JPH07504886A - 細胞調節因子のインヒビターおよびはん痕形成を予防または緩和する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 −「　のインヒビ　− およびはん　ヅ　を　または　る 本発明は、国立癌研究所からの政府の認可ＣＡ　３０１９９、ＣＡ　４２５０７ およびＣＡ　２８ｇ９６の下で成し遂げられた。従って、合衆国政府は、本発明 における権利を有し得る。

ｌ胛旦背１ 本発明は、細胞生物学、さらに詳細には、細胞増殖の制御に関する。プロテオグ リカンは、１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタンパク質で ある。公知のプロテオグリカンは、種々の広範囲な機能をはたし、種々の細胞部 位で見いだされる。多くのプロテオグリカンは、細胞外マトリックスの成分であ り、細胞外マトリックスにおいて、このプロテオグリカンは細胞を集合させ、細 胞をマトリックスに付着させる。

細胞外マトリックスの主要な機能の１つは、増殖因子を貯蔵し、細胞に与えるこ とである。プロテオグリカンは、増殖因子結合の重要な媒介物であり、そのコア タン７＜り質およびグリコサミノグリカン部分を介して相互作用することによっ て種々の増殖因子の生物学的活性を変化させることが示されている（　Ｒｕｏｓ ｌａｈｔｉ、１９８９年；　ＲｕｏｓｌａｈｔｉおよびＹａｍａｇｕｃｈｉ、　 １９９１年）。

グリコサミノグリカンに結合する増殖因子には、酸性および塩基性ＦＧＦ　（Ｂ ｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ、　１９８９年を参照）、ＧＭ−ＣＳＦ、イン ターロイキン−３（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８８年）、プレイオドロフィン（Ｌ ｉら、１９９０年）、アンフィレグリン（５ｈｏｙａｂら、１９８８年）、ＨＢ −ＥＧＦ　（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら、１９９１年）および血小板因子４　（ Ｈｕａｎｇら、１９８２年）が含まれ、これらはそれぞれヘパリンおよびヘパラ ン硫酸塩に活発に結合する。ＦＧＦのヘパリンまたはヘパラン硫酸塩プロテオグ リカンへの結合により、増殖因子はタンパク質分解から保護され、マトリックス に結合した増殖因子貯蔵部を形成すると思われる（Ｓａｋｓｅｌａら、１９８８ 年；　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚら、１９９０年）、この貯蔵部から増殖因子 が、プロテオグリカンのコアタンパク質の部分的分解またはプロテオグリカンの ヘパラン硫酸塩部分の分解を介して、活性型で放出され得る（Ｓａｋｓｅｌａお よびＲｉｆｋｉｎ、１９９０年；　Ｉｓｈａｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉら、１９９０ 年）。塩基性ＦＧＦは、グリコサミノグリカンと結合し、シグナルトランスダク ションレセブターと相互作用し得る（　Ｙａｙｏｎら、１９９１年；　Ｒａｐｒ ａｅｇｅｒら、１９９１年）。

ＴＧＦ−βのプロテオグリカンへの結合は、種々のタイプの増殖因子−プロテオ グリカン相互作用を示す。ＴＧＦ−βは、少なくとも２つのプロテオグリカンの コアタンパク質に結合することが示されている。これらのプロテオグリカンの１ つは、デコリン、すなわち、そのコアタンパク質を介してＴＧＦ−βと相互作用 し得る小さな間質細胞外マトリックスプロテオグリカンである（　Ｙａｍａｇｕ ｃｈｉら、１９９０年）。ＰＣ−１１またはＰＧ−４０とじても知られるデコリ ンは、繊維芽細胞によって生成される小さなプロテオグリカンである。そのコア タンパク質の分子量は、約４Ｑ、　Ｇｏｏダルトンである。そのコアは、配列決 定され（にｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８３ニア６８３（１９８６）；　Ｄａｙら、 Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　２４８＋８０１　（１９Ｂ？）、これらの文献は、本明 細書に参考として援用される）、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸タイプの 単一なグリコサミノグリカン鎖を有することが知られている（本明細書に参考と して援用したＰｅａｒｓｏｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５８：１５ １０１　（１９８３）を参照）。

デコリンの機能で、以前から公知の唯一の機能は、夏型およびＩＩ型コラーゲン への結合、およびこれらのコラーゲンによるフィブリル形成に対する効力である （　Ｖｏｇｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２２３：５８７　（１９８４）；　５ ｃｔｕａｉｄｔら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０４：１６８３、（１９１１ ７））。デコリン（ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　１９８６年） は、主として、２０から２４個のアミノ酸からなるロイシンリッチ繰り返し単位 （ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ）からなる、約４０ｋＤａのコア タンパク質によって特徴づけられる一群のプロテオグリカンの始原型である（Ｐ ａｔｔｈｙ、　１９８７年）。これまで、この群のプロテオグリカンの４つのメ ンバーがクローニングされ、デコリンに加えて、これらは、パイグリカン（ｂｉ ｇｌｙｃａｎ）　（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８９年）、フィブロモジュリン（Ｏｌ ｄｂｅｒｇら、１９１１９年）およびルミカン（Ｂｌｏｃｈｂｅｒｇｅｒら、１ ９９２年）である。デコリンおよびパイグリカンは遍在性であるが、デコリンお よびパイグリカンは、組織内で全く分かれて存在する、すなわち、デコリンは組 織の細胞外マトリックス内により多く存在して、ｉ型コラーゲンに結合しくＶｏ ｇｅｌら、１９８４年；　５ｃｏｔｔ。

１９８６年；　ＢｒｏｗｎおよびＶｏｇｅｌ、１９８９年）、そしてパイグリカ ンは細胞の周囲により近接して存在する（　Ｂｉａｎｃｏら、１９９０年）。

フィブロモジュリンは、軟骨、酢、強膜に高濃度で幾分か限定されて分散するが 、皮膚および無機質化骨においては低濃度で分散する（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄら、 １９８６年）。ルミカンは、主に、角膜に見いだされる（　Ｂｌｏｅｈｂｅｒｇ ｅｒら、１９９２年）。これらのタンパク質は共に、タンパク質のスーパファミ リーを形成する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、　４：２２９．　（１９８８）；　ＭｃＦａｒＩ　ａｎｄら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４５：４９４　（１９８９））。

第２のタイプのＴＧＦ−β結合プロテオグリカンは、ｔｘｔ型ＴＧＦ−βレセプ ターであるベータグリカンである（　Ｓｅｇａｒｉｎｉおよび５ｅｙｅｄｉｎら 、１９８８年；　Ａｎｄｒｅｓら、１９８９年）。ベータグリカンは、明らかに 、ＴＧＦ−βシグナルトランスダクシ璽ン経路には関与しないが、ＴＧＦ−βを そのシグナルトランスダラシ１ンレセブタに与える細胞表面ＴＧＦ−β貯蔵部と して機能し得る細胞膜プロテオグリカンである（　Ｌ６ｐｅｚ−Ｃａｓｉｌ　ｌ ａｓら、１９９１年；ｆａｎｇら、１９９１年）。

形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、多くのタイプの細胞によって種々の形態 で生成される多機能細胞調節因子のファミリーである（Ｓｐｏｒｎら、Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５：１０３９．　（１９Ｂ？）を参照）。５つの異な るＴＧＦ−βが公知であるが、２つのＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ− β２の機能のみが詳細に特徴づけられている。ＴＧＦ−βは、米国特許第４．！ １６３．８９９号；第４．８１６．５６１号；および第４．７４２．００３号の 主題であり、これらの特許は、本明細書中で、参考として援用されている。ＴＧ Ｆ−β１およびＴＧＦ−β２は、商業上、多くのルートから入手可能である（例 えば、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ ）　ｏ　細胞によっては、ＴＧＦ−βは、細胞増殖を促進するが、細胞増殖を抑 制する場合もある。ＴＧＦ−βの顕著な効力は、細胞外マトリックスタンパク質 およびそれらのレセプターの生成を細胞によって促進することである（　Ｋｅｓ ｋｉ−Ｏｊａら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋　３３：９５　（１９Ｂ？ ）　；　Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｃｅ１ｌ　４９：４３７　（１９８７）；　ｒＰｅ ｐｔｉｄｅｓ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｅｐ ｔｏｒｓＪのＲｏｂｅｒ　ｔｓおよび５ｐｏｒｎ　［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ ｌａｇ、　）Ｉｅｉｄｅｌｂｅｒｇｌ　（１９８９）を参照）。

ＴＧＦ−βが、多くの重要な細胞制御機能を有しているのに対して、不適当なＴ ＧＦ−β活性は、生物に有害であり得る。間葉の成長および開票細胞の増殖は、 ＴＧＦ−βによって刺激されるため、い（つかの腫瘍細胞は、自己分泌増殖因子 としてＴＧＦ−βを使用し得る。従って、ＴＧＦ−βの増殖因子活性が妨害され るなら、腫瘍増殖は制御され得る。場合によっては、ＴＧＦ−βによる細胞増殖 の阻害は、傷ついた組織の治癒を妨げ得るという点において有害であり得る。Ｔ ＧＦ−βによる細胞外マトリックス生成の刺激は、創傷治癒などの場合に重要で ある。しかし、場合によっては、人体は、この応答を非常に遠方でとらえ、細胞 外マトリックスの過剰な蓄積が引き起こされる。細胞外マトリックスの過剰な蓄 積の例としては、ＴＧＦ−βの有害な関与を伴う疾病である糸球体腎炎が挙げら れる。

従って、ＴＧＦ−βなどの細胞調節因子の効力を変化させ得る化合物を開発する 必要がある。本発明は、この要求を満足し、それに関連した利点を提供する。

及豆囚斐１ 本発明は、細胞調節因子の活性を阻害する方法であって、細胞調節因子を精製ポ リペプチドに接触させる工程を包含し、ポリペプチドが、タンパク質の細胞調節 因子結合ドメインを含み、タンパク質が、約２４個のアミノ酸からなるロイシン を多量に含む繰り返し単位によって特徴づけられる、方法を提供する。特定の実 施態様では、本発明は、デコリン、すなわち、通常１つのグリコサミノグリカン 鎖を有する４０．Ｇｏｏダルトンのタンパク質の、ＴＧＦ−βを結合する能力に 関する。本発明はまた、形態回復因子（ＭＲＦ）として称される新規な細胞調節 因子を提供する。さらに、細胞調節因子および細胞調節因子に結合し、その活性 に影響を与えるタンパク質を同定し、検出し、精製する方法が提供される。

本発明は、さらに、創傷にデコリンまたはデコリンの機能的等傷物を投与するこ とによって、はん痕形成を予防または緩和する方法に関する。この方法は、熱傷 、外傷または手術から生じる皮膚創傷に特に有用である。さらに、本発明は、デ コリンまたはデコリンの機能的等価物と、このような方法に有用な薬学的に許容 可能な担体とを含有する薬剤組成物を含む。最後に、デコリンを投与することに よる病理症状を予防または抑制する方法もまた提供される。

図面の簡単な説明 図１は、セリン受容体部位のアラニンへの変異を含むデフリンｃＤＮＡの発現を 示す。ＣＯ５−１培養物を、野生型デフリン（レーンｌ）、セリン−４残基がア ラニンで置換されたデフリン（レーン２）、またはセリン−４残基がスレオニン で置換されたデフリン（レーン３）をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトし た。抗デコリン抗体および３５Ｓ−硫酸塩（Ａ）またはＪ−ロイシン（Ｂ）で標 識した培地を用いて免疫沈降を行った。

レーン４は、模擬トランスフェクトｃｏｓ−を培養物からの免疫沈降物を示す。

矢印は、ゲルの頂部を示す。数字は、分子量標準のｖｒｘｔｏ−’を示す。

図２は、［１２’ＩＩ−ＴＧＦ−β１とデフリンセファロースとの結合ヲ示す。

図２Ａは、デコジンーセファロースアフイニテイークロマトグラフィーによる［ １２５１１−ＴＧＦ−β１の分画を示す。［１２５＋］−ＴＧＦ−β１　（５Ｘ 　１０１０５ｃｐを、０．２ｍｌの充填デフリンセフ１０−ス（・）またはＩＭ のＮａＣ１および０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含む２１１１のＰＢＳ　ｐＨ ７，４中のゼラチン−セファロース（Ｏ）と、ＢＳＡでコートされたポリプロピ レン管中でインキュベートした。−昼夜インキュベートした後、アフィニティー マトリックスを、ＢＳＡでコートされた使い捨てカラム（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）に移 し、結合緩衝液で洗浄した。まず、この結合緩衝液中３ＭのＮａＣ１で溶出を行 い、次いで、同一の緩衝液中８Ｍの尿素で溶出した。図２Ｂは、非還元条件下で 、５ＤＳ−ボッアクリルアミドゲルによるデフリン−セファロースアフィニティ ークロマトグラフィーの溶出物の分析を示す。レーン１：オリジナルの［１２５ 目標識ＴＧＦ−βｌ試料；レーン２−７：素通り画分および洗浄画分；レーン８ −１０：３ＭのＮａＣ１画分；　レーン１１−１４：８Ｍの尿素画分。

矢印は、１２％の分離ゲルの頂部および底部を示す。

図３は、プロテオグリカンおよびそのコアタンパク質による、［”５１Ｆ−ＴＧ Ｆ−βｌとデフリンとの結合の阻害を示す。図３Ａは、組換デフリン（・）、ウ シの皮膚から単離されたデフリン（ＰＣＩＩ）　（■）、ウシの関節軟骨（ＰＣ Ｉ）がら単離されたパイグリカン（ム）、ニワトリの軟骨プロテオグリカン（０ ）、およびＢＳＡＣ口）による、［’　２５１３−ＴＧＦ−β１と、デフリンで コートされたマイクロタイターウェルとの結合の競合を示す。

各点は、２組の決定群の平均を示す。図３Ｂは、［’　２５１　］−ＴＧＦ−β ｌと、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理プロテオグリカンおよびＢＳＡとの結合の 競合を示す。競合物質の濃度を、無傷のプロテオグリカンとして表した。ンンボ ルは、図３Ａのシンボルと同一である。

図４は、デフリンによるＴＧＦ−β１の増殖調節活性の中和を示す。図４Ａは、 デフリンによるＣｌｌ０細胞のＴＧＦ−βｌで誘発された増殖の阻害を示す。［ ３旧チミジン取り込みアッセイは、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１と示されたＩＩ の精製デフリン（・）またはＢＳＡ　（○）との存在下で、図１で説明したよう に行った。使用した濃度では、ＴＧＦ−β１は、ＣＨＯ細胞における［１月チミ ジン取り込みの５０％増加を誘発した。データは、この増殖刺激の中和パーセン トを示す。すなわち、ＴＧＦ−βｌまたはデフリンのどちらかが欠如している場 合の［３旧チミジン取り込みが０％であり、ＴＧＦ−βは存在するが、デフリン が存在しない場合の取り込みが１００％である。各点は、３組の試料の平均上標 準偏差を示す。図４Ｂは、デフリンによる、ＭｖＬｕ細胞におけるＴＧＦ−β１ で誘発された増殖阻害の中和を示す。アッセイは、ＴＧＦ−β１を０．５ｎｇ／ ｍｌで加えたこと以外は、Ａと同様に行った。このＴＧＦ−β１の濃度は、Ｍｖ Ｌｕ細胞における［３月チミジン取り込みの５０％減少を誘発した。データは、 ＴＧＦ−βで誘発された増殖阻害の中和を示す。すなわち、ＴＧＦ−βかっデフ リンが欠如している場合の［１月チミジンの取り込みが１００％であり、ＴＧＦ −βは存在下するが、デフリンが存在しない場合の取り込みが０％である。

図５Ａは、ゲルろ過による、デコジン発現ＣＩＯ細胞からの増殖阻害活性の分離 を示す。デフリン過剰発現細胞の無血清の馴化培地を、中性トリスＩＩｃＩ緩衝 液中でＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーにより分画し、増殖阻害活性 を含む画分をプールし、グアニジン−ＨＣｌで４Ｍにし、同一のグアニジン−Ｈ Ｃ１溶液で平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂカラム上で分画した。

画分のタンパク質含有量、デフリン含有量および増殖調節活性を分析した。マー カータンパク質の溶出位置を矢印で示す。

ＢＳＡ：ラン血清子ルブミン（Ｍｒ＝６６．０００）　；　ＣＡ：炭酸脱水酵素 （Ｍｒ＝２９，０００）　；　ＣＹ：チトクロームｃ　（Ｍｒ＝１２．４００） 　；　Ａｐ：アプロチニン（Ｍｒ□６，５００）　；　ＴＧＦ：［＋２５Ｉ］− ＴＧＦ−β１　（Ｍｒ＝２５，０００）　０図５Ｂは、ゲルろ過により得られる 増殖刺激物質のＴＧＦ−βｌとしての同定を示す。セファロース６Ｂからの後期 画分の増殖刺激活性（パネルＡの棒線）を、抗ＴＧＦ−β抗血清に由来するプロ ティンＡ精製１ｇＧを用いてその活性を阻害することによって同定した。データ は、［３旧チミジン取り込みアッセイにおける増殖刺激活性の阻害パーセントを 示す。各点は、３組の決定群の平均±標準偏差を示す。抗−ＴＧＦ−β１（・） 、正常ウサギＩｇＧ　（○）。

図６は、ＴＧＦ−β１に対する抗体によって抑制されないデフリン結合細胞調節 活性を示す顕微鏡写真を示す。

図７は、デフリンが、ＨｅｐＧ２細胞上での［’　２５ＩＩ−ＴＧＦ−βとＩＩ Ｉ型ＴＧＦ−βレセプター（βグリカン）との結合を阻害することを示す。図７ ８は、４−１２％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解されたＨｅｐＧ２細胞の非還元溶 解物を示す。図７ｂは、４−１２％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解された還元溶解 物を示す。デフリン（１０，０００Ｘモル過剰）存在下での、βグリカンバンド （約３００ｋＤａ）および非架橋バンド（ＴＧＦ−βを含まない、２５ｋＤａ） の強度の減少を示す。

図８は、デフリンが、ＭＧ−６３細胞上での［’　２５１１−ＴＧＦ−βと１１ ｒ型ＴＧＦ−βレセプターとの結合を阻害することを示す。図８８は、非還元条 件下での、４−１２％の５ＯＳ−ＰＡＧＥ上の溶解物の分解を示し、図８ｂは、 還元条件下での結果を示す。

図９は、デフリン（ＤＣ−９，ＤＣ−１２）およびバイオグリカンが、［”ｌ］ −ＴＧＦ−βと固定デフリンとの結合を阻害すること示す。

図１Ｏは、［１２５１］−ＴＧＦ−βとＨｅｐＧ２細胞との結合をデコリンが阻 害する場合の濃度依存性を示す。

図１１は、ｃＤＮＡから推定されたヒトフィブロモジニリンのアミノ酸配列を示 す。ヒトフィブロモジニリン配列を、ウシのフィブロモジニリン（Ｏｌｄｂｅｒ ｇら、１９１１９年）、ヒトデコリン（ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔ ＋、　１９８６年）およびヒトバイグリカン（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８９年）の アミノ酸配列と並べて示す。星印は、推定されたシグナル配列を欠失するプロテ オグリカンコアタンパク質のＮ）＋２−末端が、連結部位に付加されたさらに２ つのアミノ酸（グリシンおよびセリン）を有するＥ、ｃｏｌｉ−マルトース結合 タンパク質（ＭＢＰ）に融合した配列位置を示す。

同一のアミノ酸は箱印で囲んでいる。

図１２は、プロテオグリカン融合タンパク質の原核発現ベクターの構築を示す。

親ベクターｐＱＥ−８は、Ｂｇｌｌｌ／Ｂａ＋ｍ旧−ＭＢＰフラグメントを挿入 することによって改変した。このフラグメントはまた、因子Ｘａプロテアーゼ開 裂部位を含み、プロテオグリカンコアタンパク質挿入フラグメントを導入するた めの唯一のＢａ＋＊ＨＩクローニング部位を提供した。［ｌＢＳ　＝リポソーム 結合部位＋　６Ｘｌｉ５＝連続した６個のヒスチジンのコード配列：　ＭＢＰ＝ Ｅ、ｃｏｌｉ−マルトース結合タンパク質のコード配列；（０＝λフアージの転 写ターミネータ−「ｔｏＪ　（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９８７年）　；　ｃａＬ ＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのプロモーター非含有遺伝 子；　Ｔ１＝Ｅ、ｃｏｌｉ　ｒｒｎＢオペロンの転写ターミネータ−ＴＩ　（Ｂ ｒｏｓｉｕｓら、１９８１年）。

図１３は、精製された組換プロテオグリカンコア融合タンパク質のゲル電気泳動 による分析を示す。各精製タンパク質（１μｇ／ウェル）を、４−２０％（７） ＮａＤｏｄＳＯａ　−ホリ７　り’Ｊ　７　ミＦ　ケルに充填した。非還元条件 下で電気泳動を行った後、ゲルをクーマシープル−Ｒ−２５０で染色した。Ａ＝ マルトース結合タンハク質；　Ｂ＝ＭＢＰ−ハイク’７　ｈ　ン；　Ｃ＝ＭＢＰ −７’：ｌ　！Ｊ　７；　Ｄ＝ＭＢＰ−フィブロモジニリン。分子量マーカータ ンパク質のサイズ（ｋＤａ）を示す。

図１４は、放射標識プロテオグリカン融合タンパク質およびＭＢＰと、ＴＧＦ− β１でコートされたマイクロタイターウェルとの結合を示す。ＴＧＦ−βｌを、 示された濃度（７５μｌ／ウエル）中で使用して、マイクロタイターウェルをコ ートした。ウェルを１２５１で標識されたＭＯＰ−パイグリカン（■）、ＭＢＰ −デコリン（・）、ＭＢＰ−フィブロモジニリン（ム）またはＭＢＰ　（◆）と インキュベートした。一定量（約５０．０００ｃｐ＋ｅ／ウエル、比活性２３０ ０−２８００ＣＩ／＊ｍｏｌ）の標識タンパク質を、ＴＧＦ−βｌでコートした ウェル（全容量１００μｌ）に加えた。３７℃で６時間インキュベートした後、 ウェルを４回洗浄した。ガンマ線計数管で全ウェルを計数することによって、Ｔ ＧＦ−β１−結合を測定し、ウェルに加えられた標識タンパク質の全量のパーセ ントとして表す（±Ｓ、　Ｄ、　）。

図１５は、ＴＧＦ−βｌに結合するプロテオグリカンコアタンパク質の特異性を 示す。マイクロタイターウェルを、示されたタンパク質（７５μｌ／ウエル、３ μｇ／＋ｉｌ）でコートした。１２５１−ＭＢＰ−バイオグリカン（斜線のはい った棒線）、”’Ｉ−ＭＯＰ−デコリン（黒塗りの棒線）または”’Ｉ−ＭＢＰ −フィブロモジコリン（クロス斜線のはいった棒線）をウェル（全容量１００μ ｌ）ニ加えた。３７℃で６時間インキュベートした後、ウェルを３回洗浄し、ガ ンマ線計数管で計数した。結合（±Ｓ、　Ｏ，＞は、ウェルに加えられた標識タ ンパク質の全量のパーセントとして表される。

図１６は、ＭＢＰ−パイグリカンとＴＧＦ−βｌとの結合の時間経過を示す。＋ ２Ｊ−ＭＢｐ−パイグリカンを、４℃（・）または３７°Ｃ（■）でそれぞれ、 ＴＧＦ−βｌでコートされたウェル（７５μ１１１ｕｇ／ｍｌ）に加えた。示さ れたタイム期間後、ウェルを３回洗浄し、ガンマ線計数管で計数した。結合（± Ｓ、　Ｄ、　）は、加えた１２’Ｉ−ＭＢＰ−パイグリカンの全量のパーセント として表す。

図１７は、プロテオグリカン融合タンパク質および無傷のプロテオグリカンによ る、バイグリカン融合タンノヤク質とＴＯＦ−β１との結合の阻害を示す。＋２ ５１−ＭＢＰ−パイグリカンとＴＧＦ−βｌとの結合を、示された濃度の（Ａ） 非標識のＭＢＰ−ＢＧ　（！Ｉ）、ＭＢＰ−ＤＥＣ（・）、ＭＢＰ−ＦＭ　（ム ）またはＭＢＰ　（◆）または（Ｂ）精製されたパイグリカン（閣）、デコリン （・）またはフィブロモジニリン（ム）の存在下で測定した。３７°Ｃで６時間 インキュベートした後、ウェルを３回洗浄し、ガンマ線計数管で計数した。結合 （±Ｓ、Ｄ、）を競合物質の非存在下で結合した放射１ｍ（７）パーセントとし て表す。

図１８は、放射標識されたＴＧＦ−β１、−β２および一β３と、パイグリカン 融合タンパク質でコートされたマイクロタイターウェルとの結合の競合を示す。

１′■で標識されたＴＧＰ−β１（黒塗りの棒線）、ＴＧＦ−β２（斜線のはい った棒線）またはＴＧＦ−β３（白ぬきの棒線）　（５Ｇ、ＯＯＯｃｐｍ／ウェ ル、比活性ｓ、ｏｏｏ〜７．０ＯＯＣＩ／ｗｎｏｌ）と、表面結合されたＭＢＰ −パイグリカン（コーティング濃１ｉ１０μｇ／ｍｌ、７５μｌ／ウエル）との 結合を、非標識のＭＢＰ−ＢＧ、　ＭＢ−ＤＥＣ％ＭＢＰ−ＦＭ、　ＭＢＰ、パ イグリカン、デコリンまたはフィブロモジニリン（１８Ｍ）の非存在（対照）ま たは存在下で調べた。結合を、ウェルに加えられた標識されたＴＧＦ−β１．２ または３の全量のパーセント（±Ｓ、　Ｄ、　）として表されるように、非特異 的結合に対して補正した。

図１９は、プロテオグリカン融合タンパク質による、標識ＴＧＦ−β１とＭｖＬ ｕ細胞との結合の競合を示す。　（Ａ）４８ウエルプレート中で培養しＭｖＬｕ 　ミンク肺細胞の半集密性（５ｕｂｃｏｎｆ　Ｉｕｅｎｔ）培養物を、全量１０ ０μ＋中で非標識のＴＧＦ−β１　（２０ｎＭ）または示された濃度のプロテオ グリカン融合タンパク質の存在下（ｎ、　ｓ、　）または非存在下（Ｂｏ）で、 ＋２５１−７（Ｈｐ−β１　（１００ｐＭ）とインキュベートした。４℃で４時 間インキュベートした後、細胞を４回洗浄した。次いで、細胞を１％のＴｒｉｔ ｏｎ−Ｘｉ００中で４０分間溶解し、ガンマ線計数管で放射活性をアッセイした 。結合（±Ｓ、Ｄ、、　ｎ＝３）は、加えられた＋２５１−ＴＧＦ−β１の全量 のパーセントとして表す。（Ｂ）　ミンク肺細胞を、２４ウエルプレート中の非 標識のＴＧＦ−β（２０ｎＭ）またはＭＢＰ−融合タンパク質（３μＭ）の非存 在または存在下で、”’Ｉ−ＴＧＦ−β１（１００９Ｍ）とインキュベートした 。４℃で４時間インキュベートした後、細胞を、スペリン酸ジスクシンイミジル の架橋剤で処理し、ＮａＤｏｄＳＯａ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー で分析した。競合物質（ａ）の非存在下での、ＴＧＦ−β１　（ｂ）　、ＭＢＰ −ＢＧ（ｃ）、ＭＢＰ−ＤＥＣ（ｄ）、ＭＢＰ−ＦＭ　（ｅ）またはＭＢＰ（ｆ ）の結合。予め染色したマーカータンパク質の位置を示す。丁ＧＦ−βＩ型およ び１！型レセプター、およびベータグリカン（β−Ｇ）の位置を示す。矢印は、 レセプターおよびベータグリカン（β−Ｇ）を指し示す。

灸朋９ＪＩＵＬ敬咀 ＴＧＦ−βの生産の増加は、細胞外マトリックス成分の蓄積によって特徴づけら れる多数の線維症の疾病において、重要な要素であることが見いだされている（ ＢｏｒｄｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｔ、　１９９２）。フィブロネクチン、コ ラーゲンおよびテネイシン（ＩｇｎｏｔｚおよびＭａ’ｓｓａｇｕｅｓ　１９８ ６ＨＶｅｒｇａら、１９８７；　Ｐｅａｒｓｏｎら、１９８ｇ）のほかに、ＴＧ Ｆ−βもまた、プロテオグリカンの発現を促進する（ＢａｓｓｏｌｓおよびＭａ ｓｓａｇｕｒｅ、　１９８８）　ｏ　メサンギウム細胞では、ＴＧＦ−βによる 誘発後、デフリンとバイグリカンの両方が５０倍にも増加し得る（　Ｂｏｒｄｅ ｒら、１９９０ａ）のに対して、線維芽細胞ではパイグリカンのみが増えるよう である（　Ｒｏｍａｒｉｓら、１９９２；　Ｋａｈａｒｉら、１９９１）。フィ ブロモジニリンはこの点については研究されていない。ＴＧＦ−βは実験的に誘 発された糸球体腎炎の病原において、極めて重要な役割を果たし、その最も臨界 的な発現は糸球体での細胞外マド１ルツクスの蓄積である（Ｂｏｒｄｅｒら、１ ９９０）。近年の研究は、組換デフリンを糸球体腎炎のラットに注入すると、マ トリックス蓄積を抑制し得ることを示している（　Ｂｏｒｄｅｒら、１９９２） 。本発明は、フィブロモジニリンがそのような状態においてさらに効果的である ことを示している。デフリン型プロテオグリカンの活性を中和する丁ＧＦ−βは 、これらの分子に基づいて、新規な型の治療法を開発し得ることを示している。

本発明は、細胞調節因子の活性を阻害する方法を提供する。

この方法は、細胞調節因子を精製ポリペプチドと接触させることを包含し、ここ でこのポリペプチドは、タンパク質の細胞調節因子結合ドメインを含み、そして このタンパク質は約２４のアミノ酸のロイシンリッチ繰り返し単位によって特徴 づけられる。癌のような疾病は、制御されない細胞の増殖によるものなので、本 発明はそのような疾病の処置に用いられる。

「細胞調節因子」は、細胞の活性を調節し得る分子を意味する。細胞調節因子と は、一般には細胞表面レセプターを結合させるタンパク質で、増殖因子を含む。

細胞調節因子の例は、５つのＴＧＦ−β、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、 インシュリン様成長因子ｌおよび１１、線維芽細胞増殖因子、インターロイキン −２、神経成長因子、造血細胞増殖因子（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ％Ｍ−ＣＳＦ 、　Ｇ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン）および以下でｒＭＲＦＪと称する新しく 発見された形態回復因子を含む。種々の調節因子は、調節因子の活性を影響し得 る種々のタンパク質によって結合し得る。例えば、ＴＧＦ−β１はデフリン、バ イグリカンおよびフィブロモジニリンにより、ＭＲＦはデフリンにより結合する 。

「細胞調節因子結合ドメインｊは、細胞調節因子に結合するタンパク質のフラグ メントを意味する。本明細書に記載される特定の実施例はタンパク質を利用する が、結合活性を保持するタンパク質フラグメントが本発明の範囲内に含まれてい ることが理解される。そのような活性を保持するフラグメントは、例えばデフリ ンをＴＧＦ−βに、あるいはロイシンリッチ繰り返し単位を含む他のポリペプチ ドをその同族体増殖因子に結合することを競合的に阻害する能力により認識され 得る。１例として、フラグメントは未変性のポリペプチドの加水分解、あるいは 周知のアミノ酸配列に基づくフラグメントの合成によって得られ得る。そして、 そのようなフラグメントは、競合アッセイに用いられ、結合活性を保持するかど うかが決定され得る。例えば、デフリンは、実施例１１の方法によるように、親 和性マトリックスに付着し得る。次いで、標識ＴＧＦ−βおよび当該のフラグメ ントは親和性マトリックスと接触し得、それに結合するＴＧＦ−βの量が測定さ れ得る。

本明細書で用いられるように、「デフリン」は、ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓ ｌａｈｔｉ　（前出）においてデフリンに属する構造的特徴を実質的に有するプ ロテオグリカンを称している。ヒト線維芽細胞デフリンは、Ｋｒｕｓｉｕｓおよ びＲｕｏｓｌａｈｔｉ　（前出）に示されるアミノ酸配列を実質的に有している 。「デフリン」は、未変性の組成物と、機能的特徴を実質的に保持する改変物と の両方を称している。デフリンコアタンパク質は、実質的にグリコサミノグリカ ンとは置換を行わないデフリンを称し、デフリンの定義内に含まれる。デフリン は、変異あるいは他の手段（例えば、グリコサミノグリカン鎖をコアタンパク質 に付着させることのできない細胞において、組換デフリンを生成すること）によ って、グリコサミノグリカンを取り除く。

デフリンの機能的等傷物は、デフリンの機能的特徴を保持するデフリンの改変物 、および、例えばデフリンと類似の機能的活性を有するパイグリカンおよびフィ ブロモジニリンのような、デフリンと相同性の分子を含む。改変物は、例えば、 デフリンコアタンパク質の機能的活性に干渉しない１つまたはそれ以上の側鎖の 付加を含む。

各々の調節因子結合タンパク質は、タンパク質の約８０％を構成し得る約２４の アミノ酸のロイシンリッチ繰り返し単位を含有するので、結合活性を保持するフ ラグメントは、ロイシンリッチ繰り返し単位において生しると思われる。しかし 、結合活性が、カルボキシ末端アミノ酸、あるいは繰り返し単位とカルボキシ末 端アミノ酸との連結部分に存在することは考えられる。

本発明は、当業者が細胞調節因子に結合し得るタンｉ４り質、あるいは特定のフ ァミリーのタンパク質に結合する細胞調節因子を同定し得る一般的な方法を教示 する。本発明はまた、これらの新規なタンパク質、あるいは周知の在来のタン／ くり質を、細胞調節因子の活性に影響を及ぼすかどうかを測定するためにアッセ イし得る一般的な方法を教示する。特１こ、本発明は、デフリンおよびバイグリ カンがＴＧＦ−βおよびＭＲＦと結合し、そのような結合によりＴＧＦ−βの細 胞調節機能が抑制される、という発見を教示している。さらに、デフリンおよび パイグリカンは、約８０％相同であり、ロインン残基の配列が保存されている約 ２４のアミノ酸のロイシンリッチ繰り返し単位を含有する。定義されているよう に、各繰り返し単位は、一般的に少なくとも２つのロイシン残基を含有し、５つ またはそれ以上のロインン残基を含有し得る。故に、これらのプロテオグリカン は、同じタンパク質ファミリーのメンバーであると考えられる。Ｒｕｏｓｌａｈ ｔｉ　（前出）、Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｔ、　２６４：４ ５７１−４５７６　（１９８９）およびＰａｔｔｈｙ％Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ。

１、、１９８：５６７−５７７　（１９８７）を参照。すべては参考として援用 される。このロイシンリッチ繰り返し単位、すなわちフィブロモジュリンを有す る、他の周知のあるいは最近発見されたタンパク質は、類似の細胞調節活性を有 すると思われる。このようなタンパク質の細胞調節因子と結合する能力は、例え ば、アフィニティークロマトグラフィー、あるいは実施例１■に記載されるよう にＴＧＦ−βなどの周知の細胞調節因子を用いるマイクロタイターアッセイによ り、容易に試験され得る。あるいは、最近発見された細胞調節因子は、例えば、 １つまたはそれ以上の調節因子結合タンパク質を用いたアフィニティークロマト グラフィーによって、いずれも試験され得る。一旦そのような結合が生じること が決定されると、実施例Ｉ１１に記載される増殖アッセイなどの方法により、す べての調節因子の活性への結合の影響を測定する。さらに、当業者は、実施例に おいて、新規な細胞調節因子をＴＧＦ−βと、あるいは、新規なロイシンリッチ 繰り返し単位タンパク質をデフリンあるいはパイグリカンと、単に置換すること で、それらの活性を測定し得る。故に、本発明は、新規な細胞調節因子とこれら の因子の活性に影響を及ぼすタンパク質とを同定し試験するための、一般的な方 法を提供する。

本発明はまた、精製ポリペプチドに付着する細胞調節因子を含む新規な精製化合 物であり、ポリペプチドが、タンパク質の細胞調節因子結合ドメインを含み、タ ンパク質が、約２４のアミノ酸のロイシンリッチ繰り返し単位によって特徴づけ られる、化合物を提供する。

さらに本発明は、約２０ｋｄの分子量を有するＭＲＦと称される新規な精製タン パク質を提供する。このタンパク質は、ＣＩＯ細胞から単離され得、非解離条件 下でデフリンと共精製し、解離条件下でデフリンから分離し、形質転換３Ｔ３細 胞の形態を変化させ、抗ＴＧＦ−β１抗体により阻害されない活性を有する。さ らに、ＨＰＬＣにおいて、ＭＲＦはＴＧＦ−β１から分離する。

さらに本発明は、細胞調節因子を精製する方法を提供する。

この方法は、この調節因子を、細胞調節因子と結合し、そして約２４のアミノ酸 のロイシンリッチ繰り返し単位を有するタンパク質と接触させて、タンパク質と 結合するようになる調節因子を精製することを包含する。この方法は、例えば、 デれ得る。

さらに本発明は、ＴＧＦ−β−調節活性により生じた病状を処置する方法を提供 する。この方法は、ＴＧＦ−βを精製ポリペプチドと接触させることを包含し、 ここで、このポリペプチドはタンパク質のＴＧＦ−β結合ドメインを含み、そし て、このタンパク質は約２４のアミノ酸のロイシンリッチ繰り返し単位により特 徴づけられており、それによって病状がもたらされる活性を妨害するか、あるい は低下させる。本方法は一般的に用いられ得るが、処置され得る病状の特定の例 は、癌、線維症の疾病、および糸球体腎炎を含む。例えば、線維症の癌では、デ フリンはＴＧＦ−βに結合するために使用され得、癌細胞におけるＴＧＦ−βの 増殖刺激活性を破壊する。他の増殖性の病状は、慢性関節リウマチ、動脈硬化症 、成人呼吸促進症候群、肝硬変、肺線維症、術後心筋梗塞、心臓線維症、血管形 成術後回狭窄、腎間質性線維症、およびケロイドおよびはん痕形成などの特定の 皮膚線維症の症状を含む。

本発明はまた、細胞調節因子の阻害を妨害する方法を提供する。本方法は、細胞 調節因子の活性を阻害するタンノくり質を、このタンパク質の活性を阻害する分 子に接触させることを包含する。例えば、デフリンは、ＴＧＦ−βとデフリンと が結合することを妨害する分子（例えば抗体）と結合し、故にデフリンがＴＧＦ −βの活性を阻害するのを妨害し得る。従って、ＴＧＦ−βの創傷治癒活性は、 ＴＧＦ−β１のインヒビターに結合することにより促進され得る。

さらに、デフリンはＴＧＦ−βがそのレセプターに結合することを阻害すること が見いだされている。図７．８および１ｏは、デフリンが存在する条件および存 在しない条件下で、ＴＧＦ−βレセプター（ベータグリカン）を有する細胞をＴ ＧＦ−βと、インキュベートした研究の結果を示している。

さらに本発明は、デフリンあるいはデフリンの機能的等偽物を創傷に投与するこ とによって、はん痕形成を予防あるいは緩和する方法に関する。皮膚のはん痕形 成は、種々の皮膚の損傷に次いで、コラーゲン、フィブロネクチンおよびプロテ オグリカンを、含む線維組織の過剰な蓄積で生じる経過である。線維のマトリッ クス蓄積の誘発は、血小板および炎症細胞による創傷部位における増殖因子の放 出によって生じる。

線維はん癌組織の沈着を誘発すると考えられている主要な増殖因子は、形質転換 増殖因子−β（ＴＧＦ−β）である。デフリンは、結合し、細胞外マトリックス の誘発を含むＴＧＦ−βの種々の生物学的機能を中和する。この線維細胞外マト リックスに弾性特性がないため、深い皮膚の損傷から生ずるはん癌組織はしばし ば重要な組織機能を損ない、醜悪なはん痕になり得る。

本発明の方法において、デフリン、または、バイグリカンまたはフィブロモジュ リンのようなデフリンの機能的等価物を使用する利点は、それが正常なヒトのタ ンパク質であり、天然のＴＧＦ−β調節経路に関係があると考えられていること である。故に、デフリンは、熱傷、他の侵襲性の皮膚損傷、および美容手術また は復元手術がら生じる皮膚のはん痕形成を予防し、あるいは緩和し得る。

デフリン処理創傷は、デフリンで処理されていない対照創傷と比較すると、検出 可能なはん痕が本質的にないことが見いだされている。ＴＧＦ−β−誘発はん痕 形成経過は、成人および第３トリメスターのヒト胎児にのみ見られるが、第１お よび第２トリメスターの間の胎児には本質的に存在しない。胎児の創傷にはん痕 がないことは、創傷床にＴＧＦ−βがないことと相互関係がある。対して、成人 組織の創傷床には丁ＧＦ−βががなり沈着しており、十分に処理された創傷に代 わって、かなり線維性である膠原性マトリックスを含有する、赤くなった溝状の はん痕になる。デフリン処理創傷は、組織学的に正常であり、第１および第２ト リメスターの胎児の創傷に類似していた。

さらに本発明は、デフリンあるいはその機能的等飾物（例えば、バイグリカンあ るいはフィブロモジュリン）と、上記の方法において有用な薬学的に許容可能な 担体とを含有する薬剤組成物に関する。薬学的に許容可能な担体は、例えば、ヒ アルロン酸、および、重炭酸イオン緩衝液、リン酸緩衝液、リンガ−溶液、所望 であれば５％のブドウ糖あるいはヒト血清アルブミンを補足した生理的塩類溶液 などの水溶液を含む。

薬剤組成物は当業者に周知である創傷治癒を促進する他の物質も含み得る。その ような物質は、例えば、生物学的に活性な化学物質およびポリペプチド（１９９ ０年６月２８日に公開されたＰＣＴ　１０９０１０６７６７に記載されている生 分解性ポリマーに付着するＲＧＤ含有ポリペプチドを含む）を含み得、それらは 本明細書に参考として援用されている。そのようなポリペプチドは、当該分野で 周知のいずれかの手段（例えば共有結合またはイオン結合を含む）によってポリ マーに付着し得る。

ＴＧＦ−β、ＭＲＦ、デフリン、バイグリカンおよびフィブロモジュリンを含む 本発明の種々の分子の活性に影響を実質的に与えない改変物もまた、これらの分 子の定義内に含まれることは理解される。デフリン、バイグリカン、フィブロモ ジュリンのコアタンパク質もまた、これらの分子の定義内に含まれることも理解 される。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を制限するもので はない。

実施例１ デフリンおよびデフリンコアタンパク　の鉦ｌユ９１裂 発Ｊし孜 ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８３ニア６８３　（１９８６）　（この開示内容は、本 明細書に参考として援用されている）に記載された全長１．　［ｌＫｂのデフリ ンｃＤＮＡを、デフリン発現ベクターの構築に用いた。デフリンコアクン、ｆり 質の発現に対して、ｃＤＮＡは変異を生じ、その結果、セリンをコードする４番 目のコドン、ＴＣＴが、トレニオンをコードするＡＣＴまたはアラニンをコード するＧＣＴに変化した。

これは、Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ　ＵＳ Ａ　８２：４８８　（１９８５）（この開示内容は、本明細書に参考として援用 されている）の方法に従って、部位特異的変異誘発によって作製する。適切な変 異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって確認される。

哺乳類発現ベクターｐｓＶ２−デコリンおよびｐＳＶ２−デフリン／　ＣＰ　− ｔ　ｈ　ｒ　４コアタンパク質は、デフリンｃＤＮＡまたは変異デフリンｃＤＮ Ａを、ｐｓＶ２の３．４ｋｂＨｉｎ旧ＩＩ一旦Ｕ旧のフラグメントに連結するこ とによって構築した（Ｍｕｌｌ　ｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２０９：１４２３　（１９８Ｇ）、この開示内容は、本明細書に参考として援用 されている）。

ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）−ネガティブＣＨＯ細胞（（：ＨＯ−Ｃ Ｏ４４）を、リン酸カルシウム共沈法によって、ｐＳｖ２−デフリンまたはｐＳ Ｖ２−デフリン／ＣＰおよびｐＳＶ２（Ｉｈｆで共にトランスフェクトした。ｐ ＳＶ２−デフリンによってトランスフェクトされたＣ）１０−ＣＯ４４細胞は、 寄託番号Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、　ＣＲＬ１０３３２に基づいて、Ａｍｅｒｉｃａｎ 　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されている。トランス フェクト細胞を、９％の透析ラン胎児血清、２ｍＭのグルタミン、１００　単位 ／　ｔａ　ｌのベニンジンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足 した、ヌクレオシド非含有α改変最小必須培地（α−ＭＥＭ）　（ＧＩＢＣＯ， Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ）中で培養した。トランスフェクト細胞から生じるコロ ニーをクローニングシリンダーを用いて選び取り、膨張させ、ｆｆｓ　３０　、 で標識した培養の上澄みから免疫沈降させることによって、デフリンの発現を調 べる。次いで、実質的な量のデフリンを発現するクローンを、０．６４μＭまで 段階的に増加する濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）によって、遺伝子増幅した （　ｋａｕｆｉａｎおよび５ｈａｒｐ、　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５９＋６０１　（１９８２）、その開示内容は、本明 細書に参考として援用されている）。希釈液を限定するか、または単−ＭＴＸ抵 抗性コロニーを選択するかによって、全ての増幅細胞系をクローニングした。こ れらの樹立細胞系の保存培養を、ＭＴＸ含有培地で維持した。タンパク質生成に 使用する前に、細胞を、保存培養からＭＴＸ非含有培地に副次培養し、そして、 この培地を少なくとも一度通し、存在し得るＭＴＸ効果を取り除いた。

一方、ＡｄａｍｓおよびＲｏｓｅ、　Ｃｅ１ｌ　４１：１Ｏ０７、（１９８５） 　（この開示内容は、本明細書に参考として援用されている）に記載されている ように、コアタンパク質をＣＯ３−１細胞で発現させた。簡潔に言えば、６つの ウェルのマルチウェルプレートに、９．６ｃｍ２の増殖面積当り、３〜５　ｘ　 １０５の細胞を接種し、２４時間の間に付着させて増殖させた。培養物は、５０ 〜７０％集密となったときに、これをプラスミドＤＮＡによってトランスフェク トした。細胞とプレートの剥離を防ぐために、細胞層を、５０ｍＭのトリス、１ ５０ｍＭのＮａＣ１（ｐＨ７，２）を含み、１ｍＭのＣａＣｌ２および０．５ｍ ＭのＭｇＣ＋２を補足したトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）によつて３７℃で短 時間で洗浄した。２μｇの閉環形プラスミドＤＮＡおよび平均分子量がｓｏｏ、 　ｏｏｏである０、５ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を含 む上記の水溶液を１ｍｌ用い、３７℃で３０分間、このウェルをインキュベート した。対照として、培養物を、あらゆるデコリン挿入フラグメントが欠如してい るｐＳＶ２発現プラスミドによってトランスフェクトすること、またはＤＮＡを 用いずに、模擬的にトランスフェクトすることを行った。ＤＮＡ／ＴＢＳ／ＤＥ ＡＥ−デキストラン溶液を取り除き、ＴＢＳでウェルを洗浄した後、１０％のウ シ胎児血清および１００ｕ　Ｍのりｏｏキン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤｕｌｂｅｃ ｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｉｒｖｔｎｅ　５ｃｉｅｒ＋ｔｉｆｉｃ）を用いて、 培養物を３７℃で３時間インキュベートした。次いで、細胞層を、２回洗浄し、 クロロキンを含まない上記の培地で、約３６時間の間培養した。Ｗ１３８ヒト胎 児肺繊維芽細胞を、同じ培地で手順通りに培養した。

ＣＯ３−１培養物を、プラスミドＤＮＡによるトランスフェクシ貸ンの後、３６ 〜４８時間の間、放射標識した。全ての放射線標識された代謝前駆体は、Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　（Ｂｏｓｔ。

ｎ、　ＭＡ）から購入した。使用した同位体は、３５３−硫酸塩（４６Ｇ　ｍｃ ｉ／＋＊ｌ）、Ｌ　−［３，４，５−’Ｈ（Ｎ）］−ロイシン（１４０Ｃｉ／ｍ ｌ）およびＬ　−［”Ｃ（Ｕ）］−アミノ酸混合物（製品番号４４５Ｅ）であっ た。

１０％の透析ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸を補 足した、２００μＣｉ／＋ｍｌの３５Ｓ−硫酸塩または３Ｈ−ロイシン、または ｌＯμＣｉ／ｍｌの１４（−アミノ酸混合物を含む、ＦｌａｗのＦ−１２培地（ ＧＩＢＣＯＬａｂｓ）中で、培養物を２４時間の間標識した。培地を採集し、こ れに５＋ｅＭのＥＤＴＡ、　０．５ｍＭのフェニルメチ！レスルフォニルフルオ ライド、０．０４園ｇ／ｌのアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌのペプスタチンを 補足してプロテアーゼの活性を阻害し、２０分間、２，０００　Ｘ　Ｇの遠心分 離によって細胞デブリを除去し、−２０”Ｃで貯蔵した。ＴＢＳで細胞層を洗浄 し、次いで、ゴム冠ポリスマンによって、１ｍｌ／ウェルの水冷細胞溶解緩衝液 、すなわち、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、　０．５　Ｍ　ＮａＣ１，０，１％Ｂ ＳＡ、１％　ＩＩＰ−４０，０，５％　トリト：／　Ｘ−１００，０，１χＳＤ Ｓ、　ＰＨ８，３、中にこすり落とすことによって、細胞抽出物を調製した。そ の細胞抽出物を、１．５時間、１３，０００ＸＧ、４°Ｃの条件下の遠心分離に よって清澄化した。

ウサギの抗血清を、ヒトのデコリンのコアタンパク質の成熟形態の最初の１５残 基（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ−ＧＩＦ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−＾ｒｇ−Ａｓｐ）に基づく合成ペプチド に対して調製した。合成ペプチドおよびそれに対する抗血清は、他に記載されて いる（ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８６　（前出））。簡潔 に言えば、ペプチドを、製造業者によって考案された化学物質を用いて、固相ペ プチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ ｔｙ、　ＣＡ）によって合成した。製造業者の指示に従い、Ｎ−スクシンイシジ ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｅａｔａｖａｙ、　ＮＪ）を用いて、ペプチド を、キーホールリンベットヘモ二バント中で乳化し、ウサギに注入した。さらに 、１．２、および３力月後に、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジニバント中で結合体を、 ウサギに注入した。各注入の投与量は、０．６ｍｇのペプチドに等しい。３回目 および４回目の注入の１０日後、血液を採血した。当該技術分野で周知のように 、抗血清を、ゲルタールアルデヒドで架橋したペプチドおよび単離されたデコリ ンに対して、ＥＬＩＳＡ　（Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ＋ｅｏ１ ．７０：４１９−４３９（１９８０））、免疫沈降、およびイムノブロッティン グにおいて、そして蛍光抗体法で細胞を染色することによって、試験した。

馴化培地、または、２組のウェルから採集した細胞抽出物に、２０μｌの抗血清 を添加し、次いで、４℃で一晩かけて混合することによって、免疫沈降を行った 。２０μｍの充填されたプロティンＡ−アガロース（Ｓｉｇｍａ）と、４℃で２ 時間インキュベーシヨンすることによって、免疫複合体を単離した。ビーズを、 ３つの異なる管を用いて細胞溶解緩衝液で洗浄し、次いで、１０％のメルカプト エタノールを含むゲルの電気泳動試料緩衝液の中で煮沸する前に、リン酸緩衝生 理食塩水で２回洗浄した。当該技術分野で周知のように、免疫沈降したタンパク 質を、７．５−２０％のグラジェントゲルまたは７．５％の非グラジェントゲル の５ＯＳ−ＰＡＧＥによって分離した。フルオログラフィーを、増感スクリーン を用い、Ｅｎｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ ）によって行った。典型的な露光時間は、−７０°Ｃで７〜ｌＯ日間である。オ ートラジオグラフを、ＬＫＢ　Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ　ＸＬ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　 Ｌａ５ｅｒ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒによって走査し１　プロテオグリカンバ ンドの相対強度および移動度を比較した。

デコジンーｐＳＶ２構築物によってトランスフェクトされ、３５Ｓ、−硫酸塩に よって代謝的に放射標識されたｃｏｓ−を細胞から、細胞抽出物および培地を５ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけることによって、模擬トランスフェクト細胞中に硫酸 化バンドが存在しないことがわかった。デコジンファタンパク質由来の合成ペプ チドに対して生じた抗血清による免疫沈降によって、新たなバンドがデコリンで あることがわかった。

通常は、グリコサミノグリカン（セゾンー４）に１１換されているセリン残基が 、５ＤＳ−ＰＡＧＥによってトレオニン残基に置換されたような変異を生じた構 築物の発現は、野生型の構築物によって得られるプロテオグリカンのレベルの、 約１０％しか表さない。免疫反応性物質の残りは、遊離コアタンパク質の位置に 移動する。

アラニン変異ｅＤＮＡ構築物が、同様の方法で発現されて分析される場合、コア タンパク質のみを得、デコリンのプロテオグリカン型は得られない。図１は、デ コリン（レーン１）およびそのトレオニン−４変異コアタンパク質（レーン３） およびアラニン−４変異コアタンパク質（レーン２）の発現は、ＣＯ３細胞のト ランスフェクトント中で発現したことを示す。３５Ｓ０４で標識された（Ａ）お よび３Ｈ−ロイシンで標識された（Ｂ）培養の上澄みを、ヒトデコリンのＮｌ２ −末端に対して調製されたウサギアンチペプチド抗血清を用いて免疫沈降した。

に　した′の　５ｅｎｔ　″　か゛のデコ蓼ンおよびデフリンコア　ンパク　の ｐｓＶ２−デフリンベクターでトランスフェクトされ、そして、上記、ならびに 、ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉがＮａｔｕｒｅ　３６（１９８ ８）の２４４−２４６ページで記述しているようにして（これらの開示内容は本 明細書に参考として援用されている）、増殖した細胞を、９％の透析ウシ胎児血 清、２ｍＭのグルタミン、１００ユ＝、、ト／■ｌのペニンジンおよび１１００ ｔ１／ｍｌのストレプトマイシンで補足されたヌクレオシド非含有α−ＭＥＭの 、８個の１７５ｃ鳳２の培地フラスコ中で９０％集密まで増殖させた。９０％集 密した時点で、培地を、以下のカラムを通過した、６％の透析ウシ胎児血清で補 足された、ヌクレオシドを有しないα−ＭＥＭが入ったフラスコ毎に２５１１１ に変更した二上記カラムは、ｐＨ７，４，０，０５Ｍのリン酸緩衝液中の０．２ ５ＭのＮａＣ１によって平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ　Ｐｌｏｔカ ラム（Ｐｈａｒｎ＋ａｃ　ｉａ）である。細胞を３日間培養し、培養に使用した 後の培地を集め、即座に０．５＋ｉＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライ ド、ｌμｇ／＋ｌ＋のペプスタチン、０．０４ｍｇ／ｍｌのアプロチニンおよび ５ｍＭのＥＤＴＡで処理した。

４００１の上記培養に使用した後の培地を、最初にゼラチン−セファロースに通 し、フィブロネクチン、およびセファロースに付着する物質を取り除いた。次い で、その素通り画分を、ｐ［、４，５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩおよび０．２Ｍ のＮａＣ１で前もって平衡化したＤＥＡＥ−セファロースと混合し、そして４℃ で緩やかに攪拌しながらバッチ吸着させた。このスラリーを１．６Ｘ２４（：閣 のカラムに注ぎ、０．２ＭのＮａＣ１を含有するｐＨ７，４、Ｓｈ＋ＭのＴｒｉ ｓ／ｌ’ｌｃｌで十分に洗浄し、ｐＦ１７．４．５０ｅＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ中 の、ＮａＣ１の０．２Ｍ−０，８Ｍの直線グラジェントで溶出した。デフリン濃 度を、Ｙａ＋＊ａｇｕｃｈｔｔｉ；よびＲｕｏｓｌａｈｔｉ　（前出）が記述し ているような競合ＥＬＩＳＡによって測定した。デフリンを含有する画分を、プ ールし、さらにＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液中の８Ｍの尿素によって平衡化した５ｅ Ｄｈａｄｅｘゲル濾過カラム上で分画した。デフリンを含有する両分を集めた。

りＳＶ　２−デコジン／ＣＰベクター、または、アラニン変性ｃＤＮＡを含有ス るベクターでトランスフェクトされ、そして上記のように増殖されたクローン細 胞系から、コアタンパク質を精製した。これらの細胞を、上記のように集密まで 増殖する。

集密した時点で、この細胞単層を無血清培地で４度洗浄し、そして２ｍＭのグル タミンで補足されたａＭＥＭ中で２時間インキュベートする。この培養に使用し た後の培地を捨てる。

細胞を次いで２ｍＭのグルタミンで補足されたαＭＥＭで２４時間インキュベー トし、そしてこの培養に使用した後の培地を集め、即座に０．５ｍＭのフェニル メチルスルフォニルフルオライド、ｌμｇ／ｍｌのペプスタチン、０．０４＋ｉ ｇ／ｍｌのアプロチニンおよび５ａＭのＥＤＴＡで処理し、無血清の培養に使用 した後の培地とする。この培養に使用した後の培地を、最初にゼラチン−セフ１ ０−スに通し、次いでその素通り画分を、Ｏ，ＩＭのＮａＣ１を含有するｐＨ７ ，４，５０１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ中で前もって平衡化した、Ｃトセフｙ　ロー 　スＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　（Ｐｈａｒｅ＋ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）にバッチ吸着させる。４℃で終夜イン キュベートした後、そのスラリーをカラムに注ぎ、前もって平衡化した緩衝液で 十分に洗浄し、ｐＨ７，４，５０１ａＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１中で、０．１Ｍ−Ｌ Ｍの直線グラジェントのＮａＣ！で溶出する。このデフリンを含有する画分をプ ールし、５０ｍＭのＮＨａＨＣＯ３で透析し、そして凍結乾燥する。この凍結乾 燥された材料を、８Ｍの尿素を含有するｐＨ７，４，５０ｍＭのＴｒｉｓに溶解 し、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラム（１，５ｘｌｌＯｃ＋ａ）にかける 。５ＤＳ−ポリアクリルアミドの電気泳動によって表わされるようなデフリンコ アタンパク質を含有する画分を集め、精製デフリンコアタンパク質を定義する。

実施例ＩＩ ＴＧＦ−のデフリンへの　４ デフリンおよびゼラチンを、製造業者の指示に従いセファロースマトリックス１ ｍｌ当り１ｍｇのタンパク質を使用して、臭化シアン活性化セファロース（Ｓｉ ｇｎ＋ａ）に結合させた。市販のＴＧＦ−β１　（Ｃａｌｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｌ ａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を、クロラミンＴ法（Ｆｒｏｌｉｋら、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９：１０９９５−１１０００　（１９８４）、この開 示内容は本明細書中に参考として援用されている）によって、１２５■で標識し た。そして、この標識されたＴＧＦ−βを、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５上のゲ ルによって、未反応のヨウ素から分離した（図２）。上記５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ −２５は、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸塩緩衝生理 食塩水（ＰＢＳ）によって平衡化した。　［１２５１］　−ＴＧＦ−β１　（５ Ｘ１０５ＣＩ）Ｉｌｌ）を、ＢＳＡでコートされたポリプロピレン管内で、ＩＭ のＮａＣ１および０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含有するｐＨ７，４のＰＢ３ ２ｍｌ中の、０．２ｍｌの充填デフリン−セファロース（・）またはゼラチン− セファロース（０）でインキュベートした。終夜インキュベートした後、アフィ ニティーマトリックスをＢＳＡでコートされた使い捨てカラム（Ｂｉｏ　Ｒａｄ ）に移し、結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した。溶出を、 最初に結合緩衝液中の３ＭのＮａＣ１で、次いで同じ緩衝液中の８Ｍの尿素で処 理することによって行った。画分を集め、ガンマ線計数管で放射活性を計測し、 非還元状態で１２％ゲルを使用した５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

上記２つのカラムの放射活性プロフィールを図２Ａに示し、上記画分の５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析を図２Ｂに示す。開始材料であるＴＧＦ−β１は、２Ｓｋｄにメジ ャーバンドを含有する。この／インドは天然のＴＧＦ−β１ダイマー由来のもの である。さらに、上記調製物中には多くのマイナーバンドが存在する。放射活性 の約２０−３０％が、上記デフリンカラムに結合し、８Ｍ尿素で溶出する。これ に対して、ゼラチン−セファロースで行ったコントロール分画における尿素で溶 出した画分には、放射活性が約２％しか存在しない（図２Ａ）。上記デフリン− セファロースの非結合画分は、すべての上記少量成分および２５ｋｄのＴＧＦ− βｌの一部を含有する。これに対して、結合しｔこ尿素で溶出した画分はＴＧＦ −βｌのみを含有する（図２Ｂ）。これらの結果は、ＴＧＦ−β１が特異的にデ フリンに結合することを示す。これは、最初のＴＧＦ−β１調製物中に存在する 種々の成分のうちで、ＴＧＦ−β１のみがデコジンーセファロースアフィニティ ーマトリノクスに結合し、対照のゼラチン−セファロースアフィニティーマトリ ックスにはほとんど結合しなかったためである。デフリン−セファロースカラム に結合しなかった上記ＴＧＦ−βｌは、ヨウ素化によって変性され得る。この可 能性の証拠を、以下に記載のような標識されていないＴＧＦ−βｌのアフィニテ ィークロマトグラフィーによって得た。

２番目の試験では、１８０ｎＨの標識されていないＴＧＦ−β１を、上記のよう な１２５１−　Ｔ　Ｇ　Ｆ−βに対するデフリン−セファロース上で分画した。

ＴＧＦ−βｌ　（１８０１ｇ）を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，４ ）中のデフリン−セファロースまたはＢＳＡ−アガロース（０，２ｍ　ｌ充填容 量）でインキユベートした。４℃で終夜インキユベートした後、この樹脂を１５ ＋ｉｌの緩衝液で洗浄し、最初にＰＢＳ中の３　Ｍ　ＮａＣ１５ｍｌで、次いで ８Ｍ尿素を含有するＰＢ３５ｍｌで溶出した。各プールのアリコートを、血清を 有しない培地で透析し、そしてＭｖＬｕ細胞中における［３Ｈ］　−チミジン取 込みの阻害について試験した〈実施例１１１）。

各プール中のＴＧＦ−βｌの量を、周知の濃度のＴＧＦ−β゛ｌを用いた同様の 試験から得られる［３Ｈ］−チミジン取込みの標準曲線から計算した。この結果 は、上記ＴＧＦ−βｌが本質的に量的に上記デフリンカラムに結合し、これに対 してコントロールカラムにはほとんど結合しないことを示す（表Ｉ）。上記ＴＧ Ｆ−βｌ活性の部分的な回復は、透析中のＴＧＦ−βｌの損失が原因であり得る 。

表」− ＭｖＬｕ細胞における増殖阻害試験によりモニターされた標識されていないＴＧ Ｆ−βのデフリン−セフ１０−スアフイニテイークロマトグラフイー ＴＧＦ−β１　（ｎｇ） 溶出　テ゛ゴジンーセフマトス　ＢＳＡ−セフ７０−ス素通りおよび洗浄　２． ７（２，３％）　８２．０（９３，９％）３Ｍ　ＮａＣ１２，２（１，８％）　 １．３（１，５％）８Ｍ尿素　１１６．０（９５，９％’）　４．０（４，６％ ）ｂ、マイクロ　イ　−ア・セイにおＣるＴＧＦ−１のデフ１ンへの　ム：コア 　ンパク　およびバイブ１カフ区圭玉旦！ ＴＧＦ−β１のデフリンへの結合もまたマイクロタイター結合アッセイによって 調べた。このアッセイを行うために、９６−ウェルのマイクロタイタープレート のウェルを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中の２μｇ／蒙ｌの 組換デフリンで終夜コートした。上記ウェルを、Ｏ，Ｏ５％Ｔｗｅｅｎを含有す るＰＢＳ（Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、５ｘｌＯ’ｃｐｍの［１２ ｓ　１コ　−ＴＧＦ−βｌを含有する試料およびＰ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｖｅｅｎ中 の様々な濃度の競合物質を各ウェルに加えた。次いで、このプレートを３７°Ｃ で４時間インキコベートしく４°Ｃで終夜コンドロイチナーゼＡＢＣ−消化プロ テオグリカンと共に試験した）、Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｖｅｅｎで洗浄した。その 結合放射活性を０．２Ｍ　ＮａＯＨ中の１％ＳＤＳで可溶化した。競合物質を有 しないトータルの結合は、使用された条件下で約４％であった。標識されたＴＧ Ｆ−β１に対して１００倍モル過剰な、標識されていないＴＧＦ−β１を培養混 合物に加えることによって測定された非特異的な結合は、トータルの結合の約１ ３％であった。このアッセイもまた、他のデフリン調製物の能力および相互作用 と競合する関連タンパク質を調べるために使用した。

デフリン結合の完成を、以下のタンパク質によって試験した（図３：記号につい ては「図面の簡単な説明」の項で示す）＝（１）ウシの皮膚から単離したデフリ ン（ＰＧＩＩ）、（２）ウシの関節の軟骨から単離したパイグリカン（ＰＣＩ） （ＰＧ■およびＰＧＩＩともにＭｏｎｔｅＮｏｒｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ ｅｒ、　Ｎ、Ｙ、のＤｒ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇから得た； そしてＲｏｓｅｎｂｅｒｇらのＪ。

Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｍ、　２５０：６３０４−６３１３．　（１９８５）に記 載されており、その開示内容は本明細書に参考として援用されている）、（３） ニワトリの軟骨のプロテオグリカン（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡのＤｒ、　Ｐａｕ ｌ　Ｇｏｅｔｉｎｅｋにより提供された、そしてＧｏｅｔｉｎｃｋ、　Ｐ、Ｆ、 による　ｅＧｃｃ’ｕａのＶｏｌ、　ＩＩｌ、　Ｈｏｒｖｉｔｚ、　Ｍ、１．編 ｐｐ、　１９７−２１７．＾ｃａｄｅｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、　、ＮＹに記載され ている）。

コアタンパク質を調製するために、プロテオグリカンをフンドロイチナーゼＡＢ Ｃ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｊａｐａｎ）で以下のようにして消 化した二５００μｇのプロテオグリカンを、０．１ＭのＴｒｉｓ／ＣＩ　（ｐＨ ８，０）　２５Ｏμｌ中のフンドロイチナーゼＡＢＣ０，８ユニット、３ｈＭの 酢酸ナトリウム、２ｍＭのＰ　Ｍ　Ｓ　Ｆ、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド、 １ｈ＋ＭのＥＤＴＡ、および０４６ｍＭのペプスタチンと共に１．３７°Ｃで１ 時間インキュベートすることによって消化した。組換デフリンおよびウシの皮膚 から単離したデフリン（ＰＧ　Ｉ　Ｉ）は予想通り［１２５１１−Ｔ　Ｇ　Ｆ− βｌの結合を阻害したく図３Ａ）。ウシの関節の軟骨から単離したパイグリカン は、インヒビターとしてデフリンと同様に有効であった。多くの硫酸コンドロイ チン鎖を含有するニワトリの軟骨のプロテオグリカンは、阻害効果を全く示さな かったので、デフリンおよびパイグリカンの効果は、グリコサミノグリカンが原 因ではないと考えられる。ウシ血清アルブミンは阻害効果を全く示さなかった。

この考えは、上記変性デフリンコアタンパク質（図示されていない）およびフン ドロイチナーゼＡＢＣ−消化デコリンおよびパイグリカンを用いた競合試験によ って、さらに裏付けられた（図３８）。これらの各タンパク質は阻害性であるが 、軟骨のプロテオグリカンコアタンパク質は阻害性ではなかった。上記デフリン およびノイイグリカンコアタンパク質は、元のプロテオグリカンよりもいくらか 活性であった。コンドロイチナーゼＡＢＣで処理されたウシ血清アルブミンは、 阻害性を全く示さなかった。別の結合試験は％　［１２５Ｉ］−ＴＧＦ−βｌが 、パイグリカンまたはそのコンドロイチナーゼ処理コアタンパク質でコートされ たマイクロタイターウェルに結合することを示した。これらの結果は、ＴＧＦ− βｌが、デコリンおよびパイグリカンのコアタンパク質に結合すること、ならび に、これらのタンパク質の潜在的な結合部位として機能するロイシンリッチ繰り 返し単位を含むことを示す。

実施例ＩＩＩ ＴＧＦ−１によって１　または　された　におけるデコーンの　の ＴＧＦ−βｌ活性を調節するデコリンの能力を、　［３Ｈ］　−チミジン取り込 みアッセイによって調べた。１つのアッセイでは、ｐＳＶ２ｄＭｒのみでトラン スフェクトされた非増殖ＣＨＯ細胞系（参考文献１中のコントロール細胞系Ａ、 本明細書中ではＣＨＯ細胞と呼ぶ）を使用した。上記細胞を、９％の透析ウシ胎 児血清（ｄ　Ｆ　ＣＳ）で補足されたα改変最小必須培地（ａ　−Ｍ　Ｅ　ＭＳ ＧＩＢＣＯ，Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中で維持し、［３Ｈ］　−チチ ミンの取り込みを記載のようにアッセイした（ＣｈｅｉｆｅｔＺら、Ｃｅ１ｌ　 ４８：４０９−４１５　（１９８７））。　ＴＧＦ−βｌを、　ＣＨＯ細胞培養 物に５Ｈ／ｍｌで加えた。それは、この濃度で°は、ごれらの細胞における［３ Ｈ］−チミジンの取り込みの５０％増加を誘発した。デコリンまたはＢＳＡを、 種々の濃度で上記培地に加えた。その結果を図４Ａに示す。そのデータは、ＴＧ Ｆ−βｌによって誘発された増殖刺激の中和のパーセントを表す。すなわち、Ｔ ＧＦ−βｌまたはデコリンのどちらがが欠如している場合の［３Ｈ］−チミジン の取り込みが０％であり、デコリンでなくＴＧＦ−β１が存在している場合の［ ３Ｈコ　−チミジンの取り込みが１００％であることを表す。各点は、３組の試 料の平均上標準偏差を示す。図中の・はデコリン、ＯはＢＳＡを示す。

デコリンは、約５μｇ／＋ｓｌでＴＧＦ−βｌの増殖刺激活性を最大活性の半分 に中和した。さらに、追加のデコリンは、　［１Ｈ〕−チミジンの取り込みを、 ＴＧＦ−βｌを全く加えずに、観察されたレベルより下に抑制した。デコリンは また、ｃＨＯ細胞自体によって作られたＴＧＦ−βを阻害することを示した。上 記デコリン発現物質および対照ＣＨＯ細胞は共に、濃度約０．２５ｎｇ／ｍｌの 明らかな活性ＴＧＦ−βを、ミンク肺上皮細胞の増殖の阻害によって測定された ように、馴化培地中に生産した。（このアッセイは、培地中のデコリンがらの妨 害なしに実行され得る。なぜなら、以下に示すように、ミンク細胞上のＴＧＦ− βの効果が、デコジン生産培地中に存在するデコリン濃度では、実質的に阻害さ れないからである。）ＭｖＬｕミンク肺上皮線上皮細胞ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａ１ｌｅｃｔｉｏｎ　ＣＣＬ　６４）による試験もまた、 ＴＧＦ−β１の活性に基づくデコリンによる効果を明らかにした。図４Ｂは、チ ミジンの取り込みによって測定される上記細胞の増殖が、ＴＧＦ−β１によって 抑制されたことを示す。アッセイは、ＴＧＦ−βｌを０．５ｎｇ／＋ｅｌで加え たこと以外は図４Ａと同様に行った。

ＴＧＦ−βの濃度は、上記ＭｖＬｕ細胞中の［３Ｈ］−チミジンの取り込みの５ ０％減少を誘発した。このデータは、ＴＧＦ−βによって誘発された増殖阻害の 中和を表す。すなわち、ＴＧＦ−βかっデコリンが欠如している場合の［３Ｈ］ 　−チミジンの取り込みが１００％であり、デコリンでなくＴＧＦ−βが存在し ている場合の［３Ｈ］−チミジンの取り込みが０％であることを表す。

実施例ＩＶ の　が　５ｒｅａｄｉｎ　および哀　口・　をコントロール　るしいデコリン　 ４ 過剰発現培地中に含有されるデコリンの分析は、上記デコリンの活性を開示する だけでなく、他のデコリンと関連した増殖調節活性もまた明らかにした。過剰発 現培地は、ＴＧＦ−βに類似の増殖阻害活性を有することが明らかになった。

これは、解離条件下のＤＥＡＥ単離デ単離ノコリン濾過によって示された。デコ リンｃＤＮＡによってトランスフェクトされた、デコジン過剰発現物質ＣＨＯ− ＤＧ４４細胞の無血清状態の馴化培地を、中性Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！衝液中のＤＥ ＡＥ−セファロースクロマトグラフィーで分画し、増殖阻害活性を含有する画分 を、５ｈＭ）ＪｌｎｌＣＯ３で透析し、凍結乾燥し、そして酢酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ５，９）中にグアニジン−ＨＣｌと共に４Ｍで溶解した。溶解した材料 を、同じグアニジン−ＨＣｌ溶液で平衡化した１、　５ｘ７０Ｃ１１のセファロ ースＣＬ−６Ｂカラムで分画した。この画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥ、デコリンＥＬ ＩＳＡおよび細胞増殖アッセイによって分析した（すべての試験方法は上に記載 されている）。３つのタンパク質のピークを得た。１つはフィブロネクチン（＋ ｓ、　ｖ、　５００、０００）のような高分子量のタンパク質を含有し、増殖調 節活性は検出されなかった。２番目は、実施例ＩＩＩにおいて記述された活性を 有するデコリンであった。３番目は、低分子量（１０，０００−３０，０００ダ ルトン）の画分てあり、それはミンク細胞アッセイにおける増殖阻害活性を有し 、そしてＣＨＯ細胞の増殖を刺激した。図５は、これらの結果を要約している。

図示されるものは、ＣＨＯ細胞による［３Ｈ］−チミジンの取り込みに影響する ゲル濾過画分の能力、および、酵素イムノアッセイによって測定されるデコリン の濃度である。同時に図示されるもの（矢印）は、分子サイズマーカーの溶出位 置である：ＢＳＡ、ウシ血清アルブミ７　（Ｍｒ＝６６．０００）　；　ＣＡ。

炭酸脱水酵素（Ｍｒ＝２９，０００）　；　ＣＹ、　チトクロームｃ　（Ｍｒ＝ １２．４００）　；　ＡＰ、アプロチニン（Ｍｒ＝６，５００）　；　Ｔ　Ｇ　 Ｆ、［＋２’　！］−ＴＧＦ−β１　（Ｍｒ＝２５．０００）。

低分子量画分で検出される増殖調節活性の性質を、抗ＴＧＦ−βｌ抗血清を用い て調べた。この抗血清を、ヒト成熟ＴＧＦ−βｌの残基７ｇ−１０９位由来の合 成ペプチドに対して調製した。同じペプチドの環式型に対して他のものによって 生じた抗血清、すなわち、ジスルフィド結合している末端ンステイン残基が、Ｔ ＧＦ−β１がそのレセプターへの結合を阻害することが以前水されていた（　Ｆ 　１ａｎｄｅｒｓら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７Ｓ９−７４６　（ １９８８）、この開示内容は本明細書に参考として援用されている）。このペプ チドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの固相ペプチド合成機で合成し、 ＩＩＰＬｃで精製した。ウサギを、Ｏ，Ｓｍｇのメチル化Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇ ｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）と混合し、７゜インド完全アジニバント 中で乳化した上記ペプチドを２＋ｓｇずつ皮下注射して免疫した。注射は一般的 に４週間あけて行い、そのウサギは２回目の注射の約１週間後に採血し、後続の すべての注射の約１週間後にも採血した。本実験で使用された抗血清は、ラジオ イムノアッセイにおいて１：６，０００のタイター（５０％結合）を有し、イム ノプロット法においてＴＧＦ−βｌに結合した。

この抗血清は、ＣＨＯ細胞に基づく精製ＴＧＦ−β１の活性を阻害し得た。さら にこの抗血清は、図５に示すように、ＣＨＯ細胞に基づ＜　［３Ｈ］　−チミジ ンの取り込みアッセイによって測定された低分子量画分の増殖刺激活性もまた阻 害した。抗ＴＧＦ−βｌ抗血清から調製されたＩｇＧ画分の濃度の増加は、低分 子量画分の濃度依存的な刺激効果を抑制した（・）。通常のウサギ血清由来のＩ ｇＧは、上記アッセイにおいて全く効果を有さなかった（○）。

上の結果によって、低分子量画分の刺激因子はＴＧＦ−β１として同定された。

しかし、ＴＧＦ−βｌは上記画分中唯一の活性化合物ではない。図５に示した抗 ＴＧＦ−βｌ抗体によるチミジンの取り込みの回復にかがゎらず、低分子量画分 で処理された細胞は、対照１ｇＧで処理された細胞または抗体単独で処理された 細胞と、形態的に異なっていた。この効果は、抗体処理された低分子量画分がＨ −ｒａｓ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　？９：３６３７−３６４０（１９ｇ２））の培養物に加え られる場合に、特に明らがであった。図６に示すように、上記低分子量画分およ び抗体で処理された細胞（パネルＢ中の顕微鏡写真）は、対照細胞（パネルＡ中 の顕微鏡写真）より広がり、より接触阻害されていることが明らかになった。こ の結果は、ＣＨＯ細胞由来の組換デフリンが、細胞調節因子（ＭＲＦ、十分に特 徴付けられたＴＧＦ−βの因子とは異なる）と会合することを示す。

新しい因子がＴＧＦ−βｌと異なることについての別の証拠は、ＨＰＬＣ試験か ら得た。さらにセファロースＣＬ−６Ｂカラムからの低分子量の分離を、０．１ ％トリフルオロ酢酸中のＶｙｄａｃＣ４逆相カラム（１ｘ２５ｃｓ、５μｍの粒 子サイズ、ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉ。

ｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、　ＣＡ）で行った。結合されたタンパ ク質を、アセトニトリル（２２−４０％）のグラジェントによって溶出した。そ して画分を、ミンク肺上皮細胞中の増殖阻害活性、および、Ｈ−ｒａｓ　３Ｔ３ 細胞中のＭＲＦ活性に対してアッセイした。

この結果は、ＴＧＦ−βｌ活性がグラジェントの最初で溶出し、これに対して、 ＭＲＦ活性は濃度勾配の最後付近で溶出することを示した。

実施例Ｖ ＴＧＦ−への Ａ　１２Ｊ　−ＴＧＦ−のＨｅＧ２への約２．５ｘｌＯ’個の）ＩｅｐＧ２細胞 （ヒト肝細胞癌、ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ　８０６５）を、組換デフリン、ＴＧＦ −β、またはα−ＴＧＦ−β抗体の存在下で１１００ｐの［１２５１Ｆ−ＴＧＦ −βを用いて、室温で２時間インキュベートした。細胞を４回洗浄し、次いで０ 、２５ｍ＋Ｍのスペリン酸ジサクシンイミジル（ＤＳＳ）を含有する結合緩衝液 （１２８ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、　５ｍＭ　Ｍｇ２５Ｏａ、１．２ｍ ＭＣａｃＩ２．５（１＋ＩＩＭ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、　２＋ａｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ 　Ａ、　ｐＨ７，５）で１５分間懸濁した。次いで細胞を、ｌ５０ｍＭのスクロ ースを含有する洗浄緩衝液（結合緩衝液からＢＳＡを除いたもの）中で洗浄し、 懸濁前にＳＤＳを含有するＬａｅ＋＊ｍ　ｌ　ｉ試料緩衝液（当業者に公知であ る）中に溶解させた。溶解物を、還元および非還元状態で、４−１２％の５ＤＳ −ＰＡＧＥ上で分析した。架橋されたＴＧＦ−βをオートラジオグラフィーで可 視化した。

図７にこの研究結果を示す。デフリンは、ＴＧＦ−βのβグリカン（ＨｅｐＧ２ 細胞上にあるＴＧＦ−βレセプター）への結合を阻害する。

Ｂ、　”’Ｉ　−ＴＧＦ−のＭＧ−６３への１約１０５個のＭＧ−６３細胞（雄 性骨肉腫、　ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１４２７）を、組換デフリン調製物（Ｄ Ｃ−１３と呼称される）またはＴＧＦ−βの存在下で１５０ｐＭの［１２５１］ −ＴＧＦ−βを用いて、室温で２時間インキュベートした。細胞を実施例Ｖ　（ Ａ）の水冷結合緩衝液で４回洗浄し、次いで０．２５＋ａＭのＤＳＳを含有する 結合緩衝液で１５分間懸濁した。細胞を、２５０ｍＭのスクロース緩衝液中で洗 浄し、その後プロテアーゼインヒビターを含有スる１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０ ０緩衝液中に溶解させた。溶解した細胞を、１２．０００　ｘ　ｇで遠心分離し 、核を取り除いた。同容量のＬａｅｍｍｌｉ　ＳＤＳ試料緩衝液を、各上澄み液 に加え、次いで４−１２％ｔｒｉｓ−グリシンゲルにジンて電気泳動させた。架 橋されたＴＧＦ−２２５をオートラジオグラフィーで可視化した。

図８にこの研究結果を示す。ＨｅｐＧ　２細胞を用いた上記の研究と同様に、デ フリンは、ＴＧＦ−βのＭＧ−６３細胞上のレセプターへの結合を阻害する。

Ｃ，”’Ｉ−ＴＧＦ−の　デフリンへの　パノ殉９６−ウェルのＬｉｎｂｒｏマ イクロタイタープレートを、０．５μｇ／ｍｌの組換デフリンで、５０μｌ／ウ エルでコートした。このプレートを３７°Ｃのインキュベーター中に終夜静置し 、その後ウェル毎に２００μｌのｐ　ＢＳ　（０，１５Ｍ　ＮａＣ１）で３回洗 浄し、結合していないデフリンを取り除いた。＋５Ｉで標識されたＴＧＦ−β（ ４００ｐＭ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈ ｕｎｔｅｒ　Ｌａｂｅｌｅｄ）を、２００μＩＰ　Ｂ　Ｓ　１０．０５％Ｔｖｅ ｅｎ−２０中で、競合物質と共にまたは競合物質なしで、室温で１時間４５分間 インキュベートした。競合物質は、組換ヒトデフリン調製物（ＤＣ−９およびＤ Ｃ−１２）およびパイグリカンを、不カディア゛コントロールとしてのＭＢＰと 共に含んでいた。ＤＣ−９およびＤＣ−１２は、組換ヒトデコリンからなる異な った調製物である。　ＰＴ−７１またはＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）は ネガティブコントロールであり；バイグリカンは組換ヒトバイグリカンである。

５０μｌ／ウエルのあらかじめインキ一ベートしたＴＧＦ−β混合物または対照 を加え、０℃で終夜インキュベートした。

インキ一ベートの後、５０μｌの遊離ＴＧＦ−β上澄み液を標識された管に移し た。このプレートをＰＢＳ（２００μｌ／ウエル）中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ− ２０で３回洗浄した。還元試料緩衝液（２ＸＬａｅｍｍ１ｉ試料緩衝液）を１０ ０μｌ／ウエルで加え、３７℃で３０分間インキュベートした。この溶液を緩や かに振動させながら（ｐｕＩｓｉｎｇ）、１０６μ＋の結合した１２５１−ＴＧ Ｆ−βを各ウェルから取り除き、管に移し、ガンマ線計数管で計測した。上記５ ０μｌの遊離ＴＧＦ−β試料を、１００μｍの結合したＴＧＦ−β試料と平行し て計測し、結合：遊離の比率を得た。固定化デコリンを用いた結合の研究の結果 を、図９に要約する。

Ｄ　”Ｊ−ＴＧＦ−のｅＧ２　への　ム約２．５ｘｌＯ’個のＨｅｐＧ２細胞を 、組換ヒトデコリン（ＤＣ−１２）またはＰＴ−７１（Ｍ　Ｂ　Ｐ　”）の存在 下で２５０９Ｍの［Ｉ２Ｊ］−ＴＧＦ−βを用いて、室温で２時間インキュベー トした。細胞を実施例Ｖ　（Ａ）の洗浄緩衝液で４回洗浄し、結合したＣＰＭを 測定した。

この結果を、図１Ｏに要約する。ＨｅｐＧ２細胞に結合したＴＧＦ−βのデコリ ン（ＤＣ−１２）阻害に対する数的データを表ＩＩに示す。表中の「％変化」は 、培地（ネガティブコントロール）のｅｐ＋１と比較した試験試料の平均ｃｐｓ の違いを表している。このα−ＴＧＦ−β抗体は、標識されたＴＧＦ−βがＴＧ Ｆ−βレセプターを有する細胞へ結合することを阻害し、ポジティブコントロー ルとして機能する。　（以下余白）表目 １２５１−ＴＧＦ−βｌのＨＥＰＧ２細胞への結合２．５Ｘ１０Ｅ−７Ｍ　１１ ，２５９ 実施例Ｖｔ 集ん１肛双旦鷹 成体マウスの刺毛した背中の皮膚に、一対の縦の傷をつけた。処置は、層を貫い て背中の皮膚の骨格筋系まで切開した。

切開部分を、１０５ｇ／ｍｌのヒアルロン酸（対照）、または、ＴＢＳ中のデコ リン（０，５Ｂ／醜１）／ヒアルロン酸（１０ｍｇ／ｍｌ）混合物のいずれかの 一回投与量２５０μｍで処理した。上記混合物を形成するために、０゜５ｍｇ／ ｍｌの組換デコリンを１０ｍｇ／■ｌのヒアルロン酸と混合した。各マウスは、 処理しない対照傷および処理された傷を有する。この傷を縫合してふさいだ。１ ４日後、傷を大まかにモニターし、組織を採取した。対照および処理された傷の 部位（４ミクロン）の凍結切片を、Ｍａｓｓｏｎの三色染色法で可視化した標準 の組織学的方法を用いて分析した。

上記ヒアルロン酸対照は、通常の成体の動物に見られるような典型的な皮膚はん 痕を阻害した。これに対して、デコリン処理した傷は、検出可能なはん痕の阻害 は見られず本質的に組織学的に通常であった。デコリン処理した傷は、第１およ び第２のトリメスターの胎児の傷に類似した。

実施例Ｖｌｌ ヒトバイグリカンおよびフィブロモジ：ＬＩン　ｃ　ＤＮＡのクローニング 全細胞ＲＮＡを、１２時間ＴＧＦ−β１（３ｎｇ／謁υにさらしたＷｌ−３８ヒ ト肺繊維芽細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、　ＣＣＬ　７５；　Ｒｏｅｋｖｉｌｌ ｅ、　ＭＤ）の半集密性培養物から、グアニジニウムイソチオンアネートを用い て抽出した（Ｓａ■ｂｒｏｏｋら、１９８９）。全細胞ＲＮＡ　（１μｇ）を、 ｃＤＮＡブライミングのためのランダムへキサヌクレオチドを用いて、ＭｏＭｕ ＬＶ逆転写酵素で逆転写した（　Ｋａｗａｓａｋｉ、１９８９）。ヒトバイグリ カンまたはヒトフィブロモジニリンのコード配列の全長をコードする二本鎖ｃＤ ＮＡを、逆転写されたＷｌ−３＋１ＲＮＡを増幅することにより生成した。この とき、ヒトバイグリカン（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８９）またはウシフィブロモジ コリン（Ｏｌｄｂｅｒｇら、１９８９）の公表された配列に基づくアンブリマー （ａｍｐｌｉｍｅｒ）を使用した。デフリンに対して、前記のデフリンｃＤＮＡ を鋳型として用いた（ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈＬｉ、　１９８６） 。このＰＣＲ生成物をｐＢＩｕｅｓｅｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌ ａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）　ｌこサブクローニングした。得られたＦ’ＣＲ生成 物の同定を、ＤＮＡ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、１９’＋７）によって実証し た。このＰＣＲ生成バイグリカンクローンは、５塩基中の公表されたパイグリカ ンの配列と異なる。２つの配列の違いは、Ｆｉｓｈｅｒら（１９８９）のクロー ンｐ１６　（Ｄｒ、　Ｌ　Ｆｉｓｈｅｒによって快く提供された）の再配列決定 法によって調整され得る。残りの違いは、１つのアミノ酸交換（Ｌｙｓ＋７ｇか らＡｓ旧７６）をもたらした。

ヒトフィブロモジニリンが、そのウシ等個物に非常によく一致することが明らか になった。１．２ｋｂＰ　ＣＲ生成物のＤＮＡ配列決定分析によって、３７６の アミノ酸タン／（り質をコードする１１２８ｂｐのオーブンリーディングフレー ムが明らかになった。

推定タンパク質配列は、以前に公表されたウシフィブロモジコリンの配列と９２ ％の配列が同一であった。図１１に、ウシフィブロモジコリンの配列と一緒に並 べられたヒトフィブロモジニリンアミノ酸の配列、および、本研究に使用された 他の２つのプロテオグリカンの配列を示す。

実施例Ｖｌｌｌ ベタ　−の　および　ム　ンパク　の　１ＣＯＯＨ末端因子Ｘａ開裂部位で改変 されたＭＢＰＢ列を、６個のヒスチジンカセットからなるアフィニティータグも またコードするベクター、ｐＱＥ−８（Ｑｕｉａｇｅｎ；　Ｃｈａｔｓｖｏｒｔ ｈ、　ＣＡ）に導入した。このｐＱＥ−１ｔ／Ｍ　Ｂ　Ｐ発現ベクターを、ＭＢ Ｐおよび因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位をｐＱＥ−８のＢａＩ２旧部位にコード するＢｇｌｌｌ／ＢａｍＨＩＤ　Ｎ　Ａフラグメントをサブクローニングするこ とによって生成した（図１２）。ヒトバイグリカン、デフリン、またはフイブロ モジュリンのコアタンパク質をコードするＢａＩ旧フラグメントを、ｐＱＥ−８ ／　Ｍ　Ｂ　Ｐ中の得られる単一のＢａｗｌ（１部位に、続けてクローニングし た（図１２）。

このヒスチジンアフィニティータグは、Ｎｉ金Ｘキレートアフィニティーカラム を使用する単一の精製工程において、純度が９５％を超える融合タンパク質の精 製を可能にした（Ｈｏｃｈｕｌｉら、１９８７．）。

パイグリカン、デフリン、およびフィブロモジニリンをＱｉａｇｅｎ　（Ｃｈａ ｔｓｗｏｒＬｈ、　ＣＡ）の指示に従い調製した。手短に言えば、組換バクテリ アをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイ７ン（２５ｔｔ　ｇ／ｍ ｌ）を含有するＬＢ培培地中子７°Ｃ、ＯＤｕ＋ａの密度が約０．６から０．８ になるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＯを加え最終濃度を２ｍＭとし、タンパ ク質の発現を３時間続けた。

次いで、このバクテリアを遠心分離（５０００ｘｇ、　１５分）によって集め、 ４５分から６０分で緩衝液Ａ　（０，ＬＭ　Ｎａ１（ＰＯａ、Ｇ、ＧＬＩＡ　Ｔ ｒｉｓ。

６Ｍグアニジニウム−ＨＣｌ５ｐＨ１１，Ｑ）中に溶解した。この溶解物を２０ ．　ＯＯＯｘｇで２０分間遠心分離した。イミダゾールを上澄み液に加え、最終 濃度を１０ｄとし、この混合物をＮ１−ＮＴＡカラムに入れた。このカラムを、 数種のカラム容量の緩衝液Ｂ　（０，１ＭＮａＨＰＯｊ、　０．ＯＩＭ　Ｔｒｉ ｓ、　８Ｍ尿素、ｐＨ８，０）で洗浄し、緩衝液Ｃ（緩衝液ＢをｐＨ５，９に調 整したもの）で溶出した。タン）＜り質含有画分を、８Ｍ尿素中のＩ　Ｍ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩを加えることによりてｐＨを８にＴＡ整した。上記タンパク質のジ チオトレイトールによる還元、および、ヨードアセトアミドによるカルボキシメ チル化（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、　１９８９）の後、このタン、ｆり質を、試 薬、および、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ）を使用したゲル濾過によってそれぞれの結合緩衝液と交換された 緩衝液から分離した。

この精製されたＭＢＰ融合タンＡり質は、予想されるアミノ酸配列と適合する５ ＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動移動度を示した（図１３）。これらのタンパク質は 、生理的緩衝液に比較的可溶であるが、４°Ｃでの長時間の貯蔵の間には％ｓ（ ら力）の沈澱を生じた。

（以下余白） 実施例ＩＸ ンバク　のヨウ ／？クチリアで発現した融合タンパク質を、製造者（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅ＋１ｉ ｃａｌ　Ｃｏ、）の指示に従いＩＯＤＯ−ＧＥＭを用いてヨウ素化した。

手短に言えば、５０μｍのｌ０ＤＱ−ＧＥＮ溶液（Ｌ＋ａｇ／Ｚ５＋ｉｌ　Ｃ１ （Ｃ１３）をホウケイ酸ガラス管の底で乾燥した。ヨウ素化緩衝液中（Ｇ、ＩＭ ＮａＰ　：、Ｉ　ｎ＋Ｍ　ＥＧＴＡ、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４）に 溶解したタンパク質（１０−２０Ｍｇ）、および、キャリアーを有しないＮａ１ ２Ｊを上記管に加えた。室温で１２分間インキュベートした後、２００μｌのヨ ウ素化緩衝、液およびこの混合物を、標識されたタンパク質の放射化学精製を行 うためにＰＤ−１０カラムに入れた。標識された融合タンパク質の比活性および 放射化学的純度を、精製工程の前後で、標識混合物中のピクリン酸の沈澱可能な 放射活性タンパク質画分を測定することにより計算した。放射化学的純度が９５ ％より上である比活性は、２３００から２８００Ｃｉ／＋ａ＋ｓ。

ｌの範囲であった。ＴＧＦ−β１．２、および３　（１−５μｇ）を、ヨウ素化 緩衝液として０．２５Ｍ　ＮａＰｒ、２Ｍ尿素、ｐＨ７，４を使用して、上記の ように標識した。

実施例Ｘ 孔ｉ止蒔金試屈 増加する量のＴＧＦ−β１でコートされたマイクロタイターウェル中の、放射性 標識されたＭＢＰ−プロテオグリカン融合タンパク質をインキユベートして、固 相結合アッセイを行った。

Ｉｍｍｕｌｏｎ−２マイクロタイターウエル（Ｄｙｎａｔｅｅｈ；　Ｃｈａｎｔ ｉｌｌｙ、　ＶＡ）を、Ｔ　Ｇ　Ｆ　−β１　（７５μｌ、　１℃ｇ／１１）ま たは０．１ＭＩ［炭酸塩、緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解した他のタンパク質で、 ４℃で終夜コートした。次いでコートされたウェルを、振って乾燥しくＮ１ｃｋ ｅｄ　ｄｒｙ）、そして２００ｇ　ｌの結合緩衝液（５０＋ｅＭ　Ｔｒｉｓ−Ｆ ＩＣＩ。

ｐ）１７゜４．１５０ｍＭ　ＮａＣ＋、２％Ｂ　Ｓ　Ａ、　０．０５％Ｔｗｅｅ ｎ−２０ｓ　Ｏ，０１％ＮａＮ５）を用いて３７℃で３時間インキュベートし、 非特異的な結合部位をブロックした。プレートを、即座に使用するか、または、 将来使用するために一２ｏ″Ｃで２週間になるまで保存した。結合アッセイのた めに、プロ・ツクされたウェルを１回洗浄し、次いで標識されたおよび標識され ていないタンパク質をトータル容量が１００μｍの結合緩衝液に加え、他に指示 がない限す３７°Ｃで６時間インキュベートした。その後、上記ウェル内容物を 吸引により取り除き、これらのウェルを水冷結合緩衝液で３回洗浄した。表面固 定化タンパク質への結合は、ガンマ線計数管で完全なウェルを計測することによ り測定した。

上記ウェルへの非特異的な結合は、加えたトータルの放射活性の５％より少なか った。ＴＧＦ−βｌのコート効率は５８．７±０．５％（ｎ＝３）で、１つのウ ェルに対して約４４ｎｇのＴＧＦ−β１であった。このコート効率は、終夜イン キュベートした期間およびそれに続く洗浄工程の後、コート溶液に少量の１２５ Ｉで標識されたＴＧＦ−βｌを加えることにより、表面会合した放射活性を測定 することによって計算した。すべての試験は２組または３組で行った。

放射標識されたＭＢＰ−パイグリカン（ＭＢＰ−ＢＧ）、ＭＢＰ−デ：７１Ｊ： ／　（ＭＢＰ−ＤＥＣ）およびＭＢＰ−７４ブロモシユリン（ＭＢＰ−ＦＭ）は 、ＴＧＦ−βｌでコートされたウェルに、濃度依存的に結合し、最大結合濃度は 、それぞれ５０％、２０％、および５５％であった（図１４）。放射標識された ＭＢＰ単独では、ＴＧＦ−βｌでコートされたウェルに結合しなかった。

放射標識された融合タンパク質の結合は、ＴＧＦ−βに対して特異的であった。

なぜなら、固定化されたＮＧＰＳ　ＥＧＦｌ　インシュリンまたは血小板第４因 子への結合は、はとんど観察されなかったからである。ＭＢＰ−ＦＭは、固定化 されたＴＧＦ−βｌ前駆体タンパク質に少し結合したが、ＭＢＰ−ＢＧおよびＭ ＢＰ−ＤＥＣは結合しなかった（図１５）。

パイグリカン融合タンパク質であるＭＢＰ−パイグリカンは、ＴＧＦ−βｌに対 して高い結合活性を示すので、さらに、プロテオグリカン−ＴＧＦ−β１相互作 用を特徴付けるために使用した。ＭＢＰ−ＢＧのＴＧＦ−β１への結合は、時間 および温度依存であった（図１６）。結合は、３７℃では急速に速くなるが４℃ では非常に遅くなり、４°Ｃでの最高結合速度は３７℃のわずか約２０％であっ た。

標識されていないＭＢＰ−ＢＧは　＋２５１で標識されたＭＢＰ−ＢＧのＴＧＦ −β１への結合に対して濃度に依存して競合した（図１７Ａ）。ＭＢＰ−ＤＥＣ およびＭＢＰ−ＦＭは、ＩｎされたＭＢＰ−ＢＧのＴＧＦ−βｌへの結合と競合 した。

それらはＭＢＰ−ＢＧと同等に有効な競合物質であり、約３０から・４０ｎＭに 最大値の半分の阻害濃度を得た。、ＭＢＰは不活性テアった。精製ウシプロテオ グリカンを競合物質として使用した場合、パイグリカンおよびデコリンはフィブ ロモジュリンよりも効力が少ないことが明らかになった：最大値の半分の阻害濃 度は、それぞれ１５０．２００および１０ｎＭであった。

図１７Ａに示すアッセイのデータを、ＬＩＧＡＮＤコンピュータープログラム（ ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄ、　１９８０）を用いて分析し、プロテオグ リカン融合タンパク質とＴＧＦ−β１との相互作用に対する解離定数（Ｋｄ）お よび最大結合部位濃度（Ｂヨ、８）を計算した。Ｋｄ値が高アフィニティー結合 部位に対して１から１７ｎＭの範囲で、低アフィニティー結合部位に対してそれ ぞれ４７から２００ｎＭの範囲である、２結合部位モデルにおいて最良の結果が 得られた。Ｂ　ｌｌ５Ｘ値は、高アフィニティー結合部位に対しては１つのウェ ルについて１０−１３モルの範囲で、低アフィニティー結合部位に対しては１つ のウェルについて１．６ｘｌＯ−’２モルの範囲であった。１１１ｇ／ｍｌのＴ ＧＦ−β１コーティング濃度、７５μｍのコーティング体積および約６０％のコ ート効率を与えると、これらは、プロテオグリカン融合タンパク質とＴＧＦ−β ｌとのモル比が以下の値を示す：それぞれ、高アフィニティー結合部位に対して に１０で、低アフィニティー結合部位に対して１：１゜ プロテオグリカンを、ＴＧＦ−βの他の公知の哺乳類の同型物質であるＴＧＦ− β２およびＴＧＦ−β３を結合させる能力についても試験した。ＴＧＦ−β１． 　２、および３の固定化ＭＢＰ−パイグリカンへの結合は、すべての３つの融合 タンパク質およびすべての３つの無傷のプロテオグリカンによって阻害された（ 図１８）。ＭＢＰ−ＢＧに結合するＴＧＦ−β３は、フィブロモジュリンよりも デコリンおよびパイグリカンによってより効果的に阻害された。

固相放射リガンド結合研究は、ヒトバイグリカン、デコリンおよびフィブロモジ ュリンのコアタンパク質配列を含有する組換融合タンパク質が、類似のアフィニ ティーによる標識されたＭＢＰ−パイグリカンのＴＧＦ−βｌへの結合と競合す ることを示し、コアタンパク質の官能的で高度に保護された領域がＴＧＦ−βへ の結合に含まれることを示した。バクテリアによって生成された組換プロテオグ リカンコアタンパク質が、哺乳類細胞によって生成される組換デコリン（Ｙａｗ ＋ａｇｕｃｈｉら、１９９Ｇ）および組織由来のプロテオグリカンと類似の活性 を有したという事実は、これらのプロテオグリカンのコアタンパク質中のＴＧＦ −β結合活性の存在を完全に確立した。

実施例Ｘ１ １区猪金星員 ＴＧＦ−βｌの細胞への結合と競合するプロテオグリカン融合タンパク質を、細 胞結合試験によって調べた。細胞結合試験は、Ｍａｓｓａｇｕｅ　（１９ｇ？） の方法に従い行った。手短に言えば・１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で維持 された４８または２４ウエルの細胞培地器（Ｃｏｓｔａｒ；　Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ、　ＭＡ）中の、ＭｖＬｕまたは■ｅｐＧ２細胞（それぞれ、ＡＴＣＣ受託番 号Ｎｏｓ、　（：ＣＬ　６４およびＩＩＢ８０６５；　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　 ＭＤ）の半集密性単一層を、細胞結合試験に使用した。細胞を、標識されていな いＴＧＦ−β１またはプロテオグリカン融合タンパク質が存在または欠如してい る状態で、標識されたＴＧＦ−βｌとインキュベートした。この細胞を水冷結合 緩衝液（１２８ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、　５　＋＊Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ、 １、．２ｍＭＣａＣｌ２．５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，２’＋ｇ／ｍ ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ）で２回洗浄し、次いで４°Ｃで３０分間細胞結合緩衝液でイン キュベー）・シて、内因性レセプター会合ＴＧＦ−βを取り除いた。標識された および標識されていないタンパク質を含有する試料を上記ウェルに加え、トータ ル容量を４８ウ工ル皿に対しては１００μｍ、２４ウ工ル皿に対しては２００μ ｍとし、ロータリープラントホーム上で緩やかに攪拌しながら４℃でインキュベ ートした。４時間インキュベートした後、上記細胞を結合緩衝液で３回洗浄した 。１００マイクロタイター（２４ウ工ル皿に対して２００μｌ）の溶解緩衝液（ ２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００，１ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ）を各ウェルに加え、４°Ｃで３０分 間インキュベートした。３組の試料由来の細胞会合放射活性を、ガンマ線計数管 で溶解した細胞の割合を調べて測定した。

これに対して、標識されていないＴＧＦ−β１は、標識されたＴＧＦ−β１の、 ３つのタイプすべてのＴＧＦ−βレセプターへの結合と効果的に競合した。ＴＧ Ｆ−βｌの３つのタイプすべての細胞への結合と競合するには、非常に高濃度の プロテオグリカン融合タンパク質が必要であった（図１９Ａ）。最大値の半分の 競合は、平均して約３μＭの融合タンパク質濃度で達成された。

実施例Ｘｒｌ ＴＧＦ−のレセプ　−への加 レセプターと架橋させるため、細胞を２４ウエルの培地面で増殖させ、上記のよ うに操作した。標識されたおよび標識されていないリガンドとインキュベートし た後、この細胞を結合緩衝液で１回洗浄し、そしてＢＳＡを有しない結合緩衝液 で３回洗浄した。次いで、スペリン酸ジスクシンイミジル（最終濃度０．２ｍＭ ）を含有する１００μｌの結合緩衝液（ＢＳＡなし）を加え、この細胞を４°Ｃ で１５分間インキュベートした。架橋反応の後、細胞をｔｏｏμｔの溶解緩衝液 （１２ＳｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ％ｐＨ７、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、 １％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ＧＧ、　１Ｏａｇ／ｍｌｏイペブチン、１Ｏａｇ／ｍ ｌアンチベイン、ｓｏ１ｇ／偽ｌアプロチニン、１００μｇ／ｍｌベンザミジン −ＨＣｌ、　１Ｏａｇ／ｍｌペプスタチン）に溶解した。

溶解物を同じ緩衝液と混合し、還元状態でプレキャストした４−１２％のＮｏｖ ｅＸゲルを使用した５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

電気泳動の後、上記ゲルを乾燥し、−７０℃で数日間、ＸＡＲ−１００Ｘ線フイ ルムにさらした。

架橋試験によって、ＴＧＦ−β１のＩ型およびｒ■■型レセプターへの結合が、 本質的に変化していないＩＩ型レセプターへの結合よりも、３つのすべてのプロ テオグリカン融合タンパク質によってより影響されることが明らかになった（図 １９Ｂ）。それぞれのオートラジオグラムのレーザーデンシトメトリー分析は、 ＴＧＦ−βｌのｒ型およびＩＩＩ型レセプターへの結合が、使用されたプロテオ グリカン濃度でそれぞれ約２５％または５０％に減少することを示した。

競合は、ＴＧＦ−βの■型およびＩＩＩ型レセプターへの結合に対して最も効果 的であった。これはおそらく、これらのレセプターが、■Ｔ型レセプターよりも ＴＧＦ−βに対して低いアフィニティーを有するためである。プロテオグリカン のＴＧＦ−βに対するアフィニティーが、いずれのレセプターのアフィニティー よりもずっと低い一方で、すべてのプロテオグリカンは、アフィニティーが不足 し得る濃度で潜在的に構成する組織中に豊富に存在する。さらに、細胞結合試験 で使用された試験条件は、ＴＧＦ−βのプロテオグリカンへの結合を促進しない 。

本発明は、現在の好ましい実施態様について記述しているが、本発明の意図から 離れることなしに種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。したが って本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。

ＦＩＧ、ｌＡ　ＦＩＧ、旧 ２ｇ−２９− 塵ムａｔ　（而） 臼Ｇ、　２Ｂ　１　２　３　４　５　＠　７　８　１１１０１１１２１３１４’ ｌＬ＋Ｒｙａ實（ｐｇ／ｍ１） ＦＩＧ、　３Ａ ｆｉ４ｉ物慣　（μ９／而） ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、６Ａ Ｆ［Ｇ、６Ｂ ３〇− ２１−−１−５，ＦＩＧ、７ｂ ＦＩＧ、８ａ き ９腎　四−〇 −・−７コｌ）ン ＦＩＧ、ＩＯ ヌヌな；　呂ｇ粗ミ　８９ス、ｆｉ　８ｇＢ詔シーーーーー　〜＋＋− ＦＩＧ、ｌ３ ｋＤａ ２０〇− ＦＩＧ、１９Ｂ ｋＤａ ２１Ｂ−＠　−＠−・　・１３−Ｇ ａｂｃｄ　＠　曹 ≠　Ｉ　得ｊす　９日−ｄ９四−”；２１”’ｆ２Ｌ４ヅ・　′　得Ｖ’１９− ｄ９聞−１ｑ２１ψ’ｊｕｔｅ♀覧％“Ｉ−」９上−１９２１ Ｍ８Ｐ−ＢＧＭＢＰ−ＤＥＣＭＡＰ−ＦＭ　ＭＡＰＦＩＧ、　１９Ａ 田竪槓審輔牛 、　、　ＰＣＴＡＩ３　９２１０９８７１（５１）Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記 号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　ＡＢＳ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、Ｒ Ｏ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ （７１）出願人　ザ　ユニバーシティ　オブ　ユタアメリカ合衆国　ユタ　８４ １１２　ソルトレイク　シティ 特表千７−５０４８８６　（２４） ＦＩ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＣ （７２）発明者　ルオスラーティ、エルキ　アイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１０７ランチヨ　サンタ　フェ、ビー、 オー。

ボックス　１０５４ （７２）発明者　ロンゲイカー、マイケル　ティー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４１１７サンフランシスコ、バーナサス　 アベニュー　３３７ （７２）発明者　ウィトビー、ディピッド　ジェイ。

イギリス国　リーズ　エルニス１６８エイエイチ、アデル、ミル　レイス　コテ ージ（７２）発明者　ハーバ−、ジョン　アール。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２００８カールズパッド、ユニコーニオ　 ストリート　２４３３ アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１０７サン　ディエゴ、アミフォード　 ドライアメリカ合衆国　ユタ　８４１２４　ソルトレイク　シティ、アピナデイ 　ロード４４６４

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．デコリンあるいはデコリンの機能的等価物を創傷に投与することを包含する 、はん痕形成を予防あるいは緩和する方法。
2. ２．前記機能的等価物が、バイグリカンである、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記機能的等価物が、フィブロモジュリンである、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記はん痕形成が、皮膚はん痕形成である、請求項１に記載の方法。
5. ５．デコリンあるいはその機能的等価物と、薬学的に許容可能な担体とを含有す る、薬剤組成物。
6. ６．前記機能的等価物が、バイグリカンである、請求項５に記載の薬剤組成物。
7. ７．前記機能的等価物が、フィブロモジュリンである、請求項５に記載の薬剤組 成物。
8. ８．前記薬学的に許容可能な担体が、ヒアルロン酸である、請求項５に記載の薬 剤組成物。
9. ９．前記組成物が、さらに生分解性ポリマーに付着するＲＧＤ含有ポリペプチド を含む、請求項５に記載の薬剤組成物。
10. １０．ＴＧＦ−βと精製ポリペプチドとを接触させることを包含する、ＴＧＦ− β調節活性により生じた病状を処置する方法であって、該ポリペプチドが、タン パク質のＴＧＦ−β結合ドメインを含み、該タンパク質が、約２４のアミノ酸の ロイシンリッチ操り返し単位によって特徴づけられ、それによって該病状がもた らされる活性を妨害するかまたは低下させる、方法。
11. １１．前記タンパク質が、デコリンである、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記タンパク質が、バイグリカンである、請求項１０に記載の方法。
13. １３．前記タンパク質が、フィブロモジュリンである、請求項１０に記載の方法 。
14. １４．前記病状が、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、動脈硬化症、成人呼吸促進 症候群、肝硬変、肺線維症、術後心筋梗塞、心臓線維症、血管形成術後再狭窄、 腎間質性線維症、あるいは皮膚線維症の症状である、請求項１０に記載の方法。
15. １５．前記病状が、糸球体腎炎である、請求項１４に記載の方法。