JPH07504821A - 植物の種子のリシンおよびスレオニン含有量を増加させるための核酸断片および方法 - Google Patents

植物の種子のリシンおよびスレオニン含有量を増加させるための核酸断片および方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物の種子のりシンおよびスレオニン含有量を増加させるための核酸断片および 方法 技術分野 本発明は、リジンによる阻害に対して非感受性であるアスバルトキナーゼ（ＡＫ ）をコード化する非反復の合成核酸断片に関する。形質転換させた生物において 上昇させたレベルのりシンもしくはスレオニンを産生させるためのその断片の用 途のための方法も提供される。
発明の背景 多くの穀物に由来するヒト用食物および動物用飼料は、動物の食養生法において 必要である１０の必須アミノ酸の内のいくつかが不足している。トウモロコシ（ ジー　メイズ　Ｌ、（Ｚ且旦　ｍａｙｓ　Ｌ、））においては、リジンが、多く の動物の食養生法必要条件について最も限定さているアミノ酸である。ダイズ（ フランク　マックス　Ｌ、（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　Ｌ、））食は、主にリジ ン補足物としてトウモロコシを基にした動物用飼料に対する添加物として用いら れている。従って、トウモロコシもしくはダイズのいずれかのりシン含有量の増 加は、微生物の発酵を介して産生されるリジンが添加されている混合穀物飼料を 補足する必要を減少させるもしくは除去するものと思われる。
植物育種者は、天然に存在する変異体を使用して作物における蛋白質の質および 量を増加させることに長い間興味を抱いてきた。正常のものと比較してより高い レベルのリシン（７０％）を含むトウモロコシ株がおよび、Ｎｅ１ｓｏｎ、Ｓ’ ｃｉｅｎｃｅ、よ５０．１４６９−７０　（１９６５）］。しかしながら、変異 体遺伝子、’ｏｐａｑＬＩｅ−２を取込んでいるこれらの株は粗悪な農耕品質を 示しく病気および害虫に対する感受性の上昇、８−１４％の収穫量減少、低い穀 粒重量、より遅い乾燥化、フランクひき割りのより低い乾燥製粉収量、および、 保存問題の増大）、互、２８１−３００　（１９８７））　。ｏｐａｑｕｅ−２ およびｓｕｇａｒｙ−２遺伝子および付随する修飾物を使用してＣＩＭＭＹＴに おいて改良された高品質蛋白質トウモロコシ（ＱＰＭ）は、堅い内胚乳、および 、穀粒内における強化レベルのりシンおよびトリプトファンを有する［Ｖａｓａ ｌ、Ａ、に、、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｆｏ　ｔｈｅ　３ｒｄ ’　５ｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。
Ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ、Ａｕｇｕｓｔ　３１−Ｓｅ３１−５ｅｐｔｅ、１９８ ３］。しかしながら、そのＱＰＭ株において表わされる遺伝子プールは熱帯性お よび亜熱帯性である。高品質蛋白質トウモロコシは遺伝子的に複雑な形質のもの であり、現存する株は米国内の用途におけるとっかかりとなる生殖質向きではな く、このことがトウモロコシ育種者によるＱＰＭの採用を遠ざけている。
種子のアミノ酸含有量は、主に（９０−９９％）種子中に含まれるアミノ酸組成 により決定され、さらに、わずかばかりのもの（１−１０％）は遊離アミノ酸プ ールにより決定される。種子中における総蛋白質の量は、穀類中に含まれる約１ ０％の乾燥重量がら、マメ科植物の２０−４０９６の乾燥重量にまで変化する。
多くの蛋白質結合性アミノ酸は、種子の発育中に合成されかつ発芽後の主な栄養 保存物として働く種子貯蔵蛋白質中に含まれている。多くの種子においては、こ の貯蔵蛋白質は、総蛋白質の５０％もしくはそれを上回る割合を占めている。
種子のアミノ酸組成を改善するために、遺伝子工学技術を用いて形質転換植物内 における貯蔵蛋白質のための遺伝子を同定および発現させている。例えば、２６ ％のイオウ含有性アミノ酸からなる種子の２８アルブミンのための、ブラジルナ ツツからの遺伝子が単離され［Ａ］ｔｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７） Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
８　：　２３９−２５０１　、さらにこれは、形質転換させたタバコの種子中に おいて、マメのファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）貯蔵蛋白質遺伝子からの調 節配列の制御下で発現させられている。タバコの種子中においてイオウに富む蛋 白質が蓄積した結果、その種子中に含まれるメチオニンのレベルが最高で３０％ まで上昇した［ＡＩｔｅｂａｃｈ　ｅｔａｌ、（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、　１３：５１３−５２２１゜しかしながら、植物蛋白質の標準的 なりシン含有量に関連して同様にリシンが強化されている植物種子貯蔵蛋白質は 今日までに同定されておらず、このことが、リジンを増加させるのにこの方法を 使用することを遠ざけているのである。
スレオニン、メチオニン、および、イソロイシンに加えてリジンはアスパラギン 酸に由来するアミノ酸であり、さらに、この種族の各−員の生物合成の調節は相 互連絡を取り合っている。この回路における代謝流動の調節は、主に最終産物を 介して行なわれているらしい。この回路の第一段階は、酵素アスパルトキナーゼ （Ａ　Ｋ　）によるアスパラギン酸のリン酸化であり、かつ、この酵素は、多く の生物における調節にとっての重要な標的であることが見いだされている。しか しながら、アスパラギン酸回路を通る４−炭素分子の異常流出についての詳細な 生理学的研究が、モデル植物系レムナ　ポーキコスタータ（Ｌｅｍｎａ　ｐａｕ ｃｉｃｏｓｔａｔａ）において行なわれている［Ｇｉｏｖａｎｅ　Ｉ　ｌ　ｉｅ ｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９Ｑ：１５８４− １５９９１゜この著者達は、「これらのデータは、アスバルトキナーゼにより触 媒される段階は、正常では、［植物中における］アミノ酸のアスパラギン酸−放 向への４−炭素単位の参入の調節にとって重要な地点ではないことの、確固たる 証拠をここに提供している」と述べている。
このアスパラギン酸種族の回路は、枝別れ地点の反応においても調節を受けてい る。リシンに関しては、これは、ジヒドロジピコリン酸合成（ＤＨＤＰＳ）によ り触媒されるピルビン酸と、アスパラギン酸β−セミアルデヒドとの縮合である 一方、スレオニンおよびメチオニンに関しては、ホモセリンジヒドロゲナーゼ（ ＨＤ　Ｈ）によるアスパラギン酸β−セミアルデヒドの還元に続くホモセリンキ ナーゼ（ＨＫ）によるホモセリンのリン酸化が重要な調節地点である。
リジンのアナログである５（２−アミノエチル）−システィン（ＡＥＣ）に対す る耐性について選択することによる、植物のりシン過剰産生性変異体を単離する ための多くの試みが、単独で、あるいは、リシンプラス　スレオニン耐性選択と 組み合わせて行なわれてきた。しかしながら、商業上の価値があると思われる、 種子中リジンレベルの増加の例は未だに報告されていない。別の手掛かりは、遺 伝子工学技術を介して、リジンのような特定の遊離アミノ酸の産生および蓄積を 増加させることである。アスパラギン酸−旅回路の、要所となる調節酵素につい て数々小麦胚芽のＤＨＤＰＳと比較してリシンによる阻害に対する感受性が約２ ０倍低い。この大腸菌ｄｅｐＡ遺伝子は、植物の遺伝子発現配列に結合されてお り、形質転換を介してタバコ細胞内に取り込まれており、かつ、葉における遊離 リシンレベルを実質的に増加させる原因となっていることが示されている［Ｇｌ ａｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）ＰＣＴ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌ。Ｐ ＣＴ／ＵＳ８９１０１３０９］。
しかしながら、リジンの増加が種子内において見い出されたことの証拠は存在し ていなかった（種子をテストに供することが可能であったとしても）。植物遺伝 子発現配列に結合されているこの大腸菌ｄｅｐＡ遺伝子は、Ｇａ１ｉｌｉ　ｅｔ 　ａｌ、　［（１９９１）　Ａｂｓｔｒ。
４２２　ｆｒｏｍ　Ｔｈ１ｒｄ　Ｉｎｔ、　Ｃｏｎｇ、　ｏｆ　Ｉｎｔ。
Ｓａｃ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、］、および、５ｈａｕ］　ｅｔ　 ａｌ、［（１９９２）　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒ、　２：２０３−２０９１により タバコ細胞内にも導入されており、かつ、葉における遊離リジンレベルの増加を もたらすことが示されている。繰り返すが、種子における遊離リシンのレベルの 増加についての証拠は存在していなかった。これらの研究音速は、最近、形質転 換を介するタバコ細胞中への、リジン非感受性ＡＫ酵素をコード化する大腸菌１ ｙｓＣ遺伝子の導入についての発表を行なっている［Ｇａ１ｉｌｉ　ｅｔ　ａｌ 、（１９９２）Ｅｕｒ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌ、　９１１］、９３２８．２ ；５ａｕｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９９２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。
１００　：１１５７−１１６３］。大腸菌酵素の発現の結果、形質転換させた植 物の葉および種子における遊離スレオニンのレベルの増加を生じる。大腸菌ＤＨ ＤＰＳおよびＡＫを発現する植物の交配により、親のＤＨＤＰＳ植物に比較して 葉中により多（のりシンが蓄積するが、親のＡＫ植物に比較して葉中により少な い遊離スレオニンが堆積する子孫が得られた。種子内における遊離リジンのレベ ル増加についての証拠は存在しなかった。
植物における生物合成回路の調節の詳細についての理解が限定されたものである がために、特に種子に対する遺伝子工学技術の適用は当てにできない状態になっ ている。種子におけるアスパラギン酸由来のアミノ酸の源については利用できる 情報がほとんどない。例えば、多くの植物からは、種子内でそれらが合成される のか、あるいは、葉から種子に移送されるのか、あるいは、その両方であるのか は明らかにされていない。
さらに、遊離アミノ酸は、種子の総アミノ酸含有量のわずかな部分を補っている にすぎない。そのため、遊離アミノ酸の超過蓄積は、種子の総アミノ酸組成に重 大な影響を及ぼすためには何倍にも増幅される必要がある。その上、種子内に含 まれる遊離アミノ酸の異化についてはほとんどのことが知られていない。遊離リ ジンの異化は、トウモロコツおよび大麦の発育中の内胚乳内において観察されて いる。リジンの異化の第一段階は、リシン−ケトグルクール酸レダクターゼによ り触媒化されるものと思われている［Ｂｒｏｃｈｅｔｔｏ−Ｂｒａｇａ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９９２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９８：１１３９−１１ ４７］。このような異化回路が植物内に広く普及しているのか、そして、これら は遊離アミノ酸の蓄積レベルに影響を与えているのかは、未知である。
この出願以前には、遺伝子工学を介して、種子内において、リシンもしくは他の 任意のアミノ酸レベルを増加させる方法は知られていなかった。従って、種子内 における遊離アミノ酸の超過蓄積の結果、栄養品質の改善策をもたらすために、 遺伝子即ちキメラ遺伝子、および、種子内においてそれらを発現させるための方 法についての必要性が存在する。
発明の要約 出願人の発明は、（ａ）リジンによる阻害に対して非感受性であるＡＫをコード 化する第１核酸サブフラグメント、および、（ｂ）植物のＤＨＤＰＳと比較して 、リシンによる阻害に対して感受性が少なくとも２０倍以上低いジヒドロジピコ リン酸シンターゼをコード化する第２核酸サブフラグメント、を含む、単離され た核酸断片である。ある好ましい実施態様は、さらに、アンチセンスリシンケト グルクール酸レダクターゼをコード化する第３の核酸サブフラグメントを含む。
別の実施態様においては、第１および第２サブフラグメントが、適切な植物葉緑 体トランジット配列に操作的に結合されており、かつ、各サブフラグメントも適 切な調節配列に結合されて、植物内における発現を促進している。好ましい実施 態様は、 （ａ）第１核酸サブフラグメントが、大腸菌ＡＫＩｆｌのりシン非感受性変異体 をコード化する、配列番号１において示され、かつ、以下に示される、 （１）位置３１８におけるアミノ酸が、スレオニン以外のアミノ酸であるか、も しくは、 （２）位置３５２におけるアミノ酸が、メチオニン以外のアミノ酸である、 という条件の内の少なくとも一つを満たすという点にさらなる特徴を有する、配 列に対して実質的に相同である核酸配列を含み、あるいは、（ｂ）第２核酸配列 が、細菌に由来している１、先に記載された発明のいずれかである。
別の実施態様は、 （ａ）第１核酸サブフラグメントが、以下に示される、（１）位置３１８におけ るアミノ酸が、イソロイシンであるか、もしくは、 （２）位置３５２におけるアミノ酸が、イソロイシンである、という条件の位置 の少なくとも一つを満たすという点にさらなる特徴を有する配列であり、 （ｂ）第２核酸サブフラグメントが、細菌、好ましくは大腸菌もしくはコリネバ クテリウム　ダルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉ ｃｕｍ）のいずれかに由来するものである、という発明である。
本発明の他の実施態様は、大腸菌ＡＫＩＩＩをコード化する、配列番号１におい て示される配列に対して実質的に相同である少なくとも一つのヌクレオチド配列 を含む単離された核酸配列であって、当該核酸断片は大腸菌ＡＫＩＩＩのりシン 非感受性変異体をコード化している。
主題となる事柄もやはり、リシンケトグルタール酸レダクターゼをコード化する 核酸サブフラグメントを含む、単離された核酸配列を含む。
記載されている核酸断片で形質転換させた植物、種子、および、微生物もまた、 本発明の実施態様である。本発明の別の実施態様は、記載されている非反復な核 酸断片で植物を形質転換させることにより、種子のスレオニンもしくはりシン含 有量を増加させるための方法である。
図面および配列図面簡単な説明 願の一部を形成する配列図から、より完全に理解することができる。
図１は、遺伝子発現カセットの図式的表示を示す。
図２は、二成分性（ｂｉｎａｒｙ）プラスミドベクターｐＺＳ９７にの地図を示 す。
図３は、二成分性プラスミドベクターｐＺＳ９７の地図を示す。
図４は、二成分性プラスミドベクターｐＺ１９９の地図を示す。
図５は、プラスミドベクタ−ｐ　Ｂｒ３　０　３の地図を示す。
配列番号１は、実施例１に記載しである、ＡＫＩＩＩをコード化する、野生型大 腸菌の１ｙｓＣ遺伝子のコーディング領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を 示す。
配列番号２および３は、大腸菌のＩ　ｙｓＣ遺伝子の翻訳開始コドンにおいてＮ ｅｏ　１部位を作製するために、実施例２において使用した。
実施例３において使用した。
配列番号６は、実施例３において記載しである、リジン非感受性ＤＨＤＰＳをコ ード化する、野生型コリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子のコーディング領域の ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、大腸菌ｄａｐＡ遺伝子の翻訳開始コドンにおいてＮｃｏ１部位を 作製するために、実施例４において使用した。
配列番号８、９、１０、および、１１は、葉緑体トランジット配列を作製するた め、および、その配列を大腸菌１ｙｓＣ，大腸菌±ｙｓＣ−Ｍ４、大腸菌ｄａｐ Ａ、および、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）ｄａｐＡ遺伝 子に結合させるために、実施例６において使用した。
配列番号１２および１３は、大腸菌ｄａｐＡ遺伝子の翻訳停止コドンのすぐ後に Ｋｐｎ　１部位を作製するために、実施例６において使用した。
配列番号１４および１５は、葉緑体トランノット配列を作製するため、および、 その配列をコリネバクテリウムｄａｐＡ遺伝子に結合させるために、実施例６に おいて使用した。
配列番号１６は、トウモロコンのための構成的発現カセットとして、実施例６に おいて使用した。
配列番号１７−２２は、トウモロコシ葉緑体トランジット配列を作製するため、 および、その配列を大Ｈａ　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４遺伝子に結合させるために、 実施例６において使用した。
配列番号２３および２４は、ＰＣＲプライマーとしてトウモロコシの葉緑体トラ ンジット配列を作製するため、および、その配列を大腸菌ｄａｐＡ遺伝子に結合 させるために、実施例６において使用した。
この配列図は、本明細書において参考文献により取り込まれている、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３　二　３０２１−３０３０　（１９ ８５）　、および、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａ］　２１９　（Ｎｏ ．２）＋３４５−３７３　（１９８４）において記載されているＩＵＰＡＣ−Ｉ ＹＵＢ標準との類似点において定義される、ヌクレオチド配列特性のための一文 字コードおよび、アミノ酸のための３文字コードを含んでいる。
発明の詳細な記述 遺伝子工学を介して植物の種子中に含まれる特定の遊離アミノ酸の蓄積を増加さ せるために、出願人は、この回路におけるどの酵素がこの回路を制御しているか を決定した。これを実行するために、この回路中に含まれる酵素をコード化する 遺伝子を細菌から単離した。いくつかの場合においては、その遺伝子内において 突然変異が生じ、コード化されている酵素が最終産物阻害に対して非感受性とな っていた。この遺伝子は植物を起源とするものではないため、それらの遺伝子は 、細胞内局在化配列、および、植物内における発現のための適切な調節配列に結 合させる必要があった。個々に独立しているか、あるいは、つながっているそれ らの遺伝子を、その後、形質転換を介して植物内に導入し、さらに、望ましい植 物器官（複数の場合もありうる）内における望ましいアミノ酸（複数の場合もあ りうる）の蓄積を除去する能力についてそれらの遺伝子の評価を行なった。
下記に示される教示は、形質転換させていない植物のアミノ酸のレベルと比較し た場合、形質転換させた植物の種子内におけるリシンおよびスレオニンの蓄積を 増加させるのに有用な核酸断片および処置法を記載している。具体的には、出願 人は、２つの核酸サブフラグメントからなる非反復（ｕｎｉｑｕｅ）の第１核酸 断片を提供しており、それらのサブフラグメントの一つは、リジンによる阻害に 対して非感受性であるＡＫをコード化しており、もう一方のものは、例えば、小 麦ＤＨＤＰＳのような典型的な植物ＤＨＤＰＳに比較して、リジンによるフィー ドバック阻害に対する感受性が少なくとも２０倍以上低いＤＨＤＰＳをコード化 している。出願人は、形質転換をさせていない宿種植物と比較した場合、形質転 換させた植物の種子内において蓄積するりシンをうまく増加させるのは、組合わ さったサブフラグメントであることを発見した。形質転換させた植物の種子内に おけるリシンの蓄積をより大きなものにするために、出願人は、アンチセンスリ シンケトグルクール酸レダクターゼ（ＬＫＲ）キメラ遺伝子を含む核酸断片をも 提供した。この断片は、第１断片に対して結合させることができるか、あるいは 、第１断片で形質転換させた植物の交配を介して、アンチセンスＬＫＲキメラ遺 伝子を含む核酸断片で形質転換させた植物と結合させることができる。出願人は 、リジン阻害に対して非感受性であるＡＫをコード化する核酸断片をも提供した 。この断片で形質転換させた植物は、形質転換させていない植物と比較して、そ れらの種子内におけるスレオニン蓄積が増加する。
本開示の文脈内においては数々の用語が利用されている。本明細書内において使 用されるように、用語「核酸Ｊは、糖、リン酸、および、プリンもしくはピリミ ジンのうちのいずれかを含む単員体からなる、１本鎖もしくは２本鎖であること ができる巨大分子を意味する。「核酸断片」は、与えられた核酸分子の一分画で ある。より高等な植物においては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝的物質で ある一方、リポ核酸（ＲＮＡ）は、蛋白質へのＤＮＡ内に含まれる情報の転移に 拘わっている。「ゲノム」は、ある生物体の各細胞内に含まれる遺伝的物質の全 本体である。
用語「ヌクレオチド配列」は、１本もしくは２本鎖であることができ、随意に、 ＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー内への組込みが可能な、合成、非天然、もしくは 、変化させたヌクレオチド塩基を含んでいる、ＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマー を意味する。
本明細書内において使用されているように、用語「に相同な」は、２つの核酸分 子のヌクレオチド配列間、もしくは、２つの蛋白質分子のアミノ酸配列間の相補 性を意味する。このような相同性の評価は、当該技術分野における当業者により 良く理解されている、緊縮条件下におけるＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮ Ａハイブリッド形成のいずれかにより　［Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈ４ｇｇｉｎｓ 　（ｅｄｓ、）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、　 ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、Ｕ、Ｋ、において記載されティる］、アル イハ、２つの核酸もしくは蛋白質間の配列類似性の比較により提供される。
本明細書内において使用されるように、「実質的に相同な」は、相同な配列のた めのものと比較すると、より緊縮性の低いハイブリッド形成条件を必要とする核 酸分子を意味し、さらに、コード化されているアミノ酸における変化を生じない 塩基変化を伴うことができる、あるいは、一つもしくは複数のアミノ酸を変化さ せるがそのＤＮＡ配列によりコード化される蛋白質の機能的特性には影響を与え ない塩基変化を伴なうコーディングＤＮＡ配列をも意味する。従って、本明細書 中に記載されている核酸配列は、ＤＮＡ配列が実質的に相同である限りは、核酸 断片の欠失、転位、ランダムもしくは調節された突然変異、および、時として生 じるヌクレオチド配列のエラーにさえ由来する、ヌクレオチド塩基の可能な変動 物を含む分子を含む分子を含む。
「遺伝子」は、コーディング領域に先行する（５゛　非コーディング）および後 続の（３°非コーデイング）調節配列を含む、特異的蛋白質を発現する核酸断片 を意味する。「固有の」遺伝子は、それ自身の調節配列を有する、天然において 見いだされる遺伝子を意味する。「キメラ」遺伝子は、異種の調節およびコーデ ィング配列を含む遺伝子を意味する。
「内在性」遺伝子は、ゲノム中の天然の配置において通常は見いだされる固有な 遺伝子を意味する。「外来性」遺伝子は、宿種生物体内において通常は見いださ れないが、遺伝子転移によって導入される遺伝子を意味する。
［コーディング配夕１月は、特異的蛋白質をコードし、かつ、非コーディング配 列を除外するＤＮＡ配列を意味する。
「開始コドン」および「停止コドン」は、蛋白質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始お よび鎖停止をそれぞれ特定するコーディング配列中に含まれる３つの近接するヌ クレオチドの単位を意味する。「読み取り枠」は、コーディング配列の、翻訳開 始コドンと停止コドンとの間をコード化するアミノ酸配列を意味する。
ｒＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写から結果 的に生じる産物を意味する。このＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完璧な相補的コ ピーである場合には、これは、−次転写産物を意味するか、あるいは、−次転写 産物の転写後のプロセッシングに由来するＲＮＡ配列であることができる。「メ ツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）Ｊは、細胞により蛋白質内に翻訳されること ができるＲＮＡを意味する。
ｒｃＤＮＡＪは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、がっ、それに由来する２本鎖 ＤＮＡを意味する。「センスＪ　ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を意味 する。「アンチセンスＲＮＡＪは、標的−次転写産物、即ち、ｍＲＮＡのすべて もしくは一部分に対して相補的であり、がっ、その−次転写産物、即ち、ｍＲＮ Ａのプロセッング、輸送、および／または、翻訳を妨げることにより、標的遺伝 子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を意味する。アンチセンスＲＮＡの相補性は、 特異的遺伝子転写物の任意の部位、つまり、５゛非コーディング配列、３゛非コ ーディング配列、イントロン、もしくは、コーディング配列に関して生ずること ができる。追加として、本明細書中に用いられているように、アンチセンスＲＮ Ａは、遺伝子発現を遮断するというアンチセンスＲＮＡの効能を増加させるリボ チーム配列の領域を含むことができる。「リボチーム」は、触媒的なＲ，Ｎ　Ａ を意味し、かつ、配列特異的エンドリボヌクレアーゼを含む。
本明細書中において用いられているように、適切な「調節配列」は、あるコーデ ィング配列の上流（５’）、その中、および／又は、下流（３′）に位置し、可 能性としては細胞の蛋白質生物合成装置と結合しているコーディング配列の転写 および／又は発現を調節するヌクレオチド配列を意味する。これらの調節配列に は、プロモーター、翻訳リーダー配列、転写停止配列、および、ポリアデニル化 配列がある。
「プロモーター」は、ある遺伝子中に含まれ、通常そのコーディング配列の上流 （５゛）に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼおよび正しい転写に必要な他の因 子についての識別を提供することにより、コーディング配列の発現を調節する、 ＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは、生理学的もしくは発生的条件に対して 反応する転写開始の効果を調節する蛋白質因子の結合に拘わっているＤＮＡ配列 をも含むことができる。
それはまた、エンハンサ−成分も含むことができる。
「エンハンサ−」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であ る。これは、プロモーターの先天的な成分であるか、あるいは、プロモーターの レベルおよび／又は組織特異性を亢進させるために挿入された異種成分であるこ とができる。［構成的プロモーター」は、すべての組織内において、いつでも遺 伝子発現を指令するプロモーターを意味する。本明細書中において参照される、 「器官特異的」もしくは「発生特異的」プロモーターは、葉もしくは種子のよう な特異的な器官において、あるいは、初期もしくは後期胚発生の各々のような、 ある器官における特異的発生段階において、はぼ独占的に遺伝子発現を指令する プロモーターである。
用語「操作可能に結合している」は、一つの核酸配列の機能が他の核酸配列によ って影響を受けるように結合されている、一本の核酸分子上の複数の核酸配列を 意味する。例えば、一つのプロモーターが、ある構造遺伝子（つまり、本明細書 中において与えられている、リジン非感受性であるアスバルトキナーゼをコード 化する遺伝子）の発現に影響を与えることができる場合には（つまり、この構造 遺伝子は、そのプロモーターの転写調節下にある）、そのプロモーターは、その 構造遺伝子と操作可能なように結合している。
本明細書中において用いられている用語「発現」は、ある遺伝子によりコード化 されている蛋白質産物の産生を意味することを意図している。
より特別には、「発現」は、細胞の蛋白質機関と共同して、蛋白質産物のレベル を変化させるという結果を生じる、本発明の核酸断片（複数である場合もある） に由来するセンス（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な 蓄積を意味する。「アンチセンス阻害」は、標的蛋白質の発現を妨げることがで きるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する。「ｆ３剰発現」は、正常もし くは形質転換されていない生物体内における、産生のレベルを越える、形質転換 生物体内におけるある遺伝子産物の産生を意味する。「コサプレッション」は、 内在性遺伝子に対して実質的な相同性を有する外来性遺伝子の発現を意味し、外 来性および内在性遺伝子の両方の発現のサプレッションを結果として生じる。「 変化したレベル」は、正常もしくは形質転換させていない生物体のものとは異な る量もしくは比率における、形質転換生物体内における遺伝子産物（複数である 場合もある）の産生を意味する。
「３゛非コーディング配列」は、ｍＲＡＮプロセッシングもしくは遺伝子発現に 影響を与えることができる、ポリアデニル化シグナルもしくは任意の他の調節シ グナルを含む遺伝子のＤＮＡ配列部分を意味する。
このポリアデニル化シグナルは、通常は、ｍＲＮＡ前駆体の３゛端に刻するポリ アデニル酸の管の添加に影響を与えるという特徴を有する。
「翻訳リーダー配列」は、ＲＮＡ中に転写されてゆき、かつ、翻訳開始コドンの 完全にプロセッシングされたｍＲＮＡ上流（５゛）において存在する、プロモー ターとコーディング配列との間の遺伝子のＤＮＡ配列部分を意味する。この翻訳 リーダー配列は、ｍＲＮＡに対する一次転写物のプロセッシング、ｍＲＮＡの安 定性、もしくは、翻訳効率に影響を与えることができる。
「成熟した」蛋白質は、標的用シグナルを持たない、翻訳後にプロセッシングさ れたポリペプチドを意味する。「前駆体」蛋白質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物 を意味する。「葉緑体標的用シグナル」は、蛋白質とつながって翻訳され、かつ 、このことを葉緑体に指図するアミノ酸配列である。「葉緑体トランジット配列 」は、葉緑体標的用シグナルをコード化するヌクレオチド配列を意味する。
本明細書においては、「形質転換」は、宿種生物体のゲノム内への外来性遺伝子 の転移、および、その遺伝子の遺伝子的に安定な受け渡しを意味する。植物の形 質転換の方法の例には、アグロバクテリウム介在性形質転換、および、分子加速 化、即ち「遺伝子ガン」形質転換技術がある。
ＡＫ遺伝子の単離 既に、大腸菌１ｙｓＣ遺伝子をクローン化し、制限エンドヌクレアーゼ地図を作 製し、さらに、配列を決定しである［Ｃａ５ｓａｎ　ｅｔａｌ、（１９８６）　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１：１０５２−１０５７３．本発明のために 、］　ｙｓＣ遺伝子を、Ｋｏｈａｒａ。
Ａｋｉｙａｍａ　ａｎｄ　ｌ５ｏｎｏ［Ｋｏｈａａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７） Ｃｅｌｌ　５０：５９５−５０８］により作製されたクローン化されている大腸 菌ＤＮＡの３４００の重複セグメントの定序ライブラリーから、バクテリオファ ージ　ラムダ−クローンを使用して取得した。
この大腸菌］　ｙｓＣ遺伝子は、リジン阻害に対して感受性である酵素ＡＫｉｌ ｌをコード化している。ＡＫＩＩＩ酵素をリシンに対して感受性にさせる突然変 異がＩｙｓＣ遺伝子遺伝子−て生じた。
リシン耐性についての分子的根拠を決定するために、野生型１ｙｓＣ遺伝子およ び３つの変異体遺伝子の配列を決定した。配列番号１において示される、クロー ン化した野生型１ｙｓＣ遺伝子の配列は、発表されているＩｙｓＣ配列とはコー ディング領域内における５つの位置が異なっ匹遺伝子の配列は、各々１つのヌク レオチドが野生型配列とは異なっており、その結果、蛋白質内における単一なア ミノ酸置換を生じていた。
ある変異体（Ｍ２）は、配列番号１のヌクレオチド９５４におけるＧの代わりに 置換されているＡを有しており、その結果ＡＫＩＩＩのアミノ酸配列におけるメ チオニンに代わるイソロイシン置換を生じており、さらに、２つの変異体（Ｍ３ およびＭ４）は、配列番号１のヌクレオチド１０５５における、相同な、Ｃに変 わるＴの置換を有し、その結果スレオニンに代わるインロイシン置換を生じてい た。
他の突然変異を、実施例１において記載しているように、インビボにおいて、あ るいは、当該技術分野における当業者に知られている方法による部位特異的突然 変異によりインビトロにおいて、のいずれかで、作製することができ、この結果 、野生型ＡＫＩＩＩ内のこれらの部位に存在するメチオニンもしくはスレオニン 残基についてのアミノ酸置換を生じた。このような突然変異の結果リジン非感受 性酵素を生じることが期待される。その上、実施例１において記載される方法を 使用して、希望する数量の、リシン非感受性ＡＫＩＩＩをコード化する追加的な 変異体］ｙｓＣ遺伝子遺伝子し、さらに、その性質決定を行なうことが簡単にで きる。
数々の他のＡＫ遺伝子が単離され、かつ、配列決定されている。これらには、大 腸菌のｔ　ｈ　ｒ　Ａ遺伝子［Ｋａｔｉｎｋａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７７　：　５７３０−５ ７３３］　、大腸菌のｍｅｔＬ遺伝子遺伝子ｋｉｎｅｔ　ａｌ、（１９８３）　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８；Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ ３：２１４６−２１５１］がある。大腸菌のｔｈｒＡ遺伝子遺伝子重機能を備え た蛋白質、ＡＫ　Ｉ　−ＨＤＨＩをコード化している。この酵素のＡＫ活性はり シンに対しては非感受性であるが、スレオニンに対して感受性である。大腸菌の ｍ　ｅ　ｔ　Ｌ遺伝子遺伝子もやはり二重機能を備えた蛋白質、ＡＫ　Ｉ　Ｉ　 −ＨＤＨＩ　Ｉをコード化しており、この酵素のＡＫ活性もやはりリシンに対し て非感受性である。イーストのＨＯＭ３遺伝子は、リジンに対して非感受性であ るが、スレオニンに対しては感受性であるＡＫをコード化している。
これらの遺伝子に加え、リジン非感受性ＡＫをコード化している数種の植物遺伝 子が知られている。大麦においては、２つの異なるリジン非感受性ＡＫイソ酵素 を結果として生じる、２つの結合していない遺伝子中ニおける、リジン　プラス 　スレオニン耐性変異体形成性突然変異が記載されティる［Ｂｒｉｇｈｔ　ｅｔ 　ａｌ、　（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９９：２７８−２７９、Ｒｏｇｎｅ ｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｐｌａｎｔａ　１５７：３２−３８、Ａｒｒ ｕｄａ　ｅｔａｌ、　（１９８４）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　７６＋４ ４２−４４６１゜トウモロコシにおいては、リジン　プラス　スレオニン耐性細 胞株が、その親株と比較した場合にリジン阻害に対してより弱い感受性を示すＡ Ｋ活性を有していた［Ｈｉｂｂｅｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｐｌａｎ ｔａ　１４８：１８３−１８７１．その後に単離されたりシン　プラス　スレオ ニン耐性トウモロコシ変異体は、異なる遺伝子座が変化させられており、かつ、 リジン非感受性ＡＫをも産生する［Ｄｉｅｄｒｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９ ０）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　７９：２０９　２１５、Ｄｏｔｓ ｏｎ　ｅｔａｌ、　（１９９０）　Ｐｌａｎｔａ　１８２：５４６−５５２］。
タバコにおいては、葉において２つのＡＫ酵素が存在し、一つのものはりシン感 受性であり、もう一方のものはスレオニン感受性である。完全にリシン非感受性 であるＡｋを発現する、リジン　プラス　スレオニン耐性タバコ変異体が記載さ れている［Ｆｒａｎｋａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐ ｌ、Ｇｅｎｅｔ、　８２：２７３−２８２］。これらの植物変異体は、リジン非 感受性ＡＫをコード化している遺伝子の源として働き、かつ、本明細書内におけ る教示に基づき、形質転換させた植物の種子内におけるリシンおよびスレオニン の蓄積を増加させるのに使用することができる。
ニンジンからのＡｋの部分的アミノ酸配列が報告されている［Ｗｉｌｓｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。
９７　：１３２３　：１３２８］。この情報を使用して、一連の縮重ＤＮＡオリ ゴヌクレオチドを設計し、合成し、さらに、ハイブリッド形成用プローブとして 使用して、ニンジンＡＫ遺伝子の単離を可能にすることができる。最近、ニンジ ンＡＫ遺伝子が単離され、かつ、そのヌクレオチド配列が決定された［Ｍａ、ｔ ｔｈｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）米国特許出願第０７７”ｌ　４６．７ ０５号］。この遺伝子を異種ハイブリッド形成用プローブとして使用して、先に 記載したりノン非感受性ＡＫをコード化する遺伝子を単離することができる。
クテリオファーン　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系［Ｒｏｓｅ ｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５６：１２５−１３５］ を利用する細菌性発現ベクターを使用した。この発現ベクターおよびＩｙｓＣ遺 伝子を、実施例２において記載されるように改変して１ｙｓｃ発現ベクターを作 製した。変異体］ｙｓＣ遺伝子（Ｍ２、Ｍ３、および、Ｍ４＞の発現のために、 野生型１ｙｓｃ遺伝子を、実施例２において記載したように、変異体遺伝子で置 換させた。
高レベル発現のために、各発現ベクターを、大腸菌株Ｂ１２１（ＤＥ３）［５ｔ ｕｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　１８９：１１３−１３０１内に形質転換させた。実施例２において 記載したように培養物を成育させ、発現を誘導し、細胞を回収し、さらに、抽出 物を調製した。誘導を行なわなかった培養物、および、誘導を行なった培養物か らの抽出物の上清およびペレット分画を、実施例２において記載されているよう に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＡＫ酵素アッセイにより分析 した。誘導を行なった培養物の上清およびベレット分画中に含まれる、クーマシ ーブルー染色により可視化される主要蛋白質がＡＫＩＩＩであった。約８０％の ＡＫＩＩＩ蛋白質が上清中に存在し、かつ、ＡＫＩＩＩは、抽出物中に含まれる 大腸菌の総蛋白質の１０−２０％を占めていた。
約８０％のＡＫＩＩＩ酵素活性が上清分画中に存在した。野生型および変異体の 未処理抽出物の特異活性は、ミリグラム総蛋白質当たりのマイニュート（ｍｉｎ ｕｔｅ）当たり５−７μモル産生物であった。野生型ＡＫＩＩＩは、このアッセ イにおいては、Ｌ−リジンの存在に対して感受性を示した。５０パーセント阻害 が、約０．４ｍＭの濃度において、さらに、９０パーセント阻害が、約０．１ｍ Ｍの濃度において観察された。コレトハ対照的に、変異体ＡＫＩＩｒ−Ｍ２、Ｍ ３、および、Ｍ４は、１５ｍＭのし一リジンによっては全く阻害されなかった。
野生型ＡＫＩＩＩ蛋白質は、実施例２において記載されているように、誘導をか けた培養物の上清から精製した。精製したＡＫＩＩＩ蛋白質に対してウサギ抗体 を作製した。
多くの他の細菌性発現ベクターが、刊行物において記載されている。
当該技術分野における当業者は、これらのもののうちの任意のものを使用して１ ｙｓｃ発現ベクターを作製することができる。これらの−１ｙｓ−ｐ発現ベクタ ーをその後、形質転換を介して適切な微生物中に導入させて、ＡＫＩＩＩの高レ ベル発現のための系を提供することができる。
ＤＨＤＰＳ遺伝子の単離 既に、大腸菌のｄａｐＡ遺伝子（ｅｃｏｄａｐＡ）がクローン化され、制限エン ドヌクレアーゼの地図が作製され、さらに、配列決定が行なわれている［Ｒｉｃ ｈａｕｄ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６６ ：２９７−３００１゜本発明のために、このｄａｐＡ遺伝子を、Ｋｏｈａ　ｒａ ＳＡｋ　ｉ　ｙａｍａ、および、ｌ５ｏｎｏ［Ｋｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（ １９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０：５９５−５０８］により作製されたクローン化さ れた大腸菌ＤＮＡの３４００の重複セグメントの定序ライブラリーから、バクテ リオファージラムダ−クローンを用いて取得した。このｅｃｏｄａｐＡ遺伝子は 、リジン阻害に対して感受性であるＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ酵素をコード化している。
しかしながら、これは、例えば小麦胚芽ＤＨＤＰＳのような典型的な植物ＤＨＤ ＰＳと比較すると、リシンによる阻害に対する感受性が約２０倍低い。
コリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子（ｄｏｒｄａｐＡ）を、ポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ，）を使用して、ＡＴＣＣ株１３０３２由来のゲノムＤＮＡから単 離した。コリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列は発表されて いる［Ｂｏｎｎａ’５ｓｉｅ　ｅｔ　ａｌ。
（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８：６４２１コ。こ の配列からは、その遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を可能にさせると思われるポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，）のためのオリゴヌクレオチドブライマーを設計 し、さらに同時に、その遺伝子の開始コドンの位置および停止コドンの直後にお いて非反復の制限エンドヌクレアーゼ部位を添加して、その遺伝子を伴うさらに 別の構造物を利用することかで非感受性であるＤＨＤＰＳ酵素をコード化してい る。
翻訳開始コドンにおける制限エンドヌクレアーゼ部位の導入に加え、ＰＣＲプラ イマーもやはり、セリンをコードしているＡＧＣからアラニンをコードしている ＯＣＴへと、ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の第２コドンを変化させた。活性を示すリジ ン非感受性ＤＨＤＰＳを発現する数種のクローン化ＤＮＡ断片が単離されており 、これにより、第２コドンのアミの酸置換は酵素活性に影響を与えないことが示 されている。
ＰＣＲで作製したコリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子をＰｒｏｍｅｇａ社から のファゲミドベクターｐＧＥＭ−９ｚｆ　（）内にサブクローン化させ、さらに 、１本鎮Ｄ　Ｎ　Ａを作製して配列を決定した（配列番号６）。既に述べた第２ コドンにおける差異は別として、この配列は、２つの位置、つまり、ヌクレオチ ド７９８および７９９を除いては、発表されている配列と一致していた。発表さ れている配列においてはこれらはＴＣである一方、配列番号６において示される 遺伝子においてはこれらはＣＴである。この変化の結果、セリンに代わるロイシ ンのアミノ酸置換が生じている。この差異についての理由は判明していない。こ の差異は、ＤＨＤＰＳ酵素活性については明白な影響を与えない。
ＤＨＤＰＳをコード化する他の遺伝子の単離が刊行物において記載されている。
小麦からのＤＨＤＰＳをコード化するｃＤＮＡ　［Ｋａｎｅｋｏ　ｅｔ　ａｌ、 （１９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５　：１７４５１−１７４ ５５１、　および、トウモロコンからのＤＨＤＰＳをコード化するｃＤＮＡ　［ Ｆｒ１ｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ 、　２２８：２８７−２９３］が２つの例である。これらの遺伝子は野生型のり シン感受性ＤＨＤＰＳ酵素をコード化している。しかしながら、Ｎｅｇｒｕｔｕ ｉ　ｅｔ　ａｌ、［（１９８４）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　 ６８：１１−２０３は、野生型酵素と比較して、ＤＨＤＰＳ活性がリシン阻害に 対してより弱い感受性を示す２つのＡＥＣ耐性タバコ突然変異体を取得した。こ れらの遺伝子は、小麦もしくはトウモロコン遺伝子の単離のために既に記載した 方法を使用して、あるいは、別の方法として、異種のハイブリッド形成用プロー ブとして小麦もしくはトウモロコシの遺伝子を使用することにより単離すること ができた。
ＤＨＤＰＳをコード化するさらに他の遺伝子が、当該技術分野におけＰＳ遺伝子 の内のいずれかを利用することにより単離することができる。
さらに別の方法として、Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓをコード化する他の遺伝子を、Ｃ０ｅ ｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２１２：１０５−１１１］およびトウモロコシのＤＨＤＰＳ 遺伝子を単離するために行なったように、大腸菌のｄａｐΔ変異体との機能上の 相補性により単離することができる。
大腸菌内におけるｅｃｏｄａｐＡおよびｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現 大腸菌内におけるｅｃｏｄａｐＡおよびｃｏｒｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現を 行なうために、バクテリオファージのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモー ター系［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５６　 ：１２７−１３５３を利用する細菌性発現べを作製した。
高レベル発現のために、各発現ベクターを、大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）内に 形質転換させた［５ｔｕｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｉ、　（１９８６）Ｊ、Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　１８９：１１３−１３０１゜実施例４において記載されているよう にして、培養物を成育させ、発現を誘導させ、細胞を回収し、さらに、抽出物を 、調製した。誘導をかけなかった培養物および誘導をかけた培養物の抽出物の上 清およびペレット分画を、実施例４において記載されているようにして、ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＤＨＤＰＳ酵素アッセイにより分析した 。誘導をかけた両方培養物の上清およびペレット分画中においてクーマシーブル ー染色により可視化される主要蛋白質は、Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓについて期待される サイズである３２−３４ｋｄの分子員を有していた。誘導をかけなかった培養物 中においてさえも、この蛋白質は、産生された最も優勢な蛋白質であった。
ＤＨＤＰＳ蛋白質が上清中に存在し、かつ、ＤＨＤＰＳは、その抽出物中に含ま れる総蛋白質の１０−２０％を占めていた。ｃｏｒｄａｐＡ遺伝子で誘導をかけ た培養物中においては、５０％を上回るＤＨＤＰＳ蛋白質がペレット分画中に含 まれていた。両方の場合におけるペレット分画は９０−９５％純粋なり　ＨＤ　 Ｐ　Ｓであり、他の単純蛋白質は有意な重量では存在していなかった。従って、 これらの分画は、ウサギ抗体の作製における用途のためには十分に純粋であった 。
誘導をかけた抽出物の上清分画中の大腸菌Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓの特異活性は、ミリ グラム蛋白質当たり５０　０ＤＳ４゜単位であった。大腸菌Ｄ　ＨＤ　ＰＳは、 このアッセイにおいてはＬ−リシンの存在に対して感受性を示した。５０パーセ ント阻害が約０．５ｍＭの濃度において観察された。コリネバクテリウムのＤＨ ＤＰＳについては、酵素活性は、誘導をかけた抽出物よりはむしろ、誘導をかけ なかった抽出物の上清分画において測定された。酵素活性は、ミリグラム蛋白質 当たり、マイニュート当たり、約４　０Ｄ５３０単位であった。大腸菌のＤＨＤ ＰＳとは対照的に、コリネバクテリウムのＤＨＤＰＳは７０ｍＭの濃度において さえ、Ｌ−リジンによって全く阻害されなかった。
池の多くの細菌性発現ベクターが、刊行物において記載されている。
当該技術分野における当業者は、これらの内の任意のものを利用して、ｅｃｏｄ ａｐＡもしくはｃｏｒｄａｐＡ発現ベクターを作製することができる。これらの 発現ベクターをその後、形質転換を介して適切な微生物中に導入させ、ＤＨＤＰ Ｓの高レベル発現のための系を提供することができる。
高レベルのＤＨＤＰＳおよび／又はＡＫＩＩ’ｌを発現する大腸菌によるアミノ 酸の排出 大腸菌発現カセットを発現ベクター内に挿入し、その後、大腸菌株ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）［５ｔｕｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｊ。
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９＋１１３−１３０］内に形質転換させて大腸菌を 誘導し、アミノ酸を産生および排出させた。使用した処置法の詳細および結果は 、実施例５において示されている。
当該技術分野における当業者に知られている他の細菌性発現ベクターを使用して 、ＩｙｓＣおよびｄａｐＡ遺伝子のための発現かセットを作製および組み合わせ ることができる。これらの発現ベクターをその後形質転換を介して適切な微生物 中に導入して、リジン、スレオニン、および、メチオニンの産生および排出のた めの別の系を提供することができる。
植物内におけるＩｙｓＣおよびｄａｐＡコーディング領域の発現のためのキメラ 遺伝子の作製 植物内における外来性遺伝子の発現が確立されている［Ｄｅ　Ｂｌａｅｒｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。
１４３　：　２７７−２９１１　、適切なレベルのＩｙｓｃおよびｄａｐＡのｍ 　ＲＮ　Ａの発現は、異なるプロモーターを利用する異なるキメラ遺伝子の用途 を必要とすることがある。このようなキメラ遺伝子は、一つの発現ベクター内に 一緒に、あるいは、１つを上回るベクターを使用しておよびｄａｐＡ遺伝子のコ ーディング配列の発現のための好ましいクラスの異種宿主は、真核生物宿主、特 により高等な植物の細胞である。より高等な植物、および、それらに由来する種 子の内で特に好ましいのは、ダイス、ナタネ（ブランカ　ナブス（Ｂｒａｓｓｉ ｃａ　ｎａｐｕｓ）、ｉｃａｇｏ　５ａｔｉｖａ））、小麦（トリティクム　ｓ ｐ（Ｔｒｉｔｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ））、米（オリザ　サテイバ（Ｏｒｙ ｚａｓａｔｉｖａ））、および、飼料用牧草である。植物内における発現は、こ のような植物内における調節配列機能を使用する。
コーディング配列の発現を駆動させるために選択したプロモーターの起源は、そ れが、初期の宿主組織内において、ＩｙｓＣもしくはｄａｐΔ遺伝子のための翻 訳可能なｍ　ＲＮ　Ａを発現させることにより本発明を実行するのに十分な転写 活性を有しているかぎり限定されるものではない。すべての植物器官における発 現のための、および、特に、葉における発現のための好ましいプロモーターには 、カリフラワーモサイクウイルス内において１９Ｓおよび３５Ｓの転写を指令す るプロモーター［０ｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３ １３：８１０−８１２：Ｈｕｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　８６：４８２−４９３コ、リブロース　１．５−ビスリン酸カプロキシラ ーゼの小サブユニット［Ｍｏｒｅｌｌ’ｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｎａ ｔｕｒｅ　３１５：２００；Ｂｒｏｇｌｉｅ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：８３８；Ｈｅｒｅｒｒａ−Ｅｓｔｒｅ ｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１Ｏ：１１５：Ｃｏｒ ｕｚｚｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３：１６７１；Ｆａｃ ｉｏｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３： ２４１］、トウモロコシのゼイン蛋白質［Ｍａｔｚｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８４）　ＥＭＢＯＪ。
３：１５２５１、および、クロロフィルａ／ｂ結合性蛋白質［Ｌａｍｐａ　ｅｔ 　ａｌ、　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３１６：７５０−７５２１がある。
適用法によっては、植物の１つもしくは複数の器官における発現に特異的なプロ モーターを選択することが望ましいことがある。その例には、発現が光合成性器 官において望まれる場合におけるリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラー セの小サブユニットの光誘導可能なプロモーター、あるいは、種子内において特 異的に活性であるプロモーターがある。
好ましいプロモーターは、種子内において特異的に蛋白質の発現を可能にするプ ロモーターである。種子は野菜のアミノ酸の主要な源であるため、および、種子 特異的発現は非種子器官における任意に潜在する悪影響を回避すると思われるた めに、このプロモーターは特に有用であることができる。種子特異的プロモータ ーの例には、種子の貯蔵蛋白質のプロモータがあるが、これに限定はされない。
この種子の貯蔵蛋白質は厳密に調節されており、種子内においてほぼ独占的に、 高度に器官特異的および段階特異的方法において発現させられている［Ｈｉｇｇ ｉｎｓｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、　３５：１９１−２２１；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９ ）　Ｃｅ　Ｉ　ｌ　５６　：１４９−１６０　＋Ｔｈｏｍｐｓ。
ｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　ＢｉｏＥｓｓａｙｓ　１０：１０８−１１３ １゜その上、異なる種子貯蔵蛋白質が、種子の発達の異なる段階において発現さ せられることがある。
最近では、形質転換双子葉植物における種子貯蔵蛋白質遺伝子の種子特異的発現 については、多大な数の例が存在する。これらには、マメのβ−ファセオリン［ Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐｌａｌａｎ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：３３ ２０−３３２４：Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１ニア１７−７２９］、マメのレクチン［Ｖｏｅｌｋ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６：３５７１−３５７７１ 、ダイスレクチン［ｏｋａｍｕｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：８２４０−８２４４１、ダイ ス　クニッッ　トリプシンインヒビター［Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：０９５−１１０９１、ダイスのβ− コングリシニン（ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）［Ｂｅａｃｈｙｅｔ　ａｌ、　（１ ９８５）　ＥＭＢＯＪ、　４：３０４７−３０５３：Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８５：４５８−４６２＋Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、 　７：２９７−３０２：Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９’）　Ｄｅｖ、　 Ｇｅｎｅｔ。
１０：１１２−１２２：Ｎａ１ｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９３８）Ｐｌａｎｔ　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１：１０９−１２３１．１ンドウのピシリン（ｖｉｃ ｉｌｉｎ）［Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　ＰＩａｒ、ｔ　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１：６８３−６９５］、エントウのコンビシリン（ｃｏ ｎｖｉｃｉｌｉｎ）［Ｎｅｗｂｉｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　Ｐｌａ ｎｔａ　１８０：４６１コ　、エントウのレグミン（Ｉｅｇｕｍｉｎ）［５ｈｉ ｒｓａｔ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８９）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１５：３２６］、ナ タネのネービン（ｎａｐｉｎ）［Ｒａｄｋｅ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８８）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　７５：６８５−６９ ４１　、のための、双子葉植物からの遺伝子、並びに、トウモロコシ（７）１５ ｋＤゼイ：、ｚ（ｚｅｉｎ）［Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６　：３２１３−３２２１　；５ｃｈｅｒｎｔｈ ａｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、　７：１２４９−１２５ ３；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、　８８：１００２−１００７１、大麦のβ−ホルデイン（ｈｏｒｄｅ ｉｎ）［Ｍａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１．０：３５９−３６６１ 、および、小麦グルテニン（ｇｌｕｔｅｎｉｎ）［Ｃｏ１ｏｔｅｔ　ａｌ、　（ １９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６：３５３９　３５６４〕のような単子葉植物から の遺伝子がある。さらに、キメラ遺伝子構造物中において異種のコーディング配 列に操作可能に結合しである種子持異的遺伝子のプロモーターもやはり、形質転 換植物内における一過性でありかつ場所特異的な発現パターンを保持している。
このような例には、アラビドプシス（Ａｒａｂ　１ｄｏｐｓ　ｉ　ｓ）およびＢ 、ナブス（Ｂ、　ｎａｐｕｓ）の種子内におけるエンケファリンの発現のための 、アラビドプシス　サリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ） の２８種子貯蔵蛋白質遺伝子プロモーター［Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。
ｇｙ　７：９２９−９３２１、および、ルシフェラーゼ［Ｒｉｇｇｓｅｔ　ａｌ 、　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　６３：４７−５７］を発現するため のマメのレクチンおよびマメのβ−ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｊｎ）プロモ ーター、および、クロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ［Ｃｏ１ ｏｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）ＥＭＢＯＪ、　６：３５５９−３５６４１を 発現するための小麦グルテニンプロモーターがある。
クニッットリブシン　インヒビター［Ｊｏｆｕｋｕ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：１０７９−１０９３：Ｐｅｒｅｚ− Ｇｒａｕ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　ＰＩａ、ｎｔ　Ｃｅ１１　１：１０９ ５−１１０９１、グリノニン［Ｎ１ｅｌｓｏｎ　ｅｔａｌ、　（１９８９）　Ｐ ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：３１３−３２８１、β−コンクリノーン［］１ａｒａ ｄａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：４１５−４２ ５］、のためのプロモーターのような、広範囲にわたって特徴が決定されている 種々のダイズ種子貯蔵蛋白質遺伝子からの異種プロモーターが、本発明の核酸断 片の発現において特に利用されるものと思われる。ダイズのβ−コングリソニン 貯蔵蛋白質のα゛　−およびβ−サブユニットのプロモーターは、特に、形質転 換植物内において、ダイズ種子発生の中期から後期段階の子葉中に含まれるＩｙ ｓＣおよびｄａｐＡのｍＲＮＡを発現させるのに有用であると思われ［Ｂｅａｃ ｈｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ。
４＋３０４７−３０５３；Ｂａｒｋｅｒ　ｅＬ　ａｌ、　（１９８８）Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５：４５８−４６２；Ｃｈｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８８）　ＥＭＢＯＪ、　７：２９７−３０２：Ｃｈｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｄｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０：１１２−１２２； Ｎａ１ｔ。
ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
１１　＋１０９−１２３１　、それは、ａ）形質種子中においては、それらの発 現に関する位置効果が非常にわずかであり、かつ、ｂ）α゛　−サブユニット遺 伝子のためのプロモーターは、β−サブユニット遺伝子のためのものの２．３日 前に発現される、というように、その２つのプロモーターが異なる一過性の調製 を示すためである。
１０ｋＤのゼイン［Ｋｉｒｉｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）Ｇｅｎｅ　 ７１：３５９−３７０］、２７ｋＤのゼイン［Ｐｒａｔｅｔ　ａｌ、　（１９８ ７）　Ｇｅｎｅ　５２：５１−４９；Ｇａ１ｌａｒｄｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ８）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　５４：２１１−２８１１、および、１９ｋＤのゼ イン［Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２６０：１６４５１−１６４５９１からの内胚乳特異的プロモーターのよう な、広範囲にわたり特徴が決定されている種々のトウモロコシ貯蔵蛋白質遺伝子 からの異種プロモーターもやはり、本発明の核酸断片の発現において特に用いら れるものと思われる。トウモロコンにおけるこれらのプロモーターの転写比活性 が報告されており［Ｋｏｄｒｚｙｃｋ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：１０５−１１４］、これは、トウモ ロコシのためのキメラ遺伝子構造物内における用途のためのプロモーターを選択 するための基盤を提供している。トウモロコシの胚における発現のために、Ｇ　 Ｌ　Ｂ　１遺伝子からの強力な胚特異的プロモーター［Ｋｒ１ｚ　（１９８９） 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２７：２３９−２５１、Ｗａｌ ｌａｃｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９５ ：９７３−９７５１を使用することができる。
他のプロモーター構造物内へのエン／１ンサーもしくはエン／１ンサ一様因子の 導入も、本発明を行なうための、］ｙｓＣおよびｄａｐＡ遺伝子のための一次転 写レベルの増加を提供するものと思われる。これらには、３５Ｓプロモーター内 において見いだされたエンハンサ−［０ｄｅｌｌｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　 Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
１０　：　２６３−２７２］のような細菌性のエン／１ンサー、オバイン（Ｏｐ ｉｎｅ）遺伝子からのエンハンサ−［Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ、ａｌ、　（１９８９） 　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　１：９７７−９８４１、あるいは、任意の他の源から のエンハンサ−などがあり、これらは、本発明の核酸断片に対して操作可能に結 合させであるプロモーター内に入れる場合には転写の増加を生じる。
構成的プロモーターに対して４０倍の種子特異的増強化を付与することができる 、β−コングリシニンのα°　−サブユニットのための遺伝子から単離されたＤ ＮＡ配列成分は、特に重要なものである［Ｃｈｅｎｅｔ　ａｌ、　（１９８８） 　ＥＭＢＯＪ、　７：２９７−３０２；Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９） 　Ｉ）ｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０：１１２−１２２１゜当該技術分野における 当業者は、形質転換植物内における、プロモーターでの種子特異的増強化発現を 獲得するために、この成分を単離し、さらに、これを、任意の遺伝子のプロモー ター領域内に挿入することを簡単に行なうことができる。β−コングリシニンと は異なる倍率で発現される任意の種子特異的遺伝子内においてこのような成分を 挿入すると、結果として、種子発生の間のより長い期間にわたる、形質転換植物 内における発現を生じるものと思われる。
１ｙｓｃもしくはｄａｐＡコーディング領域の適切な発現のために必要であると 思われる、ポリアデニル化シグナルおよび他の調節配列を提供することができる 任意の３°非コーデイング領域を使用して、本発明を実行することができる。こ れには、マメのファセオリン遺伝子の３′端、ダイズのβ−コングリシニン遺伝 子の３°端のような任意の貯蔵蛋白質からの３°端、３５３もしくは１９Ｓカリ フラワーモザイクウイルス転写物の３°端のような、ウィルス遺伝子からの３“ 端、オバイン合成遺伝子からの３゛端、リブロース１．５−ビスリン酸カルボキ シラーゼもしくはクロロフィルａ　／　ｂ結合性蛋白質の３′端、あるいは、利 用する配列がその核酸配列内に含まれる必要な調節情報を提供する結果、その配 列を操作可能なように結合しであるプロモーター／　ｌ　ｙ　ｓ　Ｃコーディン グ領域組合わせ配列を適切に発現させるような、任意の源からの３′配列がある 。当該技術分野においては、異なる３′非コーデイング領域の有用性を教示する 数々の例が存在している［例えば、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、　（ １９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ１：６７１−６８０を参照せよ］。
本発明を実行するために蛋白質の適切な発現が必要である場合には、細胞内局在 化配列をコードするＤＮＡ配列を、１ｙｓｃおよびｄａｐＡコーディング配列に 添加することができる。植物のアミノ酸性合成酵素は葉緑体内に局在化すること がしられており、そのため、それらは、葉緑体標識化シグナルをつけた状態で合 成される。ＤＨＤＰＳおよびＡＫＩＩＩのような細菌性蛋白質にはこのようなシ グナルがない。従って、葉緑体のトランジット配列を、ｄａｐＡおよび１ｙｓｃ コーディング配列に融合させることができる。好ましい葉緑体トランジット配列 は、双ｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。
Ｇｅｎｅ　ｔ、　１　：　４３８−４９８］からの、そして、単子葉植物におけ る用途のためには、例えば、トウモロコン［Ｌｅｂｒｕｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１ ９８７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１５：４３６０コからの、リ ブロース１，５−ビスリン酸カルボキシダーゼの小サブユニットのものである。
植物内への１ｙｓｃおよびｄａｐＡキメラ遺伝子の導入より高等な植物の真核細 胞内へのＤＮＡ配列（つまり、形質転換用の）を導入させる様々な方法が、当該 技術分野における当業者に利用できる（欧州特許出願公開第　２９５　９５９号 および同０　１３８　３４１号を参照のこと）。このような方法には、アグロＩ くクテリウム（Δ遣ニーだ形質転換ベクターに基づくものがある。このようなベ クターの二成分性の種類のものを使用することが特に好ましい。Ｔｉ由来のベク ターは、例えば、ダイズ、綿、および、セイヨウアブラナのような単子葉植物お よび双子葉植物を始めとする、広井範囲のより高等な植物を形質転換させる［Ｐ ａｃｃｉｏｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　３２４１＋Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ ｌＳＴｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　８：３＋５ｕｋｈａ ｐｉｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 　８：２０９−２１６；Ｌｏｒｚ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｇ ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１９９：１７８；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　（１９８５）　Ｍｏ ｌ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９９：１８３］。
植物内へ導入させるために、実施例７−１２および１４−１６において記載され ているように、本発明のキメラ遺伝子を二成分性ベクター内に挿入することがで きる。このベクターは、アグロバクテリウム　ッメファキエンス（Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の二成分性のＴｉプラスミドベクタ ー系［Ｂｅｖａｎ、　（１９８４）Ｎｕｃｌ　Δｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２： ８７１１−８７２０コの一部分である。
外来性ＤＮＡ構造物の直接的取込み［欧州特許出願公開第２９５９５９号を参照 のことコ、エレクトロポレーション技術［Ｆ　ｒ　ｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１ ９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１９７９１を参照のこと］、も しくは、核酸構造物でコートした金属性粒子での高速弾道ボンバードメント［Ｋ １１ｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９３７）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３ ２７：７０を参照し、さらに、米国特許第４．．９４５．０５０号を参照のこと ］、のような他の形質転換方法が、当該技術分野における当業者にとって利用で きる。一度形質転換させたら、当該技術分野における当業者はこれらの細胞を再 生することができる。
ナタネ［Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、　９１：６９４−７０１１、ヒマワリ　［Ｅｖｅｒｅｔｔ　ｅｔ　ａ ｌ、　（１９８７）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５　：１２０１］　、ダイ ズ［ＭｃＣａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）Ｂｊｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　６：９２３；Ｈｉｎｃｈｅｅ　ｅｔａｌ、　（１９８８）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　６：９１５＋Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｌａｎ ｔ　Ｐｈｙｓｉ。
１、９１：１２１２−１２１８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｔ。
（１９８９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：７ ５００　７５０４；ＥＰＯＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　０３０１　７４９　Ａ２］ 、および、トウモロコシ［Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０ ）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２：６０３−６１８；Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ、　 （１９９０）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ　］　ｏｇｙ　８　：　８３３−８３９１の ような、商業上重要な作物１内に外来性遺伝子を形質転換させるために最近記載 された方法は、特に適切なものである。
高速弾道ボンバードメントによる植物内への導入のために、本発明のキメラ遺伝 子を、実施例６において記載したように、適切なベクター内に挿入することがで きる。形質転換させた植物を、実施例１７−１９において記載したように取得す ることができる。
植物内におけるｌ　ｙｓＣおよびｄａｐＡキメラ遺伝子の発現形質転換させた植 物の葉もしくは種子内におけるキメラ遺伝子の発現についてアッセイを行なうた めに、ＡＫＩＩ’ＩもしくはＤＨＤＰＳ蛋白質を、当該技術分野における当業者 に知られている方法により、酵素学的および／又は免疫学的に検出および定量す ることができる。このような方法においては、高レベルの発現蛋白質を産生ずる 株を簡単に同定することができる。
葉の遊離アミノ酸組成を測定する目的で、遊離アミノ酸を、実施例７において記 載されているものを始めとする様々な方法により抽出することができる。種子の 遊離アミノ酸もしくは総アミノ酸組成を測定するには、抽出物を、実施例８にお いて記載されているものを始めとする様々な方法により調製することができる。
葉内における遊離リジンもしくはスレオニン（もしくは、任意の他のアミノ酸） レベルについて、ＡＫｒｌｌもしくはＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４　（葉緑体標的用シ グナルを有する）の発現の顕著な影響は存在しなかった（実施例７の表２を参照 せよ）。ＡＫ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４は、回路の最終産物の任意のものによるフィー ドバック阻害に対して非感受性であるため、このことは、調節が、葉における生 合成回路における他の段階において働いているに違いないことを示している。
それとは対照的に、種子内におけるＡＫＩＩＩもしくはＡｌ（１１１Ｍ４（葉緑 体標的用シグナルを有する）の発現の結果、形質転換していない植物と比較する と、種子内の遊離スレオニンのレベルが、それぞれ、２から４倍、あるいは、４ から２３倍増大し、かつ、ある場合においては、遊離リジンのレベルが２から３ 倍増大するという結果を生じた（実施例８の表３）。より高いレベルのＡＫｒＴ ＩもしくはＡＫ［Ｉ−Ｍ４蛋白質を発現する形質転換体と、より高いレベルの遊 離スレオニンを有するものとの間に優良な相関が存在したが、このような相関は 、リジンについては当てはまらなかった。ＡＫＩＩＩ蛋白質により遊離スレオニ ンもしくはりシンが比較的少ない増加を示したが、形質転換しながった植物と比 較すると、この増加は、種子内における総スレオニンもしくはりシンのレベルを 検出可能な程十分に増加させるものではなかった。
ＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４蛋白質の発現を介しては遊離スレオニンがより大きく増加 するが、形質転換させながった植物からの種子と比較すると、この増加は、種子 内における総スレオニンのレベルを検出可能な程十分に増加せるものであった。
種子の総スレオニン含有量において１６から２５パーセントの増加が観察された 。総スレオニンの増加を示す株は、遊離スレオニンレベルにおける最高の増加、 および、ＡＫＩＩＩ−Ｍ４蛋白質の高発現を示すものと同一であった。
上記の教示は、アミの酸生合成が種子内において行なわれ、がっ、このアミノ酸 合成をアミノ酸生合成用酵素をコード化する外来性遺伝子の発現により調節する ことができるということを示している。その上、それらは、アミノ酸生合成回路 の調節は、例えば、種子と葉のように、ある植物器官と他の植物器官とは顕著に 異なることがあることを示している。この所見の重要性は、下記に記載されてい る、葉および種子内における外来性Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓの発現の異なる効果を考慮 するこであるとを強調している。種子内におけるスレオニン生合成は、ＡＫの最 終産物阻害を介して一次的に調節されていると結論付けることができる。従って 、植物の種子内におけるスレオニン蓄積は、リジン阻害に対して非感受性であり 、かつ、葉緑体内に局在化するＡＫをコード化する、形質転換を介して導入され た、ある遺伝子の発現により増加させることができる。
先の教示は、種子内において導入されたより高レベルの酵素を発現する形質転換 させた植物は、種子内においてより高レベルの遊離スレオニシンを蓄積すること も証明している。さらに、この教示は、種子内においてリジン非感受性ＡＫを発 現する形質転換させた植物は、同じレベルのりシン感受性ＡＫを発現する形質転 換させた植物が行うのと比較すると、種子内においてより高いレベルの遊離スレ オニンを蓄積することを証明している。商業上有用な遊離スレオニンの増加を生 ずるためには、完全なりシン非感受性ＡＫが好ましい。
これらの教示は、種子内における遊離リジンのレベルが、ＡＫの最終産物阻害を 通して、もう一つのアスパラギン酸由来のアミノ酸であるスレオニンの蓄積を調 節することを示している。高レベルの遊離リシン自体を蓄積させる目的で、リジ ン非感受性ＡＫの発現を介してＡＫのりシン阻害を回避させる必要があるものと 思われる。
活性を有する大腸菌Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ酵素の発現は、形質転換させたタバコ植物 の、若葉および成熟している葉の両方において行った（実施例９、表４）。正常 なタバコ植物と比較して５０から１００倍高い高レベルの遊離リジンが葉緑体標 的用シダカルを有する酵素を発現する植物の若葉中に蓄積したが、このような標 的用シグナル無しの場合ではこのようなレベルの蓄積は生じなかった。しかしな がら、遊離リシンのより少ない蓄積（２から８倍）が、より大きい葉において見 られた。篩部におけるリジンを測定する実験により、リジンは、大きい葉から輸 送されることが示唆されている。この輸送されたリシンは、栄養物を輸送するよ りはむしろ受け取ることが知られている小さな成長中の葉におけるリジンの蓄積 に対して貢献しているものと思われる。大腸菌のＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ酵素が種子内 並びに葉内において発現されたとしても、これらの植物の種子内における遊離リ シンレベルには何の影響も及ぼさないことが観察された。
葉緑体標的用シグナルを有する、もしくは、シグナルが無いかの、いずれかの大 腸菌ＤＨＤＰＳ酵素の高レベルの種子特異的発現は、任意の形質転換させた株に おける種子の、総合的もしくは遊離の、リジンもしくはスレオニン（あるいは、 任意の他のアミノ酸）組成に何ら影響を及ぼさなかった（実施例１０、表５）。
これらの結果は、植物酵素と比較してリシン感受性がより低いＤＨＤＰＳ酵素の 種子内における発現は、遊離リジンの産生もしくは蓄積を増大させるに至るほど 十分なものではないことを証明している。
大腸菌のＤＨＤＰＳ酵素を発現する形質転換体からのこれらの教示は、葉内にお けるリジン生合成がＤＨＤＰＳの最終産物阻害を介して一次的に調節されている 一方、種子内においては、その回路内に、少なくとも一つの追加的調節地点が存 在するはずであることを示している。大腸菌のＡＫＩＩＩおよびＡＫ　Ｉ　Ｉ　 Ｉ　−Ｍ４酵素を発現する形質転換体からの教示は、種子内における遊離リシン のレベルが、ＡＫの最終産物阻害を通して、アスパラギン酸由来のアミノ酸全て の蓄積を調節することを示している。ＡＫは、従って、追加的な調節地点である 。
葉および種子における、大腸菌のＤＨＤＰＳとＡＫＩＩＩ−Ｍ４の両方の高レベ ル発現を同時に実行するために、各遺伝子を発現する植物を交雑させることがで き、かつ、両者を発現するハイブリッドを選択することができる。他の方法は、 同じＤＮＡ断片上に存在する両方の遺伝子を含むベクターを作成し、さらに、形 質転換を介して結合させである遺伝子を植物内へ導入することであると思われる 。これが好ましいのは、その後に起こる植物の繁殖という大仕事の間中これらの 遺伝子が結合したままでいるものと思われるためである。同じＤＮＡ断片上に両 方の遺伝子を保持している代表的なベクターを、実施例１１．１２．１６、およ び、１８に記載した。
３５Ｓプロモーターに結合させである大腸菌のＤＨＤＰＳおよびＡＫＩＩＩ−Ｍ ４の両方の遺伝子を保持するベクターで形質転換させたタバコ植物を、実施例１ １において記載しである。ＡＫＩＩＩ−Ｍ４をほとんど発現しない、あるいは、 全く発現しない形質転換体においては、大腸菌のＤＨＤＰＳの発現のレベルが葉 内におけるリシン蓄積のレベルを決定する（実施例１１、表６）。しかしながら 、ＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４および大腸菌のＤＨＤＰＳの両方を発現する形質転換体 内においては、各蛋白質の発現のレベルは、リシン蓄積のレベルを調節する上で の役割を担っている。比較可能なレベルにおいてＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓを発現する形 質転換させた株は、ＡＫＩＩＩ−Ｍ４も発現される場合には、より多くのりシン を蓄積する（表６、株５６４−１８Ａ、５６４−５６Ａ、５６４−３６Ｅ、５６ ４−５５Ｂ、および、５６４−４７Ａを比較せよ）。従って、リジン非感受性Ａ Ｋの発現は、内在性植物酵素と比較して、リシンに対して２０倍感受性が低いＤ ＨＤＰＳ酵素と一緒に発現される場合、葉内におけるリシン蓄積を増大させる。
これらの葉に関する結果は、種子内において別々に大腸菌ＡＫＩＩＩ−Ｍ４及び 大腸菌Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓを発現させることに由来する種子に関する結果と共に考 え合わせると、種子内における大腸菌ＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４及び大腸菌Ｄ　ＨＤ 　Ｐ　Ｓの両方の同時発現は、遊離リシンの蓄積を増加させることにつながり、 かつ、遊離スレオニンの蓄積の増大にもつながるものと思われることを示唆して いる。ファセオリンのプロモーターに結合させである大腸菌のＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ 及びＡＫＩＩＩ−Ｍ４遺伝子の両方を保持するベクターで形質転換させたタバコ 植物が、実施例１２において記載されている。これらの植物内においては、遊離 リジンおよび遊離スレオニンの蓄積が増大している。遊離スレオニンのレベルの 増大は、正常な種子の４倍を越え、ＡＫＩＩＩ−Ｍ４のみを発現する種子内にお いては２０倍を上回っていた。遊離スレオニンの蓄積の減少は、回路の中間生成 物が生合成回路のリシン支流にそれて行っていることを示している。
遊離リジンのレベルの増大は、正常な種子（もしくは、大腸菌のＤＨＤＰＳのみ を発現している種子）の２倍以上であった。しかしながら、種子におけるリシン の増大は、葉において観察される１００倍の増加には匹敵しない。
大腸菌のＤＨＤＰＳ酵素は、植物のＤＨＤＰＳと比較してリジン阻害に対する感 受性がより低いが、それでも依然としてリジンにより阻害される。ＡＫ蛋白質に ついての先の教示は、完全にリジン非感受性である酵素の発現は、植物酵素と比 較して感受性が低くはあるが依然としてリシンにより阻害される酵素の発現と比 較すると、アスパラギン酸回路の最終産物スレオニンの蓄積をより大きくさせる ことができることを示している。従って、種子特異的プロモーターに結合させで あるコリネバクテリウムのＤＨＤＰＳ及びＡｉｌ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４遺伝子の両方を 保持するベクターを、実施例１５及び１９において記載したように作成した。種 子特異的プロモーターに結合させであるコリネバクテリウムのＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ 及びＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４遺伝子の両方を保持するベクターで形質転換させたタ バコ植物は、実施例１５において記載されている。表９において示したように、 これらの植物は、リジン非感受性ＡＫと一緒に大腸菌のＤＨＤＰＳを発現する既 に記載した植物と比較して、種子内におけるより大きな遊離リシンの蓄積を示す ことはなかった。後から考察した所によると、この結果は、種子内におけるリジ ン蓄積は大腸菌のＤＨＤＰＳを阻害するのに十分な程の高いレベルには決して達 しないため、リシン非感受性のコリネバクテリウムＤＨＤＰＳでこの酵素を置換 しても何の影響も及ぼさないという事実により説明することができる。
高レベルの大腸菌のＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４および大腸菌のＤＨＤＰＳもしくはコ リネバクテリウムのＤＨＤＰＳを発現させる形質転換させた株においては、実質 的な量のα−アミノアジピン酸を検出することができた。
この化合物は、穀物の種子中のりシンの異化における中間生成物であると考えら れているが、通常では、その蓄積のレベルが低いがために、放射性トレーサー実 験を介してのみ検出される。遊離アミノ酸のレベルと比較可能な高レベルのこの 中間生成物の発見は、大量のりシンがこれらの形質転換させた株の種子内におい て産生され、かつ、これらは異化回路に入って行っているということを示してい る。α−アミノアジピン酸の形成は、大腸菌ＤＨＤＰＳのみ、もしくは、ＡＫＩ ＩＩ−Ｍ４のみを発現する形質転換体においては観察されなかった。これらの結 果は、種子内において高レベルの遊離リジンを産生ずるためには、両方の酵素を 同時に発現することが必要であることを示している。高レベルの遊離リジンを蓄 積させるためには、リシンの異化を回避させる必要もあるものと思われる。別の 方法では、産生される高レベルのりシンを、例えば、ジー、トリー、もしくは、 オリゴペプチド内へ、あるいは、リジンに富む貯蔵蛋白質内へと取り込むことに よるような破壊に対して非感受性である、ある形態へと変換させることが望まし いと思われる。
植物のリシンケトグルクール酸レダクターゼ遺伝子の単離植物内におけるリジン の異化について入手できる情報は未だにほとんど存在していない。入手できる証 拠により、リジンは、サツカロピン回路を介して異化されるということが示され ている。この回路の存在についての最初の酵素的証拠は、発育途中のトウモロコ ンの種子の未成熟な内（はい）乳におけるリシンケトグルクール酸レダクターゼ （ＬＫＲ）活性の検出であった［Ａｒ　ｒｕｄａ　ｅ−ｔ　ａ　１．　（１９８ ２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　６９：９８８−９８９］、ＬＫＲは、リ シンの異化の第１段階、つまり、コファクターとしてのＮＡＤＰＩ−１を使用し て、サツカロビンへの、Ｌ−リジンとα−ケトゲルタール酸の縮合を触媒する。
ＬＫＲ活性は、内（はい）乳の発達開始時点から急速に増大し、授粉後約２０日 でピークレベルに達し、その後減少する［Ａｒｒｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８３）　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２　：　２６８７−２６８９１゜リジ ンの異化を回避させるためには、ＬＫＲの発現もしくは活性を減少もしくは除去 することが望ましいと思われる。これは、ＬＫＲ遺伝子をクローニングし、Ｌ　 Ｋ　ＲのためのアンチセンスＲＮＡ（Ｅｕｒ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃ、 　Ｎ。
８４１１２６４７．７）を発現させるためにキメラ遺伝子を調製し、さらに、そ のキメラ遺伝子を形質転換を介して植物内に導入することにより実行することが できる。
トウモロコシのＬＫＲ遺伝子をクローン化させる目的で、ＲＮＡを授粉ｉ＆１９ 日目の発育中の種子から単離した。このＲＮＡを、ベクターＬａｍｂｄａ　Ｚａ ｐ　１１におけるｃＤＮＡライブラリーをあつらえで合成してもらうために、Ｃ １ｏｎｔｅｃｈ’　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　（Ｐａｌｏ　Ａ ｌ　ｔｏ、ＣＡ）に送付した。このＬａｍｂｄａ　Ｚａｐ　ＩＩライブラリーの ファゲミドライブラリーへの変換、およびその後の、プラスミドライブラリーへ の変換を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社により供給されたプロトコールに従って実行した 。いったんプラスミドライブラリーへと変換されたら、取得されたアンピシリン 耐性クローンは、そのベクターのｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（−）内にｃＤ ＮＡ挿入断片を保持している。このｃＤＮＡの発現は、ベクター上の１ａｃＺプ ロモーターの調節下にある。
ＬＫＲ遺伝子を保持しているクローンを選択するために、特別に設計した大腸菌 宿主、ＤＥ１２６を、実施例２０において記載したように作製した。ＤＥＬ２６ は、遺伝子型　Ｆ’　１６／ｍａｌＥ５２：　：ＴｎｌＱ、ａｒｇ−１ｉｌｖＡ ２９６、ｔｈｒＡｌｌｏｌ、ｍｅｔＬｌｏｏ、ＩｙｓＣ”、λ−１ｒｐｓＬ９、 ｍａｌＴｌ、ｘｙ＋−７、ｍｔｌ−２、ｔｈｉ−１？、５ｕｐＥ４４？を有して いる。この宿主の生育は、合成用培地中に含まれる２０μｇ／ｍＬのＬ−リシン により阻害される。ＤＥ１２６におけるＬＫＲの発現は、リジン濃度を引き下げ ることにより成長阻害を逆行させるものと期待されている。リシン耐性的な生育 を導くトウモロコシのｃＤＮＡライブラリーからのクローンを選択するためのＤ ＥＬ２６の用途を、実施例２０において記載しである。
このような方法で取得されたトウモロコシのＬＫＲｃＤＮＡを、他の植物種から のＬＫＲ遺伝子を同定および単離するための、ＤＮパハイブリッド形成用プロー ブとして使用することができる。ＬＫＲのためのアンチセンスＲＮＡを発現する ように設計されたキメラ遺伝子は、先に記載した植物プロモーター配列の任意の ものに対して逆の配向性でＬＫＲ遺伝子を結合させることにより作製することが できる。好ましいプロモーターは種子特異的プロモーターである。トウモロコシ については、例えば、１ＱｋＤもしくは２７ｋＤのゼインプロモーターのような 、強力な内（はい）乳特異的プロモーターが好ましいと思われる。
アンチセンスＬＫＲのためのキメラ遺伝子、並びに、リシン非感受性ＡＫ及びＤ ＨＤＰＳを発現する植物を取得する目的で、このアンチセンスＬＫＲ遺伝子を、 リジン非感受性ＡＫおよびＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓをコード化する遺伝子に対して結合 することができ、さらに、３つすべての遺伝子を形質転換を介して植物内に導入 することができる。別の方法では、アンチセンスＬＫＲのためのキメラ遺伝子を 、リシン非感受性ＡＫおよびＤＨＤＰＳを発現するあらかじめ形質転換してあっ た植物内に導入するか、あるいは、このアンチセンスＬ　Ｋ、　Ｒ遺伝子を正常 な植物内に導入することができ、さらに、取得される形質転換体をリジン非感受 性ＡＫおよびＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓを発現する植物と交配させることができる。
多くの植物の細胞培養物および苗木の生育は、高濃度のリシン　プラス　スレオ ニン（もしくは、インビボにおいてメチオニンに変換されるホモセリン）により 阻害される。生育は、メチオニンの添加により復帰する。リシン　プラス　スレ オニンの阻害は、回路を通してフラ・プラスを減少させてメチオニンについての 飢餓状態に導（、内在性ＡＫのフィードバック阻害からの結果生じるものと思わ れている。タノくコにおいては、葉内において２つのＡＫ酵素が存在し、一つは りシン感受性であり、もうひとつはスレオニン感受性である［Ｎａ’ｇｒｕｔｕ ｉ　ｅｔ　ａｍ（１９８４）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　６８ ：１１−２０］。高濃度のりシン　プラス　スレオニンは、タバコの葉盤（１ｅ ａｆ　ｄｉｓｋ）からの支脈の生育を阻害し、さらに、阻害は、低濃度のメチオ ニンの添加により逆行する。従って、成長阻害は、恐らく、２つのＡＫイソ酵素 の阻害に起因するものと思われる。
活性なりシンおよびスレオニン非感受性ＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４の発現も、リジン 　プラス　スレオニンの成長阻害を逆行させる（実施例７、表２）。
発現されるＡＫＩＩＩ−Ｍ４タンパク質のレベルと、リジン　プラススレオニン に対する耐性との間には良好な相関が存在する。リジン感受性の野生型ＡＫＩＩ Ｉの発現は、同様の効果を示さない。ＡＫＩＩＩ−Ｍ４タンパク質の発現は標準 的には阻害条件下における成長を可能にするため、植物内におけるＡＫＩＩＩ− Ｍ４の発現を起こすキメラ遺伝子を、実施例１３および１７において説明されて いるような形質転換体のための選択可能な遺伝子標識として使用することができ る。
実施例 本発明は、以下に記載する実碓例によりさらに明確にされ、その実施例において は、記載がない限り、すべての割合およびパーセンテージは重量によるものであ り、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示して はいるものの、これらは、説明としてのみ与えられていることを了解事項とする 。先の論議およびこれらの実施例により、当該技術分野における当業者は、本発 明の主要な特徴を確認することができ、さらに、その精神および範囲から逸脱す ることなく、本発明の様々な変形物および改変物を作成して、それを、様々な利 用法および条件に適合させることができる。
アーゼ地図が作成され、さらに、配列が決定されている［Ｃａ５ｓａｎｅ　ｔ　 ａ、　］　、　（１，９８６の）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１・１ ０５２−１０５７１゜本発明のために、この１ｙｓｃ遺伝子を、Ｋｏｈａｒａ、 　Ａｋｉｙａｍａ　ａｎｄ　ｌ５ｏｎｏ［Ｋｏｈａｒａｅｔ　ａｌ、（１９８７ ）　Ｃｅ１ｌ　５０：５９５−５０８］により作製されたクローン化した大腸菌 ＤＮＡの３４００の重複セグメントの定序ライブラリーから、バクテリオファー ジのラムダ−クローンを使用して取得した。このライブラリーは、大腸菌の細胞 質全体の物理学的な地図を提供し、さらに、この物理学的地図を、遺伝子地図に 結び付ける。大腸菌の遺伝子地図上の９０分に存在するＩｙｓＣの地図上の位置 ［Ｔｈｅｚｃ　ｃｔ　ａｌ、　（１９７４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１ １７：１３３−１４３］、クローン化させた遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地 図［Ｃａ５ｓａｎ　ｃｔ　ａｌ、　（１９８６）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２６１：１０５２−１０５７］、および、大腸菌ラブラリ−におけるクローン 化させたＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼ地図［Ｋｏｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ 、　（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０：５９５　５０８］の知見から、１ｙｓｃ遺 伝子を保持していることに関するそれらしい候補としてラムダーファーソ４Ｅ５ および７Ａ４［Ｋｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０　 ：　５９５−５０８］を選択することができた。ファージは、記載されティるよ うｌ：［ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｔｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　（１９８７）　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔａｌ、　ｅｄｓ、　Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照せよ］、ＬＥ３９２を 宿主として使用して［Ｓａｍｂｒ。
（＋ｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　 ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌｌＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ、ｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓを参照セヨ］、単一プラークから取 得してきたものを液体培養中で生育させた。ファージＤＮＡを、記載されている ように、フェノール抽出により調製した［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、　ｅｄｓ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋを参照せよ］。
遺伝子の配列から、１８６０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｎｈｅ　Ｉ断片、２１４０ｂｐ のＥｃｏＲ１−Ｘｍｎ　Ｔ　断片、および、１６００ｂらの断片の各々が両方の ファージＤＮＡにおいて検出され、これは、これらが１ｙｓＣ遺伝子を保持して いることを証明している。ＥｃｏＲｌ−Ｎｈｅｌ断片を単離し、さらに、同じ酵 素で消化させたプラスミドｐＢＲ３２２中にサブクローン化させたところ、アン ピシリン耐性で、テトラサイクリン感受性の大腸菌形質転換体が取得された。こ のプラスミドをｐＢＴ４３６と表示した。
クローン化させた１ｙｓｃ遺伝子が機能を有することを確証するために、ｐＢＴ ４３６を、３つの大腸菌ＡＫ遺伝子各々の中に突然変異が含マレテイル大腸菌株 Ｇｉｆ１０６Ｍ１（大腸菌Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔ。
ｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ株ＣＧ５Ｃ−５０４７）内に形質転換させた［Ｔｈｅｚｅ　 ｅｔ　ａｌ、　（１９７４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１１７・１３３−１４．３］。この株はすべてのＡＫ活性が欠損しており、その ため、ジアミノビメール酸（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）（やはり細胞壁 生合成について必須であるリジンとなる前駆体）、スレオニン、および、メチオ ニンを必要とする。形質転換させた株においては、これらすべての栄養上の必要 条件が緩和されており、これは、クローン化された］　ｙｓＣ遺伝子が機能を有 するＡＫＩＩＩをコード化していることを証明している。
生育用培地に対する約０．２ｍＭの濃度のりシン（もしくは、インビボにおいて リソンヘ容易に変換されるンアミノビメール酸）の添加は、ｐＢＴ４３６で形質 転換させたＧｉｆ１０６Ｍの生育を阻害する。ｐＢＴ４３６ブラスミドについて の選択を持続させるために、Ｇｉｆ１０６Ｍ１の生育に必要なアルギニンとイソ ロイシン、および、アンピノリンを補足しであるＭ９倍培地Ｓａｍｂｒｏｏｋ　 ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔ。
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓを参照せよ］を使用した。この阻害は、生育培地への、ス レオニン　プラス　メチオニンの添加により逆行する。
これらの結果は、ＡＫＩＩＩは細胞外から添加されるリシンにより阻害されて、 アスパラギン酸に由来する池のアミノ酸に関しての飢餓状態を生じることを示し ている。Ｐｂｔ４３５６で形質転換させたＧｉｆ１０６Ｍ１のこの特性を利用し て、リシン非感受性のＡＫＩＩＩをコード化する１ｙｓＣ内に存在する突然変異 についての選択を行った。
ｐＢＴ４３６で計質変換させたＧｉｆ１０６Ｍ１の単一なコロニーを広いあげて 、１００μＬの１％リシンと１００μＬのＭ９培地との混合物２００μＬ中に再 懸濁させた。１０’−１０’個の細胞を含む細胞懸濁液すべてを、アルギニン、 イソロイシン、および、アンピシリンを補足しであるＭ９培地を含むペトリ皿上 に広げた。このようにして１６枚のベトリ皿を調製した。■から２０個のコロニ ーが１６枚のベトリ皿の内の１１枚において出現した。ひとつもしくは２つ（可 能であれば）のコロニーを拾いあげ、リシン耐性について再テストを行い、この テストから、９個のりシン耐性クローンが取得された。プラスミドＤＮＡをこれ らのうちの８個のものから調製し、Ｇｉｆ１０６Ｍｌ内へ再形質転換させて、リ ジン耐性がプラスミドに起因するものかどうかを決定した。８個のプラスミドＤ ＮＡの内６個がリジン耐性コロニーを生じた。これらの６つのものの内の３個が 、１５ｍＭのりシンにより阻害されないＡＫＩＩＩをコード化するＩｙｓＣ遺伝 子を保持している一方、野生型のＡＫＩＴＩは、０．３−０．４ｍＭのりシンに より５０％が、さらに、１ｍＭのリシンにより〉９０％が阻害された（詳細につ いては、実施例２を参照せよ）。
リジン耐性についての分子的基盤を決定するために、野生型の＋ｙΣｐおよび３ つの突然変異体遺伝子の配列を決定した。ｒＵｓｉｎｇｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ　ｐ ｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ｓｃｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｄｏｕｂｌｅ　５ｔｒ ａｎｄｅｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（商標）（ ソークエナーゼ（商標）での２重鎮を形成している鋳型の配列を決定するための ミニ調製プラスミドＤＮＡを使用するＪ　［Ｋｒａｆｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８８）　Ｂｉ。
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：５４４−５４５］　ことに関する方法を使用した。
発表されているＩｙｓＣ遺伝子に基づき、かつ、約２００ｂｐごとに間隔が空け られているオリゴヌクレオチドブライマーを合成して、配列決定を容易にした。
ｐＢＴ４３６　（配列番号１）内にクローン化されている野生型１ｙｓＣ遺伝子 は、コーディング領域における５つの位置が発表されているＩｙｓＣ配列と異な りでいた。ヌクレオチドにおけるこれらの差異の内の４つは、コドンの３番目の 位置におけるものであり、結果としてはＡＫＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列に おける変化を生じないものと思われる。これらの差異の内の一つは、結果として ＡＫＩＩＩのアミノ酸５８における、ンステインのグリシンへの置換を生じるも のと思われる。これらの差異は、恐らく、１ｙｓｃが、クローン化されてきた異 なる株に起因するものと思われる。
リシン非感受性ＡＫをコード化する３つの突然変異体の１ｙｓｃ遺伝子の配列は 、各々、単一のヌクレオチドが野生型配列とは異なっており、結果としては、そ のたん白質内における単一のアミノ酸置換を生じている。突然変異体Ｍ２は、配 列番号１のヌクレオチド９５４において、Ｇに代わって置換されている八を有し ており、結果としては、アミノ酸３１８における、メチオニンに代わるイソロイ シンの置換を生じ、さらに、突然変異体Ｍ３およびＭ４は、配列番号１のヌクレ オチド１０５５において、Ｃに代わるＴの同義の置換を有しており、結果として 、アミノ酸３５２におけるスレオニンに代わるイソロイシンの置換を生じていた 。
従って、これらの単一アミノ酸置換の内のいずれかが、リジン阻害に対して非感 受性であるＡＫＩＩＩ酵素を付与す−るに足りるものである。
実施例２ 大腸菌における野生型および突然変異体の１ｙｓｃ遺伝子の高レベル発現 Ｎｃｏ　Ｉ　（ＣＣＡＴＧＧ）部位を、以下に示すオリゴヌクレオチドを使用し て、ＩｙｓＣ遺伝子の翻訳開始コドンにおいて挿入した。
配列番号２ 配列番号３ ＧＴＡＣＣＧＣＣＡＡ　ＡＴＴＴＧＧＡＧ八Ｃ入ＡＣ入へＴＴＴＣＪ　ＧＣＣλ ＴＧアニーリングの際、これらのオリゴヌクレオチドは、ＢａｍＨＩおよびＡｓ ｐ７１８の「くっつきやすい」末端を有している。プラスミドｐＢＴ４３６を、 ’］ｙｓＣのコーディング配列の上流で切断するＢａｍＨＩ、および、開始コド ンの３１ヌクレオチド下流で切断するＡｓｐ７１８で消化させた。アニーリング させたオリゴヌクレオチドをプラスミドベクターに結合させて大腸菌の形質転換 体を取得した。プラスミドＤＮＡを調製し、さらに、Ｎｃｏ　１部位の存在に基 づいて、そのオリゴヌクレオチドの挿入についてのスクリーニングを行った。そ の部位を含むプラスミドの配列を決定して、その挿入が正しいものであることを 確認し、そのプラスミドをｐＢ７４５７と表示した。ＩｙｓＣの開始コドンにお いてＮｃｏ　１部位を作成することに加え、このオリゴヌクレオチドの挿入によ り、セリンをコードするＴＣＴから、アラニンをコードスルＯＣＴへと第２コド ンが変化した。このアミノ酸置換は、ＡＫＩＩ■酵素活性においては明らかな影 響を及ぼさない。
大腸菌内にオける±ｙｓＣ遺伝子の高レベル発現を実行するために、細菌性発現 ベクターｐＢＴ４３０を使用した。このベクターは、バクテリオファージＴ７　 ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７　プロモーター系を利用するｐＥＴ−３ａ　［Ｒｏｓ ｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）Ｇｎｅｎ　５６　：１２５−１３５ １の誘導体である。プラスミドｐＢＴ３４０は、最初にｐＥＴ−３ａにおけるＥ ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を、そのもともとの位置において破壊するこ とにより作製した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ　Ｉ１１部位を含むオリゴヌクレ オチドアダプターを、ｐＥＴ−３ａのＢａｍＨ１部位に挿入した。これにより、 発現ベクター内への遺伝子の挿入のための追加的な非反復なりローニング部位を 有するｐＥＴ−３μＭを作製した。その後、翻訳開始の位置にあるＮｄｅ　１部 位を１、オリゴヌクレオチド特異的突然変異を使用してＮｃｏ　Ｔ部位へと変換 させた。この領域におけるｐＥＴ−３μＭのＤＮＡ配列、つまり５’−ＣＡＴＡ ＴＧＧを、ｐＢＴ４３０にしてプラスミドｐＢＴ４５７の外に切り出し、さらに 、同じ酵素で消化させた発現ベクターｐＢＴ４３０内へ挿入させ、プラスミドｐ ＢＴ４６１を作り出した。この突然変異体の］ｙｓＣ遺伝子（Ｍ２、Ｍ３、およ び、Ｍ４）の発現のために、ｐ　ＢＴ４６１を、翻訳開始コドンの下流の約３０ ヌクレオチドから野生型の１ｙｓｃ遺伝子を除去するＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩで消 化させ、さらに、突然変異体の遺伝子からの疑似的なＫｐｎ　Ｔ−ＥｃｏＲＩ断 片を挿入して、プラスミドｐＢＴ４９０、ｐＢＴ４９１、および、ｐＢＴ４９２ をそれぞれ産生した。
高レベル発現のために、それらのプラスミドの各々を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ ３）［５ｔｕｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　Ｊ。
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９：１１３−１３０コ内に形質転換させた。培養物 を、２５°Ｃにおいて、アンピリジン（１００μｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地内で生 育させた。６００ｎｍにおける光学濃度が約１である時点で、ＩＰＴＧ（イソプ ロピルチオ−β−ガラクトシド、インデューサー）を、最終濃度が０．４ｍＭと なるように添加し、さらに、インキュベーションを、２５°Ｃにおいて３時間継 続させた。細胞を遠心法により回収し、５０ｍＭのＮａＣ１；５０ｍＭのトリス −ＨＣｌ、ｐＨ７，５；１ｍＭのＥＤＴＡ内に、もともとの培養量の１／２０倍 （もしくは１／１００倍）で再懸濁させ、−２０℃において凍結させた。１ｍＬ の凍結分注を３７°Ｃにおいて解凍させ、氷水槽内で超音波処理にかけて細胞を 融解させた。溶菌液を、４℃において５分間、１５，００Ｑｒｐｍで遠心処理し た。上清を除去して、ベレットを、１ｍＬの先の緩衝液内に再懸濁させた。
誘導をかけなかった、あるいは、ＩＰＴＧで誘導をかけた、ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ｐＢＴ４６１の培養物の、上清およびベレット分画を、ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分析した。誘導をかけた培養物の上清中に含まれる、ク ーマシーブルー染色により可視化される主要たん白質の分子量は約４８ｋｄであ り、これは、ＡＫＩＩＩについて予測されるサイズであった。約８０％のＡＫＩ ＩＩたん白質が上清中に存在し、かつ、ＡＫＴＩＩは、抽出物中により含まれる 大腸菌の総たん白質の１０−２０％を占めていた。
ＡＫ活性は、下記に示すようにしてアッセイした。
アッセイ用混合物（１２本のアッセイ用試験官用）：４．５ｍＬのＨ２Ｏ １、Ｑｍ、Ｌの８Ｍ　ＫＯＨ １，０ｍＬの８　Ｍ　Ｎ　８２０　Ｈ−ＨＣ１１，０ｍＬのＬＭ　ｌ−リ、Ｚ、 −ＨＣｌ　Ｉ）Ｈ８，００，５ｍＬの０．２Ｍ　ＡＴＰ　（０，２ＭのＮａＯＨ 中に含まれる１２１、ｍｇ／ｍ１） ５０μＬのＩ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４ １，５ｍＬのエツペンドルフ　アッセイ用試験管は、各々下記のものを含む。
０．６４ｍＬのアッセイ用混合液 ０．０４ｍＬの０．２ＭＬ−アスパラギン酸もしくは０．０４ｍＬの■］２０ ０．０００５−０．１２ｍＬの抽出物 ０．８ｍＬの体積にするのに必要なＨ２０アッセイ用試験管を、３０℃において 希望する時間（１０−６０分）の間インキュベートした。その後、Ｑ、４−ｍｌ のＦｅＣｌ３試薬（１０％　Ｗ／Ｖ　ＦｅＣｌ３．３３％トリ塩化酢酸、Ｑ、’ 　７Ｍ　ＨＣＩ）を添加し、その物質を、エンペンドルフ遠心機内で２分間遠心 させた。
上清はデカンテーションにより除去した。ＯＤを５４０ｎｍで測定し、アスパラ ギン酸ヒドロキサム酸標準物と比較した。
約８０％のＡＫＩＩＩ活性が上清分画内に存在した。野生型および突然変異体の 未処理抽出物の特異活性は、ミリグラム総たん白質当たりの針当たり、５−７μ モルであった。野生型のＡＫＩＩＩは、このアッセイにおいてはＬ−リジンの存 在に対して感受性を示した。５０パーセント阻害が約０．４ｍＭの濃度において 観察され、かつ、９０パーセント阻害が約１．ＱｍＭにおいて観察された。これ とは対照的に、突然変異体ＡＫＩＩＩ−Ｍ２、Ｍ３、および、Ｍ４（実施例１を 参照せよ）は、１５ｍＭのし一リジンによっても全く阻害されなかった。
野生型のＡＫＩＩＩたん白質を、以下に示すように、Ｉ　ＰＴＧで誘導させた培 養物の上清から精製した。１ｍＬの抽出物に対して、０，２５ｍＬの１０％硫化 ストレプトマイシンを添加し、さらに、４℃下において一晩放置した。この混合 物を、４℃下において、１５分間、１５．００Ｏｒｐｍで遠心処理した。上清を 回収し、セファデックスＧ−２５Ｍカラム（Ｃｏｌｕｍｎ　ＰＤ−１０、Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ社）を使用して脱塩化させた。その後、これをＭｏｎｏ−Ｑ　ＨＰ ＬＣカラムにかけ、０−ＩＭのＮａＣｌ濃度こう配液で溶出させた。大部分のＡ ＫＩＴＩ活性を含む２本の１ｍＬ分画をひとまとめにし、濃縮、脱塩を行い、さ らに、ＨＰＣＬサイズ測定用カラム（ＴＳＫ　Ｇ３００ＳＷ）にかけた。分画を 、２０ｍＭのＫＰＯ４緩衝液、ｐＨ７，２，２ｍＭのＭｇＳＯ４，１０ｍＭのβ −メルカプトエタノール、０．１５ＭのＫＣＩ、０゜５ｍＭのし一すシン中で溶 出させたところ、これらの分画は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ り〉９５％純粋であることが見いだされた。精製されたＡＫＩＩＩたん白質を、 Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ（３１０Ｓｗａｍｐｒ ｉｄｇｅ　Ｒ。
ａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ　１７５１７）に送付して、このたん白質に対するウ サギ抗体を作製してもらった。
実施例３ 大腸菌およびコリネバクテリウム　ダルタミクムのｄａｐ遺伝子の単離大腸菌の ｄａｐＡ遺伝子（ｅｃｏｄａｐＡ）が既にクローン化され、制限エンドヌクレア ーゼ地図が作成され、さらに、配列が決定されている［Ｒｉｃｈａｕｄ　ｅｔ　 ａｌ、（１９８６）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７） 　Ｃｅ１ｌ　５０：５９５−６０８、実施例１を参照せよコにより作製された、 クローン化された大腸菌ＤＮＡの３４００の重複セグメントの定序ライブラリー から、バクテリオファージ　ラムダ−クローンを使用して取得した。大腸菌の遺 伝子地図上の５３分のところにあるｄａｐＡの地図上の位置［Ｂａｃｊ。
ａｍ　（１９８３）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４７：１８０−２３０ ３　、クローン化させた遺伝子の制限エンドヌクレーアーゼ地図［Ｒｉｃｈａｕ ｄ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６６：２９ ７−３００］、および、大腸菌ライブラリー内に含まれるクローン化させたＤＮ Ａ断片の制限エンドヌクレアーゼ地図［Ｋｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８ ７）　Ｃｅ１ｌ　５０：５９５−６０８３の知識から、ラムダ−ファージ４Ｃ１ １及び５Ａ８　［Ｋ。
ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５０：５９５−５０８］を 、ｄａｐＡ遺伝子を保持することに関するそれらしい候補として選択することが できた。これらのファージを、記載されているように［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。
１ｏｇｙ（１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ’　ａｌ、　ｅｄｓ、、Ｊｏｌｌｎ 　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照ノコト］、ＬＥ３９２を 宿主として使用して［Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８９）　Ｍｏ１ｒｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂ。
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓを参照ノコと］　、単一フー７−’ｙカら取得したも のを液体培養物中で生育させた。ファージＤＮＡは、記載されているように［Ｃ ｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ １９８７）　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　ｄｅｓ、、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ ｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと］、フェノール抽出により調 整した。ｄａｐＡ遺伝子に関しては、約２．８ｋｂｏ）Ｐａｔ　Ｉ　ＤＮＡ断片 を含む両方のファージが期待された［Ｒｉｃｈａｕｄ　ｅｔ、ａｌ、　（１９８ ６）　Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６６：２９７−３００１゜この断片をファージ５Ａ８ の消化物から単離し、Ｐｓｔ　Ｉで消化させたベクターｐＢＲ３２２内に挿入し て、プラスミドｐＢＴ４２７を取得シた。
コリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子（ｃｏｒｄａｐＡ）を、ポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）を使用して、ＡＴＣＣ株１３０３２がらのゲノムＤＮＡから単離 した。コリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列が発表されてい る［Ｂｏｎｎａｓｓｉｅ　ｅｔ　ａｌ（１９９Ｑ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１３°６４２１］。この配列から、その遺伝子を含んでいるＤＮ Ａ断片の増幅、および、それと同時に、開始コドン（Ｎｃｏ　Ｉ）の位置および 停止コドン（ＥｃｏＲＩ）をちょうど越えた場所において非反復の制限エンドヌ クレアーゼ部位を添加することを可能にするーＰＣＲのためのオリゴヌクレオチ ドブライマーを設計することが可能であった。使用したオリゴヌクレオチドブラ イマーは、以下に示すものであった。
配列番号４゜ ＣにＧＧＧＣＣＡＴ　ＧＧＣＴＡＣ入ＧＧＴ　ＴＴＡＡＣＡＧＣＴ八　ＡＧ八へ ＣＧＧＡＧＴ　へＧへＧＣＡＣＴ配列番号５・ ＧＡＴＡＴＣＧｉ−Ｊ、Ｔ　ＴＣＴＣＡＴＴＡＴＡ　ＧｕＣＴＣＣＡＳＣＴＴＴ ＴＴＴＣＰＣＲは、販売社の説明書に従い、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔ ｕｓキットを使用して、同会社により製造されたサーモサイクラ−上で行った。
この反応産物は、アガロースゲルにかけ、さらに、臭化エチジウムで染色した際 、コリネバクテリウムのｄａｐＡ遺伝子について予期されるサイズである約９０ ０ｂｐの強力なりＮＡバンドを示した。ＰＣＲで作製した断片を、制限酵素Ｎｃ ｏＲＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、さらに、同じ酵素で消化させた発現ベクター ｐＢＴ４３０　（実施例２を参照のこと）内に挿入した。翻訳開始コドンにおけ るＮｃｏ　Ｉ部位の導入に加え、このＰＣＲプライマーは、結果的に、セリンを コードするＡＧＣからアラニンをコードするＧＣＴへの第２コドンの変化も生じ ていた。活性を有するリジン非感受性ＤＨＤＰＳ　（実施例４を参照のこと）を 発現する数種のクローンが単離され、このことにより、第２コドンのアミノ酸置 換は活性に影響を与えないことが示され、この一つのクローンを、ＦＳ７６６と 表示した。
ＰＣＲにより作製したコリネバクテリウムｄａｐＡ遺伝子を、Ｐｒ。
ｍｅｇａ社からのファゲミドベクターｐＧＥＭ−９２ｆ　（−）内にサブクロー ン化させ、一本鎖ＤＮＡを調製し、その配列を決定した。この配列を配列番号６ に示した。既に記載した第２コドンにおける差異を除くと、この配列は、２つの 位置、つまりヌクレオチド７９８および７９９におけるものを除いて、発表され ている配列と適合した。発表されている配列においてはこれらはＴＣであるが、 配列番号６において示されている遺伝子においてはこれらはＣＴになっている。
この変化の結果、セリンの変わりにロイシンになっているアミノ酸置換が生じた 。この差異に関する理由は明らかにされていない。これは恐らく、発表されてい る配列における過ち、遺伝子の単離に使用された株における差異、もしくは、Ｐ ＣＲにより生じた過ちに起因するものと思われる。同じ変化が、考えられない。
この差異は、ＤＨＤＰＳ活性においては明らかな影響を及ぼさない（実施例４を 参照のこと）。
一つのＮｃｏ　Ｔ　（ＣＣＡＴＧＧ）部位を、オリゴヌクレオチド特異的突然変 異を使用して、大腸菌のｃｌａｐＡ遺伝子内の翻訳開始コドンに挿入した。プラ スミドｐＢＴ４２７　（実施例３を参照せよ）内に存在する、ｄａｐＡ遺伝子を 保持するｐＡ２．８ｋｂのＰＳｔ　Ｉ　ＤＮＡ断片を、７７ゲミドベクターｐＴ Ｚ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＰｓｔ　１部位内に挿入して、ｐＢ７４３ １を取得した。このｄａｐＡ遺伝子の配向性は、コーディング鎖が一本鎖のファ ゲミドＤＮＡ上に存在するようになっていた。オリゴヌクレオチド特異的突然変 異は、Ｂｉ。
−Ｒａｄ社からのＭｕｔａ−Ｇｎｅｎキットを使用して、製造業者のプロトコー ルに従い、下記に示した突然変異原性のプライマーを用いて行った。
配列番号７： ＣＴＴＣＣＣＧＴＧＡ　ＣＣＡＴＧＧＧＣＣ入ＴＣ仮定的突然入具Ｃ仮定的突然 変異体部位の存在に関してスクリーニングにかけたところ、ＤＮＡ配列決定によ り、ｐＢＴ４３７と表示されるプラスミドが突然変異の近傍内において適切な配 列を有していることが示された。翻訳開始コドンにおけるＮｃｏ　１部位の添加 は、結果として、フェニルアラニンをコードするＴＴＣからバリンをコードする ＧＴＣへ換える変化も生じた。
大腸菌内におけるｄａｐＡ遺伝子の高レベル発現を行うために、細菌性の発現ベ クターｐＢＴ４３０　（実施例２を参照のこと）を使用した。
大腸菌のｄａｐＡ遺伝子を１１５０ｂｐのＮｃｏ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ断片と してプラスミドｐＢＴ４３７の外に切り出し、同じ酵素で消化させた発現ベクタ ーｐＢＴ４３０内に挿入して、プラスミドｐＢＴ４４２を取得した。コリネバク テリウムのｄａｐＡ遺伝子の発現のために、ｐＢＴ４３０　（ｐＦＳ７６６、実 施例３を参照のこと）内に挿入した配列番号６のＮｃｏ　ＩからＥｃｏＲＩまて の９１０ｂｐの断片を使用しｌこ。
高レベル発現のために、各プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）［５ｔｕ ｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８’６）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９ ：１１３−１３０］内に形質転換させた。培養物を、２５°Ｃにおいて、アンピ リジン（１，００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地中で生育さた。６００ｎｍでの光学 濃度が約１になった時点で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトンド、 インデューサー）を最終濃度が０゜４ｍＭになるように添加し、さらに、インキ ュベーションを、２５°Ｃにおいて３時間継続させた。細胞を遠心処理により回 収し、５０ｍＭのＮａｃＩ、５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７，５，１ｍＭｃ ）ＥＤＴＡ中に、最初の体積の１／２０倍（もしくは１／１００倍）で再懸濁さ せ、さらに、−２０℃において凍結させた。凍結させた１ｍＬの分注を３７０Ｃ で解凍し、氷水浴槽中で超音波処理にかけて細胞を溶菌させた。この溶菌液を、 ４℃下において５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心処理した。
上清を除去し、ベレットを１ｍｌの先の緩衝液中に再懸濁させた。
誘導をかけていない、およびＩ　ＰＴＧで誘導をかけた、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ ｐＢＴ４４２もしくはＢＬ２１　（ＤＥ３）／ｐＦＳ７６６の培養物の、上清お よびベレット分画を、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
誘導をかけた両方の培養物の上清およびベレット分画中に含まれる、クーマシー ブルーにより可視化される主要たん白質は、Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓにつして予測され るサイズである３２−３４ｋｄの分子量を有していた。誘導をかけていない培養 物中においてさえも、このたん白質は産生された最も優勢なたん白質であった。
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ４４２　ＩＰＴＧで誘導をかけた培養物中において は、約８０％のＤＨＤＰＳたん白質が上清中に存在し、さらに、ＤＨＤＰＳは、 抽出物中に含まれる総たん白質の１０−２０％を占めていた。Ｉ　ＰＴＧで誘導 をかけたＢＬ２１　（ＤＥ３）／ｐＦＳ７６６の培養物においては、５０％を上 回るＤＨＤＰＳたん白質がベレット分画中に存在していた。両方の事例における ペレット分画は９０−９５％純粋なり　ＨＤ　Ｐ　Ｓであり、顕著な量で存在す る他の単一たん白質は存在しなかった。従って、これらの分画は、抗体の作製に おける用途のために十分に純粋であった。大腸菌のＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓもしくはコ リネバクテリウムのＤ　ＨＤ　Ｐ　Ａのいずれかの２−４ミリグラムを含むペレ ット分画を、５０ｍＭのＮａＣ１，５ＱｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのンチオスレイトール、０２％のＳＤＳ中に可溶化 させ、さらに、Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ（３１ ０Ｓｗａｍｐｒｉｄｇｅ　ＲｏａｄＳＤｅｎｖｅｒ。
ＰＡ　１７５１７）に送付して、そのたん白質により対する抗体を作製してもら った。ＤＨＤＰＳ酵素活性を、以下に記載するようにアッセイした。アッセイ用 混合物（ＩＯＸｌ、ＯｍＬのアッセイ用試験管用、もしくは、４０Ｘ０．２５ｍ Ｌのマイクロタイターディツシュ用）は、使用する直前に新鮮なものを作成した 。
２．５ｍＬのＩ］２０ ０．５ｍＬの１．、、ＯＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，００，５ｍＬの０．ＩＭ 　ピルビン酸ＮａＱ、５ｍＬの０−アミノベンズアルデヒド（エタノール中に含 まれる１０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌ　） １、ＯＮのＨＣｌ中に含まれる２５μＬの］、、ＯＭ　ＤＬ−アスパラギン酸− β−セミアルデヒド（Ａ　Ｓ　Ａ）アッセイ（１，０ｍＭ）：　フィクロアッセ イ（０，２５ｍＬ）ＤＨＤＰＳアッセイミックス　０．４ｍＬ　０．１０ｍＬ酵 素抽出物＋ｌＩ２０・　０．１０ｍＬ　、　０２５ｍＬ１０ｍＭ　Ｌ−リシン　 ５μＬもしくは２ｈＬ　１μＬもしくは５μＬ（希望時間３０°Ｃでインキュベ ートせよ。次のものを添加して反応を停止させよ。） １、　ＯＮ　ＨＣｌ、　０．５０ｍＬ　０．１２５ｍＬ３０−６０分間色を浮き 出させる。沈殿物を、エッベンドルフ遠心機内で回転処理させて沈殿させる。０ 分に対するＯＤ、４゜をブランク値として計測する。マイクロアッセイのために は、０．２ｍＬの分注をマイクロタイターウェル内に入れ、ＯＤ、３゜での計測 を行う。
誘導をかけた抽出物の上清分画中に含まれる大腸菌のＤＨＤＰＳの特異活性は、 １．ＯｍＬのアッセイにおいては、ミリグランムたん白質当たりの分当たり約５ ０　０ＤＳ４゜単位であった。大腸菌のＤＨＤＰＳは、コノアッセイにおいては 、Ｌ−リシンのＤＨＤＰＳ存在に対して感受性を示した。５０パーセント阻害が 約Ｑ、５ｍＭのＤＨＤＰＳ濃度において見いだされた。コリネバクテリウムのＤ ＨＤＰＳについては、この活性が、誘導をかけた抽出物よりはむしろ、誘導をか けなかった抽出物の上清分画中において測定された。酵素活性は、０．２５ｍＬ のＤＨＤ　ＰＳのアッセイ中において、ミリグラムたん白質当たりの分当たり約 ４０Ｄ、３゜単位であった。大腸菌のＤＨＤＰＳとは対比的に、コリネバクテリ ウムのＤＨＤＰＳは、７０ｍＭという濃度においてさえもＬ−リジンによっては 全く阻害されなかった。
実施例５ 高レベルのＤＨＤＰＳおよび／又はＡＫｒＴＩを発現する大腸菌によるアミノ酸 の排出 Ｔ７　ＲＮＡのポリメラーゼプロモーターに結合させである大腸菌のｄａｐＡ遺 伝子を有する大腸菌の発現カセットを、ｐＢＴ４４２　（実施例４を参照せよ） を、Ｂｇｌ　ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化させることにより単離し、その消化産 物をアガロースゲル電気泳動を介して分離させ、さらに、そのゲルから約１２５ ０８Ｐの断片を溶出させた。この遺伝子を含む）のＢａｍＨ１部位に挿入した。
両方の転写が同じ方向において行われると思われる挿入断片を、制限エンドヌク レアーゼ分析により同定し、プラスミドｐＢＴ５１７　（Ｔ７／ｄａｐＡ＋Ｔ７ ／±ヱ匹−Ｍ４）およびｐＢＴ５１９　（Ｔ７／ｄａｐＡ＋Ｔ７／１ｙｓｃ）を 取得した。
大腸菌を誘導させてアミノ酸を産生および排出させる目的で、これらのプラスミ ド、並びに、プラスミドｐＢＴ４４２、ｐ　Ｂｒ３６１、および、ｐＢＴ４９２ （および、対照としてのｐＢＲ３２２）を、大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）内に 形質転換させた［５ｔｕｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８６）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８９：１１３−１３０］。これら のプラスミドすべて、特にｐＢＴ５１７およびｐＢＴ５１９は、この宿主株内に おいては幾分不安定であり、生育中にアンピッリン耐性のための選択を行うにあ たり注意深く管理を行う必要がある。
すべての株を、アンピシリンを補足した最小限度の塩のＭ９培地［Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓを参照せよ］内において生育させて、３７° Ｃにおいて一晩かけてプラスミドについての選択を持続させた。培養物は、それ らの。Ｄ６゜０が１に達した時点で回収した。細胞を遠心処理によって取り除き 、上清（３ｍＬ）を０．２ミクロンのフィルターに通して残存している細胞およ び大きな分子を除去した。この上清分画の５マイクロリツトルの分注を、カラム 分離後のニンヒドリン検出を利用するＢｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　６３００ア ミノ酸分析機でアミノ酸組成を分析した。結果を表１に示した。
！−１ （細胞培養上清中のアミノ酸ｍ暇）〔昭に″足堡　ニー　比−−カ己　Ｌ−− ｐＢＲ３２２００００，０５０，１００ｐＢ７４４２　０．＜８　０　０　０． ０＜　０．０６　０　０ｐＢＴ４６１　０．１４　０．０５　０　０．０２　０ ．０３　０　０ｐＢ了４９２　０．１６　０．０７　０　０．０２　０．０：ｌ 　０　０ｐＢＴｓ１７０．１８００．０ユＯＯＯ，０２０，０２０］丁５１９　 ０．ユ４　０　０．０１　０　０　０．０１　０ｐＢＲ３２２の対照を除くすべ てのプラスミドは、培養培地中にリジンの排出を行うに至った。］ｙｓＣもしく はｌｙｓｃ−Ｍ４遺伝子の発現により、リジンとスレオニンの両方の排出が生じ た。］ｙｓＣ−Ｍ４十ｄ　ａ　ｐＡの発現により、リジン、メチオニン、アスパ ラギン酸、および、グルタミン酸の排出が生じたが、スレオニンの排出は生じな かった。
それに加え、アラニンとバリン排出は、この培養土消中に検出されながった。同 様な結果が、グルタミン酸が抽出されなかった点を除き、１ｙｓＣ＋ｄａｐＡに 関して得られている。
実施例６ 使用した。葉の発現カセット（図１ａ）は、カリフラワー　モザイクウィルスの ３５Ｓ　プロモーター［０ｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒ ｅ　３１３：８１０−８１２１、葉緑体のａ　／　ｂ　結合性たん白質（Ｃａｂ ）遺伝子からの翻訳リーダー［Ｄｕｎｓｍｕｉｒ（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１３：２５０３−２５１８］　、および、ノパリシシン ターゼ（Ｎｏｓ）遺伝子からの３°翻訳停止領域［Ｄｅｐ　ｉ　ｃｋｅ　ｒ　ｅ 　ｔ　ａ　＋、　（１９８２）Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１：５６ １−５７０］からできている。５′領域と３°領域との間は、制限酵素部位Ｎｃ ｏ　１（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）　、ＥｃｏＲＩ、Ｓｍａ　Ｉ、および、 Ｋｐｎ　Ｉである。カセットすべてをＳａｌ　Ｉ部位でその両脇を挾みこんだが 、このカセットの上流にも一つのＢａｍＨ１部位が存在する。
種子特異的発現カセット（図１ｂ）は、マメのファセオルス　ブルガリス（Ｐｈ ａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの種子貯蔵たん白質ファセオリンのβ サブユニットをコード化する遺伝子に由来するプロモーターおよび転写ターミネ ータ−からできている［Ｄｏｙｌｅ　ｅｔａｌ、　（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：９２２８−９２３８］。このファセオリンカセット は、翻訳開始コドンがら上流側（５°）にある約５００ヌクレオチド、および、 ファセオリンの翻訳停止コドンから下流側（３゛）にある約１６５０ヌクレオチ ドを含んでいる。この５′領域と３“領域との間は、非反復な制限エンドヌクレ アーゼ部位Ｎｃｏ　Ｉ　（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）、Ｓｍａｌ、Ｋｐｎ　 Ｉ、および、Ｘｂａ　Ｉである。このカセット全体の両脇を、Ｈ４ｎｄ　ＩＩＩ 部位で挟み込んである。
第２の種子発現カセットをｃｏｒｄａｐＡ遺伝子のために使用した。
これは、ダイスのクニック　トリプシンインヒビター３（ＫＴＩ３）遺伝子［Ｊ ｏｆｕｋｕ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１　１　：　４ ２７−４．３５１からのプロモーターおよび翻訳ターミネータ−からできている 。ＫＴＩ３カセットは、翻訳開始コドンがら上流側（５°）にある約２０００ヌ クレオチド、および、ファセオリンの翻訳停止コドンから下流側（３′）にある 約２４０ヌクレオチドを含む。この５゛領域と３′領域との間は、非反復な制限 エンドヌクレアーゼ部位Ｎｃｏ　Ｉ　（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）、Ｘｂａ 　１ＳＫｐｎ　Ｌおよび、Ｓｍａ　Ｉである。このカセット全体の両脇を、Ｂａ ｍＨ１部位で挾み込んである。
トウモロコンのタメの構造性発現カセットを、ＩｙｓＣ−Ｍ４遺伝子およびｅｃ ｏｄａｐＡ遺伝子の発現のために使用した。これは２つのトウモロコシプロモー ターの断片に由来するキメラプロモーターからできており、これを、インビトロ における部位特異的突然変異誘発により改変させて、高レベルの構成的プロモー ター、および、トウモロコシ遺伝子の未知の断片からの３゛領域を生じた。この ５°領域と３°領域との間は、非反復な制限エンドヌクレアーゼ部位Ｎｃｏ　Ｉ 　（ＡＴＧ翻訳開始コドンを含む）、Ｓｍａ　■、および、Ｂｇｌ　ＩＩである 。トゥモロコシの構成的発現カセットのヌクレオチド配列を、配列番号１６にお いて示した。
植物のアミノ酸生合成酵素は葉緑体内において局在化することが知られており、 このため、葉緑体標的用シグナルをつけた状態で合成される。
ＤＨＤＰＳおよびＡＫＩＩＩのような細菌性たん白質は、このようなシグナルを 有していない。そのため、幾つかのキメラ遺伝子内においては、せた。使用した ｃｔｓは、ダイズからのリボース　１．５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小さ いサブユニットのｃｔｓを基にしたものである［Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、Ｍｏｌ。
Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　１：４８３−４９８１．配列番号８−１１のオリゴ ヌクレオチドは、下記に示したように合成および使用した。
トウモロコシについては、使用したｃｔｓは、トウモロコシがらのリボース　１ ，５−ビスリン酸カルボキンラーゼの小さいサブユニットのＣｔｓを基にしたも のであり［Ｌｅｂｒｕｎ　ｅ　ｔ　ａ　１．　（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：４３６０］、これを、ダイズのｃｔｓと区別するた めにｍｃｔｓと表示する。配列番号１７−２２のｃｔｓオリゴヌクレオチドは、 下記に記載したように合成し、使用した。
１４のキメラ遺伝子を作製した。
Ｌ且且／Ｎｏｓ　３’ リン　３′領域 番号５）　ファセオリン　５゛領域／ｃ　ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／７ ｙセオリン　３゛領域 番号７）　３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃｔｓ／ｅセオリン 　３′領域 番号９）　ファセオリン　５゛領域／ｃ　ｔ　ｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／ファセオリ ン　３“領域 番号１０）　３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔｓ／Ｉ３３゛領域 番号１３）　Ｉ（Ｉ−Ｔ５３４　５’領域／ｍｃ　ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ− Ｍ４／ＨＨ２−１３°領域 ■旧４２−１　３’　領域 完全なＩ　ｙｓＣコーディング領域　プラス　約９０ｂｐの３′非コ一プイン配 列を含む、１４４０ｂｐのＮｃｏｌ−ＨｐａＩ断片を電気泳動後のアガロースゲ ルから単離し、さらに、Ｎｃｏ　ＴおよびＳｍａＩで消化した葉の発現カセット （キメラ遺伝子Ｎｏ、１）内に挿入し、プラスミドｐＢＴ４８３を取得した。
配列番号８および配列番号９のオリゴヌクレオチドは葉緑体標識用シグナルのカ ルボキシ末端の一部分をコード化しており、これらをアニールした結果、Ｎｃｏ 　Ｉ適合性末端を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して精製し、さら に、Ｎｃｏ　Ｉで消化させたｐＢＴ４６１内に挿入した。正しい配列が正しい配 向性て挿入されていることをＤＮＡ配列決定により立証し、ｐＢＴ４９６を取得 した。配列番号１０および配列番号１１のオリゴヌクレオチドは葉緑体標識用シ グナルのアミノ末端の一部分をコード化しており、これらをアニールした結果、 ＮＣ０Ｉ適合性末端を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して精製し、 さらに、Ｎｅｏ　Ｉで消化させたｐＢＴ４６１内に挿入した。正しい配列が正し い配向性で挿入されていることを、ＤＮＡ配列決定により立証し、ｐＢＴ５２１ を取得した。このようにして、ｃｔｓを］　ｙｓＣ遺伝子に対して融合させた。
一ディング領域を含む約９００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。この断片を、Ｓａ ｌ　Ｉで消化さぜたｐＢＴ４９２内に挿入し、融合させたｅｔ換させた。リジン 非感受性を結果として生じる突然変異は置換させた断非コープイン配列を含む、 １６００ｂｐのＮｃｏｌ−ＨｐａＩ断片を単離し、さらに、ＮｃＯ■およびＳｍ ａ　１で消化した葉の発現カセット（キメラ遺伝子Ｎｏ、２）内に挿入してプラ スミドｐＢＴ５４１を取得し、Ｎｃｏ　ＩおよびＳｍａ　Ｉで消化した種子特異 的発現カセット（キメラ遺伝子Ｎｏ、４）内に挿入してプラスミドｐＢ７５４３ を収約９０ｂｐの３′非コ一プイン配列を含む、９０ｂｐのＮｃｏＩ−Ｈｐａ　 Ｉ断片を単離し、さらに、Ｎｅｏ　ＩおよびＳｍａ　Ｉで消化した葉の発現カセ ット（キメラ遺伝子Ｎｏ、３）内に挿入してプラスミドｐＢＴ５４０を取得し、 Ｎｃｏ　ＩおよびＳｍａ　Ｉで消化した種子特異的発現力セント（キメラ遺伝子 Ｎｏ、５）内に挿入してプラスミドｐＢＴ５４４を取得した。
発現カセット内に挿入する前に、ｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を改変させて、制限エン ドヌクレアーゼ部位Ｊ（ｐｎ　＋を翻訳停止コドンのすぐ後に挿配列番号１２ ＣＣＧこτＴ″＋Ｇ＋τ　ＧＴ−ン丁へ二〇丁２　に一配列番号１３： 八Ｇ：’：’ＴＧＧ″：λこ　ＣτＡττ入二八Ｓこ　へλ入こＣＧＧＣＡＴ　 Ｇ配列番号１２および配列番号１３のオリゴヌクレオチドをアニールした結果、 一方の端にｓｐｈ　Ｉ適合性末端を、さらに、もう一方にＨｉｎｄ　ＩＩＩ適合 性末端を生じ、さらにこれを、ｓｐｈ　Ｉ　プラスＨ４ｎｄ　ＩＩＩで消化させ たｐ　Ｂｒ３３７内に挿入した。正しい配列が挿入されていることをＤＮＡ配列 決定により立証し、ｐ　Ｂｒ３４３を取得した。
ｅｃｏｄａｐＡのコーディング領域全体を含むｐＢ７４４３からの８８０ｂｐの Ｎｃｏｌ−Ｋｐｎｌ断片を電気泳動後のアガロールゲルから単離し、さらにこれ を、Ｎｃｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉとで消化させた葉の発現カセソｌ−（キメラ遺伝子 Ｎｏ、６）内に挿入してプラスミドｐＢＴ４５０を取得し、Ｎｃｏ　ＩとＫｐｎ 　Ｉとで消化させた種子特異的発現カセット（キメラ遺伝子Ｎｏ、８）内に挿入 してプラスミドｐＢＴ４９４を取得した。
配列番号８および配列番号９のオリゴヌクレオチドは葉緑体標識用シグナルのカ ルボキン末端の一部分をコード化しており、これらをアニールした結果Ｎｃｏ　 Ｉ適合性末端を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して精製し、さらに 、Ｎｃｏ　＋で消化させたｐ　Ｂｒ３５０内に挿入した。正しい配列が正しい配 向性で挿入されていることをＤＮＡ配列決定により立証し、ｐＢＴ４５１を取得 した。ｅｃｏｄａｐＡの完全なコーディング領域に対して融合させた葉緑体標的 用シグナルのカルボキン末端部分をコード化するｐＢＴ４５１からの、９５０ｂ ｐのＮｃｏＩ−Ｋｐｎｌ断片を電気泳動後のアガロースゲルから単離し、さらに 、Ｎｃｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉとで消化させた種子特異的発現力セント内に挿入し、 プラスミドｐＢＴ４９５を取得した。配列番号１０および配列番号１１のオリゴ ヌクレオチドは葉緑体標識用シグナルのアミン末適合性末端を生じ、ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動を介して精製し、さらに、Ｎｃｏ　Ｉで消化させたｐＢＴ ４５１およびｐＢＴ４９５内に挿入した。正しい配列が正しい配向性で挿入され ていることを、ＤＮＡ配列決定により立証し、ｐＢＴ４５５およびｐＢＴ５２０ をそれぞれ取得した。このようにしてｃｔｓを、葉の発現カセット（キメラ遺伝 子Ｎ０８７）および種子特異的発現カセット（キメラ遺伝子Ｎｏ、９）内のｅｃ ｏｄａｐＡ遺伝子に対して融合させた。
ｃｏｒｄａｐＡのコーディング領域全体を含むｐＦＳ７６６からの８７０ｂｐの Ｎｃｏ　Ｔ−ＥｃｏＲｒ断片を電気泳動後のアガロースゲルから単離し、さらに これを、Ｎｃｏ　ＩとＥｃｏＲＩとで消化させた葉の発現カセット内に挿入して 、プラスミドｐＦＳ７８９を取得した。
このｃｔｓをｃｏｒｄａｐＡに付加させるために、完全なｃｔｓを含むＤＮＡ断 片をＰＣＲを使用して調製した。鋳型ＤＮＡはｐ　Ｂｒ５４０であり、さらに、 使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、以下に記載するものであった。
配列番号１４ ＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡ　ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣ入ＧＣＴ配列番号１５ ＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＴ　ＧＣＴ入ＧＣ触ＰＣＲは、Ｐｅｒ ｋ、ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社のキラ（・を使用して、販売社の説明書に 従い、同会社により製造されたサーモサイクラ−上で行った。ＰＣＲにより作製 された１６０ｂｐの断片を、４つのキオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下 においてＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して、平滑末端を有する断片を取得し た。このｃｔｓ断片を、Ｎｅｏ　Ｉで消化させたｐＦＳ７８９内に挿入し、さら に、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で処理して、５゛　オーバーハング内を 充てんした。挿入させた断片とベクター／挿入物のつなぎ目が正しい状態になっ ていることをＤＮＡ配列決定により決定し、番号１０のキメラ遺伝子を含むｐＦ Ｓ８４６を取得した。
ｃｏｒｄａｐＡのコーディング領域に付加させたｃｔｓを含むｐＦ３８４６から の１０３０ｂｐのＮｃｏｌ−Ｋｐｎｌ断片を電気泳動後のアガロースゲルから単 離し、さらにこれを、Ｎｃｏ　ＩとＫｐｎ　１とで消化させたファセオリンの種 子発現カセット内に挿入して、キメラ遺伝子Ｎｏ、１１を含むプラスミドｐＦＳ ８８９を取得した。類似した方法により、ｐＦＳ８８９からの１０．３０ｂｐの Ｎｃｏ　Ｉ−に、ｐｎＩ断片をＮｃｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉとで消化させたＫＴＩ３ の種子発現カセット内に挿入して、キメラ遺伝子Ｎｏ、１２を含むプラスミドｐ Ｆ３８６２を取得した。
配列番号１７および配列番号１８のオリゴヌクレオチドはトウモロコノの葉緑体 標識用シグナルのカルボキン末端の一部分をコード化しており、これらをアニー ルした結果Ｘｂａ　ＩおよびＮｅｏ　Ｉ適合性末端を生じ、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動を介して精製し、さらに、Ｘｂａ　Ｉ　プラス　Ｎｃｏ　Ｉで消化 させたｐＢＴ４９２内に挿入した（実施例２を参照せよ）。正しい配列が正しい 配向性で挿入されていることをＤＮＡ配列決定により立証し、ｐＢＴ５５６を取 得した。配列番号１９および配列番号２０のオリゴヌクレオチドは葉緑体標識用 シグナルの中間部分をコード化しており、これらをアニールした結果ＢｇｌＩＩ およびＸｂａ　Ｉ適合性末端を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して 精製し、さらに、Ｂｇｌ　ＩＩおよびＸｂａ　Ｉで消化させたｐＢＴ５５６内に 挿入した。正しい配列が正しい配向性で挿入されていることをＤＮＡ配列決定に より立証し、ｐＢＴ５５７を取得した。
配列番号２１および配列番号２２のオリゴヌクレオチドは葉緑体標識用シグナル のアミノ末端の一部分をコード化しており、これらをアニールした結果Ｎｃｏ　 ＩおよびＡｆｌ　Ｉｆ適合性末端を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介 して精製し、さらに、Ｎｃｏ　ＩおよびＡｆｌ　ＩＩで消化させたｐＢＴ５５７ 内に挿入した。正しい配列が正しい配向性で挿入されて、いることをＤＮＡ配列 決定により立証し、ｐＢＴ５５８を取得した。このようにしてｍｃｔＳをｌｙｓ ｃ−Ｍ４遺伝子に対して融合させた。
］ｙｓＣ−Ｍ４に付加させたｍｃｔｓを含むｐＢＴ５５８からの１゜６ｋｂのＮ ｃｏｌ−Ｈｐａｌ断片を電気泳動後のアガロールゲルから単離し、さらにこれを 、Ｎｃｏ　ＩとＳｍａ　Ｉとで消化させたトウモロコンの構造性発現力セント内 に挿入して、配列番号１３のキメラ遺伝子を含むプラスミドｐＢ７５７３を取得 した。
このｍｃｔｓをｅｃｏｄａｐＡに付加するために、完全なｍａｔｓを含むＤＮＡ 断片を、先に記載したようにＰＣＲを使用して調製した。鋳型ＤＮＡはｐＢＴ５ ５８であり、さらに、使用したオリゴヌクレオチドブライマーは、以下に記載す るものであった。
配列番号２３・ ＧＣＣ，ＣＣＣＡＣＣＧ　ＴＧ六ＴＧ八へ列番号２４： ＣＡＣＣＧＧＡＴＴＣＴＴｃｃｃｃ このｍｃｔｓ断片を、Ｎｃｏ　Ｉで消化したｐＢＴ４５０　（上記）内に挿入し 、さらに、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で処理して５゛オーバーハング内 を充てんさせた。挿入させた断片と、ベクター／挿入物のつなぎ目が正しい法曹 であることをＤＮＡ配列決定により決定し、ｐ　Ｂｒ３７６を取得した。プラス ミドｐＢＴ５７６をＡｓｐ　Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で 処理して平滑末端を有する断片を取得し、さらにその後にＮｃｏ　Ｉで消化した 。結果として生じる、ｍｃｔｓに付加させであるｅｃｏｃＪａｐＡ遺伝子を含む 、１３００ｂｐのＮｃｏ　Ｔ平滑末端断片を、電気泳動後にアガロースゲルがら 単離した。この断片を、Ｂｇｌ　ＩＩで消化させ、ＤＮＡポリメラーゼのフレノ ウ断片で処理して平滑末端を生じさせたトウモロコシの構成的発現カセット内に 挿入し、さらにその後にＮｃｏ　Ｉで消化させて、キメラ遺伝子Ｎｏ、１４を含 むプラスミｌ’　ｐＢ　Ｔ　５８３を取得した。
３５Ｓ　プロモーター／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃキメラ遺伝子でのタバコの形質転換３ ５Ｓ　プロモーター／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃキメラ遺伝子でのタバコの形質転換を、 以下に示す内容に従って実行した。
３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ＩｙｓＣ／Ｎｏｓ　３’　、３ ５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔｓ／ＩｙｓＣ／Ｎｏ５３″、おヨ ヒ、３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　ｌ）−ター／ｃ　ｔ　ｓ／ｌｙｓｃ−Ｍ４ ／Ｎｏｓ　３’　キメラ遺伝子を３．５−３．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ 断片として単離し、さらに、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＴで消化させたベクター１） ＺＳ９７Ｋ　（図２）内に挿入して、プラスミドｐＢＴ４９７、ｐＢＴ５４５、 および、ｐ　Ｂｒ３４２をそれぞれ取得した。このベクターは、アグロバクテリ ウム　ッメフ７キエンスの二成分性Ｔｉプラスミドベクター系［Ｂｅｖａｎ、　 （１９８４）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２：８７１１−８７２０ コの一部分である。このベクターは、（１）形質転換させた植物細胞のための選 択可能標識としての、キメラ遺伝子ツバリンシンターゼ　プロモーター／ネオマ イシンフォスフオドランスフェラーゼ　コーディング領域（ｎｏｓ：ＮＰＴ　Ｉ Ｉ）　［Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０４：１８４ −１８６１、　（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左右の境界部分［Ｂｅｖａ ｎ、　（１９８４）　Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２：８７１１−８７２０１、（３）ＥｃｏＲＩ、Ｋ ｐｎ　Ｉ、ＢａｍＨＩ、および、Ｓａｌ　Ｉのための非反復な制限エンドヌクレ アーゼ部位を有する大腸菌のＩａｃＺ　α−相相補化上セグメントＶｉｅｒｅａ 　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８ｓｅｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドｐｖｓ１ からの細菌性複製起点［１ｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　ＰＩ−ａｓｍ ｉｄ　１１：２０６−２２０１、および、（５）形質転換させたＡ、　ツメファ キエンスのための選択可能な標識としてのＴｎ５からの細菌性ネオマイシンフォ スフオドランスフェラーゼ遺伝子［Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７５）Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：３６２８−３６ ３２１　、を含んでいる。
３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃ　ｔ　ｓ／　］　ｙ　ｓ　Ｃ ／Ｎ。
Ｓ３°、および、３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／　ｃ　ｔ　ｓ／ｌ ｙｓｃ−Ｍ４／Ｎｏｓ　３’キメラ遺伝子もやはり二成分性ベクターｐＢ７４５ ６内に挿入して、ｐＢＴ５４７およびｐＢＴ５４６をそれぞれ取得した。このベ クターは、キメラ遺伝子３５Ｓ　プロモーター／Ｓａｌ　Ｉ断片としてあらかじ め挿入しであるｐＺＳ９７である（実施例９を参照せよ）。クローニング過程に おいて、ｄａｐＡキメラ遺伝子が大量に検出された。結果として、これらのプラ スミドは、植物内において発現される唯一のトランス遺伝子（選択可能標識遺伝 子ＮＰＴ　ＩＴ５４５およびｐＢＴ５４２と等価である。
キメラなＩｙｓＣ遺伝子を含む二成分性ベクターを、二親交配［Ｒｕｖｋｉｎ　 ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２８９　二　８５−８８］により 、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４［Ｈｏｃｋｅｍａ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：１７９−１８０１に転移 させた。このアグロバクテリウム形質転換体を使用してタバコの葉盤を接種させ た［Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ。
（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１２２９−１２３１３゜形質転換植物 をカナマイシンを含む選択的培地内において再生させた。
形質転換させた植物の葉内におけるキメラ遺伝子の発現のためのアッセイを行う ために、たん白質を以下に示すように抽出した。主脈を除去しである約２．５ｇ の若い植物の葉を、０．２ｇのポリビニルポリピロリドン、および、１１ｍＬの ５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０゜５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　（ＴＮＥ）とともにｄｏｕｎｃｅホモジェナイザー内に入れ、完全にすりつ ぶした。この懸濁液を、Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ　Ｈｏｍｏｇｅｎ ｉｚｅｒを設定７で操作する２０秒間の処理によりさらに均一化させた。結果と して得られる懸濁液を、４℃において２０分間、Ｄｕｐｏｎｔ−３ｏｒｖａｌｌ 高速遠心機内で、５Ｓ３４０−ターを使用して遠心処理にかけて、粒子類を除去 した。この上清をデカンテーションにより除去し、必要であればＴＮＥを添加す ることにより容積を１０ｍＬに合わせ、さらに、８ｍＬの冷却飽和硫酸アンモニ ウムを添加した。この混合物を水上に３０分間放置し、さらに、先に記載したよ うに遠心処理を施した。上清をデカンテーションにより除去し、ＡＫＩＩＩたん 白質を含んでいるベレットを１ｍＬのＴＮＥ中に再ｖ１５させ、さらに、セファ デックス　Ｇ−２５Ｍカラム（カラムＰＤ−ＩＱ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を通 すことにより脱塩させた。
免疫学的性質決定のために、３倍容積分の抽出物を、１倍容積分の４ｘＳＤＳＳ 用Ｓゲルサンプル液（０，１７Ｍ　ｌ−リス−ＨＣｌ　ｐＨ６゜８．６．７％　 ＳＤＳ、１６．７％　β−メルカプトエタノール、３３％　グリセロール）と混 合し、さらに、ライン当たり３μｌの各抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル にかけ、細菌が産生したＡＫＩＩＩをサイズ標準として使用し、この際、形質転 換させていないタバコの葉から抽出したたん白質を陰性対照として使用した。そ の後、このたん白質を電気泳動にかけて分離させたうえでニトロセルロース膜上 にプロットさせた（ウェスタンプロフト）。ＢｉｏＲａｄ社のＩｍｍｕｎ−Ｂｌ 。
ｔ　Ｋｉｔを用い、同会社により提供される標準的なプロトコールを使用して、 実施例２において記載されているように調整したＡＫＩＩＩ抗体に対してこの膜 を露出させるが、この際、ウサギ血清は１　：　５０００の希釈率となるように した。すすぎにより未結合の一次抗体を除去した後、この膜を、セイヨウカラシ のパーオキシダーゼ（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）に対して結合させであるロバ の抗ウサギＩｇである二次抗体に対して１：３０００の希釈率で露出させた。す すぎにより未結合の二次抗体を除去した後、この膜を、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のケ ミルミネッセンス試薬およびＸ−線フィルムに対して露出させた。
キメラ遺伝子である３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔｓ／Ｉｙｓ Ｃ−Ｍ４／Ｎｏｓ　３’　を含む１３の形質転換体の内の７つ、および、キメラ 遺伝子である３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃｔｓ／１ｙｓｃ ／Ｎｏｓ　３’　を含む１７の形質転換体の内の１３がＡＫＩＩＩたん白質を産 生した（表２）。すべての場合において、ＡＫｌｌｌ抗体と反応したたん白質は 、数種のサイズを持つものであった。
大腸菌内において産生されるＡＫＩｌｌとサイズが等価であるたん白質と、約６ ｋｄ太き目のたん白質とが、はぼ同じ量ですべてのサンプル中に見いだされてお り、このことは、葉緑体標識用シグナルが、合成されたたん白質のおおよそ半分 のものから取り除かれていることを示唆している。これはさらに、約半分のたん 白質が葉緑体に入り込んでいることを示唆している。それに加え、より大きな分 子量のたん白質がかなりな量で観察された。このたん白質の出所は核であり、存 在する総量は、結合させた成熟したＡＫＩｌｌたん白質と仮説的なＡＫＩＩＩ前 駆体たん白質ノ量と比較して、それに等しいか、あるいは、ややそれを上回る程 度であった。
葉の抽出物を、実施例２において記載したように、ＡＫ活性のためにアッセイし た。ＡＫＩＩＩはりシン　プラス　スレオニンに対する耐性が増加しているため 、ＡＫＩＩＩがもし存在するとしても、内在性のＡＫ活性とは区別することがで きる。しかしながら残念なことに、このアッセイは、これらの抽出物中に含まれ るＡＫＩＩＩ活性についての信頼性の高い検出を行うほど感度がよ（なかった。
キメラ遺伝子である３５Ｓプロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／　ｃ　ｔ　ｓ ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／Ｎｏ　ｓ３°遺伝子を含む４つの形質転換体の内、 ＡＫＩＩＩ活性を示したものは０であった。３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ 　リーダー／ｃｔｓ／ＩｙｓＣ／Ｎｏｓ　３’遺伝子を含む形質転換体からの一 つの抽出物のみが、説得力のあるレベルの酵素活性を示した。これは、形質転換 体５４６−４９Ａに由来するものであり、これはさらに、ウェスタンプロ、ソト を介して最高レベルのＡＫ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　−Ｍ４たん白質を示した抽出物でもあ った。
活性を有するＡＫＩＩＴ酵素の発現を検出するための別の方法は、高濃度のりタ ン　プラス　スレオニン１こ対する葉組織の感受性もしり（マ耐性を評価するこ とである。多くの植物の摩田胞培養物および苗木の生育１よ高濃度のりシン　プ ラス　スレオニア１こよって阻害される力（、これ（ま、メチオニン（もしくは 、インビボにおいてメチオニンに転換するホモセリン）の添加により逆行する。
リジン　プラス　スレオニンの阻害１ま、回路を通してフラックスを減少させて メチオニン１こつ０ての飢餓状態を誘導する内在性ＡＫのフィートノく・ツク阻 害１こ起因するものと考えられる。
タバコにおいては、葉のなかに２つのＡＫ酵素力え存在し、ひとつ＋；！　１， １シン感受性であり、もうひとつはスレオニン感受性である［Ｎｅｇｒｕｔｕｉ 　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　６８： １１−２０１０高濃度の１ノシン　プラス　スレオニン（よタバコの葉盤からの 苗条の生育を阻害し、この阻害１ま、低濃度のメチオニンの添加により逆行する 。従って、生育阻害（ま恐らくこの２つのＡＫイソ酵素の阻害に起因するものと 思わ第１る。
活性を有する、リジンとスレオニンとｌこ非感受性なＡＫＩｌｌ、−Ｍ４の発現 は、この生育阻害を逆行させることが予測される。表２（こお（１て見られるよ うに、このことが実際に観察されてＬＭる。事実、ＡＫＩＩＩ−Ｍ４たん白質の 発現レベルと、リジン　プラス　スレオニン阻害番二対する耐性との間には良好 な関連性が存在する。’Ｊレシン受性の野生型ＡＫＩＩＩの発現は同様の効果を 示さなし１゜最高の発現をｊ牙う形質転換体のみがリジン　プラス　スレオニン 阻害（こ対して少し耐性を示しｔこ力（、これは、ＡＫ口１−Ｍ４に関して観察 されｔこものと比較すると、！ａｌｌ的なというには程遠いものであった。
葉の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を以下（こ示すように抽 出した。約３０−４０ｍｇの若葉組織をカミソリで切り刻み、水上において、１ ２　ｖ／　５　ｖ／　３　ｖ　（ＭＣＷ）の比率で混合させた０゜５ｍＬのメタ ノール／クロロフォルム／水の中に落とし入れた。１０−３０分後、この懸濁液 を室温にさらし、０ｍｎ１　１０００　Ｈａｎｄｈｅｌｄ　Ｒｅｃｈａｒｇｅａ ｂｌｅ　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（手持ち型充電用均−化装置）で均一化させ、 さらにその後、工・ノペンドルフ社のマイクロ遠心機で３分間遠心処理を施した 。約Ｑ、５ｍＬの上清をデカンテーションし、０．２ｍＬの追加的なＭＣＷをベ レツトに添加し、これをその後ポルテックスミキサーにかけ、さらに、先のよう に遠心処理を施した。約０．２ｍＬの２次上清を１次上清に添加した。これに対 して、まず０．２ｍＬのクロロフォルムを、そしてその後にＱ、３ｍＬの水を添 加した。この混合物をポルテックスミキサーにかけ、工・ソベンドルフ社のマイ クロ遠心機内で約３分間遠心処理を施し、上のほうの約１、ＱｍＬの水相を除去 し、５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ　Ｃ。
ｎｃｅｎｔ　ｒａｔｏｒ内において乾固させた。サンプルの１／１０を、カラム 通過後のニンヒドリン検出を利用するＢｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　６３００の アミノ酸分析機にかけた。葉における比較遊離アミノ酸レベルは、ロイシンを内 部標準として使用して、ロイシン）二対する１」シンもしくはスレオニンの比率 と比較した。ＡＫＩＩＩもしくはＡＫＩｌｌ−Ｍ４の発現は、葉の中に残存して いるリジンもしくはスレオニン（あるいは、任意の他のアミノ酸）については− 貫した効果を示さなかった（表２）。
表　２ ５＜７−２テ：　ｏ　５　３　ε　＋→↓実施例８ ム聾エレ二〇二が一乙ユ屡諺ム３亘ド！Ｌ組房１輯囮 ファセオリン　プロモーター／　ｉ　ｙ　ｓ　Ｃキメラ遺伝子カセット、ファセ 第１ル　５°領域／ｃ　ｔ　ｓ／　１．　ｙ　ｓ　Ｃ／ファセ第１ル　３°領域 、ファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／ｌｙｓｃ−Ｍ４／７ｙセ、ｔリン　３’ｉ 域（実施例６）を、約３．３　ｋ、　ｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片として単離した 。これらの断片を、二成分性ベクターｐＺＳ９７　（実施例３）の非反復な旧ｎ ｄ　ＩＩＩＶ内に挿入し、ｐＢＴ５４８およびｐＢＴ５４９をそれぞれ取得した 。このベクターは、２つの追加的な非反復なりローニング部位であるＳｍａ　Ｉ およびＨｉｎｄ　ＩＩＩ、および、細菌性ネオマイシンフォスフオドランスフェ ラーゼ遺伝子の代わりの、Ａ。
ツメファキエンスのための検出可能標識としての細菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子 （アンビリシン耐性を生じる）の存在を除いては、実施例７に記載したｐＺＳ９ ７Ｋに類似している。
キメラなＩ　ｙｓＣ遺伝子を含む二成分性ベクターを、三親交配により、アグロ バクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に転移させ、このアグロバクテ リウム形質転換体をタバコの葉盤の接種に使用し、さらに、形質転換植物を実施 例７において示した方法により再生させた。
形質転換させた植物の種子内におけるキメラ遺伝子の発現についてのアッセイの ために、植物を開花、自己授粉させ、さらに、種子を実らせた。総たん白質を、 以下に示すように、成熟した種子から抽出した。約３０−４０ｍｇの種子を］− ，５ｍＬの使い捨て用プラスチック　マイクロフユージ管内に入れ、０．２５． ｍＬの５０ｍＭ１−’Ｊスス−Ｃｌ　ｐＨ６，８，２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳ ＤＳ、１％のβ−メルカプトエタノール内ですりつぶした。このすりつぶし作業 は、マイクロフユージ管に適合するように設計された使い捨て用のプラスチック 軸のついているミクロ化されているすりつぶし機を使用して行った。結果として 生じる懸濁液をマイクロフユージ管内で、室温下において５分間遠心処理を行っ て、粒子類を除去した。３倍量の容積の抽出物を、１倍量の容積の４×５ＤＳ− ’ｆル”ｊンプル用緩衝液（０，１７Ｍ（７）ト’Ｊス−ＨＣｌ　ｐＨ６８，６ ７％のＳＤＳ、１６．７％のβ−メルカプトエタノール、３３％のグリセロール ）と混合し、ライン当たり５μＬの各抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに かけたが、この際、細菌により産生されたＡＫ　ｒ　Ｉ　Ｉをサイズ標準として 使用し、さらに、形質転換させなかったタバコの種子からのたん白質抽出物を陰 性対照として使用した。その後このたん白質を電気泳動にかけて分離させてから ニトロセルロース膜上にプロットさせた。この膜を、Ｂ　Ｉ　ｏＲａ　ｄ社のＩ ｍｍｕｎ−Ｂ　ｌ　ｏ　ｔＫｉｔを用い、同会社により提供される標準的なプロ トコールを使用して、実施例２において記載されているように調整したＡＫＩＩ ｒ抗体（実施例２において記載されているように調製した）に対してこの膜を露 出させたが、この際ウサギ血清は１・５０００の希釈率になるようにした。
すすぎにより未結合の一次抗体を除去した後、この膜を、セイヨウカランのバー オギノダーセ（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ社）に対して結合させであるロバの抗 ウサギＩｇである二次抗体に対して、１　：　３０００の希釈率で露出させた。
すすぎにより未結合の二次抗体を除去した後、この膜を、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の ケミルミネッセンス試薬およびＸ−線フィルムに対して露出させた。
キメラ遺伝子であるファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／］ｙｓＣ／フアセオリン 　３゛領域を含む１１の形質転換体の内の１０、および、キメラ遺伝子であるフ ァセオリン　５′領域／ｃ　ｔ　ｓ／　ｌ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ファセオリン　 ３゛領域を含む１１の形質転換体の内の１０がＡＫＩＩＩたん白質を産生じた（ 表３）。すべての場合において、ＡＫＩＩＩ抗体と反応したたん白質は数種のサ イズを持つものであった。大腸菌内において産生されるＡＫｒＩＩとサイズが等 価であるたん白質と、約６ｋｄ太き目のたん白質とは、はぼ等しい量ですべての サンプル中に見いだされており、このことは、葉緑体標識用シグナルが、合成さ れたたん白質のおおよそ半分のものから取り除かれていることを示唆している。
これはさらに、約半分のたん白質が葉緑体に入り込んでいることを示唆している 。それに加え、より小さな分子量のたん白質がかなりな量で観察され、これは恐 ら＜Ａｋｌｌｌポリペプチドの分解産物を表しているものと思われる。
種子の遊アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を成熟した種子から、以 下に示すように抽出した。約３０−４０ｍｇの種子、および、おおよそ同じ量の 滅菌した砂を、室温において、１２ｖ１５ｖ／３ｖの比率で混合させた０、６ｍ Ｌのメタノール／クロロフォルム／水（ＭＣＷ）と−緒に１．５ｍＬの使い捨て 用プラスチックマイクロフユーン管内に入れた。種子は、マイクロフユージ管に 適合するように設計された使い捨て用のプラスチックの軸を備え付けであるモー ター駆動のすりつぶし機ですりつぶした。すりつぶし作業の後、追加的な０．５ ｍＬのＭＣＷを添加し、この混合物をボルテックスミキサーにかけ、さらにその 後、エソペンドルフのマイクロ遠心機で３分間遠心処理を施した　約０゜６ｍＬ の上清をデカンテーションし、０．２ｍＬの追加的なＭＣＷをベレットに添加し 、これをその後ポルテックスミキサーにかけ、さらに、先のように遠心処理を施 した。約０．２ｍＬの２次上清を１次上清に添加した。これに対して、まず０． ２ｍＬのクロロフォルムを、そしてその後に９．３ｍＬの水を添加した。この混 合物をポルテックスミキサーにかけ、エッベンドルフ社のマイクロ遠心機内で約 ３分間遠心処理を施し、上のほうの約１．０ｍＬの水相を除去し、５ａｖａｎｔ 　５ｐｅｅｄ　Ｖａ、ｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ内において乾固させた。サ ンプルは、窒素下における１１０−１２０°Ｃにおいて、２４時間、６Ｎの塩酸 、０．４％のβ−メルカプトエタノール中で加水分解し、そのサンプルの１／４ をカラム通過後のニンヒドリン検出を利用するＢｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　６ ３００のアミノ酸分析機にかけた。葉における比較遊離アミノ酸レベルは、ロイ シンを内部標準として使用して、ロイシンに対するリシンもしくはスレオニンの 比率と比較した。
種子の総アミノ酸組成を測定するために、６つの種子を、窒素下にお番プる１１ ０−１２０°Ｃにおいて、２４時間、６Ｎの塩酸、０．４％のβ−メルカプトエ タノール内において加水分解させ、このサンプルの１／１０を、カラム通過後の ニンヒドリン検出を利用するＢ　ｅ　ｃ　ｋｍａ　ｎＭｏｄｅｌ　６３００のア ミノ酸分析機にかけた。種子における比較遊離アミノ酸レベルは、ロイシンに対 するリンノ、メチオニン、スレオニンもしくはイソロイノンの比率と比較したた め、ロイシンを内部標準として使用した。このトランス遺伝子は、１次的な形質 転換体のこれらの自己授粉させた子孫内において隔離されており、さらに、６つ の遺伝子のみの分析を行ったという理由のため、何らかのサンプリングエラーが 生じることが予期された。従って、測定を、幾つかのラインについて複数回繰り 返した（表３）。
種子内におけるｃｔｓ／］ｙｓＣ遺伝子の発現の結果、種子内における遊離スレ オニンレベルの２から４倍の増加、および、幾つかの場合においては遊離リジン レベルの２から３倍の増加を生じた。より高いレベルのＡＫＩＩＩたん白質発現 させる形質転換体と、より高いレベルの遊離スレオニンを有するものとの間には 良好な相関関係が存在したが、このような相関はりシンに関しては該当しなかっ た。スレオニンもしくはりシンのこれらの増加は比較的小さく、種子内における 総スレオニンもしくはリシンのレベルを検出可能なまでに増加させる程十分なも のではなかった。種子内におけるｃ　ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４遺伝子の 発現の結果、種子内における遊離スレオニンのレベルの４から２３倍の増加、お よび、幾つかの場合においては遊離リジンレベルの２から３倍の増加を生じた。
より高いレベルのＡＫＩｉｌたん白質発現させる形質転換体と、より高いレベル の遊離スレオニンを有するものとの間には良好な相関関係が存在したが、このよ うな相関はやはリリシンに関しては該当しなかった。
遊離スレオニンの増加はより大きなものであり、種子内における総スレオニンの レベルを検出可能なまでに増加させる程十分なものであった。
種子の総スレオニン含有量の６から２５ノく一セントの４から増加が、複数回の サンプル採取を行った３つの株において観察された。（ロイシンに対するイソロ イシンの比率を比較のために示した。）総スレオニンの増加を示す株は、遊離ス レオニンの最高レベルの増加およびＡＫＩ［−Ｍ４たん白質の高い発現を示した ものと同一のものであった。これらの結果より、遊離スレオニンは、正常なタバ コ種子内においては存在する総スレオニンの約１％を占めるが、高レベルのＡＫ Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４を発現する種子内においては存在する総スレオニンの約１８％ を占めると（１う見積りを立てることができる。
ｌｊｉ　Ｉｌｌ　０．４９　１．３４　０．６ａ　Ｏ，３５０，６１１０，６３ −５４８２Ａ　’ａ　ユ５　２．３　０．７ａ　Ｏ，＜３　０．’ｌｌ　Ｏ，６ ７＋５４Ｂ−リ　Ｏ，ｌｉ９　５．３　０．ＢＯＯ，３５０，６９０，６５↓＋ →５４Ｂ−６Ａ　０．３９　３．５　０，８５　０，３５　０，６９　０．６４ 　＋５ベト籟　Ｃ，Ｂ２　４．２　Ｃε３　０．３６　０．６ａ　０．６５　４ ４Ｓ／Ｊ−１４Ａ　Ｃ，４！　３．！　ＯＢ２　０．３２　０．６”Ｉ　Ｃ，６ ５よ５４ａ−１ｓ入　０．５１　１．５　０．６タ　０．３７　０，６７　０． ６３　−５４Ｂ−２２μ　１，４１　２．９　０　７５　０　ベア　０　７＜　 ０．６５　÷中。
Ｓ＜８−２＜Ａ　Ｏ，１３３７０，Ｂユ　０．３ａ　０．６８　０．６５　＝、 ＋５４８−＜ＬＡ　Ｏ，４０２，Ｂ　Ｏ，７７０，コ’ｌ　０．６Ｂ　ＯＢ５　 −５４８−５ｏλ　０．４６　４．０　０．８Ｌ　Ｏ，３３０，６８０，６５＋ ５４ｇ−５ｔＡ　Ｏ，５０３，８０，１１００，３３０，６７０１５、−一５４ ９−５人　０６３５．９　０．ｆ＋９　０．：！２　０．６５　０．６５　＋５ ４９−７六　〇、５１　Ｂ、３　０ｊ８　０．３３　０，６７　０．６］　→− ５４９−２Ｃ入０．６ｉ３００．ＳａＱ、３Ｂ”０．Ｂ２雷０６５１→−４５４ ９３：ＡＯ＜３１．３０６９０．３２ｏ、＝＜０．６３−５＜９−３９フ　０． ４３　１６　０．８３　０，３５　０，７１　０．６３　＋４４５４９−４［Ｉ Ａ　ｏ、ａｏ　４．９　ｏ、ｉ＜　０．３３（１，６：ｌ　Ｏ，６＜　＋５４９ −＜１ＣＯ，９９１３０，８００，３Ｂ−０，’１９費０．６５−　＋−Ｐ↓Ｓ ＜９−＜献０．４８　７．１　０，８４　０．３４　０．７０　０．６４　＋５ ６−５２＾　ＯＪＩ　９．２　０，８０　０，３９　０．”Ｔｏ　０．６５　− ５＜９−５７Ａ　Ｏ，６０１５０，７’ｌ　０．３５−　ＯＪ５・　０．６４− 　十＋漆５４９−６００　ｏ、ｅｓ　！ｌ　Ｏｊ９　０．３ｍ　Ｏ，Ｄ　Ｏ，６ ５＝、−。
ファセオリン　５°領域／　ｃ　ｔ　ｓ／　ｌ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ファセオｌ ノン３゛領域で形質転換させた２つの植物である植物５４９−５Ａ及び５４９− ４０Ａの自己授粉に由来する種子は、１本のカナマイシン感受性苗木に対して３ 本のカナマイシン耐性苗木と１．％う結果を示し、これ（ま、このトランス遺伝 子が単一部位において挿入されて（Ａることを示してＩ、）る。
子孫植物を育成し、自己授粉させ、さらに、種子をカナマイシン標識用遺伝子の 隔離について分析した。そのトランス遺伝子挿入断片（ごつし）て同型接合性で あり、そのためその遺伝子カセットの２つのコピーを含んでいる子孫植物は、そ の遺伝子カセットの１つのコピーを有する兄弟の異型接合性子孫の種子内におけ るスレオニンの約２倍のスレオニンを蓄積し、さらに、その遺伝子を持たない種 子の約８倍を蓄積して０た。このことは、大腸菌遺伝子の発現レベルが、遊離ス レオニンの蓄積を調節していることを証明している。
実施例９ 影咀二住士ぜ二白工壓国舵Ｖムｌ旦部！ム註座１３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ 　リーダー／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏ５３°および３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ 　ｂ　リーダー／　ｃ　ｔ　ｓ　／　ｅ　ｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ　３’　キメラ 遺伝子を、３．１および３，３ｋｂのＢａｍＨｌ−３ａｌ　Ｉ断片として各々単 離し、さらに、ＢａｍＨｌ−３ａｌＩで消化させた二成分性ベクターｐＺＳ９７ Ｋ　（図２）内に挿入し、プラスミドｐＢ７４．６２及びｐ　Ｂｒ３６３を各々 取得した。
この二成分性ベクターを実施例７に記載しである。
により、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に対して転移さ せ、このアグロバクテリウム形質転換体を、タバコの葉盤を接種させるために使 用し、さらに、結果として生じた形質転換植物を、実施例７において示す方法に より再生させた。
形質転換させた植物の葉内におけるキメラ遺伝子の発現についてのアッセイを行 うために、たん白質を、以下に記載するような改変を伴いながら、実施例７にお いて記載されたように抽出した。最初の硫酸アンモニウム沈殿からの上清約１８ ｍＬを、追加的な１２ｍＬの飽和冷却硫酸アンモニウムを添加しながら混合した 。この混合物を水上に３０分間放置し、さらに、実施例７において記載したよう に遠心処理を施した。上清をデカンテーションし、さらに、ＤＨＤＰＳたん白質 を含んでいるベレットを１ｍＬのＴＮＥ中に再懸濁させ、さらに、５ｅｐｈａｄ ｅｘ　Ｇ−２５Ｍカラム（Ｃｏｌｕｍｎ　ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） を通すことにより脱塩させた。
この葉抽出物を、実施例４において記載したようにＤＨＤＰＳ活性についてアッ セイした。大腸菌のＤＨＤＰＳは、リジン対する大腸菌の耐性が増大しているこ とによりタバコのＤＨＤＰＳと区別することができ、大腸菌のＤ　Ｉ−（Ｄ　Ｐ 　Ｓは、Ｑ、１ｍＭのりタンにおいて８０−９０％のりタン活性を保持しており 、一方、タバコのＤ　Ｉ−（Ｄ　Ｐ　Ｓは、その濃度のリジンにおいては完全に 阻害された。キメラ遺伝子３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｅｃｏｄ ａｐＡ／Ｎｏｓ　３’　を含む１０の形質転換体の内の１つが大腸菌のＤＨＤＰ Ｓの発現を示したが、一方で、キメラ遺伝子３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ 　リーダー／ｃｔｓ／ｅｃ。
ｄａｐＡ／Ｎｏｓ　３’　を含む１０の形質転換体の内の５つが大腸菌のＤＨＤ ＰＳのうちの発現を示した。
遊離アミノ酸は、実施例７において記載したように葉から抽出した。
キメラ遺伝子３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄ ａｐＡ／Ｎｏｓ　３’　の発現の結果、葉における遊離リジンのレベルが実質的 に増加したが、３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　！ｊ　−ター／ｅｃｏｄａｐＡ ／Ｎｏｓ　３’　ではそのような結果を生じなかった。形質転換させていないタ バコと比較して２から９０倍高い遊離リジンレベルが観察された。
形質転換させた植物を開花させ、自己授粉させ、さらに、種子を実らせた。３５ Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａ且Δ／Ｎｏｓ　 ３”遺伝子で形質転換させた幾つかの株からの種子の表面を滅菌し、さらに、カ ナマイシンが存在するアガロースプレート上に接種させた。１本のカナマイシン 感受性苗木に対して３本のカナマイシン耐性苗木という結果を示すことで、トラ ンス遺伝子が単一部位において挿入されていることを示している株が同定された 。これらの株から、標準的な遺伝子分析法を使用して、このトランス遺伝子挿入 断片にとって同型接合型である子孫を取得した。この同型接合型子孫は、その後 、若葉および成熟した葉における大腸菌Ｄ　Ｉ−１Ｄ　Ｐ　Ｓの発現について、 および、若葉および成熟した葉および成熟した種子中に蓄積した遊離アミノ酸レ ベルについての特徴決定に供しした。
活性を有する大腸菌ＤＨＤＰＳ酵素の発現は、形質転換体の同型接合型子孫の若 葉および成熟した葉の両方において顕著に認められた（表４）。通常のタバコ植 物と比較して５０−１００倍の高いレベルの遊離リジンがその植物の若葉内に蓄 積したが、より大きな葉内においては遊離リタンの蓄積はずっと少なかった（２ から８倍）。師部におけるリシンを測定する実験により、リシンは大きい葉から 輸出されることが示唆されている。輸出されたリシンは、栄養素を輸出するより はむしろ受け取るということが知られているより小さな育成中の葉におけるリシ ンの蓄積に寄与しているものと思われる。より大きな葉がその植物の生物量の大 部分を構成しているため、植物におけるリジンの総蓄積量の増加は、より大きな 葉１乎おけるリシンのレベルによりより大きく影響される。これらの植物の種子 内の遊離リジンにおいては、何の影響も観察されなかっであるＢＴ４６３形質転 換体の子孫 標準　３インチ　０．５　０．００６　０　０．５４６３−１８Ｃ−２３インチ 　４７　０．４１　７．６　０．４４６３−１８Ｃ−２１２インチ　１．　０． ０２　５．５　−４６３−２５Ａ−４３インチ　５８　０，４２　６．６　０． ４４６３−２５Ａ−４１２インチ　４　０．０２　１２．２　−４６３−３８Ｃ −３３インチ　２８　０，２８　６．Ｉ　Ｑ、５４６３−３８Ｃ−３１，２イン チ　２　０，０４　８．３　−の形質転換 且Δ／ファセオリン３′領域、および、ファセオリン５゛領域／　ｃ　ｔ　ｓ／ ｅｃｏｄａｐＡ／ファセオリン３′領域（実施例６）を、約２．６および２．８ ｋｂのＨｉｎｄ　１１１断片として各々単離した。これらの断片を二成分性ベク ターｐＺＳ９７　（図３）の非反復なＨｉｎｄＩ１１部位内に挿入し、ｐＢＴ５ ０６およびｐＢＴ５３４を各々取得した。
このベクターは、実施例８において記載されている。
キメラなｅｃｏｄａｐＡ遺伝子を含む二成分性ベクターを、二親交配により、ア グロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４内に転移させ、このアグロ バクテリウム形質転換体を使用してタバコの葉盤を接種し、さらに、結果として 得られた形質転換植物を、実施例７において示した方法により再生させた。
キメラ遺伝子の発現についてのアッセイを行うために、形質転換させた植物を開 花させ、自己授粉させ、さらに、種子を実らせた。種子の総たん白質を実施例８ において記載したように抽出し、さらに、以下に示す改変を伴いつつ、実施例７ において記載したように免疫学的な分析を行った。ウェスタンブロンド膜を、Ｂ ｉｏＲａｄ社のＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ　Ｋｉｔを用いる同会社の標準的なプロト コールを使用して、実施例４において調製されたＤＨＤＰＳ抗体に対して露出さ せたが、この際ウサギ血清は１　：　５０００の希釈率になるようにした。
キメラ遺伝子であるファセオリン　５゛領域／ｅｃｏｄａｐＡ／フアセオリン　 ３゛領域を含む１４の形質転換体の内の１３、および、キメセオリン　３゛領域 を含む］３の形質転換体の内の９つが、ウェスタンプロットを介して検出するこ とができるＤ　Ｈ’Ｄ　Ｐ　Ｓたん白質を産生じた（表３）。Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ 抗体と反応するたん白質のサイズは様々であった。
大部分のたん白質は大腸菌内に産生されるＤＨＤＰＳとサイズが等しく、いずれ にせよこのキメラ遺伝子は葉緑体のトランジット配列を含んでいた。このことは 、葉緑体の標的用シグナルが、合成される前駆体たん白質から既に効率良く取り 外されていることを示していた。これはさらに、大多数のたん白質が葉緑体に入 っていったことを示唆している。それに加え、より低い分子量のたん白質も幾つ か観察され、これは恐らく、ＤＨＤＰＳポリペプチドの破壊産物を示すものと思 われる。
種子の遊離アミノ酸組成および総アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸 および総アミノ酸を成熟した種子から抽出し、さらに、実施任意のものにおける 種子の、総すシンもしくはスレオニン組成について何の影響も及ぼさなかった（ 表５）。ファセオリン　５′領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／フアセオリン　３ ゛キメラ遺伝子で形質転換させた株の幾つかのものも、遊離アミノ酸組成におけ る任意の影響についてテストした。高レベルの大腸菌ＤＨＤＰＳたん白質を発現 する株においては、やはり、種子のりシンもしくはスレオニンについては、控え めな影響すら観察されなかった（表５）。これは、このたん白質の発現が葉にお ける遊離リソンレベル与える劇的な影響（実施例９において記載しである）をふ まえたうえでは驚くべき結果であった。
このことについての一つの可能な説明は、ウェスタンプロットを介して観察され るＤＨＤＰＳたん白質は機能を有していないものであるということであった。こ の仮説をテストするために、総たん白質抽出物を成熟しこ種子、から調製し、さ らに、ＤＨＤＰＳ活性についてアッセイを行った。約３０−４０ｍｇの種子を使 い捨て用のプラスチックマイクロフユージ管に入れ、さらに、０．２５ｍＬの５ ０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ　（ＴＮＥ） 中ですりつぶした。このすりつぶし作業は、マイクロフユージ管内に適合させる ように設計されている使い捨て用のプラス千ツクの軸を備えたモーター駆動のす りつぶし機を使用して行った。結果として得られる上清を、マイクロフユージ内 で、室温において５分間遠心処理して、粒子類を除去した。ベレット化した物質 と上方の油相との間の約０．１ｍＬの水性」二清を除去した。
この種子抽出物を、実施例４において記載したようにＤＨＤＰＳ活性についてア ッセイした。大腸菌のＤＨＤＰＳは、大腸菌のリシンに対する耐性が増加してい ることによりタバコのＤＨＤＰＳとは識別でき、大腸菌のＤＨＤＰＳは、０．４ ｍＭのりシンにおいてその活性の約５０％を保持していたが、一方で、タバコの Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓはその濃度のリシンで完全に阻害された。高レベルの大腸菌Ｄ 　ＨＤ　Ｐ　Ｓ活性がテストした４つの抽出物すべてにおいて観察され、この説 明は除外された。
キメラなｅｃｏｄａｐＡ遺伝子内におけるｃｔｓ配列の存在は、葉における高レ ベルのりシンの蓄積を誘導するためには必須のものであった。
従って、他の可能な説明は、二成分性のベクター内へ、キメラなファセオリン　 ５′領域／ｃ　ｔ　ｓ／ｅ　ｃ　ｏ　ｄ　ａ　ｐＡ／ファセオリン　３゛遺伝子 を挿入している間に、このｃｔｓ配列がどういう訳か消失してしまったというこ とであった。しかしながら、形質転換させた株のベクターの内の幾つかのものを ＰＣＲ分析したところ、ｃｔｓ配列の存在が証明され、はこの可能性は除外され た。
第３の説明は、種子内ではアミノ酸は通常は合成されておらず、そのため、回路 中に存在する他の酵素が種子内に存在しないというものであった。ファセオリン 　５′領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／フアセオリン３゛遺伝子の発現の結果、 種子内において高レベルの遊離スレオニンの蓄積が生じたという実施例８におい て示される実験結果により、これは該当しないということが示されている。
これらの結果および実施例９において示された結果を総括すると、種子もしくは 葉のいずれかにおけるリシン非感受性ＤＨＤＰＳの発現は、種子内において、増 加した遊離リシンの蓄積を生じるほど十分なものではないということが証明され た。
標ｔす’Ｃ，＜５１．３４Ｃ，３５０，６２５０６−１９；Ｘ　Ｏ，３７０，＜ ５　”５０６−：ｊＢ　０　３５　Ｃ，ＧＶ　＋５０ｇ−，！３Ｂ　Ｃ３４０， ６７” ５０６−３ＥＲＣ，３６０１９８７−−”５０６−３り＾　０３７　０　フＱ　 ＋＋５０５−＜７二　Ｃニコ　０．６ａ　””５０ε−＜已入　０３３　０　ε ９　＋＋＋５０６−＜９λ　０．３３　０．６９　＋＋＋５３４−２２Ｂ　Ｏ， ４３１，３２０，３９０，５１４，９＋十＋５３＜−３１Ａ　Ｃ，３４０，６６ ５３４−３８；、　Ｏ，：！５　−、ｔテ　Ｃ，４２Ｃコ３　＋＋十５３４−３ ４Ｂ　Ｏ，８０１，ｉ３　０．＜２　０．、’１０５３４−３５；、０．＜３　 ｉ、ＩＢ　０．３３０．６７＋＋＋５３４−３７：ＩＯ，４２１，５８０，３Ｖ 　Ｏ，６ｇ５３４−４已λ０．４６１．２４０．３５０．６８６．２＋÷＋実施 例１１ 影咀二兜！づ二仁工と１と値二ひ五」盈鉦ヱＶヒムプニ即Ｚ」ユ以上士せｊ勲迂 二ソバゼ五」婢３５Ｓ　ブｏモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃｔｓ／ｅｃｏ ｄａｐＡ／Ｎｏｓ　３°、および、３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダ ー／ターｐＺ３９７に内において結合させた（図２）。この二成分性ベクターは 実施例７において記載されている。オリコ′ヌクレオチドアダプターを合成して 、３５Ｓ　プロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／ｃｔｓ／土工おいてＢａｍ８ 　１部位をＥｃｏＲ１部位に変換させた。この３５Ｓプロモーター／Ｃａｂ　リ ーダー／　ｃ　ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／Ｎｏ　ｓ３゛キメラ遺伝子を その後プラスミドｐＢＴ５４０　（実施例６）から３．６ｋｂｏ）ＥｃｏＲＩ断 片として単離し、さらに、ＥｃｏＲＩで消化させたｐＢＴ４６３　（実施例９） 内に挿入して、プラスミドｐＢＴ５６４を取得した。このベクターは、同じ配向 性で挿入された３５５Ｍ４／Ｎｏｓ　３°キメラ遺伝子との両方を有している。
キメラなｅｃｏｄａｐＡおよびｌｙｓｃ−Ｍ４遺伝子を含む二成分性ベクターを 、二親交配により、アグロバクテリウム株ＬＡＢ４４０４／ｐＡＬ４４０４に転 移させ、このアグロバクテリウム形質転換体を使用してタバコの葉盤を接種し、 さらに、結果として生じた形質転換植物を、実施例７において示した方法により 再生させた。
形質転換させた植物の葉内におけるキメラ遺伝子の発現についてアッセイするた めに、たん白質を、ＡＫ、ＩＩＩについては実施例７において記載したように、 さらに、Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓについては実施例９において記載したように抽出した 。この葉抽出物を、実施例４および９において記載されているようにＤ　ＨＤ　 Ｐ　Ｓ活性についてアッセイした。大腸菌のＤＨＤＰＳはリジンに対する耐性が 増加していることにより、タバコのＤＨＤＰＳとは識別することができ、大腸菌 のＤＨＤＰＳは０．１ｍＭのリジンにおいてその活性の８０−９０％を保持して いたが、一方で、タバコのＤＨＤＰＳは、その濃度のりシンでは完全に阻害され た。抽出物は、実施例７および１０において記載されているように、ウェスタン プロットを介してＡＫＩＩＩおよびＤＨＤＰＳタンパク質の発現についての免疫 学的な特徴決定に供した。
１２の形質転換体の内の１０が大腸菌のＤＨＤＰＳ酵素活性を発現した（表６） 。酵素活性のレベルと、免疫学的に検出されたＤＨＤＰＳたん白質の量との間に は良好が相関が存在した。実施例７において記載されているように、ＡＫアッセ イはこれらの抽出物中の酵素活性を検出するほど十分な感度ではなかった。しか しながら、ＡＫＩＩＩ−Ｍ４タンパク質は、１２の抽出物の内の８つにおいて免 疫学的に検出された。５６４、−２１　Ａおよび４７Ａのような幾つかの形質転 換体においては、ＤＨＰＤＳとＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４との発現レベルの間に大き な隔たりがあったが、１２の株の内の１０においては良好な相関が存在した。
遊離アミノ酸を葉から抽出し、さらに、実施例７において記載したようにアミノ 酸組成についての分析を行った。顕著な量のＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４が存在してい ない場合、キメラ遺伝子である３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔ ｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／Ｎｏｓ　３’の発現のレベルがリジン蓄積のレベルを決定 していた（表６）。株５６４−２１Ａ、４７Ａ、および、３９Ｃを比較すると、 いずれのものも顕著な量のＡＫＴｌｌ−Ｍ４を発現していない。株５６４−２１ Ａは、より低いレベルの大腸菌ＤＨＤＰＳを発現する株５６４−４７Ａと比較す ると約１０倍高いレベルのりシンを蓄積しており、かつ、大腸菌Ｄ　ＨＤ　Ｐ　 Ｓを発現しない５６４−３９Ｃと比較すると４０倍高いレベルのりシンを蓄積し ている。しかしながら、すべて類似した値の大腸菌Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓを発現する 形質転換体（５６４−１８Ａ、５６Ａ、３６Ｅ、５５Ｂ、４７Ａ）においては、 キメラ遺伝子である３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔｓ／］ｙｓ Ｃ−Ｍ４／Ｎｏｓ　３’　の発現ノＬｚヘルカ’）　シン蓄’ｆｆｉのレベルを 調節していた。従って、３５Ｓ　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔｓ／Ｉ ｙｓＣ−Ｍ４／Ｎｏｓ　３’（７）発現ハ、単独テ発現される際には、葉の遊離 アミノ酸レベルに何の影響も及ぼさないが（実施例７を参照せよ）、３５Ｓ　プ ロモーター／　Ｃａ　ｂ　リーダー／。ｔ８／ｅ６゜ｄａｐＡ／Ｎｏｓ　３“　 キメラ遺伝子と一緒に発現される際にはりシン蓄積を増大させることがあるとい うことは自明である。これらの遺伝子が一緒に発現されても、葉における任意の 他の遊離アミノ酸の１ノベルには影響を与えなかった。
５６＜−２ユ入　１ニア　５７　Ｓ？　０．＜９　２．４　＋本番　十／−５６ ４−１８＾　９９　５６　６ｅ　Ｏ，５７ｉ、！　＋＋　今÷５６＜−５６＃、 　＋、ｏ＜　５８　５８　０．５６　１．５　−＋＋　＋＋５６４−３６三　８ ５　１つ　−７０２０ユ　５　＋＋　＋＋＋５６４−４７Ａ　１８　１　＜、ｓ 　Ｏ，０６０，６＋＋遊離アミノ酸は、自己授粉させた植物に由来する成熟した 種子から抽出し、さらに、実施例８において記載したように定量化した。葉にお いてより最高の遊離リジン蓄積を示す植物、つまり、植物５６４−１８Ａ。
５６４−２１Ａ、５６４−３６Ｅ、５４６−５６Ａからのものと比較した場合、 形質転換させなかった植物からの種子のアミノ酸組成には顕著な差異が存在しな かった。
キメラな遺伝子カセットであるファセオリン　プロモーター／　ｃ　ｔ　ｓ／ｅ ｃｏｄａｐＡ／ファセオリン　３′領域、および、ファセオリンプロモーター／ 　ｃ　ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ファセオリン　３°　（実施例６）を 、二成分性ベクターｐＺＳ９７　（図３）内において結合させた。
この二成分性ベクターは実施例８において記載されている。これを行つために、 ファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／フアセオリン　３゛キメラ 遺伝子を２．７ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ断片として単離し、さらに、ベクターｐＵ ｃ１３１８［Ｋａｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ 　Ｒｅｓ、６：２７７８１のＨｉｎｄ　Ｉ１１部位に挿入してｐＢＴ５６８を取 得した。それにより、ｐＢＴ５６８をＢａｍＨＩで消化させ、さらに、２．７ｋ ｂ（７）ＢａｍＨ１断片上にキメラ遺伝子を単離することが可能であった。この 断片をＢａｍＨＴで消化させたｐＢＴ５４９　（実施例８）内に挿入してｐＢＴ ５７０を取得した。二〇二成分性ベクターは、同じ配向性で挿入されている両方 のキメラ遺伝子、ファセオリン　５°領域／ｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ／フアセオ リン　３゛遺伝子、および、ファセオリン　５゜領域／。ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ 　Ｃ−Ｍ４／ファセオリン　３゛を有している。
二成分性ベクターｐＢＴ５７０を、三親交配によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ ４４０４／ｐＡＬ４４０４に転移させ、このアグロバクテリウム形質転換体を使 用してタバコの音盤を接種し、さらに、結果として生じる形質転換植物を、実施 例７において記載されている方法により再生させた。
形質転換させた植物の種子内におけるキメラ遺伝子の発現についてアッセイを行 うために、この植物を開花させ、自己授粉させ、さらに、種子を実らせた。総た ん白質を成熟した種子から抽出し、さらに、実施例８において記載されているウ ェスタンプロットを介して分析した。
２５の形質転換体の内の２１がＤＨＤＰＳたん白質を発現し、かつ、これらの内 の１９はＡＫＩＩＩたん白質も発現した（表７）。発現されたたん白質の量は、 形質転換体内に存在する遺伝子コピーの数に関連しており、最高発現を示す株で ある５７０−４Ｂ、５７０−１２Ｃ，５７０−５９Ｂ、および、５７０−２３Ｂ は、カナマイシン標識遺伝子の隔離に基づくところによると、すべてが、２つも しくはそれを上回る数の遺伝子カセットの挿入部位を有していた。酵素学的に活 性な大腸菌のＤＨＤＰＳは、たん白質が検出されているテスト済みの株すべての の成熟した種子内において観察された。
種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を成熟した種子から抽 出し、さらに、実施例８において記載されているように分析した。Ｄ　ＨＤ　Ｐ 　ＳとＡＫＩＩＩたん白質の両方をより高いレベルで発現する形質転換体と、よ り高いれべるの遊離リシンおよびスレオニンを有するものとの間には良好な相関 が存在した。最高の発現を行う株（表７において星印がつけである）は、種子内 において、２倍までの遊離リシンレベルの増加および４倍までの遊離スレオニン レベルの増加を示した。
最高の発現を示す株においては、高レベルのα−アミノアジピン酸を検出するこ とが可能であった。この化合物は、穀類の種子におけるリジンの異化の中間体で あることが知られているが、その蓄積レベルが低いため通常では放射性トレーサ ー実験を介してのみ検出される。高レベルのこの中間体の形成は、大量のりシン がこれらの形質転換させた株の種子内において産生され、かつ、異化回路を通過 していることを示している。α−アミノアジピン酸の形成は、種子内において、 大腸菌のＤＨＤＰＳのみ、もしくは、ＡＫＩ　Ｉ　Ｉ−Ｍ４のみを発現する形質 転換体内では観察されなかった。これらの結果は、高レベルの遊離リジンを産生 ずるためには両方の酵素を同時に発現することが必要であるということを示して いる。
表７ ５７０−４Ｂ　Ｏ，３１２，６０，３４０，６４＋＋＋　〒＋　１５．１５１０ −ＶＣＯ，３９２，、ｌ　Ｏ，３４Ｃ，６４丁−−５７０−εａＯ，２９２，１ ０，３４Ｇ、Ｅ３＋−５７０−１２二＋　０６　５　二　〇　三　〇　６ｅ　Ｏ 十−轟　み−祷〒　＞　４．３−　＞ｉｓ：１５７０−ＸＥＡＣユ３３００二Ｓ Ｏε５〒＋　４＋　１５＋１Ｓ’１Ｇ−３７＾　Ｃ，３：１　２４　０．３４　 ０．６４　よ／−＋／−５７Ｃ−巳−己　〇二２１．５　０，２３０．４４−　 −５７０−５ＳＳ’　０．＜６　３．ＯＱ　二５　０．ＥＡ　＋＋＝　ｗ＋＋　 ２．６　＞ｉｓ：！５７０−１！Ａ　Ｏ，２己２３０３−□　０６７＋シ　−〒 　３１５つＧ−：ＩＣ；　０．４□　２．３　０，２５０．６７マー　−５ｊＧ −２３ｕ’　０．＜０３．６０３べ　０ε５〒〒−峰÷今　３．１　６３上Ｓ’ １Ｃ−２５：′１　０　コ０　２．３　Ｇ、３５　０．６６　壽−◆ｌ−５フ０ −２５人　”５　２．５　０．３＜　０　６３　＋−Ｔ　↑〒　３１５７０−３ ３六−ｉ　Ｃ，２Ｓ　２．ＣＯ二４　０６４　辛＋　＋◆　３　ユ５７Ｃ−３５ ；、−３０，３３：、６　０．２Ｓ　Ｃ，Ｃ３−−５）Ｏ−＜２）　り　２１　 ２．５　０．３＜　Ｏε２　−よ　十′３１５７Ｇ−見５、　０．６０　ｘ、＝ 　Ｇニジ　０６４　◆−＋＋３１１α−アミノアンピノ酸を有する遊離アミノ酸 すノプルを示す。
実施例１３ タバコの形質転換体のための選択可能な遺伝標識としてのｃｔｓ／ＩｙｓＣ−Ｍ ４キメラ遺伝子の用途 二成分性ベクターｐＺＳ９７Ｋ　（ｐＢＴ５４２、実施例７を参照せよ）内の３ ５３　プロモーター／Ｃａｂ　リーダー／ｃｔｓ／］ｙｓＣ−Ｍｓ／Ｎｏｓ　３ ’　キメラ遺伝子を、タバコの形質転換のための選択可能な遺伝子標識として使 用した。高濃度のりシン　プラス　スレオニンは、タバコの音盤からの新芽の生 育を阻害する。活性を有するリジンおよびスレオニン非感受性ＡＫＩＩＩ−Ｍ４ の発現は、この生育阻害を逆行さぜる（実施例７を参照せよ）。
二成分性ベクターｐＢＴ５４２を、二親交配によりアグロバクテリウム株ＬＢＡ ４４０４／ｐＡＬ４４０４に転移させ、このアグロバクテリウム形質転換体を使 用してタバコの音盤を接種し、さらに、結果として得られる形質転換させた新芽 を、３ｍＭのりシン　プラス　３ｍＭのスレオニンを含む新芽発育用培地上で選 択した。新芽を、３ｍＭリシンプラス　３ｍＭスレオニンを含む根発育用の培地 に移した。植物を、根が出た発芽から生育させた。この植物からの音盤を、３ｍ Ｍのりシンプラス　３ｍＭのスレオニンを含む新芽発育用培地内に入れた。形質 転換させた植物は、この培地上において音盤の周囲で発生した新芽の急増により 同定した。
実施例１４ ３５Ｓ　プロモーター／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡキメラ遺伝子でのタバ／Ｎｏｓ 　３°キメラ遺伝子を３．０ｋｂのＢａｍＨｌ−３ａｌ　Ｉ断片として単離し、 さらに、ＢａｍＨＩ−’Ｓａｔ　Ｉで消化した二成分性ベクターｐＺＳ９７Ｋ（ 図２）内に挿入してプラスミドｐＦＳ８５２を取得した。この二成分性ベクター は、実施例７において記載しである。
キメラなｃｏｒｄａｐＡ遺伝子を含むこの二成分性ベクターを、二親交配により アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４に転移させ、このアグロ バクテリウム形質転換体を使用してタバコの音盤を接種し、さらに、結果として 得られる形質転換植物を、実施例７において示した方法により再生させた。
形質転換させた植物の葉におけるキメラ遺伝子の発現についてのアッセイを行う ために、たん白質を、以下の改変を伴いつつ、実施例７において記載したように 抽出した。−次硫酸アンモニア沈殿からの上清的１８ｍＬを、追加的な１．２ｍ Ｌの飽和冷却硫酸アンモニウムと混合した。
この混合物を水上に３０分間放置し、実施例７において記載したように遠心処理 を施した。上清をデカンテーノヨンし、ＤＨＤＰＳたん白質を含んでいるペレッ トを１　ｍ　ＬのＴＮＥ中に再懸濁させ、さらに、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ Ｍカラム（Ｃｏｌｕｍｎ　ＰＤ−１０、Ｐａｒｍａｃｉａ社）を通すことにより 脱塩させた。
この葉抽出物を、実施例４において記載されているように、Ｄ　ＨＤ　ＰＳたん 白質および酵素活性についてアッセイした。コリネバクテリアのＤＨＤＰＳ酵素 活性は、その酵素がリシン阻害に対して非感受性であることによりタバコのＩ） 　ｌ−Ｉ　Ｄ　Ｐ　Ｓと識別することができる。１１の形質転換体の内の８つが 、ウェスタンプロットを介して検出されるたん白質として、および、活性な酵素 としての両方で、コリネバクテリアのＤＨＤＰＳ発現を示した。
遊離アミノ酸は、実施例７において記載されているように葉から抽出した。コリ ネバクテリアのＤＨＤＰＳの発現の結果、葉における遊離リジンのレベルが大き く増加したく表８）。しかしながら、ＤＨＤＰＳの発現レベルと遊離リシン蓄積 の量との間には良好な相関が存在しなかった。形質転換しなかったタバコよりも ２から５０倍高い遊離リジンレベルが観察された。高レベルの遊離リンノを示す 株における葉の総リシンのレベルも、２から２．５倍増加した。
標準　０５　０Ｂ ｒｓｓａ６−２ｘ　１．０　０．８ ｒｓｓｅ６−４人　〇、９　０．８　６．１ＦＳＳ８６−１１！ｌ　３．６　０ ．８　３．４ｒｓｓＢ６−１１０　２６　２．０　３．５ｒｓ５Ｂ６−１３Ａ　 ２．＜　０．８　３−５ＦＳＳ８６−１９こ二５ユｏ、ｓ３．４ＦＳＳ［１６− ２２３＞ｉｓ　１．５　２．３ＦＳ５ａｇ−３０ヨ　Ｏ，ａ　− ＦＳ５Ｂ６−３６Ｂ　１８　１．５　＝＋　３　９ｒｓｓθ６−５１Ａ　１．３ ．　０．１１ｒｓｓＢ６−５ａｃ　１．２　０Ｊ　５．１これらの植物を開花さ せ、自己授粉させ、さらに、種子を実らせた。
成熟した種子を収穫し、さらに、実施例８において記載したように遊離アミノ酸 組成についてのアッセイを行った。形質転換させなかったタバコの種子と比較し て、形質転換体の遊離リシン組成には差異は存在しなＫＴｒ３　プロモーター／ ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ、もしくは、ファセオリン　プロモーター／ｃｔｓ／ｃ ｏｒｄａｐＡ　プラス　ファセオリン　プロモーター／ｃ　ｔ　ｓ／　］　ｙ　 ｓ　Ｃ−Ｍ４キメラ遺伝子でのタバコの形質転換 キメラな遺伝子カセツトである、Ｋ”ｒｒ３　５’　領域／　ｃ　ｔ　ｓ　／　 ｃ　。
領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファセオリン　３′領域とファセオリンの５′ 領域／　ｃ　ｔ　ｓ／　ｌ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ファセオリンの３゛領域（実施 例６）を、二成分性ベクターｐＺＳ９７　（図３）内で結合させた。この二成分 性ベクターは、実施例８において記載されている。
これを行うために、ＫＴｒ３　５°領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／に、Ｔｌ３ ３°領域遺伝子カセントを３．３ｋｂのＢａｍＨＩ断片として単離し、さらに、 ＢａｍＨＩで消化したｐＢＴ５４９　（実施例８）内に挿入してｐＦ５８８３を 取得した。この二成分性ベクターは、反対の配向性で挿入した、キメラ遺伝子で あるＫＴＩ３　５’領域／　（ｔ　ｓファセオリン　５゛領域／ｃ　ｔ　ｓ／ｃ ｏｒｄａｐＡ／ファセオリン３′領域のキメラ遺伝子カセツトを、オリゴヌクレ オチドアダプターを使用して改変させて、各末端に存在するＨｉｎｄｌｌＩ部位 をＢａｍＨＩ部位へと変換した。この遺伝子かセットをその後２．７ｋｂのＢａ ｍＨＩ断片として単離し、さらに、ＢａｍＨＩ自消化したｐＢＴ５４９（実施例 ８）内に挿入してｐＦｓ９０３を取得した。この二成分性ベクターは、同じ配向 性で挿入されているフ７セオリン　５′領域／両方を有している。
二成分性ベクターｐＦＳ８８３及びｐＦｓ９０３を、三親交配により、アグロバ クテリウム株ＬＡＢ４４０４／ｐＡＬ４４０４に転移させ、このアグロバクテリ ウム形質転換体を使用してタバコの音盤を接種し、さらに、結果として得られる 形質転換植物を、実施例７において示した方法により再生させた。
形質転換させた植物の種子内におけるキメラ遺伝子の発現についてアッセイを行 うために、この植物を開花させ、自己授粉させ、さらに、種子を実らせた。総た ん白質を成熟した種子から抽出し、さらに、実施例８において記載されているウ ェスタンプロットを介して分析した。
テストした２２の形質転換体の内の２１がＤＨＤＰＳたん白質を発現し、さらに 、これらの内の１８はＡＫＩＩＩたん白質も発現した（表８）。
酵素学的に活性であるコリネバクテリアのＤＨＤＰＳは、一つを除き、たん白質 が検出されたテスト済みの株すべての成熟した種子内において観察された。
これらの種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を成熟した種 子から抽出し、さらに、実施例８−において記載したように分析シタ。ＤＨＤＰ ＳおよびＡＫＩＩＩたん白質の両方をより高いレベルで発現する形質転換体と、 より高いレベルの遊離リジン及びスレオユアヲ有スルものとの間には良好な相関 が存在した。最高発現を行う株（ま、ｍ子内１：おいて、３倍までの遊離リシン レベルの増加、および、８倍までのａｍスレオニンレベルの増加を示した。実施 例１２において示されているように、リシンの異化を暗示する高いレベルのα− アミノアジピン酸が形質転換させた株の内の多くのものにおいて観察された（表 ９において星印により示しである）。遊離アミノ酸組成もしくはたん白質発現ル ベルにおいて、コリネバクテリアのＤＨＤＰＳ遺伝子の発現を駆動すせるＫＴＩ ３あるいはファセオリンの調節配列を有する形質転換体間には主な差異は存在し なかった。
標　１’Ｉ　Ｏ，５Ｌ３　−　− ｒＳＢａ３−４Ａ　Ｏ，９４，０”　”　＞１５４Ｆ’５ａｌ１３−］ＩＡ１． ０３．５’＋＋＋３．１３＋１ｒｓａε３−１４Ｂ　Ｏ，５２，５＋＋　、＋＋ ７５８８３−１６へ・　０，７　１０．５　ゆ　←崎　０ｒｓａａ３−１７Ａ＋ 　１０５．０　４４−１　４４４　７．０ｒＳＢＢ３−ＩＢＣ−１，２３，５− ’　４　５．８　３＋１ｒｓａａ：１−２１Ａ　Ｏ，５１，５４＋／−ＦＳ８８ ３−２６３−　】、１　３　６　＋＋　十イ　２４ｒｓＢ［１３−２９ＢＣ，５ １，５＝−０，４Ｆ’Ｍ３−３２ＢＯ，１２，４＋４　＋　１５　３１ｒｓｇａ ３−３８Ｂ＋　１．１　１１．３　＋　４４　２．０７５８８３−５９Ｃ！　１ ．４　６．１　＋　÷　０．５　１５＋１ｒｓ９０３−３ＣＯ，５１，８＋　＋ ＋＋ｒｓ９０３Ｊ八”　０．８　２．）　＋＋〒　十◆十峰ｒ５９０３−９３　 ０．６　１．８　＋→　＋＋　４．３ｒ５９０３−１０人　０．５　１．５　− 　−ｒＳ９０３−２２ｒ　０．５　１Ｊ　＋−，＋＋　０．ｇ７５９０３−３５ ニー０．２２１よ一２４＋Ｆ５ＳＯ３−３５Ｂ　Ｇ、７　２．５　＝　−ｒ５９ ０］−’ｉｌＡ”　１．２　２．０　＋＋　＋＋＋ｒｓ９０３（２人　Ｏｊ　２ ．２　＋４　４＋÷　５４７５９０３−１０　０．５　＋、９ ７５９０３−５３Ｂ　０．６　１．’１−α−アミノアンピン酸を有する遊離ア ミノ酸サンプルを示す。
遊離アミノ酸組成、および、細菌のＤＨＤＰＳおよびＡＫＩＩＩたん白質の発現 を、単独の遺伝子カセット挿入断片として隔離されている２つの株の発達中の種 子内においても分析した（表１０を参照せよ）。ＫＴＩ３プロモーターの調節下 にあるＤＨＤＰＳたん白質の発現は、予測されたように、ファセオリン　プロモ ーターの調節下にあるＡＫＩＩＩたん白質の場合と比較してより早い時期に検出 された。開花後１４日目に、両方のたん白質が高いレベルで発現され、かつ、通 常の種子と比較して、約８倍の遊離リシンレベルの増加が存在した。これらの結 果により、リジン非感受性ＤＨＤＰＳとりシン非感受性ＡＫの同時発現の結果、 種子内における高レベルの遊離リジンの産生が生じたことが立証される。
しかしながら、遊離リジンは、一層高いレベルにまで蓄積し続けるの訳ではない 。成熟した種子内においては、遊離リシンは、正常な成熟した種子内におけるも のの２−３倍高いレベルであり、リジンの分解産物であるα−アミノアジピン酸 が蓄積する。これらの結果は、リシンの異化が種子内において起こり、リシン非 感受性ＤＨＤＰ、Ｓおよびリジン非感受性ＡＫを発現する形質転換体内において 産生される高レベルの遊離リジンの蓄積を回避させるというさらに別の証拠を提 供する。
ｒｓ８Ｅ３−】８Ｃ９ｉ、１　２．１　−　−ｒＳ８８３−１ａＣ１０ユ＜３． ３”／−−ｒＳＩＩＢ３−１［ＩＣ＋、４　２．５　÷　−ｒｓａａ３−ｕＣｌ ＜　４．：ｌ　１．Ｏ＋＋　”＋＋ｒｓｓａ３−１ｓｃ”　Ｆ＆　Ｑ　１．２　 コＪ　〒＋＊　＋＋７５１１８３−３２Ｂ　９　”　”９　〒　−Ｆ’５ａＢ３ −３２：ｌ　１０　１．Ｇ　２ｊ　＋　−ＦＳＢＢ３−３２ヨｌｉ１．＜２３〒 −ＦＳｌ１６３−３２Ｅｌ−１４３，９１，３＋−−呼ｒｓＢＦ！３−３２シ　 成熟　０り　２鴫　＋ふ＋　＋＋′ａ−アミノアジピン酸を有する遊離アミノ酸 サンプルを示す。
リン　プロモーター／ｃｔｓ／ｌｙｓｃ−Ｍ４キメラ遺伝子でのカノーラ（Ｃａ ｎｏｌａ）の形質転換 キメラな遺伝子カセットである、ファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／リン　５′ 領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／フアセオリン３′　領域リンの３゛領域（実施 例６）を、実施例８において記載されているｐＺＳ９７Ｋに類似する二成分性ベ クターｐＺｓ１９９　（図４）内に挿入した。ｐＺｓ１９９においては、カリフ ラワーモザイクウィルスからの３５８　プロモーターがＮＰＴＩＩの３′発現を 駆動させていたｎｏｓプロモーターと置き換わって標識遺伝子のより良い発現を 提供しており、さらに、多重制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリリンカーの ３゛配向性が逆になっていた。
ファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／フアセオリン３′領域を挿 入するために、この遺伝子カセットを２．７ｋｂ（７）ＢａｍＨＩ断片として（ 実施例１５において記載されている）単離し、さらに、ＢａｍＨ１で消化させた ｐＺｓ１９９内に挿入してプラスミドｐＦＳ９２６を取得した。二〇二成分性ベ クターは、３５Ｓ／ＮＰＴ　１１／ｎｏｓ　３’標識遺伝子と同じ配向性で挿入 されているキメラ遺伝子、ファセオリン　５′領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ フアセオリン３°領域を有している。
ファセオリン　５゛領域／ｃ　ｔ　ｓ／　ｌ　ｙ　ｓＣ−Ｍ４／ファセオリン３ °領域を挿入するために、この遺伝子カセットを３．３ｋｂのＥｃ。
Ｒ１からＳｐｅ　Ｉまでの断片として単離し、さらに、ＥｃｏＲＩプラス　Ｘｂ ａ　Ｉで消化させたｐＺｓ１９９内に挿入してプラスミドｐＦＳ５９３を取得し た。この二成分性ベクターは、３５Ｓ／ＮＰＴＩＴ／ｎｏｓ　３°標識遺伝子と 同じ配向性で挿入されているキメラリンの３°領域を有している。
この２つのカセットを接続するために、ｐＢＴ５９３のＥｃｏＲＩ部位を、オリ ゴヌクレオチドアダプターを使用して、ＢａｍＨ１部位に変換させ、結果として 得られたベクターをＢａｍＨＩで切断し、さらに、ファセオリン　５゛領域／ｃ ｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／フアセオリンの　゛領域遺伝子カセットを２．７ｋｂの ＢａｍＨＩ断片として単離、挿入を行ってｐＢＴ５９７を取得した。この二成分 性ベクターは、３５Ｓ／ＮＰＴ　ＩＩ／ｎｏｓ　３°標識遺伝子と同じ配向性で 挿入されているキメラ遺伝子、ファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／ｃｏｒｄａｌ Δ／フアセオリン　３゛領域、および、ファセオリン　５°領域／Ｃｔ　ｓ／　 ｌ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ファセオリン　３°領域の両方を有している。
ブラシカ　ナーブス（Ｂｒａｓｓ　ｉｃａ　ｎａｐｕｓ）品種の［ウエスタ＝（ Ｗｅｓｔａｒ）Ｊを、適切な二成分性ベクターを保持している無力化させである アグロバクテリウム　ツメファキエンス株ＬＢＡ４４０４との苗木片の共培養に より形質転換させた。
Ｂ、　ナーブスの種子を、１０％のＣｂｌｏｒｏｘ、０．１％のＳＤＳ中で３０ 分間かくはんすることにより滅菌し、さらにその後、滅菌蒸留水で完全にすすい だ。この種子を、３０ｍＭのＣａＣＩｚ、および、１．５％のアガロースを含む 滅菌培地に接種し、さらに、２４°Ｃの暗所において６日間育成した。
植物の形質転換のためにアグロバクテリウムの液体培養物を、１００ｍＬのカナ マイノンを含むＭｉｎｉｍａｌ　Ａ培地中において、２８°Ｃて一晩育成した。
細菌細胞を遠心処理によりペレット化させ、さらに、１００μＭのアセトシリン ボン（ａｃｅｔｏｓｙｒ　ｉｎｇｏｎｅ）を含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　 Ｓｋｏｏｇ社のＭｉｎｉｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ液体培地中において、１０６細 胞７ｍＬの濃度において再懸濁させることにより再生させた。
Ｂ、ナーブスの苗木の胚軸を５ｍｍの断片に切り刻み、これを直ちに細菌懸濁液 中に入れた。３０分後、この胚軸片を細菌懸濁液から取り出し、１０ｇＭのアセ トシリンボンを含むＢＣ−３５細胞培地中に入れた。植物組織およびアゲロバク チリアを、薄暗い光りの中、２４℃において３日間共培養した。
この胚軸片を、アグロバクテリウムを殺すための２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリ ン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、および、形質転換させた植物細胞の生育に ついて選択するための２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＢＣ−３５細胞用培地 へと転移させることにより、この共培養を終了させた。この苗木片を、継続的な 光の下、２４℃において３週間、この培地上でインキュベートした。
３週間後、この断片を、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび２５ｍｇ／Ｌの カナマイシンを含むＢ５−４８再生培地に転移させた。植物組織を、細胞用培地 について記載した同一の培養条件下において、新鮮な選択的再生培地で２週間毎 にサブカルチャーを行った。形質転換させたと仮定する細胞は、再生培地上で迅 速に生育し、ｃａｌｌｉが約２ｍｍの直径に達した際、それらを胚軸片から取り 外し、カナマイシンを入れていない同じ培地に入れた。
苗条は、Ｂ５−４８再生培地に転移させた後数週間以内に出現し始めた。その苗 条が識別可能な茎を形成すると直ちにそれらをｃａｌｌｉから切り取り、ＭＳＶ 、−ＩＡ伸長用培地に転移させ、さらに、２４℃における１６：８−ｈの光周期 下に移した。
いったん苗条が幾つかの箱間を伸ばしたら、それらの苗条をアガロース表面上で 切断し、さらに、その切断末端をＲｏｏｔｏｎｅ中に浸した。
処理を施した苗条を湿潤させたＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ　３５０ソイレス鉢植え用培 地中に直接植え付けた。この鉢をビニール袋で覆い、この袋を、約１０日後に植 物が明らかに成長した際に取り外した。形質転換の結果を表１１に示した。形質 転換させた植物は、各二成分性ベクターを使用して取得した。
植物を、日中の温度を２３°Ｃに、かつ、夜間の温度を１７℃させである１６’ ＋８−ｈの光周期下で生育させた。最初の開花用の茎が伸び始めてきたら、その 茎を花粉封じ込め用のメツシュの袋で覆って異系統交配を妨げた。その植物を毎 日数回揺することにより自己授粉を容易にさせた。自己授粉に由来する成熟した 種子を、植え付は後約３カ月で収穫した。
Ｍｉｎｉｍａｌ　Ａ　細菌増殖用培地 蒸留水に溶解せよ １０．５ｇの硫酸カリウム、二塩基酸 ４．５ｇの硫酸カリウム、−塩基酸 １．０ｇの硫酸アンモニウム ０．５ｇの酢酸ナトリウム、ジヒドロ酸塩蒸留水で９７９ｍＬに用量をあわせよ オートクレーブ処理にかけよ ２０ｍＬのフィルター滅菌済み１０％ンヨ糖を添加せよ１ｍＬのフィルター滅菌 済み１ＭＭｇ５○４を添加せよりｒａｓｓｉｃａ　Ｃａ１ｌｕｓ　培地ＢＣ−３ ５Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ 　Ｍｅｄｉｕｍ （ＭＳ塩、１００ｍｇ／Ｌ　ｉ−イノシトール、０．４ｍｇ／Ｌ　チアミン：Ｇ ＩＢＣＯ＃５１０−３１１８）３０ｇのショ糖 １８ｇのマニトール ０．５ｍｇ／Ｌの２．４−Ｄ ０．３ｍｇ／Ｌのキネチン ０、　６％のアガロース Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　 Ｍｅｄｉｕｍ Ｇａｍｂｏｒｇ　Ｂ５　ビタミン類（ＳＩＧＭＡ　＃１１０１９）Ｌｏのグルコ ース ２５ｏｍｇのキシロース ６００ｍｇｃ）ＭＥＳ ０．４％のアガロース ｐＨ５，７ フィルター滅菌を行い、さらに、オートクレーブ処理後に添加せよ２．０ｍｇ／ Ｌのゼアチン ０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡ Ｂｒａｓｓｉｃａ苗条伸長用培地ＭＳＶ−ＩＡＭｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓ ｋｏｏｇ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄｉｕｍ Ｇａｍｂｏｒｇ　Ｂ５　ビタミン類 １０ｇのグルコース ０．６％のアガロース カローラの形質転換体 二成分性　ＫＡＮ”　発芽している ベクター　切断末端数　カルス数　カルス数　種物数ｐＺｓ１９９　１２０　４ １　５　２ ｐＦＳ９２６　６００　２７８　５２　２８ｐＢＴ５９３　６００　７０　１０ 　３ｐＢＴ５９７　６００　２２３　４０　２３実施例１７ 選択可能標識としてのキメラなＩｙｓＣ−Ｍ４遺伝子を使用するトウモロコシの 形質転換 胚発生性カルスの培養を、「タイプ　ＴＩカルス」組織培養反応を得るために改 良したトウモロコシ株の穀粒から切取った成熟した胚（約１゜０から１．５ｍｍ ）から開始させた。授粉後１０から１２日にこの胚を切り開き、軸のある側を下 にして、アガロースで固化させである、０゜５ｍｇ／Ｌ　２．４−Ｄを補足した ＮＧ培地［Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ。
（１９７４）　Ｓｃｉ　Ｓｉｎ　１８：６５９−６６８］　（Ｎ６−０５）中に 入れた。この胚を２７℃の暗所に放置した。懸垂型構造上についた、体細胞性前 胚および体細胞性胚の未分化な細胞塊からなるもろい胚発生性カルスが、成熟し た胚の胚盤から増殖してきた。個々の胚がら単離されたクローン性胚発生性カル スを同定し、さらに、２から３週間ごとにＮ６−０．５培地上でサブクローン化 させた。
粒子衝撃法を使用して遺伝子をカルス培養細胞に転移させた。旧。
１ｉｓｔｉｃ、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（ＢｉｏＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ、ＨｅｒｃｕｌｅｓｌＣＡ）を、これらの実験のために使用した。
トウモロコシにおける構成的遺伝子発現のために設計されたキメラ遺伝子、ＨＨ ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／］ｙｓＣ−Ｍ４／ＨＨ２−１３゛領域（実施例６を 参照せよ）を含むプラスミドｐＢＴ５７３を、金粒子の表面上に沈着させた。こ れを行うために、２．５μｇ（７）ｐＢＴ５７３（水中におけるａ度約１ｍｇ／ ｍＬ）を、水中に懸濁しである２５ｍＬの金粒子（平均直径１．５μｍ）（ｍＬ 当たり金６０ｍｇ）に対して添加した。その後、試験管をポルテックスミキサー にかけながら、塩化カルシウム（２５ｍＬの２．５Ｍ溶液）およびスペルミジン （１０ｍＬの１．０Ｍ溶液）を金−ＤＮＡ懸濁液に添加した。この金粒子をマイ クロフユージ内で１０分間遠心処理にかけ、上清を除去した。その後、この金粒 子を２００ｍＬの絶対エタノール中に再懸濁さ也再度遠心処理にかけ、さらに、 上清を除去した。最後に、その金粒子を２５μＬの絶対エタノール中に再懸濁さ せ、さらに、１秒間で２度の超音波処理を施した。５μＬのＤＮＡ被覆化金粒子 をその後、各々のマクロ担体盤上に乗せ、エタノールを揮発させて、その盤上に 乾燥したＤＮＡ被覆化金粒子を残存させた。
胚発生性カルス（＃１３２．２．２と表示されるカルス株より取得した）を、０ ．２５Ｍのソルビトールおよび０．２５Ｍのマニトールを補足しであるＮ６−０ ．５培地を含む１０１００Ｘ２０のベトリ皿の中心の直径約５ｃｒｎの円形領域 内に並べた。この組織を、前処理として、衝撃を行う前に２時間この培地中に入 れておき、かつ、衝撃処理中にお（、でもこの培地中に残存させた。２時間の前 処理期間の最後に、組織を含むベトリ皿をＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバー 内に入れた。このチャンバー内の空気をその後吸引して２８インチＨｇの真空状 態にした。ショック用試験管内の１−１ｅ圧が１１．００ｐｓｉに達した際に破 裂する破裂用膜を使用するヘリット（ｈｅｌｉｔ）ショック波でマクロ担体を加 速させた。この組織を、停止用スクリーンから約ｇｃｍのところに置いた。
組織の入っている４つのプレートを、ＤＮＡ被覆化金粒子で衝撃した。
砲撃後直ちに、カルス組織を、ソルビトールもしくはマニトールを補足していな いＮ６−０．５培地に移した。
衝撃後７日目に、カルス組織の小さな塊（直径２−４　ｍｍ）を、カゼインもし くはプロリンは含まないがリンノおよびスレオニンを各２ｍＭ補足しである（Ｌ Ｔ）Ｎ６−０．５培地に移した。この組織はこの培地上でゆっくりと生育し続け 、さらにこれを、ＬＴを補足した新鮮なＢ６−〇、５培地に２週間ごとに移した 。１２週間後、活発に生育しているカルスの内の２つのクローンを、ＬＴ補足化 培地を含む２つの別々のプレート上で同定した。これらのクローンを選択的培地 上で継代培養したところ、生育し続けた。選択されたクローン内における］ｙｓ Ｃ−Ｍ４遺伝子の存在をＰＣＲ分析により立証した。カルスを植物の再生を促進 させる培地に移した。
実施例１８ 構成的トウモロコシ　プロモーター／　ｃ　ｔ　ｓ　／　ｅ　ｃ　ｏ　ｄ　ａ　 ｐ　Ａおよヒ構造的トウモロコシ　プロモーター／ｃ　ｔ　ｓ／Ｌｙ　ｓ　Ｃ− Ｍ４でのトウモロコシの形質転換 キメラ遺伝子カセントである、ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ｅｃｏｄａｐＡ ／ＨＨ２−１３’領域　プラス　ＨＨ５３４５’領域／ｍｃｔｓ／ＬｙｓＣ−Ｍ ４／ＨＨ２−１３’領域（実施例６）をベクターｐＧｅｍ９ｚ内に挿入してトウ モロコンの形質転換用ベクターを作製した。プラスミドｐＢＴ５８３　（実施例 ６）をＳａｌ　１で消化し、さらに、ＨＨ５３４５°領域／ｍｃｔｓ／ｅｃｏｄ ａｐＡ／ＨＨ２−１３°領域遺伝子カセツトを含む１８５０ｂｐの断片を単離し た。このＤＮＡ断片を、Ｘｈｏ　Ｉで消化した、ＨＨ５３４５’領域／ｍｅｔｓ ／ＬｙｓＣ−Ｍ４／ＨＨ２−１３’領域を保持しているｐＢＴ５７３（実施例６ ）中に挿入した。
ベクターｐ　Ｂｒ３８６を、粒子衝撃法を使用して胚発生性トウモロコシカルス 組織内に取り込ませた。結果として生じるベクターは同じ配向性で両方のキメラ 遺伝子を有しており、これをｐ　Ｂｒ３８６と表示した。
ベクターｐＢＴ５８６を、粒子衝撃法を使用し、胚発生性トウモロコンカルス組 織内に取り込ませた。胚発生性カルス培養物の確立および粒子衝撃のためのパラ メーターは、実施例１３に記載されているものであった。
選択的標識を含む２つのプラスミドの内のいずれが一つを形質転換に使用した。
一つのプラスミド、ｐＡＬＳＬＵＳ［Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａ］、　（１９９０） 　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ　８：８３３−８３９コは、トウモロコシのアセ ト乳酸シンターゼ（’Ａ　Ｌ　Ｓ　）遺伝子のｃ　ＤＮＡを含んでいた。ＡＬＳ のｃＤＮＡを、この遺伝子によりコードされている酵素がクロルスルフロン（ｃ ｈｏｌｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）に対して耐性になるようにインビトロにおいて突然 変異させた。このプラスミドもやはり、ホタルのルシフェラーゼのコーディング 領域を発現させるために、カリフラワーモザイクウィルスからの３５３プロモー ターおよびツバリン　シンターゼのｃ　ＤＮＡ　３’領域を使用する遺伝子を含 んでいる［ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ Ｉ　Ｂｉｏｌ、　７＋７２５　７３７１゜他のプラスミド、ｐＤＥＴＲｒｃは、 除草剤であるグルフォシネート（ｇｌｕｆｏｓ　１ｎａｔｅ）に対する耐性を付 与するストレプトマイセス　ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈ ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）からのｂａｒ遺伝子を含んでいた［Ｔｏｍｐｓｏｎ 　’ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　６：２５ １９−２５２３１．この細菌性遺伝子は、植物内における適切な翻訳開始のため に、翻訳コドンがＧＴＧからＡＴＧへと変化させである［Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　ｅ ｔ　ａｌ（１９８７）　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　６：２５１３−２５ １８１゜このｂａｒ遺伝子はカリフラワーモザイクウィルスからの３５３　プロ モーターにより駆動され、かつ、アグロバクテリウム　ツメファキエンスからの オクトビン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ）シンターゼ遺伝子からの停止シグナルおよびポ リアデニル化シグナルを使用する。
衝撃のために、２５μｇの各プラスミド、つまり、ｐＢＴ５８６と２つの選択可 能標識プラスミドの内の一つを、実施例１３において記載したように金粒子の表 面上に共役沈殿させた。胚発生組織培養物の衝撃についても、やはり実施例１３ において記載されている。
衝撃の７日後、この組織を選択的培地に移した。選択可能標識ｐＡＬＳＬＵＣで 衝撃を与えた組織を、クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒａｎ）（３０ ｎｇ／Ｌ）を含み、かつ、カゼインもしくはプロリンを含んでいないＮ６−０． ５培地に移した。選択可能標識ｐＤＥＴＲＩＣで衝撃を与えた組織を、２ｍｇ／ Ｌのグルフォンネートを含み、がっ、カゼインもしくはプロリンを含んでいない Ｎ６−０．５培地に移した。この組織は、これらの選択的培地上でゆっくりと生 育し続けた。さらに２週間を経た後、組織を、選択的作用因子類を含む新鮮なＮ ６−０゜５培地に移した。
クロルスルフロン−およびグルフォシネートー耐性カルスクローンを、さらに６ −８週間を経た後に同定することができた。これらのクローンは選択的培地に移 した際、生育し続けた。
形質転換させたクローン内におけるｐＢＴ５８６の存在は、ＰＣＲ分析により実 証されている。取り込ませたＡＫ遺伝子の機能性は、形質転換させたクローンを 、リジンおよびスレオニンを各２ｍＭ含む（ＬＴ選択、実施例１３を参照せよ） Ｎ６−０．５培地のプレート上に植え付けることによりテストした。すべてのク ローンはＬＴ培地上で生育することが可能であり、これは、大腸菌のアスパラギ ン酸キナーゼが発現され、かつ、適切に機能していることを示している。大腸菌 のＤ　ＨＤ　Ｐ　Ｓ酵素が機能を有していることをテストするために、形質転換 させたカルスを、リジンのアナログでありかつ植物性Ｄ　ＨＤ　Ｐ　Ｓの有効な インヒビターである２−アミンエチルンスティン（ＡＥＣ）を２μｍ含むＮ６− ０．　５培地のプレート上にまいた。形質転換させたカルス組織はＡＥＣに対し て耐性であり、このことは、取り込まれているＤＨＤＰＳは植物性酵素と比較す るとＡＥＣに対して約１６倍感受性が低いものであり、これが産生され、かつ、 機能を有しているということを示している。植物を形質転換させた数種のクロー ンから再生し、成熟するまで生育中である。
キメラ遺伝子カセットであるファセオリン　５゛領域／ｃｔｓ／ｃ。
ダイズの形質転換用ベクターｐＢＴ６０３　（図５）内に挿入した。このベクタ ーは、改変させたｐＧＥＭ９ｚプラスミド内のＮｏｓ　３’領域と共に、大腸菌 のβ−グルクロニダーゼ遺伝子［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｅｔ　ａｌ、　（１９８６ ）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：８４４７−８４５１１の発現を駆動させるカリフラワ ーモザイクウィルスからの３５Ｓ　プロモーターからできているダイズの形質転 換用標識遺伝子を有している。
ファセオリン　５゛領域／ｃ　ｔ　ｓ／　Ｉ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ファセオリン ３゛領域を挿入するためにこの遺伝子カセットを３．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断 片として単離し、さらに、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化させたｐＢＴ６０３内に挿入 してプラスミドｐ［Ｔ６０９を取得した。この二成分性ベクターは、３５Ｓ／Ｇ ＵＳ／Ｎｏｓ　３’標識遺伝子とは反対の配向性で挿入されているキメラ遺伝子 、ファセオリン　５°領域／ｃｔｓ／　］　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ４／ｃ　ｔ　ｓ／　 ｌ　ｙ　ｓ　Ｃ−Ｍ’４／ファセオリン　３′領域を有している。
ファセオリン　５゛領域／ｃ　ｔｓ／ｃｏｒｄａｐＡ／ファセオリン３°領域を 挿入するためにこの遺伝子カセットを２．７ｋｂのＢａｍＨＩ断片として単離し 、さらに、ＢａｍＨＩで消化させたｐＢＴ６０９内に挿入してプラスミドｐＢＴ ６１４を取得した。この二成分性ベクターは、同じ配向性で挿入されているキメ ラ遺伝子、ファセオリン　５′領域の両方を有しており、さらに、この両方とも が３５Ｓ／ＧＵＳ／Ｎｏｓ　３°標識遺伝子とは反対の配向性になっている。
ダイズは、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　５゜０１５． ５８０において記載されている処理法に従って、プラスミドｐＢＴ６１４で形質 転換させた。ダイズの形質転換は、Ａｇｒａｃｅｔｕｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｍ ｉｄｄ　Ｉ　ｅ　ｔｏｎ、Ｗｌ）によッテ行われた。
リシンケトグルクール酸レダクターゼ（Ｌ　Ｋ　Ｒ：）酵素活性が、発達中のト ウモロコンの種子の未成熟な内胚乳内に観察された［Ａ　ｒ　ｒ　ｕ　ｄ　ａｅ ｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　６９・９８８−９ ８９１゜ＬＫＲ活性は内胚乳発生の開始時から急速に増加し、授粉後約２０発育 にピークレベルに達し、その後下降した［Ａｒｒｕｄａ　ｅｔ　ａｍ　（１９８ ３）　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２　：　２６８７−２６８９］　。
トウモロコンのＬＫＲ遺伝子をクローン化する目的で、ＲＮＡを授粉後１９日口 の発達中の種子から単離した。このＲＮＡをＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）に、ベクター　ラムダ −Ｚａｐ　ＩＩ内のｃＤＮＡライブラリーをあつらえで合成してもらうために送 付した。ラムダ−Ｚａｐ　ＩＩライブラリーをファゲミドライブラリー内へ、さ らにその後にプラスミドライブラリー内へと転換させる作業は、Ｃｌｏｎｔｅｃ ｈ社により提供されるプロトコールに従って行った。プラスミドライブラリー内 に一度転換させると、得たれたアンピシリン耐性クローンは、ベクターｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔのＳＫ　（−）内にｃＤＮＡ挿入断片を保持する。このｃＤＮＡ 断片の発現は、ベクター上の］ａｃＺプロモーターの調節下にある。
ラムダ−Ｚａｐ　ＩＩファージと糸状ヘルパーファージの１００μｍ対１μｍの 混合物を使用して２つのファゲミドライブラリーを作製した。
１００μｍのラムダ−Ｚａｐ　ｌＩ対１０μｍのへルバーファージ、および、２ ０μｍのラムダ−Ｚａｐ　１１対１０μｌのへルバーファージの混合物を使用し て２つの追加的なライブラリーを作製した。ファゲミド調製物の力価は使用した 混合物にかかわりなく類似しており、宿主としての大腸菌株ＸＬ−Ｂｌｕｅに関 してはｍＬ当たり約２Ｘ１０３であり、宿主としてのＤＥ１２６　（下記を参照 せよ）に関してはｍＬ当たり約１×１０３であった。
ＬＫＲを保持するクローンを選択するために、特別に設計された大腸菌宿主であ るＤＥ１２６を作製した。ＤＥＬ２６の作製は数段階において行われた。
（１）−膜化されているコリファージＰ　ｌ　ｖ’ｉ　ｒの形質導入用ストック を、標準的な方法を使用して（これらの方法については、１ＭｉｌＩｅｒＳＥｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ（大腸菌Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　＃６１３７）の培養物の感染により取得した。
（２）このファージストックを、受容体としての株ＧＩＦ１０６Ｍ１ｔｉｃ　５ ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　＃５０７４）での形質導入的交配（この方法について は、Ｊ、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓを参照せよ）におけるドナーとして使用した。組換え体を、抗生 物質テトラサイクリンを含む豊潤な培地［ＤＡＰでＬを補足しである］上で選択 した。テトラサイクリン耐性を付与するトランスポゾンＴｎｌＯを、株ＴＳＴＩ のｍａｌＥ遺伝子内に挿入する。この交配に由来するテトラサイクリン耐性形質 導れているが、０．　５分を下回る染色体により十分に分離された位置に存在す る。
（３）テトラサイクリン耐性形質導入体全ての表現型決定を行い、適切な発酵条 件および微量栄養素の測定を行った。受容体株ＧＩＦ１０６Ｍ１は、ｔｈｒＡ、 ｍｅｔＬ、および、ＩｙｓＣにおける突然変異のためにアスバルトキナーゼイソ 酵素が完全に欠損しており、そのため、生育するためにはスレオニン、メチオニ ン、リシン、および、メソージアミびエネルギー源として働くゲルコールに加え 、ビタミンＢ１、Ｌ−アルギニン、Ｌ−イソロイシン、および、Ｌ−バリンを含 む最低限の培地中トキナーゼを発現するものと思われる。従って、最低限培地へ りシンを添加スると、スレオニン、メチオニン、および、ＤＡＰに関する飢餓状 態を生じることにより、ＩｙｓＣ″″組換え体の生育が妨げられるはずである。
調査を行った２００のテトラサイクリン耐性形質導入体の内の４９が、スレオニ ン、メチオニン、および、ＤＡＰを欠（最低限の培地上で生育した。さらに、４ ９のすべてのものは、最低限の培地に対するし一リジンの添加により阻害された 。これらの形質導入体の内の一つをＤＥ１２５と表示した。ＤＥ１２５は、テト ラサイクリン耐性、アルギニン、イソロイシン、および、バリンを要求する生育 、および、リシンに対する感受性という表現型を有している。この株の遺伝子型 は、Ｆ−ヱ±−７匹去↓−２ｔｈｉ　ｌ　（？）　５ｕｐＥ４４　（？）である 。
（４）この段階は、株ＤＥ１２５の雄誘導体の産生を伴う。株ＤＥＩ２５を、接 合の方法により、雄株ＡＢ１５２’８　［Ｆ’　１６／ｄｅ　Ｉ　ｔａ（ｇｐｔ −１）ｒｏＡ）６２．１ａｃＹ１、もしくは、ＩａｃＺ４、呈±ｎＶ４４、ｇａ ｌＫ２　ｒａｃ−（？）、ｈｉｓＧ４、ｒｆｂｄｌ、ｍｇｌ−５１，ｋｃ１ｇＫ ５１　（？）　、ｉ　１ｖｃ７、ａｒｇＥ３、ｔｈ±−１］　（大腸菌Ｇｅｎｅ ｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　＃１５２８）と交配させた。Ｆｏ　１６は 、±±ｖＧＭＥＤＡＹＣ遺伝子群を保持している。この２つの株を、菌株の生育 を許容する豊潤な培地上に筋目をつけて植え付けて交配させた。インキュベーシ ョン後、このプレートを、テトラサイクリン、アルギニン、ビタミンＢ１、およ び、グルコースを含む合成用培地に対してレプリカ法を使用して移し植えた。Ｄ ＥＬ２５はイソロイシンを合成することができないためこの培地上で生育するこ とができない。抗生物質テトラサイクリンが含まれており、かつ、合成用培地か らプロリンおよびヒスチジンが除去されている場合にはＡＢＩ５２８の生育が妨 げられる。細胞片がこの選択的培地上で生育した。これらの組換え細胞の単一コ ロニーを同じ培地上で単離した。あるクローンの表現型は、Ｉｌｖ’、Ａｒｇ＼ ＴｅｔＲ，リシン耐性、維持異的ファージ（ＭＳ２）耐性であることが決定され ており、これは、ＡＢ１５２８からＤＥ１２５へのＦ“　１６の単純な転移に矛 盾しないものである。
このクローンをＤＥＬ２６と表示し、このクローンは、遺伝子型Ｆ’　１６／ｍ ａ　ＩＥ５２　：　：ＴｎｌＯｌａｒｇ−１ｉｌｖＡ２９６、ｔｈｒＡｌｌｏｌ 、ｍｅｔＬｌｏｏ、１ｙＳＣ４、λ＼　ｒｐｓＬ９、ｍａＩＴｌ、ｘｙ↓−７、 匹す−−７、匹工±−２，１九±−１？、５ｕｐＥ４４？を有している。このク ローンは、合成用培地中に含まれる２０μｇ／ｍＬのし一リジンにより阻害され る。
ＬＫＲ遺伝子を保持するトウモロコシのｃ’ＤＮＡライブラリーからクローンを 選択するため、１００μＬのファゲミドライブラリーを、Ｌ肉汁中で生育させた ＤＥ１２６の一晩の培養物の１００ＩｉＬと混合し、この細胞を、ビタミンＢ１ 、Ｌ−アルギニン、炭素およびエネルギー源としてのグルコース、１００μｇ／ ｍＬのアンピシリン、および、２ｏ１３０、もしくは、４０μｇ／ｍＬのＬ−リ シンを含む合成用培地のプレートに入れた。３つの異なるリシン濃度各々につき ４枚のプレートを調製した。ファゲミドおよびＤＥ１２６の量は、プレート当た り約１×１０５のアンピシリン耐性トランスフェクト体が得られるようにした。
プレート当たり１０から１３のりシン耐性コロニーが生育した（５０００のアン ピンリン耐性コロニー光たり約１つのりシン耐性体）。
プラスミドＤＮＡを１０の独立したクローンから単離し、ＤＥＬ２６内に再度形 質転換させた。１０のＤＮＡの内の７つがリシン耐性り。−ンを産生し、これに より、リジン耐性特性がそのプラスミド上に保持されていることが立証された。
報告されているトウモロコンＬＫＲのサイズは約１４０．０００ダルトンで、こ れは少なくとも３．８ｋｂのｍＲＮＡを必要とする。それらのＤＮＡのＬＫＲ制 限酵素分析により、クローン１１ＤはｃＤＮＡの全長方を保持するに十分な大き さである約４ｋｂのトウモロコンＤＮＡ挿入断片を有するプラスミドを含んでい ることが示された。
配列表 （１）一般情報 （ｊ）出１ｉ者：Ｅ、　１．　ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲ３ＡＮＤ　 ＣＯＭＰＡＮＹ （ｉ　ｉ）発明の名称二種子のりシンおよびスレオニン含有量を増加させるため の核酸断片および方法 （ｉ　ｉ　ｉ）配列数：２４ （１ｖ）通信先住所： （Ａ）、１５て先：Ｅ、　１．　ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲ３ＡＮＤ 　ＣＯＭＰＡＮＹ （Ｂ）街路名：１００７　ＭＡＲＫＥＴ　５ＴＲＥＥＴ（Ｃ）市：ＷＩＬＭＩＮ ＧＴＯＮ （Ｄ）州：ＤＥＬＡＷＡＲＥ （Ｅ）国：Ｕ、　ｓ、　Ａ。
（Ｆ）ＺＩＰ：　１９８９８ （Ｖ）コンピューター解読可能書類 （Ａ）媒体の種類：ディスケット、３．５インチ（Ｂ）コンピューター：マツキ ントラシュ（Ｃ）操作系：マツキントラシュ、６．０（Ｄ）ソフトウェアー：マ イクロソフトワード、４．０（ｖｉ）出願者の現在のデータ・ （Ａ）出願番号：ＢＢ−１０３７−Ａ （Ｂ）提出日・ （Ｃ）分類。
（ｖｉｉ）出願者の従来のデータ。
（Ａ）出願番号：０７／８５５．４１４（Ｂ）提出日　１９９２年３月１９日 （ｖｉｉｉ）弁護士／代理店の情報： （Ａ）氏名：ＬＩＮＤＡ　ＡＸＡＭＥＴＨＹ　ＦＬＯＹＤ（Ｂ）登録番号・３３ ．６９２ （Ｃ）参照／審理予定表番号：　ＢＢ−１０３７−Ａ（ｉｘ）電信情報 （Ａ）電話番号・３０２−９９２−４９２９（Ｂ）テレファックス・３０２−８ ９２−７９４９（Ｃ）テレックス：８３５４２０ （２）配列番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＋１３５０ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特＠： （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．１３５０ （ｘｉ）配列：配列番号１ ＡＴＧ　ＧＥＴ　ＧｋＡ　ＡＣＴ　ＧＥＴ　ＧＴＣＴＣＣλ八人　ＴＴＴ　ＧＦ ＳＣＧＧＴ　ｋｃ：　ＡＧ：　Ｇτ入　Ｇごτ　ｃＡ：　４W Ｈｅ＝　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｘｌｅ　Ｖａｌ　ｖｉｉ　Ｓ＠：　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　 Ｇ二ｙ　Ｇｌｙ　τｈ＝　Ｓｅ：　Ｖａｉ　Ａｉａ　Ａｓｐｌ　５　１０　１５ ＴＴＴ　ＧＡＣＧＣＣＡ”ＯＡＡＣＣＧ：：　ＡＧ：　ＧＥＴ　ＧＡＴ　ｋＴＴ 　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＯ？　’ＧＡ”　ＧＣＣＡＡＣ９６ｔｈｅ　Ａｓｐ　入１ ｍ　Ｍｅ：　入５ｎ　入：ｇ　Ｓｅ：　Ａｉａ　入ｓｐ　Ｘｌｅ　ＶａＬ　Ｌｅ ｕ　Ｓｔ：　入ｓｐ　入ｌａ　ｋｓｎＧＴＧ　ＣＣＴ　丁τ＾　ＧＴＴ　ＧＴＣ ＣＴＣＴＣＧ　ＣＣＴ　丁ＣＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＡＴＣＡＣＴ　＾ＡＴ　ＣＴ Ｇ　ＣｆＧ　１４S Ｖａｌ　Ａ：９　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｓ：　入１ｍ　Ｓｅ：　 入１ａ　Ｇｌｙ　Ｚｌｅ　τｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＬａｕＧＴＣＧＣＴ　ＴＴ Ａ　ＧＣＴ　ＧＪ、Ｘ　ＧＧ、％　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＧＡＧ　Ｃ Ｇ＾Ｔ丁ＣＧ品υＱ　ＣＴＣ１９２Ｖａｌ　入ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　 Ｌｙｓ　ＬｓｕＳｏ　５５　６０ ＧＡＣＣＣＴ　ＡＴ（ＣＧ：　入ＡＣＡＴＣＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＣＣＡＣＴ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＡ　ｃａ′：　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＴＡＣ２４０＾ｓｐ　入１ａ　１１ ＊　八；９　Ａｓｎ　）ｉｓ　Ｇｉｎ　Ｐｈ＠　Ａｌａ　ｆｉｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　＾：９　Ｌｔｕ　Ａｒｇ　τｙ＝ＣＣＧ　ＡＡＣＧＴＴ　ＡＴＣＣＧＴ　Ｇ ｋＡ　ＧＡＧ　ｋＴＴ　ＧＡＡ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＣ Ｔ　ＡＣＴ　２８a Ｐｒｏ　入ｓｎ　Ｖｉｌ　ｌ＠　Ａ：ｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｘｉｓ　丁ｈ：ａｓ　ｓｏ　５ｓ ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣＧＣＡ　Ａ ＣＧ　丁ＣＴ　ＣＣＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣ＾Ｃ＾　ＧＡＴ　３R６ Ｖａ１　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＧＬｕ　Ａｉａ　入ｌａ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 丁ｈｒ　５ｅ：　Ｐｒｏ　Ａｉａ　Ｌｅｕ　丁ｈｒ　八５ｐ１００　１（！５　 １１０ ＧＡＧ　ＣＯＧ　ＧＴＣＡＧ：　ＣＡＣＧＳ：　ＣＡＧ　ＣＴＣ入ＴＧ　ＴＣＧ 　Ａｃｅ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　０丁丁　ＧＡＧ　３８■ Ｇｌｕ　Ｌ４！ｖ　Ｖａｉ　Ｓ＋Ｉ：　ＨＬｓ　Ｇｉｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ｌ’ 、ｅ：　Ｓｅ：　丁ｈ：　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｎ@Ｇｌｕ １１５　１２ご　１２５ ＡＴＣＣＴＣＣＧ：：　ＧＡＡ　ＣＧＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＣＡＣＧＣＡ　ＣλＧ ＴＧＧ　７丁τ　ＧＡＴ　ＧτＡＣＧτ　へ人入　４３２ＸＬ＠　Ｌ＠：　Ａｕ ｇ　ＧＡ−＾ｒ９　Ａｓｐ　Ｖａｉ　ＧＡ−＾！：ａ　Ｇｉ＊　丁＝ｐ　Ｐｈｅ 　入ｓｐ　Ｖａｌ　＾：ｑ　Ｌｙｓ１３０　１！５　１４０ ＧτＧ　入？Ｑ　ＣＣＴ　＾＝；　八人’ｌ：Ｇ入Ｓ　ＣＧＡ　’：？Ｔ　ＧＧ Ｔ　ＣＧＴ　Ｇ；Ａ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＣＡＴ　Ａ丁Ａ　ＧbＣ４８０ Ｖｉユ　Ｈｅ＝　入：；　Ｔｈ：　＾騎　Ａｓｐ　＾：９　Ｐｈａ　Ｓｌｙ　ｊ ｓ：ｑ　入λａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｘ１＊　Ａｌａ１４５　ＬＳＯ１５ ５１６０ Ｇａｓ　ＣＴＣＧ：Ｓ　ＧＡＡ　ＣＯＧ　Ｇ：’：、ＧＣＳ　ＣＯＧ　Ｃへ〇Ｃ τＧ　ＣＴＣＣＣＡ　ＣＯＴ　ＣＴＣλに７Ｇ入Ａ　５２８人ユａ　Ｌａｇ　入 ユａＧユｕ　Ｌ＠＝　Ａｈａ　人工ａ　ｕ＝　ＧＡＹ；　ｕ−Ｌｅｕ　、！１＝ ：ｓ　＾：；　ｋｕ　＾ｇｎＧ上り１６５　１７０　１７！Ｉ ＣＣ：　＝フＡ　ＣＯＧ　ＡＴＣ八ＣＯＣ入’ａ　ＧＣＡ　？？−，ＡＴＣＧＧ Ｔ　入ＧＣＧＡＡ　入入丁　八人＾　００丁　ＣＯＴ　５７U Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　ａニコ　Ｇｉｙ　Ｐｈ＠　ズ１−　 Ｇｌｙ　５ｔ：　Ｇｌｕ　＾−ｎ　ＬｙＳ　ａｘｙ　＾ｒ９１８０　１８　１９ Ｇ ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　ＧＧご　ＣＯＴ　ＧＧＡ　Ｇ’：ａＣＡＳ： 　ＧＡＹ　ＴＡ７　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣ（：　ＴＴＧ　ＣsＧ　Ｇ２＜ １ｈ二　）ｈ：　フ？、：　Ｌｅｕ　Ｇユ？　ＡＨ，７Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｔ： 　Ａｓｐ　丁ｙ：　丁ｈ：　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ偕ｕ　Ｌ噛■ １０　２０（！　２０５ ＧＣＧ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　丁τ入　ＣＡＣＣＣＡ　丁Ｃ丁　ＣＯＴ　ＧＴＴ　Ｇ ＡＹ　入τＣ％Ｇ　ＡＣＣＧλＣＧτＣＣＣＧ　６７２人１ａ　Ｇｌｕ　Ａ１１ ｌ　１４ｕ　）ｉニコ　λ上ａ　Ｓ七　Ａｒｇ　ｖａｌ　Ａｓｐ　ｌｅ　丁；Ｐ 　丁ｈ；　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒ。
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べ２り　＜２５　４３０ ＧＧＣＯＡＡ　ＧＡＹ　Ｏ：：　ＧＡＧ　Ｃ＾ＳＧτＳＧ丁ＧＣλ＾　＾人ＡＣ ＴＧＣ＾丁　八Ｇτ　入入７７τＧ　丁τ丁　１３６Ｇｉｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 入１ａ　Ｇｌｕ　Ｇ１＊　Ｖａｉ　ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　 Ｓｓ：　ＡＳｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈ＊ＧＦＩＳ　τ入入　１３５０ （２）配列番号２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３６ ＣＢ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数二一本膜 （ｐ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号２： （２）配列番号３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３６ （Ｂ）配列の種類；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （目）分子の種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列；配列番号３： ＧＴＡＣＣＧＣＣλＡ　ムττＴＧＧλＧ入ＣへＡＣ入ＡＴＴＴＣへ　ｃｃｃ八 Ｔへ　３６（２）配列番号４についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：４８ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号４： ＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴ　ＧＧＣＴ八ＣＡへＧＴ　丁丁入ＡＣへＧＣＴＡ　八ＧＡ ＣＣＧＧＡＧＴ　λＧ八へＣＡＣτ　４日（２）配列番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ；３７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号５゜ ＧＡ入丁ＴＣＧＡ）、Ｔ　ＴＣＴＣＡＴＴ八τＡ　ＧへＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴ ＴＴＴＣ３７（２）配列番号６についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：９１７ ＣＢ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数二一本膜 （Ｄ）トポロジー＝１！鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ ＣＢ）存在位置：３．．９１１ （ｘ　ｉ）配列：配列番号６： Ｃ；　ＡＴＣＧ；τ　入ご入　ＧＣＴ　？：Ａ　ＡＨＡ　Ｇ：？　入Ａｓ　λこ ＣＧＣＡ　ＧτＡＧ入コ　ＣＡＧ　：フ：　ＧＯ：　４７Ｍ＠Ｌ　ＡＬａ　Ｔｈ ：　Ｇｌｙ　Ｌａ冨　Ｔｈ：　ＡＬａ　Ｌｙｓ　Ｔｈご　Ｇｉｙ　Ｖａｌ　Ｇｌ ｕ　）ｌｉｓ　Ｐｈｅ　Ｇａｙｌ　５　１０　Ｌ５ ＾二；　Ｇττ　ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＴＯＧＴ：　Ａ二τ　ＣＣＡ　７ 丁；　へＣＣＧ人前　丁ＣＣＧＣＡ　ＧＡ；　入τ（９５丁Ｔｈ：’Ｊ＆Ｌ　Ｇ ａｙ　ＶａＬ　Ａｉａ　Ｍ＠ＣＶａｌ　丁ｈ：　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　丁ｈ＝　Ｇｌ ｕ　Ｓｓ：　Ｇｌｙ　入ｓｐ　工１・Ｇ＾：　八ツＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＧＣ０ ０口　Ｇ入ＡＧ丁ＣＧＣＧ　ＣＣＴ　丁入子　丁ＴＧＧτＴＧ＾τ　ＡＡＧ　Ｇ ＧＣ１４３＾ｓｐ　Ｉｌｅ　入１ａＡユａ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｉ　 ＡＬａ　ＡＬａ　丁ｙ＝　１．ｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｙ丁？ＧＧ ＾：　丁＝τ　７τＳ　Ｇ’：？　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＳＳ　＾ｃ＝　Ａ（Ｊ　Ｇ ＣＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＣＣＡ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　１X１ Ｌ４１Ｊ　Ａｓｐ　５ｅ：　Ｌ噛＊　ｖａｌ　Ｌｎｕ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　丁ｈ：　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　５ｅ：　Ｐｒｏ　丁ｈ：　丁ｈG ＡＳＣＧＣＣＣＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴＡ　Ｇ７ＪＩ　ＣＴＩＩ　ＣＴＣ１ Ｊ−Ｇ　ＧＣＣＧ’：Ｔ　ＣＧ：　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＴ７@２３９ τｈ＝　Ａｌａ　Ａｉａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅａ　 Ｌａ５　八ｌａ　Ｖａｌ　Ａｒ９　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＶａＬＧＧＧ　ＧＡ丁　Ｃ ＧＧ　ＧＣＧ　人前ＧＣＴＣ八；；　Ｇこｃｃｃ丁　Ｇ丁ＣＧＧＡ　へＣ口　人 ＡＣ入λＣ入ＣＧ　ＣＧＧ　２Ｂ７Ｇ４ｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　 Ｌｅａ　Ｉｌｅ　入１ａ　Ｇｌｙ　ｖａｘ　Ｇｕｙ　丁ｈｘ　入Ｓｎ　＾５ｎ　 丁ｈｒ　入ｒ９＾ＣＡ　丁ＣＴ　ＧＴ（、（、八入　Ｃ７了　ＧＣＧ　ＣＡＡ　 ００丁　ＧＣＴ　ＣＣＴ　丁ＣＴ　ＣＣ７ＧＳＳ　ＣＣＡ　Ｇ、％ＣＧＧＣR３ ５ τｈ＝　Ｓｅｘ　Ｖａｉ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　八ｌａ　Ｇｌｕ　八Ｌｍ　Ａｌａ　 ＡＬａ　Ｓｅτ　八１ａ　Ｇｌｙ　へ工轟　八５ｐ　Ｇｌｙｌｏｏ　１０５　） １０ Ｃττ　丁子＾　６７丁　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ｃｃτ　τ＾τ　ＴｈＣＴに　人前 Ｇ　ＣＣＧ　ＡＧ二　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＴＧ　３Wコ Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　了ｈ：　Ｐ：ｏ　丁ｙ＝　丁ｙ：　Ｓｅ：　 Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅ：　Ｇｌｉ　Ｃ＋ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｉａ■ ０丁Ｇ　ＩＩ；Ｇ　ＣＡ：　τ丁ＣＧＧτ　Ｇこ入　入τフ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　 ＣＣＡ　入０λ　ＧλＧＧフＴＣＣλ　八ツ７　τＧ？　４R１ Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　入１ａ　入１１　 人１ａ　τｈｙ：　ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｐｔｏ　エエ七　Ｃｙ■ ＣＴＣＴＡＴ　ＧＡＣ＾τ丁　ＣＣＴ　ＧＯＴ　ＣＧＧ　ＴＣＡ　ＧＧ：　Ａτ τ　ＣＣＡ　入ττ　ＧＡＧ　１０丁　Ｇ八丁　ＡＣＧ　４V９ Ｌｅｕ　Ｔｙ＝　入ｓｐ　Ｘｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　＾：ｑ　Ｓｅ：　Ｇｉｙ　 １１ｅ　Ｐｒｏ　工ｉｓ　Ｇｌｕ　５ａ：　＾ｊｐ　丁ｈ：１４５　１５０　ｉ ｓ５ 人ＴＯＡＧＡ　ＣＧＣＣＴＣＡＧＴ　ＧＡＡ　：丁＾　ＣＣＴ　ＡＣＧ　入フτ 　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＴ；　λλＧＧλ＝ａ＝ｃｓ２７Ｍ＠ｔ　Ａ：ｇ　Ａｒｇ 　Ｌｅｕ　Ｓｅ：　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐ：ｏ　Ｔｈ：工ｈｅ　Ｌｅｕ＾Ｌａ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ＾ｓｐ　Ａｉａ１６０　１６５　１’７０　１’＋５ 五八ＧＧＯτ　ＧＡＣＣＴＣＧＴＴ　ＧＣＡ　ＧこＣＡＣＧ　ＴＣＡ　ＴＴＧ　 入τＣ八人＾　ＧＡＡ　入ＣＧＧＧ入　Ｃ丁了　５７５ｂｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ 　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａτｈ：　Ｓｓ：　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＧＣＣ丁ＧＧ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　（ｔＧＣＧ八 丁　ＧＡＣＣＣＡ　ＣＴＡ　ＡＡＣＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　Ｃ７丁　ＧＣＴ　 ＴＴＧ　Ｇ２R Ａｌａ　丁ｒｐ　丁ｙｒ　Ｓｓ：　Ｇｕｙ　、Ｘｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｆｏ　Ｌ＠＊ 　Ａｓｎ　’Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｚｐ　Ｌｅｕ　八↓ａ　Ｌモ■ ＧＧＣＧＧＡ　ＴＣＡ　ＧＯＴ　Ｔｉｃ　ＡＣＴ　ＴＣＣＧ７ｋ　ＡＣＴ　ＧＣ Ａ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＣＣＣＡＣＡ　ＧＣＡ　６７１Ｇｕｙ　Ｇｉｙ　Ｓ ｅ：　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　＝Ａｔ　Ｓｅ：　Ｖａｎ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｍｉｓ　入 １ａ　入Ｌｍ　Ｐ：ｏ　丁ｈ：　人工直２１０　２１！＋　２２０ τ丁Ａ　ＣＯＴ　ＧＡＧ　丁τＧ　１八ＣＡＣＡ　ＡＧ：　ττＣＧＡＧ　Ｇ入 ζ　ＧＧＣＧ＾ＣＣ丁ＣＧτＣＣＧτ　ＧＣＧ　ＩＬ９１、ｓｕ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｕ　Ｌｅａ　丁Ｖｆ　丁＋′Ｉｒ　５七　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　入 ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒ９　＾P晶 ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＡＴＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　ＣＣＧ　ＣＴＧ 　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＧＣＣＣＡＡ　ＧＧＴ　ＣＧＣ７６７人ｒｇ　Ｇｉｕ　Ｉｌ ｅ　＾Ｓｎ　ＡＬａ　ＬｙＳ　Ｌａｐ　Ｓｅ二　Ｐ：ｏ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　ｆｉ 、Ｌａ　ＡＬａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　八Gｑ ２４０　２＜５　２５０　．２５５ ）＝ＳＣ＝″：　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＧこ　丁τＧ　Ｇ；入　入λＡＧＣτ　Ｇご ＴＣτＧ　ＣＣＴ　ＣτＧＣ＾＝　Ｃ，＝　ＡＴＣ８１５Ｌｅ＝　Ｇｉｙ　ＧＬ ｙ　Ｖａｉ　Ｓｅｘ　Ｌ９・−人Ｌａ　Ｌｙｓ　へ１晶　ＡＬａ　１ｒｔｕ　Ａ ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇλｒ＋　Ｇｌｙ　ＩIａ ＡＡ：　ＧＴＡ　ＧＣ；Ａ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＣＱＡ　ｃ＝：　Ｃ’：Ａ　１丁 ＋、ＡＴＣＧこＴ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡ|％　８６３ ７１５＋、ＶＩＬ　Ｇｌｙ　ｆｉ、３ｐ　Ｐ：ｚ　；、：；　ｕｓ−Ｐ：ｐ　： 二Ｃどｅ；　λＬａ’　Ｐ：５　λｓｘＧ工ａＧユ＊　ＧＬ■ ２ｊＳ　２Ｂ０　２１！５ Ｃフ：　Ｃ入ＣｉＣ：τ　Ｃτ二　にＧＡ　ＧＩ％ＡＧξ＝　八ツ３　ζ八入　 八＾ａｃこ７　ＧＣＡ　６７丁　Ｃ１入　τ入２　τＧλＧ■lττＣ９１８ Ｌ４ｕ　Ｇ４＝　ＱＬａ　Ｌａ−Ａｒｇ　Ｇニー　Ｐ、Ｓｐ　Ｈｅ−Ｌ：、−５ ＬＹＳ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　ｖａｌ　Ｌｅｕ２９ご　２９５　３００ （２）配列番号７につＬ）での情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２２ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列、配列番号７： ＣＴ；ごＣＩ：＝＝λ　ＣＣり１．ｕｗ−ｗ＋ｗ八　。
（２）配列番号８につＬ）での情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・７５ （Ｂ）配列の種類、核酸 （Ｃ）鎖の数、一本積 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （白）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｌ）配列・配列番号８ ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴ７ＣＣＣＣＡＣＧ、ＩＩ　ＧＧ入ＡＧＡＣＣλλ　Ｃ入 Ａ丁ＧＡＣへ丁子　ＡＣＣ丁二丁へＴτＧＣ丁へＧＣへ人ＣfＣＧ。
τＧＣ，砿ＧＩｌＩＧτλＣ詰τ、　１ｓ（２）配列番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さニア５ （Ｂ）配列の種類、核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本積 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列；配列番号９： ＣＡＴＧＣ八ττＧへ　ＡＣ７０τ丁ＣＣＡＣＣＧ丁丁子Ｃ？ＡＧＣ入ＡＴＧＧ へＧＧτ入　ＡＴＧＴＣＡτ丁Ｇ丁　丁ＧＧτＣ丁τＣＣτ@６０ ＣＧＴＧＧＧＧ入＾Ｇ　ｃｃｘｃ：　７５（２）配列番号１０についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：９０ （Ｂ）配列の種類、核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本積 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （爾）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘ　ｉ）配列：配列番号１０： ＣＡＴＧＧＣ−、−、：：　？ＣＣＡＴＧＡＴＣＴ　ＣＣＴＣＣＣＣｋＧＣＴＧ ＧＴｋＣＣｋＣＣＧ丁ＣＡＡＣＣＧ丁Ｇ　ＣＣＧＧＴＧＣＣfＧ　５０ ＣＡ丁ＧＧ丁τＧＣＴ　ＣＣ入ττＣ八へＣＧ　ＧＣＣ丁Ｃλ入入へ人　９０（ ２）配列番号１１についての情報 （ｆ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝９０ （Ｂ）配列の種類：核酸 ＣＣ＞鎖の数ニ一本積 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１１： へ人；＾Ｇζ：ＳＳＳ　ＧンＧＧＡＧ入τＣλ　丁子ＧＡＧＣｉ入＾ＧＣ９０（ ２）配列番号１２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・２３ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 Ｎ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１２： ＣＣＧＧＴ？’！’ＧＣＴ　ＧＴ触τＡＧＧＴＡ　ＣＣＡ　２３（２）配列番号 １３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・３１ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （酉）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列：配列番号１３： ＡＧＣＴＴＧＧτＡＣＣＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＪユＣＣＧＧＣ入ＴＧ　３１（２ ）配列番号１４についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、２７ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）！１１の数ニ一本積 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種Ｑ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１４゜ ＧＣＴＴＣＣＴＣＡ）、　ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＧＳＴ　２７（２）配 列番号１５についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２８ （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数　一本積 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１５ Ｃ入ＴτＧＴＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＴ　ＧＣＴ入ＧＣ入Ａ　２Ｂ（２）配 列番号１６についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：８３９ ＣＢ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本積 （Ｄ）トポロジー、直鎮状 （ｉ　ｉ）分子の種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列・配列番号１６： Ｔτ口λへ声Ｓへ；＾　入Ａ＾Ｊ、λλＮＮ））　ＮＣＣ：ＣＧ入Ａ；入　Ｇ＾ ＧτＧＣτ丁τＧＧＧＴＣＣ口入ＡＧＣ丁子ＣττＴ入Ｇみb６００ ＴＳＴＳ：’：：＝Ｓ：　ＧＴ”：：ＣＣ：ＣτＱ　Ａ入Ｔ？−、：ＴＣＣユニ Ｃ７み丁＾？：、ｃ；、ｃ７Ｃ入Ｃ７？Ｓ７ＣＪ：、Ｊ、ＴbＡｙ　こＧＴ　６ ＠Ｏ ＴＣ；こ：′：？ＣＣＣＣＴｆｉ、′：ＡＴＣＴ；ニー　ＡＣＧこτＣＴＣＣＡ 　ＧこＡＧτ？ＣＣＡＣ：　Ｃ丁へ丁へ丁Ｃへ人ＡＣ口ＴＣ■■sＡＣＣ７２０ ＣＣ入ＣＣＡ　：入ＡＣ入み？＾：丁２′：Ａτ　＾Ｃτフ？ＣＡτ；７　τ口 へＣ；τ人前Ｃ丁　ＣＡτＧτＡＣＣ丁τ　ＣＣＡＡ、ＴＴH？ＴＴ　７１１０ τＣτＸＣτＶ、Ｔ入　入ττＡＴ丁τＡＣＧ　丁Ｇ：、、こλＳ入へ人　Ｃ？ τ入ＧＧご入ＡＧ　ＧＧ八へ八へ＾ＧＡＧ　入ＧＣＧＧＴＡbＣ８３９ （２）配列番号１７についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　４３ （Ｂ）配列の種類、核酸 （Ｃ）鎖の数、一本積 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列、配列番号１７： ＣＴ入ＧＡＡＧＣＣＴ　ＣＧＧこλλＣＧτＣＡＧ口入ＡＣＧＧＣＧ　ＧＡＡＧ ＡＡτＣＣＧ　ＧＴＧ　４３（２）配列番号１８についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　４３ （Ｂ）配列の種類・核酸 （Ｃ）鎖の数、一本積 （Ｄ）トポロジー、直鎮状 （１］）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（Ｘ］）配列　配列番号１８ ＣＡＴＧＣＡＣＣＧＧ　声、τ丁ＣＴＴＣＣＧこ　ＣＧＴＴＧＣＴＧＡＣＧＴＴ ＧＣＣＧＡＧＧ　Ｃ丁７　４３（２）配列番号１９についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：５５ ＣＢ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎮状 （１１）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号１９： （２）配列番号２０についての情報 （ｊ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　５５ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列　配列番号２０ （２）配列番号２１についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：５９ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘＤ配列　配列番号２１ Ｃ８τＧＧ０ＧＣＣＣＡｃｅこＴＧｋ７Ｇ入　ＴＧＧ：ＣＴＣＧ？ＣＧＧＣ：Ａ ＣＣＧこＣＧＴＣＧＣ丁ＣＣＧ丁　ＴＣＣ八ＧへＧＧＣ５９（２）配列番号２２ についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　５９ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎮の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列・配列番号２２ ７丁λ＾Ｇこ０口こτ　ＧＳＡＡＣＧＧＡＳこ　ＧＡＣＧＳＣＧＧ−、Ｓ　ＧＣ ＣＧＡ：１．ＧＡＧＧ　ｃｃｘ＝ｃ八τＣ八へ丁ＧへＧＧＣCこＧこ　５９ （２）配列番号２３についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１６ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）分子の種類　ＤＮＡ　（、ゲノム）（Ｘ］）配列　配列番号２３ ＧＣＧＣ：ＣＣ；ＶＣＣＧ　ＴＧ？、ＴＧ；１１６（２）配列番号２４について の情報 （］）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１６ （Ｂ）配列の種類　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列　配列番号２４ ＣＡＣＣＧＧＡＴ丁ＣＴＴｃｃｃｃ　１６ＢｏｍＨＩ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）、、、　＋　１ 請求の範囲 １．リシンによる阻害に対して非感受性であり、かつ、適切な植物葉緑体トラン ジット配列および適切な調節配列に対して操作可能に結合して形質転換させた植 物の種子内における発現を促進させた、アスパルトキナーゼをコード化する単離 された核酸断片。
２、単離された核酸断片であって、 （ａ）請求の範囲１の核酸断片を含む第１核酸サブフラグメント、および、 （ｂ）植物のＤＨＤＰＳと比較してリシンによる阻害に対して少なくとも２０倍 感受性が低く、かつ、適切な植物葉緑体トランジット配列および適切な調節配列 に対して操作可能に結合して形質転換させた植物の種子内における発現を促進さ せた、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコード化する第２核酸サブフラグメン ト、を含む、上記核酸断片。
３、リシンケトグルタール酸レダクターゼをコード化する、単離された核酸断片 。
４、単離された核酸断片であって、 （ｂ）植物のＤＨＤＰＳと比較してリシンによる阻害に対して少なくとも２０倍 感受性が低いジヒドロジピコリン酸シンターゼをコード化する第２核酸サブフラ グメント、および、（ｃ）請求の範囲３において記載されている第３核酸断片、 を含む、上記核酸断片。
５、請求の範囲４の核酸断片であって、第１および第２サブフラグメントを各々 適切な植物葉緑体トランジット配列および適切な調節配列に操作可能に結合して 形質転換させた植物の種子内における発現を促進させてあり、かつ、第３核酸サ ブフラグメントを適切な調節配列に結合して形質転換させた植物の種子内におけ るアンチセンスＲＮＡの発現を促進させた、上記核酸断片。
６、単離された核酸断片であって、野生型の大腸菌のＡＫＩＩＩをコード化する 、配列番号１において示される配列に対して実質的に相同であるヌクレオチド配 列を含み、当該核酸断片が大腸菌のＡＫＩＩＩのりシン非感受性変異体をコード 化するような少なくとも一つの突然変異を含み、かつ、以下に示す、 （ａ）位置３１８のアミノ酸がスレオニン以外のアミノ酸であるか、もしくは、 （ｂ）位置３５２のアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である、という条件の 内の少なくとも一つが満たされているという別の特徴を有する、上記核酸配列。
７、請求の範囲６の単離された核酸断片であって、この断片を植物の促進させた 、上記核酸断片。
８　請求の範囲２の核酸断片であって、（ａ）第１核酸サブフラグメントが請求 の範囲６の核酸断片を含み、かつ、 （ｂ）第２核酸サブフラグメントが細菌に由来する、上記核酸断片。
９、ゲノム中に請求の範囲１−８の核酸断片を含む植物。
１０、ゲノム中に、 （ａ）リジンによる阻害に対して非感受性であるアスパルトキナーゼをコード化 する第１核酸サブフラグメント、および、（ｂ）植物のＤＨＤＰＳと比較してリ シンによる阻害に対して少なくとも２０倍感度が低いジヒドロジピコリン酸シン ターゼをコード化する第２核酸サブフラグメント、 を含む核酸断片を含む植物。
１１、請求の範囲９もしくは１０の植物から取得される種子。
１２、植物の種子のりシン含有量を増加させるための方法であって、（ａ）請求 の範囲２．４．５、もしくは、８のリジン核酸断片で植物細胞を形質転換させ、 （ｂ）種子を取得するのに適する条件下において段階（ａ）から取得された形質 転換させた植物細胞から繁殖ツｊのある成熟した植物を育成させ、さらに、 （Ｃ）段階（ｂ）の子孫の種子から増加したレベルのリジンを含む種子を選択す ること、 を含む上記方法。
１３、植物の種子のスレオニン含有量を増加させるための方法であって、 （ａ）請求の範囲１．６、もしくは、７の核酸断片で植物の細胞を形質転換させ 、 （ｂ）種子を取得するのに適する条件下において段階（ａ）から取得された形質 転換させた植物細胞から繁殖力のある成熟した植物を育成させ、さらに、 （Ｃ）段階（ｂ）の子孫の種子から増加しているレベルのスレオニンを含む種子 を選択すること、 を含む上記方法。
１４、植物の種子のりシン含有量を増加させるための、請求の範囲１２の方法に より産生される植物であって、この植物が当該核酸断片を子孫植物に対して受け 渡すことができ、かっ、この子孫植物が、この核酸断片を含んでいない植物の遊 離リシンレベルと比較して、少なくとも２倍高いレベルの遊離リジンを産生ずる 能力を有する、上記植物。
１５　植物の種子のスレオニン含有量を増加させるための、請求の範囲１３の方 法により産生される植物であって、この植物が当該核酸断片を子孫植物に対して 受け渡すことができ、かつ、この子孫植物が、この核酸断片を含んでいない植物 の遊離スレオニンレベルと比較して、少なくとも２倍高いレベルの遊離スレオニ ンを産生ずる能力を有する、上記植物。
、　、・ＰＣＴ／ＬＩＳ　９３１０２４８０フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９１００　 ９３５９−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。
ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ。
ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、 Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ Ｉ

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. １．単離された核酸断片であって、 （ａ）リシンによる阻害に対して非感受性であるアパルトールキナーゼをコード 化している第１核酸サブフラグメント、および、（ｂ）植物のＤＨＤＰＳと比較 するとリシンによる阻害に対する非感受性が少なくとも２０倍低いジヒドロジピ コリン酸シンターゼをコード化する第２核酸サブフラグメント、 を含む、上記核酸断片。
  2. ２．請求の範囲１の核酸断片であって、（ａ）第１核酸サブフラグメントが、大 腸菌のＡＫＩＩＩをコード化する、配列番号１に示されている配列に対して実質 的に相同なヌクレオチド配列を含み、当該核酸断片が大腸菌ＡＫＩＩＩのリシン 非感受性変異体をコード化し、かつ、以下に記載する、（１）位置３１８のアミ ノ酸がスレオニン以外のアミノ酸であるか、もしくは、 （２）位置３５２のアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である、という条件の 内の少なくとも一つが満たされているというさらなる特徴を有するか、あるいは 、 （ｂ）第２核酸サブフラグメントか細菌に由来するか、のいずれかである、上記 核酸断片。
  3. ３．単離された核酸断片であって、リシンケトグルタール酸レダクターゼをコー ド化する核酸サブフラグメントを含む上記核酸断片。
  4. ４．請求の範囲１の核酸断片であって、さらに、（ｃ）アンチセンスリシンケト グルタール酸レダクターゼを含む第３核酸サブフラグメント、を含む、上記核酸 断片。
  5. ５．請求の範囲１の核酸断片であって、各サブフラグメントが適切な植物葉緑体 トランジット配列に対して操作可能に結合してあり、かつ、各サブフラグメント が適切な調節配列に対して操作可能に結合してあり、形質転換させた植物の種子 内における発現を促進させる、上記核酸断片。
  6. ６．請求の範囲４の核酸断片であって、第１および第２サブフラグメントが各々 適切な植物葉緑体トランジット配列に対して操作可能に結合してあり、かつ、各 サブフラグメントが適切な調節配列に対して操作可能なように結合してあり、形 質転換させた種子内における発現を促進させる、上記核酸配列。
  7. ７．単離された核酸断片であって、大腸菌のＡＫＩｌをコード化する、配列番号 １に示される配列に対して実質的に相同な少なくとも一つのヌクレオチドを含み 、当該核酸断片が大腸菌のＡＫＩＩＩのリシン非感受性変異体をコード化してお り、かつ、以下に記載する、（ａ）位置３１８のアミノ酸がスレオニン以外のア ミノ酸であるか、もしくは、 （ｂ）位置３５２のアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である、という条件の 内の少なくとも一つが満たされているという別の特徴を有、する、上記核酸断片 。
  8. ８．請求の範囲７の単離された核酸断片であって、この断片が植物の葉緑体トラ ンジット配列に対して操作可能に結合してあり、かつ、適切な調節配列に対して 操作可能に結合してあり、形質転換させた植物の種子内における発現を促進させ る、上記核酸配列。
  9. ９．請求の範囲５もしくは６の核酸断片をゲノム内に含む植物。
  10. １０．請求の範囲７の核酸断片をゲノム内に含む植物。
  11. １１．請求の範囲９もしくは１０の植物から取得した種子。
  12. １２．請求の範囲１、３、もしくは、７の核酸断片で形質転換させた徴生物。
  13. １３．植物の種子内のスレオニン含有量を増加させる方法であって、（ａ）請求 の範囲８の核酸断片で植物の細胞を形質転換させ、（ｂ）種子を取得するのに適 する条件下において段階（ａ）から取得され形質転換させた植物細胞から繁殖力 のある成熟した植物を育成させ、さらに、 （ｃ）段階（ｂ）の子孫の種子から増加レベルのスレオニンを含む種子を選択す ること、 を含む、上記方法。
  14. １４．植物の種子のリシン含有量を増加させるための方法であって、（ａ）請求 の範囲５もしくは６の核酸断片で植物の細胞を形質転換させ、 （ｂ）種子を取得するのに適する条件下において段階（ａ）から取得され形質転 換させた植物細胞から繁殖力のある成熟した植物を育成させ、さらに、 （ｃ）段階（ｂ）の子孫の種子から増加レベルのリシンを含む種子を選択するこ と、 を含む、上記方法。
  15. １５．植物の種子のスレオニン含有量を増加させるための、請求の範囲１３の方 法により産生される植物であって、この植物が当該核酸断片を子孫植物に対して 受け渡すことができ、かつ、この子孫植物が、この核酸断片を含んでいない植物 の遊離スレオエンレベルと比較して、少なくとも２倍高いレベルのスレオニンを 藍生する能力を有する、上記植物。
  16. １６．植物の種子のリシン含有量を増加させるための、請求の範囲１４の方法に より産生される植物であって、この植物が当該核酸断片を子孫植物に対して受け 渡すことができ、かつ、この子孫植物が、この核酸断片を含んでいない植物の遊 離リシンレベルと比較して、少なくとも２倍高いレベルのリシンを産生する能力 を有する、上記植物。
  17. １７．ゲノム内に、 （ａ）リシンによる阻害に対して非感受性であるＡＫをコード化する第１核酸サ ブフラグメント、 （ｂ）植物のＤＨＤＰＳと比較して、リシンによる阻害に対して感受性が少なく とも２０倍低いＤＨＤＰＳをコード化する第２核酸サブフラグメント、および、 （ｃ）リシンケトグルタール酸レダクターゼのためのアンチセンスＲＮＡを発現 するための第３核酸サブフラグメント、を含む植物。
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