JPH07504321A

JPH07504321A - マラリアワクチンにおけるまたはそれに関する改良

Info

Publication number: JPH07504321A
Application number: JP5513568A
Authority: JP
Inventors: ホルダー，アンソニー・アーサー; ブラックマン，マイケル・ジョン; チャペル，ジョナサン・アンドリュー
Original assignee: メディカル・リサーチ・カウンシル
Priority date: 1992-02-22
Filing date: 1993-02-22
Publication date: 1995-05-18
Also published as: ATE231555T1; NZ249208A; ES2192556T3; EP0627004B1; EP0627004A1; CA2128109A1; US5720959A; WO1993017107A1; DE69332652T2; DK0627004T3; KR950700415A; DE69332652D1; GB9203821D0; AU666519B2; AU3570493A; KR100262624B1; CA2128109C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、マラリアタンパク質の抗原部分の同定に関し、宿主細胞、特に細菌におけるそれらの発現、およびワクチンとしてのそれらの可能性のある使用に関する。

発明の背景マラリアは、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の原生動物寄生体によって引き起こされる。寄生体には、ヒトに感染する４つの種、Ｐ、ファルシパルム（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、の主なる原因となっている。しかしながら、各々のマラリア感染についても、関連する重大な病状があり、世界の人口の大部分かこの病気の危険にさらされている。マラリアは、世界の人口の４０％が住んでいる地域における公衆衛生の問題であると推測されており、この病気は、これらの社会にとって深刻な社会的かつ経済的重要性をもっている。

制御手段の放棄または破壊のために、かつ殺虫剤に対するベクターの抵抗力の増大および化学療法に対するファルシパルムマラリアの抵抗力の増大のために、近年この病気の再来があった。したがって、マラリアに対する効果的なワクチンを開発する差し迫った必要がある。

ワクチンを開発するための試みの多くは、宿主において、関連の種および寄生体の段階に対する防御的免疫応答を引き起こすことのできる個々のタンパク質を同定しようということに、焦点が当てられてきた。寄生体の生活環の複雑性、合成ポリペプチドのスペクＩ・ル内での抗原の数および多様性、ならびにマラリアを制御する免疫系の重要な局面に対する我々が有する理解の浅薄さのために、これはそれ自体大変な仕事である。

にもかかわらず、幾つかのタンパク質は、モノクローナル抗体、免疫をもつ個体からの血清、およびバクテリアのライブラリから発現される遺伝子のフラグメントに対する抗体を使用することによって、同定されてきた。インビトロまたはインビボでの寄生体の増殖および成長に対する抗体の効果、直接的な免疫処置の研究、およびタンパク質の細胞より小さいロケーションまたほの可能性のある機能を含む、様々な基準を使用して、幾つかのワクチンの候補が提案されてきた。

そのような候補の１つは、メロゾイトの外部に位置する、メロゾイト表面プロティン−１（Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）　（ＭＳ　Ｐ　ｌと省略されるが、ＭＳＡＩ、ＰＭＭＳＡ、Ｐ、１９０またはｇＰ１９５としてもまた知られている）てあり、赤血球に侵入する寄生体の段階である。

ＭＳＰＩは、すべてのマラリア寄生体積のメロゾイト表面に見られるため、マラリアワクチンの候補として理想的な標的である。前駆体タンパク質は、実際、タンパク質分解処理され、異なる分子量を有する幾つかのポリペプチドの複合体を形成する（ホルダ（Ｈｏｌｄｅｒ）ら、［１９８７コＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇＹ段階の攻撃に対して防御するだろうということが示されてきた（シデキ（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ）ら、［１９８７］　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ、ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４．３０１４−３０１８）　、この分子に対するモノクローナル抗体はインビトロでの侵入を抑制するだろうという２つの異なった報告がある（バースン＆バーキンズ（Ｐｉｒｓｏｎ　＆　Ｐｅｒｋｉｎｓ、［１９８５］　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙユ３４．１９４６−１９５１　；ブラックマン（Ｂｌａ、ｃｋｍａｎ）ら、　［１９９０］　Ｊｏｕｒｎａ、１ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　［７２，３７９− ３８２）　ｏこの第２の研究において、抗体の標的は、前駆体のＣ−末端から得られる＋９ｋＤａフラグメントとして同定され、赤血球へ侵入する間メロゾイト表面に保持される。Ｐ８　ヨエリイ（Ｐ。

ｙｏｅｌｉｉ）によって発現される同種のタンパク質に特異性のモノクローナル抗体は、感染されたマウスへの受動的転移の後インビボでのこの寄生体の増殖を抑制する（マンャリアン　（Ｍａｊａｒｉａｎ）　ら。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｉ：￥１２　、　３１３１−３１３７　［１，９８４］　）。そして、エピトープは、このタンパク質のＣ−末端配列に位置づけられた（バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、［＋９８９］　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４３．２６７０−２６７６　）。

前駆体のＣ−末端領域に対する抗体は、メルカプトエタノールまたはジチオトレイ］・−ルのような還元剤で処理された後のタンパク質には結合せず、この領域における幾つかのシスティン残基は特定のジスルフィド結合に関係していることを示唆する。「Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の細胞内タンパク質どして発現されるタンパク質は、正確なジスルフィドを形成しないことはよく知られているので、バキュロウィルス／′昆虫細胞系を使用する分泌および発現が、前駆体の末端の２９３アミノ酸のために使用されてきた（マーフ実用製品に向けてのこれらのポリペプチドのさらなる開発において、寄生体からのそれらの分離は実行可能な提案ではない。そのため、この問題を回避するために、多くの現行の研究は、組替ＤＮＡ技術またはペプチド合成技術を使用することに力を注いでいる。しかし、合成の間のポリペプチドの不正確な折り畳みおよびアセンブリのために、生産物の抗原特性か本来のタンパク質と同じでないかもしれないので、バクテリアにおける遺伝子配列の発現は必ずしも真っ直ぐなものではない。従って、Ｃ−末端の１１４アミノ酸（ブラックマンら、　［１９９１コ＆１ｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　４９．２９−３４）に相当する、５６ｋＤａｆ！ｌ（パースン＆パーキンズ、＋　９８５）または１９ｋＤａｆｆｆ！（ブラックマンら、　［１９９０］　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａローナル抗体の正確なマツピングは、報告されていないし、Ｅ、コリにおける標的の効果的な発現も報告されていない。

この発明は、次の驚くべく発見に基づいている。メロゾイト表面プロティンに対向する防御抗体の標的を、アミノ酸のショートストレッチとして定義することか可能てあり、この標的は、本来のタンパク質と区別のつかない形聾で、細菌中で合成され得る。

発明の概要第１の局面において、ＭＳＰＩタンパク質において本来近接して生しる配列から分離した、実質的に図１ａ（添付の配列リス１−のＳｅｑ、ＴＤ　Ｎｏ、ｌ）に示されているような配列を含むポリペプチド、またはその機能的な均等物を、この発明は提供する。

別の局面において、ＭＳＰＩタンパク質において本来近接して生じる配列から分裂した、実質的に図２ａ（Ｓｅｑ。

ＩＤ　Ｎｏ、３）に示されているような配列を含むポリペプチド、またはその機能的な均等物を、この発明は提供する。

図１は、ＥＧＦ　ｌ様領域として知られるポリペプチドの２つの対立遺伝子変異体のアミノ酸配列（ＡおよびＢは、それぞれＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、ｌおよび２）を示す。図２は、ＥＧＦＺ様領域上領域知られるポリペプチドの配列の２つの対立遺伝子変異体のアミノ酸配列（ＡおよびＢは、それぞれＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、３および４）を示す。なお、その生化学的特徴を存意に変化させることなしに、機能的均等物を得るために、他の重要でない変更がＥＧＦ　ｌ様領域またはＥＧＦ２様領域の配列になされ得ることは、当業者には明らかである。

たとえば、対立遺伝子変異体と同様に、機能的均等物は、１つ又はそれ以上の保存されたアミノ酸置換（すなわち、アミノ酸の、同様の特徴を有するものへの置換）があるそれらを含んでもよい。なされ得る他の置換は、ＭＳＰＩ配列からのアミノ酸を上皮増殖因子配列からのものに変えるものであって、それは、ＥＧＦ様構造を実質的に保存する。

選択的に、または付加的に、ＭＳＰＩ　ＥＧＦ様配列の僅かな付加、欠失または切り詰めがなされ得る。他の明らかな機能的均等物は、プラスモデイウム属の他の種（例えば、人間に感染すると知られている４つの種、またはマウス病原体Ｐ　ヨエリイ（Ｐ、　ｙｏｅｌｉｉ）等）のＭＳＰタンパク質にあるそれらのＥＧＦ様領域である。

ＥＧＦ　ｌ様（図１）およびＥＧＦ２様（図２）領域の配列において示されるＮ −末端メチオニン残基は、必要不可欠ではないことを述べておく必要がある。それらは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）との処理による結合アミノ酸配列からのＥＧＦ様領域の開裂を考慮にする、選択自由な特徴である。

ＭＳＰＩをコードする遺伝子の配列は、次のような２株のＰ、ファルシパルムで決定されてきた。Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／　Ｔ　９／９４およびＭＡＤ２０（それぞれ、ブラックマンら、（１９９１）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　４９．２９＝３４、およびタナベ（Ｔａｎａｂｅ）ら、［１９８７］　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕＪａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２９５．２７３−２８７）である。発明者は、ＰＣＲによって、これらの遺伝子（ブラックマン等、〔１９９１〕参照）で固定されてきた、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様領域、（ＥＧＦｌ様およびＥＧＦＺ様）をコードするＤＮＡを得ることができた。

ＥＧＦ　ｌ様およびＥＧＦ２様領域をコードする配列は、プラスミドに挿入される。得られるプラスミド構造は、グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼを用いて融合タンパク質として、ＥＧＦ様領域の発現を誘導することができた。

このように別の局面で、ＭＳＰＩタンパク質において本来近接して生じる配列から分離した、ＥＧＦ　ｌ様および／またはＥＧＦ２様領域をコードする配列を含むベクターを、この発明は提供する。

一般的に上で定義されたベクターは、ＥＧＦ　ｌ様および／またはＥＧＦ２様配列を発現することができる。

ＥＧＦ様配列がＭＳＰＩタンパク質で採用するコンフォメーションを保持する方法で、それらは発現されてもよい。

別の局面で、この発明は、他のＭＳＰＩ配列から分離し、それらがＭＳＰＩで採用するコンフォメーションで、ＥＧＦｌ一様領域および／またはＥＧＦ２様領域を生産する方法を提供し、その方法は、ＥＧＦｌ様および／またはＥＧＦ２ｔＪ領域を発現することのできる上で定義されたベクターを適切な宿主細胞に挿入することと、その宿主細胞を増殖させることと、生産されたＥＧＦｌ様および／またはＥＧＦ２様領域を分離することとを含む。

さらなる局面で、他のＭＳＰＩをコードするヌクレオチド配列から分離した、ＥＧＦ　ｌ様領域および／またはＥＧＦ２様領域をコードする配列を含むヌクレオチド配列、またはその機能的均等物を提供する。そのような機能的均等物は、異なるヌクレオチド配列を存するが、遺伝子コードの縮体のために、同じアミノ酸配列（または保存された置換または僅かな欠失、付加または切り詰めを含む、アミノ酸配列）をコードするそれらの配列、および発明のヌクレオチド配列の相補体にハイブリッド形成するそれらのヌクレオチド配列を含む。

典型的に、ＥＧＦ一様領域は、融合タンパク質として発現される。

好ましくは、融合タンパク質は、例に記載のように、グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼを用いる融合のような精製の容易さを考慮するものであるべきである。他のそのような簡単に精製される融合タンパク質は、当業者に知られている。

例１に記載の実施例において、融合タンパク質は、そのようなものなので、ＥＧＦ様領域は、非−ＭＳＰＩポリペプチド配列から開裂されるかもしれない。

さらなる局面において、この発明は、上で定義されたベクターて、形質転換される宿主細胞を提供する。形質転換された宿主細胞は、細菌、植物、真菌類または動物起源であるかもしれない。

例１に記載のように、本来のコンフォメーションでのＥＧＦ様領域の発現は、（インビトロでのマラリア寄生体複製を抑制することが知られている、抗体との反応によって判断されるように）、例２および３で定義されるデータによって支持される、マラリアに対する防御的免疫応答を引き起こすためのワクチンとして、組替えＤＮＡから得られる材料の使用を考慮してもよい。

したがって別の局面で、この発明は、図１または図２に示す配列を含むワクチンまたはその機能的均等物を提供する。好ましくは、ワクチンは両方のＥＧＦ様領域の配列またはその機能的均等物を含むとよい。便宜のため、ワクチンは、本来のコンフォメーションでのポリペプチドを含み、かつ一般に適切なアジュバント（たとえばａ　Ｉ　ｕｍ）とともに投与される。典型的に、ＥＧＦ様領域は、生理的に受容できる担体において運搬され、および／または別の免疫原に融合される。

別の局面において、この発明は、図１または図２に示す配列を含むワクチンまたはその機能的均等物を投与することによって、人体を扱う方法を提供する。

より良く理解されるだろう。図面に次のようなものがある。

図１は、ＥＧＦ　ｌ様領域の２つの対立遺伝子変異体の配列を示す。

１２は、ＥＧＦ２様領域の対立遺伝子変異体の配列を示す。

図３は、ヒトのＥＧＦの構造をもとに予想されるＭＳＰＩ　ＦＧＦの構造を示す。

図４は、ＥＧＦ　Ｉ様およびＥＧＦ２様コード配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマ（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、５−８）の配列、およびそれらのＭＳＰＩタンパク質に関、連の位置を示す。

図５は、メロゾイト抽出物、および融合タンパク質を含むＥＧＦ様領域のイムノプロット（［ウェスタンＪプロット）分析の結果を示す。

図６は、Ｐ、ヨエリイからの、組合わせられたＥＧＦ様Ｔ９／９４の配列から得られるオリゴヌクレオチドが、複製連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマとして作用するために使用された。これらのプライマの配列は以下に示される。

ＥＣ；Ｆｌ　５’プライマ（添付配列リストで、Ｓｅｑ。

ＩＤＮｏ、５＋５’　ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＣＭＴＧＣ３’ＥＧＦＩ　３’　ブライｖ　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、６）：５　’　ＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣ３’ＥＧＦ２　５’プライマ（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、７）　：５’　ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣ７’ ＴＧＴＡＡＣ３’ＥＧＦ２　３’ブライｖ（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、８）：５　’ 　ＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＡＧＡＧＧＭＣＴＧＣＡＧＡハ　３１５′プライマの５′末端には、斗見工Ｉおよび旦見二ＨＩのための制限部位を導入するための伸長と、それに続くＡＴＧメチオニン（Ｍｅｔ）コドンがある。このＭｅｔのコドンの重要性については以下で検討する。

Ｍｅｔコドンの３′に密接して、ＥＧＦ　ｌ様配列（８５９−８７９）（７）起点またはＥＧＦ２様配列（９８８−１００８）の起点のいずれかに相補的な、２１塩基の配列がある。各々の３′プライマは、５’−３’の方向で、５ａｃＩおよびＢｇｌＴＩのための制限部位を導入するための伸長を含み、ＴＡＡ停止コドンがあり、続いてＥＧＦ　ｌ様配列（９８５−１００２）の３′末端またはＥＧＦ２様配列（＋１２９−１１．４．６）の３′末端いずれかに相補的な、■８の塩基の配列がある。

ＰＣＲ生産物は、旦ａｍＨＩおよび旦（±ＩＩで切断され、かっＢａｍＨｌで制限された　ｐＧｅｘ−３ｘに挿入された（スミス＆ジョンソン（Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）　、［１９８８１、Ｇｅｎｅ　６７．３１−４０　。連結反応生産物が、Ｅ、コリ株ＤＨ５ａｌｐｈａを形質転換するために使用された。

正確な配向への挿入物との組替え体は、制限酵素分析によって同定された。新しい構造物の連結体は、ＤＮＡ配列決定法によって確実にされた。

図１は、２つの対立遺伝子タイプ、ＭＳＰＩＦＧＦＩＡ（たとえばＷｅｌｌｃｏｍｅ　ＳＴ　９　／　９４株）およびＭＳＰＩＦＧＦＩ、（たとえば、ＭＡＤ２０株）のための第１のＥＧＦ様領域として増幅された領域のアミノ酸配列を示す。アミノ末端メチオニンは、組替え体タンパク質からの開裂を促進するために導入される選択的特徴であった。

図２は、２つの対立遺伝子タイプ、ＭＳＰＩＦＧＦ２Ａ（たとえば、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　、　Ｔ　９　／　９４株）およびＭＳＰＩＥＧＦ２．（、たとえば、ＭＡＤ２０株）のたメツ第２（７）ＥＧＦ様領域として増幅された領域のアミノ酸配列を示す。

アミノ末端メチオニンは、組替えタンパク質からの開裂を促進するために導入される選択的特徴であった。

−１６７８を示す。ＥＧＦにおいて、システィンは、次のようにジスルフィドの形で対になる（図３で実線として示される）。すなわち、Ｃ３とＣ−１Ｃ２とＣ４およびＣ５とＣ９である。正味の電荷は、中性ｐＨで、正、負または正味の電荷なしのいずれかとして、各アミノ酸に対し示されている。Ｐ、ファルシパルム　ＭＳＰＩＦＧＦＩにおいて、１つのアミノ酸のみが次のような株の間で変わる。Ａ−タイプ株のＱＩ６４４　（正味の電荷なし）またはＢ−タイプ株のＥ１６４４　（正味の負の電荷）である。

発現の研究のために、組替え細菌は、がＬ−液体（Ｌ−ｂ　ｒ　ｏ　ｔ　ｈ）中で３７°Ｃ１晩増殖された。培養物は、新鮮な培地で５倍に希釈され、かつＩＰＴＧが最終の濃度が０゜２５ｍＭになるように添加された。さらに３時間増殖の後、細胞が採取された。細胞ベレットは、０．２％（Ｖ／Ｖ）ノニデッド（ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ　４０を含有する、２５ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、、ｐＨ８，０中で再懸濁され、イソプロパツール中のＰＭＳＦが、最終の濃度が１ｍＭになるように添加された。１ｍｌにつき１ｍｇのリゾチームが添加され、サンプルが２時間水の上で放置され、その後Ｍ、ＳＯ４が２ｍＭまでそしてＤＮアーゼが１ｍｌにつき２０ｍｇ添加され、混合物はさらに２時間放置された。

溶解精製物は、４°Ｃで２０分間１７，０００ｇにて遠心分離された。可溶性ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース（ジグｖ−ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　、カタログ番号Ｇ９７６１から得られる）でのクロマトグラフィによって上澄みから精製され、かつ８Ｍ尿素を用いて溶出された。ペレットフラクション中の不溶性タンパク質は、５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＥＧＴＡ、ＩｍＭ　ＰＭＳＦ　ｐＨ８，０を用いて二度洗浄され、最初は１％（Ｖ／Ｖ）ＮＰ−４０を含有し、次に０．５Ｍ　ＫＳＣＮを含有していた。その後、２５ｍＭ　）リス−ＨＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８゜０中で再懸濁された。生合成によりタンパク質を標識するために、組換え体が上述のように増殖され、最小培地中■Ｓシスティンの存在下で合成が誘導された。

ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマの設計は（ＥＧＦ様領域の起点でＭｅｔ残基を導入するために）、Ｍｅｔ残基でポリペプチド鎖を開裂する、臭化シアン（ＣＮＢｒ）の使用によって、ＭＳＰＩ配列を融合タンパク質から開裂させた。

図４は、ＭＳＰＩＦＧＦＩ　（１および２）ならびにＭＳＰＩＥＧＦ２　（３および４）の増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマを示し、それは適切な制限酵素開裂部位およびメチオニンコドンを含む。プライマ２および４の場合、逆の相補配列が示される。この図の後半部では、この前駆体の処理によって得られる本来のフラグメントの位置を示すＭＳＰＩの略図、ＥＧＦ様領域の位置およびそれらを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマの位置が提示される。

ハイブリッドタンパク質が、７０％（Ｖ／Ｖ）ギ酸中に１ｍｌにつき５ｍｇ５の割合で溶解され、かつ臭化シアン（１０００倍モル過剰、３．３ｒｎｇ　ＣＮＶｒ／ｍｇ　タンパク質）を用いて２４時間室温の暗所で処理された。水を用いて５倍に希釈した後、過剰の試薬は、凍結乾燥、またはスペクトラボア（５ｐｅｃｔｒａｐｏｒｅ）　７透析膜を使用して先行の希釈なしにｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸アンモニウムに対する透析によって、取り除かれた。

第１のＥＧＦ領域をさらに精製するために、ＣＮＢｒ消化物は、ｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸アンモニウムアセテートに溶解され、かつモノクローナル抗体１１１．４（ホルダーら、［１９８５］　Ｎａｔｕｒｅ　３１７．２７０−２７３）がセファロースに結合され、この緩衝液で平衡された、アフィニテイカラムに供された。洗浄の後、結合された材料は、ＭＣＩでｐＨ２，５に調整された０、１Ｍグリシンを用いて溶出された。

この方法でのＥＧＦ様領域の発現は、以下で述べられる抗体とのそれらの反応によって判断されるような、本来のコンフォメーションを採用させたことがわかる。

タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはＳＤＳおよび尿素（スワンク＆マンクレス（Ｓｗａｎｋ　＆　Ｍｕｎｋｒｅｓ　）　、　１９７１　）の存在下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。

タンパク質をニトロセルロースへ移した後、結合する抗体は、アルカリ性リン酸 −共役の第２の抗体、および発色物質を使用して検出された。その結果は図５で示される。特異性を有する抗体で形成された免疫沈降物中の放射性標識タンパク質もまた、ポリアクリルアミドゲルで分析された。

図５は、ウェスタンプロットでのタンパク質を用いる、様々な抗体調整の反応を示す。タンパク質は、メロゾイトの抽出物（クローンＴ９／９４からのレーン１、クローンＴ９／９６からのレーン２）、またはＭＳＰＩＥＧＦＩＡ（レーン３）およびＭＳＰＩＥＧＦ２．（レーン４）を用いて精製されたＧＳＴ融合タンパク質のいずれかであった。

ＳＤＳの存在下で電気泳動による分離の後、タンパク質はクーマシー・ブルーで染色されるか、もしくはセルロースに転移され、ポリクローナル（ａｎ　ｔ　１ −Ｍ５Ｐ　１）またはモノクローナル抗体でプローブされた。

タンパク質はまた、Ｖｙｄａｘ　Ｃ４カラムを使用して、０．１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルの０％〜１００％勾配を用いて溶出されるＨＰＬＣシステムでのクロマトグラフィーに供された。

ＥＧＦ様領域は、それらの本来のコンフォメーションにあり、インビトロでのマラリア寄生体複製を抑制することが知られている抗体と反応することを、これらの実験は示した。

既に述べられたように、ＥＧＦ様ポリペプチドを、融合タンパク質の他の部分から分離することは可能である。しかし、マラリアに対する防御的免疫応答を高めるために、ＥＧＦ様領域を他のポリペプチドまたは他の物質に結合させておくことは有益であるだろう。たとえば、ＥＧＦ様領域は、マラリア寄生体からの他の防御的抗原またはエピトープに結合され得る。

それらの本来のコンフォメーションでのＭＳＰＩ　ＥＧＦ様領域の発現の成功は、ＥＧＦ様領域の防御的免疫応答を刺激する能力を調べるための実験を促した。

Ｐ、ヨエリイによって感染され得るマウスが、ヒトのマラリアのための一般に認められるモデルであり、広く研究されてきた。従って、第１のステップは、Ｐ、ヨエリイＭＳＰＩからのＥＧＦ様領域をクローン化することであった。

Ｐ、ヨエリイの複合ＥＧＦ様領域をコードするＤＮＡは、以下に示すプライマを使用して、Ｐ、ヨエリイゲノミツクＤＮＡのＰＣＲ増幅によって合成された。

プライマＰｙＭＳＰＥＧＦ１　５’ブライ７　（４２ｍｅｒ、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、９）：ＥＬＧＩ）ＩＭＤＧＭＤＬＬＧブライｖＰｙＭＳＰＥＧＦ４　３’プライマ（Ｓｅｑ。

ＩＤ　Ｎｏ、１０）　：ＴＣＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＧＡ八へｃｓｓｓｓ　★（侍よ）（ＴＴＣＴＧＴ　ＡＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣＣＡＧＣＴＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ　Ｇ八）Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｓａｃ　１増幅活生産物は、制限酵素ＢａｍＨ１および旦」」工ＩＩを用いて処理され、精製され、かつ発現ベクターｐＧｅｘ３ｘに連結された。Ｅ、コリＤＨ５アルファのアンビシ１ノン耐性への形質転換の後、個々のクローンは、制限酵素消化およびタンパク質生成の分析によってスクリーニングされた。適当な融合タンパク質（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端に融合された２つのＥＧＦ様領域）を出現させる単一のクローンが選択され、挿入物のＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列決定によって確実にされた。複合ＥＧＦ様領域を含む、Ｐ、ヨエリイＭＳＰｌの増幅された領域のアミノ酸配列は、図６に示されてしする（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　１２）。

所望とするクローンの細菌の培養物は、１晩３７℃でＬ−液体（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）中で増殖され、新鮮な予め温められた培地で最終の容量が５００ｍ１になるようｌ：５（Ｖ／Ｖ）に希釈され、さらに１時間増殖されて、その後タンパク質合成が、０．１ｍＭのＩ　ＰＴＧの添加によって引き起こされた。さらに３時間のインキュベージコンの後、細菌の細胞は、１０分間の５，０００ｇでの遠心分離によって採取され、かつ細菌の細胞は、−７０°Ｃで凍結された。

ＧＳＴタンパク質のみを発現するコントロールの培養物もまた増幅され、これらの培養物からの細胞もまた一７０℃て貯蔵された。

ＧＳＴおよびＧＳＴ／ＥＧＦ様融合タンパク質は、結合およびグルタチオン−アガロースからの溶出によって、細菌の溶解産物から精製された。５００ｍ１の誘導された培賽物に相当する細胞のペーストは、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む、１０ｍ１の「細胞溶解緩衝液Ｊ　（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，０，２％（Ｖ／Ｖ）／ニデントＰ４０゜１ｎｎＭ　ＥＤＴＡ）中で、氷の上で再懸濁された。リゾチームが、１ｍｇ　ｍｌ−’まで加えられ、かつ２時間氷の上に置かれた後、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４およびデオキシリボヌクレアーゼ（タイプＩ）がそれぞれ、最終の濃度が２ｍＭおよび２０ｕｇ　ｍｌ−’になるまで加えられた。さらに２時間氷の上に置かれた後、細胞溶解産物は、２０分間３９，０００ｇにおいて遠心分離された。培地フラクションは、５０ｍ１グルタチオン−アガロースを含むクロマトグラフィーカラムに通され、その後、カラムは、リン酸塩緩衝（ＰＢＳ）を用いてよく洗浄された。ＧＳＴまたはＧＳＴ−融合タンパク質は、ｐＨ７，５の５０ｒｎＭ）リス中で８Ｍ尿素を使用して、カラムから溶出された。融合タンパク質を含む溶出されたフラクションは、クーマシー・ブルー染色を用いてＳＤＳ　ＰＡＧＥによって同定された。ピークフラクションは、プールされ、かつＰＢＳに対してよく透析された。タンパク質の精製は、ゲル電気泳動分析およびアミノ酸分析によって確実にされた。

ＧＳＴ　（対照グループ）およびＧＳＴ−融合タンパク質（実験グループ）でマウスを免疫処置するどともに、複合ＭＳＰＥＧＦ様領域を、ＧＳＴから分離して調製し、かつマウスの第３のグループをこの調製で免疫処置することが決定された。接種材料を調製するために、ＧＳＴ−ＥＧＦ融合を含む細菌の溶解産物は、上述のグルタチオン−アガロースのカラムに通された。カラム溶出緩衝液が、因子Ｘａ消化緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０゜１００ｍｍ　ＮａＣ１，ＩｍＭ　ＣａＣ１ｘ＞と取り換えられた。因子Ｘａ　（２５ｕｇタンパク質）を含む緩衝液はロードされ、かつカラムは、４℃で８時間放置された。

放出され組合わせられた領域タンパク質は、溶出され、この処理は繰返された。

フラクションは、ＳＤＳの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析され、かつプールされた。

５０ｍＭ重炭酸アンモニウムに対する透析の後、サンプルは、凍結乾燥され、かつＰＢＳで再溶解された。タンパク質の精製は、ゲル電気泳動、アミノ酸分析および配列分析によって確実にされた。開裂されたフラグメントのＮ−末端アミノ酸配列が決定され、次のようになった。ＧＩＨＭ　Ｄ　Ｇ　Ｍ　Ｄ　Ｌ　Ｌ　Ｇ（Ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、１１）。複合ＥＧＦ様領域の起点の、因子Ｘａの予想された開裂部位およびクローン化されたＤＮＡからの還元アミノ酸配列からのものと、これは一致する。

免疫／攻撃実験の第１の組において、以下で示された表に従って、精製されたタンパク質は、マウスのグループを免疫処置するために使用され、それらは、ドナーマウスからの５０００の寄生体−感染された赤血球で続いて攻撃された。

免疫処置　日　タンパク質の量　アジュバント（マイクログラムて）最初　０　１０　完全フロイント第１のブース１−２１　４０　不完全フロイント第２のブースト　４３　４０　不完全フロイントチャレンジ　５７グループｌは、ＧＳＴから開裂された、複合ＥＧＦ様領域で免疫処置され、グループ２は、無傷融合タンパク質（ＧＳＴ−複合ＥＧＦ様領域）で免疫処置され、グループ３は、ＧＳＴ担体タンパク質のみを受け取った。５４日て、血清標本か各々のマウスから取り出され、血液段階寄生体に対する間接イムノフルオレッセンス・アッセイによって、抗体レベルか測定された。

結果は表１に示す通りであり、各々のグループについて、異なった時（日）での攻撃の後の、個々の免疫処置されたマウスにおける、感染の発生（％寄生体）を示す。寄生体の成長は、ギエスマ（Ｇｉｅｓｍａ）染色を用いて染色された血液の塗抹標本で規則的にモニタされ、感染された赤血球の確率か計算された。寄生体の不在は、５０倍の顕微鏡視野で寄生体を検出てきない（各々は２００の赤血球を含む）として定義された。

この実験において、グループ１および２のすへてのマウスは、ｌ１５１２０より大きいＩＦＡ力価を有していた。

表１は、ＧＳＴ　（グループ１および２）を含まないまたはそれを含む、複合ＥＧＦ様領域で免疫処置された■２のマウスのうちの１１は、寄生体が検出できないことを示し、かつ１つの動物は単に一時的な寄生体を経験したということを示す。対照的に、ＧＳＴのみ（グループ３）で免疫処置された対照グループのすべての動物は、重い寄生体を成長させ、１つ以外のすへてか、実験の期間の間、圧倒的な感染のために死んだ。この結果は、それのみかまたは担体タンパク質としてのＧＳＴを含む、ＥＧＦ様領域を用いるワクチンによって得られる、顕著に効果的な防御を証明する。

例３さらなる実験か、第１の実験の結果を確実にするためにかつ免疫処置するタンパク質中の第２の構造の重要性を評価するためになされた。

融合タンパク質の第２の構造を妨げそれがリフォームできないようにするために、サンプルは、ジチオトレイトールて希釈され、過剰のインドアセタミドでアルキル化された。この処理は、タンパク質のジスルフィド結合を破壊して、かつカルボキシアミドメチル基の添加によってシスティン残基のスルフヒドリル基を修正する。すべてのスルフヒドリル基を希釈するために、融合タンパク質（１，２ｍｇ）か、８Ｍ尿素および０．２Ｍジチオ）・レイトールを含む、ＰＢＳ中で溶解され、かつ３０分間３７°Ｃでインキュベートされた。過剰のインドアセタミド（０，ＩＭ　ＮａＯＨ中の３６０ｕｌの１Ｍ溶液）が添加され、かつインキュベーションがさらに３０分継続されｐＨを７以上に維持するために、周期的にＩＯＭ　ＮａＯＨを添加した。最終的に、サンプルはＰＢＳに対してよく透析された。

このように、攻撃実験の第２の組において、マウスは次のもので免疫処置された。開裂された複合ＥＧＦ様領域（グループｌ）、無傷融合タンパク質（ＧＳＴ− 複合ＥＧＦ様領域）（グループ２）、薄められかつカルボキシアミドメチル化された融合タンパク質（グループ３）　、ＧＳＴ担体のみ（グループ４）およびＰＢＳ　（グループ５）である。免疫処置の表は、第２のブーストが４２日で与えられた以外、第１の実験におけるそれと同一であった。

第２の実験においては、寄生体の不在が４０倍の顕微鏡視野で寄生体を検出できない（各々は３００の赤血球を含む）として定義されたことを除いて、実験は第１と同じ方法で行なわれた。結果を表２に示す。

ＩＦＡ分析によって、グループ１のマウスの血清は、１１５１２０より大きい抗体力価を有しており、グループ２のそれらはｌ／１０．２４０を超える力価を有していた。

免疫源の修正は、次のような本来のタンパク質と反応して生産される抗体のレベルを下げた。グループ３のマウスの血清抗体力価は、Ｉ／１２８０から１１５１２０までになった。表２で示されるように、このときの攻撃の後、第１の２つのグループでの１９のマウスのうちの１４は、寄生体か検出できないことを示し、さらに４つのマウスは一時的な低いレベルの寄生体を経験し、かつ動物のうちの１つは防御されなかった。対照グループにおいて、ＰＢＳおよびアジュバントのみで免疫処置されたマウスはすべて、十分に感染しやすく、ＧＳＴのみで免疫処置された１０のマウスのうち８もまた防御されなかった。興味深いことに、ワクチンのために使用されたタンパク質のアルキル化および還元（グループ３）は、マウスに与えられる防御を弱めた。このグループにおいて、すべてのマウスは感染され、かつ１０のうちの３が死に、残りのマウスは延ばされた高い寄生体を有した。この結果は、複合ＥＧＦ様領域を用いたワクチンによって介された、観察された防御を確実にし、防御を介するときジスルフィド結合によって強められる、エピトープの重要性を証明する。

組（＋）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、Ｉについてのｌ＃ｔ［ｉ：（ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ、４８アミノ酸（Ｂ）タイプ　アミノ酸（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｉ）分子タイプ：ペプチド（■）仮説　なしく１ｉｉ）アンチセンス　なしくＶ）フラグメントタイプ：インターナル（ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ：（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２についての情報：（ｉ）配ダ１４１性。

（Ａ）長さ＝４８アミノ酸（Ｂ）タイプ、アミノ酸（Ｄ）トボロジー：不明（ｉｉ）分子タイプ　ペプチド（ｉｉｉ）仮説　なしく　ｉｊｉ　）アンチセンス　なしくＶ）フラグメントタイプ　インターナル（Ｘｌ）配列の記載：’ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２Ａａｎ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｎ　Ｈｌｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａａｎ　５ｕ■ Ｇｌｙ　Ｃｙｅ　ｐＨｓ＾ｒｇ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ＾ｓｐ　Ｏ１ｕ＾ｒｇＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙａ　Ｌｙｓ　ＣｖＩ５Ｌｅｕ　Ｌａｕ２Ｇ　２５　３９（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３についての情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝５３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トボロジー：不明（ｉｌ）分子タイプ　ペプチド（肋）仮説、なしくｉｊ）アンチセンス：なしくＶ）フラグメントタイプ・インターナル（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、３：Ａａｎ　Ｐｒｏ　Ａｆｆｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａａｎ　Ａａｎ　Ｏｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ＡＢＰ　＾Ｉａ　Ａ８■ 人１ａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡｓＰ　ｆ３６ｒ　Ｇｌｙ　Ｈｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　丁ｈ■ ２９　２５　３θ Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＣｙＩ！Ｉ　Ｔｈｒ　ＬｙＩＳ　Ｐｒｏ　入ｇｐ　Ｇｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　oｈｅ３５　４Ｑ　４５（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４についてのｔｌ！：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ　５３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー　不明（ｉｉ）分子タイプ：ペプチド（ｉｉ）仮説：なしく１ｉｉ）アンチセンス：なしくＶ）フラグメントタイプ・インターナル（Ｘｌ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４：（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５についての情報。

（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝４２塩基対（Ｂ）タイプ、核酸（Ｃ）鎖：単一（Ｄ）Ｉ−ボロジー：直線（ｉ）分子タイプ・ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｉ）仮説、なしくｉｉ）アンチセンス：あり（ｘｉ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５＋丁＾入Ｇ＾ＧＣＴＣＧ　ＧＯ＾Ｔｃｃ＾ＯＡＴ　Ｇ＾＾ＣＡＴｒＴＣＡ　ＣＡＡＣＸＣＣＡＡＴ　ＧＣ４２（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６についての情報：（ｉ）配列特性・（Ａ）長さ＝３５塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：単一（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｌ）分子タイプ：　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｉ）仮説、なしくｉｉ）アンチセンス：あり（ｘ　ｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６：ＴＣＣＧＡＧＣＴＩＪ　（ＩＡＴｃ丁ＴＡＡＧＴ　ＡＧＧＡＴｒＴＧＧＡ　丁ｍｃ　３５（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７についての情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ＝４２塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（ＣＨＪＩ：単一（Ｄ）トポロジー・直線（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉ）仮説：なしくｉｉ）アンチセンス・あり（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７：ＴＡＡＧ＾ＧＣＴＣＧ　ＧＧ入丁ｃｃλＧＡＴ　ＧＡＡＴＣＣＡＡ入ＴＣＣＴ＾ＣＴＴＧＴ＾　＾ｃ　４２（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８についての情報：（１）配列特性（Ａ）長さ：３５塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）ｉｌ：単一（Ｄ）トポロジー・直線（ｕ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉ）仮説、なしくｉ）アンチセンス、あり（ｘ　ｉ）配列の記載二ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８：丁ＣＣＧＡＧＣＴＣＡ　ＧＡＴＣＴｒＡＧＴｒ　ＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧ　ＣＡＧＡ＾　３５（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、９についての情ｆｉｌ：（ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ　４２塩基対（Ｂ）タイプ、核酸（Ｃ’）ｉｎ：単一（Ｄ）トポロジー・直線（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉ）仮説：なしくｉｉ）アンチセンス：あり（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、９ＴλλＧλＧＣＴＣＧ　ＧＧＡＴＣＣＡＣ＾Ｔ　ＧＧＸＴＧＧＴＡＴＧ　Ｇ＾η了ＡＴｒλＧσ丁　４２（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１０にツいての情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ・７０塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）！Ｉｔ：単一（Ｄ）トポロジー・直線（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉ）仮説、なしくｉｉ）アンチセンス、あり（ｘ　ｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１０：ＴＣＣＧＡＧＣ丁ＣＡ　ＧＡ丁ＣＴＴＡＧＣＴ　ＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡ　ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧ　ＴＡＧＴｒＣｎ”ＣＣ＾ＧＣＴＡ＾Ｇ＾Ｔb６１１ＴＧＡＧＣＴＣＯＧＡ　７＠（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩについての情報。

（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ・１１アミノ酸（Ｂ）タイプ、アミノ酸（Ｄ）トポロジー、不明（ｉｉ）分子タイプ：ペプチド（ｉｉ）仮説：なしくｉ）アンチセンス、なしくＶ）フラグメントタイプ、インターナル（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩ：Ｇｌｙ　Ｉｔ＠Ｈｈｔ　Ｍｅｔ　Ａｍｐ　Ｏｌｙ　Ｎｅｔ　Ａａｐ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙｉ　５　１＠（１）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１２についての情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ、１０６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ＞１４：単一（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｉ）分子タイプ：ペプチド（ｉｉ）仮説：なしくｉｉ）アンチセンス、なしくＶ）フラグメントタイプ、インターナル（ｘ　ｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１２Ｍ＠ｔ　Ａ＋ｐ　Ｇｌｙ　Ｍａｃ＾ｅｐ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｃ’ｙｓ　Ｖａｌｌ　５　ｉｌｌ　１５ λＩ５ｐ　丁ｈｒ　Ａｒｇ　入ａｐ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ａａｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙａ　Ｐｈｅ　λｒ９　人ｓｐ　入ｓｐ　λａ■ ２＠　２５　３＋１ａｔｙ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｃｖｓ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ、Ｔｙｒ　Ｌｙ！Ｉ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌ■ ３５　４９　４コＡｆｆｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙａ　Ｖａｌσ１ｕ＾ａｎ＾ｓｎ　Ａａｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃｙａ　Ａｓｐ　ｌｌｅ＾６ｎ＾ａｎ　ＧＩＹ５１１　５５　６ｅ ■　ロー　（り　ローロー　ＬＬＪ　ＣＬ　ＣＪロ　（、！：）　ＣＩ　ＣＪく　０　く　ロ ε ・−−」Ｕ］Ｅ−ＩＱＱ　山　８Ｏｚ　Ｏ＋　（Ｊ　ＣＱＥ−Ｉｏ）ｌロ　に）　り〉　０　菌　り０　×　＜　り＞％ｚ（７）：！：　ン　０　り ×　リ　Ｕ　ＣＪ山　−（１）− 〇　区　山　国 −よ　ロ　〉ｓ、２　凹　０　＞ロ　に）　じ　ペ Σ　Ｅ−１ａ　ｚじ　０２：、　山ＯＺ　Ｚ　Ｅ。

Σ　ＯＨＱ。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　６年　８月２２日１、事件の表示国際出願番号・　ＰＣＴ／ＧＢ９３１００３６７２、発明の名称マラリアワクチンにおけるまたはそれに関する改良３、特許出願人住　所　イギリス、ダブリュ・トエヌ　４・エイ・エル　ロンドン、パーク・クレセント、２０名　称　メディカル・リサーチ・カウンシルｆ−目−ｑ１峠国籍　イギリス４、代理人住　所　大阪市北区南森町２丁目１番２９号　住友銀行南森町ビル請求の範囲１．実質的に図１　（Ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、１）に示す配列またはその機能的均等物を含むポリペプチドであって、メロゾイト表面プロティン１（ＭＳＰＩ）において本来近接して生じる配列から分離した、ポリペプチド。

２、実質的に図２　（Ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、３）に示す配列またはその機能的均等物を含むポリペプチドであって、ＭＳＰＩにおいて本来近接して生じる配列から分離した、ポリペプチド。

３、請求項１および／または請求項２のポリペプチドをコードする配列を含む、ヌクレオチド配列またはその機能的均等物。

４、請求項３のヌクレオチド配列を含む、ベクター。

５、適当な宿主細胞に挿入されるとき、ＭＳＰＩで採用されるコンフォメーションの請求項１および／または請求項２に記載のポリペプチドを発現させる、請求項４に記載のベクター。

６、請求項１および／または請求項２のポリペプチドが融合タンパク質として発現される、請求項４または５に記載のベクター。

７、融合タンパク質が、その精製を促進する部分を含む、請求項６に記載のベクター。

８、融合タンパク質が、請求項１および／または請求項２に記載のポリペプチドがタンパク質の残りのものから開裂されるかもしれないようになっている、請求項６または国際調査報告＋□−０６，ρＣＴ／ＧＢ　９３１００３６７、　−ＰＣＴ／ＧＢ　９３１００３６７フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／　Ａ６１Ｋ　３９１０１５　ＡＥＢ　９２８４−４Ｃ（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｎ　１／２１ＣＩ２Ｒ１：１９）（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、ＳＫ、　ＵＡ。

Ｓ（７２）発明者　チャペル、ジョナサン・アンドリューイギリス、エヌ・アール・２１７・イー・ビイ　ノーフォーク、フェイクンハム、トフトウリーズ・ハウス（番地なし）

Claims

【特許請求の範囲】

１．実質的に図１（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１）に示す配列を含むポリペプチドであって、メロゾイト表面プロテイン１（ＭＳＰ１）において本来近接して生じる配列から分離した、ポリペプチド。
２．実質的に図２（Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．２）に示す配列を含むポリペプチドであって、ＭＳＰ１において本来近接して生じる配列から分離した、ポリペプチド。
３．請求項１および／または請求項２のポリペプチドをコードする配列を含む、ヌクレオチド配列またはその機能的均等物。
４．請求項３のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
５．適当な宿主細胞に挿入されるとき、ＭＳＰ１で採用されるコンフォメーションの請求項１および／または請求項２に記載のポリペプチドを発現させる、請求項４に記載のベクター。
６．請求項１および／または請求項２のポリペプチドが融合タンパク質として発現される、請求項４または５に記載のベクター。
７．融合タンパク質が、その精製を促進する部分を含む、請求項６に記載のベクター。
８．融合タンパク質が、請求項１および／または請求項２に記載のポリペプチドがタンパク質の残りのものから開裂されるかもしれないようになっている、請求項６または７に記載のベクター。
９．請求項１および／または請求項２に記載のポリペプチドを作製する方法であって、請求項４から９のいずれか１つのベクターを、適当な宿主細胞に導入することと、その宿主細胞を増殖させることと、ポリペプチドまたはそのように生産されたポリペプチドを分離することを含む、ポリペプチドの作製方法。
１０．請求項４から８のうちいずれか１つに従うベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
１１．請求項１および／または請求項２に記載のポリペプチドと、生理学的に受容できる担体とを含む、ワクチン。
１２．請求項１および／または請求項２のポリペプチドが融合タンパク質として存在する、請求項１１に記載のワクチン。
１３．請求項１および請求項２のポリペプチドが、ＭＳＰ１で採用されたコンフォメーションに存在する、請求項１１または１２に記載のワクチン。
１４．人体を取扱う方法であって、請求項１１、１２または１３に従う、効果的な量のワクチンを投与することを含む、治療方法。