JPH07505139A

JPH07505139A - 肝成長因子レセプター

Info

Publication number: JPH07505139A
Application number: JP5514113A
Authority: JP
Inventors: ケミーシク，トーマス・イー; バンダ・ウーダ，ジヨージ・エフ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-02-06
Filing date: 1993-02-05
Publication date: 1995-06-08
Also published as: AU3599693A; WO1993015754A1; EP0625051A1; AU674509B2; US5888965A; US5362716A; CA2129423A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】肝成長因子レセプター本出願は１９９２年２月６日出願の特許出願第０７／８３０．５８６号の一部継続出願であり、同出願は、１９８９年１２月２７日出願の特許出願第０７／４５７．５５６号及び１９９０年９月１４日出願の特許出願第０７１５８２．０６３号の一部継続出願である１９９１年１月１８日出願の特許出願第０７／６４２．９７１号の一部継続出願である。上記全特許出願の内容は全て、参考として本明細書に組入れる。

技術分野本発明は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）とｍｅｔがん原遺転子タンパク質とを含んでなる複合体に関する。本発明は更に、ＨＧＦ配位子又はｍｅｔがん原遺転子レセプターの存在の検出方法及び配位子、レセプター又はこれら両方を含んでなる複合体の単離方法に関する。

本発明は更に、増殖性疾患（例えば肝炎、肝の発癌現象、発癌現象）の症状の診断や治療、及び創傷治癒の方法に関する。

更には、本発明は、Ｊ（ＧＦによる造血前駆細胞の増殖を刺激する方法に関する。

発明の背景肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は最初、ラット肝細胞の有糸分裂生起刺激能力に基づいてヒト及びウサギ血漿や、ラット血小板から精製された（Ｇｏｈｏｄａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、丁１ｖｅｓｔ。

８１、４１４（１９８８）；ｌａｒｎｅｇａｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９．３３１４（１９８９）；Ｎａｋａａ＋ｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　ＦＥ［ｌＳ　Ｌｅｔｔ、　２２４．３１１（１９８７））。従って、ＨＧＦは肝の部分切除又は肝臓損傷後の肝臓再生を促進する体液性因子として作用し得る（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、４、１７６（１９９０））。同じ因子をヒト線維芽細胞培養培地から精製したところ、メラニン細胞や、様々な上皮及び内皮細胞に作用することが判明した（Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．４１５（１９９０））。幾つかの器官テＩＩＧＦ発現の証拠（Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８８゜４１５（１９９０）；Ｔａ５ｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８７、３２００（１９９０）；Ｚａｒｎｅｇａｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８７．１２５２（１９９０）；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１６５．１２２９（１９８９））に加えて、前述の発見は、［（ＧＦが広範な細胞型の増殖のバラクリンメゾイエイタ−としても作用し得ることを指摘している。ＨＧＦの分子クローニングによって、プラスミノーゲン及び関連セリンプロテアーゼとの顕著な構造相同性が判明した（Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ。

ｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３４２，４４０（１９８９）；Ｍｉｙａｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

細胞でのタンパク質の急速なチロシンリン酸化を誘発するという最近の証拠は、チロシンキナーゼレセプターがそのマイトジェンシグナルを媒介し得ることを示唆している（Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕｓ＾８８．４１５（１９９０））。

ＨＧＦは、セリンプロテアーゼ群（例えばプラスミノーゲン、プロトロンビン、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲンアクチベーター）と構造的に関連する（Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ。

に、ＨＧＦは、以前に広域マイトジェンとして特性分析された、プラスミノーゲン様成長因子（ＰＬＧＦ）と呼ばれる変形＋（ＧＦを含んでいる。セリンプロテアーゼ群の要素を含む数種のプロテアーゼは、恐ら（はインシュリンレセプターのトリプシン消化活性化と同様のタンパク質分解機構を通じてＤＮＡ合成を刺激する（Ｓｈｏｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２６３、４８５２（１９８８））。今日までのところ、ウロキナーゼだけが、既知のチロシンキナーゼレセプターと何ら相同性のない特異的な細胞表面レセプターと結合することが判明した（Ｒｏｌｄａｎ　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ、　９．４６７（１９９０））。ＨＧＦがスキャター因子と非常に類似しているか又は同一であることが最近ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．７００１−７００５（１９９１））。スキャター因子は、上皮細胞を互いに解離させて、移動を開始させるものとして特性分析されている（Ｇｈｅｒａｒｄｉ。

ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．５８４４−５８４８（１９８９）観察は、ＩＩＧＦが、創傷治癒に必要な上皮細胞の成長や再生に機能し得ると示唆している。更には、適切な条件下では、１１ＧＦは造血細胞に対し刺激作用及び阻害作用を有し得る。

ＨＧＦのレセプターを同定する必要があることは明白である。本発明はこのようなレセプター（ｍｅｔがん原遺転子産物）、及びＨＧＦとｍｅｔがん原遺転子タンパク質とを含んでなる複合体を提供する。ｍｅｔがん原遺転子タンパク質は、チロノンキナーゼ成長因子レセプター群の一つである。

ｃＭｅｔ　ｌ１ｌＲＮＡが幾つかのマウス骨髄様前駆細胞腫瘍細胞系で検出され（Ｉｙｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｆｆｆ、　１．８７−９５（１，９９０））、ＩＩＧＦがこれらの細胞系で有糸分裂を促進し得るかどうかという問題が提起された。ＩＩＧＦがこのような一細胞系：　ＮＦＳ−６０の成長や阻害に及ぼす作用力（検査された。ＮＦＳ−６０細胞系は、ｉｌ　ｖｉｔｒｏ成長を維持するため；こＩＬ−３を必要とし、分化で阻止された未成熟造血前駆細胞の典型である（Ｈｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．　６６８７−６６９１（１９８５）；Ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｘｐ、　ｔｌｅｍａｔｏｌ、　１６．２５６−２６１（１９８８））。かなりのレベルのｍｅｔ　ｍＲＮ＾を発現することは以前（こ判明している（Ｉｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆ、　１．８７−９５（１９９０））。ＮＦＳ−６０細胞内への［３■］チミジンの取り込み（二対するＨＧＦの刺激能力を検査した。

これらの発見を以前に実証された肝細胞、上皮細胞、内皮細胞及びメラニン細胞へのＩＩＧＦの作用と兼ね合わせ、またスキャター因子とヒト成長因子との間には明ら力）１こ密接な関係があることを考慮すると、ＩＩＧＦは様々な組織１こ由来する再生可能細胞のための成長因子であることが証明される。肝臓再生及び骨髄様前駆細胞に対する）ＩＧＦの刺激能力は、肝細胞の増殖を誘発しくＫｕｍａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、　１８０、２３５−２４２（１９９０））、ＩＬ−３依存性コロニー形成の相乗因子として作用する（Ｉｋｅｂｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４．　９０３５−９０３９（１９８７）；Ｌｅａｒｙ、　ｅｔ　ａｌ、Ｂｌｏｏｄ　７１．　１７５９−１．７６３　（１，９８８）　）ことが判明しているＩＬ−６の作用と顕著に類似している。

ＨＧＦが係わるレセプター／配位子の関係が分かれば、これらの分子の発現が重要な役割を果たす増殖性疾患の研究や治療が容易になる。更には、ＩＩｅｔがん原遺転子しセプターー■ＧＦ複合体を同定すれば、因子結合の作用を受ける肝臓組織以外の組織を同定するための手段が得られる。

発明の要約肝細胞成長因子（ＨＧＦ）配位子とｍｅｔがん原遺転子タンノ（り質レセプターとを含んでなる複合体、及びこの複合体の使用方法を提供することが本発明の目的である。

造血前駆細胞の増殖の刺激方法を提供することが本発明の他の目的である。

造血前駆細胞の増殖の阻害方法を提供することが本発明の他の目的である。

ＨＧＦ、　ｍｅｔがん原遺転子レセプタータンパク質及びＨＧＦ−ｍｅｔがん原遺転子しセプタータンパク質複合体からなる群のいずれかを認識して、それと反応とする抗体を提供することが本発明の他の目的である。

図面及び以下の発明の説明によって、本発明の他の様々な目的や利点が明白となろう。

本発明は、ＨＧＦ　（配位子）又はｒａｅｔ／がん原遺転子産物（レセプター）の検出方法、及び配位子、レセプター又はこれらの両方を含んでなる複合体の単離方法に関する。本発明は更に、増殖性疾患の診断／治療方法に関する。本発明は更に、適切な条件下でのＨＧＦによる造血前駆細胞増殖の刺＃／阻害方法に関する。

図面の簡単な説明図１゜ＨＧＦに応答しての８５１５８９ヒト乳房上皮細胞中ｐ１４５のチロシンリン酸化。

パネル（ａ）。　未処理の対照細胞（レーン１　）　、　ＨＧＦ及びＥＧＦで処理した細胞に由来するホスホチロシルタンパク質のイムノプロット（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　。ＨＧＦはり、３７℃で１０分間成長因子（１１００ｎ／ｍｌ）に暴露し、水上にて洗剤で可溶化し、モノクローナル抗ｐＴｙｒで免疫沈殿させた（υｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。免疫沈殿したタンパク質を、７゜５％ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＯＳ−ＰＡＧＥ）で分離しくＬａｅａｍｌｉ　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０（１９７０））、別記の抗体と同じ抗体でイムノプロットした（Ｂｏｔｔａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５．１２７６７（１９９０））。

パネル（ｂ）。対照（レーン１）及びＩＩＧＦ処理した細胞に由来する３２ｐ標識リンタンパク質のオートラジオグラム。

以下の文献に記載されている方法（ｆｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｐａｒｔ＾：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ｃ，Ｒ，Ｋａｈｎ　ａｎｄ　Ｌ、　Ｈａｒｒｉｓｏｎ、　Ｅｄｓ、（Ｌｉｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ｇ）ｐｐ、　１２５−１４７）で、血清のない細胞を３２ｐ−オルトホスフェート（１，０ｍＣ１／ｍｌ）で代謝的に標識した。

指示通り、細胞をＩＩＧＦ　（１００ｎｇ／＋１）　テ３７℃ｔ、”ｃｉｏ分間処理し、水上にて洗剤で可溶化した。ホスホチロシルタンパク質を抗ｐＴｙｒで免疫沈殿させ、７，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。

パネル（Ｃ）。パネル（ｂ）のレーン２由来のｐ１４５のホスホアミノ数分析を以下の文献に記載されている方法（ｆｈｉｔｅｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｐａｒｔ＾：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　５ｔｕｒｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ｃ，Ｒ，Ｋａｈｎ　ａｎｄ　Ｌ。

Ｈａｒｒｉｓｏｎ、　Ｅｄｓ、　Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８８．　ｐｌ）、１２５−１４７）で実施した。点線円は、非標識ホスホセリン（ｐＳ）　、ホスホトレオニン（ｐＴ）及びホスオチロシン（ｐＹ）の移動を示す。

図２゜ｃ−ｍｅｔがん原遺転子産物のβ−サブユニットとしてのｐ１４５の同定パネル（ａ）。対照（レーン１）及びＩＩＧＦ処理したＢ５１５８９細胞由来の抗ｐＴｙｒ免疫沈殿物の抗ｃ−ｍｅｔイムノプロット。

図１のパネル（ａ）のところに記載した方法で免疫沈殿用試料（２ｍｇのタンパク質）を調製し、７，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｉｍｍｏｂｆｌｏｎ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜に移動させ、モノクローナル抗ｃ−ｍｅｔ及び［＋２５４］−プロティン−八で検出した。抗ｐＴｙｒで免疫沈殿し得るｃ−ＩＩｌｅｔタンパク質のパーセンテージを決定するために、２０ｈｇのＢ５１５８９細胞溶解物（ＬＹＳＡＴＥ）を５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離し、ｃ−ｎｅｔに対するモノクローナル抗体で直接５％５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した対照（レーン１．３）及びＩＩＧＦ処理Ｂ５１５８９細胞由来の３２ｐ標識リンタンパク質のオートラジオグラム。血清のない細胞を３２ｐ−オルトホスフェートで代謝的に標識し、未処理のまま（対照）か又はＨＧＦで処理し、図１のパネル（ｂ）に記載したように抗ｐＴｙｒで免疫沈殿させた。指示通り、電気泳動にかける前に試料を１０００１輩のβ−メルカプトエタノールで還元した。

図３゜ｃ−ｍｅｔタンパク質−チロリンキナーゼへの１２５標識ＨＧＦｐ２８の共有親和性架橋。

パネル（ａ）。ｃ−ｍｅｔタンパク質の細胞質ドメインに対するモノクローナル抗体を用いて、Ｍ４２６ヒト肺線維芽細胞及びＢ５１５８９細胞から溶解物（２００ｇｇのタンパク質）のイムノプロットを製造した。

パネル（ｂ）。非還元条件（ＮＲ）及び還元条件（Ｒ）下で６゜５％５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離したＭ４２６及びＢ５１５８９細胞へのＩ２５標識１１ＧＦｐ２８の架橋。記載する方法でＩ（ＧＦｐ２８を精製し、クロラミン−Ｔ法（Ｈｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　１９４．４９５（１９６２））によって［１２５１コーＮａテ放射標識した。細胞を＋　２５１標識ＨＧＦｐ２８　（５Ｘ　ＩＱ３ｃｐｍ）を含むＨＥＰＥＳ結合緩衝液（Ｂｏｔｔａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５．１２７６７（１９９０））を用いて２５℃で４５分間インキュベートし、冷たいＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４）で洗浄し、ジスクシンイミジルスベレートで処理した（Ｂａｔｔａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．１２７６７（１９９０））。

次いで、細胞をＳＤＳで可溶化し、指示通り１００ｍＭのβ−メルカプトエタノールの存在下で３分間沸騰させた。＋２ｓＩ標識タンパク質を６．５％５ＤＳ− ＰＡＧＥで分離し、−７０℃でオートラジオグラフィ−処理した。

パネル（ｃ）。ｃ−ｓｅｔペプチド抗血清を含むＢ５１５８９細胞由来の［＋　 ”Ｉ］−）ＩＧＦｐ２８架橋複合体の免疫沈殿（Ｇｏｚａｔｔｉ−Ｈａｃｅｓｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８５．２１（１９８８乃。免疫沈殿の前に、前述した方法で試料を製造して、架橋させると、還元条件下で左側レーン（ＬＹＳＡＴＥ）に示す電気泳動パターンが得られた。隣接レーンは、競合ペプチド（Ｉｈｇ／ｍｌ）の不在下（ａ−ＮＥＴ）又は存在下（＋ｃＯＭＰ）での、ｃ−ｍｅｔペプチド抗血清（１：１００）を含む架橋種の免疫沈殿を示す。

免疫沈殿したタンパク質を、固定したプロティン−〇　（Ｇｅｎｅｘ）に吸収させ、前述した如き電気泳動及びオートラジオグラフィーの前にＳＯＳで溶離した。

図４゜ＮＦＳ−６０細胞の［３１月チミジン取り込み。

パネル（Δ）。細胞（３Ｘ　１０６）を１００μｍの培地に平板培養した。指示通りに、第１のウェルには２０Ｕ　ＩＬ−３（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を加え、以下のウェルではＩＬ−３の量を減らした。４８時間後、ウェル１個当たり１μＣｉの［３月チミジンを加えた。細胞を更に７時間インキュベートし、次いでフィルター上で採取し、処理してシンチレーションカウンティングした。図示する点は２個のウェルの平均である。

パネル（Ｂ）。下側の曲線は、ＨＧＦだけを加えた場合の［３■］チミジン取り込み量を示す。第１のウェルは希釈度がに２０００のＩＩＧＦを受け取り、以後は図示するように希釈度を変えた。上側曲線は、ＩＬ−３と組み合わせて加えたときのＨＧＦの作用を示す。ウェル毎に２．５Ｕ　ＩＬ−３を加えた。ＩＩＧＦのレベルは前述した通りであった。

図５゜ＮＦＳ−５８骨髄様白血病系、未分別骨髄及びｆｉｎ骨髄由来のＲＮＡのノーザンプロット。１０ｊｇの総ＲＮ＾を１．２％ホルムアルデヒド−アガロースゲル上に泳動させ、ｄｕｒａｌｏｓｅ−ｕＶに移動させ、マウスｓｅｔの全コード領域を含む制限断片でブロービングした。膜を（５ｘ　５ＳＰＥ、５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、５０％ホルムアミド、０．１％　ＳＤＳ、　１０ｈｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）で４時間プレハイブリダイズし、次いでランダムブライミングで標識したプローブを含む前記溶液中でハイブリダイズした。

膜を（２Ｘ　ＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）中で２度、それぞれ１０分間室温で洗浄し、次いで（０，２％ＳＳＣ，０，１％５Ｏ３）中で２度、それぞれ１０分間５３℃で洗浄した。膜を一７０℃で増感紙を含むＸ−ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムに暴露した。

図６゜寒天での骨髄細胞のコロニー形成。（Ａ）ＲＧＦをＧＭ−ＣＳＦと一緒に加えた。（Ｂ）ＩＩＧＦをＩＬ−３と一緒に加えた。

５ｔａｎｌｅｙ等の方法（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　７９＋６５７−６６８（１９７２））を変形させたものを用いて、ｌｉｎ細胞のコロニー形成を測定した。ｌｉｎ骨髄細胞を１ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０．１０％ＦＣＳ及び０．３％５ｅａｐｌａｑｕｅアガロース（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）に懸濁させ、５％ＣＯ□下、３５ｍｍのＬｕｘペトリ皿（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）にて３７℃でインキュベートし、コロニー成長を採水発明は一般に、ＨＧＦとそのレセプターであるｍｅｔがん原遺転子タンパク質とを含んでなる複合体に関する。ＨＧＦとレセプターとの結合は、レセプターの内在性チロシンキナーゼ活性を調節する。従って、本発明は更に、複合体の使用方法に関する。

本発明の一実施態様は、ＨＧＦとｍｅｔがん原遺転子タンパク質との相互作用で形成される複合体に関する。好ましい実施態様では、複合体は、天然では結合しているタンパク質を含まない。

ＨＧＦとｃ−ｓｅｔレセプターチロシンキナーゼとの直接相互作用は、インシュリン、ＥＧＦ及び他のペプチド成長因子のものと類似するマイトジエンングナルトランスダクションの生化学機構を示唆している。この相互作用は、ＨＧＦの構造的に関連するセリンプロテアーゼ同族体群との重要な機能的相違を示している。ＩＩＧＦはセリンプロテアーゼ群と同種であるが、ＨＧＦをプロテアーゼとして機能させ得るに必要なアミノ酸を含まない。ＨＧＦはプロテアーゼとしては機能し得す、チロシンキナーゼに結合するので、シグナルトランスダクションの方法は、セリンプロテアーゼ群の他の要素とは異なっていなければならない。　本発明は更に、１１６Ｆ　（配位子）　、ｍｅｔがん原遺転子産物（レセプター）又は配位子−レセプター複合体の同定のために診断で使用することができる検出定量方法に関する。ｌ１ｅｔがん原遺転子レセプターは多くの細胞株及び組織（例えば肝臓）で発現されるので、本明細書に記載する方法は、■ＧＦ結合の作用を受ける肝臓以外の組織を同定する手段を提供する。本発明の方法は更に、広域組織の生化学機構及び生理機構の調節におけるレセプターと配位子との相互作用の役割を理解するのに役立つ。

ＩＪＧＦ−レセプター複合体又はその単なる一部分に対する抗体を、天然形態及び組換え形態の両方で産生することができる。本発明は、この複合体に特異的な抗体に関する。

ＨＧＦ−レセプター複合体又はその反応性断片を他の材料、特にポリペプチド（例えば免疫原として使用すべき融合又は共有結合ポリペプチド）に結合することができる。ＨＧＦ−レセプター複合体及びその機能的断片を、様々な免疫原（例えばキーホールリンベットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド等）に融合又は共有結合することができる。ポリクローナル抗血清の製造方法の記載にツイテは例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｆｌｏｅｂｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉ。

ｎ　（ｌｌａｒｐｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ、　１９６９）、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ、　５ｐｅｃｆｆｉｃｉｔｙ　ｏｆＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（Ｄｏｖｅｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｉｏｎｓ、　Ｎｅｗ＋　Ｙｏｒｋ。

１９６２）及びｆｉｌｌｉａａｓ　ｅｔ　ａ１８Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、　１（＾ｃａｄｅｍｆｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６７）を参照のこと。典型的な方法は、動物を抗原で高度免疫処置することからなる。次いで、免疫処置を反復した直後に動物血液を採取し、γグロブリンを単離する。

場合によっては、様々な哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を産生ずることが望ましい。このようなモノクローナル抗体の産生技術の記載は、５ｔｉｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｉｔｏｒｓ。

Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　（Ｌａｎｇｅ　１ｌｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｊｏｎｓ、　Ｌｏｓ＾１ｔｏｓ、　Ｃ＾、　Ｆｏｕｒｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）や本明細書で引用した参考文献、特にモノクローナル抗体の産生方法を記載するＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）に見ることができる。

本発明は更に、標識ＨＧＦをプローブとして用いて、生物試料中のＨＧＦレセプターを検出定量する方法に関する。適切な標識には例えば、放射標識（例えば＋２６１）及びフルオレセインが含まれる。

従来技術でよく知られた標準的な手法を用いて、生物試料を非イオン性洗剤で抽出し、非標識ＨＧＦの存在下又は不在下で標識）ＩＧＦと共にインキュベートすることができる。

例えば、ｍｅｔがん原遺転子レセプタータンパク質又はＨＧＦ−ｍｅｔがん原遺転子レセプター複合体を認識する特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体で複合体を免疫沈殿させることによって、得られた複合体を、複合体を形成していない（又は結合していない）標識材料がら分離することができる。得られた複合体に結合した標識の存在によって得られる全シグナルを、当業界でよく知られているようなバックグラウンドブランク試料がらのシグナルと比較する。あるいは、ポリエチレングリコールで沈殿させることによって、複合体を複合体を形成していない材料から分離してもよい。いずれの手法でも、免疫沈殿又は沈殿する標識の量は直接、生物試料中の複合体の量に関係する。　本発明は更に、標識ＨＧＦレセプターをプローブとして用いて生物試料中のＨＧＦを検出定量する方法に関する。本方法は、前述の手法に従って相互（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）結合アッセイとして実施する。但し、ＩＩＧＦ又はＩＩＧＦ−ｍｅｔがん原遺転子レセプター複合体を特異的に認識するものを抗体として置換する。

本発明は更に、試料中のＨＧＦ−ａｂｅｔがん原遺転子レセプター複合体を検出定量する方法に関する。好ましい実施態様では、抗体を用いて複合体を検出定量する。この実施態様で用いる抗体は、ＨＧＦ、　ｍｅｔ−がん原遺転子レセプタータンパク質又はＩＩＧＦ−レセプター複合体に対するものであり得る。抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。試料を非イオン性洗剤で抽出し、標識した１１ＧＦ又はｍｅｔがん原遺転子レセプタータンパク質と共にインキュベートすることができる。インキュベーション後に、試料を三官能試薬（例えばジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）のような化学架橋剤）で共有架橋させることができる。反応停止剤で反応を停止させた後に、試料を特異抗体で免疫沈殿させるか又はポリエチレングリコールで沈殿させることができる。定量には、例えばゲル電気泳動によるクロマトグラフィーの分離及びそれに続くオートラジオグラフィーが必要である。

他の実施態様では、本発明は、試料中のＩＩＧＦ−ｍｅｔがん原遺転子レセプター複合体の検出方法に関し、ＩＩＧＦとｍｅｔがん原遺転子レセプターｍＲＮＡとの同時発現を測定する。ＨＧＦと謳ｅｔがん原遺転子レセプターとの同時発現は、＋＊ＲＮ＾同定のためいずれか一方の遺伝子の配列に由来するオリゴ若しくはｃＤＮ＾プローブを用いるノーザン分析か、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いるか又はこれらを任意に組み合わせた当業者に公知の方法で測定することができる。ノーザン分析及びＰＣＢ技術は、当業者にはよく知られた方法である。

本発明は更に、前述の方法を用いた診断手法に関する。

本発明の方法によって検出される疾患には例えば、増殖性疾患（例えば肝細胞癌又はｍｅｔがん原遺転子レセプターを正常に発現する組織の他の癌）が含まれ得る。このような組織は、上皮細胞（例えば皮膚、肺、冑、腎臓若しくは結腸、肝臓）、内皮細胞（例えば血管内壁若しくは骨髄に含まれる細胞）、又は造血幹細胞に由来し得る。本発明の診断方法を使用して、前述した細胞に由来する組織及びＨＧＦを正常に発現する細胞［例えば血小板、線維芽細胞（皮膚及び他の器官の基質組織）及び膵臓］での創傷治癒を測定することもできる。

ＨＧＦ−ｓｅｔマイトジェン経路の不活性化は、正常細胞又は病的細胞の増殖を抑制又は停止させるように考案された治療法の基礎を提供する。これらの手法は、損傷（ｉｍｐａｉｒｅｄ）諷ｅｔ結合ドメインが欠如しているか若しくはこれを有する、又は損傷活性ドメインが欠如しているか若しくはこれを有するが、他の方法で）ＩＧＦの構造的及び生化学的特性を保持する化学的又は遺伝学的に作製されたＩＩＧＦ由来種の産生を含んでいる。このような化学的又は遺伝学的産生技術は当業者にはよ（知られている。同様に、損傷１１ＧＦ結合ドメインが欠如しているか若しくはこれを有する、又は損傷チロシンキナーゼドメインが欠如しているか若しくはこれを有するが、他の方法でｍｅｔタンパク質の構造的及び生化学的特性を保持する遺伝学的に産生されたｍｅｔ種の産生も含まれる。

これらの手法は更に、ＩＩＧＦによる正常ｍｅｔタンパク質活性化のアンタゴニストとして作用し得る細胞外１１ＧＦ結合ドメインからなる水溶性形態のｍｅｔタンパク質を産生することを包含する。前述した化学的又は遺伝学的に産生されたＨＧＦ又はｍｅｔタンパク質種の、選択された作用部位への供給は、従来のドラッグデリバリ−１遺伝子伝達又はこれらを任意に組み合わせた当業者に公知の方法を用いて実施され得る。

ＨＧＦ　−ｍｅｔマイトジェン経路の人工的活性化は、天然の創傷治癒機構を回復、置換又は強化するように考案された治療法の基準となる。これらの方法は、ｍｅｔタンパク質とＨＧＦとの結合相互作用を高める化学的若しくは遺伝学的に産生若しくは誘導されたＨＧＦ若しくはｍｅｔ種の創傷部位に適用して、人工的に維持されたＩＩＧＦ−■ｅｔ相互作用を起こすことからなる。例えば、ｍｅｔのＨＧＦ結合ドメイン若しくはＩＩＧＦのｍｅｔ結合ドメイン（又は両方）の部位特異的突然変異誘発を使用して、ＨＧＦ／ＩＩＩｅｔ対の一方の要素が対の他方の要素に対してより高い結合親和性を有するようにして、損傷組織の成長又は再生の加速に作用してもよい。

同様に、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して、ＨＧＦ結合（構造的に活性化したチロリンキナーゼを有するｍｅｔ突然変異を含む）によって正常に調節されたｍｅｔタンパク質のキナーゼ活性を高めるか又は維持することができる。前述した遺伝学的に産生されたＨＧＦ又はｍｅｔタンパク質種の、選択された作用部位への供給は、従来のドラ・ノグデＩＪ　／＜　ＩＪ−１遺伝子伝達又はこれらを任意に組み合わせｔこ当業者によく知られた方法を用いて実施され得る。体外から投与したＨＧＦと組み合わせて、組換えＤＮＡ技術又は化学誘導体化でｍｅｔの天然発現を補ってＨＧＦ−ｍｅｔマイトジェン経路を活性イヒすることも含まれる。　更には、幾つかのリンホカイン−１ノンホカインレセプター対が造血を調節することカベ分力）つｔこ。

本発明で発見した）ＩＧＦ及びｍｅｔがん原遺転子産物が造血１こ果たす役割によって、以前は知られていなかった造血調節の局面が分かる。ＨＧＦは、単独でも、他のリンホカインと組み合わせても造血を刺激又は阻害するのに有用であり得る。

ｍｃｔ発現は骨髄様性白血病系で実証され、ＨＧＦｌｔ　ｍｅｔタンパク質の配位子であることが判明した。本発明（よ、ＨＧＦ力犬造血調節機能を果たすことを実証してＬＸる。本発明力（骨髄再生を刺激するか、白血病を治療するか又は感染（こ対する免疫応答を刺激する方法を提供することを当業者１ま理解している。

本発明のこの局面の一実施態様では、このような治療方法は、ＨＧＦ、　１（ＧＦ−レセプター複合体又はｍｅｔタン、（り質レセプターを単独で又はストレス抗原と組み合わせたものを含み得る。選択した抗原は、薬理学的に許容できるビヒクルで哺乳動物に送達され得る。当業者には自明の如く、ＩＩＧＦ、　ＩＩＧＦ−レセプター又はｍｅｔタンパク質レセプター全体をそっくりそのまま使用する必要はない。これらのタンパク質の免疫原部分を使用することができる。当業者には自明の如く、本発明のこのようなワクチン、即ち治療薬は免疫応答を高めることが知られている有効量の免疫アジュバントを含み得る。１種以上の抗原タンパク質に対する免疫応答を誘発して、造血系又は免疫系の望ましい刺激又は抑制を起こすのに十分な量のタンパク質又はポリペプチドが治療配合物中に存在する。抗原は様々な方法で投与することができ、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムに吸収させるか、炭水化物又は担体タンパク質に結合するか、アジュバント（例えばマラムイルペプチド）又はこの分野で承認されている他の薬剤と一緒に投与するか、他の供給系（例えば中心体又はリポゾーム）で配合するか又はリビングベクター系で投与する。

以下の非制限的な実施例で本発明を更に詳しく説明する。

ＨＧＦに応答しての上皮細胞中ｐ１４５のチロシンリン酸化ヒト乳房上皮細胞系Ｂ５１５８９は、ＥＧＦのマイトジェン作用９細胞を（約１１００ｎ／ｍｌの）　ＨＧＦで３７℃で１０分間処理し、氷上で可溶化した。ホスホチロシンに対する抗体（抗ｐＴｙｒ）　Ｃ免疫沈殿させて、ホスホチロシルタンパク質を細胞溶解物から単離した。これらのタンパク質をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、同一抗体でイムノプロットした。この方法では、未処理の細胞中で数種のホスホチロシルタンパク質を検出した（図１、パネル（ａ））。未処理の細胞をＨＧＦで処理すると、１４５−ｋＤタンパク質（ｐ１４５）のリン酸化が誘導された（図１、パネルａ、中央レーン）。表皮性成長因子（ＥＧＦ）に暴露したＢ５１５８９細胞は、ｐ１４５ではなく　、ＥＧＦレセプターのチロシンリン酸化を示した（図１、パネルａ、右側レーン）。３２ｐ −オルトホスフェートで標識したＩＩＧＦ処理細胞及び対照由来の溶解物を使用して、抗ｐＴｙｒで免疫沈殿させると、ＨＧＦ処理細胞で特異的にｐ１４５のリン酸化が検出された（図１、パネル（ｂ））。３２ｐ−標識ｐ１４５をホスホアミノ酸分析するとホスホチロシンの存在が確認され、またホスホセリンが存在することも判明した（図１、パネル（Ｃ））。ＨＧＦの刺激を受けたｐ１４５のチロシン上でのリン酸化及びその見掛は分子量は、ｐ１４５がＩＩＧＦに対するレセプターチロシンキナーゼを示すという可能性と適合していた。

実施例■ ｃ−ｍｅｔがん原遺転子産物のβサブユニットとしてのｐ１４５の肌寒未だ既知の配位子がないレセプター様分子が多数発表されている。これらの分子の一つはｃ−＋ｇｅｔがん原遺転子産物であり、これは、５Ｏ−ｋＤ　（α）及び１４５−ｋＤ　（β）のジスルフィド結合サブユニットからなるレセプター様チロシンキナーゼである（Ｔｅｍｐｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｒ、　］、　Ｃａｎｃｅｒ　５８．３（１９８８）；Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　４，１３８３（１９８９））。完全に処理されたｃ−ａ＋ｅｔ産物では、αサブユニットは細胞外であり、βサブユニットは細胞外ドメイン、トランスメンブランドメイン、チロシンキナーゼドメイン、及びチロシンリン酸化部位を有する（Ｇｉｏｒｄａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　４．１３８３（１９８９）；Ｇｏｎｚａｔｔｉ−８ａｃｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＩＳ＾８５゜２１、（１９８８））。

ｐ１４５がｃ−ｓｅｔタンパク質のβサブユニットを示し得るという仮定を検証するために、対照及びＨＧＦ処理したＢ５１５８９細胞から抗ｐＴｙｒで免疫沈殿させたタンパク質を、ｃ−ｍｅｔ産物の細胞質ドメインに対するモノクローナル抗体と共にイムノプロットした。とりわけ、組換えヒトｃ−ｍｅｔタンパク質細胞質ドメインに対して産生されたマウスモノクローナルＩｇＧを使用した。ヒトｃ−ｍｅｔタンパク質の免疫沈殿又はイムノブロッティングによる認識は、組換えタンパク質断片の存在下でインキュベートすることによって特異的に阻害され得る。

重要な１４５−ｋＤタンパク質がＩＩＧＦ処理した細胞で特異的に観察された（図２、パネル（ａ））ことは、このマイトジェンがチロシン残基上でのｃ１ｅｔタンパク質のリン酸化を誘発する直接的な証拠となった。同様に処理した細胞から製造した溶解物全てをｃ−ｍｅｔ抗体で直接ブロッティングすると、ＨＧＦに応答してチロシン上でリン酸化したｃ−ｍｅｔタンノくり質のパーセンテージを定量することができた（図２、パネル（ａ））。細胞性ｃ−ｍｅｔタンパク質総量の少なくとも１０％がＨＧＦ刺激後に抗ｐＴｙｒによって免疫沈殿したと推定される。抗ｐＴｙｒによる１分以内の免疫沈殿でｃ−ｎｅｔタンパク質を回収することができ、またこの作用が少なくとも３時間持続することがＨＧＦ作用の時間経過分析で判明した。還元条件下及び非還元条件下でのｐ１４５の電気泳動移動度を比較して、ｐ１４５がｃ−ｍｅｔタンパク質のβサブユニットであることを確認した（図２、パネル（ｂ））。

還元しなければ、ｃ１ｅｔタンパク質の５Ｏ−ｋＤαサブユニットはβサブユニットにジスルフィド結合したままであり、２１（１９８ｇ））。

同様に、ＩＩＧＦで処理した！２ｐ標識Ｂ５１５８９細胞から免疫沈殿したｐ１４５は、還元又は非還元電気泳動条件下でｃ−＋＋ｅｔがん原遺転子産物の移動特性のシフトを示した（図２、パネル（ｂ））。これらの結果からｐ１４５がｃ −ｍｅｔタンパク質のβサブユニットとして同定され、またＨＧＦがチロシン残基上でのリン酸化を刺激することが確定した。

１２５ｒ−■ＧＦｐ２８はｃ１ｅｔタンパク質−チロジンキナーゼに物理的に結合する。

１１ＧＦに応答してのｃ−ｖｅｔタンパク質のチロシンリン酸化の速度及び範囲は、ｃ−ｗｅｔタンパク質がＨＧＦに対する細胞表面レセプターである可能性を裏付けた。しかしながら、レセプターたるキナーゼが他のレセプターをリン酸化し得る証拠がある（Ｓｔｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ、　７．９９５（１９８８）；Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　７．１６４７（１９８ｇ））。従って、ｃ−ｓｅｔ産物をＩ（ＧＦレセプターとして明確に同定するには、直接的な相互作用を実証する必要がある。！２５１＄９識ＨＧＦは、一本鎖とへテロダイマー標識種との混合物からなるため、共有親和性架橋には不適切である。同様の結合特性を有するより小さな形態のＢＧＦ　（■ＧＦ９２８）を、単一実体として＋２５Ｉ標識し、ＩＩＧＦレセプターの特性分析で使用した。

以下に示すクロラミン−Ｔ方法によってＨＧＦｐ２ｇを［１２５Ｉ］Ｎａで標識した＋　＋ＩＧＦｐ２８　（１，ＯＭ　ＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７゜４）５０μｌ中に３１１ｇ）をクロラミン−Ｔ　Ｃ４ａｌのリン酸塩緩衝液中に１．２１１ｇ）及び［１２５Ｉ］　Ｎａ　（１４Ｃｉ）と２４℃で１分間反応させた。メタ重亜硫酸ナトリウム（８１１のリン酸塩緩衝液中に１０μ ｇ）を加えて反応を停止させた。０．１％ウシ血清アルブミン（２００μｌ）を含むリン酸塩緩衝液で混合物を希釈し、０．１％ＢＳＡを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で平衡化したヘパリン−セファ０−スＣＬ−６Ｂカラム（充填容量３００μｍ）に通した。カラムを３０ｍ１のＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、１．ＯＭ　ＮａＣ１（２００ｘ１画分）を含むＰＢＳ／ＢＳＡ’ｔ’　溶離して、カラムからトリクロロ酢酸沈殿可能放射活性９８％を除去した。ピーク画分（比活性：１５０〜２５ｈＣｉ＃ｇ）　４９９％トリクロロ酢酸沈殿可能であり、５Ｏ３−ＰＡＧＥ上では単一バンドとして移動した。

Ｂ５１５８９細胞及び検出可能な量のｃ−ｓｅｔタンパク質が同様に欠如しているＨＧＦ非感受性細胞系のＭ４２６ヒト線維芽細胞上で１５１標識ＨＧＦ　９２ｇを用いて比較架橋研究を実施した（図３、パネル（ａ））。Ｂ５１５８９細胞上でレセプターと架橋した＋２５１標識ＨＧＦ９２ｇは、非還元条件下で２１０ −ｋＤタンパク質複合体として移動した（図３、パネル（ｂ））。還元条件下では、主要１７０−ｋＤ複合体が観察された（図３、パネル（ｂ））。これらの見掛は分子寸法は、ｃ−ｗｅｔタンパク質の１４５−ｋＤのβサブユニットと標識ＨＧＦｐ２８との直接的な相互作用と合致していた。還元条件下では、１９０− ｋＤと約３００−ｋＤの２つの些少バンドも検出された（図３、パネル（ｂ））。

還元条件下で観察された種への＋　２５１標識＋１ＧＦｐ２８の架橋は、非標識ＨＧ　Ｆ　ｐ　２８又はＩＩＧＦ中和抗血清の添加によって阻止された。同一条件下で、１２５■標識＋１ＧＦｐ２８はＭ４２６細胞中の任意の大型タンパク質に架橋し損なった（図３、パネルｂ）。

１２５■標識ＨＧＦｐ２８がｃ−ｍｅｔタンパク質に物理的に結合することを確定するために、＋　２５Ｉ標識１１ＧＦｐ２８架橋複合体を、ｃ−＋ａｅｔタンパク質のβサブユニットのカルボキシル末端２８アミノ酸に特異的なポリクローナル抗血清（に□ｎｚａｉｔｉ−１１ａｃｅｓｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．２１（１９８８））で免疫沈殿させた。還元条件下で検出した、共有架橋した主要１７０−ｋＤ種及び些少３００−ｋＤ種を抗体で免疫沈殿させ、ペプチドを競合させて、これらの種の検出を特異的に阻止した（図３、パネル（Ｃ））。これらの結果は、１２５■標識！１ＧＦｐ２８とｃ−ｗｅｔのβサブユニットとの間に直接的な分子相互作用があることを実証している。些少３００−ｋＤ架橋種の組成を決定すべきである。これらの発見は全て、ｃ−ｓｅｔ産物がＩＩＧＦに対する細胞表面レセプターであることを確定している。

先に説明し、ここでも比較のために繰り返して言うが、ＩＬ−３は、用量依存的にＮＦＳ−６０細胞内への［３旧チミジン取り込みを刺激した（図４、パネル（Ａ））。組換えＨＧＦを加えるだけでは、［３Ｈ］チミジンの取り込みはほとんど又は全く刺激を受けなかった（図４、パネル（Ｂ））。）ＩＧＦがＩＬ−３と相乗的に作用し得るかどうかを決定するために、所与の最適以下濃度のＩＬ−３（２，５Ｌｌ）で［３Ｈ］チミジン取り込みに対する１ｉＧＦの作用を調べた（図４、パネル（Ｂ））。ＢＧＦを２．５υのＩＬ−３と一緒に加えると、［３＋１］チミジンの取り込みが促進されて、３倍に増した。約５Ｏｎｇｏ）ＨＧＦを加えると、［３Ｈ］チミジンの取り込みが半最大レベルに達した。

１１６Ｆは更にＩＬ−３と相乗作用を示して、他のＩＬ−３依存性骨髄様細胞系Ｄａ−１の成長を促進した。

ＮＦＳ−６０系は、分化で停止される骨髄様前駆細胞を示す。

ｍｅｔの発現を前駆細胞を増したが又は未分別のマウス骨髄細胞で調べた。分化した細胞上に存在する抗原に特異的な抗体及び磁気ビーズを用いて、全骨髄細胞から分化細胞を除去して前駆細胞が増した母集団を作製し、血統陰性（ｌｉ６− ６０２（１９９０））。ＲＮＡｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを作製した。各ＲＮＡ　ｌｈｇをホルムアルデヒド−アガロースゲル上に泳動させた。ｇｉｅｔを発現するーマウス骨髄様前駆細胞系（ＮＦＳ−５８）を比較のため使用しく図５、左側レーン）、３つの異なるｃ−ｍｅｔ　ｍＲＮＡを示した（図５）。幾つかの細胞系及び組織では予め、多数のマウスｍｅｔ■Ｉ？Ｎ＾種が検出され（Ｉｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

互にスプライシングしたＷＲＮＡが記載されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１１．２９６２−２９７０（１９９１））、未分別の骨髄及び１ｉｎ−骨髄は共に単一のｍｅｔ　ＷＲＮＡを示し、骨髄細胞で初めてａｂｅｔ発現が実証された。

実施例■ 軟質寒天におけるＦＩＧＦの骨髄細胞への作用骨髄細胞でのａｂｅｔがん原遺転子の発現に関して、軟質寒天コロニーアブセイで、１（ＧＦがこれらの細胞の成長に及ぼす作用を調べた。前駆細胞系で得られた結果と同様に、ＨＧＦを１ｆｎ −細胞に加えても、コロニーは形成されなかった。

しかしながら、ＨＧＦを最適以下量のＩＬ−３に加えると、コロニー形成が５０％増した（図６）。同様の成長条件下で最適以下レベルのＧＭＣＳＦを用いると、ｎＧＦは同様に相乗作用を示し、コロニー形成は６０％はど増した。いずれの場合も、得られたコロニーは、ＩＬ−３だけで得られる場合と同様の割合でマクロファージ及び顆粒球を含んでおり、このことはＨＧＦが分化パターンを変えないことを示していた。マウススキャター因子を用いて同一の刺激パターンを観察した。

従って、１ｉｎ−骨髄細胞で得られた結果は、ＮＦＳ−６０系で得られた結果と合致し、ＨＧＦがＣＳＦと相乗作用して、骨髄様前駆細胞の増殖を刺激することを示している。

前述した全ての刊行物の全内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。

前記発明では簡潔明瞭にするためある実施態様を説明したが、本明細書を読めば、本発明及び添付のクレームの範囲を逸脱することな〈実施態様に様々な変更を加えることができることが当業者には自明であろう。

補正口の写しく翻訳文）提出書（特許法第１１１４条の８）平成６年８月５日１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１００８２４２、発明の名称　肝成長因子レセプター３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国、メリーランド・２０８９２、ベセスダ、ボックス・オー・ティー・ティー、オフィス・オブ・テクノロジー・トランスファー、ナショナル・インステイテユーツ拳オブ・ヘルス名　称　アメリカ合衆国４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正口の提出年月日　１９９４年１月２１日別紙：３４条補正１、哺乳動物を造血前駆細胞の刺激に有効な量の医薬品で治療する哺乳動物の造血前駆細胞の刺激方法で使用する医薬品の製造における、肝細胞成長因子とＩ　Ｌ−３及びＧＭ−ＣＳＦからなる群の中から選択される少なくとも１種の他の成長因子との使用。

２、白血病患者を医薬的に有効な量の医薬品で治療する白血病の治療方法で使用する医薬品の製造における肝細胞成長因子の使用。

３、前記肝細胞成長因子を、ＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ３Ｆからなる群の中から選択される少なくとも１種の他の成長因子と共に前記医薬品で使用する請求項２に記載の肝細胞成長因子の使用。

４、免疫応答の刺激を必要とする患者を免疫応答を刺激する量の医薬品で治療する刺激を必要とする患者の免疫応答の刺激方法で使用する医薬品の製造における、肝細胞成長因子とＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ５Ｆからなる群の中から選択される少なくとも１種の他の成長因子との使用。

５、＠乳動物を造血前駆細胞の成長を阻害する量の医薬品で治療する哺乳動物の造血前駆細胞の成長阻害方法で使用する医薬品の製造における、肝細胞成長因子アンタゴニストの使用。

６、免疫応答の阻害を必要とする患者を免疫応答を阻害する量の医薬品で治療する患者の免疫応答の阻害方法で使用する医薬品の製造における、肝細胞成長因子アンタゴニストの使用。

国際調査報告ＡＮ）−Ｉ　ＡＮＧ　４　ＮｈＪＥ：Ｘ　ＡＰＪＩＮＥ：ＸＥフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰＩＡ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＡ（７２）発明者　パンダ・ウーダ、ジョージ・エフアメリカ合衆国、バージニア・２２６１１、ベリービル、ボックス・２９０５、ルート・１（番地なし）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＧＦ、ｍｅｔタンパク質レセプター及びＨＧＦ−ｍｅｔタンパク質レセプター複合体からなる群の中から選択したタンパク質を哺乳動物に投与することからなる骨髄再生の刺激方法。
２．ＨＧＦ、ｍｅｔタンパク質レセプター及びＨＧＦ−ｍｅｔタンパク質レセプター複合体からなる群の中から選択したタンパク質を哺乳動物に投与することからなる白血病の治療方法。
３．ＨＧＦ、ｍｅｔタンパク質レセプター及びＨＧＦ−ｍｅｔタンパク質レセプター複合体からなるタンパク質を前記哺乳動物に投与することからなる哺乳動物の免疫応答の刺激方法。
４．ＨＧＦ配位子とｍｅｔがん原遺伝子レセプタータンパク質とを含んでなる複合体に特異的な抗体。
５．前記応答を作用させるのに十分な量の請求項４に記載の抗体と医薬的に許容できる担体とを含んでなる、骨髄再生の誘発、白血病治療又は感染に対する免疫応答刺激のために使用するのに適した組成物。
６．ＨＧＦ、ｍｅｔタンパク質レセプター及びＨＧＦ−ｍｅｔタンパク質レセプター複合体からなる群の中から選択したタンパク質を哺乳動物に投与することからなる骨髄再生の阻害方法。
７．ＨＧＦ、ｍｅｔタンパク質レセプター及びＨＧＦ−ｍｅｔタンパク質レセプター複合体からなるタンパク質を前記哺乳動物に投与することからなる哺乳動物の免疫応答の阻害方法。