JPH07504571A

JPH07504571A - 病原体−標的生物触媒

Info

Publication number: JPH07504571A
Application number: JP5515951A
Authority: JP
Inventors: クレア，ロベルト
Original assignee: クリージエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-05
Publication date: 1995-05-25
Also published as: DK0629244T3; ATE143053T1; ES2097497T3; DE69304899T2; WO1993018162A1; CA2130832C; AU680407B2; AU3795093A; EP0629244A1; DE69304899D1; CA2130832A1; EP0629244B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウィルスを含む病原体生物は、食作用を受けた後のそれらの体内動態に基づき様々な種類に分類することができる。例えば食作用を受けた時にすぐに破壊される生物（すなわち肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌）は細胞外寄生体として振る舞い、病原性細胞の外に留まる限り組織を破壊するにすぎない。

細胞外寄生体として作用する病原体は、抗病原性表面成分に対して病毒力を所有する。多くの病原性細菌は、例えば高分子量多糖を含む莢膜を保持している。莢膜、食作用および病毒力の間の関係は肺炎連鎖球菌により明らかに例示されている。完全に莢膜化されたＳ（平滑）株は食作用（抗体の不在で）に耐性であり、マウスに対して高い毒性をもち、一方その非莢膜化Ｒ（粗面）変異体は容易に貧食され、本質的に非毒性であることが分かっている。しかし莢膜多糖の酵素的除去により、または抗体との組み合わせによりＳ生物体は無毒性、かつ貧食を受けることができるようになる。

細胞外寄生体とは対照的に、ふたつの種類の細胞内寄生体が存在し、両方とも禽食細胞中で増殖できる。この細胞内寄生体の１種は、絶対細胞内寄生体（すなわちリケッチア、クラミジア）である。ウィルスを含むこれらの生物体に関しては、そこれらの取り込みについて必須である細胞表面上のレセプターの微妙な差異が耐性に極めて重要である。

多くの病原体は、細胞内または細胞外にかかわらず、臓器向性である。

したがってそれらが感染する、または冒す組織または細胞−型に関して高度に選択的である。組織親和性のひとつの決定子は、ひとつの宿主−型の上にはあるが他には無い特別なレセプターに対する接着を促進する、病原体上の表面巨大分子の存在である。例えば特異的細菌接着の役割は、今では宿主組織または細胞−型の選択的集団化で、益々認識されるようになっている。多くの絶対細胞内寄生体については、有機栄養的接着の原因である分子も病原体の内面化に重要である。

この細胞−特異的相互作用を遮断することは病原性を破壊するのに役立つ。例えば病原体表面構造物に対する抗体は、オプソニン化によるだけでなく、接着に関与する抗原を被覆することにより免疫を促進する。

さらに体内分泌では、分泌された細胞表面構造物に緊密に関連した糖タンパク質が、固定されたレセプターと競合することにより宿主防御の役割を果たし、これにより接着性病原体の吸着を妨げる。

ウィルスは非細胞性であるが、原核または真核細胞系よりはるかに単純である。

それらは群として極度に均一的であるが、すべてのウィルスは共通な特定の基本的性質を持つ。すべてのウィルスは絶対細胞内寄生体である。すなわちそれらはある宿主細胞中に存在しなければ複製できない。宿主細胞外ではウィルスは粒子、またはヴイリオンとして存在し、その中でウィルスの遺伝物質はタンパク質サブユニットから成るキャプシド殻中に包含され、場合によっては膜エンベロツブも同様である。

所定のウィルスは特定の細胞−型にのみ感染するという、ウィルスが細胞−特異的親和性を表すことが実証されている。ウィルスの宿主細胞の範囲は、細胞に対する付着の特異性により決定され、これはヴイリオンキャプシドおよび細胞表面上の特異的レセプターの両方の性質に依存する。例えばインフルエンザウィルスはキャプシド構造の一部として、ウィルスが宿主細胞に存在するレセプターに結合し易すくするヘモアグルチニンタンパク質を有する。これらの制限はトランスフェクションが起これば消失する、すなわち裸のウィルス核酸により感染が行われた時は、その入り口はウィルス−特異的レセプターに依存していない。

ＣＤ４はＴリンパ球のサブセット上に主に見いだされる表面種タンパク質であり、クラス■主要組織適合系（Ｍ）ＩＣ）抗原およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の両方のレセプターである。ＨＩＶウィルスのＣＤＡ＋細胞に対する親和性は、直接的結合ならびにピリオン−会合ｇｐ１２０タンパク質とＣＤ４との間の高い親和性相互作用を介して支配されている（ＭｃＤｏｕｇａｌら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１：３８２および１ａｓｋｙら（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０：９７５）。さらに、エンベロツブタンパク質を発現している細胞はＣＤ− ４提示細胞とカルチャー中で融合しくＬｉｐｓｏｎら（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２３ニア２５　：　５ｏｄｖｏｓｋｉら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２２：４７０）　、多核融合細胞を形成する。

多（のＣＤ４のアミノ−末端免疫グロブリン一様ドメインはｇｐ１２０に結合するに十分であるが、第ニドメインも結合に寄与していることが実証された（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４　；　Ｂｅｒｇｅｒら（１９８８）ＰＮＡＳ　８５：２３５７　；　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ　８５：６１０２およびＣ１ａｙｔｏｎら（１９８８）Ｎａｔｕ民η５：３６３）。さらにエンペロツブ糖タンパク質、ｇＰ１２０の炭水化物 −仲介相互作用に関する研究により、細胞表面への結合もｇｐ１２０の炭水化物部分が関与していることが証明された（Ｌａｒｋｉｎら、１９８９ＡＩＤＳ　３ニア９３）。

ＨＩｖウィルスの増殖を阻止することを対象とする抗ウイルス治療は、ＣＤ４とｇｐ１２０とを間の相互作用を特異的に阻害することに向けられて来た。

方法にはｇｐ１２０の種々のエピトープに対する抗体が関与し、例えばｇｐ１２０の部分に似た免疫源性ペプチドでの免疫、あるいは抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体の投与が容易になった。天然または組換えｇｐ１２０の両方は、細れた変異体のみを中和化している。

ヒトおよびマウスを対象とした研究では、ｖ３ループまたは主要中和決定子と名づけられたｇｐ１２０の小さな領域（ふたつの不変、ジスルフィド−架橋システィンの間の約３５残基を含んで成る）　（Ｃｙｓ−３０３からＣｙｓ−３３８：３３３）　、このドメインのアミノ酸配列の分析によれば、ｖ３ループの中央部分中の１４のうちの９つで８０パーセントより良く保存されていることが分かり、ｖ３ループ可変性に関する拘束があることを示唆している（ＬａＲｏｓａら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：９３２）　。これらの結果は、コンセンサスｖ３ループ配列および構造の類似性ゆえに選ばれたＨＩＶワクチン免疫源は、多くのＨＩＶ単離物を中和化する抗体を誘導するであろうことを示唆している。

ＣＤ４の可溶性形は、おそらくウィルスまたは感染細胞表面上のｇｐ１２０に結合し、覆うことにより、ＩＩＩＶｇｐ１２０とＣＤ４＋の間の相互作用を阻害できる（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１　：　７６　；　Ｃｈａｏら（１９８９）、ＴＢＣ２６４：５８１２　およびＣａｐｏｎら１２０の結合を阻害する硫酸デキストランおよびアラリントリカルポン酸のような化合物を、ＨＩＶの予防に使用するために調査した（Ｓｃｈｏｌ、ｓら（１９８９）ＰＮＡＳ　８６：３３２２およびＬｄｅｒｍａｎら（１９８９）Ｊ、　ＩｍｍｕｍｏＬ　１４３：１１４９）　。最近、Ｎ−カルボキシメトキシ−カルボニル−プロリル−フェニルアラニルベンジルエステルが、ＣＤ４への結合を妨げるようにｇｐ１２０を不可逆的に変性させ、ＩＩＩＶ−１の感染を阻害することが示された（Ｆｉｎｂｅｒｇら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：２８７）。

ＨＩＶ感染細胞を標的とするトキシンの使用も調査された。例えばＣＤ４のｇｐ１２０−結合ドメインは、ｎｘＶｇｐ１２０分子を発現している細胞が選択的に破壊されるようにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシンＡ分子ブタンバク質のエピトープ、ｇｐ１２０またはｇｐ４１に特異的なヒトモノクローナル抗体を含んで成るイムノトキシン（リシンＡ鎖またはジフテリアトキシンのようなトキシンに連結した）はｆｌＩＶ感染細胞を特異的に殺すために採用された（Ｔｉｌｌら、（１９８９）ＰＮＡＳ嬰：１９８７）。あるいはＣＤＪ＋を標的トシたポークライードマイトジェンはｔｌＩＶタンパク質合成を効率的に遮断し、かつ感染患者由来の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞中でＨＩＶ生産を強（阻害することが示された（Ｚａｒｌｉｎｇら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　３４７：９２）。

ＨＩＶ−１ウイルスのｖ３−型特異的中和ループの頂部に接近した位置に、トリプシン様、またはキモトリプシン様の特別な酵素により、あるいはアスパラギン酸プロテアーゼにより、タンパク質溶解開裂を受ける可能性がある幾つかの部位が存在することが報告された（例えばＣ１ｅｍｅｎｔｓら、１９９１、エイズ調査およびヒトレトロウィルス（＾ＩＤＳ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａり編入される）。

発明の要約本発明は病原性を阻止するために、病原体を特異的に標的として結合し、かつ病原体の成分を破壊する生物触媒に関し、ならびに病原体生物による感染を防御または処置する方法に関する。この生物触媒は病原体表面成分に特異的に結合する結合剤、および病原性が阻止されるように病原体の成分を分解する触媒部分を含んで成る。結合剤および触媒部分は化学薬品または遺伝子工学的技法により連結される。

結合剤は典型的には抗体、レセプターまたはそれらのいずれかの類似体であり、標的表面成分に特異的である。あるいは結合剤はポリアニオン性またはポリカチオン性分子で、病原体の表面成分の荷電した決定子にイオン的相互作用によって結合できるものである。

触媒部分は酵素または触媒的抗体であり、病原体の成分を分解あるいは実質的に変更して病原性を阻止する。酵素の例には、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼおよび他の加水分解酵素がある。触媒部分によって分解されるように標的とされた病原体の成分は、結合剤により結合するために標的とされた成分と同じ、または異なってもよい。細菌に関しては、標的成分は莢膜構造であることができる。ウィルスに関しては表面成分はエンベロツブタンパク質または糖タンパク質であり、好ましくはウィルスの細胞性レセプターと相互作用し、かつ感染の機構に関与するものである。ひとつの例はＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロツブタンパク質である。この成分を標的とするためには、結合剤はｇｐ１２０に特異的な抗体、またはｇｐＬ２０に結合できるＣＤ４レセプターの部分であり得る。

本発明の生物触媒は、病原体生物による感染を予防または処置するために使用できる。生物触媒は宿主生物に、生理的に受容しうる賦形剤中に病原性を阻止するに十分量で投与される。

図面の簡単な説明第１図はＣＤ４遺伝子断片の二重鎖核酸配列を表す。

第２図はｔＰＡの触媒的ドメインをＰＣＲ増幅するための５゛および３°アンブリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を表す。

第３図はＣＤ４／ｌＰＡ融合タンパク質を創作するために使用した種々のプラスミドを表す。

第４Ａおよび４Ｂ図はＣＤ４／ｌＰＡ融合遺伝子の核酸配列および対応するアミノ酸配列を表す。

第５図はトロンビンの断片を含有する触媒的ドメインをＰＣＲ増幅するための５ ′および３゛アンブリマーを表す。

第６Ａおよび６Ｂ図はＣＤ４／トロンビン融合遺伝子の核酸配列および対応するアミノ酸配列を表す。

発明の詳細な記述病原体の表面成分は病原体の生存に主要な役割を果たすことができ、それゆえに宿主に対する病原性に主要な役割を果たすことができる。例えば所定の表面成分は病原体と宿主細胞、または組織との相互作用に重要であり、従って病原体の組織−親和性の決定因子である。細胞内病原体に関しては、表面成分は細胞中への導入に必要であり、一方細胞外病原体の場合には、特定の表面成分が食作用の回避に必須である。細胞壁を作るタンパク質、脂質および多糖、細胞内貧食および飲作用成分を含む栄養レセプター、ならびに走化性レセプターのような他の表面成分も、病原体の生存に重要である。本発明は病原性に必要な病原体の表面成分に対する生物触媒を提供し、これはこの成分に対して触媒的部分が作用した時にこの分子の機能的統合性を破壊することによって病原体性を崩壊させるものである。

本生物触媒の際立った利点は、病原体に対する分子の作用の性質にある。上述したように、病原体の表面成分と宿主細胞との間の相互作用が病原性に関連している。一般的にこれらの相互作用を破壊することは、表面成分に含まれる少なくともひとつの必須決定子に結合し、かつ覆う分子を使用する方法により達成されてきた。典型的なマスキング分子は可溶性レセプターのようなものであり、マスキング分子は触媒的というよりはむしろ化学量論的に作用するため、効率的に病原体を中和化するためには多数の分子の循環が必要である。本発明の病原体−標的生物触媒は、病原体の表面成分に対する触媒部分を対象とする。表面成分は分解され、正常な病原体／細胞相互作用は破壊され、それにより病原性を阻止する。

生物触媒の効力は表面成分の分解に際し、分子が反応により“消費゛されないという事実によって増強される。

多くの現在の治療法は、結合した成分を覆う作用により、病原体の表面成分の機能に影響を与えて病原性を阻止することを対象としている。

■、生物触媒本発明の病原体−標的生物触媒は、病原体の表面成分を特異的に認識し、かつ結合する結合剤、ならびに表面成分−またはその近くに位置する他の成分を表面成分の機能的統合性が破壊され、かつ病原性が崩壊するように分解する触媒部分を含んで成る。例えば、病原体の表面成分と宿主細胞との間の相互作用は妨害され、これにより病原性が阻止される。

Ａ、結合剤病原体の表面成分に対する結合剤は、好ましくは病原体の決定子に特異的であり、宿主成分に対するよりも実質的に低い結合親和性を持つ。

結合剤の会合定数は、十分な選択性を提供するように選ぶ、または作り上げることができるが、生物触媒が受け入れられる速度で“回転“するように十分低い。

結合剤は抗体またはそれらの結合断片を含んで成ることができ、限定されるものでないが次のものを含む；重鎖または軽鎖起源のいずれかの個々の鎖抗体；軽鎖（Ｖ、）または重鎮（Ｖ、）または両方を含有する断片由来の可変領域、あるいはその部分；　Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）　、、Ｆｖ％　ＳＦＶ　（単鎖抗体）または実質的に同様な抗体断片：重／軽鎖（ＨＬ）対。　さらに抗体または結合剤はキメラ抗体であることができ、このひとつの部分はヒト由来であり、残りは他の種由来のものである。例えば病原体の表面成分に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域を、ヒトの重および軽鎖中に工学的に導入できる。さらに好ましくは、マウス相補性決定部位（ＣＤＲｓ）または超可変領域をヒト重および軽鎖の可変領域に工学的に導入することである。この種のキメラ抗体の利点は、非− 自己抗原の組み合わせが少ないので、免疫源性が低いことにある。このタイプの抗体の構築法はＲｅ１ｃｔ＋ａｌａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３２二３２３　；　Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　３２９：１５３４　；　Ｓｕｎら、（１９８７）ＰＮＡＳ　８４：２１４　；およびＪ。

ｎｅｓ　ラ、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２に記載され、これらを引用することにより本明細書の内容とする。

結合剤はまた１ノセブター、またはレセプターの部分であって病原体の表面成分に特異的に十分結合するものである。レセプターは単一ペプチド鎖、または内因性のジスルフィド結合または外因性の化学的架橋により多ペプチド鎖に維持されたものであることができる。レセプターを細胞の表面から開裂して精製することができる。あるいは配列をクローン化し、精製のために外因系で発現させることもできる。

場合によっては、電荷の偏りを有する表面成分の決定子とのイオン的相互作用を利用する分子を使用することが適当なこともある。オリゴヌクレオチド、ヘパリン、レンチナンおよび同様な多糖鎖のようなポリアニオン性またはポリカチオン性結合剤、ポリ−アスパラギン酸、ポリ−グルタミン酸、ポリ−リシンおよびポリ−アルギニンのようなポリ−アミノペプチド類、または他の結合剤が、生理的ｐＦＩでそれらの構造全体にわたって多くの負の、または正の電荷を保持し、タンパク質部分に特異的に結合するために使用できる。同様に、疎水性結合を利用する結合剤が、生物触媒を標的とするために利用できる。

Ｂ、触媒部分病原体−標的生物触媒は、任意のプロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、または他の加水分解酵素であることができ、あるいはイソメラーゼ類、トランスフェラーゼ類（キナーゼ類を含む）、リアーゼ類および酸化還元酵素類を含む酵素的活性であり、病原体の表面成分を分解できるその他の酵素活性である。病原性を阻止するために、絶対細胞内寄生体の場合には、分解は病原体が宿主細胞の表面成分に結合する能力を壊し、または場合によっては寄生体の生存に必須な他のいくつかの表面成分を壊すことができる。細胞外寄生体の場合には分解は貧食作用を容易にするか、あるいは生存に必須な他の成分を破壊する。

本目的に利用できるプロテアーゼ類、または触媒的に活性なそれらの断片の例として、セリンプロテアーゼ類、システィンプロテアーゼ類、アスパラギンあるいは酸プロテアーゼ類、メタロプロテアーゼ類、あるいは宿主細胞または組織との生産的相互作用に、あるいは素置作用の回避に際し必要な結合決定子を破壊するために、表面成分のアミド骨格を開裂できる任意の他のプロテアーゼ類である。

本明細書では、グリコシダーゼ類は病原体の表面成分の炭水化物構造を変化させることができる糖溶解酵素と定義し、例えば炭水化物が仲介する病原体の表面成分と宿主細胞との相互作用が病原性に重要な場合に有用である。リゾチームは多糖に対する加水分解酵素の例であり、細菌の細胞壁のグリコシド結合を加水分解する酵素能力により細菌溶解性であることが実証された。同様にリパーゼは、結合を妨害し、貧食作用を容易にし、あるいは病原体の生存能力を破壊するために病原体の膜構造を変化させるために使用できる。

天然に存在する酵素は精製でき、あるいは可能である時には組換え酵素を発現させて精製することができる。組換えタンパク質の場合には、容易な精製を進行させる変異体を加えること、あるいは化学連結基での誘導を支配することが有用である。例えば、システィンの導入のような部位−特異的突然変異誘発法による遊離のスルフヒドリル基の付加は、水銀−誘導化カラムによる精製を行うことを可能にし、ならびに化学連結試薬のための反応部位を提供できる。

タンパク質は適当な触媒活性が精製したタンパク質に付随するかぎり、全体で、または断片で得ることができる。場合によっては酵素は前駆体（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）として単離することもでき、活性な酵素の成熟体を提供するだめに酵素的開裂のような修飾が必要である。

本発明の触媒部分として有用なプロテアーゼ類には次のものがある：キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、組織−型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）　、ウロキナーゼ（ＵＫ）　、単鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕ− ＰＡ）、トロンビン、カリクレイン、アクロシン、カテプシンＧ１凝固因子■ａ、　ＩＸａおよびＸｌａ；カテプシンＢ１パパイン、フィシン、キモパパイン、クロストリパインおよびカテプシンＬのようなシスティンプロテアーゼ類；ならびにペプシン、キモシン、およびカテプシンＤのような酸プロテアーゼ。

多くの精製セリンプロテアーゼが市販されており、次のようなものがある：ヒト白血球由来白血球エラスターゼ（シグマ（Ｓｉｇｕｍａ）　：カタログ番号Ｅ１５０８）　；ヒト唾液由来膵臓エラスターゼ（シグマカタログ番号Ｅ１６３３）　；ヒト血漿由来プラスミン（シグマカタログ番号Ｐ４８９５）　；ヒトミエローマ細胞カルチャー由来　単鎖−ｔｐ＾（シグマカタログ番号Ｔ７７７６）；組換え二重鎖ｔ−ＰＡ　（シグマカタログ番号Ｔ４６５４）　；ヒト腎臓由来ウロキナーゼ（シグマカタログ番号Ｕ３００４）　、ヒト尿由来ウロキナーゼ（シグマカタログ番号０６８７６）　、）リブシン（シグマカタログ番号Ｔ８００３）　；およびアルファーキモトリプシン（シグマカタログ番号Ｃ７７６２）。

他の有用な酵素には次のようなものがある：膵臓リパーゼ；リポプロティンリパーゼ類；モノグリセリドリパーゼ；スフィンゴシル−グルコピラノシド；スフィンゴミエリナーゼ：フォスフォイノシシド類；フォスフォリパーゼ類：カルボキシペブチダーゼ、アミノペプチダーゼおよびジペプチダーゼのようなペプチダーゼ類；グルコシダーゼ類；グルカナーゼ類：ガラクトシダーゼ類：マンノシダーゼ類；アミラーゼ類およびデキストリナーゼ類。

さらに触媒部分は触媒的抗体であることができる。任意の目的分子に選択的に結合する抗体を生成できるので、この技術は高度に選択的な触媒を作り上げる可能性を与える。触媒的抗体の作成法は、Ｌｅｒｎｅｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：６５９　；　Ｂｅｎｋｏｖｉｃら　（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：１１３５　；　Ｔｒａｍｏｔａ氏B ら（１９８６）Ｓｃｊ、ｅｎｃｅ　２３４：１５６６に開示され、これらすべては引用により本明細書の内容となる。あるいは触媒的抗体の作成は、ウオーク− スルー突然変異誘発法（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２３６２を参照、これも引用により本明細書の内容となる）のような方法により行うことができる。

■、生物触媒の作成法触媒部分は、化学的カップリング法または遺伝子工学を含む多くの方法により結合剤と連結することができる。

Ａ、　化学的カップリング試薬当業者には周知の多くの化学的−架橋試薬がある。本発明に好ましい架橋試薬はへテロ三官能性架橋剤であり、これはタンパク質を段階的に連結するために使用することができる。ヘテロ三官能性架橋剤はタンパク質を結合するために、より特別なカップリング法を設計する能力を提供し、これによりホモ−タンバク質ポリマーのような望ましくない副反応の発生を減少させる。様々なヘテロ三官能性架橋剤が当業者に周知である。それにはスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）　、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）　；Ｎ−スクシンイミジル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）　、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）　、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）　；　４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルネ（ＳＭＰＴ）　、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）　、スクシンイミジル　６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−トコヘキサノエート（ＬＣ−３ＰＤＰ）。これらのＮ− ヒドロキシスクシンイミジル部分を有する架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができ、これは一般的に水溶性がより高い。さらに、結合鎖中にジスルフィド結合を有するこれらの架橋剤は、インビボでのリンカ−開裂量を減少させるようにアルキル誘導体の代わりとして合成できる。

ヘテロ三官能性架橋剤に加えて、ホモニ官能性および光反応性架橋剤を含む多くの他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）　、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭ［］）およびジメチルピメルイミデート・２）ＩＣＩ（ＤＭＰ）は本発明での使用に有用なホモニ官能性架橋剤の例であり、ならびにビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］　ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４′−アジド−２′−二トロフェニルーアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡ）］）は本発明での使用に有用な光反応性架橋剤である。最近のタンパク質カップリング法に関する総説は、Ｍｅａｎｓら、（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１：２−１２　（引用により本明細書の内容となる）を参照にされたい。

上記に含まれるひとつの具体的に有用な種類のへテロ三官能性架橋剤は、第一アミン反応性基を含む、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、または水溶性の類似体Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）である。

アルカリ性のｐＨでの第一アミン（リシン　イプシロン基）は、プロトン化されておらず、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＢＳエステルへの核的攻撃により反応する。

反応はアミド結合を形成し、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳを副産物として遊離する。

ヘテロ三官能性架橋剤の一部として有用な他の反応基は、チオール反応基である。よくあるチオール反応基はマレイミド類、ハロゲン類およびピリジルジスルフィド類である。マレイミド類は特異的に遊離のスルフヒドリル（システィン残基）と、数分内に、わずかに酸性から中性（ｐＨ６，５−７，５）の条件下で反応する。ハロゲン類（ヨウドアセチル官能基）は−８Ｈ基と生理的ｐＥＩで反応する。これらの両方の反応性基は安定なチオエーテル基を形成する。

ヘテロ三官能性架橋剤の第三の成分はスペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ　ａｒｍ）またはブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）である。ブリッジはふたつの反応性末端を連結する構造である。このブリッジの最も明らかな特質は立体障害に対する効果である。より長いブリッジは、連結する必要があるふたつの複雑な生体分子間を容易につなぐことができる場合がある。例えばＳＭＰＢは１４゜５オングストロームの全長を有する。

ヘテロ三官能性架橋剤を使用してタンパク質−タンパク質複合体を作成することは、アミン反応およびスルフィドリル反応が関与する二段階工程である。アミン反応である第一工程について、選択したタンパク質は第一アミンを有するべきである。これはりシンのイプシロンアミンまたは多くのタンパク質に見いだされるＮ−末端の第一アルファ　アミンである。タンパク質は遊離のスルフィドリル基を含有してはならない。

結合すべきタンパク質の両方が遊離のスルフィドリル基を含有する場合には、ひとつのタンパク質を例えばＮ−エチルマレイミドを使用してスルフィドリル基を遮断するように修飾することかできる（Ｐａｒｔｉｓら、（１９８３）　Ｊ、　Ｐｒｏ、　Ｃｈｅｗ、　２：２６３を参照、これは引用１：ヨリ本明細書ｉ：Ｉｉ人）　、　特定のタンパク質のスルフィドリルの量を計算するために、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬を使用できる（例えばエルマンら、（１９５８）Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、　７４：４４３、およびＲｉｄｄｌｅｓら、（１９７９）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　９４　ニア５を参照、これらは引用により本明細書の内容となる）。

反応緩衝液は、外因性のアミン類およびスルフヒドリル類を含有すべきではない。反応緩衝液のｐｆｌは７．０から７．５の間である。このｐＨ範囲はマレイミド基がアミン類と反応するのを防止し、マレイミド基をスルフヒドリルとの第二反応のために保護する。

ＮｔｌＳ−エステルを含む架橋剤は水溶性に限界がある。それらは、架橋剤を反応混合物に導入する前に最少量の有機溶媒（ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）に溶解すべきである。架橋剤／溶媒は、反応が起こることを可能にする乳剤を形成する。

スルホ−ＮＨＳエステル類似体は、より水溶性であり、反応緩衝液に直接加えることができる。高イオン強度の緩衝液は、スルホ−ＮＨＳエステルが“塩析”する傾向があるので避けるべきである。加水分解による反応性の損失を避けるために、架橋剤はタンパク質溶液を溶解した直後に反応混合物に加える。

反応は濃縮タンパク質溶液でより効率的である。反応混合物のｐＨをアルカリ性にするほど、反応速度は速くなる。ＮＨＳおよびスルホ−ＮＨＳエステルの加水分解速度も、ｐｎの上昇にともない増加する。より高い温度で加水分解およびアシル化の両方の反応速度が上昇する。

いったん反応が完了したら、第一タンパク質はスルフヒドリル反応部分で活性化されている。活性化されたタンパク質は反応混合物から単純なゲル濾過または透析により単離できる。架橋の第二工程であるスルフヒドリル反応を行うために、マレイミドとの反応に選ばれたタンパク質、活性化ハロゲンまたはピリジルジスルフィドは遊離のスルフヒドリルを含有していなければならず、通常はそれはシスティン残基由来のものである。遊離のスルフヒドリルはタンパク質ジスルフィドの還元により生成できる。あるいは第一アミンをトラウドの試薬（Ｔｒａｕｔ ’　ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）で修飾して、スルフヒドリルを加える（１１１Ｂｔｔｅｒら、（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ　２４：１５１７、引用により編入）。タンパク質中の可能なスルフヒドリルを計算するためにエルマン試薬を再度使用できる。

すべての場合において、緩衝液はスルフヒドリルの酸化を防止するために脱気しなければならない。ＥＤＴＡは緩衝液中に存在しうる任意の酸化金属をキレート化するために加えることができる。緩衝液はいかなるスルフヒドリル含有化合物も含むべきではない。

マレイミドはわずかに酸性から中性のｐＨ範囲で（６，５−７，５）　−３Ｈ基と特異的に反応する。中性ｐＨは、ハロゲンおよびピリジルジスルフィドが関与する反応に十分である。このような条件下で、マレイミドは一般的に一８Ｈ基とおよそ数分で反応する。ハロゲンおよびピリジルジスルフィドにはより長時間を要する。

アミン反応工程で調製した第一スルフヒドリル反応性−タンパク質を、適当な緩衝液条件下でスルフヒドリル−含有タンパク質と混合する。タンパク質−タンパク質結合体を、反応混合物からゲル濾過または透析により単離できる。

Ｂ１組換え融合タンパク質本発明の生物触媒は融合タンパク質として構築でき、ひとつの連続的ポリペプチド鎖中に触媒部分および結合剤を含有する。融合タンパク質の調製においては、結合剤、触媒部分の配列、および場合によってはふたつの断片っくなぐペプチドリンカ−配列を含んで成る配列をコードするＤＮＡを含んで成る融合遺伝子が構築される。この融合タンパク質を作成するために、酵素全体をタンパク質の一部としてクローン化および発現させることができ、あるいは触媒部分を含有する適当な断片を使用できる。同様に、レセプターまたは抗体のような結合剤のクローン化コード配列全体、あるいは病原体の表面成分に結合できる分子の断片を使用できる。翻訳産物が所望の融合タンパク質である融合遺伝子を創作するために組換えＤＮＡ技術を使用することは、当業者にとっては周知である。

遺伝子およびその制御領域の両方のコード配列を再度設計して、タンパク質産物の機能的特質、作成されるタンパク質量またはタンパク質を生産する細胞の型を変化さることができる。遺伝子のコード配列は広範囲に変更することができ、例えばその部分を異なる遺伝子のコード配列と融合して、融合タンパク質をコードする新規ハイブリッド遺伝子を作成する。融合タンパク質の生産法の例は、ｐｃ丁出願ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２９６８、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０３５８７、ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７３３５、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３３旦：６８に記載され、これは引用により本明細書の内容となる。

融合遺伝子の作成法は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の連結が連結のための平滑−末端、または粘着−末端法、適当な末端を提供るすための制限酵素消化、適当な付着末端への組み込み、所望でない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用して従来技術に従い行われる。場合によっては融合遺伝子は自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成できる。

融合タンパク質分子を発現させるために、転写および翻訳制御要素、ならびに融合遺伝子構造に対する他の非−コード配列を含むことが望ましいかもしれない。

例えば構造および誘導プロモーターを含む制御要素、エンハンサ−またはインヒビターを包含することができる。

これらの制御コントロール配列には、例えばｌａｃ系、β−ラクタマーゼ系、廿ｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ラムダファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、酵母α−接合因子のプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウィルス後期プロモーター、ＧＣボックス、反復７２塩基対、ＴＡＴＡボックス、ＴＡＲトランス活性化配列、シャインーダルガーノ配列、ＩＰＴＧ誘導プロモーター、ならびに原核または真核細胞またはそれらのウィルスおよび種々のそれらの組み合わせを制御する既知の配列がある。

真核系の発現には、介在配列およびポリ−アゾニレ−ジョンシグナルのような他の非−コード配列または制御要素を含有することが必要かもしれない。当業者は転写および翻訳の制御コントロールに重要な要素を含む融合遺伝子をどのように作成するか認識および理解しているであろう。

結合剤および触媒部分を融合した遺伝子を、原核細胞、真核細胞、または両方の中のいずれかで発現するために適当なベクター中に連結できる。本発明の生物触媒を生産するための発現媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）は、プラスミドまたは他のベクターである。例えば融合遺伝子のための適当なベクターは、次のタイプのプラスミドである：イー、コリー（Ｅ、Ｃｏ１１）のような原核細胞中で発現するためにはｐＢＲ３２２、ｐＥＭＢＬプラスミド、ｐＥＸプラスミド、ｐＢＴａｃプラスミドおよびｐＵＣプラスミド。

酵母中での組換えタンパク質の発現のために多くのベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５およびＹＲＰ１７はニス、セルビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に遺伝子構築物を導入するために有用なりローニングおよび発現媒介物である。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉの存在によりイー、コリー（Ｅ、Ｃｏ１１）中でも複製でき、ならびにニス、セルビシエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で酵母２ミクロンプラスミドの複製決定子により複製できる。

さらにアンピシリンのような薬剤耐性マーカーを使用できる。

好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌中でベクターが増殖し易くするための原核配列、および真核細胞中で発現するひとつ以上の真核の転写単位を含有する。ｐＳＶ２ｇｐｔ、　ｐｓＶ２ｎｅｏ、ｐｓＶ２−ｄｈｆｒ、　ｐＴｋ２、ｐＲｓＶｎｅｏ、　ｐＭＳＧ。

ｐｓＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐｎｙｇ誘導ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに有用な哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターをｐＢＲ３２２のような細菌プラスミド由来の配列で修飾し、原核および真核細胞両方の中での複製および選択耐性を容易にする。あるいはウシパピローマウィルス（ＢＰＶ−１）　、エプスタイン−バールウィルス（ｐＨＥＢｏおよびｐ２０５）のようなウィルスの誘導体は、真核細胞中のタンパク質の一時的発現に使用できる。原核または真核両方に適するその他の発現系については、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第二版、ＳａｍｂｒｏｏｋＳＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−出版、１９８９　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ＋１９８９）を参照にされたい。これは引用により本明細書の内容となる。

好適な態様において、発現ベクターはベクターが複製および発現する各細胞系が、少な（ともひとつの選択マーカーを含むように選択される。

例えばイー、コリー（Ｅ、　Ｃｏ１１）中で容易に増幅するように、アンピシリン、クロラムフェニコールまたはカナマイシンに耐性であることを付与する配列を使用して誘導することができる。哺乳細胞がらの選択については、哺乳類発現可能イー、コリー（Ｅ、Ｃｏ１１）　ｅｃｏｇｐｔ遺伝子（これはキサンチン− グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードし、トランスフェクションしたＨＰＲＴ−＃乳細胞をミコフェノール酸で選択することを可能にする）を使用できる。

触媒部分のポリペプチド配列に融合した融合タンパク質が抗体の重鎮または軽鎖由来ポリペプチド配列を含有するハイブリッド分子である場合には、同一細胞中で他方の抗体鎖の遺伝子をコートランスフエクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）およびコーエクスプレス（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）することが望ましいかもしれない。例えば融合タンパク質がガンマ　重鎖／トリプシン　ハイブリッドであるとき、適当なカッパまたはラムダ軽鎖とのコーエクスプレッションはふたつの外因性トランスフェクト遺伝子からの抗体のインビボ集合を容易にするだろう（例えばＲｉｃｅら、（１９８２）　ＰＮＡＳ７９ニア８６２　；　Ｏｉら、（１９８３）ＰＮＡＳ　８０：８２５　：および輩ｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２を参照にされたい。これらは引用により本明細書の内容となる。）場合によっては融合タンパク質の触媒部分と結合剤断片との間に非構造化ポリペプチド１ルカー領域の導入が必要なことがあるがもしれない。

このリンカ−は融合タンパク質の柔軟性の増強を容易にし、触媒部分が表面成分と自由に相互作用できるようにし、二つの断片の間にある立体障害を減少させて、同時に各断片の適当な折りたたみを可能にする。リンカ−は天然に存在するものでよ（、タンパク質のふたつのドメインの間のランダムコイル中に存在するように定めれた配列などである。あるいはリンカ−は合成種であってもよい。例えば配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３は合成非構造リンカ−として使用できる。この種のリンカ−はＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）ＰＮＡＳ　８５：４８７９　；および米国特許第５．０９１．５１３号明細書に記載され、これらは引用により本明細書の内容となる）。ヒト由来の天然に存在する非構造のリンカ−は、免疫源性の危険が減少しているので好ましい。

■、生物触媒の試験法本発明の生物触媒を作成するにあたり、それらの効力を試験することが望ましい。病原性を遮断する能力をアッセイするに加えて、生物触媒の効果を、比較しうる濃度の触媒部分単独と比較することも望ましい。

生物触媒の効力および能力の測定に有用なアッセイには、インビトロおよびインビボアッセイの両方のアッセイが含まれる。例えば標的表面成分が生成できるとき、適当な場合には生物触媒はそのコンブネート（ｃｏｎｇｎａｔｅ）レセプターへの結合を測定するアッセイにより、あるいは表面成分の開裂をモニターするアッセイ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥのように）により評価できる。

細胞カルチャー中の病原性を抑制する能力も測定できる。宿主細胞によるウィルスまたは他の絶対細胞内寄生体の取り込みをモニターできる。

細胞外寄生体の生存も、無細胞媒体によりモニターできる。

適当な場合には、病原性の防御における生物触媒のインビボ効力をアッセイするために、動物モデル系を使用できる。例えばマウスまたはラットを、すでに生物触媒処理、触媒部分のみの処理、または未処理の病原性試料で感染させ、病原体の発現状態を評価できる。

ＴＶ、ＨＩＶに対する生物触媒本発明の生物触媒の応用のひとつは、ＨＩＶの処理である。病原体−標的生物触媒は、ＨＩＶウィルスの表面成分に特異的に結合するように設計され、従って酵素的薬剤をウィルス粒子またはＨＩＶコートタンパク質を発現している感染細胞まで選択的に運ぶ。例えば糖タンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ４１または非開裂ｇｐ１６０に対して結合する薬剤は、触媒部分を標的とするに有効でありうる。少なくともひとつのＨＩＶコートタンパク質構造の触媒的分解により、ピリオン／宿主細胞、およびウィルス的に感染した細胞／宿主細胞相互作用を妨害することができる。

すでに詳細に説明したように、ＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用はＨＩＶウィルスの感染性に影響を与えた。ｇｐ１２０タンパク質に対する生物触媒の合成のために、多くの結合剤が有用である。例えば、特異的にｇｐ１２０上のエピトープを認識する抗体またはそれらの結合断片、あるいは場合によってはｇｐ１２０のＣＤ４結合部位と相互作用できるＣＤ４レセプターの可溶性画分、は両方ともＨＩＶウィルスの重要な結合決定子に対する触媒的活性を支配するために有用な結合剤である。

ＨＩＶ−病原性の阻止に対する生物触媒のひとつの態様には、■３ループの開裂の支配が関与している。例えばトロンビンまたはトリプシンのような適当なプロテアーゼは、ＣＤ４の可溶性断片と化学的にカップリングされ、酵素的に活性な分子を生産する。ＣＤ４のふたつの最もＮ−末端のドメインＥ１およびＥ２（通常ｖ１およびｖ２とも呼ばれている）を含んで成る可溶性ＣＤ４断片は、市販されている（アメリカン　バイオテクノロジー社（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、　：カタログ番号０１３１０１）、あるいは最もＮ−末端のドメインＥ１ｍ）はクローン化および発現できる（例えばＰｏｕｌｉｎら、（１９９１）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６５：４８９３　；およびＣｈａｏら、（１９８９）Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６４：５８１２を参照にされたい。これらは引用により本明細書の内容となる）。精製した５ＣＤ４タンパク質とプロテアーゼの化学結合は、上記の架橋剤を使用することにより行うことができる。

あるいは化学架橋剤の代わりに、ＨＩＶ−生物触媒を融合タンパク質として構築できる。ＣＤ４の細胞外断片は本質的に４ドメインとして存在し、ふたつの最もＮ−末端のドメインがｇｐ１２０の結合に関与している（Ａｒｔｈｏｓら、（１９８９）Ｃｅｌｌ　５７：４６９　；およびＡｓｈｋｅｎａｚｉら、（１９９０）ＰＮＡＳ　８７：７１５０）。事実、実質的なｇｐ１２０の結合はＮ−末端から初めの１００７ミノ残基（Ｆ、１ドメイン）を含んで成る断片により行われる。ＥｌとＥ２との間に、短いポリペプチド配列（約１０残基長）が存在し、これは本質的にランダムコイルとして存在すると思われている（ｆａｎｇら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　３４８：４１１）。プロテアーゼまたは触媒的に活性なそれらの断片をコードする遺伝子を、ＣＤ４の初めの１１１アミノ酸残基をコードする遺伝子の３゛末端に連結することにより（Ｃｈａｏら、（１９８９）Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　２６４：５８１２）、非構造的ポリペプチドリンカ−が挿入される。適当な発現ベクターおよび宿主細胞は当業者に周知である。

プロテアーゼと５ＣＤ４断片の化学的および遺伝子的融合の両方について、当業者は付着部位、およびカップリング部位の柔軟性の程度を制御する必要があることを認識するであろう。立体障害は、酵素の触媒活性に影響すると同時に、ＣＤ４断片の結合に関する会合定数にも影響する。架橋剤を選択するにあたり、タンパク質分子へのリンカ−ブリッジおよび付着部位の長さが重要である。融合タンパク質の構築については、酵素およびＣＤ４断片の両方の折りたたみに対する異質配列の影響を考慮すべきである。

ｖ３ループの分解に対する他の有用な結合剤は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する抗体がある（例えば、Ｔｉ１ｌｅｙら、（１９９１）Ｒｅｓ　Ｖｉｒｏｌ　１４２：２４７　：　Ｏｈｎらの抗体はキメラ抗体、あるいは上記のような結合断片であることができる。適当なリンカ−は明らかとなるであろう。

ングするために開発されてきた。結合アッセイの例として次のようなものがある：ｉ）遊離酵素、または生物触媒構造物で処理した後の固定化ｇｐ１２０に対するＣＤ４の結合を測定するＥＬＩＳＡ−型アッセイ。固定化ｇｐ１２０は酵素または生物触媒構造物のいずれかとともにインキュベーションされる。酵素または生物触媒は次に洗い出され、ＣＤ４の結合の程度が直接的、すなわち標識５ＣＤ４　（アメリカン　バイオテクノロジー社、カタログ番号０１３００３から入手可能なＦＩＴＣ−標識ＣＤ４のような）を使用して、あるいは間接的に５ＣＤ４、続いて標識−抗−ＣＤ４抗体を使用するサンドイッチ−型で測定される。ｎ）標識−ｇｐ１２０の５ＣＤ４への結合が、生物触媒構造物の遊離酵素のずれかで処理されたｇｐ１２０の結合に対して測定される、競合的結合アッセイ。

さらにインビトロ生物的アッセイは、生物触媒のＨＩＶ感染性阻止能力を測定するために使用できる。例えばウィルス中和化アッセイは、細胞培養物を生物触媒ですでに処理した保存ウィルスとともにインキュベーションさせて行うことができる。生物触媒−処理ウィルス、未処理ウィルスおよび遊離酵素で処理したウィルスの非感染性は、逆転写酵素のような手段によりアッセイできる（Ｏｈｎｏら、（１９９１）ＰＮＡＳ蔓：１０７２６）。

シンシチウムアッセイも、遊離の酵素と比較した生物触媒によるｇｐ１２０のＣＤ４結合を不活性化する能力を評価するために使用できる。簡単に説明すると、Ｉｎ−１に慢性的に感染させた細胞を生物触媒の希釈物とともにインキュベーションする。シンジチアを受けると思われる細胞（Ｃ１８８のような）を次に加え、感染細胞とともにインキュベーションする。３つのリンパ球直径よりも大きいシンシチウムを陽性と測定し、ならびに未処理感染細胞または遊離−酵素処理の感染細胞から得たシンシチウムの数と比較して測定する（Ｒｉｃｈｍａｎら、（１９９０）　ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａａ＋、　Ｃｏｕｒｉｅｒ　Ｎｏ、　９０−９１、第６ −９頁。これも引用することにより本明細書の内容となる）。

ｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用を妨害するために設計された、多くの従来のＨＩＶ治療の研究は、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）のような分子を覆うことが関与していた。

触媒部分をエンベロツブタンパク質ｇｐ１２０へ選択的に運んで分解することを標的とする本発明のひとつの利点は、免疫系でのＴ細胞の正常な機能が影響を受けないという事実にある。５ＣＤ４治療の場合には、この治療が化学量論に依存するため、大量の５ＣＤ４または誘導体の存在が、Ｔ細胞の外因性ＣＤ４と競合し、これによって免疫反応における細胞の機能に悪い作用を及ぼす。実際、上記の理由によりＣＤ４により認識される決定子に結合するためのマスキング分子は、この問題に直面する。本発明の方法は、生物触媒の触媒的作用により結合分子の濃度がかなり低いという点がより望ましい点である。

本発明の生物触媒は医薬的に受容しつるキャリアーとともに適用されることができる。適当な医薬的キャリアーは当業者には周知である。生物触媒の投与濃度は、病原性が阻止されるように定められる。生物触媒の投与のために、投与量決定に関与する因子は、最低の有効濃度、同時に循環から生物触媒のクリアランスである。熟練者はこれらの因子を実験無しで定められる。

ＣＤ４のアミノ末端断片をコードするＣｌ１４遺伝子が以下のように構築された。以下のようにＣＤ４−０１からＣＤ４−１６と命名されたオリゴヌクレオチドを標準的な核酸合成法により合成した。

ＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＧＴＡＡＣＣＡＡＭＴＣＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＭＧＴＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＣＤ４−１３ＧＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＧＣＧＡＴＣＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＣ、＋１．ＣＧＴＧＡＧＣＴＣ３００ｐｉｏ１（７）各オリゴヌクレオチドＣＤ４−０１からＣＤ４−１６を、０ＮＥ−ＰＴＩＯＲＡＬＬ緩衝液（ファルマシア：　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ビスカタウエイ、ニューシャーシー州）　、ｌａＭ　ＡＴＰ　（終濃度）、および１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア、カタログ番号２７−０７３６−Ｏｆ）と３０ｐ１０反応容量で混合した。反応混合物を３７℃で１時間、インキュベーションした。

オリゴヌクレオチドのリン酸化の後、反応試験管を沸騰湯浴中に置いて、加熱器のスイッチを切り、オリゴヌクレオチド混合物中の相補的配列をアニーリングし易くするために水浴を室温に冷却した。アニーリングの後、ライゲーション緩衝液（ＢＲＬ、ゲチスバーグ、メリーランド州および１単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、カタログ番号５２２４５Ｂ）を試験管に加え、試験管を室温に４時間室いた。ライゲーションの後、３μｍのアリコートを取り出して、集成体を確認するために１％アガロースゲルで分析した。最終的な集成体の配列は第１図に表す。

ライゲーション混合物をフェノールクロロホルムで１回、およびクロロホルムで１回洗浄し、ＤＮＡを２容量のＥｔｏｌｌで沈殿させた。ペレットを水に再懸濁し、ＣＤ４−ＤＮＡおよびｌ＋ｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌ［ＫＳ　（ストラタジーン、二、−シャーシー州）をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨＩで消化した。消化が完了した後、ＤＮＡをアガロースゲルで分離し、バンドを切りだし、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮで精製した。等モル量濃度のＣＤ４構築物およびベクター（全体で１０１００ｎを、１７°Ｃで１６時間連結した。連結した混合物を次に５×に水で希釈し、２μｍのこの混合物を５０μ］のコンピテントなＪＭ１０９細胞を形質転換させるために使用した。

実施例２プロティンＡ″Ｚ”　ドメイン／エンテロキナーゼ開裂認識（ＥＫＣＲ）配列／ＣＤ４融合遺伝子を以下のように構築した；二重鎖オリゴヌクレオチド５“−ＮσＴＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＣ−３゜３’−ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＧＧＴＡＣ−５’をＮｃｏｌで消化し、第１図に示したＣＤ４構造物の５°末端のＢｓｐＨ１部位に連結した。

生成した）、ＮＣＲ／ＣＤ４融合遺伝子を、次にｐＥＺＺ−１８（ファルマシア、カタログ番号２７−４８１０−Ｏｆ）のＥｃｏＲＩおよび５ａ１１部位に、対応する制限酵素で処理したＣＤ４融合遺伝子により作成されたＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉ突出部を使用して連結した。ｐＥＺＺ−１８ベクターは、プロティンＡの“Ｂ”ＩｇＧ結合ドメインに基づいたプロティン＾シグナル配列、およびふたつの合成″ｚ″　ドメインを含む。この構築物は“ｚｚ”融合タンパク質をイー、コリー（Ｅ、Ｃ。

見）から分泌させ、水性の環境下で溶解性を上昇させる。従って生成した融合遺伝子はＺＺ／ＥＫＣＲ／ＣＤ４融合タンパク質をコードする。プロティンＡ配列は、生成した融合タンパク質をエンテロキナーゼで処理してＣＤ４から取り出すことができる。Ｓｕら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３ニア５６　；およびＦｏｒｓｂｅｒｇら、（１９９２）Ｊ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅａ＋　１１：２０１を参照にされたい。これらは引用により本明細書の内容となる。

実施例３ヒト組織−プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の触媒ドメインをコードする遺伝子断片を、ヒトｔＰＡ　ｃＴ）ＮＡクローンの別個の部分のＰＣＲ増幅により単離した。Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第二板、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集（Ｃ５ＩＩ出版：　１９８９）　、第５．６、および１４章を参照。これは引用により本明細書の内容となる。第２図に示された５′−アンブリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）および３′−アンブリマーを使用して、ｔＰＡの触媒的ドメイン断片をプラスミドｐｔＰＡ−ｔｒｐ１２（ＡＴＣＣ番号４０４０４）から増幅した。Ｐｅｎｎ１ｃａら、（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０１：２１４を参照のこと。これは引用により本明細書の内容となる。最終的な増幅生成物は５ｅｒ２６２からＰｒｏ５２７のヌクレオチド配列を含んだ。さらに上記アンブリマーの設計により、５゛末端の増幅生成物はＢｉｎｄｎ［およびＮ５ｉｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を、ならびに第１図のＣＤ４構築物のＰｓｔ１部位の下流のＣＤＪカルボキシ末端配列を含んだ。増幅生成物の３′末端はｔｌ’ Ａドメインの停止コドンの直接下流にあるが、ＸｈｏｌおよびＢａｍｔｌｌ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含んだ。

この増幅された触媒ドメイン断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｎ　ＫＳのそのＨｉｎｍおよび３°χｈａ１部位に連結し、複製可能なベクターｐＢｌｕｔＰＡ　（第３図参照）を作成した。

実施例４ＣＤ４／ｌＰ＾融合遺伝子を作成するために、ｔＰＡ遺伝子断片をｐＢｌｕｔＰＡから切り出した。ベクターを始めにＸｈｏｌで切断し、クレノーで処理して平滑末端を作成した。引き続き、直線化したベクターをＮ５ｉｌで切り、５°“粘着末端”を残した。生成物をアガロースゲルで泳動し、Ｎ５ｉｌ／Ｘｈｏｌ　ｔＰＡ断片を単離した。

次にｐＥＺＺＥＫ／ＣＤ４ベクターをｓｐｈ　＋で消化し、次にＴ４ポリメラーゼで処理してｓｐｈ　１部位に平滑末端を作成した。直線化したベクターを次にＰｓｔ　Ｉで切り、これは第１図のＣＤ４構築物の３′末端で示されるＰｓｔ　１部位で開裂し、残りのプラスミドを単離した。

Ｎｓｉ／Ｘｈｏｌ　ｔＰ＾断片を次にＰｓｔｌ／５ｐｈｌ処理ｐＥＺＺＥＫｃＤ４プラスミド中に連結し、新たなベクターｐＣＤ４／ｌＰ＾を作成した。

ベクターｐＣＤ４／ｌＰＡ　（第３図）は、アミノ末端からカルボキシ末端、プロティン＾分泌ならびに“Ｚ“　ドメイン、エンテロキナーゼ開裂認識配列、ＣＤ４ドメインおよびｔｐ＾の触媒ドメインを含む全体的な融合集成体を有する融合タンパク質をコードする。融合遺伝子のＣＤ４／ｌＰＡ部分の核酸配列、および対応するアミノ酸配列を第４Ａ図および４Ｂ図に示す。

精製したＰＣＤ４／ｌＰＡプラスミドはコンピテントなＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン、カタログ番号２００２６８）を形質転換するために使用した。

形質転換した細胞を培養し、ＣＤ４／ｌＰＡ融合タンパク質をＩｇＧ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６ＦＦカラムを使用して細胞上清液から単離した。“ＺＺ”　ドメインはＩｇＧ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６ＦＦ　（ファルマシア、カタログ番号１７−０９０９−０１）に強固に結合し、これで発現タンパク質を一回で精製できる。Ｌｏｗｅｎａｄｌｅｒら、（１９８７）Ｇｅｎｅ５８：８７を参照、これは引用により本明細書に編入される。精製した融合タンパク質をアッセイし、ならびに寒天拡散プレート（バイオラッド：Ｂ　１ｏＲａｄｓ力タログ番号５（ＩＱ −００１１）中のカゼインを消化する能力によりその粗タンパク質溶解活性を有することが示された。

実施例５ＣＤ４／ｌＰＡ融合タンパク質の構築物に使用した同様な方法で、ＣＤ４／　）ロンビン融合タンパク質を作成できる。ヒト肝臓ＣＤＮ＾ライブラリー（ストラタジーン、カタログ番号９３７２００）から出発して、トロンビンの触媒断片を第５図に示された５°および３°アンブリマーを使用してＰＣＲ増幅法により得ることができる。ＰＣＲ生成物は、トロンビンのｌ１ｅ３２１からＧｌｕ５７９（Ｆｒｉｅｚｎｅｒら、（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２＋２０８７を参照、引用により本明細書に編入）、ならびにＰＣＲアンブリマーの存在ゆえに、ＣＤ４のＮｓｉ　Ｉエンドヌクレアーゼ部位およびカルボキシ末端をその５°末端に、Ｘｈｏ　ｌエンドヌクｌノア−上部位をその３′末端に含有した。

上記のようにトロンビン遺伝子断片をｐＥＺＺＥＫ／ＣＤ４に連結してＣＤ４／　）ロンビン融合遺伝子を生成できる。融合遺伝子のＣＤ４／トロンビン部分の配列、および対応するアミノ酸配列を第６Ａおよび６Ｂ図に与える。

均等物当業者は本明細書に記載された特別な方法の多くの均等物を認識するであろうし、または日常的な実験を使用するだけで確認することができる。そのような均等物は本発明の範囲の中にあるものと考えられ、以下の請求の範囲に包含される。

ｎｑｗσ４スＣＤ４／ｌＰＡ融合タンパク質、第１部Ｍれ　Ｌｙｓ　ＬｙＩＩ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｕｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｃ１ｙ　ｋｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ@１６ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌｍ　１；ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　５＠ｒ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｌ、ｙｓ　Ａｓｎ　Ｓ■秩@３Ｊ＾ｓｎ　Ｇｉｎ　ＩＬ−Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　入ｓｎ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ｓｉｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　丁ｈｒ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　SＢＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　し＠ｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　入１ａ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　＾【９　Ａｒｇ　５ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　＾Ｈｐ@６４Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ@８０ＧＡ丁　ＡＣＣ？ムチ　ＡＴＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＩＩ；　ＧｋＡ　（ＴＴ　ＣＡＡ　ＣＴＣ＾露ｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｃ１ｕ　へ奪ｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ＋　Ｃ１ｕ　Ｃ１ｕ　Ｖａｌ　にｌｎ　Ｌｅ普@９６Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌ、＠ｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　しｅｕ　Ｈｉｓ　Ｃ；撃凵@１１２Ｃ，ｌｎ　Ｓｇｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃ１１ｎ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐ窒潤@１２８にｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙ　にｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ@１４４Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌ、ｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ＾ｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ@！６０Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＣＬｙ　Ｌｉｅ　Ｌ＠ｕ　ｌｉｅ　５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｌｔｕ　Ｓｓｒ　Ａｌａ@１７６Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ｘｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｖａｌ　：ｌｅ@１９２Ｌｅｕ　にｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　＾［９＼’ａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃ＋ｌｕ　Ｇｌｕ　にｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈ■@二〇ＰｆＩ（ｉ’ｌＥｌσ４のＣＤ４／ｌＰＡ融合タンパク質、第２部ＧＣＣＣＡＧ　（ｉＡＧ　ＡＣＣＡＧＣＧｉＴＧ（ＴＣＣＧＣＡＣＴ　ＧＴＣＴＧＣＣＴｒ　ＣＣＣＣＣＧＧＣＧ　ＧＡＣ＾１ａ　にｉｎ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　５＠ｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　ｆ’ｒｏ　Ａｌａ　入謳o　２５６ＣＴｃＣＡＧｅｒａＣｃＧＧＡＣ’ｒｃｃＡｃｅｃＡＧＴａ’ｒｃ入ＧＣＴＣＴＣＣＣＣＣＴＡＣＧＣＣ入八Ｇし＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌ、ｙ刀@２７２ＣＴＣ＾Ｇ＾　Ｃ↑ＧＴ＾ＣＣＣＡ　ＴＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡ　↑ＣＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＡＡＣＶａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ@３０４人０ＡＡＣＡ（ＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＴＣＧＣ八ｃｃｃｃｃＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｍへｔ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ@３２０ＧＧＣ；ＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＣ丁ＱＣＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴＣＧＧＧＡ＋１；ＱＣＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌｍ　Ｍｎ　Ｌ、１ＩＩＪ　ＨＬｓ　Ａｓｐ　八ｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＡＩＩＰ　５ＩＩＴ　Ｇｌｙ@Ｇａｙ　３コロＣＣＣＣＴＧ　ｑＴＣＴＧＴ　ＣＴＣＭＣＧＡＴ　ＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＣＴ　ＴＴＧ　ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＣｙＳ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｍａｃ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ@３５２＾ＧＣＴＣＧ　ＧＣＣＣＴＣＧＣＣ丁ＧＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　にＴｃ　ＣＣＧ　ＣＣＴ　ＣＴＣ丁ＡＣＡＣＡｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｃ１ｙ　Ｃｙｓ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　にｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ@３ＧＢ入ｋＧＣＴＴ　ＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＡ　ＣＡＣＴＧＣ；　ＡＴＴ　ＣＯＴ　ＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡ　ＣＣＧ　ＴＧ＾しｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　しｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｈｅｍ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　３ａ１５’−ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＧＧＣＣＡＧ　ＴＣＣＣｒＧ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＣＣＡ丁Ｇ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＧＧＣＴＣＧ　ＧＡＴ−３’（ＪＩ（ｊ’ＬＥｌσ６λ ＣＤ４／トロンビン融合タンパク質、第１部’ｌ’ＩｃＪ’ｌｌ＠’Ｅ、　６’ ＢＣＤ４／トロンビン融合タンパク質、第２部国ａ！１審幅牛

Claims

【特許請求の範囲】

１．病原体の表面成分に特異的に結合する結合剤、および病原性が阻止されるように病原体の成分を分解する触媒部分を含んで成る病原体−標的生物触媒。
２．病原体がウイルスである請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
３．ウイルスがＨＩＶである請求の範囲第２項記載の病原体−標的生物触媒。
４．病原体がウイルスであり、かつ表面成分はウイルスのエンベロップタンパク質である請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
５．ウイルスがＨＩＶであり、かつ表面成分はｇｐ１２０である請求の範囲第４項記載の病原体−標的生物触媒。
６．結合剤が病原体の表面成分に特異的な抗体、またはそれらの結合断片である請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
７．抗体またはそれらの結合断片が：ａ）重鎖起源の個々の抗体鎖；ｂ）軽鎖起源の個々の抗体鎖：ｃ）Ｌ鎖（ＶＬ）またはＨ鎖（ＶＨ）からの可変領域、またはそれらの部分；ｃ）Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、またはＦ（ａｂ）２断片；ならびにｄ）Ｈしの一価の断片、から成る群から選択される請求の範囲第６項記載の病原体−標的生物触媒。
８．病原体の表面成分に対する結合剤がレセプター、またはそれらの結合ドメインである請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
９．結合剤が、ポリカチオン性分子、ポリアニオン性分子、および疎水性分子から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
１０．結合剤がポリヌクレオチド、多糖およびポリアニオン性ペプチドからなる群から選択されるポリアニオン性分子である請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
１１．病原体がＨＩＶであり、かつ結合剤はｇｐ１２０に結合するに十分なＣＤ４の部分である請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
１２．触媒部分が酵素、または酵素的に活性なそれらの断片である請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
１３．酵素、または酵素的に活性なそれらの断片がプロテアーゼ、リパーゼおよびグリコシダーゼから成る群から選択される請求の範囲第１２項記載の病原体− 標的生物触媒。
１４．酵素が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼから成る群から選択されるプロテアーゼである請求の範囲第１２項記載の病原体−標的生物触媒。
１５．病原体−標的生物触媒が融合タンパク質である請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
１６．結合剤および触媒部分が化学架橋剤により共有結合的に結合している請求の範囲第１項記載の病原体−標的生物触媒。
１７．ウイルスの表面成分に特異的な結合剤、およびウイルスの病原性を阻止するために表面成分を十分分解する酵素、またはそれらの触媒的に活性な断片を含んで成るウイルスー標的生物触媒。
１８．ウイルスがＨＩＶである請求の範囲第１７項記載のウイルスー標的生物触媒。
１９．結合剤がｇｐ１２０に特異的な抗体、またはそれらの断片である請求の範囲第１８項記載のウイルスー標的生物触媒。
２０．結合剤がＣＤ４、またはそれらのｇｐ１２０−結合ドメインである請求の範囲第１８項記載のウイルスー標的生物触媒。
２１．ＣＤ４のｇｐ１２０結合ドメインが、ＣＤ４のＥ１からＥ２ドメインおよびＣＤ４のＥ１ドメインから成る群から選択される請求の範囲第２０項記載のウイルスー標的生物触媒。
２２．酵素、またはそれらの触媒的に活性な断片が、プロテアーゼ、リパーゼおよびグリコシダーゼからなる群から選択される請求の範囲第１７項記載のウイルスー標的生物触媒。
２３．ウイルスー標的生物触媒が融合タンパク質である請求の範囲第１７項記載のウイルスー標的生物触媒。
２４．結合剤および酵素、または酵素的に活性なそれらの断片が化学架橋剤により共有結合的に結合している請求の範囲第１７項記載のウイルスー標的生物触媒。
２５．ＨＩＶの病原性を阻止するためにｇｐ１２０を十分分解するプロテアーゼ、または触媒的に活性なそれらの断片にカップリングされた、ｇｐ１２０に特異的な結合剤を含んで成るＨＩＶを標的とする生物触媒。
２６．結合剤がｇｐ１２０に特異的な抗体、またはそれらの断片である請求の範囲第２５項記載のＨＩＶ−１−標的生物触媒。
２７．結合剤がｇｐ１２０のＣＤ４領域に特異的である請求の範囲第２５項記載のＨＩＶ−１−標的生物触媒。
２８．結合剤がＣＤ４、またはそれらのｇｐ１２０結合ドメインである請求の範囲第２５項記載のＨＩＶ−１−標的生物触媒。
２９．ＣＤ４のｇｐ１２結合ドメインがＣＤ４のＥ１からＥ２ドメイン、およびＣＤ４のＥ１ドメインから成る群から選択される請求の範囲第２８項記載のＨＩＶ−標的生物触媒。
３０．ＨＩＶ−標的生物触媒が融合タンパク質である請求の範囲第２５項記載のＨＩＶ−標的生物触媒。
３１．結合剤およびプロテアーゼ、または酸素的に活性なそれらの断片が化学架橋剤により共有結合的に結合している請求の範囲第２５項記載のＨＩＶ−１−標的生物触媒。
３２．Ａ．病原体の表面成分に特異的に結合する結合剤、およびＢ．病原体の成分を分解する触媒部分を含む融合タンパク質を含んで成る病原体−標的生物触媒であって、生物触媒による病原体成分の分解で病原性が阻止される、病原体−標的生物触媒。
３３．融合タンパク質がさらに結合剤と触媒部分とを連結させるリンカー配列を含んで成る請求の範囲第３２項記載の病原体−標的生物触媒。
３４．リンカー配列が合成、または天然に存在する非構造化ペプチド配列である請求の範囲第３２項記載の病原体−標的生物触媒。
３５．請求の範囲第３２項記載の病原体−標的生物触媒であって、Ａ．病原体がＨＩＶであり、Ｂ．結合剤がｇｐ１２０に特異的な抗体、ｇｐ１２０に特異的に結合するｇｐ１２０、ＣＤ４およびＣＤ４の断片に特異的な抗体の断片から成る群から選択され、ならびにＣ．触媒部分がプロテアーゼ、リパーゼ、およびグリコシダーゼから成る群から選択され、ここで選択的なｇｐ１２０の分解がＨＩＶ感染性の阻止を起こす、上記病原体− 標的生物触媒。
３６．融合タンパク質がさらに、結合剤と触媒部分との間にリンカー配列を含んで成る請求の範囲第３５項記載の病原体−標的生物触媒。
３７．病原体の表面成分に特異的に結合する結合剤をコードするＤＮＡ、および病原性が阻止されるように病原体の成分を分解する触媒部分をコードするＤＮＡを含んで成る、請求の範囲第３２項記載の病原体−標的生物触媒をコードするハイブリッドＤＮＡ。
３８．第４Ａおよび４Ｂ図のアミノ酸配列、あるいはそれらの機能部分、またはそれらの実質的な相同体を含む融合タンパク質を含んでなるＨＩＶを標的とする生物触媒。
３９．第６Ａおよび６Ｂ図のアミノ酸配列、あるいはそれらの機能部分、またはそれらの実質的な相同体を含む融合タンパク質を含んでなるＨＩＶを標的とする生物触媒。