JPH07505535A

JPH07505535A - カンピロバクタージュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列

Info

Publication number: JPH07505535A
Application number: JP6516767A
Authority: JP
Inventors: ゲスドン，ジャン−ルュク; ストネ，ヴェロニク
Original assignee: アンスティチュ　パストゥール
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-31
Publication date: 1995-06-22
Anticipated expiration: 2018-12-10
Also published as: CA2132985A1; EP0636187A1; FR2701028A1; WO1994017205A1; DE69425708T2; ES2150981T3; FR2701028B1; ATE195974T1; DK0636187T3; EP0636187B1; JP3476821B2; DE69425708D1; CA2132985C; US5691138A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】カンピロバクタ−シュシュ＝　（Ｃａｍｐｙｌ’ｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）のゲノムの核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列本発明はカンピロバクタージュジュニ（以下ＣａｍρｙｌｏｂａｃｔｅｒＪｅＪ υ旧またはＣ，ｊｅｊｕ旧と表記する）に特異的な核酸の塩基配列と、この塩基配列を用いて生物サンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕ旧のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させるためのヌクレオチドブライマーとしてのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧の配列またはその断片を検出するだめの特異的ヌクレオチドプローブとしての応用とに関するものである。

カンピロバクタ−感染症は世界中で人および野性動物または家畜の両方に広く拡がっている感染症である。

現在カンピロバクタ−（Ｃａｍｐｙ　１ｏｂａｃｔｅｒ）と呼ばれるこのバクテリアは２０世紀初頭には発見されていたが、同定および培養が困難であったため長い間無視されてきた。最初に羊および牛から弔離された当時はＶｉｂｒｉｏ　ｆｅｔｕｓと呼ばれ、Ｃａｍｐｙ　Ｉｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓと呼ばれるようになったのは後である。人間で最初のカンピロバクタ−症例が報告されはじめたのは１９４６年のことであるが、カンピロバクタ−感染症の重大さが実証され、認識されるようになったのはカンピロバクタ−用の選択的培地が開発され始めた１９７２年からである。

Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｔｕｓ型の種が命名されて以来、その他の種および亜種が１２種類の発見された。その正確な数字は命名者および分類法によって変わる。多くの場合、全く新規な分類基準が提案される。

これらの中で人間および／または動物の病理で最も多く見られるのはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　と、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉと、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｔｕｓとである。現在では、人間における伝染性下痢の最大の原因は（：ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧であると考えられている。

１９８６年にフランスで設立された「カンピロバクタ−感染症監視ネットワーク　（ｒｅｓｅａｕ　ｄｅ　５ｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ａｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）　Ｊは、報告例についての疫学的データおよび臨床データのレジタを毎年発行している。例えば、１９８８年、１９８９年および１９９０年ではこの感染症に関連があるとされた種で最も多かったのはＣ，ｊｅｊｕ旧であった（分析したケースの６０〜７５％）。

人間の腸でのＣ，ｊｅｊｕ旧感染症の主要な症状は下痢であり、最も深刻なケースでは重度の脱水症状となり、脱水症に対して弱い子供と幼児には特に危険である。しかし、多くの場合、Ｃ９ｊｅｊｕ旧による腸炎は合併症を起こさないまま一週間後に自然に止まる。しかし、糞便培養結果は数週間後あるいは一ケ月後でも陽性のままであり、５〜１０％のケースは再発する。すなわちカンピロバクタ −は人の体内で日和見バクテリア的に挙動するので、免疫が抑制されている人および深刻な疾病持っ人（エイズ、肝硬変、癌、白血病等の患者）の場合には徹底した処置と監視が必要がある。

上記以外にＣ，ｊｅｊｕ旧感染結果として報告されているものには腸間膜腺炎、胆嚢炎、泌尿器感染、髄膜炎、敗血症、結節性紅斑またはギランーバレ症候群などであるが、これらは例外的かつ稀なケースである。

動物ではカンピロバクタ−は通常共生物として牛、羊、豚、家禽、野性の鳥、犬および猫等の多くの種の消化管内に住んでいる。これらの動物は病気に罹っているか健康キャリヤーであるかに係わらず巨大な保菌宿主を構成しているので、感染の危険は高い。牛および羊での明らかな感染ケースでＣ，ｊｅｊｕ旧が「家畜赤痢（＋Ｊｙｓｅｎｔｅｒｉｅ　ｄｕ　ｂｅｔａｉｌ）」の原因であることは１９３１年の最初の報告から知られている。その結果、家畜への影響だけではなく、微生物が動物の周囲（地面や水）に蔓延して人間に入る危険がある。無症候動物すなわち「健康キャリヤー」の場合でも、これら動物やその排泄物に直接接触したり、汚染された食物や水（調製時に汚染された肉や十分に調理されていない肉や低温殺菌されていない牛乳、汚染された水等）を飲食すると、人間に入ることになる。

従って、病原であるＣ０ｊｅｊｕｎｉを一日でもげ早く同定することは、適当な方法で人と動物の両方でのコンタミネーションを防ぐために予防的側面から極めて重要である。特に、無菌状態の必要とする食品業界の場合に重要である。また、Ｃ，ｊｅｊｕｎｉに感染後した患者の治療後の正しいモニタリングや再発の完全予防の点で人間の病理学でも重要である。

さらに、感染時に感染の進行と伝染・伝播を防ぐための適切かつ効果的な処置が行えるようにするためには、原因となる微生物を発病後に迅速かつ正確に同定することが極めて重要である。

しかし、カンピロバクタ−の同定とその関連種の決定は容易ではない。すなわち、従来法では、単離に特別な培地を必要とし、少なくとも４８時間培養して濃縮してからでないとこの微生物は検出できない。この時間は迅速な診断を必要とする場合には長過ぎる時間である。また、現在の微生物学的診断は異種間に存在する表現型の違いを利用する細菌学的および／または生化学的手法であり、所定の特性に対して突然変異体が現れた場合には診断ミスとなる危険性がある。Ｃ，ｊｅｊｕ旧とＣ０ｃｏｌｉとを区別する唯一の基準は馬尿酸塩を加水分解するか否かであり（Ｃ，ｊｅｊｕ旧は加水分解できるが、Ｃ，Ｃｏ１１はできない）、区別不可能ということも起り得る。事実、馬尿酸塩に対して陰性のＣ，ｊｅｊｕｎｉ株も存在する（ｌｌｅｂｅｒｔ達、Ｊ、　ＣＩｉｎｌＭｉｃｒＣｌｌｎｌ、。

Ｃ１ｊｅｊｕ旧種の同定に分子ハイブリダイゼーションを用いる方法は既１こ提案されている。しかし、公知の方法は培養後にしか同定が行えず、生物試料中でこのバクテリアを検出するには感度が不十分である。そのため、放射性プローブ（Ｎｇ達、Ｍｏｌ。

を用いたカンピロバクタ−の同定・分離方法が提案されたが、これらの方法では全ゲノムプローブを使用する必要があり、しかも、検出閾値が約１０’バクテリアと非常に高いために培養による濃縮が必要である（Ｃｈｅｖｒ　ｉｅｒ達、上記）。

種を判定するためにピッケン達（Ｐｉｃｋｅｎ　ｅｔ、　ａｔｏＭｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。

ｊｅｊｕ旧　の特異的核酸プローブを研究したが、特異性の問題は残っており、プローブとなる可能性のある配列は決定されていない。同様に、アルカリホスファターゼに結合したオリゴマーで構成された別のＣ，ｊｅｊｕ旧の「特異的」プローブも報告されている（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｎ、Ａ、Ｒ，、１９８６，四Ｎｏ、　１５）　（配列は公開されていない）。しかし、この特異性はＣ０ｊｅｊｕ旧由来の断片についてテストされているのみで、Ｃ，ｊｅｊｕ旧とカンビロバフター属のその他の種のゲノム全体に対してはテストされていない。

最近、Ｃ，Ｃｏ１１　ＶＣ１６７のｆｌａＡ遺伝子から選択したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＨによってＣ，ｊｅｊｕ旧を同定する方法が報告された（Ｏｙｏｆｏ　ｅｔ　ａ＋、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、帽ｃｒｏｂｉｏ１．．１９９２゜３０、Ｎｏ、１０．２６１３−２６１９）。しかし、この方法では　Ｃ，Ｃｏ１１とＣ，ｊｅｊｕｎｉとを区別することができない。

本出願人らは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧種に特異的な検出法に使用可能な核酸の塩基配列を単離した。

従って、本発明の対象は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉのゲノムの核酸塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列において、ヌクレオチド配列Ｎ０９１と、これと相補的な配列と、この配列の少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配列との中から選択されることを特徴とする塩基配列にある。

本発明の他の対象は、上記のヌクレオチド配列の全部または一部を含むヌクレオチド配列、特にヌクレオチド配列Ｎｏ、　２と、これと相補的な配列と、この配列の少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配列との中から選択されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列にある。

「少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配列」とは、サムプルツク、フリーシュ、およびマニアチスが定義した通常のストリンジエンシーの条件（ＳＡＭＢＲＯＯＫ　Ｊ、、ＦＲＩＴＳＣｔｌ　Ｂ、Ｆ、ａｎｄ　ＭＡＮＩＡＴＩＳ　Ｔ　：　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　（１９８９）、Ａ　！、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅｄ、Ｃｏ１ｄ、　Ｓｐｒｉｎｇｌｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　９．４７−９．６２＞下で、配列Ｎｏ、　１　、配列ＮＯ１２またはこれらと相補的な配列とハイブリダイズする配列を意味する。この条件は培地のストリンジエンシ一温度Ｔｍで決まる。

最も有利な配列は（Ｔｍ−１５℃）から（Ｔｍ−２０℃）の温度範囲でハイブリダイズする配列である。

本発明の配列は少なくとも１２個のヌクレオチドを有するのが有利である。

本発明のさらに他の対象は、上記で定義の配列の増幅生成物（ｐｒｏｄｕｉｔｓ　ｄ’　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）にある。

本発明のさらに他の対象は、上記定義のヌクレオチド配列を含むクローニングベクターにある。

上記定義のヌクレオチド配列はＤＮＡ配列でもＲＮＡ配列でもよい。

配列Ｎｏ、　１の断片の正確なサイズは１４７　ｂｐである。この配列はＣ０ｊｅｊｕ旧種に対して特異的で、カンピロバクタ−属のその他８つの代表的な種とはハイブリダイズしない。

配列Ｎｏ、２の断片の長さは１．１８９　ｂｐで、Ｃ０ｃｏｌｉと極めて軽くハイブリダイズするが、試験を行ったその他７つのカンピロバクタ一種とはハイブリダイズしない。

データベースｒＧｅｎｅｂａｎｋ　ｊおよびｒＥＭＢＬＪを検索したが、配列Ｎｏ、　１および配列Ｎ００２と公知ＤＮＡ配列との間には類似性は全くなかった。

配列Ｎｏ、１および配列ＮＯ１２は、機能的に均等な部分または変体で、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧を検出および同定するための分子ハイブリダイゼーション法で用いることができる。

機能的に均等な変体には、これらの断片の特異性に必須な特性を損わずに塩基対が突然変異、欠失、挿入または置換された配列が含まれる。

本発明のヌクレオイド配列は医学および獣医学における診断および疫学的用途で、特にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの特異的な核酸プローブまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの特異的配列の増幅（ａｍｏｒｃｅｓ）用のオリゴヌクレオチドブライマーとして用いることができる。

本発明プローブは上記配列または配列の断片中に少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含んでいるのが有利である。このプローブはＤＮＡプローブかＲＮＡプローブである。

本発明のヌクレオチド配列は、生物試料中のＣａｍｐｙ　Ｉｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ−Ｇ特異的かつ直接的な方法で特異的に検出するだめのプローブとして使用することができる。このプローブはバクテリアが属する生物型とは無関係にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧種のバクテリアを検出することができる（Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ種のバクテリアは馬尿酸塩を加水分解して１１２ＳとＤＮａｓｅｌ　とを産生ずる能力に応じて工、ＩＩ、　ＩＩＩおよびＩｖ型とよばれる４つに分類されるの“Ｌｉａｒ　ｂｉｏｔｙｐｅ”が存在する）。

本発明オリゴヌクレオチドプローブは亜種であるＣ０ｊｅｊｕｎｉｓｕｂｓｐ、　ｄｏｙｌｅｉ　も検出することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブはＣ，ｊｅｊｕｎｉと同じ生物試ネ４中に存在する可能性のあるその他の種類：　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ、　Ｅｎｔｅｒｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＳＢｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍおよび５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅに属するバクテリアからのＤＮＡを検出することはない。

ラベルしていない配列をプローブとして直接使用することができるが、通常は、多くの用途で使用できるプローブとするために、配列を放射性元素（３２Ｐ、３ＳＳ、３Ｈ１１２５■）または非放射性分子−（ビオチン、アヤチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリジン）でラベル化する。

後者の場合には、フランス国特許第２．４２２．９５６号および第２゜５１８、７５５号に記載のラベル方法のいずれかを用いることができる。ハイブリダイゼーションは種々の方法で行うことができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｊ、Ａ、ａｎｄ　Ｋｒ１ｃｋａ、　ｌｌ、Ｊ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９８８゜１６９、１−２５　）　。最も広く採用されている方法は［ａｍｐｙ　Ｉｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕ旧の細胞かり抽出した核酸を担体にトロセルロース、ナイロン、ポリスチレンなど）に固定し、固定した核酸とプローブとを所定の条件下で培養する方法である。バイブリド化させた後、過剰なプローブを除去し、形成されたハイブリッド分子を適当な方法で検出する（ブ【］−ブの放射能、蛍光活性または酵素活性を測定する等）。

本発明の核酸プローブはキャプチャープローブ（ｓｏｎｄｅｓｓ　ｄｅＣａρｔｕｒｅ）として使用することもできる。この場合にはプローブを担体に固定し、Ｃ，ｊｅｊｕｎｉから抽出した標的の核酸を特異的ハイブリダイゼーションによって捕獲する。必要な場合にば、固体担体を試料から分離し、キャプチャープローブと標的核酸との間に形成されたデユーブレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を、検出が容易な元素でラベルした第２の検出プローブを用いて検出する。

分析試料から十分な量のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの核酸が抽出できる場合には上記配列を用いて分析試料からＣａｍｐｙ　１ｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕ旧に属する株を直接同定することができる。そうでない場合には、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧から核酸を抽出する前に液体培地中で迅速に培養するか、試料から抽出できる少量のＣａｍｐｙｌｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの核酸を増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、例えばＰＣＲ法で増幅する。

オリゴヌクレオチドブライマー（ａｍｏｒｃｅｓ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）特にＰＣＲ法用のプライマーは、配列Ｎ０１１、配列Ｎ００２またはこれらの配列の断片から選択することができる。

この増幅法では増幅すべき断片の両側に付ける（ｅｎｃａｒｄａｎｔ）オリゴヌクレオチドペアを選択する必要がある（米国特許第４゜６８３、２０２号）。このオリゴテ゛オ片シリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのプライマーの長さは１８〜３０、好ましくは１８〜２２ヌクレオチドであるのが有利である。２つのプライマーの中の１方は鋳型の（（）鎮と相補的で、他方のプライマーは（−）釦と相補的である。これらのプライマーが二次構造または互いに相補的な配列を含まないことが重要である。また、各プライマーの配列の長さはプライマーが原核細胞または真核細胞、特にｊｅｊｕ旧種に属さないカンピロバクタ −由来の核酸および試料中に入り込む可能性のある人間のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしないような長さを選択しなければならない。

Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ株の塩基配列の増幅用の特異的プライマーとして選択されるアンブリマーは例えばグリフェイス達の方法に従って選択される（Ｇｒｉｆｆａｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１９９１．１９．３８８７−３８９］、）。

本発明者達はＰＣＲ法用に配列Ｎｏ、　２からのオリゴヌクレオチドを選択した。このオリゴヌクレオチドを用いることによってＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧が特異的に増幅され、その他のカンピロバクタ一種由来の核酸の増幅は見られなかった。

特に最も好ましいプライマーベアは配列ＮＯ１２由来の下記配列のオリゴヌクレオチドＶＳ］５およびＶＳ１６である：ＶＳ１５　：　”　ＧへＡ　ＴＧＡ　ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　３′ＶＳ１６：　’°　ＧＡＴ　八ＴＧ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＣＣＴＧＣ”増幅された断片はアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を行って同定するか、クロマトグラフィー法（ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換体クロマトグラフィー）を行って同定することができる。増幅特異性はプローブとしてヌクレオチド配列Ｎｏ、　１または配列Ｎ００２、その断片、これらの配列またはその断片を含むプラスミド、これらの配列またはその配列の断片と相補的なオリゴヌクレオチドまたは増幅生成物を用いた分子ハイブリダイゼーションによって管理することができる。これらのプローブは放射性元素または非放射性分子でラベルされていＣも、されていなくてもよい。

本発明のさらに他の対象は、下記段階を特徴とする生物試料中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの存在を検出する方法にある：ｉ）生物試料とプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチド断片のベアとを、プライマーがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの核酸にハイブリダイズするような条件下で接触させ、この場合、必要に応じて、生物サンプル中に含まれるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕ旧の核酸を予めハイブリダイゼーションし易い状態としておき、ｉｉ）　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｏｎｉに属する核酸を増幅させ、ｊｉ）プライマーを両側に有する断片に対応するＣａｍｐｙ　１ｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの核酸の断片が増幅されたことを検出し、ｉｖ）特異的プローブのハイブリダイゼーション、シーケンシングまたは制限部位分析等によって増幅された断片を必要に応じて確認する。

アガロースゲルを用いた場合のＰＣＲ増幅後の検出限界は、Ｃ，ｊｅｊｕ旧のバクテリア懸濁液を１０倍に順次希釈して増幅した時に１バクテリアである。

本発明のさらに他の対象は、下記要素を有することを特徴とする生物試料中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕ旧の存在を検出するためのキットにある：１）上記で定義のオリゴヌクレオチド断片のペア、２）　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ株に由来する核酸を増幅させる試薬、３）必要に応じて増幅した断片の配列を確認するもの、特に、上記定義の核酸プローブ。

このキットはラベル化されたまたはラベル化されていないプローブを含んでいるのがさらに好ましい。これらは溶液状態でも、担体に固定されていてもよい。キットにさらにバクテリアの溶菌および標的核酸の抽出に必要な試薬と、選択した方法に対応したハイブリッド化溶液および洗浄液を含めることもできる。

本発明のさらに他の対象は、上記定義の核酸プローブの疫学的道具としての分子疫学での利用にある。

実際、Ｃ，ｊｅｊｕｎｉのゲノム中に特定の断片が数回存在する場合、この反復性は同一の株の同定・分類の道具となり、その根源と感染の伝播との関連を調べることができる。

以下、本発明の詳細な説明する。

添付図面は配列Ｎｏ、２＜断片ＶＳＩ　）の配列決定手法を示している。

パスツール研究所（１’ａｓｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）提供のＣ，ｊｅｊｕｎｉ　Ｃ１ｆ’　７０．２由来のゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼｆｌｉｎｄ　ＩＩＩを用いて部分的に切断する。メーカーの推奨するバッファー中で３７℃で１時間、ＤＮＡ断１１ｇ当たり０．０６Ｕの酵素を反応させる。こうして切断されたゲノノ、ＤＮＡを０．５％アガロースゲル上で電気泳動で分離し、長さ３０〜４０ｋｂの断片を電気的に溶出させ、フェノール／クロロホルム　（１／］、）で抽出した後、エタノール中で沈澱させる。

ベクターはベーリンガー社（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ）から提供されたコスミドｒｅｆ、　ｐｆｌｃ７９である。これを同様の方法で切断し、セルフリゲーションを完全に避けるために脱リン酸化する。

リゲーションは、７００ｎｇのベクターと３０／４０ｋｂのＤＮＡ断片１．５μ ｇとを混合し、この混合物に適当なバッファーに入れたＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ１ユニットを添加した後、１４℃で１８時間放置して行った。

組み換えコスミドをインビトロでカプセル化し、バクテリア（Ｅ、ｃｏｌｉ−Ｈｅ　１０１．）の形質転換に使用する。形質転換されたバクテリアはＬＢ培地で３７℃で１時間培養した後、２５μｇ／ｍｊ’のアンピリジンを含む選択的アガー培地上に置く。アンピシリン耐性のコロニー全に対してテトラサイクリンに対する感受性テストする（３０／４０ｋｂのＤＮＡ断片はテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性遺伝子を不活化してアンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子を保存するようにベクターに挿入される）。

アルカリ溶菌法でアンピシリン耐性（Ａｍｐ　’　）且つテトラサイクリン感受性（Ｔｅｔ　’　）の最初の形質転換コロニー６０個から小規模にＤＮＡ調製する。この調製物からのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼｔｌｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、０．８％アガロールゲル上で電気泳動分析し、次いでナイロンフィルター上に移す。ＤＮＡを２５４ｎｍの紫外線に３分間曝して不可逆的に固定する。

各フィルタを、１０％のデキストラン硫酸、濃縮されたデンハルド５Ｘ溶液（口ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　（Ｉ　Ｘのデンハルド溶液は０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のポリビニルピロリドンおよび０．０２％の牛血清アルブミンに相当する）　、１０　ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｄの変性されたサケ精子ＤＮＡおよび下記３つの種：Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ　ＣＩＰ　？０．２、Ｃ，Ｃｏ１１　ＣＩＰ　７０．８０　およびＣ，ｆｅｔｕｓ　５ｕｂｓｐ、ｆｅｔｕｓ　Ｃ１ｌ’　５３９６のいずれかを［マルチブライミング（多重増幅、ａｍｏｒｃａｇ、ｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ）」”’Ｑ”Ｐ　テ放射性化したゲノムＤＮＡを含む６　Ｘ（７）Ｓ　ＳＣバッファー（ＩＸのＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムとに相当する）中で、６５℃で１６〜１８時間培養する。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを例えば６５℃の２ＸＳＳＣで１０分間づつ２回、６５℃の２ＸＳＳＣ十０．１　％（７）ＳＤＳで３０分間１回、最後に６５℃に０．１ＸのＳＣＣで１０分間１回洗浄する。湿ったままのフィルタを増感板を用いて一８０℃で１５分から３日間オートラジオグラフィーにかける。

このハイブリダイゼーションの結果、ＶＳＩと名付けられる約１．２ｋｂの断片を含むコスミドのクローンが単離される。この断片をベクターｐＨｃ１８　（ベーリンガー社から市販）でクローニングして大量調製する。得られたプラスミドをｐｖｓ　２０と名付けた。

この断片の特異性は実施例２に記載の方法で確認した。

上記ｖＳ１断片をＭ１３ｎ＋ｐ１８ファージでクローニングし、シーケンシングキット「シーケナーゼＪ　（登録商標５ｅｑｖｅｎａｓｅ　２．０゜米国、パイオケミア社（Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製）を用いてサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法で配列決定した。断片ＶＳＩの幾つかの部分は、２本のＤＮＡ鎖をアルカリ変性した後プラスミドｐＶｓ２０で直接配列決定された。シーケンシング反応は全て３５３でラベル化したｄＡＴＰを用いて行った。

添付の線図は断片ＶＳＩの／−ケンシングに用いた手法を示すもので、２．３．４．５．６．７．１４．１６．１７．１８はシーケンシングで用いた各種プライマーを示している。ＦＰおよびＲＰはｐＵｃ１８およびＭ１３ｍｐ１８のＤＮＡに共通な相補的プライマーである。

断片の全体配列が配列Ｎｏ、　２である。

こうして決定された断片ＶＳＩの１１８９個のヌクレオチドをデータベースｒ　Ｇｅｎｅｂａｎｋ　Ｊおよびｒ　ＢＭＢＬＪと比較したが、現在公知の配列に類似のものは見出せなかった。

実施例２本発明の核酸配列をプローブとして使用したサイン法によるＤＮＡ分析本試験で用いたバクテリアの符号リストは以下の通り：カンピロバクター：Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ　ＣＩＰ　７０．２Ｃ，ｃｏｌｉ　ＣＩＰ　７０．８０Ｃ，１ａｒｉ　ＣＩＰ　１０２７２２Ｃ１ｆｅｔｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｆｅｔｕｓ　ＣＩＰ　５３９５Ｃ０ｆｅｔｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓ　ＣＩＰ　６８２９Ｃ，ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ　Ｃ１２０Ｃ，ｃｕｒｖｕｓ　（ｔｌｏｐｉｔａｌ　ｄｅｓ　Ｅｎｆａｎｔｓ、　Ｂｏｒｄｅａｕｘ）Ｃ８ｓｐｕｔｏｒｕｍ　５ｕｂｓｐ、　５ｐｕｔｏｒｕａ＋　ＣＣＬＩＧ　９７２８Ｃ，ｓｐｕｔｏｒｕｍ　５ｕｂｓｐ、　ｂｕｂｕｌｕｓ　ＣＩＰ　５３１０３Ｃ，ｃｏｎｃｉｓｕｓ　１８６８８Ｃ，ｆａｃａｌｉｓ　ＣＴＰ　１２０１４カンピロバクタ−以外：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｆｌＢＩｏｌ）１ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ＣＩＰ　１０１２６０Ｓ１０１２６０Ｓａ１　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＣＪ　５３Ａ、　ｃｒｙａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ　ＣＣＬＩＧ　１７８０カンピロバクタ−属に属さないバクテリアからのＤＮＡ」１記バクテリアと陽性コント０−ルとして用いたＣ、　ｊｅｊ口旧１とのＤＮＡを制限酵素ｆｌｉｎｄ　ＩＩＩで加水分解し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ナイロン膜１１ｙｂｏｎｄ−Ｎへと移した。各ＤＮＡ断片をベーリンガー社のｒＲａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｄＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｊキットの指示に従って、３２ｐでラベル化されたνＳ１断片をプローブとして用いた分子ハイブリダイゼーションで分ＵＩシた。オートラジオグラフィーで検出された唯一の種はＣ，ｊｃｊｕ旧であった。カンピロバクタ−ｉ種以外のＤＮＡでは７２時１７１１暴露後でもハイブリダイゼーションは全く検出されなかった。

Ｃ，ｊｅｊｕ旧以外のカンピロバクタ−属由来のバクテリアのＤＮＡカンピロバクタ一種を適当な培地（５％の羊血液アガー、バイオメリュー（ｔｌｉｏ＋ｒ＋ｅｒｉｅｕｘ）社）で培養した後、以下の方法で処理する。

各ペトリ皿からバクテリアを２ｍｆのＴＥ−グルコースバッフ了（２５ｍＭのｐｌ＋８トリス塩酸、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０　ｍＭのグルコース）を用いて回収し、５，０００ｇで５分間遠心分離する。

ケ・−ギを再度懸濁（〜、ＴＥ−ゲルコールで洗浄し、再度遠心分離する。バクテリアを１００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭのｐＨ８のトリス塩酸、１ｍＭのＥ　Ｉ）　Ｔ　Ａ　）に再懸濁し、ピッチャ−達の方法でＤＮＡを抽出する（Ｐｉｔｃｈｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｌｅｔｔ、　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８９．　８．１５１−１５６）。抽出したＤＮＡを酵素旧ｎｄＩｌ＋を用いて完全に切断する。ｉ）られた断片を０．８％のＴＡＢアガロースゲル上で電気泳動して分離した後、サイン法に従ってナイロン膜上に移す。

移した断片を分子ハイブリダイゼーションで分析する。この実施例で使用したプローブは断片ＶＳ２　（配列Ｎｏ、　１の）と、断片ＶＳＩを酵素Ｂｇｌ　ＩＩで加水分解して得られる断片ｖＳ３とで、これら２つのプローブは３３ｐでラベル化されている。

プローブνＳ２はＣ０ｊｅｊｕ旧由来のＤ　Ｎ’Ａを特異的に検出し、その他のカンピロバクタ一種のゲノムＤＮＡとはハイブリダイＣ，ｃｏｌｉゲノム上のＤＮＡ断片とも極めて軽くハイブリダイズする。このクロスハイブリダイゼーションは１６時間暴露させた後にのみ検出可能である。一方、Ｃ，ｊｅｊｕ旧由来のＤＮＡはわずか１５分の暴露後に検出された。

これらの結果から、プローグＶＳＩ　（配列Ｎｏ、　２）はそれ以外の属のバクテリア由来のＤＮＡの中で（：、　ｊｅｊｕｎｉ由来のＤＮＡを特異的に検出し、断片ＶＳ２　（配列Ｎｏ、　１＞はカンピロバクタ一層内で正確に同定した場合にＣ，ｊｅｊｕ旧を特異的に認識するという結論が導かれる。

実施例３本発明の核酸の塩基配列からのプライマーを用いたＣ、　ｊｅｊｕｎｉ由来のＤＮＡのインビトルでの酵素増幅プライマーの選択ＰＣＨの特異性を決定するのは基本的にオリゴヌクレオチドブライマーの３°末端であることは分かっている（Ｍ、　Ｉｎｎ１ｓ　ｅｔｃｏｄ、、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）。従って、このの３゛領域が増幅すべき目標物に対して完全に特異的であることが重要である。

カンピロバクタ−のゲノムのグアニンおよびシトシンの比率は非常に小さいので（Ｇ十Ｃで２８〜３０％）、３゛末端がＧ十〇を多く含むプライマーは高い特異性を示すと考えられた。

本発明者らは、ＶＳＩ配列中にＧ＋Ｃを多く含みものを探したた結果、ＶＳＩ中に一度だけ存在した。この領域からプライマーの配列を決め、長さが約２０ヌクレオチドとなるように終了させた。

オリゴヌクレオチドブライマーの合成ＶＳＩ配列に由来するＯｌｉｇｏ　ＶＳ１５　およびＯｌｉｇｏ　ＶＳ１６と名付けた」１言６の配列を有する長さがそれぞれ２１および２２ヌクレオチドのプライマーをホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）を基礎にしたミリボア（帽１１ｉｐｏｒｅ）社の自動装置「サイクロンプラス（Ｃｙｃｌｏｎｅ　Ｐｌｕｓ）Ｊで合成した。合成後、オリゴヌクレオチド溶液を試験管に移し、濃縮した水酸化アンモニウム中で５５℃で１６時間培養した。オリゴヌクレオチドをエタノールで沈澱させた後、ケーキを７０％のエタノールで洗浄し、乾燥し、最後に１ｄの滅菌蒸留水に懸濁した。各プライマーの濃度は分光光度計で測定した。

増幅増幅法として、例えばサイキ達の手順に従ったインビトロ酵素増幅法（ＰＣＲ）を用いた（Ｓａｉｋｉ　ｅＬ　ａ＋、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８８゜２３９、４８７−４９１）。この方法では、１μＭのオリゴヌクレオチド０１ｉｇｏ　ＶＳ１５　およびＯｌｉｇｏ　ＶＳ１６と、異なるカンピロバクタ−株に由来するＤ　Ｎ　Ａ　３３０−１Ｏ０ｎと、０．５ユニツトのＴａｑポリメラーゼと共に用いて、バッファー（２５ｍＭのＫＣＩ、ＰＨ８，５のトリス塩酸２０ｍＭ、塩化マグネグシウム］、５ｍＭ、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート２００μＭおよび牛血清アルブミン１００μＭ／ｍｆを含む）中で最終的な反応容量を５０μｌにして行う。

ＰＣＲ法の各段階でのパラメータは以下のように選択した：９４℃で５分、６０ ℃で１分、７２℃で１分、次いで（９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分）を２８回、そして最終サイクルを９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で５分。自動装置を用いてこれを３０サイクルを行う。最終サイクル後、分析まで試料を４℃に維持する。

増幅させた試料のアガロースゲル上での電気泳動分析港輻させた試料１０μｌを、１μｇ／ｍｌのエチジウム臭素を含むＴＢＥバッファー（０，０４Ｍのトリス硼酸、０．００１ＭのＥＤＴＡ）中で２％７゛ガロースゲル上に添加する。増幅させた断片をＵＶ下で視覚化し、ポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ　６６７）フィルムを用いてゲルを撮影する。

カンピロバクタ−由来の各種ＤＮＡと、カンピロバクタ−属に属さないバクテリア由来の各種ＤＮＡと、プライマー０１１ｇ。

ＶＳ１５および旧ｉｇｏ　ＶＳ１６とを用いて得られた結果を比較した。

このプライマーベアを用いて増幅させた断片に期待される理論上の長さは３５８塩基対である。

そのような断片はＣ，ｊｅｊｕ旧から抽出されたＤＮＡのみで得られる。

以下の株：　Ｃ０ｃｏｌｉ、Ｃ０１ａｒｉ、［：、ｌ’ｅｊＢ３５ｕｂｓｐ、　ｆｅｔｕｓ。

Ｃ９ｆｅｔｕｓ　５ｕｂｓｐ、ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓ、　Ｃ０ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ａ。

ｃｒｙａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＳＣ９５ｐｕｔｏｒｕ　５ｕｂｓｐ、　５ｐｕｔｏｒｕｎ＋　、　Ｃ。

ｓｐｕｔｏｒｕｍ　５ｕｂｓｐ、ｂｕｂｕｌｕｓ　、　Ｃ１ｃｏｎｃｉｓｕｓ　、　、ｃ、ｆａｃａｌｉｓ。

Ｂ、　ｃｏｌｉ　、Ｉｔ、　ｐｙｌｏｒｉ、　Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃ，ｃｕｒｖｕｓおよび人の細胞から抽出したＤＮＡを分析したものでは、上記の期待されるサイズの断片の増幅は見られない。

Ｃ，ｆｅｔｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｆｅｔｕｓの場合、分子量の大きい断片が増幅されたが非特異的であった。すなわち、ナイロン膜に移した後のこの断片は３２Ｐでラベル化したＶＳＩプローブとハイブリダイズしない。

さらに、ホロホロチョウから単離した１５のＣ，ｊｅｊｕ旧株で上記ＰＣＲ法でＣ，ｊｅｊｕ旧の同定テストをした。株を継代培養した後にＤＮＡを抽出し、増幅した。株は全てＣ，ｊｅｊｕｎｉと同定され、これは予め行った生化学試験と一致した。

ＰＣＲテストの感度の決定」１記オリゴヌクレオチドペアを用いてＰＣＲ法でＣ，ｊｅｊｕ旧のＤＮＡの検出時の絶対的閾値をめるために、Ｃ，ｊｅｊｕ旧バクテリア懸濁液の１０倍に希釈したＰＣＲによる増幅を行った。

増幅は４０勺イクル行い、各サイクルは上記条件と同じにし、希釈液を適当な溶菌バッファーと混合した後、熱処理（６５℃で１５分間、続いて９５″Ｃ，で１０分間培養）ｉ、た。溶菌バッフＴ−の組成は以Ｆの通りニドリス塩酸１０ｍＭ　、　Ｅ　ＤＴＡ　１　ｍＭ、　ｐＨ８の０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．５％Ｎｏｎ　１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏおよび５００Ｍｇ／ｒｎｌのプロテイナーゼに０溶菌で使ったものと同じ各希釈液の１００μ！量をカンピロバクタ−用培地を入れたベトリ皿に広げ、４８時間培養後にコロニーを数えた。これらの条件下での検出限界は７バクテリアであった。

各希釈液１０μ！を増幅するＰ　ＣＲ法での検出限界は統計的（５１バクテリアである（理論上の希釈は、３．５Ｘ１０’バクテリア／１００μｌ〜３．５バクテリア／］００μｌで、それぞれ１００μ！当たりのベトリ皿のバクテリアカウント値２．５Ｘ１０’　、１０’、１０’　、１．５　ｘｌＯ’　、５６０．３２．７および０に対応する）。

結論として、このプライマーベアによってＣ，ｊｅｊｕ旧種を特異的に検出できることは重要であり、それによってＣ，ｊｅｊｕｎｉに感染した患者や生物試料から単離したものを同定することができ、臨床細菌学および獣医学の分野で使用できる。

本発明によるＣ、　ｊｅｊｕ旧の検出方法は上記のオリゴヌクレオチドプローブを用いて食品（チキンスカロッピ一二、牛肉、牛乳、水）中のＣ，ｊｅｊｕｎｉの存在を調べるのに使用することもできる。この場合にはバクテリアの溶菌前に低速遠心分離によって粗食物組織を除去する必要がある。そうすることよってＰＣＲテストの結果を向上させ、増幅反応の阻害に起因して誤って陰性と判断する危険を避けることができる。

配列リスト ■　一般情報（１）　出願人　：バスツール研究所（２）　発明の名称：カンピロバクタージュジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）− のゲノムの核酸の塩基配列と特異的に／％イブＩノダイズするヌクレオチド配列（３）　配列の数　＝４ ■　配列Ｎ０９１に関する情報：配列特性：タイプ　：　ヌクレオチド長さ　：１４７塩基対鎖の数　二　一本領形状　：　直線分子タイプ：　ＤＮＡ生物体　：　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ名称　：　ＶＳ２配列：ＡＡＧＣＴ’ｌ’ＧＴＧＡ　ＴＡＣＴ’ｌ”！’ＴＡＡＧ　ＴＧＣＴＡＴＡＧＡＡ　ＡＧＴＧ入入入ＡＴＧ　ＡＡＡＴＴ’ｒＣ丁〒〒６０　７０　８０　９０　Ｚｏ。

入ＧＣＡＧＧＣＡＴＡ　ＴＡＴＡＧＡＧＣＧＴ　ＡＴＴＧＴＴＣＣＡＡ　ＡＴＴＴＧＡＴＴＴＡ　ＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡｌｌｏ　１２０　１３０　１４０丁Ｔ’！’ＴＡＧＡＡ’ｒＧ　ＧＧＧＴＣＴＴＡＡＡ　ＡＴＡＴＴＴＡ入ＡＡ　ＡＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣ丁〒ＡＡＡＡ■　配列Ｎ００２に関する情報：配列特性：タイプ　：　ヌクレオチド長さ　：　１．１８９塩基対鎖の数　：　−重鎮形状　：　直線分子タイプ：　ＤＮＡ配列：ＡＡＴ貫のいＴＡ口πＡＡＧ　ＴαテＡＴＡＧＡＡ　ＡＣＴ（ａＬ仏ＴＧＡＩす・＝〒τ胃ＡＡＣＡＡＴＴＡＧＡ　ＡＴＡＴＣＧＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＡＧＴＧ　ＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＡＣＴＴＡＧ′ ｒＴｒＴＴｒ　ＴＡＡＡＧＣＴＧＴＡ　α：ａＡＡＧＣＴＩ’■　配列Ｎｏ、３に関する情報：配列特性：タイプ　：　ヌクレオチド長さ　：２１塩基鎖の数　二　−重鎮形状　：　直線分子タイプ：　ＤＮＡ生物体　：　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ名称　：　０１ｉｇｏ　ＶＳ１５配列： ’゛ＧＡＡ　ＴＧＡ　ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　’・■　配列Ｎｏ、４に関する情報：配列特性：タイプ　：　ヌクレオチド長さ　：２２塩基鎖の数　二　−重鎮形状　：　直線分子タイプ：　ＤＮＡ生物体　：　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ名称　：　Ｏｌｉｇｏ　ＶＳ１６配列：５・ＧＡＴ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＣＣＴＧＣ’−四

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉのゲノムの核酸塩基配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列において、ヌクレオチド配列Ｎｏ．１と、これと相補的な配列と、この配列の少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配列との中から選択されることを特徴とする塩基配列。
２．請求項１に記載のヌクレオチド配列の全部または一部を含むヌクレオチド配列。
３．ヌクレオチド配列Ｎｏ．２と、これと相補的な配列と、この配列の少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配列との中から選択される請求項１に記載のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列。
４．請求項１〜３のいずれか一項に記載の配列の１つの増幅生成物。
５．請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするクローニングベクター。
６．請求項１〜４のいずれか一項に記載のヌクレオチドより選択された少なくとも２０の連続するヌクレオチドを有することを特徴とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｊの核酸に対して特異的な核酸プローブ。
７．ヌクレオチド配列Ｎｏ．１と、ヌクレオチド配列Ｎｏ．２と、これらの相補的な配列と、これらの配列の少なくとも１つの塩基の突然変異、挿入、欠失または置換に起因して変化した配列との中から選択される請求項６に記載のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの核酸に対して特異的な核酸プローブ。
８．担体上に固定されてキャプチャープローブとして使用される請求項６または７に記載の核酸プローブ。
９．請求項１〜４のいずれか一項に記載の配列より選択されるヌクレオチドを１８〜３０個、好ましくは１８〜２２個有するオリゴヌクレオチドペアで構成されることを特徴とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの核酸配列の増幅に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーペア。
１０．下記配列を有するオリゴヌクレオチドペアで構成されることを特徴とする請求項９に記載のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｊの核酸配列の増幅に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーペア：５，【配列があります】３，５，【配列があります】３，
１１．下記段階を特徴とする生物試料中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの存在を検出する方法：ａ）生物試料と請求項９または１０に記載のプライマーペアとをプライマーがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの核酸にハイブリダイズするような条件下で接触させ、この場合、必要に応じて、生物サンプル中に含まれるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの核酸を予めハイブリダイゼーションし易い状態としておき、ｂ）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉに属する核酸を増幅させ、ｃ）プライマーを両側に有する断片に対応するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの核酸の断片が増幅されたことを検出し、ｄ）特異的プローブのハイブリダイゼーション、シーケンシングまたは制限部位分析等によって増幅された断片を必要に応じて確認する。
１２．下記段階を特徴とする食物試料中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの存在を検出する方法：ａ）低速遠心分離で粗食物組織を除去し、ｂ）食物試料と請求項９または１０に記載のプライマーペアとをプライマーがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｊの核酸にハイブリダイズするような条件下で接触させ、この場合、必要に応じて、食物サンプル中に含まれるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｍｉの核酸を予めハイブリダイゼーションし易い状態としておき、ｃ）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉに属する核酸を増幅させ、ｄ）プライマーを両側に有する断片に対応するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの核酸の断片が増幅されたことを検出する。
１３．下記要素を有することを特徴とする生物試料中または食物試料中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉの存在を検出するためのキット：１）請求項９または１０に記載のプライマーペア、２）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｍｉの核酸を増幅させる試薬、３）必要に応じて増幅した断片の配列を確認するもの、特に、請求項６〜８に記載の核酸プローブ。
１４．Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ株を特定のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ株として特定・分類するための疫学的手段としての請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸プローブの使用。