JPH07504564A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規プロテアーゼ 技術分野 本発明はバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ、の菌株から由来する洗剤用プロテ アーゼに関する。更に詳しくは、本発明はバシラスｓｐ、　ＰＤ１３８の菌株か ら由来する新規アルカリプロテアーゼに関する。更に、本発明はプロテアーゼの 製造方法、洗剤用酵素としてのプロテアーゼの使用、および本発明のプロテアー ゼを含んでなる洗剤組成物に関する。

背景技術 洗剤用酵素は２０年以上にわたって市販されてきておりそして全世界にわたって 粉末および液体洗剤において通常の洗剤成分として十分に確立されている。より 低温での洗浄の傾向にあり、洗剤用酵素の消費は近年増加している。洗剤中で用 いられる酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ並びに他の 酵素を含んでなる。商業的に最も重要なものはプロテアーゼである。

洗剤用プロテアーゼは、天然に見出されるプロテアーゼを単離し次いで洗剤中で 試験することにより開発されてきた。最良の洗剤用プロテアーゼはバシラス属の 構成員から得られる。最近、新しいタイプのプロテアーゼが市場に提供され、種 々の言及された条件下で良好な原価性能を与える可能性を提供する。

商業的プロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ”）、エスペ ラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ”）およびサビナーゼ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ”）　テあ り、これらは全てノボインダストリーＡ／Ｓ　（デンマーク）から提供されてい る。他の商業的起源のこれらのおよび他の類似の酵素製品は、洗剤溶液中、すな わちｐＨ８〜１１でおよび金属イオン封鎖剤、界面活性剤および漂白剤例えば硼 酸ナトリウムの存在下で活性である。アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ”）プロ テアーゼは、種バシラスリケニフォルミスの菌株により生産される。エスペラー ゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ”）およびサビナーゼ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ”）プロテアー ゼは、好アルカリ性バシリー（Ｂａｃｉｌ　ｌｉ）の菌株を培養することによっ て得られる。

発明の要約 本発明の目的は、高ｐＨおよび高イオン強度で改善された洗浄性能を有する新規 プロテアーゼを提供することにある。

従って、第一の面によれば本発明は２８ｋＤの見かけ分子量、９．５を超えるｐ ■、ｐＨ１１又はそれ以上に至適ｐＨ（２５℃で）、４５〜５５℃の範囲内に至 適温度（ｐＦＩ９．５で）および菌株バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ、　Ｐ Ｄ１３８゜ＮＧ　１Ｍ８４０３３８から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質 と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼを提供する。

第二の面において、本発明は菌株バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ、ＰＤ１３ ８により代表されるバシラスｓｐ、の菌株の単離された生物学的に純粋な培養物 に関する。より詳しい面において、本発明は菌株バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ｓｐ、ＰＤ１３８．　ＮＣｌＢ４Ｏ３３８、又はその突然変異体又は変異体に関 する。

第三の面において、本発明はプロテアーゼの製造方法を提供し、この方法はバシ ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ、　ＰＤ１３８のプロテアーゼ生産株を、炭素お よび窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養源培地中で培養し、次いで所望の 酵素を回収することを含んでなる。より詳しい面において、バシラス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ）ｓｐ、ＰＤ１３８．　ＮＣＩＭＢ４０３３８　、又はその突然変異体 又は変異体、又はバシラスＳｐ、　ＰＤ１３８から由来するプロテアーゼの免疫 化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼをコー ドする遺伝子を有する他の宿主生物を培養する。

第四の面において、洗剤用酵素としての酵素の使用が権利要求される。より詳し い面において、本発明は洗剤組成物およびプロテアーゼを含有する洗剤用添加剤 を提供する。

第五の面において、本発明はプロテアーゼを加えることを含んでなる洗浄方法を 提供する。

図面の簡単な説明 本発明を更に添付の図面を参照して説明する。

図１は、本発明に係る酵素の温度と蛋白質分解活性と温度の関係を示す（例１に 従って得られる酵素調製品、基質として２％のカゼインを用いそしてｐＨ９，５ での結果；■緩衝剤、口緩衝剤＋０．１％の５ＴＰＰ）。

図２は、本発明に係る酵素の蛋白質分解活性とｐＨの関係を示す（例１に従って 得られる酵素調製品、基質として１％のカゼインを用いそして２５°Ｃでの結果 ）。

発明の詳細な開示 微生物 ジャマイカの土壌のサンプルから単離された菌株によって代表される、本発明の 酵素を生産できる、本発明の新規微生物は、１９９０年１２月３日に特許手続上 の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、ナショナル　コレ ツクジョン　オブ　インダストリアル　アンド　マリーン　バクテリア（Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ［ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａ ｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）社（ＮＣＩＭＢ）　（英国、スコツトランド、ア ンダーソンＡＢ２１ＲＹ、マーチアートライブ、２３街）に、受託番号ＮＣＭＢ ４６３３８をもって寄託された。

本発明の微生物は、バシラス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ）属に属する好気性、胞子形 成細菌である。形態学的には、この細菌は直径０．７〜０．９ミクロンおよび長 さ２〜３ミクロンを有する自動性棒体である。胞子は球形から楕円形であり、中 心から終り近くまで胞子のうを膨張させていない。増殖のための至適温度は２５ 〜３７℃内にあり、そして増殖のための至適ｐＨは７〜９内であり、ｐｉ（７， ９では増殖せずそして５０”Ｃで増殖しない。微生物は、栄養源寒天斜面上で帯 黄色から黄色コロニー（丸形でかつ円滑）を形成し、そして寒天内への色素の拡 散は認められない。

微生物の培養 本発明の微生物は、同化性炭素および窒素並びに他の必須栄養源を含有する栄養 源培地中、好気性条件下で培養することができ、培地は公知の原則に従って構成 される。

適当な炭素源は炭水化物、例えばスクロース、グルコースおよびデン粉、又は穀 物、麦芽、米およびモロコシ類の如き物質を含有する炭水化物である。培地中に 導入される炭水化物の濃度は、広く変化でき、例えば２５％までかつ１〜５％以 下までであるが、通常８〜１０％が適当であろうしくパーセントはグルコースの 当量として計算される）。

普通培地中の窒素源は無機および／又は有機性のものであってよい。適当な無機 窒素源は、ニトレートおよびアンモニア塩である。

有機窒素源の内、全く多数のものが細菌の培養を含む発酵プロセスにおいて通常 用いられる。説明的例示は、大豆粉、綿実粉、ビーナツツ粉、カゼイン、トウモ ロコシ、コーンステイープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）　、酵 母エキス、尿素およびアルブミンである。加えて、培地は又有用な微量物質を含 有すべきである。

本発明の新規バシラス種はわずかに好アルカリ性である。従って培養は増殖培地 の滅菌後、炭酸水素ナトリウムの如き適当な緩衝剤を添加することによって得る ことのできる、わずかにアルカリ性ｐＨ値、１）８９．０で好ましく行うことが できる。タンク発酵槽内の培養に対し、人工通気を用いる必要がある。通気の速 度は通常のタンク発酵内で用いる速度（′−類似する。

発酵後、液体酵素濃縮物がブロスから粗い物質を除くことにより、又は所望によ り低温度で蒸発により又は逆浸透により濃縮することにより製造できる。

固体酵素調製品は、塩、例えばＮａｔＳＯａ、又は水混和性溶剤、例えばエタノ ール又はアセトンを用いて沈殿させることにより精製されたおよび／又は濃縮さ れたブロスから製造できる。適当な乾燥方法、例えば噴霧乾燥によるブロス中の 水の除去も又用いることができる。

蛋白質分解活性は、基質としてカゼインを用いて測定される。カゼインプロテア ーゼ単位（ＣＰＵ）は、標準条件下、すなわち２５°ＣおよびｐＨ９，５で３０ 分間インキュベーション下、（セリン標準と比較して測定された）１級アミノ基 の１ｍＭを放出する酵素の量として定義される。

分析方法を記載した小冊子ＡＦ２２８は、ノボノルディスクＡ／Ｓに要求により 入手可能であり、この小冊子をその番号を引用して本明細書に加入される。

酵素 本発明の酵素は新規洗剤用プロテアーゼである。この酵素は、炭素および窒素源 並びに無機塩を含有する、適当な普通接地中、本発明の微生物、好ましくはバシ ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｌ）、ＰＤ１３８．　ＮＣＩＭＢ４０３３８、又は それらの突然変異体又は変異体を培養することによって得ることのできるアルカ リプロテアーゼである。酵素は又組換ＤＮＡ工学によっても得ることができる。

本発明のプロテアーゼは次の特徴により記載することができる。

物理化学的性質 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された２８ｋＤの分子量。９．５を超えるｐｌはＬ ＫＢアムフォリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ■）ＰＡＧプレート上で等電点電気泳動 によっては正確に測定できなかった。プロテアーゼ活性は、ＰＭＳＰ、α−１− アンチトリプシンおよびターキー卵白（Ｔｕｒｋｅｙ−ｅｇｇ−ｗｈｉｔｅ）プ ロテアーゼにより阻害される。ＥＤＴＡおよび大豆蛋白質阻害剤はプロテアーゼ 活性に影響しない。

温度と活性の関係を、１％のトリポリリン酸ナトリウム（５ＴＰＰ。

多くの商業的洗剤中で、普通の成分）の存在下（白い四角形）および非存在下（ 黒い四角形）　、ｐＨ９，５でそして基質として２％のカゼインを用いて測定し た。先に述べた蛋白質分解活性の分析は、インキュベーション温度を１５°Ｃか ら７０℃の間隔内で変化させるという変形でもって用いられた。

結果を図１に示す。図１から明らかなように、酵素は１５℃未満の温度から７０ °Ｃ超の温度までで蛋白質分解活性を有し、そして４５〜５５°Ｃの範囲内、５ ０°Ｃ付近に至適温度を有する。

ｐＨに対する活性の依存性を、ｐＨ６〜１１の範囲内の予じめ定められたｐＨ値 に調節された緩衝液を用いる同じ手順によって測定した。

結果を図２に示す。図２から明らかなように、酵素は６未満ないし１１を超える ｐＨ値で蛋白質分解を有し、ｐＨ１Ｏ超に至適ｐｌを有し、より詳しくは少なく ともｐＨ１１に至適ｐＨを育する。

更に、本発明のプロテアーゼはヨーロッパタイプおよびアメリカタイプの洗剤中 、洗浄条件下２５°Ｃで６０分間安定である。

本発明のプロテアーゼは、高いイオン強度および高いｐＨを有する洗剤中で特に 有望である。洗浄能試験から、例えば例２より、９゜ｄＨ（ドイツ硬度）水中ｐ ｉ（１１で洗浄中、洗浄性能はアルカリバシラスブロテアーゼサビナーゼ（ＳＡ ＶＩＮＡＳＥ”ＸノボノルディスクＡ／Ｓ。

デンマーク）の洗浄性能よりもはるかに秀れていた。

免疫化学的性質 本発明のプロテアーゼは、菌株バシラスｓｐ、ＰＤ１３８．　ＮＣｌＢ４Ｏ３３ ８から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同−又は部分的同一（すなわち 、すくなくとも部分的同一）を有する。

免疫化学的性質は、交差反応同一性試験により免疫学的に測定できる。同一性試 験は、周知のオフテルロ二−二重免疫拡散法又はＮ。

Ｈ，アケルセン；　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔ ａｔｉｏｎ−ｉｎ−Ｇｅｌ　Ｔｅｃｈ−ｎｉｑｕｅｓｓ；ブラックウェルサイエ ンティフィック社（１９８３）　、５章および１４章に従い、双頭交差免疫電気 泳動により行うことができる。

単一特異性抗血清が、本発明の精製プロテアーゼを用い家兎を免疫することによ り前記方法に従って発生した。免疫源をフロイドアジュバントと混合しそして二 週毎に家兎に皮下注入した。８週の総免疫化期間後、抗血清を得、次いで免疫グ ロブリンを上記のＮ、　Ｈ，アケルセンにより記載した如くそこから調製した。

オクチルロ二−二重免疫試験は、本発明のプロテアーゼと公知のアルカリセリン プロテアーゼ、アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ”）　、サビナーゼ（ＳＡＶＩ ＮＡＳＥ”）　、エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ”）　、ズブチリンＮ０ＶＯ （／ボノルディスクＡ／Ｓより入手可能）、およびＫＡＺＵＳＡＳＥ”（昭和電 工より入手可能）９間で交差反応を示さなかった。

洗剤組成物 本発明に従い、プロテアーゼは洗剤組成物の一成分として典型的に添加できる。

そのようなものとして、プロテアーゼは洗剤用添加剤の形で洗剤組成物中に含有 できる。洗剤組成物並びに洗剤用添加剤は追加的に洗剤中で通常用いられる１種 又はそれ以上の他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダ ーゼ又はペルオキシダーゼを含有できる。

特異的面において、本発明は洗剤用添加剤を提供する。酵素は１種又はそれ以上 の酵素を含有する別個の添加剤を添加することにより、又は全てのこれらの酵素 を含んでなる組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物中に含ましめる ことができる。

好ましくは、洗剤用添加剤、すなわち別個の添加剤又は組合された添加剤は、粒 質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリーの形態で、 又は保護された形態で提供される。

無粉塵性粒質物は、例えば米国特許４．１０６．９９１および米国特許４、６６ １．４５２（双方ともノボノルディスクＡ／Ｓに付与）に開示される如く製造で きそして所望により当業者に公知の方法で被覆できる。

洗剤用酵素は造粒前又は造粒後に混合され得る。

液体酵素調製品は、例えば、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は 糖アルコール、乳酸又はホウ酸を確立された方法に従って添加することにより安 定化され得る。他の酵素安定剤は、当業者に公知である。

保護された酵素は、ヨーロッパ特許公開２３８．２１６に記載された方法に従っ て製造できる。

本発明の洗剤組成物は、如何なる通常の形態であってよく、例えば粉末、顆粒又 は液体である。液体洗剤は典型的には９０％までの水および０〜２０％の有機溶 剤を有する、水性であってよい。

洗剤組成物は、界面活性剤を含むことができ、これはアニオン、非イオン、カチ オン、両性又はこれらのタイプの混合物であってよい。洗剤は通常０〜５０％の アニオン界面活性剤、例えば直鎖アルキル　ベンゼン　スルホネ−１−（ＬＡＳ ）　、α−オレフィン　スルホネー）（ＡＯＳ）　、アルキル　スルフェート（ ＡＳ）　、アルコキシ　エトキシスルフェート（ＡＥＳ）又は石けんを含有する であろう。また、洗剤はポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤（例えば、国際 公開９２１０６１５４に記載の如き）を含有できる。

ｐｌｌ（水性洗剤溶液中で測定）は、通常中性又はアルカリ性、例えば７＝１． １であろう。洗剤は１〜４０％の洗剤用ビルダー、例えばゼオライト、ホスフェ ート、ホスホネート、シトレート、ＮＴＡ、　ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡアルケニル コホク酸無水物、又はシリケートを含有でき、又は洗剤はビルダー配合なしでも よい（すなわち本質的に洗剤用ビルダーを有しない）。洗剤は又他の通常の洗剤 成分、例えば布帛柔軟剤、起泡増進剤、漂白剤、例えばバーボレート、バーカー ボネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシ ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）　、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、金属イオン 封鎖剤、抗土壌−再付着剤、酵素（１以上）に対する安定剤、起泡抑制剤、染料 、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を含有できる。

本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態には次のａ）〜ｈ）が含まれる： ａ）ホスフェートビルダー、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、シリケ ート、使用において所望のｐＨに調節すべきアルカリ、および天然無機塩を含有 する洗剤粉末として配合された粉末組成物、ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン 界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル又は同等のポリマー、シリケート、 使用の際所望のｐＨに調節すべきアルカリ、および天然無機塩を含有する洗剤粉 末として配合される粉末組成物。

Ｃ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、有機酸、苛性アルカリ を含んでなる水性洗剤（使用の際７〜１０．５の値にｐＨ調節される）として配 合される組成物。

線状アルコキシル化第−アルコールから本質的になる液体非イオン界面活性剤、 ホスフェートビルダー、苛性アルカリを含んでなる非水性洗剤液体（使用の際約 ７〜１Ｏ８５の値にｐＨ調節される）と配合される洗剤組成物。

ｅ）洗剤粉末として、アニオン界面活性剤および非イオン界面剤低又は実質的に ０の中性無機塩、ホスフェートビルダーおよびナトリウムシリケートを含有する 、少なくとも６００　ｇ　／　ｉの嵩密度を有する粒質物の形態で配合された洗 剤組成物。

ｆ）洗剤粉末として、アニオン界面活性剤および非イオン界面活性剤、低又は実 質的に０の天然無機塩、ゼオライトビルダーおよびナトリウムシリケートを含有 する、少なくとも６００　ｇ　／　ｉの嵩密度を有する粒質物の形態で配合され た洗剤組成物。

ｇ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリルポリマー、脂肪酸石け ん、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、粘土粒子およびナトリウムシリケートを 含有する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。

ｈ）５〜６５重量％の界面活性剤、０〜５０重量％のビルダーおよび０〜３０重 量％の電解質を含んでなる液体圧縮洗剤組成物。

本発明の洗剤組成物において、（プロテアーゼ？）が洗液１１当たり（０，００ １−１００？）■に相当する量で添加されることが現在考えられている。

本発明を次の実施例（いかなる場合も請求の範囲で記載される本発明の範囲を制 限するものではない）により更に説明する。

例１ バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｌ）、ＰＤ１３８．　ＮＣｌＢ４Ｏ３３８を次 の組成（１１当たり）の培地１００ｒＩＬｌを含有する５００−のバッフル付エ ルレレマイカーフラスコ内で回転、振動テーブル（３００ｒ、　１１．　ｍ、　 ）上で２５°Ｃで培養した：ジャガイモデンプン　１００　ｇ 粉砕大麦　５０　ｇ 大豆粉　２０　ｇ ＮａＪＰＯｎ　Ｘ　１２ｔ（Ｊ　９　ｇプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠）　 Ｏ，ｉｇナトリウムカゼイネート　１０　ｇ 培地内のデンプンをα−アミテーゼで液化し、次いで培地を１２０°Ｃで４５分 間滅菌する。

滅菌後、培地のｐＨを炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液１０−を添加して９．０に 調節する。

４日間インキュベージコン後、培養物の蛋白質分解活性を前記方法を用いて測定 した。

培養後、ブロスの酵素活性は２０　ＣＰＵ／ｆであった。

固体物質を分離後、プロテアーゼを通常のクロマトグラフィー法により精製した 。

１１の培養ブロスからの収率は、１００ＣＰＵ／　Ｉ！を有する５（７であった 。純度は５Ｔ）Ｓ−ＰＡＧＥにより判断する如（，９０％以上であった。

この実施例に従って調製した調製品の特性は、この明細書中の先の部分に記載さ れておりそして該部分を参照される。

例２ 洗浄性能 洗浄性能試験を、４０℃で等温的に１０分間、草で汚れた綿について行った。

試験は、ｌｉ’当たり酵素蛋白質０．０１．０．０２５．０．０５．０．１．０ ．５および１．０■の酵素濃度で行った。

５、０　ｇ　／　ｆの商業上のヨーロッパの圧縮粉末洗剤を用いた。洗剤を約９ °ｄＦ（（ドイツ硬度）水に溶解し、次いでｐＨを１１に調節した。

繊維／洗液比は洗液ｌｌ当たり６ｇの繊維であった。

洗浄に続き、布を水道水でフラッシュし次いで風乾した。４６０ｎｎ＋での規約 反射率（％Ｒ）を測定した。洗浄性能の尺度として示差規約反射率ΔＲを用いた が、これは添加された酵素で洗浄後の規約反射率引く酵素を添加しないで洗浄後 の規約反射率に等しい。

これらの試験結果を表１に示す（２回の試験の平均）。

示差規約反射率の値は、本発明のプロテアーゼが高イオン強度および高９８を有 する洗剤中で特に可能性を有することを示しており、同時に本発明のプロテアー ゼは良好な洗浄能力を有する。

Ｃ フロントページの続き （７２）発明者　アースリュング、ドリト　アニタデンマーク国、デーコー−４ ０００ロスキルゼ、スボイエスレイ、フユウレン　８ （７２）発明者　リンデガールト、ポールデンマーク国、デーニー−２１００コ ペンハーゲン　ニー０．オニステル　セガゼ５２

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．次の特性： （ａ）２８ｋＤの見かけ分子量； （ｂ）９．５を超えるｐＩ； （ｃ）ｐＨ１０を超える至適ｐＨ（２５℃でかつ基質としてカゼインを用い）； （ｄ）４５〜５５℃の範囲内に至適温度（ｐＨ９．５でかつ基質としてカゼイン を用い）； （ｅ）菌株バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８．ＮＣＩＭＢ４０３ ３８から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化 学的性質 を有するプロテアーゼ。
2. ２．プロテアーゼが、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８により代 表されるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．の菌株から、又は菌株バシラス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８．ＮＣＩＭＢ４０３３８から由来するプロ テアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質をコードする 遺伝子を有する他の宿主生物から得ることのできるものである、請求の範囲第１ 項記載のプロテアーゼ。
3. ３．菌株バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８．ＮＣＩＭＢ４０３３ ８、又はその突然変異体又は変異体から得ることのできる、請求の範囲第１又は ２項記載のプロテアーゼ。
4. ４．バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８．ＮＣＩＭＢ４０３３８よ り代表されるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．の菌株の単離された生物学的 に純粋な培養物。
5. ５．菌株が、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８．ＮＣＩＭＢ４０ ３３８、又はその突然変異体又は変異体である、請求の範囲第４項記載の培養物 。
6. ６．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼの製造方法であ って、請求の範囲第４又は５項記載のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．のプ ロテアーゼ生産株を、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養源培 地中で培養し、次いで所望の酵素を回収することを含んでなる、前記方法。
7. ７．バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＰＤ１３８．ＮＣＩＭＢ４０３３８、 又はその突然変異体又は変異体、又はバシラスｓｐ．ＰＤ１３８から由来するプ ロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプ ロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物を培養する、請求の範囲第 ６項記載の方法。
8. ８．洗剤用酵素としての請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテア ーゼの使用。
9. ９．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼを含んでなる洗 剤組成物。
10. １０．更に１種又はそれ以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラー ゼ、ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼを含んでなる、請求の範囲第９項記載 の洗剤組成物。
11. １１．無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の 形態で提供される、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼ を含んでなる洗剤用添加剤。
12. １２．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のプロテアーゼを添加するこ とを含んでなる洗浄方法。
13. １３．請求の範囲第９又は１０項記載の洗剤組成物を添加することを含んでなる 、請求の範囲第１２項記載の洗浄方法。
14. １４．請求の範囲第１１項記載の洗剤用添加剤を添加することを含んでなる、請 求の範囲第１２項記載の洗浄方法。