JPH10502349A

JPH10502349A - インテグリンα▲下４▼β▲下１▼のＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンへの結合を阻害する方法

Info

Publication number: JPH10502349A
Application number: JP8503474A
Authority: JP
Inventors: コーガン，テイモシー・ピイ; レン，カイジユン; バンダースライス，ピーター; ベツク，パメラ・ジエイ
Original assignee: テキサス・バイオテクノロジー・コーポレイシヨン
Priority date: 1994-06-29
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 1998-03-03
Also published as: CA2193828A1; EP0767674A4; US6713604B1; AU2958195A; EP0767674A1; US6087330A; WO1996000581A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＣＳ１ペプチドの一部をモデルとして作られる、５〜約13個の残基の単離精製した環状ペプチドに関する。本発明のペプチドは、好ましくは、配列番号２〜１４または１６〜４２のアミノ酸残基配列を有する。本発明はさらに、α₄β₁インテグリンの、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチンまたはインベーシンなどのタンパク質への結合を選択的に阻害する方法に関し、該方法は、阻害有効量の該ペプチドの存在下、α₄β₁インテグリンを発現する細胞を該タンパク質にさらすことを含む。本発明はさらに、生理学的に許容されうる担体および本発明の環状ペプチドを含む医薬組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】インテグリンα₄β₁のＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンへの結合を阻害する方法発明の分野本発明は、概して、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンなどのタンパク質への結合を阻害する方法に関する。本発明はまた、該結合を阻害する合成環状ペプチドに関する。本発明の背景血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は、毛細管の内壁を覆う内皮細胞の表面上にあるタンパク質である。ＶＣＡＭ−１は、ある種の白血球細胞の表面に存在するヘテロ二量体タンパク質であるインテグリンα₄β₁（またはごく後期の抗原−４（late antigen-4）に対してはＶＬＡ−４）を認識して結合する。α₄β₁ のＶＣＡＭ−１への結合によって、白血球細胞が、毛細管を取り巻く組織が感染または損傷を受けている場所の毛細管壁に接着することができる。組織が微生物の進入を受けたり損傷を受けたりすると、白血球が炎症反応において重要な役割を果たす。その炎症反応の最も重要な面の一つは、細胞接着現象に係わる。一般に、白血球細胞は、血流によって循環している。しかし、組織が感染したり、損傷を受けると、白血球細胞は、攻撃を受けたり損傷した組織を認識し、冒された組織付近の毛細管壁に結合し、毛細管から冒された組織の中へ拡散する。ＶＣＡＭ−１は、ある種の白血球細胞が冒された組織を認識し、毛細管壁に結合して、冒された組織の中へ移動するのを助ける。白血球には主要な３つの型がある。すなわち、顆粒球、単球およびリンパ球である。ＶＣＡＭ−１は、単球、リンパ球ならびに顆粒球の二つのサブクラス−好酸球および好塩基球の表面で発現するα₄β₁に結合する。単球は、毛細管壁を通って血流を離れた後、成熟してマクロファージになり、侵入微生物、異物および老衰細胞を貧食消化する。リンパ球は抗体を産生し、感染細胞を殺す。好酸球および好塩基球は、種々の炎症反応の媒介物質を分泌する。毛細管を取り巻く組織の感染または損傷の後、毛細管を覆う内皮細胞がＶＣＡＭ−１などの一連の接着分子を発現する。接着分子は、感染と戦うために必要な白血球細胞の結合に重要である。白血球細胞は、ＶＣＡＭ−１に結合する前に、まず別の種類の接着分子に結合してそれらの流れを遅くし、活性化した内皮に沿って細胞が「流れに乗って進む（roll）」ことができる様にする。そのとき、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球は、α₄β₁インテグリンを介して内皮細胞上のＶＣＡＭ−１にしっかり結合することができる。この相互作用は、これらの白血球細胞の損傷した組織への移行にも関与することが明らかである。白血球細胞の損傷部位への移動は、感染との戦いおよび異物の破壊を助けるが、多くの場合、この移動は制御することができなくなり、白血球が現場に大量出血して、組織の損傷を広げることになる。従って、この過程を遮蔽することができる化合物があれば、治療剤として有益である。すなわち、白血球細胞のＶＣＡＭ−１への結合を防ぐ阻害剤を開発することは有用である。例えば、α₄β₁結合の阻害によって治療することができる病気のいくつかとして、それらに限定されないが、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、喘息、アレルギー、多発性硬化症およびタイプＩの糖尿病が挙げられる。α₄β₁は、いくつかの白血球細胞に存在することの他に、種々の癌細胞、例えば白血病、黒色腫、リンパ腫および肉腫細胞などに存在する。α₄β₁に関与する細胞接着は、ある種の癌の転移に関与する可能性があることが示唆されている。従って、α₄β₁結合の阻害剤は、いくつかの形態の癌の治療にも有用であり得る。発明の簡単な要旨本発明の一態様は、（ａ）Ｎ−末端アミン基、アセチル基（Ａｃ）、またはＮ −末端残基にアミド結合によって結合した平均分子量が約400〜約12,000ダルトンであるポリエチレングリコール部分（ＭＰＥＧ_xooo）；および（ｂ）Ｃ−末端カルボン酸基またはアミド基を有する、４〜約13個のアミノ酸残基の単離精製した環状ペプチドであって、アミノ酸残基配列Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１５）（ここで、Xaa₁は、Ｌ−またはＤ−α−アミノ酸残基であり；Xaa₂および Xaa₃は疎水性のＬ−α−アミノ酸残基であるが、ただし、Xaa₁がLysまたはArgである場合、Xaa₂はGlyおよびCys以外である。）を含むペプチドを提供する。好ましい実施態様では、Xaa₁がPhe、TrpまたはIleであり、Xaa₂がLeu、Ile、Val、Ly sまたはMetであり、Xaa₃がVal、Tyr、Leu、TrpまたはPheである。より好ましくは、Xaa₁がTrpであり、 Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValある。一実施態様において、本発明の環状ペプチドは、ラクタムの形成によって環化される。該ペプチドは、アミノ酸残基配列Xaa₄−Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１）（ここで、Xaa₁は、Ｌ−またはＤ−α−アミノ酸残基であり；Xaa₂は疎水性のＬ−α−アミノ酸残基であるが、ただし、Xaa₁がLysまたはArgである場合、Xaa₂はGlyおよびCys以外であり；Xaa₃は疎水性のＬ−α−アミノ酸残基であり；Xaa₄はＤ−またはＬ−α−アミノ酸である。）を含む。好ましくは、Xaa₁がPh eまたはTrpであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValであり、Xaa₄がGluである。より好ましくは、該ペプチドのアミノ酸残基配列が配列番号２〜８である。別の実施態様において、本発明の環状ペプチドは、さらに、システインまたは修飾システイン残基およびＮ−末端に−ＣＨ₂ＣＯ−基を含む。該実施態様によれば、Xaa₁は、好ましくは、Trpであり、Xaa₂は、好ましくは、Leuである。該ペプチドの例として好ましいアミノ酸残基配列は、配列番号９〜１２である。別の実施態様において、本発明の環状ペプチドは、さらに、２個以上のシステインまた修飾システイン残基を含み、ジスルフィド結合により環化される。好ましくは、システインまたは修飾システイン残基の一つがＮ−またはＣ−末端に位置する。一つの実施態様において、２個のシステインまたは修飾システイン残基を有する環状ペプチドは、アミノ酸残基配列Xaa₁−Xaa₂−Asp −Xaa₃（配列番号１５）（ここで、Xaa₁、Xaa₂およびXaa₃は上記で定義した通りである。）を含む。好ましくは、Xaa₁がTyr、Phe、Trp、dTrpまたはIleであり； Xaa₂がLeu、Ile、Val、Lys、MetまたはAspであり；Xaa₃がVal、Tyr、Leu、TrpまたはPheである。さらに別の態様では、Ｎ−およびＣ−末端の両方にシステインまたは修飾システイン残基を有する環状ペプチドが配列番号１のアミノ酸残基配列を含む。好ましくは、Xaa₁がTrpまたはPheであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValまたはTyrであり、Xaa₄がSerまたはGluである。本発明の例としての好ましい環状ジスルフィドペプチドのアミノ酸残基配列は、配列番号１３または１５〜４３である。本発明の別の態様では、生理学的に許容されうる希釈剤および本発明の環状ペプチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、該組成物における環状ペプチドが上記で述べたものと同じである。本発明のさらに別の態様では、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合を選択的に阻害する方法を提供する。その方法は、α₄β₁インテグリンを発現する細胞およびＶＣＡＭ−１を発現する細胞を、阻害有効量の本発明の環状ペプチドにさらすことを含む。その方法の好ましい実施態様では、ＶＣＡＭ−１が血管内皮細胞の表面上にある。別の好ましい実施態様では、α₄β₁インテグリンが単球、リンパ球、顆粒球（好酸球または好塩基球）、幹細胞またはα₄β₁を天然に発現する他の細胞などの白血球細胞の表面上にある。その方法で使用される好ましいペプチドは、上記で述べたものと同じである。細胞が生きた生物にある場合は、好ましくは、ペプチドを、有効に阻害する量で本発明の薬剤組成物に入れてその生物に投与する。本発明の別の態様では、有効に阻害する量の本発明の環状ペプチドの存在下でインテグリンをタンパク質にさらすことを含む、α₄β₁インテグリンのタンパク質への結合を選択的に阻害する方法を提供する。好ましくは、α₄β₁インテグリンが、白血球または幹細胞などの細胞の表面上で発現され、タンパク質がフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの一部である。発明の詳細な説明Ｉ．発明本発明は、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１、フィブロネクチンおよびインベーシンなどのタンパク質への結合を阻害する方法を提供する。本発明はまた、該結合を阻害する環状ペプチドを提供する。白血球の血管内皮への接着およびそれに続く組織への溢出は、炎症反応において重要なステップである。免疫グロブリン上科の一つである血管細胞接着分子− １（ＶＣＡＭ−１）は、内皮細胞および限られた数の他の細胞型によって発現される。ＶＣＡＭ−１は、腫瘍壊死因子−α₁、インターロイキン−４およびインターロイキン−１βなどのサイトカインによって誘発することができ、従って、慢性関節リウマチ、喘息およびアテローム性動脈硬化症などの炎症状態における白血球の溢出に寄与すると仮定される。ＶＣＡＭ−１の一つの分子形は、その細胞外ドメインに７個の免疫グロブリンモジュールを含む。ＶＣＡＭ−１は、インテグリン受容体α₄β₁によって認識される。α₄β₁は、主として白血球（ＴおよびＢリンパ球、単球、好塩基球および好酸球）によって発現され、また、マスト細胞及び胚神経堤の誘導体上で、および筋肉の発達において機能的である。 α₄β₁はまた、細胞外マトリックス糖タンパク質フィブロネクチンを認識する。３個の異なるα₄β₁結合部位がフィブロネクチン内で確認されており、その全てが合成形で再現された。一つの部位（ペプチドＨ１で示す）は、HepII領域にあり、従って、全てのフィブロネクチンのイソ形で発現される。他の二つ（ペプチドＣＳ１およびＣＳ５で示す）は、二者択一的にスプライシングされたタイプ III結合部分（alternatively spliced typeIII connecting segment）に存在する。これら３つのうち、ＣＳ１ペプチドは、α₄β₁に対してより高い親和性を有し、その最少活性部位として、トリペプチドLeu−Asp−Val（ＬＤＶ）を含む。Ｈ１は、関連モチーフのIle−Asp−Ala（ＩＤＡ）を含み、一方、ＣＳ５は、原型ＲＧＤモチーフの変形であるArg−Glu−Asp−Valを含む。 II．ペプチド本発明の一態様では、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合を阻害する環状ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ＣＳ１ペプチド配列のLeu−Asp−Val（ＬＤＶ）ドメインをモデルとして作られ、該ドメインは、環状ペプチドによって潜在的α₄β₁結合阻害剤を産生するように表わされる。ペプチドは、本明細書ではアミノ酸残基配列として開示する。それらの配列は、左から右にアミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向になるように記載する。アミノ酸残基配列は、１文字または３文字コードのいずれかによって表す。本明細書で使用するそれらのコードおよび種々の他の略号の意味は、IUPA C-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclatureの勧めに従い、下記に示す。本発明のペプチドの構造に修飾および変形を行っても、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合を阻害する分子を得ることができる。例えば、活性をあまり失うことなく、あるアミノ酸を配列中の他のアミノ酸と置き換えることができ、同様に、Ｄ−またはＬ−アミノ酸残基を使用することができる。Ｄ−アミノ酸は、本明細書では、d-X_aa（ここで、X_aaは３文字のアミノ酸コードである。）（例えば、dTrp）として示す。事実、あるアミノ酸を用いて置換又は付加することが可能であり、その様なアミノ酸は結合阻害をかなり高めることができる。ペプチドの生物学的機能活性を定義するのは、そのペプチドの相互作用容量（intera ctive capacity）および性質であるので、あるアミノ酸配列の置換がペプチド配列において行われても、同様の性質、特に α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合阻害を有するペプチドを得ることができる。その様なペプチドの例を下記に示す。本発明の意図するペプチドは環状である。環状ペプチドは、対応する直鎖状ペプチドのあるアミノ酸残基の間に形成された環構造を有し、本明細書に記載するアミノ酸残基の共有結合によって環化される直鎖状ペプチドとすることができる。本発明の環状ペプチドは、４〜約13個のアミノ酸残基を含む。Ｎ−末端アミノ酸残基は、遊離の末端アミン基（ＮＨ₂）、アセチル基（Ａｃ）、またはＮ−末端残基にアミド結合によって結合した平均分子量が約400〜約12,000ダルトンであるポリエチレングリコール部分（ＭＰＥＧ_xooo）を有する。Ｃ−末端アミノ酸残基は、末端カルボン酸基（ＯＨ）またはアミド基を有する。環状ペプチドは、アミノ酸残基配列Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１５）（ここで、Xaa₁は、Ｌ−またはＤ−α−アミノ酸残基であり；Xaa₂およびXaa₃は疎水性のＬ−α−アミノ酸残基であるが、ただし、Xaa₁がLysまたはArgである場合、Xaa₂はGlyおよびCys以外である。）を含む。好ましい実施態様では、Xaa₁がPhe、TrpまたはIleであり、Xaa₂がLeu、Il e、Val、LysまたはMetであり、Xaa₃がVal、Tyr、Leu、TrpまたはPheである。より好ましくは、Xaa₁がTrpであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValある。上記で述べた配列に従うペプチドは、Ｎ−末端方向に、１〜５個のＬ−またはＤ−α−アミノ酸を付加し、Ｃ−末端方向に１〜５個のＬ−またはＤ−α−アミノ酸を付加することにより延長することができる。ペプチドは、硫黄含有架橋により、またはそれを含まないで環化することができる。環状ペプチドが硫黄含有架橋を含まない場合、Ｎ−およびＣ−末端アミノ酸残基は、アミド結合（環化の場合、形式的にはラクタムである）で結合する。環状ペプチドが硫黄含有架橋を含む場合、対応する直鎖状ペプチドの１個または２個のアミノ酸残基は、Cysまたは修飾Cys残基（dCysまたはdPen）である。該環状ペプチドは、環状スルフィド、スルホキシドまたはスルホン（対応する直鎖状ペプチドにおける１個のCys残基）を含むことができ、または環状ジスルフィド（対応する直鎖状ペプチドにおける２個のCys残基）を含むことができる。環化がＮおよびＣ末端の縮合によるラクタムの形成によって生じた場合、そのペプチドは、下記アミノ酸残基配列： Xaa₄−Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１）（ここで、Xaa₁は、Ｌ−またはＤ −α−アミノ酸残基であり；Xaa₂およびXaa₃は独立して、疎水性のＬ−α−アミノ酸残基であるが、ただし、Xaa₁がArgまたはLysである場合、Xaa₂はGlyおよびC ys以外であり；Xaa₄はＤ−またはＬ−α−アミノ酸である。）を含む。好ましい実施態様では、Xaa₁がPheまたはTrpであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValであり、Xaa₄がGluまたはSerである。配列番号１に従う好ましい例のペプチドは、 Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Pro（配列番号２）、 Glu−Trp−Asp−Val−Asp（配列番号３）、 Glu−Trp−Leu−Asp−Val（配列番号４）、 Glu−Trp−Leu−Asp−Asp（配列番号５）、 Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Pro−Glu−Trp−Leu−Asp−Val（配列番号６）、 Gly−Pro−Glu−Phe−Leu−Asp−Val（配列番号７）および Glu−Phe−Leu−Asp−Val（配列番号８）の配列を有する。本発明のペプチドがスルフィド、スルホキシドまたはスルホン架橋を含む場合、該ペプチドは、一つの位置にシステインまたは修飾システイン残基を含有し、Ｎ−末端に−ＣＨ₂ＣＯ−基を含む。本明細書で使用する「修飾システイン」は、Ｄ−システイン（dCys）またはＤ−ペニシラミン（dPen）を表す。システインまたは修飾システイン残基の硫黄原子は、ＣＨ₂基に結合して環状ペプチドを形成する。上記ペプチドは、アミノ酸残基配列Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１５）（ここで、Xaa₁、Xaa₂およびXaa₃は上記で定義した通りである。）を含む。好ましくは、Xaa₁がTrpであり；Xaa₂がLeuであり；Xaa₃がValまたはCysである。好ましい例のペプチドは、ＣＨ₂ＣＯ−Ser−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号９）、ＣＨ₂ＣＯ−Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号１０）、ＣＨ₂ＣＯ−Glu−Trp−Leu−Asp−Cys−酸（配列番号１１）およびＣＨ₂ＣＯ−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−ＣＯＯＨ（配列番号１２）の配列を有する。本発明のペプチドがジスルフィド架橋を含む場合、該ペプチドは、２個のシステインまたは修飾システイン残基を含む。好ましくは、システインまたは修飾システイン残基の一つがＮ−またはＣ−末端に位置し、それらのアミノ酸残基の少なくとも一つはCysである。該ジスルフィドペプチドは、アミノ酸残基配列Xaa₁ −Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１５）（ここで、Xaa₁、Xaa₂およびXaa₃は上記で定義した通りである。）を含む。好ましくは、Xaa₁がTrpまたはCysであり；Xaa₂ がLeuであり；Xaa₃がValまたはCysである。好ましい例の上記ペプチドは、Cys− Leu−Asp−Val−Cys（配列番号１３）またはCys−Trp−Leu−Asp−Cys−酸（配列番号１４）の配列を有する。配列番号１５の別の好ましい実施態様では、Xaa₁がTyr、Phe、Trp、dTrpまたはIleであり、Xaa₂がLeu、Ile、Val、Lys、MetまたはAspであり、Xaa₃がVal、Ty r、Leu、TrpまたはPheである。より好ましくは、ジスルフィド環状ペプチドが、 Cys−Ser−Trp−Leu−Asp−Val−Cys（配列番号１６）、 Cys−dTrp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号１７）、 Ac−Cys−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号１８）、 Cys−Tyr−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号１９）、 Cys−Trp−Leu−Asp−Phe−Cys−酸（配列番号２０）、 Cys−Phe−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号２１）、 Cys−Trp−Leu−Asp−Trp−Cys−酸（配列番号２２）、 Cys−Trp−Ile−Asp−Val−Cys−酸（配列番号２３）、 Cys−Trp−Met−Asp−Val−Cys−酸（配列番号２４）、 Cys−Trp−Val−Asp−Val−Cys−酸（配列番号２５）、 Cys−Trp−Lys−Asp−Val−Cys−酸（配列番号２６）、 Cys−Trp−Leu−Glu−Val−Cys−酸（配列番号２７）、 Cys−Trp−Leu−Asp−Leu−Cys−酸（配列番号２８）、 Cys−Trp−Leu−Asp−Tyr−Cys−酸（配列番号２９）、 Cys−Ile−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号３０）、 Cys−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号３１）および dCys−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号３２）の配列を有する。別の好ましい実施態様では、本発明のジスルフィド環状ペプチドが、上記配列番号１のアミノ酸残基配列を含む。好ましくは、Xaa₁がTrpまたはPheであり、Xa a₂がLeuであり、Xaa₃がValまたはTyrであり、Xaa₄がSerまたはGluである。好ましい該ペプチドの例は、 Cys−Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−アミド（配列番号３３）、 Cys−Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号３４）、 dCys−Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号３５）、 Cys−Glu−Trp−Leu−Asp−Tyr−Cys−酸（配列番号３６）、 Cys−Ser−Phe−Leu−Asp−Tyr−Cys−酸（配列番号３７）、 Cys−Glu−Phe−Leu−Asp−Tyr−Cys−酸（配列番号３８）、 dCys−Ser−Trp−Leu−Asp−Val−dCys−酸（配列番号３９）、 Cys−Pro−Glu−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号４０）、ＭＰＥＧ₅₀₀₀−Cys−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号４１）および dPen−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号４２）の配列を有する。別の実施態様では、本発明の環状ジスルフィドペプチドが、配列：Xaa_n−Cys −Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号４３）（ここで、Xaaは、Ｄ−またはＬ−α−アミノ酸であり、ｎは１〜７の整数である。）を含む。本発明のペプチドは、当該分野で周知の標準的なペプチド合成法を使用して作ることができる。典型的には、ペプチドをＦｍｏｃ−アミノ酸で製造した。しかし、ペプチドは、当業者に周知の方法により、Ｂｏｃ保護基を使用して作ることもできる。その合成法で使用される三官能アミノ酸の側鎖保護基としては、アルギニン（Ｐｍｃ）、アスパラギン酸（ｔＢｕ）、システイン（Ｔｒｔ）、グルタミン酸（ｔＢｕ）、ヒスチジン（Ｂｏｃ）、リシン（Ｂｏｃ）、セリン（ｔＢｕ）、トレオニン（ｔＢｕ）およびチロシン（ｔＢｕ）が挙げられる。他の保護基は、特定して記載する。固相法による本発明のペプチドの製造は当業者には周知であり、以下に記載する。ペプチドは、Ｃ−末端カルボン酸ペプチドの合成に対してはｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（Wang樹脂で、一般にその樹脂は、第一のアミノ酸が結合したものを購入することができる。）などの不溶性担体上で合成し、Ｃ− 末端アミドペプチドに対しては４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂（Rink樹脂）などの不溶性担体上で合成した。それらのペプチドは、Protein Technologies Inc．Symphonyペプチド合成機において、ＨＢＴＵまたはＤＩＣ化学方法を使用して固相合成により製造した。Ｃ−末端アミドペプチドは、他のカップリングと同様の一般的方法を使用して、配列のＣ−末端アミノ酸をRink樹脂にカップリングさせることにより製造した。Ｃ−末端カルボン酸ペプチドは、Ｃ−末端アミノ酸がカルボン酸エステルとして樹脂に結合したWang樹脂を購入することにより製造した。α−アミノ保護基は、ピペリジン処理により除去し、次いで、樹脂をＦｍｏｃ−アミノ酸、ＤＩＣもしくはＨＢＴＵなどのカップリング試薬、および必要ならばＨＯＢＴにより同時処理することによりＦｍｏｃ−アミノ酸を樹脂に結合させた。該脱保護およびカップリングを繰り返して、所望する各ペプチドを得た。全ての場合において、Ｆｍｏｃ保護基は、ピペリジンの20％ＤＭＦ溶液で処理することにより除去した。しかし、当業者であれば理解されるように、ピペリジンの正確な割合（％）は重要ではなく、本発明を限定するものではない。また、当業者であれば理解されるように、ピペリジンは、他の塩基で置き換えることができ、さらに、使用するカップリング試薬およびプロトコールは、ペプチド合成の分野で周知のもの（Ｂｏｃ化学に基づく固相合成および液相ペプチド合成の使用など）で置き換えることができ、本明細書に記載の実施例で特定して使用する試薬は、本発明を限定するものではない。天然のものではない全てのアミノ酸、Ｄ−アミノ酸および他の化合物は、自動化操作の場合と同様の方法に従って、試薬を手動添加することにより結合させた。Ｃ−末端カルボン酸を有する環状スルフィド、スルホキシド、スルホンまたはジスルフィドを所望する場合、そのペプチドは、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（Wang樹脂）などの不溶担体上で合成することができ、同様のＣ−末端アミドは、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂（Rink樹脂）上で合成した。二つのシステインが存在する場合、トリチル保護基の弱酸による除去およびＤＭＳＯまたはＮＩＳの使用による樹脂上での酸化的環化によりジスルフィド結合が形成され、この化合物は、常法により樹脂から切り離した。あるいは、ジスルフィドは、グアニジン塩酸塩において直鎖状配列を溶液相環化することにより合成できる。環状スルフィド（およびその酸化産物）を所望する場合は、Ｎ−末端をブロモ酢酸でアシル化して、システインのトリチル基を除去し、ＤＭＦ中のＮＭＭ処理により環化を達成することができる。頭−尾ラクタムは、Ｃ−末端アミノ酸と樹脂との間にカルボン酸エステル結合を形成するクロロトリチル樹脂上で合成した。直鎖状ペプチドをＤＣＭ中の酢酸により樹脂から切り離し、溶液中で環化してラクタムを形成した。ペプチドは、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、ＴＦＡ反応混液により樹脂から切り離した。ＴＦＡ反応混液の正確な組成物は、存在する側鎖保護基に依存して変化させた。それは、当業者には周知である。ＴＦＡの範囲は、85〜95％であり、残りは、アニソール、チオアニソール、クレゾール、チオクレゾール、フェノール、チオフェノール、ＥＤＴ、トリメチルシランおよび水の組み合わせから選択される捕捉剤の混合物を含む。切り離し反応に必要な時間は配列に依存し、通常は１〜３時間である。切り離した後、樹脂を濾過により除去し、冷エーテルを溶液に添加して沈殿を得た。沈殿を集め、エーテルで２、３回洗浄して、残留ＴＦＡおよび捕捉剤を除去した。沈殿を凍結乾燥のために水溶液に再溶解して、粗生成物を得た。精製は、Ｃ₁₈−分離カラム（300Å、21.4mm×25cm、5μmの球状充填物）上、1 0ml/分の流速での逆相ＨＰＬＣにより行った。当業者に周知の他の適する充填物の選択も、同様に許容されうる。生成物は、214nmでのＵＶ吸収により検出した。ＨＰＬＣ系で、２つの可動相、溶液ＡおよびＢを使用して勾配溶離した。溶液Ａは0.15％のＴＦＡを含む脱イオン水中の５％アセトニトリルから成り、溶液Ｂは0.1％のＴＦＡを含むアセトニトリル中の５％脱イオン水で構成された。溶液Ｂの割合を増加させる勾配を使用してペプチドを固体支持体から溶離したが、使用する勾配は、配列に依存する。当業者に公知の他の精製法も同様に許容されうる。ペプチドの純度は、Ｃ₁₈分析ＨＰＬＣ（300Å、4.6 mm×25cm、5μmの球状充填物）により、1ml／分の流速でチェックした。例示したペプチドの合成の詳細な説明を以下の実施例に記載する。 II．医薬組成物本発明の別の態様では、本発明のペプチドおよび生理学的に許容されうる希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、１種以上の無毒性の生理学的に許容されうる希釈剤、担体、アジュバントまたは賦形剤（まとめて、希釈剤という）とともに、非経口注入用、鼻腔内送達（delivery）用、経口投与用（固体または液体形）、直腸投与用または局所投与用などの組成物に製剤する上記の１種以上のペプチドを含む。組成物は、ヒトおよび動物に、経口、直腸、非経口（静脈内、筋肉内または皮下）、槽内（intracisternally）、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏または点滴剤）的に、または口腔もしくは鼻腔用噴霧剤もしくはエーロゾルとして投与することができる。組成物はまた、標的部位での局所送達用カテーテルにより、冠状動脈内ステント（細いワイヤメッシュから成る管状器具）を介して、または生物分解可能なポリマーを介して送達する(deliver)ことができる。組成物はまた、組成物の標的送達(targeted delivery)の為にリガンド（抗体など）と複合体を形成させてもよい。組成物は、好ましくは、カテーテルによるi.V,もしくは皮下注入により投与し、または噴霧もしくはエーロゾルにより鼻腔内投与する。非経口注入に適する組成物は、生理学的に許容されうる滅菌水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液またはエマルションおよび再構成して注入可能な滅菌溶液または懸濁液にするための滅菌粉末を含むことができる。適する水性および非水性担体、希釈剤、溶媒または賦形剤の例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの適する混合物、植物油（オリーブ油など）およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジユバントを含むことができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確実に予防することができる。また、等張化剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を含むのも好ましい。吸収が持続する注入可能な薬剤形態は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを使用することによりもたらすことができる。該不活性希釈剤の他に、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤などのアジュバントを含むことができる。懸濁液は、活性化合物の他に、懸濁化剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物などを含むことができる。本発明化合物の局所投与用剤形としては、軟膏剤、粉末、噴霧剤および吸入剤が挙げられる。活性成分を、滅菌条件下で生理学的に許容されうる担体および、必要ならば、保存剤、緩衝剤またはプロペラントと混合する。眼科用製剤、眼の軟膏、粉末および溶液も、本発明の範囲ないである。 III．α₄β₁の結合を阻害する方法本発明の別の態様では、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合を選択的に阻害する方法を意図する。本発明の方法は、生きた生物で、in vitroまたはin vivoで使用することができる。本発明の方法によれば、α₄β₁インテグリンを発現する細胞を、阻害有効量の本発明のペプチドの存在下、ＶＣＡＭ−１を発現する細胞にさらす。阻害有効量を決定する方法は周知である。 α₄β₁インテグリンを発現する細胞は、天然に存在する白血球細胞、マスト細胞、または細胞表面上で天然にα₄β₁を発現する他の種類の細胞、あるいはα₄ β₁インテグリンをコードするポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を含む発現ベクターでトランスフェクションさせた細胞であることができる。特に好ましい実施態様では、α₄β₁インテグリンが、単球、リンパ球もしくは顆粒球（例えば、好酸球または好塩基球）などの白血球細胞の表面上に存在する。ＶＣＡＭ−１を発現する細胞は、天然に存在する細胞（例えば、内皮細胞）またはＶＣＡＭ−１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションさせた細胞であることができる。ＶＣＡＭ−１を発現するトランスフェクションされた細胞を産生する方法は、周知である。ＶＣＡＭ−１が細胞の表面上に存在する場合、そのＶＣＡＭ−１の発現は、好ましくは、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−４およびインターロイキン− １βなどの炎症性サイトカインによって誘発される。 α₄β₁インテグリンおよびＶＣＡＭ−１を発現する細胞が生きた生物にある場合、ペプチドは、有効な量で生きた生物に投与される。好ましくは、ペプチドは本発明の医薬組成物にする。投与は、好ましくは、脈管内注射または鼻腔内投与により行う。本発明の方法は、白血球細胞の損傷を受けた組織への制御されない移動に関連した病気の治療に特に有用である。そのような病気としては、それらに限定されないが、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、アレルギー、多発性硬化症、白血病および脳腫瘍が挙げられる。ＶＣＡＭ−１およびα₄β₁の結合を阻害する方法は、上記した本発明の環状ペプチドを使用する。好ましい該ペプチドは、上記で述べた通りである。より好ましくは、本発明方法で使用するペプチドが、配列番号２〜１４または１６〜４２のアミノ酸残基配列を有する。さらにより好ましくは、ペプチドが配列番号３〜７、９〜１２、１６〜２６、２８、２９または３１〜４２のアミノ酸残基配列を有する。本発明はまた、阻害有効量の本発明の環状ペプチドの存在下、インテグリンをタンパク質にさらすことを含む、α₄β₁インテグリンのタンパク質への結合を選択的に阻害する方法を提供する。好ましい実施態様では、α₄β₁インテグリンを細胞（天然の細胞またはα₄β₁インテグリンを発現するように形質転換した細胞）表面上で発現させる。 α₄β₁インテグリンが結合するタンパク質は、細胞表面上または細胞外マトリックスの一部で発現させることができる。特に好ましいタンパク質は、フィブロネクチンまたはインベーシンである。該方法で使用するための好ましいペプチドは、上記で述べた通りである。本発明のペプチドの結合を阻害する能力を以下の実施例で詳細に記載する。下記実施例は、本発明の特定の実施態様を説明するものであり、明細書および請求の範囲を決して限定するものではない。実施例実施例１：Cys−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号３１）の合成Ｆｍｏｃ−アミノ酸および当モル量のＨＯＢＴをＤＭＦに溶解した。ＤＣＭ中のＤＩＣをカップリング剤として使用し、反応時間を1〜1.2時間とした。Ｆｍｏｃ−Cys(Trt)Wang樹脂(25nM)を、ＤＭＦ（1.5ml）により15〜20分処理して膨潤させた後、ＤＭＦ中の20％ピペリジン（３ｘ、各８分）による処理で脱保護し、樹脂をＤＭＦ（６×）で洗浄した。第一のアミド結合を、Ｆｍｏｃ−Val(150nM) およびＤＩＣ(150nM)を使用して形成し、この方法を、全アミノ酸がカップリングするまで繰り返した。Ｎ−末端保護基を脱保護した後、ペプチドを、ＴＦＡ反応混液（５％アニソールおよび５％ＥＤＴを含む）により、室温で１時間かけて樹脂から切り離した。ＴＦＡ溶液を約0.5mlに減少させ、生成物を冷エーテルで沈殿させた。エーテル（３×）で洗浄した後、ペプチドを水溶液から凍結乾燥すると、粗製直鎖状ペプチド(21.3mg)が得られた。環化を、グアニジン・ＨＣｌ(2 ,0g)および酢酸アンモニウム(1.6g)を含む水（20ml）(pH7.8)に溶解することにより行い、その溶液を４℃で48時間攪拌した後、凍結乾燥した。精製は、5〜70％Ｂの勾配を使用し、60分かけて上記の逆相ＨＰＬＣにより行い、純粋な生成物を、凍結乾燥により、白色粉末として単離した（10.2mg、＞98 ％純度、ＨＰＬＣ分析による）。実施例２：dPen−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号４２）の合成このペプチドは、Ｆｍｏｃ−Cys(Acm)Wang樹脂およびＦｍｏｃ−Trp(Boc)およびＦｍｏｃ−dPen(Acm)を使用したことを除いて、カップリングに対しては、実施例１と同様の一般的方法を使用して製造した。環化は、ＤＣＭ：ＤＭＦ(2:1) 中のＮＩＳ（各チオールに対して４当量）による処理によって、室温で３時間、樹脂上で行った。ＤＭＦおよびＤＣＭにより洗浄した後、ペプチドをＴＦＡ反応混液により切り離し、ＨＰＬＣにより精製した。実施例３：ＣＨ₂ＣＯ−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号１２）の合成直鎖状ペプチドを実施例１の記載と同様に合成したが、この場合は、Ｆｍｏｃ −Trp(Boc)を使用した。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基を脱保護した後、ＤＣＭ（1.5ml)中のブロモ酢酸（200nM）、ＨＯＢＴ(200nM)およびＤＩＣ(200nM)を添加し、反応物を室温で１時間攪拌した。Cys残基上のTrt 基を5％のトリメチルシランを含むＤＣＭ（2.5ml)中の2％ＴＦＡで除去した後（４×、10分）、ペプチドをＤＭＦ中の5％ＮＭＭで一夜処理することにより環化した。スルフィドのスルホキシドへの酸化は、ＤＭＦ／ＤＣＭ／水中のＮａＩＯ₄ （2.5当量）により４時間行った。樹脂をＤＣＭで洗浄し、前記と同様に生成物を切り離して、精製した。ＨＰＬＣ分析により、二つのジアステレオ異性体に対応する二つの主なピークが示された。実施例４：ＣＨ₂ＣＯ−Trp−Leu−Asp−Val−Cys−酸（配列番号１２）の合成合成は実施例３と同様に行ったが、酸化は、ＤＣＭ中のＭＣＰＢＡ（６当量）により行った。実施例５：−Glu−Trp−Asp−Val−Asp−（配列番号３）の合成このペプチドは、実施例１に記載の方法と同様にして、塩化２−クロロトリチル樹脂上で合成した。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基の除去後、ペプチドを、ＤＣＭ中の30 ％の酢酸を使用して樹脂から切り離した（３×、10分）。ＤＣＭ溶液を蒸発させ、残渣を水で処理して凍結乾燥すると、保護された直鎖状ペプチドが得られた。環化は、0.4MのＮＭＭ(1mg /ml)を含むＤＭＦ中のＨＢＴＵ（1.2当量）により、20〜24時間行った。ＤＭＦを蒸発させ、残渣を水で沈殿させて洗浄した（３×）。脱保護および精製は、前記と同様に行った。実施例６：結合アッセイインテグリンα₄β₁のＶＣＡＭへの結合を阻害するペプチドの能力を測定した。α₄β₁の阻害剤として最も可能性のあるペプチドの特異性を、フィブロネクチン結合アッセイを使用して測定した。そのアッセイを下記に記載する。ＶＣＡＭ−１／α₄β₁結合アッセイそのアッセイは、α₄β₁を発現する細胞が精製ＶＣＡＭに直接結合する能力の測定を含む。このアッセイで使用するインテグリンを発現する細胞型は、ヒト前骨髄球細胞系のＨＬ−60であった。発現ベクターは、インテグリンを結合させることが知られているＶＣＡＭの領域がマウスＩｇＧとの融合タンパク質として発現されるように設計した。ヒトＶＣＡＭの二つのＮ−末端ドメインを含むｃＤＮＡはＶＣＡＭｃＤＮＡの全長からＰＣＲ反応によって得られた。同様に、マウスＩｇＧ_2Aのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むｃＤＮＡは、ハイブリドーマ細胞系402C10から単離した全ＲＮＡから得たｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＶＣＡＭｃＤＮＡをマウスＩｇＧｃＤＮＡに連結し、哺乳類発現ベクターでクローン化した。プラスミドをＣＯＳ細胞にトランスフェクションすると、融合タンパク質の発現および周囲の細胞培養培地への分泌が得られた。培地を集めて、活性タンパク質を、ヤギ抗−マウスＩｇＧで被覆したDynal磁気ポリスチレンビーズを使用した免疫沈降により精製した。免疫沈降後、ビーズは、RamosおよびＨＬ−60などのインテグリンα₄β₁を発現する細胞に結合した。mockをトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの培地とともにインキュベートしたビーズは、これらの細胞種を結合しなかったので、そのアッセイの負の対照とした。ＨＬ−60をcalcein AM C-3099（Molecular Probes）により蛍光標識し、１ml の結合緩衝液（ハンク(Hank)の平衡塩類溶液、pH7.4、1.0mMのＣａＣｌ₂、1.0mM のＭｇＣｌ₂）に再懸濁した。ビーズ（10μｌ、4×10⁶ビーズ／ml）を種々の濃度の 10μｌのペプチドとともに96ウェルのマイクロタイター皿のウェルに入れた。ビーズを10μｌの標識細胞（10⁷細胞／ml）とともに室温で10分間インキュベートした。ビーズを磁石でプラスチック上に固定した後、未結合細胞を、結合緩衝液により３回洗浄して除去した。残った結合細胞を50mMのトリス、pH7.4、5.0mMのＥＤＴＡ、1.0％のＮＰ−40に溶解し、Millipore Cytofluor 2350蛍光光度計を使用して蛍光定量法により定量した。用量反応曲線を計算し、ＩＣ₅₀値を求めた。あるいは、ペプチド間の比較に対しては、単一のペプチド濃度で接着率（％）を測定した。配列番号３〜７、９〜１２、１６〜２６、２８、２９および３１〜４２のアミノ酸残基配列を有するペプチドは、約10μM未満のペプチド濃度で、α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合を有意に阻害することが分かった。フィブロネクチン／α₄β₁結合アッセイそのアッセイは、α₄β₁を発現する細胞のフィブロネクチンへの結合を阻害するが、α₅β₁を発現する細胞のフィブロネクチンへの結合は阻害しない、ある種のペプチドの能力を利用する。Ｂ細胞系のRamosは、α₄β₁インテグリンを介してフィブロネクチンに結合することができるが、赤白血病細胞系のK562の結合は、インテグリンα₅β₁に依存する。ヒト血漿フィブロネクチンを96ウェルのアッセイプレートのウェル上に被覆した。ＢＳＡで被覆したウェルをアッセイの対照として使用した。トリス緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）、pH7.4で洗浄した後、ウェルを１％のＢＳＡを含むＴＢＳでブロックした。Calcein AM C-3099で蛍光標識したRamosおよびK562細胞を洗浄して、結合緩衝液（ハンクの平衡塩類溶液、pH7.4、1.0mMのＣａＣｌ₂、1.0mMのＭｇＣｌ₂、1.0mMのＭｎＣｌ₂）に再懸濁した。細胞を種々の濃度のペプチドと混合し、ウェルに入れた。プレートを37℃で45分間インキュベートした。洗浄後、残った結合細胞を１％のＮＰ−40で溶解し、Millipore Cytofluor 2350蛍光光度計を使用して蛍光定量法により定量した。用量反応曲線を計算した。以上の実施例は、本発明の特定の実施態様を示すものである。当業者であれば、本発明の範囲および精神から逸脱することなくそれらの実施態様において改変および変更を行うことは、容易に理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＧ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＤＡＢＵ 9051−4ＣＡＢＦＡＢＸ 9051−4ＣＡＢＡＡＣＤ 9051−4ＣＡＡＢ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レン，カイジユンアメリカ合衆国、テキサス・77478、シユガー・ランド、スピンネイカー・ウエイ・ 1211 (72)発明者バンダースライス，ピーターアメリカ合衆国、テキサス・77025、ヒユーストン、ガニツト・ストリート・3427 (72)発明者ベツク，パメラ・ジエイアメリカ合衆国、テキサス・77081、ヒユーストン、ピン・オーク・パーク・4707、アパートメント・ナンバー・1039

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）Ｎ−末端アミン基、アセチル基、またはＮ−末端残基にアミド結合によって結合した平均分子量が約400〜約12,000ダルトンであるポリエチレングリコール部分；および（ｂ）Ｃ−末端カルボン酸基またはアミド基を有する、４〜約13個のアミノ酸残基の単離精製した環状ペプチドであって、アミノ酸残基配列：Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１５）（ここで、Xaa₁は、Ｌ−またはＤ− α−アミノ酸残基であり；Xaa₂およびXaa₃は疎水性のＬ−α−アミノ酸残基であるが、ただし、Xaa₁がLysまたは Argである場合、Xaa₂はGlyおよびCys以外である。）を含むペプチド。２．Xaa₁がPhe、IleまたはTrpであり、Xaa₂がLeu、Ile、Val、LysまたはMelであり、Xaa₃がVal、Tyr、Leu、TrpまたはPheである、請求項１に記載のペプチド。３．Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValある、請求項２に記載のペプチド。４．ラクタムの形成を介して環化され、アミノ酸残基配列：Xaa₄−Xaa₁−Xaa₂− Asp−Xaa₃（配列番号１）（ここで、Xaa₁、Xaa₂およびXaa₃は請求項１で定義した通りであり、Xaa₄はＤ− またはＬ−α−アミノ酸である。）を含む、請求項１に記載のペプチド。５．Xaa₁がPheまたはTrpであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValであり、Xaa₄がGl uである、請求項４に記載のペプチド。６．配列番号２〜８のアミノ酸残基配列を有する、請求項４に記載のペプチド。７．さらに、システインまたは修飾システイン残基およびＮ−末端に−ＣＨ₂ＣＯ−基を含む、請求項１に記載のペプチド。８．システインまたは修飾システイン残基の硫黄原子が−ＣＨ₂ＣＯ−のＣＨ₂基に結合した、請求項７に記載のペプチド。９．Xaa₁がTrpまたはPheであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValまたはTyrである、請求項７に記載のペプチド。１０．Xaa₁がTrpであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValである、請求項９に記載のペプチド。１１．配列番号９〜１２のアミノ酸残基配列を有する、請求項７に記載のペプチド。１２．さらに少なくとも２個のシステインまたは修飾システイン残基を含む、請求項１に記載のペプチド。１３．少なくとも１個のシステインまたは修飾システイン残基が、Ｎ−またはＣ −末端に位置する、請求項１２に記載のペプチド。１４．Xaa₁がTrpであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValである、請求項１２に記載のペプチド。１５．アミノ酸残基配列：Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１５）（ここで、X aa₁、Xaa₂およびXaa₃は請求項１で定義した通りである。）を含む、請求項１２に記載のペプチド。１６．Xaa₁がTyr、Phe、Trp、dTrpまたはIleであり、Xaa₂がLeu、Ile、Val、Lys 、MetまたはAspであり、Xaa₃がVal、Tyr、Leu、TrpまたはPheである、請求項１５に記載のペプチド。１７．アミノ酸残基配列：Xaa₄−Xaa₁−Xaa₂−Asp−Xaa₃（配列番号１）（ここで、Xaa₁、Xaa₂およびXaa₃は請求項１５で定義した通りであり、Xaa₄はＤ−またはＬ−α−アミノ酸である。）を含む、請求項１５に記載のペプチド。１８．Xaa₁がTrpまたはPheであり、Xaa₂がLeuであり、Xaa₃がValまたはTyrであり、Xaa₄がSerまたはGluである、請求項１７に記載のペプチド。１９．配列番号１３、１４または１６〜４２のアミノ酸残基配列を有する、請求項１２に記載のペプチド。２０．生理学的に許容されうる希釈剤および請求項１に記載の環状ペプチドを含む医薬組成物。２１．ペプチドが配列番号２〜１４または１６〜４２のアミノ酸残基配列を有する、請求項２０に記載の組成物。２２．α₄β₁インテグリンのＶＣＡＭ−１への結合を選択的に阻害する方法であって、阻害有効量の請求項１に記載の環状ペプチドの存在下、α₄β₁インテグリンを発現する細胞をＶＣＡＭ−１を発現する細胞にさらすことを含む方法。２３．α₄β₁インテグリンを発現する細胞が白血球細胞であり、ＶＣＡＭ−１を発現する細胞が内皮細胞である、請求項２２に記載の方法。２４．α₄β₁インテグリンを発現する細胞のＶＣＡＭ−１を発現する血管内皮細胞への接着を選択的に阻害する方法であって、該細胞または内皮細胞を、阻害有効量の請求項１に記載の環状ペプチドにさらすことを含む方法。２５．α₄β₁を発現する細胞が白血球細胞、マスト細胞または腫瘍細胞である、請求項２４に記載の方法。２６．α₄β₁を発現する細胞および内皮細胞が、生きた生物内にある、請求項２４に記載の方法。２７．α₄β₁インテグリンのタンパク質への結合を選択的に阻害する方法であって、阻害有効量の請求項１に記載の環状ペプチドの存在下、インテグリンをタンパク質にさらすことを含む方法。２８．α₄β₁インテグリンが細胞表面上で発現する、請求項２７に記載の方法。２９．タンパク質が細胞外マトリックスの一部である、請求項２７に記載の方法。３０．タンパク質がフィブロネクチンまたはインベーシンである、請求項２７に記載の方法。