチド７９３ までのマウスＣＤ４０−Ｌのコーティング領域に対応するマウスプローブを構築 した。このプローブは、温和または苛酷なストリンジェント条件で、ＰＢＬライ ブラリーファージリフトとハイブリダイズした。簡単に説明すると、ハイブリダ イゼーション条件は、６ＸＳＳＣ，ｌｘデンノ１ルツ溶液、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ０．５％Ｎｐ４０　（ノニデットＰ−４０洗浄剤）で６３℃で−晩行うものであ った。これに続いて、３ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、５５℃で３時間洗浄し、 Ｘ線フィルムに一晩露光した。１０００プラーク当たり約１プラークの頻度で陽 性プラークを同定した。陽性プラークを２回精製して増幅した培養物からｃＤＮ Ａを調製した。

ここに開示したマウス又はヒトＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡ配列は、種間交叉ハイブリ ダイゼーション法によりマウス又はヒトＣＤ４０−Ｌの他の哺乳動物同族体をコ ードするｃＤＮＡを得るために用いることができる。簡単に説明すると、図１（ 配列番号：１）に記載したマウスＣＤ４０−Ｌ又は図２（配列番号＝１１）に記 載したヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域のヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチ ドプローブを作成する。このプローブは、マニアチスらの前記文献に記載された ものの如き標準法によって作ることができる。マウス又はヒトプローブを用いて 、温和なストリンジェント条件で、哺乳動物ＣＤＮＡライブラリー又はゲノミッ クライブラリーをスクリーニングする。哺乳動物ＣＤＮＡライブラリー又はゲノ ミックライブラリーの例には、ｃＤＮＡについて、哺乳動物の末梢血リンパ球か ら作られるライブラリーが含まれる。また、種々の細胞系から単離した種々のＣ ＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションによりスク リーニングして、哺乳動物ＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ又はｍＲＮＡの適当な供給源を 確認することができる。

組換えＤＮＡ法によるＣＤ４０−Ｌの発現のための組換え発現ベクターは、哺乳 動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子由来のものの如き適当な転写又は翻訳 調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結された、ＣＤ４０−Ｌポリペプチ ドをコードする合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含むＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ 配列を含む。調節配列の例には、遺伝子発現において調節の役割を有する配列（ 例えば、転写プロモーター又はエンハンサ−）、任意要素である転写を制御する ためのオペレーター配列、ｒｎＲＮＡリポソーム結合部位をコードする配列、及 び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド 配列は、調節配列がＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列に機能的に関係する場合は、機能 できるように連結される。かくして、プロモーターヌクレオチド配列がＣＤ４０ −Ｌ　ＤＮＡ配列の転写を制御する場合は、該プロモーターヌクレオチド配列は ＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列に機能できるように連結される。更に、リポソーム結 合部位がベクター内で翻訳を促進する位置にある場合は、該リポソーム結合部位 はＣＤ４０−Ｌポリペプチドのための配列に機能できるように連結しているとい える。加えて、シグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターの中に組み込 むことができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡ配 列をＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列に機能できるように連結してもよい。該シグナル ペプチドは、酵母宿主細胞により翻訳される融合ポリペプチドの細胞外分泌を向 上させることができる前駆体アミノ酸配列として発現される。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高 等真核細胞が含まれる。原核細胞には、グラム陰性又はグラム陽性微生物、例え ば、大腸菌又は杆菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、 大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトミセス 属、及びブドウ球菌属に属するいろいろな他の種が含まれる。高等真核細胞には 哺乳動物器官の株化細胞系が含まれる。ここに開示したＤＮＡ構築体由来のＲＮ Ａを用い、無細胞翻訳系を用いてＣＤ４０−Ｌポリペプチドを産生ずることもで きるかも知れない。細菌、菌類、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いるのに適切 なりローニング及び発現ベクターは、例えば、バウエルスら、Ｃｌｏｎｉｎｇ　 Ｖｅｃｔｏｒｓ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８５）に記載されている。

大腸菌の如き原核宿主細胞においては、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド又は類縁体は 、該原核宿主細胞内での該組換えポリペプチドの発現を促進するために、Ｎ−末 端メチオニン残基を含んでもよい。該Ｎ−末端Ｍｅｔを、発現した組換えＣＤ４ ０−Ｌポリペプチドから切断してもよい。原核宿主細胞は、広範囲なタンパク質 分解又はジスルフィドプロセシングが必要でないＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発 現に用いることができる。

組換えＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列を保持する発現ベクターを適した宿主微生物又 は哺乳動物細胞系の実質的に均質な培養液に形質移入又は形質転換する。形質転 換された宿主細胞は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 で形質転換又は形質移入された細胞で、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現する。

発現されたＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、宿主細胞の性質及び該宿主細胞内の挿 入された遺伝子構築体に依存して、該宿主細胞内と止まりかつ／又は培養上澄み 液内に分泌されるであろう。

原核宿主細胞内に形質移入された発現ベクターは、一般に、１又は２以上の表現 型選択可能マーカー（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋ ｅｒｓ）を含む。表現型選択可能マーカーは、例えば、抗生物質耐性を与えるか 又は独立栄養要求性を満たすタンパク質をコードする遺伝子、及び該宿主内での 増幅を保証するために該宿主により認識される複製起点である。原核宿主細胞に 有用な他の発現ベクターは、市販のプラスミド由来の細菌起源の選択可能マーカ ーを含む。この選択可能マーカーは、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴ ＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含むことができる。ｐＢＲ，３２２はアンピシ リン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を 同定する簡単な手段を提供する。

ｐＢＲ３２２“バックボーン”部分は、適当なプロモーター及びＣＤ４Ｏ−ＬＤ ＮＡ配列と連結している。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３ （ファルマンア・ファイン・ケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）及びｐＧＥ ＭＩ　（プロメガ・バイオチック、マジソン、Ｗｌ、ＵＳＡ）が含まれる。

プロモーター配列は、普通、組換え原核宿主細胞発現ベクターに用いられる。

普通のプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペリシリナーゼ）、ラクトー スプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５ ．１９７８　；及びジョデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、　Ｎａｔ、ｕｒｅ　２８１ ：５４４．１９７９）、トリプトファンー系（ジョデルら，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃ ｉｄｓ　Ｒｅｓ．　８：４０５７，　１９８０；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及 びｔａｃプロモーター（マニアチスら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．　４１２．　１９８２）が含まれ る。特にL 用な原核宿主細胞発現系は、ファージスＰｔプロモーター及びＣＩ８５７ｔｓ熱 不安定性リプレッサー配列を用いる。該λＰＬプロモーターの誘導体が組み込ま れているアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラス ミドベクターニハ、プラスミドｐＨＵＢ２　（、大腸菌株ＪＭＢ９　（ＡＴＣＣ ３７０９２）内のレジデント）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴｃｃ５３ ｏ８２）内のレジデント）が含まれる。

ＣＤ４０−Ｌを酵母宿主細胞内で、好ましくはサツカロミセスｇ（例えば、サツ カロミセス・セレビシェ）から発現してもよい。ピチア（Ｐｃｈｉａ）属又はク ルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）　漠の如き他の酵母の属を用い てもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、ａｕｔｏ ｎｏｍｏｏｓｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ＡＲＳ）　 、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、及び転写終結のための配列 を含有することが多いであろう。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点配列及 び選択可能マーカーを含む。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、メタ ロチオネインのためのプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ヒッツ エマン（■ｉｔｚｅｍａｎ）ら、　Ｊ．Ｂｉｏｌ，　Ｃｈｅｍ．　２５５：２０ ７３，　１９８０）又は他の解糖酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、　Ｊ．　Ａｄｖ， 　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ．　７：１４９，　１９６８　；及びホーランド（Ｈｏ ｌｌａｎｄ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１７：４９００，　１９７８）　、例え ば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘ キソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルコトキナーゼ、グル コース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピ ルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイ ソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他の ベクター及びプロモーターは、ヒッツエマン，ＥＰ−Ａ−７３．６５７に更に記 載されている。

大腸菌内での選択及び複製のために、例えば、ｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（ Ａｍｐ’遺伝子及び複製起点）を用いて酵母ベクターを組み立てることができる 。酵母発現構築体内に含まれることができる他の酵母ＤＮＡ配列には、グルコー ス抑制可能ＡＤＨ２プロモーター及びα−因子分泌リーダーが含まれる。該ＡＤ Ｈ２プロモーターは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈ ｅｗ．　２５８：２６７４。

１、９８２）及びベイヤー（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア２４． 　１９８２）　＋：記載されティる。

酵母α−因子分泌リーダー配列は異種ポリペプチドの分泌を行う。α−因子分泌 リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多 い。例えば、カーヤン（Ｋｕｒｊａｎ）ら、　Ｃｅｌｌ　３０：９３３，　１９ ８２及びビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　 Ｓｃｉ．　ＵＳ＾８１：５３３０．　１９８４を参照のこと。酵母宿主からの組 換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者に知 られている。リーダー配列の３゛末端の近傍を修飾して１又は２以上の制限部位 を含有させてもよい。これは、構造遺伝子へのリーダー配列の融合を促進するで あろう。

酵母形質転換の手順は当業者に知られている。かかる手順の１つは、ヒネン（Ｈ ｉｎｎｅｎ）らにより、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　７５：１９２９．１９７８に記載されている。ヒネンらの手順は、選択培地中 でＴｒｐ”形質転換体を選択しており、該選択培地は、０．６７％酵母窒素原基 礎培地、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２ ０μｇ／ｍｌウラシルからなる。

ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細 胞は、発現を誘発するために“富（ｒｉｃｈ）“培地内で成育させてもよい。富 培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウランルを補充した１ ％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から使い尽くされたときに起こ る。

哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発 現することもできるかも知れない。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎 臓細胞のＣＯ５−７系（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（グルラマン（Ｇｌｕｚｍａ ｎ）ら、　Ｃｅ１ｌ　２３：１７５．１９８１）　、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３ Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞、ヒーラ−細胞、及びＢＨＫ　（ＡＴＣＣＣＲＬＩＯ）細胞系が含まれる。適 する哺乳動物発現ベクターは、複製起点、プロモーター配列、構造遺伝子に連結 したエンハンサ−、リポソーム結合部位の如き他の５′又は３°フランキング非 非転写列、ポリアデニル化部位、スプライス供与体及び受容体部位、及び転写終 結配列等の非転写（ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）要素を含む。

哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列をウィルスゲノム から切り取ってもよい。例えば、普通に用いられる哺乳動物細胞プロモーター配 列及びエンハンサ−配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアン ウィルス４０　（ＳＶ４０）　、及びヒトサイトメカロウィルスから誘導される 。

ＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後 期プロモーター、エンハンサ−、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いて 、哺乳動物宿主細胞内の構造遺伝子配列の発現に必要な他の遺伝子要素を供給し てもよい。ウィルス初期及び後期プロモーターは、その両方がウィルス複製起点 も含有することができる断片としてウィルスゲノムから容易に得られるので、特 に有用テある（ファイアス（Ｆｉｅｒｓ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３ ．１９７８）　、　ＳＶ４０ウィルス複製起点部位内に位置するＨｉｎｄＩＩＩ 部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ｂｐ配列が含まれていることを条件として 、より小さい又はより大きなＳＶ４０断片も用いることができる。

代表的な哺乳動物発現ベクターは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）及びバーブ（Ｂ ｅｒｇ）（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２８０．１９８３）により 開示されているようにして構築することができる。コスマン（ＣＯ５ｍａｎ）ら によりＮａｔｕｒｅ　３１２ニア６８．１９８４に記載された有用す高発現ベク ター、つまりＰＭＬＳｖＮ１／Ｎ４をＡＴＣＣ３９８９０として寄託した。追加 の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６及び１９９１年５ 月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１，４１５号に記載されている 。これらは、参照によりここに組み入れられるものとする。ＣＤ４０−Ｌの如き タイプＴＩタンパク質細胞外領域の発現のためには、米国特許第４．９６５．１ ９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）についてのシグナル配列 、又は１９８４年７月２日に出願された米国特許出願第０６／６２６゜６６７号 に記載されたインターロイキン−２レセプターについてのシグナル配列の如き異 種のソゲナル配列を加えるべきである。

ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌは、細胞内及び膜貫通領域が含まれている場合には 膜結合型で、又細胞外領域だけの場合は可溶型で作ることができる。本発明者ら は、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を産するために、哺乳動物細胞内 で完全長マウスＣＤ４０−Ｌを発現させた。本明細書中の実施例６に記載した方 法を用いて、ＷＡＶＥＯベクター内の図１（配列番号＝１）に示したｃ　ＤＮＡ で又はＨＡＶＥＯ空ベクターでＣＶ−１細胞を形質移入した。これは、膜結合マ ウスＣＤ４０−Ｌを発現する形質移入ＣＶ−１細胞を産した。これら細胞を、以 下の実施例１０〜１３に報告した一連の実験用に、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの 供給源として用いた。

ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現するのに必要な 培養条件下で、・形質転換した宿主細胞を培養することによって調製することが できる。次いで、生成した発現ポリペプチドを培養培地又は細胞抽出物から精製 することができる。所望により、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ア ミコン（八ｍ１ｃｏｎ）又はミリボア・ベリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ ｌｉｃｏｎ）超濾過装置を用いて、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを濃縮してもよい 。濃縮工程後、ゲル濾過媒質の如き精製マトリックスに適用することができる。

また、例えば、ペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマト リックス又は支持体、等のアニオン交換樹脂を使用することができる。該マトリ ックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパ ク質精製に普通に用いられる他のタイプであってもよい。また、カチオン交換工 程を採用してもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル又はカルボキ シメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好 ましい。

最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質（例えば、ペンダントのメチル又は他の脂肪 族基を有するシリカゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフ ィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を採用して、ＣＤ４０−Ｌを更に精製することがで きる。実質的に均質な組換えタンパク質を得るために、前述の幾つか又は全ての 精製工程を組み合わせて採用することもできる。

ＣＤ４０リガンド結合ドメインを含むアフイニテイカラムを利用して、発現した ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをアフィニテイ精製することも可能である。ＣＤ４０ −Ｌポリペプチドは、高い塩濃度の溶出用緩衝液でアフイニテイ力ラムから分離 することができ、次いで、使用するために低い塩濃度の緩衝液で透析することが できる。

細菌培養で産生じた組換えタンパク質は、通常、最初に宿主細胞を崩壊させ、遠 心分離し、不溶性ポリペプチドの場合には細胞ペレットから抽出し、可溶性ポリ ペプチドの場合には上澄み液から抽出した後、１又は２以上の濃縮、塩析、イオ ン交換、アフィニティ精製又はサイズ排除クロマトグラフィ一工程を行うことに よって単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを採用しても よい。微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、音波破砕、機械的崩壊、又は細胞溶 解剤を用いる方法を含む、あらゆる慣用的方法によって崩壊することができる。

形質転換酵母宿主細胞は、好ましくはＣＤ４０−Ｌをポリペプチド分泌物として 発現させるために用いる。これは精製を簡単にする。酵母宿主細胞醗酵から分泌 された組換えポリペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇ、　２９６：１７１、１９８４）により開示された方法と類似の方法によ り精製することができる。

ウルダルらは、分取ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の精製に、２つの逐 次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。

ＣＤ４０−Ｌ組成物の投与 本発明は、適当な希釈剤又は製剤上の担体中に有効量のＣＤ４０−Ｌを含む治療 用組成物及び該組成物を用いて哺乳動物を治療する方法を提供する。治療用途に は、症状に適する方法で治療するために、精製したＣＤ４０−Ｌ又は生物学的に 活性なその類縁体を、患者に、好ましくはヒトに投与する。かくして、例えば、 目的の治療効果を得るために投与される（例えば、可溶性細胞外ドメイン又はそ の断片の形の）ＣＤ４０−Ｌ医薬組成物を、濃縮塊注射、継続的点滴、徐放型移 植、又は他の適当な方法によって与えることができる。典型的には、ＣＤ４０− Ｌ治療剤は、生理学的に許容できる製剤上の担体、補助剤又は希釈剤と混合した 精製ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを含む医薬組成物の形で投与されよう。かかる担 体は、採用する投与量及び濃度で患者に対して非毒性であろう。通常は、かかる 組成物の製剤は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを、緩衝剤；アスコルビン酸の如き 酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸 ニゲルコース、スクロース又はデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡの如きキ レート剤；グルタチオン及び他の安定剤及び補助剤と混合することを伴う。中性 緩衝食塩水又は同種の血清アルブミンと混合した食塩水は、非常に適した希釈剤 である。ＣＤ４０−Ｌセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、コードす る核酸配列及び有効なセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する有 効量のベクターを投与することによってｉｎ　ｖｉｖｏで投与してもよい。更に 、ＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含有する細胞を個体から取り、遺伝子移 入技術を用いて該細胞内にアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを組み込 み、そして該細胞を該個体内に再注入することにより、ＣＤ４０−Ｌセンス又は アンチセンスオリゴヌクレオチドをｅｘ　ｖｉｖｏで投与してもよい。

以下の実施例は特定の態様を説明しすることを意図しており、本発明の範囲を限 定することを意図するものではない。

実施例１ この実施例は、ＣＤ４０リガンドをコードするｃＤＮＡクローンの検出に用いる 可溶性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ／ＦｃＤＮＡ 構築体の構築を説明するものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用い 、スタメンコビックらの前記文献に公表された配列に基づいて、完全ＣＤ４０ヒ トレセプター配列の細胞外領域又はリガンド結合ドメインのｃＤＮＡ配列を得た 。ＣＤ４０プラスミド（ＣＤＭ８）をＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。ＣＤＭ８ は、スタメンコビックらの文献に記載されており該著者から得たものである。

５゛（上流）及び３°（下流）オリゴヌクレオチドブライマーを用いるＰＣＲ法 （サルキ（Ｓａｒｋｉ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７．１９８８）を 用いて、ＣＤ４０細胞外リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅し た。上流のオリゴヌクレオチドブライマー５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴ ＧＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣ−３′（配列番号＝５）は、ＣＤ４０のイニシェータ ーメチオニンから上流に５ａ１１部位を導入し、下流のオリゴヌクレオチドブラ イマー５’−ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧ ＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣ−３゛（配列番号ニア）は、ＣＤ　４．０のアミノ酸１ ９３の後ろにアミノ酸Ｔｙｒ　ＶａＩ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　（配列番号： ８）を挿入する。Ｇｌｕ及びＰｒｏは、ヒトＩｇＧ１の蝶番部の最初の２つのア ミノ酸であり、そのあとにＢｇｌ　ＩＩ制限部位が続く。該Ｂｇｌ　ＩＩ制限部 位は、ＣＤ４０の細胞外ドメインをヒトＩｇＧＩＦｃ領域の残りに融合するのに 用いた。

ＤＮＡ構築体ｐＤｃ４０６／ＣＤ４０／Ｆｃをサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮ Ａ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤｃ４０６ブラスミド は、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・バー・ウ ィルス（ＥＢＶ）由来の調節配列を含む。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、エプス タイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ヒトＣＭＶ即 時−初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）　１ンハンサー／プロモーター由 来のＥＢＮＡ−１を構成的に発現する遺伝子でＣＶ−１細胞系を形質移入するこ とにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤｃ４０６の如きＥＢＶ複製起点 を含有する発現ベクターのエビソーム複製を可能にする。

該融合構築体を発現する細胞を同定したので、形質移入細胞の大規模培養を行っ て、ＣＤ４０／Ｆｃを発現する細胞からの上澄み液を蓄積した。上澄み液中のＣ Ｄ４０／Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に説明す ると、哺乳動物細胞上澄み液を（例えば、０４５μフイルターで）濾過し、濾液 をプロティンＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（シュライバー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ ｅｒ）及びシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キーン（Ｉｅｅｎｅ）、　ＮＨ）に４ °Ｃで１．５　ｃｍＸ　１２．　Ｏａｍカラムについて８０ｍ１／ｈの流速で適 用することによって、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する１リツターの培 養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなくなる まで、カラムをＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）中の０．５ＭＮａＣ＋で洗浄した。

最後に、ＰＢＳでカラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ２，８の２ ５ｍＭクエン酸緩衝液でカラムから溶出させ、ｐＨ９，１の５００ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。該溶出したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の銀染色 ＳＤＳゲルにより、〉９８％純度であることが分かった。

市販の固相剤（ＩＯＤｏ−ＧＥＮ、ピアス）を用いて、ｍ’ＪＡしｆニーＣＤ４ ０／ＦＣ融合タンパク質を１２５Ｉでヨウ素化した。この操作において、５μｇ のｌ０ＤＯ−ＧＥＮを１０１０Ｘ７５ガラス試験管の底にプレートし、７５μｌ の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）及び２０μｌ　（２ｍＣｉ）Ｎａ” Ｊと共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで、４５μＩ　ＰＢＳ中に５ μｇのＣＤ４０／Ｆｃを含有する第２ガラス管に該溶液を移して、この反応混合 液を４°Ｃで２０分間インキュベートした。２ｍｌ充填容員０セファデックス（ 登録商標）Ｇ−２５（ングマ）でゲル濾過することによってこの反応混合物を分 画してから、２．５％（ｖ／Ｖ）ラン血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０．２％（ ｖ／ｖ）ナトリウムアジド及びｐＨ７，４の２０ｍＭＨＥＰＥＳ結合培地を含有 するＲＰＭ１１６４０培地中で平衡化した。最終プールの”ｌＣＤ４０／Ｆｃを 結合培地中ｌＸｌ０−”Ｍの作業ストック溶液に希釈して、レセプター結合活性 の検出し得る損失なしに４℃で１力月まで貯蔵した。

約５０〜６０％の標識取り込みが認められた。放射性ヨウ素化は、１×１０＋５ 〜５Ｘ１０１ｓｃｐｍ／ｎｍｏｌの範囲の比活性をもたらした（タンパク質の分 子当たり放射性ヨウ素原子０．４２〜２，０）。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル 電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、予想値と一致する単一の標識ポリペプチ ドの存在が明らかとなった。該標識融合タンパク質は、９８％トリクロロ酢酸（ ＴＣＡ）より大きい沈澱性であった。これは、１０１が該タンパク質に共有結合 したことを示している。

実施例２ この実施例は、ＣＤ４０−Ｌを発現すると推定される細胞系の選択を説明するも のである。実施例１に記載した放射標識ＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質を用いて 幾つかの細胞系をスクリーニングした。簡単に説明すると、標準法に従って定量 的な結合性研究を行い、種々の細胞系についてスキャッチャードプロットを得た 。クローン細胞系（ＥＬ−４，ＡＴＣＣカタログＴＩＰ３９）マウス胸腺腫細胞 系を同定して選別した。選別に先立って、Ｅ　Ｌ　−４細胞が細胞当たり約４５ ０分子のＣＤ４０−Ｌを発現することを見出した。７回選別細胞をＥＬ−４０， ７と呼び、これを成育させると細胞当たり約１０，０００分子のＣＤ４０−Ｌを 発現することが見出された。最後に、９回選別細胞をＥＬ−４０，９と呼び、こ れを成育させると細胞当たり約１５．０００分子のＣＤ４０−Ｌを発現すること を見出された。

実施例３ この実施例は、マウスＣＤ４０−Ｌの発現クローニングのためのｃＤＮＡライブ ラリーの調製を説明するものである。該ライブラリーは、ＥＬ−４０，５と呼ぶ マウス胸腺腫細胞系ＥＬ−４（Ａ、ＴＣＣＴＩ　Ｐ３９）の５回選別クローンか ら調製した。ＥＬ−４０，５細胞は、ＦＡＣ３（蛍光活性化セルソーター）中、 ビオチニル化ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質で５回選別したＥＬ−４細胞であっ た。

米国特許第４．９６８，６０７号に本質的に記載されたＥＬ−４０，５から得た ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作った。なお、この開示内容は参照によりこ こに組み入れられるものとする。簡単に説明すると、ＥＬ−４０，５細胞系から 抽出したトータルＲＮＡから単離したポリ（Ａ）”　ｍＲＮＡの逆転写によりｃ ＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブラリー構築法は、オウスベル（＾ｕｓ ｕｂｅｌ）ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１．　（１９８７）に記載された方法と 実質的に同じであった。ポリ（Ａ）”　ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロースクロ マトグラフィーにより単離し、二本鎖ｃＤＮＡは、実質的にガブラー（Ｇｕｂｌ ｅｒ）ら。

Ｇｅｎｅ　２５：２６３．１９８３に記載された通りに作った。ポリ（Ａ）”　 ｍＲＮＡ断片を、ランダムへキサヌクレオチドをプライマーに用いて逆転写酵素 によりＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに転化した。次いで、ＲＮアーゼＨをＤＮ ＡポリメラーゼＩと組み合わせて用いて、該ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを二 本鎖ｃＤＮＡ断片に転化した。生成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラー ゼでプラントエンド型にした。

５ａｌＩアダプター ５’−ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＧＣＴ−３ ゜ＧＡ　ＣＣＴ　ＴＧＣＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＣＧＡ−５’を、ヘイマーレ （Ｈａｙｍｅｒｌｅ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：８ ６１５．１９８６に記載されているようにして、生成したプラントエンド型ｃＤ ＮＡの５′末端に連結した。

６８℃でのゲル濾過クロマトグラフィーにより未連結アダプターを除いた。これ は、２４ヌクレオチド非自己相補的（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｒｙ）オーバーハングをｃＤＮＡ上に残した。同じ操作を用いて、哺乳動物発 現ベクターｐＤｃ４０６の５’５ａｌｌ末端を、ｃＤＮＡに付加したものと相補 的な２４ヌクレオチドオーバーハングに転化した。アダプター化ベクターとｃＤ ＮＡの最適割合をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で連結した。透析した 連結混合物を大腸菌株ＤＨ５α内にエレクトロポレーションで取り込ませ、アン ピシリンプレート上で形質転換体を選択した。

プール当たり約２．０００クローンの形質転換大腸菌からなる複数のプールから プラスミドＤＮＡを単離した。ＤＥＡＥ−デキストランを用いて、単離したＤＮ ＡをＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞の不完全集密層内に形質移入し、続いてルスマン（Ｌ ｕｔｈｍａｎ）ら、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：１２９５．１ ９８３及びマクカッチャン（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ）ら、　Ｉ、　Ｎａｔｌ、　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　４１：３５１．１９８６に記載された操作に実質的に 従ってクロロキン処理を行った。

ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞を完全培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍ １ペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭ　Ｌ−グルタミン を含有するダルベツコ修飾イーグル培地）中に維持し、１ウエル有室スライド（ ｃｈａａ＋ｂｅｒｅｄ　５ｌｉｄｅｓ）　（Ｌ　ａ　ｂ　−Ｔ　ｅ　ｋ　）に約 ２Ｘ１０５細胞／ウエルの密度でプレートした。該スライドを１ｍｌヒトフィブ ロネクチン（１０μｇ／ｍ１ＰＢＳ）で３０分間前処理し、続いてＰＢＳで１回 洗浄した。１層に成育している粘着細胞から培地を除いて、６６．６μＭクロロ キンサルフェートを含有する１、５ｍｌ完全培地に置き換えた。約０．２ｍｌの ＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中ｉ：２μｇＤＮＡ、０．５ｍｇ／ ｍ１ＤＥＡＥ−デキストラン）を該細胞に加えて、該混合物を３７℃で約５時間 インキュベートした。インキュベーション後、培地を除いて１０％ＤＭＳＯ（ジ メチルスルホキシド）を含有する完全培地を添加することによって、該細胞に２ ．５〜２０分間衝撃を与えた。衝撃を与えた後、溶液を新たな完全培地と置き換 えた。細胞を２〜３日間培養して成育させて、挿入したＤＮＡ配列を一過性発現 させた。これら条件により、生存するＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞中、３０〜８０％の 形質移入頻度がもたらされた。

実施例４ この実施例は、実施例１で作った標識ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質での実施例 ３で作った発現クローニングライブラリーのスクリーニングを説明するものであ る。４８〜７２時間後、実施例１で調製した放射性ヨウ素化ＣＤ４０／Ｆｃ融合 タンパク質を用いて、実施例３で作ったＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞の形質移入単層を 、ＣＤ４０−Ｌの発現についてスライドオートラジオグラフィーにより分析した 。形質移入ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞を結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ ：／　（ＢＳＡ）　、２ｍｇ／ｍｌナトリウムアジド、ｐＨ７，２の２０ｍＭＨ ＥＰＥＳ、及び５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭ１１６４０）で１度洗 浄し、１　ｘ　１０″’Ｍ　”’　ｌ−ＣＤ４０／Ｆ　ｃ融合タンパク質を含有 する結合培地中で４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、該 有室スライド内の細胞を結合培地で３回洗浄し、続いてＰＢＳ　（ｐＨ７，３） で２回洗浄して未結合放射標識融合タンパク質を除いた。

ＰＢＳ中の１０％グルタルアルデヒド中でインキュベート（室温で３０分間）す ることによって該細胞を定着させ、ＰＢＳ中で２回洗浄して風乾した。該スライ ドをコダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（水で６倍希釈）中に漬け、そして光遮断ボ ックス内の暗所で２〜４日間室温で露光した。該スライドをコダ・ツクＤ１９現 像液中で現像し、水で濯いでＡｇｆａＧ４３３Ｃ定着剤中で定着した。該スライ ドを２５〜４０×の倍率の顕微鏡で個別に検査した。明るいノく・ツクグランド に対するオートラジオグラフィーの銀粒子の存在により、ＣＤ４０−Ｌを発現す る細胞を示す陽性のスライドを特定した。

約２０００の別々のクローンを含有する１つのプールが、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タ ンパク質との結合について強い陽性と同定された。このプールを力価測定してプ レートし、それぞれ約２００コロニーを含有するプレートを得た。各プレートを 掻き取って、上記と同じ操作に従ってＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞内に形質移入するた めにプールしたプラスミドＤＮＡを得た。先に記載したスライドオートラジオグ ラフィーにより該より小さなプールをスクリーニングした。該小さなプールのう ちの１つについて、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に結合できる発現遺伝子産物 が存在することが示され、これがＣＤ４０−Ｌについて陽性であるクローンを含 有した。

この陽性の小さなプールを力価測定してプレートし、別々のコロニーを得た。

約４００の別々のコロニーを採取して９６ウエルプレートの別々のウェル内の培 養培地に接種した。行及び列毎にプールすることにより培養物を混合し、該混合 した培養物を用いて最終ラウンドの形質移入及びスクリーニング用のＤＮＡを調 製した。陽性行及び陽性列の交叉部分が強い陽性コロニーであることを示した。

１０の強い陽性コロニー（即ち、候補クローン）を同定した。それぞれの候補ク ローンからＤＮＡを単離して、形質移入及びスクリーニングを行った。５候補ク ローンがＣＤ４０／Ｆｃへの結合により陽性であった。５陽性候補クローン全て が１４６８ヌクレオチドのｃ　ＤＮＡ７９１人体を含有することが、ジデオキシ ヌクレオチド配列決定法により確認された。該ＣＤ４０−ＬクローンのｃＤＮＡ コーティング領域は、図１及び配列番号：１の配列に対応する。

ｐＤｃ４０６−ｍｃＤ４０−Ｌと命名した、マウスＣＤ４０−Ｌ配列を含有する クローニングベクターを、１９９１年１２月６日にアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ　（ＡＴＣＣ）に、受託番号６８８７２ で寄託した。このクローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号 ＝１及び図１に示した。

実施例５ この実施例は、マウスＣＤ４０−Ｌの配列からデザインしたプローブを用いてヒ トＣＤ４０−Ｌ同族体を単離するのに用いた種間交叉ハイブリダイゼーション法 を説明するものである。マウスＣＤ４０−ＬクローンｐＤｃ４０６−ＣＤ４０− Ｌからコーティング領域（ヌクレオチド１３からヌクレオチド７９３まで）を切 り取り、ランダムプライマー（ベーリンガー・マンハイム）を用いて該断片を３ ２ｐ標識することによって、マウスＣＤ４０−Ｌプローブを作った。

λｇｔｌｏアームを用いて、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｃＤＮＡライブラリ ーをλフアージベクター内に構築し、市販のキット（ギガパック（登録商標）ス トラタジェン、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、メーカーの説明書に従って１ｎｖ ｉｔｒｏでパッケージングした。該ＰＢＬ細胞は、正常なボランティアから得、 １０ｎｇ／ｍｌの０ＫＴ３　（抗ＣＤ３抗体）、及びＬｏｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ −２（イムネックス、シアトル、ＷＡ）で６日間処理したものである。該ＰＢＬ 細胞を洗浄し、５００　ｎ　ｇ／ｍ　＋イオノマイシン（カルバイオケム）及び １０ｎｇ／ｍＪ　ＰＭＡ　（シグマ）で４時間刺激した。該刺激したＰＢＬ細胞 からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを得て、メーカーの説明書に従ってλｇｔｌＯファー ジベクター（ギガバック（登録商標ンストラタジエン）内にパッケージングした 。

該マウスプローブを、６ｘＳＳＣ（１５ｍＭクエン酸トリナトリウム、及び１６ ５ｍＭ塩化ナトリウム）、１×デンハルツ溶液、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％Ｎ ｐ４０中、６３℃で一晩、ファージｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。ハイブリ ダイゼーションに続いて、３ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで、約５５℃で３時間洗 浄した。オートラジオグラフィーにより、特異的なバンドを可視化した。

ｈｃＤ４０−Ｌと命名した、ヒトＣＤ４０−Ｌ配列を含有するクローニングベク ターを、１９９１年１２月６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン、ロックビル、ＭＤ　（ＡＴＣＣ）に、受託番号６８８７３で寄託した。この クローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１１及び図２に 示した。

実施例に の実施例は、ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞内での膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの発現を説 明するものである。マクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら、　ＥＭＢＯＪ、　１０： ２８２１．、１９９１に記載され、本明細書の実施例３に記載した方法の如き標 準法を用いて、ＷＡＶＥＯベクター内のマウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡ又は空のＷ ＡＶＥＯベクターをＣＶｌ、−ＥＢＮＡ細胞内に形質移入した。簡単に説明する と、１０％ウシ胎児血清を補充した１０ｍ１のダルベツコ最小必須培地（メディ アム）に、１０ｃｍ培養皿当たり２Ｘ１０’細胞の密度でＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞 をプレートした。細胞を３７℃で一晩粘着させた。該メディアムを、６６．７μ Ｍクロロキン及びｍｃＤ４．０−Ｌをコードする５μｇのｃＤＮＡを含有するＤ ＮＡ混合物を含有する１、５ｍｌのメディアムと置き換えた。１７５μｌ及び２ ５μＩのＤＥＡＥデキストラン（ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌ）を含む培地も該細胞に 添加した。該細胞とｃＤＮＡを３７°Ｃで５時間インキュベートした。該ｃＤＮ Ａ混合物を除いて、１０％ＤＭＳＯを含有する１ｍｌの新たなメディアムで該細 胞に２．５分間衝撃を加えた。該メディアムを新たなメディアムと置き換えて、 細胞を少なくとも３日間成育させた。

実施例７ この実施例は、ＣＤ４０−Ｌに対するモノクローナル抗体の調製を説明するもの である。精製マウスＣＤ４０−Ｌ又はヒトＣＤ４０−Ｌの試料を、ここに記載し たＣＯ８細胞発現及びＣＤ４０／ＦＣアフイニテイ精製により調製する。精製Ｃ Ｄ４０−Ｌは、慣用法、例えば、米国特許第４．４１１．９９３号に８Ｆ、載さ れた方法を用いて、ＣＤ４０−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成することが できる。

簡単に説明すると、ＣＤ４０−Ｌを免疫原として完全フロインドアジュバント中 に乳化し、１０〜１００μｇの範囲の量を皮下又は腹腔内注射してマウスを免疫 感作する。１０〜１２日後、免疫感作した該動物に、不完全フロインドアジュバ ント中に乳化したＣＤ４０−Ｌを追加注射する。その後、週１回から週２回の免 疫スケジュールでマウスを周期的に注射する。ＣＤ４０−Ｌ抗体についてドツト プロット分析又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）により試験するために 、眼縁後部からの採血又は尾の先端の切除により、血清サンプルを周期的に採取 する。

適当な抗体力価の検出に続いて、食塩水中のＣＤ４０−Ｌを陽性マウスに最後に １回静脈内注射する。３〜４日後に、該動物を殺して、牌臓細胞を採取し、モし て牌臓細胞をマウスミエローマ細胞系（例えば、ＮＳＩ又はＡｇ８．６５３）と 融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成し、これをＨＡＴ　（ハイポ キサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中でマルチプルマイクロタ イタープレートにプレートして、未融合細胞、ミエローマハイブリッド、及び牌 臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。

エングバル（Ｅｒ＋ｇｖａ１．ｌ）ら、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　８：８７１ ．１９７１及び米国特許第４，７０３゜００４号に開示された方法を適用して、 精製ＣＤ４０−Ｌに対する反応性について、このハイブリドーマ細胞をＥＬ　Ｉ ＳＡによりスクリーニングする。陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ 　／　ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＣＤ４０−Ｌモノクローナル抗体 を含有する腹水を得ることができる。また、種々の方法により、ハイブリドーマ 細胞をフラスコ又は回転容器中でｉｎ　ｖｉｔｒｏで成育させることができる。

マウス腹水中に生成したモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈澱をしてか らゲル排除クロマトグラフィーに付することによって精製することができる。ま た、ＣＤ４０−Ｌへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーができるの で、プロティンＡ又はプロティンＧへの抗体結合に基づくアフィニティクロマト グラフィーを用いることもできる。

この実施例は、５ｃＤ４０及びＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質の抗アレルギー治 療作用を説明するものである。可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／ＦＣを、２ドナ− ＭＬＣ系におけるＩＩ、−４（５μｇ／ｍｌ）誘導ＩｇＥ分泌を阻害するそれら の能力について試験した。３実験からのデータを表１に示す。

表１ １　ｇ　Ｅ　（ｎｇ／ｍｌ） 添加　実験１　実験２　実験３ 培地　＜０．１　＜０．１　＜０．Ｉ ＩＬ−４２４４７５４ ＩＬ−４＋　５ｃＤ４０　（０，１μｇ／１１１）　１９　ｎ　ｄ　３８ＩＬ− ４＋　５ｃＤ４０　（０，３μｇ／ｍｌ）　１４　２９　２４ＩＬ−４＋　５ｃ Ｄ４０　（１μｇ／ｍｌ）　１０　２４．　８ＩＬ−４＋　５ｃＤ４０　（３μ ｇ／ｍｌ）　７　１９　２ＩＬ−４＋　ｒＬ−７Ｒ／Ｆｃ　（１０μｇ／ｍｌ） 　２１　ｎ　ｄ　５８培′＃：１２日後にＩｇＥレベルをＥＬＩＳＡ法により測 定した。簡単に説明すると、ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）で１：５００に希釈し たマウスｍＡｂ抗ヒトＩｇＥ（ジメド（ｚｙｍｅｄ））で平底９６ウエルマイク ロタイタープレート（コーニング）をコーティングした。３回洗浄した後、５％ 脱脂粉乳を用いて遮断工程を行い、続いてヒトＴｇＥスタンダード又は試験上澄 み液を滴定した。３回洗浄した後、ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＥ　（キルケガ ード（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）及びべり−（Ｐｅｒｒｙ））を１：５００の希釈 度で添加した。この後、更に洗浄し、次いで、１：５００の希釈度でストレプト アビジン−ＨＲＰ（ジメド）を添加した。更に洗浄した後、ＴＭＢ基質（キルケ ガード及びぺり−）を用いて反応を行い、５２０ｎｍで吸光度を測定した。全て の洗浄工程は、ＰＢＳプラス０．０５％ツイーン中で行った。

全てのインキュベーション工程は、１００μｌ／ウエルの容量で室温で１時間行 った。この測定法の感度は、１１００ｐ／ｍｌである。

この実施例は、可溶性ＣＤ２３がＩＬ−４（５μｇ／ｍｌ）刺激Ｂ細胞から脱落 するのを阻害する５ｃＤ４０及びＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質の作用を説明す るものである。可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／ＦＣを、２ドナ−ＭＬＣ系におけ るＩＬ−４誘導５ＣＤ２３脱落を阻害するそれらの能力について試験した。３実 験からのデータを表２に示す。

表２ ｓ　ＣＤ　２３　（ｎｇ／ｍｌ） 添加　実験１　実験２　実験３ ６日目　１２日目　６日目　１２日目　６日目　１２日目Ｅ−十培地　５５＜０ ．５　２４　１０　１０　５＋ＩＬ−４１１５５５９６６２４４２７＋ＩＬ−４ ＋ｓＣＤ４０（ｌｌ１ｇ／ｍｌ）　ｎｄ　ｎｄ　８８　３６　３８　９＋ｒＬ− ４＋！？ＣＤ４０（３１１ｇ／ｍｌ）　９７　４　８２　３１　４０　４＋ＩＬ −４＋５ＣＤ４０（１０μｇ／ｍｌ）　ｎｄ　ｎｄ　７２　２８　ｎｄ　ｎｄ＋ ＩＬ−４＋ＩＬ−７Ｒ／Ｆｃ（３μｇ／＋ａｌ）１１１　４８　１０３　６７　 ４０　２２ＰＢＭ十培地　１２＜０．５　１５　５　３　１０＋ＩＬ−４３９２ ５５４７２２４８２６＋ＩＬ−４＋５ＣＤ４０（ｌμｇ／ｍｌ）　ｎｄ　ｎｄ　 ４．４　１８　４６　１８＋ＩＬ−４＋５ＣＤ４０（３μｇ／ｍｌ）　２４　６ 　３７　１１　４５　１２＋ルー４＋５ＣＤ４０（１０／ｌ／ｍｌ）　ｎｄ　ｎ ｄ　２８　５　ｎｄ　ｎｄ＋ＩＬ−４＋ＩＬ−７Ｒ／Ｆｃ（３μｇ／ｍｌ）　３ ５　２６　４３　２０　５０　２３培養６及び１２日後に市販の５ｃＤ２３Ｅｌ ｒｓＡ検出キット（ビンディング・サイト、サンディエゴ、ＣＡ）により可溶性 ＣＤ２３レベルを測定した。その感度限界は５００ｐｇ／ｍｌであった。約ｌＸ ｌ０’細胞／ウエルを、平底９６ウエルマイクロタイタープレート（インターマ ウンテン・サイエンティフィック、バウンチファル、ＵＴ）で、表２に示した時 間、示した添加物の存在下又は不存在下で３重に培養した。結果は５ＣＤ４０の 抗アレルギー作用を示している。ｓＣＤ４０の代わりにＣＤ４０／ＦＣを用いて 類似の研究を行い（データは示していない）、類似の結果が得られた。従って、 実施例８及び９のこれらデータは、ＣＤ４０についての抗アレルギー特性を示す ものである。

実施例１０ この実施例は、ヒトＢ細胞についての膜結合マウスＣＤ４０−ＬのＢ細胞増殖活 性を説明するものである。ヒストバク−（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）　（登録商標 ）（シグマ。

セントルイス、ＭＯ）での密度勾配遠心分離により、正常なボランティアからの 末梢血からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。臭化２−アミノエチル イソチオウロニウム処理５ＲＢＣ（ヒツジ赤血球）でのロゼッティング及び更に ヒストバク−での密度勾配遠心分離によりＴ細胞を除くことによって、細胞（Ｅ −）のＴ細胞除去試料を得た。１０％熱不活性化ウシつ児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）を 加えたＰＲＭＩ培地中、３７℃、１０にＣＯ２雰囲気下で、Ｂ細胞増殖分析をＥ −試料で行った。約ｌＸ１０５　Ｅ−細胞／ウェルを、平底９６ウエルマイクロ タイタープレート（コーニング）で、７日間、形質移入ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞（ 実施例６に記載した）の存在下で３重に培養しこ。該ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞は、 マウスＣＤ４Ｏ−ＬｃＤＮＡ又は空ベクターで形質移入されたものである。培養 の最終８時間、該細胞を１μＣｉ／ウエルのトリチウム標識チミジン（２５Ｃｉ 　／ｎｍｏｌｅ　。

アマジャム、アーリントンハイト、ＩＬ）でパルスした。自動細胞採取装置でグ ラスファイバーディスク上に細胞を採取し、取り込まれたｃｐｍを液体ンンチレ ーションスベクトロメトリにより測定した。

図４８は、空ベクター（ＨＡＶＥＯ）又はＨＡＶＥＯベクター中のマウスＣＤ４ Ｏ−ＬｃＤＮＡで形質移入されたＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞のヒトＢ細胞増殖の比較 を示している。これらデータは、膜結合ＣＤ４．０−Ｌが、協同分裂促進因子の 不存在下でヒトＢ細胞増殖を刺激することを示している。図４ｂは、培養物中に １０　ｎ　ｇ／ｍ　］のヒトＩ　Ｌ−４を添加した以外は同じ実験を示している 。この実験では、ｒＬ−４が膜結合マウスＣＤ４０−ＬのＢ細胞分裂促進活性を 僅かに増進 している。図５は、図４ｂに示した実験を繰り返したものである。しかしながら 、該実験を繰り返した場合には、ＩＬ−４協同分裂促進活性の形跡はなかった。

ＣＤ４０−Ｌの分裂促進活性の形跡はあった。従って、膜結合ＣＤ４０−Ｌはヒ トＢ細胞の増殖を刺激する。

実施例１１ この実施例は、実施例１０で単離したＥ”細胞からのＩｇＥ産生及びＣＤ２３脱 落を刺激する膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの作用を説明するものである。約１×１ ０５細胞／ウエルを平底９６ウエルヌンクマイクロタイタープレート（インター マウンテン・サイエンティフィック、バウンチファル、ＵＴ）で、イスコツ（Ｉ ｓｃｏｖｅ、　ｓ）修飾ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）プラス１０％ＦＣ３中、１ ０％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３重に培養した。培地には、５０μｇ／ｍｌヒトト ランスフェリン（シグマＬ０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ）及びそれぞれ １μｇ／ｍｌのオレイン、リルイン及びパルミチン酸（シグマ）を補充した。５ 重ｇ／ｍｌヒトＩＬ−４の存在下で、Ｅ−細胞を１０日間培養した。マウスＣＤ ４０−Ｌ又は空ベクターで形質移入したある力価のＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞を添加 した。

１０日後、実施例８に記載したＥＬＩ　ＳＡ法によりＩｇＥを又は実施例９に記 載した方法によりＣＤ２３脱落を分析した。

図６は、Ｅ−細胞と空ベクター（ＷＡＶＥＯ）又はＣＤ４０−Ｌで形質移入され たＣＶＩ−ＥＢＮＡＭＢ胞の培養物について、上澄み液中のＩｇＥ産生（ｎｇ／ ｍｌ）の比較を示している。３０００ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞までは差が見られな いが、１００００又は３００００のＣＤ４０−Ｌ形質移入ＣＶＩ−ＥＢＮＡＩＩ ［ｌ胞の添加で、有意なＩｇＥ産生がもたらされた。比較として、Ｅ−細胞を培 地単独で又は５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　Ｉ　Ｌ−４と共に又は５重ｇ／ｍ１ｌＬ−４ プラス５００ｎｇ／ｍ１Ｇ２８−５抗体と共にインキュベートした場合、ＩｇＥ 産生はそれぞれ４゜７．２．９及び＞６００ｎｇ／ｍ＋であった。図７において 、ＣＤ２３脱落を測定した場合、ＣＤ４０−Ｌで形質移入された１００００又１ １３００００（７）ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞は、空ベクターコントロールＣＶＩ− ＥＢＮＡ細胞に比較して、増加したＣＤ２３脱落を示した。比較として、Ｅ−細 胞を培地単独で又は５重ｇ／ｍ１ＩＬ−４と共に又は５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　Ｉ　 Ｌ−４プラス５００ｎｇ／ｍ１Ｇ２８−５抗体と共にインキュベートした場合、 ＣＤ２３脱落はそれぞれ＜０．１．２．４及び１．１．２重ｇ／ｍｌであった。

これらデータは、ＩｇＥ産生及びＣＤ２３脱落の両方が膜結合ＣＤ４０〜Ｌに付 随する生物活性であることを示している。

実施例１２ この実施例は、Ｂ細胞増殖活性、ポリクローナルイムノグロブリン（Ｉｇ）産生 、抗原特異性抗体形成及び膜結合及び可溶性ＣＤ　４．０−　Ｌを臨床応用に用 いる種々の方法を説明するものである。本発明者らは、前記のグラブシュタイン ら■、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキーら工１に記載さ れた操作に従って、マウス牌臓Ｂ細胞を得た。簡単に説明すると、Ｔ細胞抗血清 及び補体を用いるＴ細胞除去及び、セファデックス（登録商標）６１０カラムに 通すことによる粘着細胞除去、及びヤギ抗マウスＩｇＭでコーティングしたベト リ皿上でのパンニングによるＢ細胞陽性選択により、細胞の混合培養物を精製し た。精製したＢ細胞を、ＲＰＭＩ、ウシ胎児血清（Ｂ細胞増殖分析用に５％及び プラーク形成細胞分析又はポリクローナル抗体分析用に２０％）、２−メルカプ トエタノール、抗生物質、アミノ酸、及びピルベート中で培養した。Ｂ細胞増殖 は、実施例１０及び前記のグラブツユタインら■、前記のマリスゼウスキーら■ 及び前記のマリスゼウスキーらＩＩに記載された測定法に従って測定した。抗原 特異性抗体形成は、グラブシュタインら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　２：１９９．１９８６　［グラブツユタインらＩＩ）に記載され た操作に従って測定した。簡単に説明すると、抗原特異性抗体形成は、抗原とし てヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（０，０３％ｖ　／　ｖ　）を１ｍｌ当たり１×１ ０６マウスＢ細胞の培地２．０ｍｌ中で用いた。該Ｂ細胞培養物を５日間インキ ュベートして、前記のグラブツユタインらＩＩに記載されたイエルネ溶血プラー ク測定法により、プラーク形成細胞を測定した。細胞数はコールタカウンター（ ｃｏｕｌ　ｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。ポリクローナルＩｇ分泌は、 前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキーら１工に記載されたよ うにして、２．０ｍｌ培地当たりｌＸ１０’Ｂ細胞の７日目培養物中で、アイソ タイプ特異的ＥＬＩＳＡ分析法により測定した。

ＣＤ４０−Ｌ若しくは空ベクターで形質移入されたＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞、又は ７Ａ１細胞（Ｔ細胞ヘルパークローン）によるＢ細胞増殖の結果を図８．１０及 び１２に示す。これらデータは、ＣＤ　４０−　Ｌにより最も大きいＢ細胞増殖 が生じたことを示している。Ｔ細胞ヘルパー細胞７Ａ１及び７Ｃ１は、Ｂ細胞増 殖に小さな作用しか有さなかった。

抗原特異性抗体形成に関する種々の細胞の作用を図９及び１１に示す。図９は、 プラーク形成細胞を、Ｔ細胞ヘルパークローン７Ａ１と可溶性ＣＤ４０−Ｌを分 泌するマウスＥＬ−４０，９細胞とを比較しながら示している。ＥＬ−４０，９ 細胞は、抗原特異性抗体形成に関して阻害的作用を有しているようである。図１ １は、Ｔ細胞ヘルパー細胞７Ｃ２及び空ベクター又はＣＤ４０−Ｌのいずれかで 形質移入されたＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞についてのＰＦＣ（プラーク形成細胞）を 示す。

７Ｃ２細胞及び膜結合ＣＤ４０−Ｌの両方が、抗原特異性抗体形成（ＰＦＣ）を 刺激した。図１，３は、１０ｎｇ／ｍ＋インターロイキンー２　（ＩＬ−２）の 存在下又は不存在下でのＣＤ４０−Ｌ及び７Ａ１細胞の抗原特異性抗体形成を比 較している。ＩＬ−２は、７Ａ１細胞についてＰＦＣを増加したが、膜結合ＣＤ ４０−Ｌにより生ずるＰＦＣを増加しなかった。

マウスＢ細胞によるポリクローナル１ｇ産生を、刺激又は阻害について、サイト カインＩＬ−４（Ｌｏｎｇ／ｍｌ）及びＬＬ−５（ＣＯ５細胞上澄み液の１・４ ０希釈液）の存在下で又はサイトカインを添加せずに、膜結合ＣＤ４０−Ｌ、、 コントロールＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞及びヘルパーＴ細胞７Ａ１で比較した。Ｉｇ Ａ、１ｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ及びＩｇＧ１の量をそれぞれ表３〜 ８に示す。

表３ Ｉ　ｇＡ、　ｎ　ｇ／ｍ　１ ＃細胞数　培地　＋ＩＬ−４＋ＩＬ−５ＣＤ４０−Ｌ　２　ｘ　１０’　６６６ ．２７５±１７４．４４４　６４．６３９±５１．７８０１　Ｘ　１０’　２８ ８．０８５±　２０．７７３　２９１．８３１±１０．６７３１　Ｘ　１０’　 ５３．７５０±　３６．５３１　９１０．０７２±６２．７１３ＨＡＶＥＯ２Ｘ 　１０’　０　６２８．１９０　＋　４２．９０７１　ｘ　１０’　０　４７７ ．７５５土５７．４７８１　Ｘ　１．０’　０　２９５．６４０±１２．７３６ ７Ａ１（２Ｃ１１）　Ｉ　Ｘ　１０’　０　２１７７．５４９±３７７、０５２ ２　Ｘ　１０’　０　６４６．８９８±８６．３２５１　Ｘ　１０’　０　４８ ０．６７１±４０．０１１培地　０　４５８．１５２±７７、２５８Ｌ　Ｐ　Ｓ 　８８．５３１±　３１．２４８　１３２．３３６±５１．３５６表４ １ｇＧ３．　ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数　培地　＋ＩＬ−４＋ＩＬ−５ＣＤ４０−Ｌ　２　ｘ　１０’　１０８ ．４２７±　１４．３５９　０１　Ｘ　１０’　１１８．０７９±　８．０２１ 　４６．５３５±　９８９９１　Ｘ　１０’　１２７．５９１±　６．２６８　 ４６７．０２３±７８．２７６ＨＡＶＥＯ２ｘ　１０’　０　２９．７７３　＋ 　５．２２４１　Ｘ　１０５１．１．２０５±　４．４３，１　６６．３２３± 　８．６７３１　Ｘ　１０’　２６．３８９±　１０．２２１　３４．６７１± １２．９７５７Ａ１（２Ｃ１１）　ＩＸｌ、０’　３３．４２０±　９．９７２ 　８２０．８５６±３９．４４２２　Ｘ　１０６０　４３６．０７４±５９．３ ３２１　Ｘ　ｔｏ’　０　２３９．７６０±４５．９７８培地　２１．８０８± 　７．１０７　６４．７７３±１３．９２４Ｌ　Ｐ　Ｓ　８１６．６９７±４３ ．５５３　１０３．７２０士比８Ｓ３表５ ＩｇＥ、　ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数　培地　士比−４＋ＩＬ−５ ＣＤ４０−Ｌ　２　Ｘ　１０５０　６４．１４４±　４．９７９１　Ｘ　１０’ 　０　８３．４９３±　９．０９３１　Ｘ　１０’　０　４６１．１５５±６０ ．５１４ＨＡＶＥＯ２Ｘ１０’　０　０ １　Ｘ　１０’　０　４．２０８±　０．５２７１　Ｘ　１０’　０　０ ７Ａ１（２Ｃ１１）　１　ｘ　１０’　０　２０８．０９１±　８．０９０２　 Ｘ　１０５０　３２．５３０±　０．７２３１　Ｘ　１０’　０　１５．８８９ ±　２．９４７培地　０　１２．６０２±　１．４６０Ｌ　Ｐ　Ｓ　Ｏ４０８， ３５５±　９．７６４表６ ＩｇＧ２ｂ、　ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数　培地　＋ＩＬ−４＋ＩＬ−５ＣＤ４０−Ｌ　２ｘｌＯ５００ １Ｘ　１０’　０　６．２３０±０．２８５１、　Ｘ　１０’　０　４７．４１ ４±０．２４１ＨＡＶＥＯ２ｘ　１０’　０　７．００１±２．３５８１　Ｘ　 １０’　０　６．２３０±２．２８５１　Ｘ　１０’　０　９．６２０±２．６ ５０７Ａ１（２Ｃ１１）　１．　Ｘ　１０’　０　１８９．３４３±２．８３７ ２　ｘ　１０’　０　２２．４３１　＋　６．８３５１　ｘ　１０’　０　７． ２０７±１．５８０培地　０　７．４２２±　１．６０２ Ｌ　Ｐ　Ｓ　０　３３．２９１±３．１８３表７ ＩｇＭ、　ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数　培地　＋ＩＬ−４＋ＩＬ〜５ＣＤ４０−Ｌ　２　Ｘ　１０’　１．８ ０５±　０．６３９　０．４３９±　０．１８４１、　Ｘ　１０’　２．２３７ ±０．５８３　５．８７８±０．８５８１、　Ｘ　１０’　２．２９３±０．５ ９５　９６．７３０±１３．００９ＨＡＶＥＯ２Ｘ　１．０５０　１０．８９０ ±２．１２６１　Ｘ　１０５０　１３．３０３±０．９９３１　Ｘ　１０’　０ ．６２４±０．１７８　２２．５３８±２．３０４７Ａ、１（２Ｃ１１）　Ｉ　 Ｘ　１０’　０．７６９±　０．１２４　１０４．８５７±１７．４６３２　Ｘ 　１０’　０．１４２±０．０５２　２７．０１６±１．．７０６ｉ　Ｘ　１． ０’　０．１２６±０．０４８　１３．０７０±０．６００培地　０２３１±　 ０．０５７　３６．８０９±　２．８６０Ｌ　Ｐ　Ｓ　５３．３０２±９．６６ ８　４１．９７４±６１５８表８ ＩｇＧ１．　ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数　培地　＋ＩＬ−４＋ＩＬ−５ＣＤ４０−Ｌ　２Ｘ１０５０　１３０． １８５±２４．５４７１　Ｘ　１０５０　３１．０．５８８±　１．２６１１　 Ｘ　１０’　０　２７０．７２７±１７．５１１ＨＡＶＥＯ２ｘ　１０５０　１ ８７．６６８±５７．７３０１　Ｘ　１．０’　０　４３．３２０±４９．７７ ０１、　Ｘ　１０’　０　１３６３．４６４±４５．８４１７ＡＩ（２Ｃ１１） 　Ｉ　Ｘ　１０’　０　１４５．６５２土１３６．０７０２　Ｘ　１０５０　３ ６５．５６３±２４．２７６１　Ｘ　１０５０　４４９．４７５±１０１．０１ ２培地　０１３３．６６０±３８６．２３１Ｌ　Ｐ　３　０　２４６．２１３± ２１．５２にれらデータは、ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用が、抗原特異 性抗体産生及びポリクローナルＩｇ分泌の両方へのＢ細胞成長及び分化のＴ細胞 接触依存性誘発を司る主要な分子性相互作用であることを示している。そういう ことであるから、これらデータは、可溶性ＣＤ４０、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパ ク質及びできるだけ可溶性のＣＤ４０−Ｌ　（モノマー）によるこの相互作用の アンタゴニストが、抗体応答の発生を有意に防げることを示唆している。従って 、ＣＤ４０、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質及び可溶性ＣＤ４０−ＬがＣＤ４０ アンタゴニストとして有用な臨床的状況には、アレルギー、狼癒、慢性間接リウ マチ、インシュリン依存真性糖尿病、及び自己免疫抗体又は抗原／抗体複合体が その疾患の臨床病理学上の原因である他のあらゆる疾患が含まれる。更に、膜結 合ＣＤ４０−Ｌ又はオリゴマー可溶性ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖及び抗体産生 を刺激するのに有用であろう。そういうことであるから、ＣＤ４０−Ｌのこれら 形態は、ワクチンアジュバントに及びハイブリドーマ細胞からのｍＡｂ分泌のた めの刺激剤として最も有用である。

実施例１３ この実施例は、末梢血単核細胞（Ｅ−）の増殖及びそれからのＩｇＥ分泌への膜 結合ＣＤ４０−Ｌの作用を説明するものである。実施例１０に記載した操作に従 ってＥ−細胞を得て、空ベクター又はｍｃＤ４０−ＬｃＤＮＡで形質移入された ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞の存在下で７又は１０日間インキュベートした。更に、Ｃ Ｄ４０／ＦＣ融合タンパク質（実施例１に記載）又はＴＮＦレセプター／Ｆｃ融 合タンパク質（Ｗ０９１１０３５５３に記載）を図１４に示した幾つかの試料に 添加した。ＩｇＥ分泌は実施例８に記載した操作に従って測定し、Ｂ細胞増殖は 実施例１０に記載した操作に従って測定した。

Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌についての結果を、形質移入ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞の ５種の異なる濃度について図１４に示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌの存在下で、Ｂ細 胞増殖及びＩｇＥ分泌の両方が増加した。ＣＤ４０／ＦＣ融合タンパク質の添加 は、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌の両方を失わせた。ＴＮＦレセプター／Ｆｃ融合 タンパク質は何の作用も有さなかった。ＩｇＥ分泌についての比較として、コン トロール物質（形質移入ＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞なし）としての！Ｌ−４の添加は この分析でＩｇＥを産生ぜず、ＩＬ−４プラスＧ２８−５抗ＣＤ４０ｍＡｂの添 加は、この分析で２９．７ｎｇ／ｍＩのＩｇＥをもたらした。

実施例１４ この実施例は、ＣＤ４．０−Ｌ／ＦＣ２構築体という可溶性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ 融合タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ／ＦｃＤＮＡ構築体の構築を説明するも のである。ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２をコードするＤＮＡは、リーダー（又はシグナ ル）ヘブチド、ホップ（Ｈｏｐｐ）ら（ホップら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇＹ　６：１２０４．１９８８）により記載された８アミノ酸の親水性配列（Ｆ ｌａｇ（登録商標）という）、イムノグロブリンの適当なＦｃ領域、［Ｇ１ｙ４ Ｓｅｒ］ｚ繰り返し配列（参照によりここに組み入れられる米国特許第５．０７ ３，６２７号に記載）又は他の適当なリンカ−配列、及びアミノ酸５０からアミ ノ酸２６１（配列番号：１１）のヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域をコードする配 列を含む。リーダー配列、Ｆｌａｇ（登録商標）、及びヒｌ−Ｉ　ｇＧ＋　Ｆ　 ｃをコードする断片の酵素切断及び連結の慣用法を用いて、リーダー配列、Ｆｌ ａｇ（登録商標）、及びヒトＩｇＧ、Ｆｃを含有するｐＤｃ４０６発現ベクター を調製し、Ｎ５ｉｌ及びＮ０ｔｌで消化した。

５゛（上流）及び３゛（下流）オリゴヌクレオチドブライマーを用いるＰＣＲ法 （サルキ（Ｓａｒｋｉ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７．１９８８）を 利用して、ヒトＣＤ４Ｏ−Ｌ（ＡＴＣＣ６８８７３：配列番号：１１）を含有す るクローニングベクターからのＣＤ４０細胞外リガンド結合ドメインをコードす るＤＮＡ配列を増幅し、ＰＣＲ断片を形成した。上流オリゴヌクレオチドブライ マー（配列番号：１３）は、リンカ−配列（（Ｇｌｙ、５ｅｒｌ　３５ｅｒＳｅ ｒ）から上流にＮ５ｔｌ部位を導入し、この後にＣＤ４０−Ｌの細胞外領域の２ １ヌクレオチド（配列番号＝１１のアミノ酸５１から５７まで）が続いた。下流 オリゴヌクレオチドブライマー（配列番号、１４）は、ＣＤ４０−Ｉ、の終止コ ドンのすぐ下流にＮｏｔ１部位を導入した。次いで、リーダー配列、Ｆｌａｇ（ 登録商標）、及びヒトＩ　ｇＧ、ＦＣを含有するｐＤｃ４０６発現ベクター内に 該ＰＣＲ断片を連結した。そのヌクレオチド配列及びＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２の推 定アミノ酸配列を配列番号＝１５及び配列番号；１６に示した。生成したＤＮＡ 構築体（ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２）をサル腎臓細胞系ＣＶＩ／ＥＢＮＡ　（ＡＴＣ ＣＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。該構築体は、ＣＤ４０に結合できる可 溶性ＣＤ４０−Ｌをコードした。このことは、ＣＤ４０を発現する細胞を用いる 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ３）分析で認められる結合により証明された。

ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２をコードする構築体で形質移入したヒト胚性腎臓２９３細 胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）の大規模培養物を成育させて、ＣＤ４０−Ｌ／Ｆ Ｃ２を含有する上澄み液を蓄積した。２９３細胞系、つまりヒトアデノウィルス ５ＤＮＡにより形質転換された一次ヒト胚性腎臓の永久系は、ｐＤｃ４０６ベク ター内に連結された組換えタンパク質の発現を可能にする。上澄み液中のＣＤ４ ０−Ｌ／ＦＣ２融合タン融合タンパクイニティ精製により精製した。簡単に説明 すると、哺乳動物細胞上澄み液を濾過（例えば、０．４５μフイルターで）し、 ストレプトアビジン−アガロース（ピアスケミカル、ロックフォード、ＩＬ、Ｕ ＳＡ）に結合したビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ ・ラボラトリーズ社、ウェストグローブ、ＰＡ、、ＵＳＡ）を含む抗体アフィニ ティカラムに濾液を４℃で１．５　ｃｍＸ　１２．　Ｏｃｍカラムについて約６ ０〜８０ｍ１／ｈの流速で適用することによって、ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ融合タ融 合タンパ歯質する培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中 に検出されなくなるまで、カラムの約２０倍容量のＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液） でカラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ２，８の１２．５ｍＭクエ ン酸緩衝液、７５ｍＭＮａＣ］でノＪラムから溶出させ、ｐＨ９，１の５００ｍ ＭＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。精製したオリゴマーＣＤ４０−Ｌ／ＦＣペ プチドは、協同刺激物質の不存在下でヒトＢ細胞増殖を誘発し、（適当なサイト カインと協力して）膜結合ＣＤ４０−Ｌについて実施例１２に記載したようにｒ ｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＭの産生をもたらした。

実施例１５ この実施例は、トリマーＣＤ４０−Ｌという可溶性ＣＤ４０−Ｌ融合タンパク質 を発現するＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ構築体の構築を説明するものである。トリマー ＣＤ４０−Ｌは、リーダー配列、“ロインンジッパー”という３３アミノ酸配列 （配列番号：１７）　、及びホップら（ホップら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　６：１２０４．１９８８）により記載された８アミノ酸の親水性配列（Ｆ ｌａｇ（登録商標）と（７）う）、続いてアミノ酸５０からアミノ酸２６１のヒ トＣＤ４０−Ｌ　（配列番号＝１１）の細胞外領域を含有する。リーダー配列及 びＦｌａｇ（登録商標）配列の有用性は、詳細な説明の欄に記載した。配列番号 ＝１７で示される３３アミノ酸配列は、溶液中で自然に三量化する。かくして、 この３３アミノ酸を含む融合タンノくり質は、自然にトリマー又はマルチマーを 形成すると考えられる。

リーダー配列、上記の３３アミノ酸配列、及びＦ　Ｉ　ａ、　ｇ配列に対応する オリゴヌクレオチドを合成し、次いで実施例１４に記載したようにして調製した 配列番号＝１１のアミノ酸５１からアミノ酸２６１をコードするＤＮＡ断片に該 最終産物を連結することにより、該構築体を調製する。

発現ベクターｐＤｃ４．０６内の生成連結産物をサル腎臓細胞系ＣＶＩ／ＥＢＮ Ａ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤｃ４０６ブラスミド は、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・ノく−・ ウィルス（ＥＢＶ）由来の調節配列を含む。ＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系は、エプス タイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ヒｌ−ＣＭＶ 即時−初期（ｉ＋＋ｍｅｄｊａｔｅ−ｅａｒｌｙ）エンハンサ−／プロモーター 由来のＥＢＮＡ−１を構成的に発現する遺伝子で、ＣＶ−１細胞系を形質移入す ることにより得られた。

ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤｃ４０６の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベク ターのエビソーム複製を可能にする。

一旦、該融合構築体を発現する細胞を同定すると、形質移入細胞の大規模培養を 行ってトリマーＣＤ４０−Ｌを発現する細胞からの上澄み液を蓄積する。実質的 に米国特許第５．０１１．９１２号に記載されたアフイニテイ精製により、上澄 み液中のトリマーＣＤ４０−Ｌ融合タンパク質を精製する。溶出したＣＤ４０− Ｌ融合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルを調製して純度を測定することができる。

配烈毘 （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さニア８３塩基対 ＣＢ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：なしくＡ）生物名：マウス （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＣＤ４０−Ｌ ぐｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＋１．．７８３ （！１）配列： 配列番号；ｌ 入ＴＧ　入τ入ＧＡ＾ＡＣＡ　？ＡＣＡＧＣＣＡＡ　ＣｃＴ　ＴＣＣＣＣＣＡＧ Ａ　ＴＣＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＡＣＴ　ＧＧＡＭｓ＋セ　エ１・Ｇｌｕ　Ｔｈｘ　 Ｔｙｒ　Ｓｅｘ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　＾ｒｇｓ・ｚ　Ｖａｌ　入 １１　Ｔｈｒ　ＧＬｙｌ　５　１０　１５ Ａｒｑ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｐ　Ｌ、ｙａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ａｓｎ　ｔａｕ　１４１ｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｓ　Ｖ≠■ Ｓｏ　５５　６０ τｒｅ　λτ入　入ＡＡ　ＡＡＧ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＴＧＣＡＡＣＡＡ Ａ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＡ　ＴＣＣＰｈ＠　工１ｅ　Ｌｙｓ 　Ｌｙａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ 　Ｇｕｙ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　５ｅｒ６５　’＋０　７５　８０ ＡｉｍＡｓｎ５ｅｒＡｓｎ入１ａ＾１ａＳａｒＶａｌＬ＠ｕＧｉｎτｒｐＡｉｍ ＬｙｓＬｙｓＧＬｙでｙ＋”ＴＡＴ　ＡＣＣＡＴＧ　入ＡＡ　ＡＧＣＡＡＣＴＴ Ｇ　ＧＴＡ　ＡＴＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＯ Ｇ１１Ｏ τＹ（Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｌ＋ｕ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ｌ ａｕ　Ｇｌｕ　八ａｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＴＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡ Ｇ　ＣＣＣＡＧＯＡＣＴ　ＧＱＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣｆｆ１Ａ　 ＣＴＣＡＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＡ（２）配列番号＝２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２６０アミノ酸残基（Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列： 配列番号：２ Ｍｅｔ　Ｚｌｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｔ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧＡＹｌ　５　１０　１５ （２）配列番号：３ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ＝７４０塩基対 （Ｂ）配列のを：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：なしくＩリアンチセンス：なし くマ１）起源： （Ａ）生物名：ヒト （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＩｇＧＩ　Ｆｃ （ｘｉ）配列： 配列番号：３ （２）配列番号：５ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセテイカル配列：なしくｉｖ）アンチセンス：なし くｖｌ）起源； （Ａ）生物名：　ＰＣＲプライマー （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローンニＣＤ４０　５’　ブライマ−（ｘｉ）配列＝ 配列番号コ５ （２）配列番号：６ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｆ）ハイポセティカル配列：なしく１ｖ）アンチセンス：なし くｖｌ）起源： （Ａ、）生物名：　ＰＣＲプライマー （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：ＣＤ４０　３’　プライマー（１１）配列： 配列番号：６ （２）配列番号、９ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：４３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：なしくｙｉ）起源： （Ａ）生物名：　ＰＣＲプライマー （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）りＯ−７：ヒト　ＩＧＧＩ／ＦＣ５’　プライマー（ｘｉ）配列・ 配列番号：９ （２）配列番号：１０ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （目）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：なしく１リアンチセンス：なし くｖｌ）起源： （Ａ）生物名：　ＰＣＲプライマー （Ｖ目）直接の起源： （Ｂ）クローン：ヒト　ＩＧＧＩ／ＦＣ３’下流プライマー（ｘｌ）配列： 配列番号：ｌＯ ＡτＧ　ＡＧＣ入ＡＣＡＡＣＴＴＧ　ＧＴＡ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　 ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＧＴＴ人＾Ｇ　ＴＣＣＣＣＣＧＧＴ　 ＡＧＡ　ＴＴＣＧＡＧ　ＡＧＡ　ＰＩＴＣＴＴＡ　ＣＴＣｋＧＡ　ＧＣＴ　ＧＣ Ａ　八人Ｔ　ＡＣＣ（２）配列番号：１２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２６１アミノ酸残基（Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列： 配列番号：１２ Ｌｅｕ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　ＶａＩＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　ｌ’ｆｏ　 Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＳｅＪ：Ｖａｌ　Ｉ）ｈｅ　Ｖａｎ　ｋｓ窒■ （２）配列番号：１３ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さニア３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配 列、なしくｉｖ）アンチセンス：なし くｘｉ）配列： 配列番号：１３ （２）配列番号＝１４ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ＝２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：なしくｉｖ）アンチセンス：なし くｘｌ）配列： 配列番号：１４ （２）配列番号：１５ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：１４２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１工）配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配 列：なしくｉｖ）アンチセンス：なし くｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：ヒト　ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２（溶解性ＣＤ４Ｏ−Ｌ）（ｉｘ） 配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：４．．１４２２ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：成熟ペプチド（Ｂ）存在位置ニア９１．１４２２ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　／グナルベブチド（Ｂ）存在位置＋４．．７Ｂ （Ｘｉ）配列： 配列番号、１５ ＴＣＡ　ＴＧＣτＣＣＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＧＡ　ＧＧＧ 　ＴＣｋ　ＧＧＣＧＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　丁ＣＣＧＡＡ　ＡＡＣＡＧＣＴＴＴ 　Ｇｋｋ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＡＪＩＡ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　五人τ　ＣＣ τ　ＣＡＡ　入ττ　ＧＣＧＧＣ入　ＣＡＴ　ＧＴＣＡＴＡ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　 ＧＣＣ入ＧＣＡＧＴ　五人ＡＡＣＡ　入ＣＡ　ＴＣτ　ＧＴＧ　ττ＾　Ｃへ〇 丁ＧＧＧＣＴ　ＧＡＡ　Ａ入ＡＧＧＡ　ＴＡＣＴＡＣＡｃｅ　ＡＴＧ　ＡＧＣＡ ＡＣ入ＡＣττＧ　ＧＴＡ　入ＣＣＣＴＧτＡ？　ＧＣＣＣＡＡ　ＧＴＣＡＣＣ ＴＴＣＴＯＹ　ＴＣＣＡＡＴ　ＣＧＧ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＴＣＣＡＧＴ　ＣＡＡ 　ＧＣＴ１２０Ｇ 丁ｙｔ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｓｍ【　八ｓｎ　 Ａｆｇ　ＧＬｕ　入１ａ　Ｓｅｘ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　へ１１コロ０　３６５　− ３７０　−−− ＣＣＡ　τＴで　ＡＴＡ　ＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡ　ＡＡＧ　ＴＣＣＣ ＣＣＧＧＴ　ＡＧＡ　ＴＴＣＧＡＧ　ＡＣＡＰｒＯｐｈ崇ｚｘ＊　Ａｌａ　Ｓ＠ ｒ　Ｌ４ｕ　Ｃｙｓ　Ｌ４ｕ　Ｉ−ｙ３　Ｓａｚ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＡｒｇ　ｔｈ ｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ３７５　３ｇ０　３８５　３９０ 人ＴＣτ？Ａ　ＣＴＣＡＧＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡＡＡτ　ＡＣＣＣＡＣＡＧＴ　Ｔ ＣＣＧＣＣ八人ＡＣＣτ　丁ｃｃｃｃａエｉｓ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｌ ａ　Ｊｕａ　Ａｊｎ　でｈｒ　Ｈｌｓ　Ｓｅｗ　５ｅｚ　Ａよａ　Ｌｙｓ　Ｉ’ ｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇ１■ ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＴＣＣＡＴＴ　ＣＡＣ丁τＧα込α詰ＧτＡτ買ω講ττＧ＾ α講φταズＧＬｎ　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｔ　ＩＬｅ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　ＧＬｙＧＩＹ Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　！’ｒｏ　Ｇｌｙ　ＡＬａＴＣＣＧ τＧ？Ｔ丁　ＧＴＣ八人τ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　（ａへＴ　ＣＣＡ　ＡＧＣＣＡＡ 　ＧＴＧ　ＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＣ入Ｃτ１コ９２ Ｓａｔ　ＶａＬ　Ｐｈａ　ＶａＬ　入３ｎ　ＶｉＬ　丁ｈｚ　八ｓｐ　Ｐｒｏ　 Ｓｅ＋：　ＧＬｎ　ＶａＬ　Ｓｅ＋：　ｕＬｓ　Ｇｌｙ　Ｔ■■ （２）配列番号＝１６ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：４７３アミノ酸残基（Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （目）配列の種類、タンパク質 （Ｉ五）配列： Ａｓｎ　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｓｅｔ　ＶａＬ　 Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＨＬｓ　Ｇｉｎ　＾３ｐ９０　９５　１０Ｇ Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｔ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　 Ｌｙｓ　ＶａＬ　Ｓｅｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　入Ｌａ　Ｌｅｕユａｓ　’　ｕｏ　 ｘｘｓ Ｐｒｏ　Ｊｕｇ　Ｐｒｏ　Ｉｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｘｉ＠　Ｓｅｘ　 Ｌｙｓ　Ａｉａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　＾ｒｑＧｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇ 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Ｐｈｅ　ＸＬｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｓｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｘ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ｔｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｃｇ　ＩＬｅＬ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　入 ｒｑ　Ａｉａ　入Ｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｊ　Ｓｓｒ　５ｓｒ　ＡＬａ　Ｌ ｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　Ｇ１ｎＧｉｎ　Ｓａｔ：　Ｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌ＠ ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｐｈａ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｙ　八Ｌａ　５ｅｒ４１Ｑ　４１５　４２０ Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　Ｇ ｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｘ　Ｈｉｓ　ＧＬｙτｈｒ　ＧＬｙＰｈ＠τｈｆＳｓｉ　Ｐ ｈａ　Ｇｌｙ　＋、４ｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　−Ｎ（２）配列番号：１７ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ＝３３アミノ酸残基 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トボロ・ノー：直鎖状 （目）配列の種類：ペプチド （■θハイポセティカル配列：なし くｉｖ）アンチセンス：なし くｘｌ）配列： 配列番号：１７ ｒｇ ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２ ８９２ｋＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＣ丁ＡＴＴＴＡＴＡＡＣ ＣＣＴｋＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＧｋＡＣＴｋＴsＴＡＴ９６１ ０１　ｏ　ｒ’ｌ　０　＋＋”＋　０　ｅｉロ　寸Ｏｅ）　ｌ／’１　１／’＋ 　０　Ｃ１ｌ／＋　ｌ／”＋Ｌｌ”＋　１１”１　、ｗ　、−−、−ｃ′４（’ ｌ　Ｎ　Ｍン争冴（内容（二寞更なしン ＦＩＧ、　４Ａ ＋ＯＥ５　Ｅ−＋　ＣＶ１’５ １０２１０３１ｏ４１ｏ５ ＣＶ　Ｉ’の数 ＦＩＧ、　４Ｂ １０Ｅ５　Ｅ−＋　ＩＬ−４＋　ＣＶＩ’ｓ浄１（内容に変更な・し） ＰＳ　Ｅ　＋　ＩＬ−４＋　ＣＶｌ　７Ｂ　目ｍＭ１０’　１０２１０３１０’ 　１０’ Ｖ１ 一つ−ＨＡＶ 好古（内容に変更なし〉 ６日目の培養物Ｓ／Ｎ中のＳ、ＣＤ２３　：１０Ｅ５　Ｅ−／ウェル、　１．Ｍ ＤＭ　−１−ＩＬ−４ＣＶ　１’の数 浄書（内容に変更なし） ６日目の培養物Ｓ／Ｎ中のＳ、ＣＤ２３　：１０Ｅ５　Ｅ−／ウェル、　ＩＭＤ Ｍ　＋　ＩＬ−４ＣＶ　１’の数 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　８ ＣＤ４０リガンド発現ＣＶ−１細胞（固定）によるＢ細胞増殖の誘発 １０３１０’　１０’　１０’ 細胞数 一ローＣＤ４．ＯＬ −Δ−７Ａ１ 一ムーＨＡＶ　ＥＯ −Ｏ−４０，９ 浄書（内容に変更なし） ＥＬ４　４０．９および７ＡＩ　Ｔｈ１細胞（固定）による抗５ＲＢＣＰＦＣの 誘発 細胞数 一ロー７Ａ１ 一〇−４０，９ 浄書（内容に変更なし） ＣＤ４０リガンド発現ＣＶ−１細胞によるＢ細胞増殖の誘発 細胞数 −”−）（ＡＶ　ＥＯ −＾−７ＡＩ　＋　ＣＤ４０Ｆｃ →−ＣＤ４０Ｆｃ 浄書（内容に変更なし） ＣＤ４０リガンド発現ＣＶ−１細胞（固定）１こよる抗５ＲＢＣＰＦＣの誘発 コロ収率％ 口ＰＦＣ 浄書（内容に変更なし） ＣＤ４０リガンド発現ＣＶ−１細胞（固定）によるマウスＢ細胞増殖の誘発 細胞／ウェル 一Δ−ＣＤ４０Ｌ −ムーＨＡＶ　ＥＯ −Ｏ−７Ｃ２１１／６ 一ローフＡ１１１／６ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１３Ａ ＣＤ４０リガンド発現ＣＶ−１細胞（固定）による抗原特異的ＰＦＣの誘発 細胞／ウェル ＦＩＧ、　１３Ｂ 浄書（内容に変更なし） Ｔ除去ＰＢＭの７白目増殖物 ＦＩＧ、　１４Ｂ Ｔ除去ＰＢＭがうの１ｏ日目の１（ＩＥ分泌ＣＶ１　（Ｘ７０＝） 手続補正書 平成　６年　５月７６−

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＤ４０に結合するＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードする単離したＤＮＡ 配列であって、下記ＤＮＡ配列からなる群から選ばれるＤＮＡ配列：（ａ）配列 番号：１１のヌクレオチド４６から８２８、１８４から８２８、又は１９３から ７６２； （ｂ）温和なストリンジェント条件で（ａ）の配列又はそれらと相補的な配列の うちの１つと検出できるようにハイブリダイズするＤＮＡ配列；（ｃ）遺伝子コ ードの縮重により、上記ＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるポリペプチド をコードするＤＮＡ配列。
2. ２．可溶性ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードする、請求項１の単離したＤＮＡ 配列。
3. ３．請求項１のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
4. ４．請求項２のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
5. ５．請求項３の発現ベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞。
6. ６．請求項４の発現ベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞。
7. ７．発現を促進する条件下で請求項５の宿主細胞を培養し、該培養物からＣＤ４ ０−Ｌポリペプチドを回収することを含む、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドの製造方 法。
8. ８．発現を促進する条件下で請求項６の宿主細胞を培養し、該培養物からＣＤ４ ０−Ｌポリペプチドを回収することを含む、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドの製造方 法。
9. ９．請求項１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む、精 製した生物学的に活性なＣＤ４０−Ｌポリペプチド組成物。
10. １０．実質的にヒトＣＤ４０−Ｌからなる、請求項９の精製した生物学的に活性 なＣＤ４０−Ｌポリペプチド組成物。
11. １１．下記ポリペプチドからなる群から選ばれる、請求項１０の精製した生物学 的に活性なＣＤ４０−Ｌポリペプチド組成物：（ａ）配列番号：１１に記載の配 列のアミノ酸１から２６１により定義されるポリペプチド； （ｂ）配列番号：１１に記載の配列のアミノ酸４７から２６１により定義される ポリペプチド：及び （ｃ）配列番号：１１に記載の配列のアミノ酸４７から５１までの配列中の１つ のアミノ酸で始まり、アミノ酸２３９から２６１までの配列中の１つのアミノ酸 までを含む配列により定義されるポリペプチド。
12. １２．ＣＤ４０−しが可溶性ＣＤ４０−しである、請求項１１の精製した生物学 的に活性なＣＤ４０−Ｌポリペプチド組成物。
13. １３．配列番号：１１のアミノ酸５１から２６１を含む、請求項１２の可溶性Ｃ Ｄ４０−Ｌ。
14. １４．２又は３以上のＣＤ４０−Ｌ細胞外領域を含むオリゴマーである、請求項 １３の可溶性ＣＤ４０−Ｌ。
15. １５．可溶性ＣＤ４０タンパク質、ＣＤ４０融合タンパク質、可溶性モノマーＣ Ｄ４０−Ｌポリペプチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる有効 量のＣＤ４０アンタゴニストを投与することを含む、アレルギー、アレルギー反 応、狼瘡、慢性間接リウマチ又は対宿主性移植片病を治療する方法。
16. １６．アジュバントでワクチン応答を増大させる方法であって、該アジュバント が、膜結合ＣＤ４０−Ｌポリペプチド、オリゴマー可溶性ＣＤ４０−Ｌポリペプ チド、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる方法。
17. １７．ＣＤ４０−Ｌ、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌからなる 群から選ばれる有効量のＣＤ４０アゴニストを投与することを含む、ハイプリド ーマ細胞を刺激してモノクローナル抗体分泌を増加させる方法。
18. １８．ＣＤ４０−Ｌ又はＣＤ４０−Ｌ免疫原と免疫反応性の抗体。
19. １９．モノクローナル抗体である、請求項１６の抗体。
20. ２０．請求項１のＤＮＡ配列又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡ相補体に対応する少 なくとも約１２ヌクレオチドの配列を含む、ＣＤ４０−しの転写又は翻訳を阻害 できるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド。