JPH07505771A - シアリルトランスフェラーゼの同定と合成のための構成物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シアミルトランスフェラーゼのｄ　とＡのための　と　゛ 本出願は、１９９２年３月９日に出願された出願番号第０７／８５０．３５７号 の一部継続出願である。

発　明　の　背　景 この発明は、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリー、すなわち触媒領域 に相同性の保存された領域を含む糖タンパク質、糖脂質やオリゴ糖の炭水化物基 の末端シアリル化を担う一連のグリコジルトランスフェラーゼに関連している。

シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーに属するものは、Ｇａｌβ１，３ ＧａｌＮＡＣα−２，３−シアリルトランスフェラーゼとＧａ１ｌ、３　（４） ＧｌｃＮＡｃ　α−２，３−シアリルトランスフェラーゼである。

この発明は、さらに新規な形と構成に、それから特に、充分な利用できる量で均 質であるような、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのメンバーの同 定と産生を行うための手段と方法に関連している。本発明は、さらにシアリルト ランスフェラーゼの産生を関連している。即ち、シアリルトランスフェラーゼを コードしているＤＮＡ分子を得る方法や、そのようなりＮＡを利用するヒトや哺 乳類のシアリルトランスフェラーゼの発現に、さらにシアリルトランスフェラー ゼやそのフラグメントをコードしている新規な核酸を含む新規化合物に関連して いる。本発明は、またシアリルトランスフェラーゼ誘導体、特にタンパク質の細 胞質のまたは膜貫通の部分を欠いた誘導体、そして組換えＤＮＡ技術によるそれ らの産生物にも向けられている。

シアリルトランスフェラーゼは、一般的な反応、つまりシチヂヂン　５−一燐酸 −シアル酸（ＣＭＰ−８Ａ）　十ＨＯ−受容体　→　ＣＭＰ＋５Ａ−０−受容体 （Ｂｅｙｅｒ、　Ｔ、Ａ、　ｅｔ　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｎｏｌ、　５２．２３− １７５　［１９８１１）において糖脂質やオリゴ糖の炭水化物基の末端部分への シアル酸転移を触媒する酵素のファミリーである。

シアリルトランスフェラーゼは、翻訳後のグリコシレージョン経路を持っている 細胞のゴルジ装置で最初に見つけられた。（Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、　ＢＪ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８９．２４６−２５５　［１９８１コ）。　それらは、ま た体液中、たとえば母翫初乳や血液中にも発見された。少なくとも１０−１２個 の異なったシアリルトランスフェラーゼが、知られている全てのシアリルオリゴ 糖配列を合成するのに必要である。それらの一つ一つは、受容体オリゴ糖の配列 と、シアル酸とそれが結合した糖の間に形成されるアノメリックリンケージとに 対する特異性によって酵素的に区別されるだろう。四つのシアリルトランスフェ ラーゼが精製されている。（Ｂｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｂ１ｄ；　Ｗｅ ｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　ｅｔ　旦↓　、Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｍ、２５７．１ ３８３５−１３８４４　［１９８２コ；　Ｍｉａｇｉ、Ｔ　ａｎｄ　Ｔｓｕｉｋ ｉ、　Ｓ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２５．２５３−２６１　［ １９８２］；　ａｎｄ　Ｊｏｚｉａｓｓｅ、　ＤＨ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．４９４１−４９５１［１９８５］）。　より詳 しくいえば、Ｇａｌβ１．４Ｇ１ｃＮＡｃ　ａ−２，６−シアリルトランスフェ ラーゼとＧａｌβ１，３　（４）ＧＩｃＮＡｃ　ａ−２゜３−シアリルトランス フェラーゼは、ラット肝臓膜から精製された（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｉｂ１ｄ）。

他のグリコジルトランスフェラーゼは、シアリル基の、フコシル基の、ガラクト シル基の、Ｎ−アセチルグルコサミニル基のそしてＮ−アセチルガラクトサミニ ル基の転移酵素を含んだ血清、母乳や初乳中に可溶性酵素として単離されている 。（Ｂｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｂ１ｄ、）ウシやヒトのβ−Ｎ−アセチルゲ ルコサミド　β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、単離されている（ Ｎａｒｉｍａｔｓｕ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、’Ｕ、Ｓ、Ａ　８３．　４７２０−４７２４　［１９８６コ；　５ｈａｐｅｒ 、ＮＬ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、Ａ、　８３．１５７３（５７７［１９８６］：Ａｐｐｅｒｔ、　Ｈ，Ｅ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｏｎ 　１３９．１６３−１６８　［１９８６］；ａｎｄ、　Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ−Ｂ ｅｙｅｒ、　Ｍ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３．８９１８−８９２２　［１９８６コ、）。これら の精製されたグリコジルトランスフェラーゼは、活性には本質的ではない、たと えば膜貫通領域のタンパク質部分のおそらく除去によってサイズに違いがある。

ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトラ ンスフェラーゼやＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを含むグリ コジルトランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡクローンの決定されたアミ ノ酸配列の比較を行うことによって、これら酵素が実質的には少しも配列の相同 性を持たないということが明らかにされた。グリコジルトランスフェラーゼのこ のファミリーが、構造的にどの様に関連しているかに対するいくつかの洞察は、 クローン化されたシアリルトランスフェラーゼの一次構造のごく最近の解析から 生じている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、鮭ｍ１．　、１ｂｉｄ、）。しかしな がら、それらは全て短いＮＨ２−末端の細胞質テール、即ち１６−２０アミノ酸 シグナル−アンカー領域や、大きなＣ００Ｈ−末端の触媒領域か続く拡張された ステム領域をもっている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．　１７７３５−１７７４３　［１９８７コ　Ｐａｕｌｓ ｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，ｅｔ、　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４ ．１７６１５−１７６１８　［１９８９コ）。シグナルアンカー領域は、開裂で きないシグナルペプチドかつ膜貫通領域として作用し、ゴルジ装置の管腔内でこ れらのグリコジルトランスフェラーゼの触媒領域に配向している。通常のアミノ 酸配列は、類似の受容体や供与体基質を持つグリコジルトランスフェラーゼのフ ァミリーの範囲内で予想されるだろう。しかしながら、驚くべきことに、相同性 のある領域は、グリコジルトランスフェラーゼの触媒領域の中にはほとんど見つ けられていない。そして、有意な配列相同性は、ＧｅｎＢａｎｋの他のどんなタ ンパク質とも一切見つかっていない（Ｓｈａｐｅｒ、　Ｎ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２１６．１０４２０−１０４２８　［１９８１１ １コ、Ｄ’Ａｇｏｓｔａｓｏ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ ｎ　１ｇ３゜２１１−２１７　［１９Ｂ９］　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　 Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　２６３゜１７７３５−１ ７７４３　［１９８７］）。これは、Ｇａｌαｌ、３−ＧＴとＧＩｃＮＡｃ　β １．　４−ＧＴ、という二つのガラクトシルトランスフェラーゼに対して特に驚 きである。しかしながら、これらのガラクトシルトランスフェラーゼは、全体に わたる相同性は見られない一方で、Ｇａ　Ｉ　ａｌ、３−ＧＴ　（ウシ、３０４ −３０９）に対する通常のへキサペプチド　ＫＤＫＫＮＤ　やＧｌｃＮＡｃ　β １，４−ＧＴ（ウシ、ヒト、ネズミのアミノ酸３４６−３５１）はある。（Ｊｏ ｚｉａｓｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２６４．　１４２ ９０−１４２９７　［１９８９コ）。

シアル酸は、糖タンパク質や糖脂質に存在する炭水化物基中の末端の糖であり、 動物組織に・広く分布している（Ｍｏｍｏｌ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、ＪＢｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　２６１．１６２７０−１６２７３　［１９８６コ）。シアル酸 は、炭水化物の末端部にあるため、その構造の生物学的機能に重要な役割を担っ ている。例えば、シアル酸は、インフルエンザウィルスの宿主細胞への結合を担 うリガンドとして機能している（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，、Ｔｈｅ」想狙 已旦翻、Ｖｏ１．２．　Ｃｏｎｎ、　Ｐ、Ｍ、、ｅｄ、、　ｐｐ、１３１−２１ ９．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　［１９８５］）。シアル酸リンケージに おける変化さえも、宿主特異性を変えるに充分である（Ｒｏｇｅｒ、　Ｇ、Ｎ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０４．７６−７８　［１９８３］）。神経 細胞接着分子（Ｎ　ＣＡ　Ｍ）は、神経系の発生においてＮＣＡｍに媒介された 細胞接着を修飾すると信じられている、発生学的に調節されているポリシアリル 化の対象物である（Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、　Ｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４０．５３−３７　［１９８８］　ａｎｄ　Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅ ｒ、　Ｕ、。

Ａｄｖ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｂｉｏｌ、　２６５．１７９−１８　［１９９ ０コ）。最近、炭水化物の構造である、シアリルルイスＸ（ＳＬｅ・）は、好中 球の活性化内皮細胞に対する結合を媒介する内皮細胞白血球接着分子（“Ｅ−８ ｅＩｅｃｔｉｎ”）のリガンドとして機能することが解明されてきている（Ｌｏ ｗｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０；　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ９０；　Ｇｏｅｌｚ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９０；　Ｗａｌｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０：　Ｂｒａｎｄｌｅｙ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９９０）。　Ｐ−セレクチン（外側の膜タンパク質、すなわちＣ Ｄ６２である血小板活性化依存的顆粒）は、セレクチンファミリーのもう一つの メンバーであり、また単球やＰＭＮｓに存在するＳＬｅ・を認識することが開示 されている（Ｌａｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７．６６７４−６６７８　［１９９０］；　Ｍｏｍ ｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１．１６２７０− １６２７３［１９８６コ；　Ｐｏ１ｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８．　６６２４−６６２８　［１９９１］；　 Ｃｈａｎ、　Ｋ、Ｆ、Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３．５６８ −５７４　［１９８８］；　Ｂｅｙｅｒ、Ｔ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｄｖ、Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、、５２．　２３−１７５　［１９８１コ、）。　両方の例において 、シアル酸は、リガンドとして機能する炭水化物構造にとって鍵となる物である 。細胞接着における役割に加えて、炭水化物構造を含んだシアル酸は、分化にお いて直接的な役割を担うことも示されつつある。造血細胞系ＨＬ−６０は、糖脂 質Ｇｊ１３の処理によって分化が誘発されうる。ガングリオシドもまた、細胞周 期の調節や成長因子−タンパク質キナーゼ活性の調節において役割を担っている と考えられている。

一つのそのようなシアリルトランスフェラーゼは、米国特許明細書５，０４７， ３３５に記載されているように、精製されている。

”精製された”シアリルトランスフェラーゼのうちの大部分が利用されている一 方で、それ谷は、ゴルジ装置や小胞体の膜結合タンパク質であるため、きわめて 少量のみが利用されているにすぎない。

これらシアリルトランスフェラーゼを精製するための経済的もしくは労力の多大 なコストは、それらの不足を生じさせる。シアリルトランスフェラーゼをコード するＤＮＡを単離し、そして哺乳類、特にヒトのシアリルトランスフェラーゼの 実用的な量を組換えＤＮＡ技術を用いて生産することが本発明の目的である。他 の種や色々な組織からシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーの他のメン バーをコードするＤＮＡを得る手段を提供することも更なる目的の一つである。

シアリルトランスフェラーゼの新規な形態を調整することも、本発明の一つの更 なる目的である。ある炭水化物基土でシアル酸の末端部位への転移を触媒する改 良方法を提供することは、ここになおもう一つの目的となる。これらのそして他 の本発明の目的は、全体として明細書から明かとなるだろう。

発　明　の　背　景 本発明の目的は、以下のことからなる方法によって達成される。

つまり、ブタＧａｌβ１．　３ＧａｌＮＡｃ　ａ２．　３−シアリルトランスフ ェラーゼやラット　Ｇａｌβ１，３　（４）−Ｇｌ　ｃＮＡｃα２，３シアリル トランスフエラーゼ（Ｇａｌβ１，４Ｇ’１ｃＮＡＣα２，６シアリルトランス フエラーゼとは異なる）のみならず哺乳類のシアリルトランスフェラーゼ（後に この中で定義される）をコードする遺伝子のクローニングと同定をすること、組 換えＤＮＡベクターにその遺伝子を組み入れること、その遺伝子を持ったベクタ ーを適当な宿主にトランスフォーミングすること、そのような宿主で哺乳類のシ アリルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させること、そして産生された哺乳類の シアリルトランスフェラーゼを回収することである。これに代えて、色々な他の 組換え技術を、シアリルトランスフェラーゼの発現を得るために使うことができ るかもしれない。同様に、本発明は、そのようなシアリルトランスフェラーゼを 産生ずる方法を提供することに加えて、哺乳類のシアリルトランスフェラーゼや その誘導体を組換え技術によって産生ずることを可能にする。シアリルトランス フェラーゼは、豊富にないタンパク質であり精製するのが難しい。シアリルトラ ンスフェラーゼ遺伝子の単離や同定は、極端に難しい。ｍＲＮＡは稀であり、細 胞系やｍＲＮＡの大量の他のソースは、利用できない。本発明は、はじめて、酵 素の触媒領域の相同性の保存された領域によって定義されたシアリルトランスフ ェラーゼ遺伝子ファミリーを構築した。本発明は、以下のことを含む組換えＤＮ Ａ技術を介して哺乳類のシアリルトランスフェラーゼを産生ずる構成と方法を提 供している。すなわち、１）酵素の完全なりＮＡ配列とそれの５°側の隣接した 領域の発見と同定；　２）＠乳類のシアリルトランスフェラーゼタンパク質、そ れにそのなかの融合体やシグナルＮ−末端コンジュゲートの発現を可能にするよ うな、前記ＤＮＡからなる発現ベクターとクローニングの構築；そして３）遺伝 子的に哺乳類のシアリルトランスフェラーゼの産生を可能にし、かつそのような ベクター含む効能によって変わるような、胎児細胞培養や他の発現系や他の発現 系である。本発明は、さらに哺乳類のシアリルトランスフェラーゼの細胞産生を コードするＤＮＡを産生ずる構成と方法を指向している。また、本発明のもう一 つの側面は、新しい化合物、すなわちシアリルトランスフェラーゼを発現させう るクローンを得る際に利用されるデオキシリボヌクレオチドやりボヌクレオチド である。さらに本発明のもう一つの側面は、シアリルトランスフェラーゼが血液 や組織に典型的に見いだされる時に共存するような、自然に出て来る全ての物質 が本質的に除去されたシアリルトランスフェラーゼそのものである。例えば、組 換え手法によって産生されたシアリルトランスフェラーゼは、ｉｎ　ｖｉｖｏの 生理学的環境中に典型的に見られる共雑物を全く含まないだろう。加えて、産生 の方法に依存して、このなかのシアリルトランスフェラーゼは、例えば血液や組 織のような土１ｖｉｖｏの生理学的環境から得られるものと多かれ少なかれ比較 されるような、一連のグリコシレージョンを含んでいるだろう。本発明は、更に 新規のシアリルトランスフェラーゼ誘導体、特にシアリルトランスフェラーゼア ミノ末端残基を欠いた誘導体を指向している。例えば、シアリルトランスフェラ ーゼ膜貫通領域やステム領域を構成する疎水的Ｎ−末端シグナル−アンカー配列 や短いＮ　Ｈ２細胞質領域を欠く誘導体である。

本発明の哺乳類のシアリルトランスフェラーゼやその誘導体は、糖タンパク質や 糖脂質にある炭水化物基土へのシアル酸の付加に利用できる。加えて、シアリル トランスフェラーゼやその誘導体は、生物学的認識において決定基として機能す る炭水化物を作るために、シアル酸を糖鎖に付加することによって酵素的に利用 できる。そのようなシアリルトランスフェラーゼ酵素は、オリゴ糖や誘導体の合 成のための多重酵素系に使われるかもしれない（Ｉｃｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ 、。

Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ　↓１３．　４６９８　［１９９１コ　ａｎｄ　Ｉ ｃｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｒｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ　旦３，６ ３００［１９９１コ）。最終的に、本発明のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子 をコードしているＤ　Ｎ　Ａ、特に触媒領域の相同性の保存された領域は、シア リルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーの他のメンバーをコードしている遺伝 子をクローニングする方法を提供する際に利用される。シアリルトランスフェラ ーゼをコードするＤＮＡやシアリルトランスフェラーゼの他の利用は、これらの 当業者にとって明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図には、ブタのＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ　ａ２，３−シアリルトランス フェラーゼ（”α２，３−０”）の核酸配列とアミノ酸配列が示されている。ブ タα２，３−ＯｍＲＮＡの核酸配列は、λＳＴ１とλＳＴ２という二つのオーバ ーラッピングしたクローンのＤＮＡ配列解析から決定されｔも　示されたα２， ３−０　ポ、リベブチトのアミノ酸は、ＤＮＡ配列の上に示されており、類似の 精製されたタンパク質のＮ−末端の残基最初のがら数えられている。

提案されるシグナル−アンカー配列は、差し示されている（枠）。

Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列を持つ強力なグリコシレージョン部位は、星印（＊）に よって示されている。その配列は、クローンλＳＴＩとλＳＴ２をオーバーラッ ピングすることによってコードした、α２．３−シアリルトランスフェラーゼの 長い形に一致している。

第２図には、ラットのＧａｌβ１，３　（４）ＧＩｃＮＡｃ　ａ２゜３−シアリ ルトランスフェラーゼ（”α２，３−Ｎ”）の核酸配列とアミノ酸配列か示され ている。ラットα２，３　ｍＲＮＡの核酸配列は、ＤＮＡ配列解析から決定され た。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドの差し示されたアミノ酸は、ＤＮ Ａ配列の上に示されており、Ｎ−末端のタンパク質配列決定によって決められた ように、成熟タンパク質の最初の残基がら数えられている。

第３図には、ＣＤＰ−ヘキサノールアミン　アガロース（ＫＣＩにより溶出）で のα２，３−０　シアリルトランスフェラーゼの精製結果が示されている。２ｋ ｇのブタ肝臓がらのポモジエネートが、ＣＤＰ−ヘキサノールアミン　アガロー ス　カラムにロードさ札ＫＣＩを直線的勾配で変化させて溶出された（実験手順 を見よ）。

タンパク質濃度や受容体としてラクトースを用いたシアリルトランスフェラーゼ 活性は、個別のフラクションで決定された。酵素活性の二つのピークが、図示さ れているようにブールＡとブールＢに分離され九 第４図には、ＣＤＰ−ヘキサノールアミン　アガロース　でのα２．３−０　シ アリルトランスフェラーゼの精製（カラムＩＩＩ、基質アンチフリーズ　糖タン パク質（Ａ　Ｆ　Ｇ　Ｐ）を用いて決定された。カラムから得られた酵素活性の あるＡとＢのエリューションは、４８　ＫＤ　ａと４５ＫＤａのタンパク質種と それぞれ明らかに一致した（挿入１ｍ　５ＤＳ−ＰＡＧＥを見よ）。これら二つ の種、すなわちα２，３−シアリルトランスフェラーゼのフオームＡとフオーム Ｂは、８−１０ｕｎ　ｉ　ｔ／ｍｇタンパク質という特異的活性を持っていた。

その４８　ＫＤ　ａや４５ＫＤａ種は、ＰＶＤＦ膜にプロットさね、ＮＨ２−末 端の配列決定により解析された。

第５図には、４８ＫＤａと４５ＫＤａのａ２．３−０シアリルトランスフエラー セペプチドのＮ　Ｈ２−末端アミノ酸配列が示されている。推定されるシグナル −アンカー領域からなる、４８ＫＤａペプチドのＮ　Ｈ２−末端部近くの１６個 の疎水性アミノ酸に下線が施しである。

第６図には、二つのα２，３−０シアリルトランスフエラーゼＣＤＮＡクローン の制限酵素地図と配列決定手段について示されている。

第７図には、二つのシアリルトランスフェラーゼのドメイン構造と相同領域の比 較について示されている。

Ａ：　α２，６−シアリルトランスフェラーゼとα２，３−０−シアリルトラン スフェラーゼの一次構造の配列は、６４％の配列アイデンティティ−と８４％の 配列シミラリティーをもつ４５個のアミノ酸領域を明らかにしている。

Ｂ：相同性のある領域が、α２，６−シアリルトランスフェラーゼのエクソン２ と３の間の結合部に広がっており、両酵素の触媒領域内にある。

第８図には、可溶性の触媒的に活性なα２，３−０−シアリルトランスフェラー ゼの発現について示されている。

Ａ：　α−２，３−０−シアリルトランスフェラーゼの可溶性フオームの発現を 指向しているｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ、すなわち５ｐ−ＳＴは、野生型シアリルトランス フェラーゼ細胞質領域とシグナル−アンカー領域をインスリンシグナルペプチド で置き換えることによって構築された。つまり、５ｐ−３Ｔは、宿主細胞にトラ ンスフェクトされた時に、３８ＫＤａの分泌タンパク質種をコードすることを予 想された。

Ｂ：５ｐ−３Ｔは、発現ヘクターｐＳＶＬに挿入さね、ＣＯ５−１細胞にトラン スフェクトされる。つまり、トランスフェクション後４８時間に、細胞は、Ｔｒ ａｎ３５Ｓ−ラベルを含んだ培地で２時間パルスラベルさね、さらにラベルのな い培地で５時間チェイスされ總　この培地は、集められ１５倍に濃縮さね、そし て５ＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーで解析された。５ｐ−３Ｔとｍｏｃｋ トランスフェクトされた細胞培地の二っののサンプルについて、解析が行われた 。

Ｃ：　ｃｏｓ−ｉ細胞は、７Ｂのように固有の方法でリポフエクチン（＋５ｐ− ３Ｔ）またはりポフェクチン単独（ｍｏｃｋ）によってトランスフェクトされた 。つまり、トランスフェクト後４８時間たった時点で培地が集められて、１５倍 に濃縮さね、そして特異的受容体基質ＡＦＧＰを用いたシアリルトランスフェラ ーゼ活性の定量が行われた（Ａｓｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．４４３４−４４４３　［１９７９コ）。

第９図には、Ｇａｌ　α２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼ酵素の最も長 い配列決定されたトリプシンで切断されたペプチドのＣＩＤスペクトルが示され ている。ペプチド配列は、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ− Ａｓｐ−３ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉ　ｓ−Ｃｙ　ｓ’−Ａ　ｒ　ｇ、ＭＭＣｌ　２ ８３．　６である。ｃｙｓ゛は、カルボキシメチル　システィンを表している。

Ｎ−末端部におけるチャージリテンションをもつイオンは、ａ、ｂ、ｃイオンと してラベルさね、Ｃ−末端のイオンは、ｘ、ｙ、Ｚフラグメントとされる（Ｂｉ ｅｍａｎｎ、　Ｋ、　（１９９０）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、出８８６− ８８７参照）。最初のイオン（ａ、Ｘ）は、α−炭素とカルボニル基の間の開裂 生成物である。

イオンｙとｂは、ペプチドが開裂した時に形成される。イオンＣと２は、アミノ 基とα炭素との間での開裂に起因して生じる。これらのフラグメントのナンバー リングは、たいてい各々の末端部がら始められる。側鎖の断片化は、いわゆるｄ 　（Ｎ−末端）やｗ（Ｃ−末端）イオンを生成するように、アミノ酸のβとγ炭 素の間でおこる。

観測されるフラグメントイオンは、表に示されている。同じイオン系列を含むイ オンは、横方向にリストされている。

第１０図には、Ｇａｌα２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼ酵素のカルバ モイル化されたトリプシンで切断されたペプチドのＣＩＤスペクトルが示されて いる。ペプチド配列は、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅ　ｒ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｒｏ−Ｖａ 　Ｉ−Ｌｙｓ、ＭＨ”　＝７７１゜４である。断片化は、明らかにリジン残基の εアミノ基での修飾ではなく、Ｎ−末端部での修飾をしめしている。ｍ／ｚ　６ ６９　（ｗ７）での大量のイオンは、このペプチドにおけるＮ−末端ロイシンの 存在を確実にする。星印でラベルされたイオンは、マトリックス関連のバックグ ラウンドイオンである（Ｆａｌｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　肋飢ｄ　 Ｃｏ＋ｎｏ＋ｕｎ、　Ｍａｓｓ　Ｓ　ｅｃｔｒｏｍ、　４：３１８）。観測され るフラグメントイオンが、表に示されている。同じイオン系列に属すイオンは、 横方向にリストされている。

第１１図には、先にクローンされたシアリルトランスフェラーゼによってＧａｌ β１．　３　（４）ＧＩｃＮＡｃ　β２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｓ ７３Ｎ）から誘導されたペプチド１や１１の配列が示されている。Ｇａｌβ１， ４ＧＩＣＮＡＣ（ＩＥ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｎ）やＧ ａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ　（ＳＴ３ ０）は、白いバーで示されている。白いボックスは、シグナル−アンカー配列を 示している。ハツチングの施されたボックスは、二つのシアリルトランスフェラ ーゼ間で同定された相同性のある領域を示している。

第１２図には、三つのクローンされたシアリルトランスフェラーゼによって共有 される保存された領域が示されている。三つのクローンされたシアリルトランス フェラーゼは、ラットのＧａｌβ１゜３　（４）Ｇｌ　ｃＮＡｃα−２，３−シ アリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｎ）、ブタのＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ　 ａ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３０）、それにラットのＧａｌ β１．４ＧｌｃＮＡｃ　α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｎ） である。その領域は、Ｇａｌβ１，３　（４）ＧｌｃＮＡｃａ−２，３−シアリ ルトランスフェラーゼ（Ｓ　Ｔ　３　Ｎ）の１５６残基から２１０残基にわたる ５５個のアミノ酸からなる。アミノ酸の相同性の保持された部分は、箱で囲んで 示されている。

第１３図には、増幅されたフラグメントであるＳＭｌの指し示されたアミノ酸配 列について、及び先に特徴づけされた相同性の保存された領域との比較について 示されている。相同性のコンセンサスな保存された領域は、増幅されたフラグメ ントＳＭ１とクローン化され特徴づけされたシアリルトランスフェラーゼの相同 性の保存された領域との比較から明らかされた。相同性の保存された領域の５０ ％以上のアミノ酸の存在性が、より下側のケースに見られると、その不変のアミ ノ酸は、より上側のケースの文字で示されている。

ｒやｑが見られる所は、ｂによって示されている。ｉまたは■の場所は、Ｘによ って示されている。下線を引いたアミノ酸は、縮重したプライマーのデザインに 使われる領域を表している。増幅したフラグメントに見られる先に不変としたア ミノ酸の変化は、星印によってしるされている。

第１４図には、ヌクレオチドと５ＴＸＩの指し示されたアミノ酸配列が示されて いる。最も長いオーブンリーディングフレームの示されたアミノ酸配夕ＩＫ　つ まり相同性ＳＭＩ　（アミノ酸１５４−２０８）の保存された領域は、影のつい たボックスで区別されている、をコードしている。提案されたシグナル−アンカ ー（アミノ酸８−２３）配列は、ボックスで囲んであり、強力なＮ−結合したグ リコシレージョン部位には下線を施しである。

詳　細　な　説　明 ここで扱われているシアリルトランスフェラーゼやその誘導体は、活性部位に相 同性を持ち、糖タンパク質や糖脂質、オリゴ糖類等の糖鎖末端にシアル酸を転移 する酵素活性を持つラットのＧａｌβ１．４Ｇ　ｌ　ｃＮＡｃ　α−２，６−シ アリルトランスフェラーゼ以外のシアリルトランスフェラーゼ酵素に関連してい る。酵素学的に機能的なシアリルトランスフェラーゼの例を挙げると、ＣＭＰ− シアル酸から受容体であるオリゴ糖にシアル酸を転移する能力を持つ。そこで、 オリゴ糖受容体は特別なシアリルトランスフェラーゼに依存して変化する。

”相同性が保存された領域”とは、２つのシアリルトランスフェラーゼのアミノ 酸配列を比較した際に、一方の酵素のアミノ酸配列と他方の酵素の同じ位置のア ミノ酸配列とが本質的に同一である領域のことである。この発明ではシアリルト ランスフェラーゼ遺伝子ファミリー内で、相同性が保存された領域が活性部位に あり、第２図で言えば１５６〜２１０残基、第１図で言えば１４２〜１９６残基 を持つタンパク質的の、少なくとも約７個の一連のアミノ酸、むしろ少なくとも 約２０個の一連のアミノ酸、さらに贅沢を言えば少なくとも約５５個のアミノ酸 を示す。相同性が保存された領域を同定することにより、保存領域のアミノ酸配 列の変異体は作られ、それらは置換、挿入、欠損のうちで１つまたは複数に当て はまるだろう。これらの変異体は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤ ＮＡ内で部位特異性の突然変異生成ヌクレオチドによって形成される。その方法 を用いて、相同性のある変異体の保存領域を持つシアリルトランスフェラーゼを コードするＤＮＡが作られる。

例えば、しばしば複雑なＮ−結合オリゴ糖を終結させるＮｅｕＮＡｃ　β２．　 ３Ｇａｌβ１，３ＧＩｃＮＡｃとＮ　ｅ　ｕ　Ａ　ｃ　ａ　２．　３Ｇａｌβ１ ，４ＧＩｃＮＡｃ配列を形成するラットのＧａｌβ１゜３　（４）Ｇｌ　ｃＮＡ ｃ　ａ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ここでは”α２，３−Ｎ”とい うこととする）もまた、シアリルトランスフェラーゼ領域に含まれる。シアリル トランスフェラーゼ領域に含まれる酵素のもう１つの例は、スレオニンやセリン と同様に、あるガングリオシドの末端に〇−結合する糖鎖にみられるＮｅｕＡｃ ａ２，３Ｇａｌβ１．３ＧａｌＮＡｃを形成するブタのＧａ１β１．　３Ｇａｌ ＮＡｃ　ａ−２，３−シアリルトランスフェラーゼである（ここでは”α２，３ −０”ということとする）。

ここで用いられるシアリルトランスフェラーゼの範囲内に含まれるものを、以下 にリストアツブした。グリコシレージョン機能とアミノ酸配列を持つシアリルト ランスフェラーゼはもちろんのこと、第１図、第２図にあるラットとブタのシア リルトランスフェラーゼや、ウシやヒト等の他の哺乳類由来の類似のシアリルト ランスフェラーゼ、または他の組織由来のもの、さらにそのようなシアリルトラ ンスフェラーゼの脱グリコシレージョンまたはグリコシレージョンされていない 誘導体、シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異体、シアリルトランス フェラーゼのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　条件下での電子対を共有する誘導体、等である 。シアリルトランスフェラーゼのこれら全ての形態は、相同性が保存された領域 を含み、酵素とじての機能を持ち、活性のあるシアリルトランスフェラーゼとし て共通の抗原決定基を少なくとも１つ共有している。

シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異体は、置換、挿入、欠損のうち の１つまたは複数に当てはまる。これら変異体は通常、シアリルトランスフェラ ーゼをコードするＤＮＡ内でのヌクレオチドの部位特異的な突然変異生成によっ て作られ、そのため、変異体をコードするＤＮＡを作成し、その後組換えた培養 細胞内でＤＮＡを発現させる。しかし、約１００〜１５０の残基をもつシアリル トランスフェラーゼフラグメントは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成に便利である。アミ ノ酸配列変異体は、その変異の予定された性質によって特徴づけられる。その特 徴とは、シアリルトランスフェラーゼアミノ酸配列の対立遺伝子、または種間変 異を生じさせないことである。

相同性が保存された領域内での変異体は、一般的には自然発生したアナログとし て量的には同じ生物学的な活性を示す。

アミノ酸配列を誘導する部位が予想される一方で、突然変異それ自体が予想され る必要のないものである。例えば、与えられた部位で効果的に突然変異を起こす ために、ランダムな突然変異生成がターゲットとなるコドンや領域で計画さね、 発現されたシアリルトランスフェラーゼ変異体は必要な活性が最良な組合せで起 きているかどうか審査される。既知の配列を持つＤＮＡの目的とする部位に置換 突然変異を起こす技術は広く知られており、例えばＭ１３プライマー突然変異生 成やＰＣＲに基づく突然変異生成がある。

アミノ酸置換は単一の塩基で起こすのが一般的である。挿入は通常１〜１０個の アミノ酸残基で行なわれる。欠損は１〜３０残基の範囲で起きることが多い。欠 損や挿入は、近接したペアで起こすことが好ましい。すなオ〕ち、２残基の欠損 や２残基の挿入である。置換や欠ｉＬ　挿入、またはそれらのどんな組合せも、 最終的にはその構造に影響を及ぼす。明らかに、変異体シアリルトランスフェラ ーゼをコードするＤＮＡ内で起きた突然変異は、その配列を翻訳できる領域外に できないし、２次的なｍ　ＲＮ　Ａ構造を作成可能な相補的領域を創造できない （ＥＰ　７５，４４４Ａ）。

置換による変異体は、第１図や第２図の配列内で少なくとも１つの残基が除去さ ね、同じ場所に異なる残基が挿入されたものである。

一般にその置換は、シアリルトランスフェラーゼの特徴を高度に調整することが 必要なとき、以下の第１表に従ってなされる。

第　１　表 Ａｓｎ　ｇｉｎ；　ｈｉｓ Ｇｉｎ　ａｓｎ ｃｒｙ　ｐｒ。

Ｈｉｓ　ａｓｎ；　ｇｌｎ Ｉ　Ｉｅ　ｌｅｕ；　ｖａｌ Ｌｅｕ　ｉ　Ｉｅ；　ｖａｌ Ｌｙｓ　ａｒｇ；　ｇｌｎ；　ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｉｅｕ；１ｌｅ Ｐｈｅ　ｍｅｔ；　ｌｅｕ；　ｔｙｒ Ｓｅｒ　ｔｈｒ Ｔｈｒ　ｓｅｒ 機能面または免疫学的同一性に関して置換変化は、第１表に示しである変化より 保守的ではないような置換を選ぶこと、すなわち（ａ）置換により影響が及ぶポ リペプチドの背骨の構造、例えばシート構造や螺旋構ｈ　（ｂ）ターゲット部位 の電価や疎水性、　（Ｃ）側鎖の容積をがらりと変えるような残基を選ぶことに よって行われる。一般的にシアリルトランスフェラーゼの性質を著しく変化する ことを期待して行う置換は、　（ａ）親水性残基、すなわちセリンやスレオニン を疎水性残基、つまりロイシス　イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ア ラニンに変えること（または逆の変化）、（ｂ）システィンやプロリンを他の残 基に変えること（または逆の変化）、　（Ｃ）圧電価を帯びた側鎖を持っ残基、 すなわちリリジスアルギニン、ヒスチジンを負電価を帯びた残基、つまりグルタ ミンやアスパラギンに変えること（または逆の変化）、　（ｄ）かなりの空間を 占める残基であるフェニルアラニンをグリシンという側鎖のない残基に変えるこ と（または逆の変化）である。

置換または欠損変異体の変化は、主にシアリルトランスフェラーゼの膜貫通また は細胞質領域を含んでいる。シアリルトランスフェラーゼの細胞質領域は、第１ 図と第２図で示されている開始コドン以下およそ１１個の付加的な残基を含むア ミノ酸配列である。ラットでは１０〜２８残基、ブタでは１２〜２７残基が、そ れぞれ転移終結配列として機能すると信じられている。ラットとブタではｐｈｅ −Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−ＡｓｎとＰ　ｒ　ｏ−Ｍｅ　ｔ　−Ａ　ｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ 　−Ｌｙｓ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓという配列によッテ導かれてい る曲がった構造と、これらの残基の圧電価が協調して、後述する膜貫通領域でシ アリルトランスフェラーゼが膜を通過するのではなく、ちょうど貫通して止まる 役割を果たす。

シアリルトランスフェラーゼの膜貫通領域は、ブタの配列では約１２〜２７残基 （第２図に示しであるようにアラニンは＋１）に位置する。ラットでも類似の位 置にある。この領域は、細胞膜の脂質２重層に対して適当な大きさで、かなり疎 水性の領域である。ゴルジ体や小胞体内のシアリルトランスフェラーゼをアンカ ーし、細胞質領域に機能すると信じられている。

細胞質と細胞膜領域の一方または両方の欠損や置換は、細胞内又は膜脂質親和性 を減少させたり、水への溶解度を変化させることによって、組換えシアリルトラ ンスフェラーゼの回収を容易にする。

そのため、水溶液中のシアリルトランスフェラーゼ維持に可溶化剤は必要ない。

　（参考：米国特許明細書第５，０３２，５１９号に記載の、可溶化β−ガアク トシデースα２の生産、この中で特別に取り入れられたＧ−シアリルトランスフ ェラーゼ）　膜貫通領域を保存したままで細胞質領域のみを欠損すると、可溶化 剤に可溶なシアリルトランスフェラーゼを生産する。細胞質領域欠損シアリルト ランスフェラーゼは、膜に進入し易くなり、その酵素活性をターゲツトにするこ とが可能になる。細胞質領域や膜貫通領域は、　（例えば、ラットα−２，３− シアリルトランスフェラーゼでは可溶なシアリルトランスフェラーゼを生成する 目的で転移終結配列であるアミノ酸１から３３を）置換するよりはむしろ、除去 されていることか好ましい。

細胞質または膜貫通（Ｃ−Ｔ）欠損及び置換シアリルトランスフェラーゼは、シ グナル配夕＋ｌ　それも宿主類似シグナルの融合として、組換え培養細胞用いて 直接的に合成された。例えば、原核細胞発現ベクターを構築して、そのＣ−Ｔ領 域がバクテリア由来アルカリフォスファターゼやＩ　ｐｐ、耐熱性エンタートキ シン■リーダーのために除去さね、酵母ではその領域は酵母の転化酵素やα因子 、燐酸化酵素リーダーによって置換された。哺乳類由来細胞での発現を見ると、 Ｃ−Ｔ領域は哺乳類細胞に感染するウィルス性分泌リーダー、例えばヘルペス単 −ｇＤシグナルによって置換される。分泌リーダーが宿主によって認識されると き、宿主のシグナルペプチダーゼは、Ｃ−Ｔ欠損シアリルトランスフェラーゼと Ｃ末端で融合したリーダーポリペプチドの融合を分割できる。Ｃ−Ｔ欠損シアリ ルトランスフェラーゼの利点は、培地内に分泌されることができることである。

この変異体は水に可溶で、細胞膜脂質に感知できるほど親和性がなく、組換え培 養細胞から容易に回収できる。

可溶化剤を添加することは、例えば非イオン性だとしても、膜結合配列を持つタ ンパク質の可溶（Ｌ　安定イヒ　生物学的活性を増加させることに役立つ。例え ば、デオキシコール酸は最適な可溶化剤であるし、ツイーン、ＮＰ−４０、トラ イトンＸ−１００や他の可溶化剤も用いることができる。可溶化剤の選択は、特 別な周囲の状態と関係するポリペプチドの性質に基づく現場の判断に従って決定 される。

置換や欠損の突然変異生成は、Ｎ−または〇−結結合グリコリレーション部位除 去する役割も果たす。グリコシレージョンされていないシアリルトランスフェラ ーゼは、組換え原核細胞で産生される。

システィンや他の不安定な残基の欠損もまた望ましいもので、例えばシアリルト ランスフェラーゼの酸化安定性を増加させる。タンパク質分解部位、すなわちＡ ｒｇ−Ａｒｇのような２塩基性残基での欠損や置換は、塩基性残基の１つを欠損 したり、１つをグルタミンかヒスチジン残基に置換することで完了する。

挿入によって作られたシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異体は、タ ーゲットとなるシアリルトランスフェラーゼに、１つかそれ以上のアミノ酸残基 を予め決められた部位に挿入することで得られる。一般的には、挿入により作ら れた変異体は、異種のタンパク質を融合したもの力＼　あるいはシアリルトラン スフェラーゼのアミノ末端またはカルボキシル末端にポリペプチドを融合したも のである。

シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、ラットとブタ以外の材料か ら、ａ）ある特定の動物の肝臓や顎下腺などの様々な組織由来のＣＤＮＡライブ ラリー、ｂ）相同な配列を含むＣＤＮＡライブラリー内のクローンの検出を目的 に、シアリルトランスフェラーゼやそのフラグメント（通常３０ｂｐ以上）の相 同性保存領域をコードする、ラベルしたＤＮＡによるハイブリダイゼーション解 析、Ｃ）そのクローンを完全な長さのクローン同定に酵素断片解析や核酸配列に よって解析する。もし、完全な長さのクローンがＣＤＮＡライブラリーに存在し なかった場合、適切なフラグメントを様々なりローンから回収し、それらクロー ンに共通な制限酵素部位でつなぎあわせて、完全な長さのクローンを構築する。

例えばシアリルトランスフェラーゼが抽出や精製によって血液や組織から得られ る時に、この発明によって産生されたシアリルトランスフェラーゼの状況を記述 する際に”本質的に・・・・・・から自由”または”本質的に純粋”という表現 は、ｉｎ　ｖｉｖｏでそれが生ずる生理的環境においてタンパク質またはシアリ ルトランスフェラーゼに関係する他の物質が全く無いということである。現在こ の発明の方法で産生じたシアリルトランスフェラーゼか、全タンパク質量の９５ ％力＼　それ以上を含み、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上に（クマシーブル ー染色で）単一のバンドを形成し、少なくとも５００ｎｍｏｌｅ／ｍｇ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ／ｍｉｎの活性を持つ。

この文章内で用いられる”実質的類似性”や”実質的同一性”という用語は、ポ リペプチド配列や核酸配列の特徴を示している。つまり、ポリペプチド配列が、 参照となる配列と比較して少なくとも７０％以上の相同性を持ち、核酸配列が、 参照となる配列と少なくとも８０％以上の相同性を持つことである。配列同一性 の割合は、参照となる配列全体の３５％以下の欠損や付加を含めて計算される。

参照となる配列が、第１図及び第２図で示されているように、より大きな配列の 一部分であるケースもある。しかし、参照となるその配列は、ポリヌクレオチド の場合では少なくとも１８ヌクレオチド、ポリペプチドの場合では少なくとも６ アミノ酸残基がなくてはならない。

一般に、原核生物は、この発明で用いられるベクターを構築するＤＮＡ配列のク ローニングに用いられる。例えｉｆ、Ｅ、　ｃｏｌｉＫ１２株２９４　（ＡＴＣ ＣＮｏ、　３１４４６）はかなり使いやすい。他の細菌株では、Ｅ、ｃｏｌｉＢ やＥ、ｃｏ　ｌ　ｉ　Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１５３７）がある。こ れらのいくつかは、制限なく使わわ、実証されている。

原核生物は遺伝子発現にも用いられている。前述の細菌株の（ＬＥ　ｃｏｌｉ　 Ｗ３１１０（Ｆ−λ＼原核細胞、ＡＴＴＣＮｏ、　２７３２５）、バチルスサブ チルス、サルモネラチフィムリウムやセラチアマルセカンスなどの他の腸内細菌 、様々なシュードモナス等が用いられる。

一般に、宿主細胞と両立できる種由来のプロモーターと制御配列を含むプラスミ ドベクターは、これらの宿主と同時に用いられる。

そのベクターは、通常、形質転換した細胞中で表現形によって選択することがで きるマーカー配列や複製部位を持っている。例えば、旦−ｃｏｌｉは、ｐ　Ｂ　 Ｒ，３２２を用いて、即ち旦−ｃｏｌｉ由来のプラスミドを用いて一般的には形 質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔユリ、、　Ｇｅｎｅ　２．、９５　［１９ ７７］）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性とテトラサイクリン耐性遺伝子を持 ち、形質転換された細胞を容易に検出できる。ｐＢＲ３２２プラスミドや他の細 菌用プラスミドは、組換えＤＮＡ構築に用いられるプロモーターや他の制御要素 を含むよう調整されてなければならない。

原核細胞形質転換に適するプロモーターは、β−ガラクタマーゼとラクトースの プロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７５．６１ ５［１９７６コ；　ａｎｄ　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２ ８１．　５４４　［１９７９コ）、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　。

Ｄ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、４．４０５７　［１９８０コ） 、ｔａｃプロモーター（ｄｅ　Ｂｏｅｒ、　Ｈ，、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　８０ ．２１−２５０９８３１）のようなハイブリッドプロモーターが実証されている 。しかし、他にも機能的なバクテリア用プロモーターがある。それらのヌクレオ チド配列は広く知られており、有能な技術者が必要などんな制限酵素部位でもシ アリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ　（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　？［１９８０］）をそれらとつなぐことは可能である。

バクテリアに用いられるプロモーターは、シアリルトランスフェラーゼをコード するＤＮＡにつなかれたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　（Ｓ、Ｄ、）配列を持 っている。

原核細胞の加えて、酵母のような真核細胞も用いられる。サツカロマイシスセレ ビシェや一般的なパン酵母は、もつとも頻繁に用いられる真核生物である。一方 、別な株も利用することができる。サツカロマイシスを用いた遺伝子発現には、 例えばプロモーターＹＲｂ　７　（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ　ｅｔ　ａユ、、Ｎａｔ ｕｒｅ　２８２．　３９　［１９７９コ；　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｇｅｎｅ　７．　１４１　［１９７９コ；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　ａｔ　ａ↓＝ 、Ｇｅｎｅ　１０．　１５７　［１９８０］）が一般的である。このプロモータ ーは、トリプトファンを含む培地内での増殖能を欠く酵母変異株を選択的に検出 するマーカーであるｔｒｐｌ遺伝子、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７６やＰＥＰ ４−１　（Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５．１２　［１９７７］）を既 に備えている。宿主である酵母細胞ゲノムの特色として、ｔｒｐｌ欠損株が、ト リプトファン欠乏下での増殖によって形質転換体を検出する際に効果的である。

宿主である酵母用の好適なプロモーター配列は、３−フオスフオグルコネートキ ナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２５５．２０７３　［１９８０］）や糖分解酵素（Ｈｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７．１４９　［１９６８コ；　ａｎ ｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７．４９００　［１９７ ８］）である、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、 ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシレース、フオスホフルクトキナーゼ、 グルコース−６＝燐酸イソメラーゼ、トリオセフオスフェートイソメラーゼ、フ オスフオグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼなどを含む。

他の酵母プロモーターは、増殖環境によって転写制御されるという付加的な利点 を持つ誘導性プロモーターであるが、アルコール脱水素酵素２やイソシトクロー ムＣ１アシッドフォスフェート、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオニス 　グリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、マルトースとガ ラクトース利用の関する酵素のプロモーター領域である。酵母での遺伝子発現に 好適なベクターとプロモーターは、Ｒ，Ｈｉｔｚｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　 Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　７３．６ ５７Ａに詳細に記載されている。

酵母のエンハンサ−もまた、酵母プロモーターと同時に好意的に利用される。

”制御領域”は、転写や翻訳のいずれかの制御に関する真核生物由来の遺伝子の ５′末端または３°末端に存在する特異的な配列に関係している。全ての真核生 物の遺伝子は、転写開始位置より２５〜３０ベース上流にＡＴリッチな領域を持 つ。多くの遺伝子は転写開始位置から７０〜８０ベース上流域にもう１つ別の配 列が観察される。それは、ＣＸＣＡＡＴ　（Ｘにはどんなヌクレオチドが入って もよい）である。はとんどの真核生物の遺伝子の３°末端には、転写されたｍＲ ＮＡにポリＡを付加するシグナルと考えられているＡＡＴＡＡＡ配列が存在する 。

哺乳類宿主細胞内でベクターからの転写を制御する好適なプロモーターは、さま ざまな源から得られた。例えば、ポリオマ、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０ ）、アデノウィルス、レトロウィルス、ヘバティティスーβウィルス、サイトメ ガロウィルスのようなウィルスゲノム、または異種の哺乳類プロモーター、すな わちベータアクチンプロモーターから得られた。ＳＶ４０ウィルスの初期および 後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウィルス起源の複製開始点をも含むＳＶ４０の 制限酵素フラグメントとして容易に得られた（Ｆｉｅｒｓｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ ｔｕｒｅ、　２７３．１１３　［１９７８コ）。ヒトのサイトメガロウィルス得 られた（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ、　Ｐ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　１８３５ ５−３６０　［１９８２］）。

もちろん、宿主細胞や近縁種からのプロモーターもまた、ここで用いられる。

高等真核生物によるエンケファキネースをコードするＤＮＡの転写は、ベクター にエンハンサ−を挿入することで増加する。エンハンサ−は、ＤＮＡのシス要素 で、通常１０〜３００ｂｐで、プロモーターに作用し転写を増加させる。エンハ ンサ−は、相対的な方向性があり、転写単位に対する５°　（Ｌａｉｍｉｎｓ、 　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　７８゜９９３　［１９８１］）と３’　（ Ｌｕｓｋｙ、　Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ、　 ３．、１１０８　［１９８３］）に位置し、それ自身をコードする配列中でイン トロン内にある（Ｏｓｂｏｒｎｅ、　Ｔ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　４．１２９３　［１９８４コ）。多くのエンハンサ−配列は 、哺乳類由来遺伝子（グロビス　エラスターゼ、アルブミス　α−フエトプロテ イス　インシュリン）から知られている。しかし、一般にエンハンサ−には真核 細胞ウィルス由来のものが用いられている。例えば、複製開始点の下流域あるＳ Ｖ４０エンハンサ−や、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサ−１ 複製開始点の下流にあるポリオマエンハンサー、アデノウィルスエンハンサ−で ある。

宿主である真核細胞（酵母、菌、昆虫、植物、動物、ヒト、他の多細胞生物との 凝集細胞）に使用する遺伝子発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与える転写 終結に必要な配列を持っている。これらの領域は、シアリルトランスフェラーゼ をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域内のポリＡ化された部分のように転写された 。哺乳類細胞に対する適切な選択的マーカーとして、例えばジハイドロフオレー トリダクテース（ＤＨＦＲ）、オルニチンデカルボキシレース、多様な薬剤に耐 性生物化学的マーカー、アデノシンデアミネース、アスパラギンシンセテース、 グルタミンシンセテース、チミジンキナーゼ、ネオマイシンなどがある。そのよ うな選択的マーカーが宿主である哺乳類由来細胞に転移が成功すると、形質転換 された細胞は選ばれた条件下でも生き残ることができる。計画的な選別に対して 、広く用いられる二つの異なったカテゴリーがある。最初のカテゴリーは、細胞 の代謝や、抗生物質を付加した培地での増殖能力を欠く突然変異細胞系に基づく ものである。中国産ハムスター卵巣由来Ｄ　ＨＦ　Ｒ−細胞とマウス由来ＬＴＫ −細胞がその例である。これらの細胞は、チミジンやハイポキサンチンのような 栄養素の存在なくしては増殖できない。それらの細胞はヌクレオチド合成系に必 要なある遺伝子を欠いており、失われているヌクレオチド合成系の回復なくして は生存できない。培地に追加する物質は、生来のＤＨＦＲ遺伝子やＴＫ遺伝子を それぞれの遺伝子を欠く細胞導入に必要なもので、これは増殖に必須である。Ｄ ＨＦＲ遺伝子やＴＫ遺伝子で形質転換されていないここの細胞は、添加されてい ない培地では生き残ることができない。

第２のカテゴリーは、優勢選択、つまりどんな細胞系を用いても計画的に選択す ることである。また、この方法は突然変異細胞系を必要としない。これらの計画 は一般的に宿主細胞の増殖を停止する薬物を用いる。珍奇な遺伝子を持つ細胞は 、薬物耐性の役割を果たすタンパク質を発現し、その選択条件下で生き残る。そ のような優勢選択の例は、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、　ａｎｄ　 Ｂｅｒｇ、　Ｐ、、　Ｊ、　Ｍ。

ｌｒｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　！、　３２７　［１９８２コ）マイコフ ェノリック酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、、　５ ｃｉｅｎｃｅ　２０９．１４２２　［１９８０］）、ハイグロマイシン（Ｓｕｇ ｄｅｎ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、互、　４１０ −４１３　［１９８５］）がある。上に挙げた３例は、それぞれ適切な薬剤であ るＧ４１８やネオマイシン（ゲンチシンＬ　ｘｇｐｔ　（マイコフェノリック酸 ん）、ハイグロマイシンに耐性を持っ真核細胞制御下で細菌遺伝子を実行する。

“増幅”は、細胞の染色体ＤＮＡ内の単離された領域の増加や複製に関係してい る。増幅は選択用薬剤にすなわちＤＨＰＲを不活化するメトトレキセート（ＭＴ Ｘ）を用いて達成される。ＤＨＦＲ遺伝子のたくさんのコピーの増幅や蓄積は、 多量なＭＴＸにもかかわらず産生される大量のＤＨＦＲに通じる。増幅圧は、培 地にＭＴＸを多量に付加することによって、内生的なりＨＦＲの存在にもかかわ らず作用される。必要な遺伝子の増幅は、必要なタンパク質をコードするＤＮＡ を持つプラスミドを宿主である哺乳類由来細胞に相互感染させることによって達 成される。また、相互導入によってＤＨＦＲや増幅した遺伝子が相互増幅に関係 する。この過程は、その細胞がより多くのＤＨＦＲを必要とし、その必要性が選 択した遺伝子の複製に一致し、更に多くのＭＴＸ濃度下で増殖可能な細胞のみを 選び出すことによって確実となる。目的とする異種のタンパク質をコードする遺 伝子が選択する遺伝子と相互に調節し合う限り、この遺伝子の複製はしばしば目 的とするタンパク質をコードする遺伝子の複製を生じさせる。その結果、異種タ ンパク質のコピーが増え、目的とする異種タンパク質をより多く産生ずる。

この発明において、高等真核生物においてシアリルトランスフェラーゼをコード するベクターの発現に関して好適な宿主細胞としては以下のものがある。ＳＶ４ ０により形質転換されたサル腎臓Ｃｖ１細胞系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ　 １６５１）、ヒト胚腎臓細胞系（２９３）　（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、　ｇｌ ｌＬ、　Ｊ、　Ｇｅｎ。ＶＬｒｏＬ、　３Ｇ、　５９　［１９７７コ）、稚ハム スター腎臓細胞（ＢＨＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）、中国産ハムスター卵巣細 胞ＤＩ（Ｆ　Ｒ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ、　ＰＮＡＳ　 （ＵＳＡ）　７７、４２１６　［１９８０］）、マウスセルトリ細胞（７Ｍ４． 　Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　２３．２４３− ２５１　［１９８０］）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣＩ　７０）、７ ７＋Ｊ７’７グリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ　１ ５８７）、ヒト子宮腫瘍細胞（ＨＥＬＡ、　ＡＴＣＣＣＣＩ　２）、イヌ腎臓細 胞（ＭＤＣＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バフアローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３ Ａ、　ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２）、ヒト肺細胞（１１３８，ＡＴＣＣＣＣＩ　 ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２．　）ＩＢ　８０６５）、マウス乳腺腫瘍 （ＭＭＴ　０６０５６２．’ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ 、　Ｊ、Ｆ’、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　３８３．４４−４６　［１９８２１）、ノくクロウィルス細胞。

１形質転換”とは生物にＤＮＡを導入して、ＤＮＡが複製し、染色体外に存在す る力＼　または染色体に組み入れられることである。

他で示されていないが、この発明で用いられている宿主細胞を形質転換する方法 は、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、　、　Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ　５２゜４５６−４５７　［１９７３］の方法である。しかし、核 注射や原形質融合のような方法によって細胞にＤＮＡを導入する他の方法もまた 用いられてきた。原核細胞や細胞壁構造を持つ細胞を用いるとき、トランスフェ クション即ち感染の最適な方法はＣｏｈｅｎ、　Ｆ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６９．’２１１０　［ １９７２コによって示された塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。

構築されたプラスミド内で正しい配列を確認する解析として、ライゲーション混 合物が旦−ｃｏｌｉ　Ｋ１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換する ために用いられ、アンピシリン耐性やテトラサイクリン耐性によりうまくゆく形 質転換体が選ばれた。形質転換体のプラスミドを調整し、制限酵素を用いたフラ グメント化により解析したり、Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｇ、　３０９　［１９８１］やＭａｘａｍ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５．４４９　［１ ９８０］の方法で配列を決定することで解析する。

宿主細胞は、この発明で発現ベクターにより形質転換さね、プロモーター活性を 誘導し、形質転換体を選び出し、遺伝子増幅（こ適切な従来の栄養組成の培地で 培養される。温度やｐＨのような培養条件は、発現のために選ばれて宿主細胞に 用いる既存の条件でよく、通常の技術で充分である。

”感染（トランスフェクション）”は、コドン配列力（実際の発現されているか どう力＼宿主細胞で遺伝子発現ベクター力（進入することである。トランスフェ クションについては多くの方法力（既１こ知られている。例えば、ＣａＰＯ４や エレクトロポレーション法である。

宿主細胞内でこのベクターが活動している証拠力（ある時、トランスフェクショ ンが成功したといえる。

以下の用例を理解するために、頻出の方法や用語力＜言己述されて０る。

“プラスミド“は、ｐに先行または後行する大文字と数字で８４寸けられている 。この発明で用いられている開始プラスミド′（マ、市販されているものか、ま たは制限酵素フラグメント以外でｉＪ用できるもの、出版された方法に従って利 用可能なブラスミド力・ら構築されたものである。付は加えて言うと、記載され たものと同価値のプラスミドも実際に知られており、通常の技術で使用できる。

ＤＮＡの“切断”は、ＤＮＡのある特定の配列を認識する制限酵素によるＤＮＡ の酵素による切断である。ここで用（為られた様々な制限酵素は、市販されてお り、その反応条件、補酵素、イ也の必要な物質は既知の条件下で充分である。解 析過程として（ま、１μｇのフ゛ラスミドやＤＮＡフラグメントは、通常的２０ μｍルソトルの緩！ｊ：夜中で約２ユニツトの酵素によって処理される。プラス ミドから目的のＤＮＡフラグメントを単離に、前述より大きな容積中でおよそ５ 〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０ユニツトの酵素で処理される。

特定の制限酵素に対し適切な緩衝液と基質力（先人たちによって決定づけされて いる。３７℃で約１時間のインキュベートが普通用いられている。しかし、提供 者の指導により変わる。切断後、反応液を直接ポリアクリルアミドゲル上で電気 泳動し、目的のフラグメントを単離する。

Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、　８．４０５７　［１９８０コに記載されている８％ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により分離されたフラグメントはその大きさにより分離される。

”脱燐酸化“はバクテリアのアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）を用いて５′ 末端の燐酸を除去することである。この過程は、ＤＮＡフラグメントに２つある 制限酵素切断面が接合し、制限酵素部位に他のフラグメントが挿入するのを邪魔 するかのよ引へ　輪を作るのを妨げるためである。脱燐酸化の過程と試薬には、 既知のものが用いられる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　ｐｐ、　１３３−１３４　［１９８２コ）。ＢＡ Ｐを用いた反応は、６８°Ｃ，５０ｍＭ）リス存在下で、酵素抽出液中に含まれ るエキソヌクレアーゼの活性を抑制しながら行われる。反応時間は１時間。反応 後、ＤＮＡフラグメントはゲル分離される。

”オリゴヌクレオチド”は、１水路ポリデオキシヌクレオチドカ＼化学的に合成 された相補的な２重鎖ヌクレオチドのいずれかである。

そのような合成オリゴヌクレオチドは、５′末端に燐酸がついていない。キナー ゼの存在下でＡＴＰから燐酸を付加した後ではないと他のオリゴヌクレオチドに つなげることができない。合成されたオリボヌクレオチドは脱燐酸化していない フラグメントにつなげることはできる。

”ライゲーション”とは、２本の２重鎖核酸フラグメントの間で燐酸エステル結 合を形成する過程のことを示す（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔｌ工、　Ｉｄ 、、　ｐ、　１４６）。特に注意すべき点がなければ、通常、ライゲーションは ０．５μｇのおよそ等モルのＤＮＡフラグメントに対して１０ユニツトのＴ４Ｄ ＮＡリガーゼという既知の緩衝液と条件下で行われる。目的のコードと制御配列 を含む適切なベクターを構築することが、標準的なライゲーション技術である。

単離したプラスミドやＤＮＡフラグメントは、目的のプラスミド形成に分離・調 整・再結合される。

”フィリングイン”や”プラントエンディグとは、制限酵素により切断された核 酸フラグメントの付着末端部分の１本鎖を２重鎖にすることである。これは、付 着末端を除去する力＼平滑末端を形成することである。この過程は、１つまたは ２．３の他の制限酵素により作られた切断面に結合能のある制限酵素切断面を、 エンドヌクレアーゼによる平滑末端や他の満たされた付着末端と両立できるよう に変換する融通のきく道具である。一般には、平滑末端化は以下の条件でなされ る。８ユニツトのＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントと２５０μ Ｍの４種類のデオシヌクレオシド３燐酸存在下で、ターゲットＤＮＡ２〜１５μ ｇに対し、１０ｍＭＭｇＣＬ、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ　ＮａＣｌ 、１０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）緩衝液の条件で３７℃でインキュベート。

インキュベートは通常３０分で終了し、フェノール・クロロホルム混液で抽出し 、エタノール沈澱する。

明らかにされた配列の一部に一致する相補的なポリペプチドは、それぞれの生殖 系遺伝子を同定したり、単離するために、ハイブリダイゼーションプローブとし て用いられる。そのようなポリヌクレオチドもまた、ｃＤＮＡをスクリーニング のためのハイブリダイゼーションプローブとして、また、ｃＤＮＡ単離のゲノム ライブラリーとして、この発明の構造的および進化的に興味のあるシアリルトラ ンスフェラーゼ配列をコードする遺伝子として用いられる。そのようなポリヌク レオチドは、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）により生殖細胞系の遺伝子配 列や近縁の配列を増幅する際プライマーとして有用である。

シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを同定または単離を目的とするハイブリダ イゼーションプローブは、ヌクレオチドに基づき設計さね、第１図と第２図に示 されたアミノ酸配列を導き出す。ハイブリダイゼーションプローブは、放射性核 種によってラベルされているが、ブタのα−２，３−０シアリルトランスフェラ ーゼ（第１図）でアミノ酸残基１３４〜１８９のうち５５残基が一致する保存領 域の一部または全部をコードする縮重したオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ 以上からなりたっている。ヘプタペプチドモチーフである　−Ａｓｐ−Ｖａｌ− Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−という配列がかなり保存されており 、このモチーフをコードする縮重したオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼ ーションプローブや、ヘプタペプチドの少なくとも４．５アミノ酸が保存さね、 １つか２つが修正されているようなものが、このモチーフの変異体といえるだろ う。第１図と第２図に紹介しである、ヘプタペプチドモチーフの１つか２つのア ミノ酸残基置換変異体をコードする縮重したオリゴヌクレオチドプローブは、プ ローブとして働く。

そのようなプローブはへブタペプチドモチーフに作用し、前述したように５５ア ミノ酸残基が保存されている。

シアリルトランスフェラーゼをコードするゲノムまたはｃＤＮＡクローンは、第 １図と第２図に示しであるようなシアリルトランスフェラーゼヌクレオチド配列 を基に設計されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、単離された。ｃＤ ＮＡクローンが必要であるとき、シアリルトランスフェラーゼを発現する細胞由 来のｃＤＮＡを含むクローンライブライ−が必要である。第１図と第２図に示し であるような配列の一部または全てに一致するような合成ポリヌクレオチド配列 が化学合成したオリゴヌクレオチドよって構築された。付は加えると、第１図と 第２図に示されている配列データに基づきプライマーを用いてポリメラーゼチェ イン反応（ＰＣＲ）は、ゲノムＤ　Ｎ　Ａ、ｍ　ＲＮ　Ａプール、ｃＤＮＡクロ ーンライブラリー由来のＤＮＡフラグメントを増幅に用いられる。ＰＣＲ法は、 ｕ、ｓ、　ｐａｔｅｎｔｓ　４，６８３，１９５　ａｎｄ　４，６８３，２０２ に記載されている。さらに、第１法と、その配列データを利用しない第２のプラ イマーを用いるＰＣＲ法か使用される。例えば、第２のプライマーにはポリＡ化 された領域に類似もしくは相補的なものが用いられた。

ヌクレオチドの置換、欠損、付加は、この発明のポリヌクレオチドに関係する技 術の１つである。しかし、そのような置換、欠損、付加は、特別なハイブリダイ ゼーションの結果、充分説得力のあるバイブ°リダイゼーション条件下で第１図 と第２図に示されているポリヌクレオチド配列の１つにハイブリダイゼーション するポリヌクレオチドの能力を実質的には破壊しない。

第１図と第２図にあるヌクレオチドとアミノ酸配列は、コードされているポリペ プチド配列の一部またはすべてに一致するポリペプチドを作成可能にする。その ポリペプチドは、完全な長さを持つシアリルトランスフェラーゼ、またはそのフ ラグメント、そのアナログをコードするポリヌクレオチドの発現によって真核、 原核どちらの宿主細胞でも産生される。そして、そのポリペプチドは化学合成ま たは翻訳をコントロールする鋳型となるポリヌクレオチドを用いてｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ翻訳系によって製造されｔ為　組換え宿主内での異種タンパク質発現の方法 、ポリペプチドの化学合成法、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系は既に広く知られていて 、以下の文献を参照されたし。Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８ ９）、　２ｎｄ　Ｅｄ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　ａｎｄ　Ｂｅｒｇｅｒ　 ａｎｄ　Ｋｉｍｍｅｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　Ｖｏｌｕｍ ｅ　１５２　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈ ｎｉ　ｕｅｓ（１９８７）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓ ａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ。

シアリルトランスフェラーゼのフラグメントを抽出するのもそんなに困難なこと ではない。フラグメントまたはアナログの好適なアミノ末端とカルボキシル末端 は、例えば酵素活性中心のような、構造的または機能的領域の境界付近にある。

実際１つまたはそれ以上の機能的領域からなるフラグメントは、異種のポリペプ チド配列を融合した形態をなすことが多い。その結果、融合したタンパク質は、 そのフラグメントから与えられる酵素活性のような機能的な性質を示す。そして 、その内部の機能的領域を一部除去した欠損ポリペプチドは、失われたフラグメ ントによって通常その性質を若干減少させる。

ハタロウイルス真核生物遺伝子発現は、複製した遺伝子から機能的に活性のある 大量のタンパク質をコントロールするもっとも有効な手段の１つである（Ｓｕｍ ｍｅｒｓ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｌｕｃｋｏｗ、　Ｖ、　（１９′８８）　肛奴す仙 ■状勉ｙ６：　４７）。この発明のシアリルトランスフエラーゼポリベブチドは バクロウィルス発現系での発現によってクローンされたポリヌクレオチドから産 生された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ｓａｎ　Ｄｉｅ ｇｏ、　ＣＡ）。

一般のシアリルトランスフェラーゼとその組換え発現産物は以下のプロトコルに 従って得られｔ島 １、ブタ肝臓シアリルトランスフェラーゼを明らかに均質になるまで純度を高め る。

２、ブタのシアリルトランスフェラーゼのＮ端アミノ酸配列を決定する。

３、ＮＨ２末端配列付近の１８アミノ酸に一致するオリゴヌクレオチドプローブ を化学的に合成する。

４、ａ）ブタ顎下腺からランダムプライマーで標識したポリＡに富んだｍＲＮＡ を用いて、または ｂ）ラット肝臓からオリゴｄＴで標識しポリＡに富んだｍＲＮＡを用いて、また は Ｃ）ラット脳からオリゴｄＴで標識しポリＡに富んだｍＲＮＡを用いて、 ｃＤＮＡライブライ−をλｇｔｌＯで構築する。

５、　シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に対してコドンで相補的な放 射能ラベルした合成デオキシオリゴヌクレオチドブールを用いる。例えば、以下 のようなａ）　５’　ＡＣＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣＡＣＣＣＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧ　ＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴ　３ ’ ｂ）　５°　ＧＡＣＧＴＣＧＧＧ　ＡＧＣＡＡＧＡＣＣＡ、ＣＣ３゜ ６、ランダムにプライマーしたブタ顎下腺由来のポリヌクレオチドキナーゼと３ ２Ｐ−ＡＴＰを用いてラベルした長短の化学合成されたオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いてスクリーニングする。２重のポジティブプラークが精製さね、挿入 されたフラグメントの配列を決定する。

７゜３２ｐラベルされた挿入フラグメントを、オリゴｄＴデオキシヌクレオチド 標識したブタ顎下腺ライブラリーを再スクリーニングに用いる。

８、ブタのシアリルトランスフェラーゼの完全なリーディングフレームは、２つ の重複クローンを得る。ラット肝臓と脳由来のｃＤＮＡは、クローンのＤＮＡ配 列解析によって決定されるような相同性が保存された領域を含む。

９、ブタのシアリルトランスフェラーゼをコードする完全な長さを持つｃＤＮＡ をプローブの２つのオーバーラツプするクローンから構築し、配列決定する。第 １図と第２図にＤＮＡ配列が明らかになって、シアリルトランスフェラーゼｃＤ ＮＡの相同性が保存された領域のデータからプローブが作成可能になった。

水種や他種由来または他の組織由来のｃＤＮＡやゲノムライブラリーのプローブ づけの効率が単純かつ増加することでシアリルトランスフェラーゼの精製、配列 決定、プローブブールの作成を不要にした。

１０、ブタとラットのシアリルトランスフェラーゼをコードする完全な長さを持 っｃＤＮＡが、適当な宿主細胞を形質転換に用いられる発現ベクターを調整した 。そして、それを目的とするのシアリルトランスフェラーゼを産生ずることを目 的として培養する。

１１、これまでの過程で生成された生物学的に活性のある成熟したシアリルトラ ンスフェラーゼは、第４図と第５図にあるように２つの相互的な形態を持ち、そ の２つの形態はそれぞれ４５ｋＤａと４８ｋＤａの分子量を持つ。

この発明のポリヌクレオチド、組換えにより産生じたシアリルトランスフェラー ゼポリペプチドとフラグメントやアミノ酸置換による変異体は、第１．２．３． ５．７．８図に示される配列データや、この発明の方法で単離されたシアリルト ランスフェラーゼｃＤＮＡから得られた配列データに基づき作成された。ポリヌ クレオチドと組換えにより産生じたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの 生産は、以下の文献にある手法でなされた。Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｍｏｌ四見ｌＬｋ知１ｎ４−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎ ｄ　Ｅｄ、　、　（１９８９）　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 　Ｎ、Ｙ、　ａｎｄ　Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ｋｉｍｍｅｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌＢｙ−、Ｖｏｌｕｍｅ　１５２　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　（１９８７）、　Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ　参 照のこと。ポリヌクレオチド配列は宿主で発現された。それに先立ち、その配列 は発現制御配列と（すなわち、その機能を確実にするために位置つけられるよう に）有機的に結合していることが分かつ總　そのため、ポリヌクレオチド配列の 転写は転写に好適な環境で起きる。

”特異的なハイブリダイゼーション”とは、ここでは、プローブとなるポリヌク レオチド（すなわち、置換、欠焦付加というこの発明で生産されたポリヌクレオ チド）と特定のターゲットとなるポリヌクレオチド（つまり、相補的な配列を持 つポリヌクレオチド）の間でハイブリッドを形感することと定義される。つまり 、プローブは、その特定のターゲットに優先的にハイブリダイゼーシヨンする。

例えば、ターゲットＲＮＡを含む真核細胞から調整したＲＮＡのノーサンプロッ ト上に単一のバンドが検出されるときや、プローブポリヌクレオチドがＰＣＲプ ライマーとして用いられたとき、単一のＰＣＲ産物が得られることなど。ある場 合には、タープ・ソトとなる配列は１つのターゲットのポリヌクレオチド以上存 在するときがある（すなわち、特定のターゲット配列が、シアリルトランスフェ ラーゼ遺伝子ファミリーの多様なメンバー内、もしくは同じ遺伝子から転写され たスプラシングが異なるＲＮＡに由来するものである場合）。最良のハイブリダ イゼーション条件というものは、配列構成や長さ、プローブ、ターゲット、使用 者の選んだ方法によりころころ変わることは明らかである。様々な案内は、適切 なハイブリダイゼーション条件を選ぶために用いられた　（参考：　Ｍａｎｉａ ｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８９）、　２ｎｄ　Ｅｄ、　、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　ａｎｄ　Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　 Ｋｉｍｍｅｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　Ｖｏｌｕｍｅ　１ ５２　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　ｊ匹抽知ｕｅｓ 　（１９８７）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄ ｉｅｇｏ、　ＣＡ、）”アンチセンスポリヌクレオチド”とは、　（１）第１図 と第２図に示されているような配夕＋Ｊ、またはこの発明の方法で単離されたシ アリルトランスフェラーゼｃＤＮＡから得られた配列の一部または全てに相補的 で、　（２）相補的なタープ・ノド配列に特異的にハイブリダイゼーシヨンする ポリヌクレオチドのことである。その相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは 、関連したタープ・ノド配列（すなわち、第１図と第２図に一致する）に対して 特異的な／’％イブリダイゼーションがポリヌクレオチドの機能的な特徴として 維持されている限り、ヌクレオチドの置換、付加、欠損や転移を含む。相補的な アンチセンスポリヌクレオチドは、個々のシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡ やシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡファミリーの多様なメンバーに対して特 異的にハイブリダイゼーション可能で、また、ｍＲＮＡの転写やコードされたポ リペプチドの翻訳を阻害する、可溶なアンチセンスＲＮＡやＤＮＡオリゴヌクレ オチドである（Ｃｈｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６：　１０００６−１００１０　（１９８９ ）；　Ｂｒｐｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、　１１３ ：　６０４−６１８　（１９９０）：Ｌｏｒｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７４：　５３−５６　（１９９０）；　Ｈｏｌｃｅｎｂｅ ｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　ＷＯ９１／１１５３５；　Ｕ、Ｓ、ＳＮ、　０７１５３ ０，１６５　（”Ｎｅｗ　ｈｕｍａｎ　ＣＲＩＰＴＯｇｅｎｅ”；　ＷＯ９１１ ０９８６５；　ＷＯ９１１０４７５３；　ＷＯ９０／１３６４１；　ａｎｄ　Ｅ Ｐ　３８６５６３．）。それゆえ、アンチセンスポリヌクレオチドはコードされ ているポリペプチドの生産を阻害する。この結果、１つまたはそれ以上のシアリ ルトランスフェラーゼの転写または翻訳を阻害するようなアンチセンスポリヌク レオチドは、ポリペプチドをグリコシレージョンする細胞の特異性や能力を変化 させる。

アンチセンスポリヌクレオチドは、感染を受けた細胞やトランスジェニックな細 胞、例えば個体の造血幹細胞群の一部または全ての再構成に用いられるトランス ジェニック多能性造血幹細胞の異種発現から産生される。アンチセンスポリヌク レオチドは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏっまり培地中またはｉｎ　ｖｉｖｏっまり循環器 系や間隙流内といった外部環境に順応した可溶性のオリゴヌクレオチドがら成り 立っている。外部環境下での可溶なアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質に 接触し、また特別なｍＲＮＡの翻訳を阻害することを示す。ある実施例では、ア ンチセンスポリヌクレオチドは一部がメチルフォスフォネートであり、フォスフ ォロチオネートかオルト−メチルリボヌクレオチドも用いられ、キメラのオリゴ ヌクレオチドもまた用いられた（Ｄａｇｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８：　４７５１）。ある適応では、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸からなっていた（Ｎｉｅｌｓｅ ｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４：　１４９７）。ア ンチセンスポリヌクレオチドに関係する一般的な方法については以下の文献を参 照して下さい。Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＤＮＡ、　（１９８８） 、　Ｄ、Ａ、　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｙ １つまたはそれ以上の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは同族のｍ ＲＮＡの翻訳を阻害したり、それぞれコードされているポリペプチドの量を減少 させる。そのアンチセンスポリヌクレオチドは、ｉｎ　ｖｉｖｏで１つまたそれ 以上のシアリルトランスフェラーゼ形成を阻害することから治療効果を与える。

１つまたはそれ以上のシアリルトランスフェラーゼトランス遺伝子の調節されて いるコピーを持つように、トランスジェニック動物は設計されている。シアリル トランスフェラーゼトランス遺伝子は、シアリルトランスフェラーゼタンパク質 をコードし、機能的プロモーターに有意義に結合しているフラグメントをコード し、例えばＧ−４１８耐性遺伝子のような選別用マーカー配列をつないでいるフ ラグメントをコードするポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである 。

遺伝子操作を用いて、使用可能なシアリルトランスフェラーゼトラス遺伝子を持 つトランスジェニックモデル系や細胞系を、薬剤スクリーニングや薬効果を評価 するモデルとして発展させることは可能である。加えて言うと、そのようなモデ ルは、シアリルトランスフェラーゼ代謝系の潜在的な生化学的な内容を決定する 道具とし役立ち、合理的な薬理設計とテストとしての実験にその基礎となる情報 を与えるだろう。

トランスジェニック動物を生み出すアプローチの１つは、１ｎｖｉｔ匹で調整し た胚幹（ＥＳ）細胞系を宿主胚盤胞にマイクロインジェクションし、その後養母 内でインキュベートするというＥＳ細胞系相同な組換えによって目的とする遺伝 子に突然変異をおこすことである（参考：　Ｆｒｏｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｔ ｉｎ　（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５６：　１４５）。別法としては突然変異を起 こした遺伝子やその一部を１細胞期胚にマイクロインジェクションし、その後、 養母内でインキュベートする技術が用いられる。トランスジェニック動物は、形 質転換せずともシアリルトランスフェラーゼタンパク質を発現しているが、様々 の用途に用いられるだろう。酵素活性を持つかどうか分からない（すなわち突然 変異が起きた）シアリルトランスフェラーゼタンパク質をコードしているトラン ス遺伝子を持つトランスジェニック動物を目的通りに設計できる。トランスジェ ニック動物を作り出す方法は既に知られている。

部位特異的突然変異と遺伝子転移は、内生的またはトランスフェクション（感染 ）によって、ｉｎ　ｖｉｖｏでシアリルトランスフェラーゼ対立遺伝子に突然変 異を起こすために用いられる。例えば、突然変異を受けた対立遺伝子はシアリル トランスフェラーゼ変異体をコードする。

また、相同組換えは宿主ゲノムの特異的部位、例えば宿主シアリルトランスフェ ラーゼ遺伝子座にシアリルトランスフェラーセ配列の挿入に用いられる。相同組 換えの１つの形態は、１つまたはそれ以上の宿主の配列を置き換えることである 。例えば、宿主シアリルトランスフェラーゼ対立遺伝子（またはその一部）が突 然変異を受けたシアリルトランスフェラーゼ配列（またはその一部）に置き換え られる。そのような遺伝子置換法について付は加えると、相同組換えは、シアリ ルトランスフェラーゼ（またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチ ドを宿主のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子座以外の部位に組み入れるのに用 いられる。相同組換えは、突然変異を受けたシアリルトランスフェラーゼ対立遺 伝子を持つヒト以外のトランスジェニック動物や細胞を作成する目的でに用いら れる。遺伝子ターゲツト法は、１つまたはそれ以上の内生的シアリルトランスフ ェラーゼ遺伝子を破壊し不活性化するために用いられる。これらはいわゆる”ノ ックアウビ　トランスジェニックといわれて次の文献に記載されている。ＷＯ９ １／１０７４１；　Ｋｕｈｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　７ ０８：　７０７ 以下に挙げる例は、単に発明を実行するために既知の最良の方式を図解、説明し であるだけで、発明を制限しているわけではない。

実　験　例　１ ブタシアリルトランスフェラーゼの　１２タイ　のα−２３−０シア嘗ルトラン スフエラーゼα−２，３−０シアリルトランスフエラーゼは以前に報告された２ 種類の方法を組み合わせて精製された（Ｓａｌｄｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４．４４３４−４４４３　（１９７９） 及びＣｏｎｒａｄｔ、　Ｈ，Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

ｉｎ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１９８８　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ−ｇｅｒｍａｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　５ｉａ ｌｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　（Ｓｃｈａｕｅｒ　ａｎｄ　Ｙａｍａｋａｗａ、　ｅｄｓ 、）　ｐｐ、　１０４−１０５゜Ｖｅｒｌａｇ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ　ａ ｎｄ　Ｂｉｌｄｕｎｇ、　Ｋｉｅｌ　（１９８８））。　酵素はブタ肝臓のトラ イトンＸ−１００抽出液を連続する３つのＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロー スカラムに通しアフィニティクロマトグラフィにより精製した。１回目と３回目 の精製でカラムを通過したフラクション（エリューション）のプロファイルを第 ３図、第４図にそれぞれ示した。１回目のアフィニティヵラムのエリューション ブロファイル中にシアリルトランスフェラーゼ活性の２つのピークが観察される ことか第３図で示されている。これら２つのピークは示されたフラクションを１ ．α−２，３−０シアリルトランスフエラーゼの分子量の異なる２つの形態が濃 縮されたものであることがあとで分かった２つのプール、プールＡとプールＢに 分離したものである。

２回目のアフィニティ精製を行うことにより、ブタ肝臓に同様に混在しているα −２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｓａｄｌｅｒ、　ＪＥ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．４４３４−４４４３　（１９７ ９））の殆どを各プールから除去した。３回目のアフィニティクロマトグラフィ 後カラムのフラクションを分析し、個々のフラクションに４８ＫＤａ　（第４Ａ 図、４−６フラクシヨン）または４５ＫＤａ　（第４Ｂ図、２−６フラクシヨン ）の分子量を持っα−２，３−シアリルトランスフェラーゼが濃縮されているこ とを確認した。これら２つのタンパク質種はそれぞれフオームＡ１　フオームＢ と命名した。両力ラムのピークのフラクションの比活性は８−１０ユニット／ｍ ｇタンパク質である。第４図の第６フラクシヨンに見られる強いバンド（約４４ ＫＤａ）は、先行するカラムを終え最後のアフィニティクロマトグラフィで酵素 活性のなくなったプールＡとプールＢの両プール中に主要な混在物として現れて いるので、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼではない。

シアリルトランスフェラーゼの活性はラクトースや低分子量不凍糖タンパク質質 を基質としてアッセイした（Ｓａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．４４３４−４４４３　（１９７９）） 。酵素はブタ肝臓から、記述された方法（５ａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５４．４４３４−４４４３　（１９ ７９）　ａｎｄ　Ｃｏｎｒａｄｔ、　Ｈ，Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　５ｉａ ｌｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１９８８Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｊａｐａ ｎｅｓｅ−Ｇｅｒｍａｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ（Ｓｃｈａｕｅｒ　ａｎｄ　Ｙａｍａｋａｗａ、　ｅｄｓ、）　ｐｐ、　１０ ４−１０５．　Ｖｅｒｌａｇ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ　ａｎｄ　Ｂｉｌｄｕ ｎｇ、　Ｋｉｅｌ　（１９８８））に多少修正を加えた方法で精製した。

２ｋｇの肝臓をすばやくホモジエネートし、膜フラクションを記述されたように 調製した（Ｓａｄｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２５４、４４３４−４４４３　（１９７９））。膜フラクション分は緩 衝液中で３回抽出しくＣｏｎｒａｄｔ、　Ｈ，Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　５ ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１９８８　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅＪａ ｐａｎｅｓｅ−Ｇｅｒｍａｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　（Ｓｃｈａｕｅｒ　ａｎｄ　Ｙａｍａｋａｗａ、　ｅｄｓ、）　ｐｐ、 　１０４−１０５．　Ｖｅｒｌａｇ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ　ａｎｄ　Ｂｉ ｌｄｕｎｇ、　Ｋｉｅｌ　（１９８８））、抽出物は１．５１　ＣＤＰ−ヘキサ ノールアミンアガロースカラム（カラム１）（１６μｍｏｌ／ｍｌ）に通した。

カラムは３リツトルのＢ緩衝液で洗浄した後、Ｂ緩衝液中に０．０５Ｍから１． ０Ｍまで直線的に増加したＫＣＩ　（２，５１ｘ２．５１）を含む溶液で溶出し た。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを含むフラクションを、２つのプ ール、プールＡとプールＢに分番九それぞれピークの主部とトレーリングエンド を表した（第３図参照）。各プールはＢ緩衝液で透析し、ＣＤＰ−ヘキサノール アミンアガロースカラム（カラムＩＩ−Ａ及びカラムＩＩＢ）のアフィニティク ロマトグラフィに再度通した。プール八には１５０ｍ１カラム、プールＢには３ ０ｍ１カラムを用い、カラムＩから調整した２つのフラクション（全体で４ｋｇ の肝臓）は第２段階で同一のカラムに通した。α−２，３−シアリルトランスフ ェラーゼはＢ緩衝液中にＯｍＭから２．０ｍＭまでの勾配をつけたＣＴＰを含む 溶液（プールＡには７５０ｍ１．プールＢには１５０ｍ１）で溶出した。α−２ ゜３−シアリルトランスフェラーゼ活性を持つフラクションはＧ５０セフアデツ クス（Ｇ５０５ｅｐｈａｄｅｘ）で脱塩し、緩衝液で平衡化してから、活性のあ るフラクションを１．０ｍ１ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム（バ ー１−１１１）にか広　Ｂ緩衝液中に０゜１ｍＭから１．ＯｍＭまでのＣＴＰの ステップ勾配（２０ステツプ、１、Ｏｍｌずつ）をもつ溶液で溶出した（第２図 参照）。活性のあるフラクションはプールし、両力ラムを合わせて８−１０ユニ ット／ｍｇタンパク質の比活性で２．５ユニツトを産生じた。４８ＫＤａ及び４ ５　ＫＤ　ａのシアリルトランスフェラーゼペプチド（第４図参照）を５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲルで泳動しくＬｅａｍｍｌｉ、　Ｕ、Ｋ。

Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０−６８５　（１９７０））、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍ ｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ電気的に移し、ク マシーブリリアントブルー（Ｓｉｇｍａ）で染色し？＝　シアリルトランスフェ ラーゼのバンドは切り出した後、そこに結合しているペプチドをエドマン（Ｅｄ ｍａｎ）分解法によりアブライドハイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　４７５Ａ）タンパク質シーケンサ−を用いてＮ８２末端のアミノ 酸配列解析し九４８ＫＤａ　（フオームＡ）及び４５ＫＤａ　（フオームＢ）の シアリルトランスフェラーゼが濃縮されたフラクションはポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＰＡＧＥ）Ｌ、ＰＶＤＦ膜にプロ・ントし、Ｎ１］２末アミノ酸配 列解析をおこなって各ペプチドのアミノ酸配列を２２残基決定した（第５図）。

フオームＡのＮＨ２末アミノ酸配列は疎水的アミノ酸から成る領域を含んでおり 、低分子量型のタンパク質は高分子量型のものがハイドロフォーシスなペプチド （ｈｙｄｒｏｐｈｏｓｉｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ）のタンパク質開裂によって生じた ものであるという５ａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　２５４．４４３４−４４４３　（１９７９））とＷｅｓｃｏｔｔ　ｅｔ　 ａｌ、、　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．１３１０９−１３１２１ ）の予想と矛盾しない。

この領域はフオームＡに特有な変性剤特性及び膜結合特性を説明するものと考え られている。

実　験　例　２ １９ンア１ルトランスフエラーゼｃ　ＤＮＡＩｎｖｉｔｏｇｅｎから販売されて いるキットを用い、ポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃ ＤＮＡはＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＣｅｔＵＳから販売されている試薬とプロ トコールを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用した。用い た条件は、９２℃で１分間変性、５０℃で２分間再生、７２℃で２分間相補鎖形 成である。ＰＣＲ反応はＳＴ１の３′側末端にある１２０ｂｐの欠損領域に隣接 した配列に対応する３０ｂｐのオリゴヌクレオチドをプライマーとして行った。

ＰＣＲ増幅反応の生成物は２％アガロースゲルで分離し、ＳＴ１とＳＴ２に相当 する互いに１２０ｂｐ異なる２本のバンドをエチジウムブロマイド染色により確 認した。明確に同定するためにこれらのバンドはゲルから抽出しくＱｉａｅｘ　 ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクロー ニングして塩基配列を決定した。

ＲＮＡの　びｃＤＮＡライブラ１−の 新鮮なブタ顎下腺（死後３０分以内）を凍結し、ドライアイス−エタノール溶液 中に移した。トータルＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（ Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２．１５６−１５９　（１９８７））に従 って分離した。ポリＡ十ＲＮＡはオリゴｄＴ−セルロースクロマトグラフィ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）を用いて生成した。２重鎖ｃＤＮＡはＰｈａｒｍａｃｉａの ｃＤＮＡ合成キットおよび推薦されている方法を用い、ランダムヘキサマーをプ ライマーとしてポリＡ＋ＲＮＡを逆転写することにより合成し１．：ｏ　Ｅｃｏ ＲＩで消化したλｇｔｌｏにはＥｃｏＲＩアダプターをｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッ ケージングした（ＰｒｏＭｅｇａ）。　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング する目的で、パッケージした混合液は［ｃｏ　Ｉ　１ｃ６００にトランスフェク ション（感染）させてブレーティングした。

ｃＤＮＡクローンの　び　１′１ 特に記述していない場合は、すべての方法はＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　 （ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、 Ｙ、　（１９８２））に従って行ッｔ、：Ｏ精製した４８ＫＤａのシアリルトラ ンスフェラーゼペプチド（第５図参照）のＮ　Ｈ２末端に近い１８アミノ酸に相 当する５３ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブ（５’　ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴ ＧＣＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣ ＣＴＴＣＴＴ３°）は、１２ｐを用いて１０７ｃｐｍ／ｐｍｏ　ｌ　ｅの比活性 でエンドラベルした。５００００個のプラークは核酸ハイブリダイゼーションに より、以下の条件のプレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション混合 液中でスクリーニングした。即ちその条件は、５ｘＳＳＣ，５０ｍＭ　リン酸２ 水素ナトリウム　ｐＨ６，７，２０％ホルムアミド、５Ｘデンハルト液、０．　 １％５Ｄｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

ｐｐ、　４４３）である。ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｈｅｒ　 ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｏ，４５ｍ　ｐｏｒｅ）は、０，２ｘＳＳＣ，０，１ ％ＳＤＳ中で４２０α　４０分間洗浄した。強くハイブリダイズしたクローン、 λＳＴ１クローンが得られ、これは４８ＫＤａと４５ＫＤａの精製したシアリル トランスフェラーゼペプチドに対応したアミノ酸をコードしたオーブンリーディ ングフレームを持っている。２っめのクローンであるλＳＴ２は、λＳＴＩの３ °側末端がら得た制限酵素フラグメントをプローブとして核酸ハイブリダイゼー ションを行うことにより単離した。このプローブは０．５ｋｂのＰｖｕ　Ｉ　Ｉ −ＥｃｏＲ■制限フラグメントであり、ランダムブライミングキットと［α−３ ２Ｐコｄ　ＣＴ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてラベルした。

ファージＤＮＡ内のｃＤＮＡインサートに対応するＥｃｏＲＩ制限フラグメント は、ｐＵＣベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングした。サブクロ ーニングしたクローンはファルマシアのＴ７キツトを用いて塩基配列を決定した 。配列データについては、ナスター（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ、、　ＷＩ、　ＵＳ Ａ）を用いてコンピューター解析をおこなった。

α２，３シアリルトランスフエラーゼのｃＤＮＡをクローニングするため、第５ 図に示したアミノ酸配列情報に基づいていくつかのクローニング手段を試みｆ、 まず第１の手段として、４８及び４５ＫＤａのタンパク質種のＮＨ２末端部分が 酵素本体に隣接しているという予想をたて、この末端部分に対応したプローブを 産生ずる目的でポリメラーゼ連鎖反応プライマーを調製しｔ島　結論をいうと、 この試みは４５ＫＤａのタンパク質種（第５図および第６図参照）のアミノ酸配 列が不正確であったために失敗した。失敗した他の例はブタ下顎腺ｃＤＮＡをス クリーニングするためのプローブとして短かい（１６−２０ｂｐ）縮重プローブ を使用したものである。最終的に成功した手段はＡフオームのタンパク質のＮＨ ２末端の１７アミノ酸配列から設計した５３ｂｐの縮重していないプローブを用 いたものであった。この５３ｂｐプローブを用いて５０００００プラークのλｇ ｔｌｏブタ顎下腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。単一の１．６ｋ ｂのクローン、コンセンサスなＡＴＧ開始コドン（ＫｏｚａｋｌＭ、、　Ｃｅ１ ｌ　４９．２８３−２９２　（１９８６）　ａｎｄ　Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、、　Ｎ ｕｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．８５７−８７２　（１９８４））とａ−２， ３−シアリルトランスフェラーゼのフオームＡとフオームＢ両方のＮ　Ｈ２末端 側アミノ酸配列をコートするオーブンリーディングフレームを持ちインフレーム 停止コドンを持たないλＳＴ１クローンが得られた。λＳＴ１のオーブンリーデ ィングフレームを翻訳するとα−２，３−シアリルトランスフェラーゼの両フオ ームのＮＨ２末端アミノ酸配列か見られることから、λＳＴＩクローンはα−２ ，３−シアリルトランスフェラーゼの一部をコードしていることが分かる。

λＳＴＩの３゛側制限フラグメントを用いて２つめのオーバーラツプしたクロー ンであるλＳＴ２ＳＴ２クローン一のライブラリーから得た（第６図参照）。λ ＳＴ２てはλＳＴＩから開始したオーブンリーディングフレームが終了している 。これら２つのｃＤＮＡは合わせて１１−のオーブンリーディングフレーム（９ ０９−１０２９、以下に参照）、５°側６００ｂｐの非翻訳領域、および３′側 １０００ｂｐの非翻訳領域ををコードしている。１０２９ｂｐのオーブンリーデ ィングフレームの核酸配列および決定したアミノ酸配列を第７図に示し總　λＳ ＴＩのオーブンリーディングフレームを翻訳して決定したアミノ酸配列と、精製 したタンパク質を直接解析して得たアミノ酸配列はよく一致している。

λＳＴ１とλＳＴ２の重複した領域は、λＳＴＩに見られる１２０ｂｐのギャッ プを除くと完全に一致している。単一のオーブンリーディングフレームはλＳＴ Ｉのこのギャップの両側に広がっている（第６図参照）。実際のｍＲＮＡを表し ているのがこの２種類のｃＤＮＡの形態のうちの一方かそれとも両方かを決定す るため、ブタ下顎腺のポリＡ＋ＲＮＡを逆転写して調製したｃＤＮＡを鋳型とし てギャップ両側に位置するプライマーを用いたＰＣＲ解析を行った。λＳＴＩと λＳＴ２に相応する増幅したＰＣＲフラグメントはこの方法で検出した（データ は示していない）。ＰＣＲ産物は同一性確認のためサブクローニングして塩基配 列を決定し、両方ともλＳＴ１とλＳＴ２の対応する領域に一致していることを 確かめた。

このような直接的なｃＤＮＡクローニングとＰＣＲ増幅の結果から、ブタ下顎腺 のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡはオーブンリーディングフ レーム内に１２０ｂｐの挿入配列をもつかとうかの違いで２種類存在することが 示唆された。

シアリルトランスフェラーゼ（１０２９ｂｐオーブンリーデイングフレーム）の タンパク質の予想される分子量は３９ｋＤａで、４つの潜在的なＮ−グリコシレ ージョン部位を持つ（第７図参照）　（Ｂｏｕｓｅ、　Ｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｊ、　２０９．３３１−３３６　（１９８３））。このうちの３つの部位がグリ コシレージョンされることにより、予想されるタンパク質の分子量は精製したシ アリルトランスフェラーゼのフオームＡで観察されたものと同じ約４５ｋＤａと なる。アミノ末端配列には２つのＡＴＧコドンが非常に近接して存在しているに も関わらず、最初のＡＴＧのみが高いコンセンサスを持つ翻訳開始部位のなかに あｉｄｓ　Ｒｅｓ、１２．８５７−８７２　（１９８４））。カイトート−リッ トル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏ。

１ｉｔｔｌｅ）疎水性解析（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５７．１０５−１ ３２　（１９８２））によりアミノ末端から１１残基はなれたところに１６個の 疎水性残基がら成る潜在的な膜貫通領域があることが分がった（第７図参照）。

この構造的な特徴から、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼはこれまでに 研究されてきた他のグリコジルトランスフェラーゼと同様にタイプＩＩの膜方向 性を持ち、この単一の疎水性領域は非開裂型のアミノ末端シグナル／アンカー領 域（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｋ、Ｊ、、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．１７６１５−１７６１８　（１９８９））と しての役割を持つと考えられる。

λＳＴＩとλＳＴ２にコードされたオーブンリーディングフレームは、α−２， ３−０シアリルトランスフエラーゼのフオームＡとフオームＢから決定したアミ ノ末端側の完全なアミノ酸配列を含んでいる。第６図に示されたように、フオー ムＡのＮＨ２アミノ酸配列配列想されるオーブンリーディングフレームの翻訳開 始部位がら８アミノ酸離れており、対応するフオームＢのＮＨ２末端配列はタン パク質のカルボキシル末端側へ２７アミノ酸残基分離れている。

α−２，３−シアリルトランスフェラーゼのフオームＢは完全な酵素活性を持つ ため（Ｒｅａｒｉｃｋ、　Ｊ、１．　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２５４．４４４４−４４５１　（１９７９））、予想される全長酵素の 開始メチオニンとフオームＢのアミノ末端の間の配列は恐らく酵素活性には必要 ない。このように、以前に研究されたグリコジルトランスフェラーゼ（Ｗｅｉｎ ｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２．１７ ７３５−１７７４３　（１９８７）　ａｎｄ　Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，ａ ｎｄ　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｋ、Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４． １７６１５−１７６１８（１９８９））で定義されたように、シグナル／アンカ ー領域と酵素活性領域の間にあるα−２，３−０シアリルトランスフエラーゼの タンパク質分解感受性領域はステム領域である。

ブタまたはラット組織から調製した２０ｍｇのトータルＲＮＡは２．２Ｍのホル ムアミド（２６）を含む１．０％アガロースゲルで電気泳動し、記述したように ニトロセルロースフィルター（ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ ）に移した。ニトロセルロースフィルターは３２ｐでラベルしたｃＤＮＡプロー ブとハイブリダイゼーションさせ前述したように洗浄した。

実　験　例　３ ０°　ブタシア１ルトランスフエラーゼのλＳＴ２クローンのＣ末端側８９０ｂ ｐをｐＧＩＲ−１９９（Ｈｓｕｅｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、　２６１．４９４０−４９４７　（１９８６））ベクターのＮ末端部位へ両 方のベクターのリーディングフレームに含まれる５ａｃ１部位を用いて組み込む ことで、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼの酵素活性領域とインシュリ ンシグナル配列を融合した分泌型のキメラタンパク質を作成した。このキメラタ ンパク質、５ｐ−８Ｔは、制限酵素ＮｈｅＩとＳｍａＩで消化して１．０ｋｂの フラグメントを分離し、ＸｂａｌとＳｍａＩでポリリンカ一部位を開裂したｐ　 Ｓ　Ｖ　Ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングした。作成したものは ｐＳＶＬ−ｓ　ｐＳＴと名付け、可溶型のａ−２，３−０シアリルトランスフエ ラーゼをＣ’　ＯＳ−１細胞で一時的に発現させるために用いた。スーパーコイ ル型のｐｓＶＬ−ｓｐＳＴはリポフェクチンを用い販売元から推薦されている方 法でトランスフェクトした。

（５０％コンフルエントの細胞を培養した６０ｍｍカルチャーディツシュに５μ ｇＤＮＡ、２０ｍ１リポフェクチン試薬をトランスフェクトした）。α−２，３ −０シアリルトランスフエラーゼの活性測定のため、トランスフェクション後４ ５時間経過後にＣＯ５−１細胞の培養上清を回収し、セントリコン３０フイルタ ー（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１５回遠心した。α−２，３−０シアリルトランス フエラーゼは不凍性糖タンパク質受容体をもちい、以前の記述（Ｓａｄｌｅｒ　 ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．４４３４−４４４３　 （１９７９））にしたがって活性測定した。

ｐＳＶＬ−ｓｐＳＴをトランスフェクションしてから４５時間経過後、ＣＯＳ細 胞（６０ｍｍカルチャーディツシュ）はｍｅｔ−ｆｒｅｅ培地（ＤＭＥＭ、５％ ウシ胎児血清）　（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、同し培地を用いて１時間培養した。

細胞は１．５ｍｌのｍｅｔ−ｆｒｅｅ培地中で１５０ｍＣ１／１５０ｐｍｏｌｅ の３ＳＳ−発現ラベル（ＮＥＮ）で２時間パルスラベルした。これらの細胞はＰ ＢＳで洗浄し、”Ｓ−ｍｅｔラベルを除いた培地で５時間チェイスした。分泌さ れたタンパク質を含むこの培地は集めて１５回遠心し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで泳動 後フルオログラフィで解析した。

以前に述べたように、α−２，３−０シアリルトランスフエラーゼのフオームＢ は酵素活性を持ち、全長型のタンパク質が開裂して出来た膜結合型酵素である。

それゆえ、もし可溶性のキメラタンパク質がＢフオームの完全な配列を含んでい るなら、このタンパク質はα−２，３−〇シアリルトランスフェラーゼの活性を 保持していると考えられる。このような可溶性タンパク質を作成するため、Ｂ− ペプチド配列のＮ　Ｈ２末端の上流の制限部位を、λ５Ｔ２ｃＤＮＡとインシュ リンシグナル配列をコードしたｐＧＩＲ−１９９ベクターとの融合のために用い た。第９Ａ図に示されているように、作成されたものは我々かシグナル配列−Ｓ Ｔ　（ｓｐ−ＳＴ）と名付けた、インシュリンシグナル配列とそれに続＜ｐＧＩ Ｒリンカ−でコードされた９アミノ酸およびα−２，３−０シアリルトランスフ エラーゼの予想される全酵素活性領域から成る融合タンパク質をコードしている 。５ｐ−ＳＴを宿主哺乳細胞にトランスフェクトした場合、３８ｋＤａの分泌タ ンパク質の合成をうながすと期待される。可溶性のグリコジルトランスフェラー ゼを合成する同様の手段はこれまでにも成功している（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、 Ｃ，ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｋ、Ｊ、、　Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　２６４ ．１７６１５−１７６１８　（１９８９）：　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｋ、Ｊ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６４．１７６１９−１７６２２　（１９８９）；　Ｌａｒｓｅｎ 、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８７．６６７４−６６７８　（１９９０））。

５ｐ−ＳＴはｐＳＶＬ発現ベクターに移し、ＣＯ３−１細胞中へ一時的にトラン スフェクションをした。４８時間後、トランスフェクションを行った細胞はトラ ンス３６Ｓラベルを含む培地で２時間培養し、ラベルを含まない培地でさらに５ 時間チェイス培養した。培地を回収して１５倍に濃縮し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ／フ ルオログラフィで解析した。この培地は予想される５ｐ−ＳＴタンパク質の分子 量である３８ｋＤａのタンパク質を多量に含んでいることが第９図に示されてい る。同時にトランスフェクトした培養では、培地はトランスフェクション後４８ 時間経過後に回収して濃縮し、α−２゜３−〇シアリルトランスフェラーゼ活性 を解析した。第９Ｃ図に示しているように、ミリユニット／ｍｌのシアリルトラ ンスフェラーゼを含む５ｐ−ＳＴをトランスフェクションした細胞およびモック のトランスフェクションをした細胞から調製した培地は大きな活性を持たなかっ た。

実　験　例　４ ラット　シアリルトランスフェラーゼの　１およ゛　１゛小胞体およびゴルジ装 置の内在性膜タンパク質である他のグリコリルトランスフエラーゼと同様に、シ アリルトランスフェラーゼは少数タンパク質で精製が困難であり、このファミリ ーのタンパク質が２つしかクローニングされていないことを説明している。Ｇａ ｌβ１．３　（４）ＧｌｃＮＡｃ　ａ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ ”　ａ２．　３−Ｎ”　）は最初、１９８２年にＷｅｉｎｓｔｅｉｎ等によって ８０００００倍に濃縮さね、１０μｇ／ｎｇ組織を産生じた（Ｗｅｉｎｓｔｅｉ ｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｎ、　’４￥２．１ ３８３５−１３８４４　（１９８２）　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１３８４５−１３８５３　（ １９８２））。簡便な方法を用いてアミノ酸配列の情報を得るためにあるいは酵 素にたいする抗体を作成するためにいくつかの手段を試みたが、得られる希釈さ れたタンパク質の量がわずかであったためにこれらの試みは失敗した。これに代 わる方法として、マススペクトロメトリーは生物学的に重要な巨大分子の構造を 明らかにするための方法としてその需要が高まってきた。新しいイオン化法とそ のための装置の開発は解析可能な分子量の範囲と検出精度を広げてきた。高速タ ンデムマススペクトロメトリーは翻訳後修飾及び化学修飾の決定（Ｄｅｖｅｒ、 　Ｔ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．２０５ １８−２０５２５　（１９８９９；　５ｅｔｔｉｎｅｒｉ、　Ｃ，Ａ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、 　１９、６６５−６７６　（１９９０）；　ａｎｄ　ＤｅＷｏｌｆ　Ｊｒ、、　 Ｗ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２７゜９０９３−９１０１　 （１９８８））と同様にタンパク質配列決定（Ｍａｔｈｅｗｓ、　Ｗ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２．７５３７−７５４５ 　（１９８７））のための強力な技術として現在確立されている。それ故、シア リルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を調ぺるためにマススペクトロメトリー を採用した。

゛　−およびカルボキシメチレーション約１３μｇのＧａｌβ１．３（４）ＧＩ ｃＮＡｃ　ａ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（α２．３Ｎ）を、３５０ ｍ１の３０ｍＭ力コディレートナトリウム（ｐＨ＝６．　５）、１００ｍＭ塩化 カルシウム、０．１％トライトンＣＦ−５４，５０％グリセロール中に保存した 。トリス塩酸（ｐＨ＝８．０）、グアニジン塩酸、ジチオスレイトールをそれぞ れ最終濃度が０．　２１ｖｉ、６μ　７ｍＭになるように加えた。還元は６０ス 　アルゴン下で１．５時間行った。

２．５ｍｌの０．２Ｍ）リス塩酸緩衝液に溶解したヨウ化酢酸ナトリウム（１， ３２ｍｇ）を混合液に加えた。アルキル化は室温、アルゴン下、暗所で１．５時 間行った。

透析 還元しカルボキシメチレーションを行ったα２．３Ｎは、ベセスダリサーチ　ラ ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ：　”　Ｂ　Ｒ Ｌ”）のマイクロダイアリンスシステム（Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓ ｔｅｍ）を使用し１２−１４ｋＤａで分子量をカットオフする　ＢＲＬ製のダイ アリシスメンプラン（Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて４リツト ルの５０ｍＭ　Ｎ−エチル−モルフォリン酢酸緩衝液（ｐＨ＝８．　１）　中で 透析した。透析完了後、１０％ＳＤＳを透析ウェルに加えてＳＤＳの最終濃度を 約０．１％とした。ウェル中の内容物はプールし、５ｐｅｅｄｖａｃ　Ｃｏｎｃ ｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｓａｖａｎｔ）を用いて乾燥した。ＳＤＳを除去するために 、Ｋｏｎ　１ｇ５ｂｅ　ｒｇ沈澱を行った（　Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、　Ｗ、Ｈ ，、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｌ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ　９１，２５４−２５９　（１９９３））。

１ニブ之之逍孔 沈澱したα２．３Ｎは消化緩衝液（１００ｍＭ）リス塩酸、２Ｍウレア、１ｍＭ 塩下カルシウム、ｐＨ＝８．０）に溶解されて、約２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃 度の溶液を得た。α２．３Ｎは１０％トリプシン（Ｗ／Ｗ）（ベーリンガーマン ノ１イム、シーケンスグレード（Ｂｏｅｈｌｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　 ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｇｒａｄｑ）、１ｍＭ　ＨＣｌに溶解）で３７℃で消化 した。７時間消化した後、さらにトリプシンを加えて最終トリプシン濃度を約１ ３％とした。１８時間後に消化を停止しｔ島トリプシン消化物は、ＡＢＩ　１４ ０Ａ　ソルベントデリバリ−システム（ｓｏｌｖｅｎｔ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓ ｙｓｔｅｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣ（ＡＢＩ　Ｃ１８カラム、１．ＯｘｌＯＯｍ ｍ）を用いて分離した。溶剤Ａは０．　１％ＴＦＡ水溶液である。また溶剤Ｂは ７０％アセトニトリル／３０％水にＴＦＡを０．０８％で加えたものである。装 置は５０ｍ１／分の流速で用いた。注入後１０分経過してから、溶剤Ｂの割合を ９０分かけて０％から５０％まで増加させ、次に３０分かけて１００％まで上昇 させた。ペプチドはＡＢｌ　７８３Ａ吸収検出装置を２１５ｎｍで用いて検出し た。いくつかのフラクションは塩酸／ｎ−ヘキサノール混合物を用いてエステル 化しｔム マススベクトロメト１− 液体第２イオンマススペクトロメトリー（ＬＳ　ＩＭＳ）はＬＳＩＭＳ源と高磁 磁石を備え付けたクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）　Ｍ　Ｓ　５０　Ｓ二重焦点マスス ペクトロメーターを用いて行った。回収した各両分のおよそ５分の１をＬＳＩＭ Ｓ解析に使用し九　１マイクロリ・ノトルの１％ＴＦＡで酸性化したグリセロー ル−チオグリセロール　１：１混合液を液体マトリックスとして使用した。サン プルはプローブチップから再回収した。衝突誘導型分離（ＣＩ　Ｄ）解析のため に、最も豊富に存在する分子イオンを選択した。実験は、質量範囲の連続した４ ％セグメントを同時に記録できる電子光学的多チヤンネルアレイ検出器を装備し たクラトスコンセプトＩＩＨＨ４セクターマススペクトロメーターを使用してお こなった。衝突エネルギーは４ｋｅＶ、衝突ガスはヘリウムでその圧力は選択し た前駆体イオンを初期値の３０％に減弱するように調整した。各サンプルの残り をロードし、前述したマトリックスを１ｍｌ加えた。高エネルギーＣＩＤのデー タはコンピューター解析を用いずに解釈した。

タンデムマススペクトロメトリーは簡便なエドマン技術を有利に行え、タンパク 質配列決定の強力な道具である。この方法では等モルの混合液からの配列決定も 可能である。マススペクトロメトリー解析をおこなうためＨＰＬＣから得た最初 の少量のタンパク質画分は疎水性を増すためにエステル化し、スパッタリング効 率を向上した（Ｆａｌｉｃｋ、　Ａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｍａｌｔｂｙ、　Ｄ、Ａ、 、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８２．１６５−１６９（１９８９））。各 画分のＬＳＩＭＳ解析により複数の分子イオンが明らかになり、各両分に２つ以 上のペプチドが存在することが示された。

ＣＩＤ解析には最も多く見られる３０種の分子イオンを選択した。

これらの実験では、最初のマススペクトロメーターには注目するイオンの１２Ｃ アイソトープピークを選んだ。２つのマススペクトロメーターの間に据えた衝突 室でヘリウム下で起こした衝突により引き起こされた分離の結果、この種のフラ グメントのみが２度目のマススペクトロメーターの終了時に検出された。高エネ ルギー衝突誘導分離（ＣＩ　Ｄ）解析では、主にペプチドの主鎖に沿って断片化 が起こる。複数の開裂、すなわちアミノ酸側鎖の断片化も同様に観測される。ペ プチド鎖に沿った断片化はアミノ酸残基の重さの異なるイオン種を生み出し、相 応するアミノ酸配列が決定される。高エネルギーモードての断片化によってアミ ノ酸決定に関しての付加的な情報かもたらさね、得られた配列を確かなものにし イソバリンロイシン／イソロイシンアミノ酸対の区別が可能になる（Ｊｏｈｎｓ ｏｎ、　Ｒ，Ｓｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　５９．２６２１−２ ６２５　（１９８７））。側鎖の断片化は、塩基性アミノ酸、すなわちアルギニ ン、リジン、ヒスチジンが配列中に存在する場合に最もよく見られる（Ｊｏｈｎ ｓｏｎ、　Ｒ，Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔ ｒｏｍ、　Ｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、　８６．１３７−１５４　（１９８ｇ））。　大 抵の場合、塩基性アミノ酸のプロトン化はＮ末端であるいはその近傍で起こり易 く、その結果分子のこの末端が電荷を保持しゃすい。塩基性アミノ酸をＣ末端に あるいはその近傍に持つペプチドは大抵Ｃ末端側での開裂を示す。このように、 トリプシンは最初の消化を行うのに有利である。高エネルギーＣＩＤのデータを 解析することにより、最終的に１４アミノ酸配列を決定した（第２表および第９ 図参照）。

ＣＩＤスペクトルを解析することにより、トリプシン消化中に起こる副反応が明 らかになうた。トリプシンの自己消化による２つの生成物がｍ／ｚ６５９．３と １１５３．６で同定された（第９図）。

長時間のインキュベートおよび適切な捕捉剤の欠如により、いくつかのトリプシ ンペプチドはＮ末端でカルバモイル化された。このような副反応はエドマン分解 を妨げる一方、Ｎ末端の修飾はマススペクトロメトリーでの配列決定に有利であ る。実際、これらの修飾ペプチドのＣＩＤ解析は上述したいくつかの配列を確証 するのに有効であり、−例としてＮ末端のロイシンをインロイシンを区別する方 法を得るのに有効な場合もある（第１０図参照）。

実　験　例　５ ラット　シア１ルトランスフエラーゼ 持異ｆｉｃＤＮＡ”ｏ−ブのＰＣＲ−５α２．３Ｎに由来する１４ペプチドのう ちの１１についてのアミノ酸配列に基づき、センス鎖とアンチセンス鎖両方から なる２２個の縮重オリゴヌクレオチドブールを合成した（Ｇｅｎｏｓｙｓ）。第 １１ペプチドと第１ペプチドは以前にクローニングしたシアリルトランスフェラ ーゼであるＧａｌβ１．４ＧＩｃＮＡｃ　ａ−２，６−シアリルトランスフェラ ーゼ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、銀 、　１３８３５−１３８４４　（１９８２））および前述したα−２，３−０の 中央部近くの領域に相同であるという観察結果に基づいて最初のＰＣＲ実験を組 み立てた（第１１図参照）。第１１ペプチドに対するセンスプライマーまたは第 １ペプチドに対するアンチセンスプライマーを、他のペプチドに対するオリゴヌ クレオチドブライマーやラット肝臓トータルＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮ Ａ第１鎖と組み合わせることで、２組のＰＣＲ実験をおこなった。鋳型を変性（ ９４℃で５分間）する段階から初めて、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ　ＤＮＡポリメラ ーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いたＧｅｎｅＡｍｐＴＭＤ Ｎ４増幅試薬キットを使用して、３５回のサイクル、９４℃で１分、３７℃で１ 分、７２℃で２分、及び最終的な伸長段階（７２℃で１５分）を加えて増幅をお こなっμ　これらのＰＣＲ実験によっていくつかのｃＤＮＡフラグメントを産生 した。第１１ペプチドと第１ペプチドは連続したアミノ酸配列を表していること を考え、特異的ｃＤＮＡフラグメントを同定するためネステッドプライマー法（ ｎｅｓｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ法）　（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｆａ ｌｏｏｎａ、　Ｆ、、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、　１５５．３３５−３ ５０　（１９８７）参照）を用いた別のＰＣＲ実験をおこなった。この方法で、 特異的なｃＤＮＡフラグメントである１１セ：ｚス−１４アンチセンス（ｌｌｓ −１４ａｓ）ｃＤＮＡフラグメントを同定し總　１１ｓ−１４ａｓ　ｃＤＮＡフ ラグメントはブルースクリプトプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクロ ーニングし、ユニバーサルブライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とシーケナーゼ バージョン２．０キツト（Ｕ　Ｓ　Ｂ）を用いて塩基配列を決定した。

シアリルトランスフェラーゼのクローニンファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 　のｃＤＮＡ合成キットを用いてラット肝臓ポリΔ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブ ラリーを作成した（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、Ｊ 、　Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６９　（１９８３））。オリゴｄＴから始まる ｃＤＮＡは合成後ＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔｌリンカ−を結合した。ｃＤＮＡは次にＥ ｃｏＲＩで開裂したλｇｔｌＯＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に結合した。ＤＮＡパ ッケージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッ ケージングをした後、ファージは宿主株のＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｈＣ６００ｈ ｆｌ−（Ｐｒｏにブレーティングした。およそ１００万のプラークを、１ｌｓ− １４ａｓｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした（ＧｕＭｅｒ、　Ｕ、　 ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、Ｊ、　Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６９　（１９ ８３））。２つの陽性ファージ（１８−１と９−１）をプラーク精製し、塩基配 列決定のためにブルースクリプトベクター（Ｓ　ｔ　ｒａ　ｔ　ａｇｅｎｅ）に サブクローニングした。

ｃＤＮＡクローンのｔ ダイホッフタンパク質データベース（Ｔｈｅ　Ｄａｙｈｏｆｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ 　ｄａｔａｂａｓｅ）を用い、既知のタンパク質に参照してペプチド配列のスク リーニングを行った。この解析でまず、α２．　３−Ｎと他の単離されたシアリ ルトランスフェラーゼとの相同性が示された。この解析により、第１１ペプチド （第２表）はラットおよびヒトβガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフ ェラーゼの両方に見られる配列との相同性があることが示された（２つの酵素は ８８％が保存的、Ｇｕ、　Ｔ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　２７５．８３ −８６　（１９９０）　ａｎｄ　Ｌａｎｃｅ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｏｎ、　１６４ ．２２５−２３２　（１９８９））。この解析をブタα２．　３−０．付加的な ペプチドである第１ペプチドの配列まで広げて行った（第２表）結果、クローニ ングしたシアリルトランスフェラーゼ両方の配列と相同性があることを確認した 。これらのペプチド配列のアライメントは以前の単離されたシアリルトランスフ ェラーゼに存在し、これら２つのペプチドはトリプシン消化中にアルギニン残基 で開裂した連続したアミノ酸配列を表していることか示唆される。

呻 第１１ペプチドと第１ペプチドが、単離された別の２つのシアリルトランスフェ ラーゼの中央部にある以前に保存領域として同定された配列に相同性を示すこと から、クローニングの戦略の基礎が示唆された（第１１図参照）。第１１ペプチ ドと第１ペプチドはタンパク質の中央部に位置していると思わわ、ＰＣＲ実験は 長いｃＤＮＡプローブを産生ずるように設計された。１４個のシアリルトランス フェラーゼペプチドのアミノ酸配列に基づき、センスおよびアンチセンス両方の 縮重オリゴヌクレオチドブライマーをＰＣＲ実験で用いるために合成した。これ らの実験では、α２．３−Ｎの長いＣＤＮＡフラグメントを増幅するために第１ １プライマーのセンス鎖と第１プライマーのアンチセンス鎖を、他のプライマー と共に用いた。これらの実験の結果、いくつかのＣＤＮＡフラグメントが増幅さ れた。第１１ペプチドと第１ペプチドはアミノ酸の連続した配列を表していると 考え、特異的ＣＤＮＡフラグメントを同定するために第１１プライマーと第１プ ライマーを用いてネステッドプライマー法（ｎｅｓｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ法）を 行った（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ、　Ｆ、　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５５．３３５−３５０　（１９８７））。　第 １１プライマーのセンス鎖と第１４プライマーのアンチセンス鎖を用いて増幅し たフラグメントは第１プライマーのセンス鎖と第１４プライマーのアンチセンス 鎖を用いて増幅したフラグメントとほぼ同サイズであり、産生じたフラグメント はアーティファクトではなくプライマーの特異的な結合によるものであることが 示唆されている。

第１１プライマーセンス鎖−第１４プライマーアンチセンス鎖フラグメントのク ローニングおよび特徴付けによって、第１１ペプチドと第１ペプチドは連続して いることが明らかになった。ＣＤＮＡフラグメントの配列と単離した２つのシア リルトランスフェラーゼの配列（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２．１７７３５−１７７４３　（１９８ ７））を比較した結果、相同性は第１ペプチドから１８アミノ酸連続しているこ とが明らかになつｔ＝　この相同性によって、１１ｓ−１４ａｓ　ＣＤＮＡフラ グメントはシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡから増幅されたものであること が確認された。またこの配列により、ＣＤＮＡフラグメントはラット肝臓に豊富 に見られるＧａ１ｂｌ、４ＧＩｃＮＡｃ　ａ−２，６−シアリルトランスフェラ ーゼ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２５７．１３８３５−１３８４４　（１９８２））のフラグメントでは ないことが示された。　１１センス−１４アンチセンスフラグメントはオリゴｄ Ｔから始まるｃＤＮＡラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーをステップクリーニング するのに用いられ、１００万個のプラークから２つの陽性のクローンを単離し總 　陽性のクローンの特徴付けを行った結果、５Ｔ３Ｎ−１クローンは２．１ｋｂ の挿入フラグメントを含み、一方５Ｔ３Ｎ−２クローンはそれよりも短い１．５ ｋｂの挿入フラグメントを含んでいることか分かつｔ＝　ノーザンプロット解析 を行うことにより、ＧａＩ　ａ−２，３−３Ｔ　ｍＲＮＡの長さは２．５ｋｂで あり（以下を参照）、５Ｔ３Ｎ−１クローンはＧａｌ　ａ２．３−ＳＴの完全な コーディング配列を含んでいるらしいことが示された。

α−２３−Ｎシア１ルトランスフエラーゼの１°１配列解析により、５７３Ｎ− １クローンはシアリルトランスフェラーゼの完全なオープンリーディングフレー ム〔第２図参照）を含んでいることか分かった。このクローンは８２ｂｐの５° 　−非翻訳領域、１１２２ｂｐのオーブンリーディングフレーム、ｌｋｂの３の オープンリーディングフレームは３７４アミノ酸をコードしており、推定される 分子量は４２０３３である。１個のアミノ酸の違いを除くと、オーブンリーディ ングフレームは精製したシアリルトランスフェラーゼのマススペクトロメトリー 解析により得られた１４個のペプチド配列をすべて含んでいる。このことから、 ５Ｔ３Ｎ−１ｃＤＮＡクローンは正しくシアリルトランスフェラーゼであること が確認された。他の単離されたグリコジルトランスフェラーゼで観察されたよう に（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、Ｃ，ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｋ、Ｊ、、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．１７６１５−１７６１８　（１９８９））、 α２．３−ＮはＮ末端に短い細胞質側鎖、約２０残基から成るシグナルアンカー 配夕１１．およびＣ末端に酵素活性領域を含む領域をもつと予測されている。

実　験　例　６ ０・　ラットシア１ルトランスフェー−ゼの酵素の特徴付けのためにシアリルト ランスフェラーゼの可溶性形態を生成する目的で、酵素の触媒領域とインスリン 開裂性のシグナル配列とを含む融合タンパク質を哺乳動物の発現ベクターｐＳＶ Ｌ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）において構築した。特定すると、シアリルトランスフ ェラーゼの触媒領域を、膜貫通領域の下流側の＋１８２（第１１図参照）の位置 で５′プライマーを用い、そしてポリアゾニレ−ジョン部位の３’　ＵＴＲ上流 側に位置する３′プライマーを用いてＰＣＲ法を行うことによって増幅した。Ｐ ＣＲ法を、アニール化温度である５５℃にて上記に記載したのと同様に行った。

得られたＰＣＲ生成物を、ｐ　Ｇ　Ｉ　Ｒ−１９９（Ｋ、　Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ より譲り受けた。）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、結果 としてｐＧＩＲヘクター（Ｈｕｓｅｈ、Ｅ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１，４９４０−４９４７　［１９８６］）に存在する インスリンシグナル配列に、シアリルトランスフェラーゼをインフレームで融合 した。結果的に得られた融合タンパク質を、発現ベクターｐｓｖｔ、のＸｂａ　 Ｉ　−３ｍａ　Ｉ部位に挿入して、発現プラスミドｐＢＤ１２２を得た。

ＣＯ５−１細胞にてトランジェントな発現を行わせるために、発現プラスミドｐ ＢＤ１２２　（２０ｍｇ）をマニュファクチュラー（ＢＲＬ）によって示唆され ているように、リポフエチンを用いて１００ｍｍのプレート上に載せたＣＯ５− １細胞にトランスフェクションし總　４８時間後にその細胞培養培地を集めて、 セントリコン１゜マイクロコンセントレータ−を用いて濃縮した。そして濃縮さ れた培地を、アクセプターとなる基質としてオリゴ糖を用いることで、シアリル トランスフェラーゼの活性のアッセイを行った。オリゴ糖へのシアル酸の転移を 、イオン交換クロマトグラフィーを用いてモニターした（Ｓａｄｌｅｒ、　Ｊ、 　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５４．５９３４−５ ９４１　［１９７９］及びＰａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．１０９３１−１０９３４　［１９８９コ参 照のこと）。

５Ｔ３Ｎ−１がα−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼをコードすること を証明する目的で、発明者らはＣＯ５−１細胞においてクローンを発現させる手 法をとった。クローン５Ｔ３Ｎ−１のアミノ酸配列は、そのタンパク質がＮＨ２ −末端のシグナルアンカー配列を含有していることを表しており、そのシグナル アンカー配列によってその細胞中にあるゴルジ装置に酵素かアンカーされること が示されている（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｙ、　Ｋ、 　Ｊ、、　Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　２６４．１７６１５−１７６１８　［１ ９８９］参照のこと）。酵素の機能分析を容易に行うために発明者らは、発現に 際して細胞から分泌されるように、酵素の形態を可溶性にすることを目的とした 。融合タンパク質を開裂性のインスリンシグナル配列を用いて構築することによ って、シアリルトランスフェラーゼのＮＨ２末端にあるシグナル−アンカー配列 を置き換えることができた。発現プラスミドｐＢＤ１２２がＣＯ５−１細胞中に て発現した場合、酵素はその細胞から分泌されて、シアリルトランスフェラーゼ 活性が示された。

α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼの酵素の性質は、精製されたタン パク質を用いることで第１の特徴づけをおこなうことができる（Ｗｅｉｎｓｔｅ ｉｎ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７．１３８ ４５−１３８５３　［１９８２］参照）。シアリルトランスフェラーゼは、Ｎｅ ｕＡｃα２．３Ｇａ　Ｉｎ２．３ＧＩｃＮＡｃを形成するＧａｌβ１，３ＧＩ　 ｃ　Ｎ　Ａ　Ｃ，あるいはＧａｌβ１，４ＧＩｃＮＡｃ配列のいずれかを含有す るβ−ガラクトシドアクセプターを触媒できることが分かっており、ＮｅｕＡｃ ａ２．３Ｇａ　Ｉｎ２．３ＧＩｃＮＡｃ配列はよく、末端複合タイプのＮ−結合 されたオリゴ糖の複合体タイプを終止させることがわかっている。発現プラスミ ドｐＢＤ１２２を用いてトランスフェクションさせた細胞から分泌された酵素は 、Ｇａ１β１．　３Ｇ１ｃＮＡｃあるいはＧａｌβ１，４ＧＩｃＮＡｃ配列のい ずれかを含むβ−ガラクトシドアクセプターを用いることができる（第２表参照 ）。元のベクターを用いてトランスフェクションを行った細胞では、そのような シアリルトランスフェラーゼ活性は見られない。分泌された酵素もまた、アシア ロ−α１酸−糖タンパク質をシアル化する能力を有している。このデータは、精 製されたα−２，３−Ｎ体の酵素の性質と一致している。

実　験　例　７ バキュロウィルスにお番るα−２３−Ｎ−２１」ルトランスフエラーゼの 末端のテトラサツカライドシアリルルイス×　（Ｓｌｅ’　：　ＳＡα２、３Ｇ ａ　Ｉ　β１、４Ｇ　Ｉ　ｃＮＡｃ　［ａｌ、　３Ｆｕｃ］）　は、　Ｐ−セレ クチン及びＥ−セレクチンのためのリガンドとして同定されており、ＳＬｅ’構 造を含有する合成オリゴサツカライドはセレクチンーリガントインターラクショ ンをブロックできる可能性のあるものである。ＳＬｅ’を完全に化学合成するこ とは技術が難しく、かつ経済的にも困難性を有している。しかし、化学的に合成 されたコアのサツカライドに末端のシアル酸とフコース残基を付加させるための 特殊なグリコジルトランスフェラーゼを使用することで、フリーのＳＬｅ’の合 成を可能にすることができる。α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼを コードする遺伝子がラットの肝のＣＤＮＡライブラリーからクローニングさね、 そしてトランスフェクトさせたＣＯ３−１細胞にて発現させた場合に、特殊なα ２，３（Ｇａｌβ１．３／４ＧＩｃＮＡｃ）シアリルトランスフェラーゼ活性を 持つことが示された（Ｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、プレバレージョンの操作法）。ポ リペプチドの酵素部位をコードしていて疎水性のシグナル／膜アンカー領域を欠 如しているｃＤＮＡクローンの一部分を、プレインスリン　シグナル配列に融合 することによって、可溶性で分泌性のα２．　３ＮＳＴタンパク質をコードする ｃＤＮＡを形成した。このｃＤＮＡをバキュロウィルストランスファーベクター でクローニングして、野生型のバキュロウィルスＤＮＡの存在下で５ｆ−９昆虫 細胞をトランスフェクションするのに用いた。α−２，３−Ｎ−シアリルトラン スフェラーゼのｃＤＮＡを含有する組換えウィルスを単離して精製し、昆虫の５ ｆ−９細胞に用いｔ：ｏ　このトランスフェクションされた感染細胞は、培地に 大用量のα２，３　ＮＳＴを分泌し、この分泌されたタンパク質をイオン交換ク ロマトグラフィーによって精製した。

５ｆ−９細胞はＡＴＣＣから購入した。ＤＮＡベクターｐｃＩＲ１９９及びｐＢ ｌｕｅＢａｃはＪ、　Ｃ，ＰａｕｌｓｏｎとＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　（ＳａｎＤ ｉｅｇｏ、　ＣＡ）よりそれぞれ入手した。５ｆ−９細胞を、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒ ａｎｄＩｓｌａｎｄ、　ＮＹ）から人手されたグレーセスインセクトメディア（ ０゜３３％のラクタルブミン　ハイドロライセード及び０．３３％のイーストレ ートで捕捉されている）に１０％の熱により不活性化された胎児のウシ血清（Ｊ ＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｌｅｎｅｘａ、　ＫＳ）を加えた培地、１ミリリ ツトルあたり０．　３及び１．５ミリオン細胞個の範囲内の細胞密度に保たれた スピカー培養で生育させた。この培地は、ＧＣＭＳ＋１０％ＦＣ３と名付けられ ている。

α２．　３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの可溶性形態を次の方法によって作 成した。完全な形のα２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡを表す ｃＤＮＡを、二つのオリゴヌクレオチドをアンプライマーとして用いているＰＣ Ｒ法を行うための鋳型として用いｔ島　これらの二つのオリゴヌクレオチドは、 その酵素のシグナル／アンカー領域を結合するちょうどＣ−末端の位置（５゛） と３°　−非翻訳領域にあるポリ（Ａ）付加部位の上流（３°）でハイブリダイ ゼーションされている。５′末端でＢａｍＨＩ部位をコートする二個のオリゴヌ クレオチドは、ＰＣＲ生産物をｐＧＩＲ１９９のＢａｍＨ１部位でクローニング するのを可能にするオリゴヌクレオチドであって、プレーインスリンシグナル配 列を持つフレーム内に融合された。隣接するＮｈｅ１部位は、遺伝子融合体を遊 離させるために用いられ、このｃＤＮＡフラグメントは、バキュロウィルス　ト ランスファーベクター　ｐＢｌｕｅｂａｃで、そのバキュロウイルスのポリへド リンプロモーターのコントロール下、クローニングした。全ての組換えＤＮＡの 操作は、酵素マニュファクチャー操作書によって推奨されている条件の下で行っ た。ｐＢｌｕｅｂａｃベクターは、異なるバキュロウィルスプロモーターのコン トロールの支配下でＥ、ｃｏｌｉ　β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでおり、 組換えが行われかつＤＮＡベクターが取り込まれているウィルスは、染色体Ｘ− ｇａｌを青色の生成物に変換することができる。

組換えバキュロウィルスの創製は、続く操作手引書に推奨されているプロトコー ルに正確に従い、ＭａｘＢａｃ発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて 行った。簡単に説明すると、プラスミド及び野生型のウィルスＤＮＡを混合して から、燐酸カルシウム法によって５ｆ−９細胞をトランスフェクションするため に用いた。ウィルスはトランスフェクトされた細胞によって産生さね、培養培地 中に入り込んでいた。組換えウィルスは、１５０μｇ／ｍｌの濃度でプラーク培 地中に含まれるＸ−ｇａｌ上にあるβ−ガラクトシダーゼの作用によって生成さ れた青色によりプラークアッセイを行うことで同定し、反復しなからの希釈／プ ラーク形成によって野生型のウィルスから精製した。精製されたウィルスは、フ レッシュな５ｆ−９細胞を感染することによって５００ｍ１に広げられた。数個 のクローンについて、ラジオアクティブなシアリルトランスフェラーゼアッセイ で直接的に培地のアリコートをテストすることによって、感染された細胞培地中 にα−２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼを分泌させる能力を分析すべく下 記に説明するようにアッセイを行っｔ島 ウィルスを大量に増殖させる目的で、２５０ｍ２の細胞培養フラスコ内において ５ｍｌのＧＣＭＳ＋１０％ＦＣＳ中、３×１０６個の５ｆ−９細胞を、野生型ウ ィルスの含まれない単一の青色プラークを用いて感染させ、２７℃で５−７日間 、増殖させた。得られたウィルスストックから５ｍｌを採取し、遠心分離を行っ て精製し、更に増殖させた。対数曲線（１ｍｌあたり０．　５−１．　５×１０ ６個の細胞）を描いて増殖途中にある５ｆ−９細胞を、１感染効率（ｍｏｉ）の 多重度で、１ｍｌあたり１×１０７個の細胞濃度で感染させた。

この１感染効率は、１ｍｌあたり１×１０８プラーク形成ユニツト（ｐｆｕ）の ５ｍｌストック中でのウィルス力価を想定している。

細胞をＧＣＭＳ＋１０％ＦＣ８中で１０倍に希釈し、２７℃で５−７日間、増殖 させた。結果として得られるウィルスの精製を行い、ウィルス力価をプラークア ッセイによって決定したところ、だいたい１０９ｐｆｕ／ｍ１以上の大きさであ った。α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼを発現させるために、対数 生育曲線で２゜５×１０９個の５ｆ−９細胞を、５Ｆ−１０と言われるテントレ ーセルフアクタ−（Ｎｕｎｃ、　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）のそれぞれの 層の表面に植え付けた。それぞれのＣＦ−１０は、６０００ｃｍ２の全生育範囲 を持ち、細胞を容積３００ｍ１中に５ｍｏ　ｉ含まれる組換えノくキュロウイル スを用いてｉ染させた。１時間インキュベートした後で、１リツトルのエクセル −４００（Ｊ　ＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）よりなる血清フリーの培地が加え られ、さらにその細胞を２７℃で７２時間インキュベートした。その培地を集め てから精製し、０．２μｍフィルターユニットを通過させて濾過した。フレッシ ュな培地（２％の胎児のウシ血清を補充したエクセル４００）が加えられてから 、その細胞を更に４８時間、２７℃でインキュベートした。それからその培地を 収穫し、精製を行ってから濾過した。

α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼ活性は、公開されている分析法（ Ｓａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９）の変形法を行うことでアッセイした。

容積３０μｍ中において１４μｍのサンプルは、３．５μｌのラクト−Ｎ−テト ラオース（Ｇａｌβ１．３Ｇ　ｌ　ｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１．４Ｇｌｃ）と 、下記に説明するような１２．５μｍのアッセイミックスチャ−と混合した。そ のサンプルは簡単に混合されてから反応チューブの底面に引き延ばさね、続いて １０分間、３７℃でインキュベートした。その後その反応物を直ちに１ｍｌの５ ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ６を用いて希釈してから、０．５ｍｌのイオン交換カラム にかけた。そのカラムを流して、１ｍｌで洗浄したものを、シンチレーションチ ューブ内に集めて計数した。１ユニツトは、１分間に１マイクロモルのシアル酸 をアクセプターにトランスファーするのに必要な酵素量として規定されている。

反応のキネティックスが線形の範囲、即ち約１１００００ｃｐに保たれているそ のままの上澄あるいは希釈された上澄のいずれかからなるサンプルが、カラムか ら取り出された。そのアッセイ混合物は、０．６５ｍ１　（５０μＣｉ）の［１ ４Ｃコ−ＣＭＰ−シアル酸（ＮＥＮ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）をドライしてか ら、２．３ｍｇのＣＭＰ−シアル酸を含有する０、６５ｍ１の水中に再懸濁する ことによって調製し總　二二に、ＬＭ、ｐＨ６のソジウム力コディエート緩衝液 を０゜９６．２０％のトライトン　ＣＦ−５４を０．４８ｍ１．　ウシ血清アル ブミンの１ｍｌあたり５０ｍｇを溶液を０．２９ｍ１　（これらは全て、Ｓｉｇ ｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯから入手した。）を加え、さらに全体の用 量が８ｍｌになるように水を加えた。このアッセイ混合物の特殊活性を決定し、 それをアリコートしてから一２０℃で貯蔵した。

用いたイオン交換樹脂は、ＡＧＩ−Ｘ８．２００−４００メツシユ、燐酸型であ る（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）。

α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼの濃縮及び精製。

α−２，３ＮＳＴを含有する培地（１−３す・ントル）は濾過し、５ＩＹＩＯカ ートリツジを備えたアミコンＣＨＰＲ３らせん状カートリッジシステム中で、は ぼ２５０ｍ１になるまで濃縮した。その後そのユニットは、濾過モードを１０ｍ Ｍのカフダイ１ルツクアシ・ノドと、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５％のグリセロー ル、ｐＨ５，３の溶液を二倍容量を用いて濾過モードを行うことによって先の濃 縮した上澄の脱塩をおこなった。続いてそのサンプルをＳ−セファロースファー ストフｏ　−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）型のカラム（２，５×１７ｃｍ）にかけて 、緩衝液Ａを用いて２ｍｌ／分の流量速度で平衡した。その全てのサンプルはカ ラム上に載せてから、そのカラムを緩衝液Ａを用いて、カラム溶出物の０Ｄ２ｅ ｓがベースライン（１，６カラム容量）に戻るまで洗浄した。それからα−２， ３ＮＳＴを５０ｍＭのカコダイリックアシツドとＩＭのＮａＣｌ、２５％のグリ セロールからなり、ｐＨ６，５の溶液を用いてカラムから溶出させｒ＝　α−２ ，３ＮＳＴを含有するフラクションを集め、５０ｍＭのカコダイリックアシッド と０．５ＭのＮａＣ１，５０％のグリセロール、ｐＨ６，０の溶液ＩＬを用いて 一昼夜透析を行ったあとで、−８０００で貯蔵し九 実　験　例　８ １ニドじ−２３二凡二とり」佳旦之入乙ｇヒ」℃ｌ」 クローン化されたラットのα−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼの組織 への分配の特徴を調べるために、全ＲＮＡを種々のラットの組織から単離し、シ アリルトランスフェラーゼの３２ｐでラベルしたｃＤＮＡを用いて探索した。〜 ２，５ＫｂのｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションが全てのテストした組織 から観察された。二個のクローン化したシアリルトランスフェラーゼついて観察 すると、α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼはラットの組織中で異な った発現を示していた。α−２，３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼのｍ　Ｒ Ｎ　Ａの最高レベルは、脳内で検出された。

肝臓や腎臓、大腸、心臓、°卵巣、及び肺では中間レベルのメツセージを発現し 、これに対して顎下腺、膵臓、腸内ではｍＲＮＡが低レベルであった。反対に、 Ｇａｌβ１．４ＧＩｃＮＡｃ　ａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼのｍＲ ＮＡ　（４，７及び４．　３Ｋｂ。

４１．４６）の最高レベルはラットの肝臓や顎下腺内で検出さね、一方、ｍＲＮ Ａが低レベルであるのは心臓、卵巣、及び脳内であった。

実　験　例　９ にて　ｄ　・の　された シアリルトランスフェラーゼファミリーの保存された領域。

三つのクローン化されたシアリルトランスフェラーゼの第１構造の比較を行うこ とで、広範囲の相同性の領域が明らかになった（第１２図参照）。この領域は、 同定されたアミノ酸の４２％と、三つ全ての酵素の間に保存されているアミノ酸 の５８％とを伴うα−２゜３−Ｎ−シアリルトランスフェラーゼの１５６番目の 残基から２１０番目の残基までの５５個のアミノ酸からなっている。三つ全ての シアリルトランスフェラーゼの配列は、この領域の他には重要な相同性を有して いない。この領域の相同性が酵素の触媒領域の中心近くに局在しているため、こ の領域は、これらのシアリルトランスフェラーゼの酵素活性に対して必要な保存 された構造に相当するのであろう。

グリコジルトランスフェラーゼのうちのシアリルトランスフェラーゼファミリー の三つのメンバーは、これまでにクローン化されている。三つ全てのクローン化 されたシグナルの配列の８５％は、重要な相同性を有してはいないが、それぞれ の分子の中心にある５５個のアミノ酸領域は、シアリルトランスフェラーゼファ ミリー内のタンパク質モチーフを示唆しており、高度に保存されている。タンパ ク質モチーフは、特定の領域内にある充分に保存されたアミノ酸配列である。こ の領域以外の他のアミノ酸残基は、通常はほとんど保存されてはおらず、そのた め同じモチーフを含むタンパク質的であっても全体の相同性は低い。このような 定義づけによれば、三つのクローン化されたシアリルトランスフェラーゼの第１ 構造によって決定されている保存された領域力ζ　シアリルトランスフェラーゼ ファミリー内のモチーフである。

タンパク質モチーフは触媒内、またリガンド結合内によく見られる（Ｈｏｄｇｍ ａｎ、　Ｔ、　Ｃ，、Ｃｏｍｐｕｔ、　Ａｐｐｌｉｃ、　Ｂｉｏｓｃｉ、　５． １−１３　［１９８９］；　Ｂａ１ｒｏｃｈ、　Ａ、　Ｐｒｏｓｉｔｅ：　タン パク質部位及びパターンのディクショナリー、５ｔｈ　ｅｄｎ、、　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｖａ　［１９９０］；　ａｎｄ　Ｓｔｅｒｎｂｅｒ ｇ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｅ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４９．１１１　［１９９１コ参照 のこと）。三つの全てのクローン化されたシアリルトランスフェラーゼは、末端 のガラクトースのα−２，３リンケージあるいはα−２，６リンケージにあるＣ ＭＰ−ＮｅｕＡｃからシアル酸のトランスファーを触媒して、次の配列を形成す る。即ち、 ＮｅｕＡｃａ−２，３Ｇａｌβ１，３　（４）ＧＩｃＮＡｃ−（Ｓ７３Ｎ） ＮｅｕＡｃａ−２，３Ｇａｌβ１．　３ＧＩｃＮＡｃ−三つ全ての酵素は、共通 の機能を有している。保存された領域内にある残基のうちの５０％以上は、チャ ージされているアミノ酸あるいは極性のあるアミノ酸のいずれか一方であり、酵 素の表面にあるものと一致している。この領域にある６個のチャージされた残基 は、３個のシアリルトランスフェラーゼ全てで同一である。３個全てのクローン 化されたシアリルトランスフェラーゼ−Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙ ｓ、Ｔｈｒ、Ｔｈｒ　（第１２図参照）の中に、同一の保存された領域で、同一 の範囲の７個のアミノ酸残基が存在することは非常に目につくことである。

実　験　例　１０ ６　の　された　いる　な シアリルトランスフェラーゼのクローニン相同性の保存された領域は、シアリル トランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのもう一つのメンバーであるシアリルトラ ンスフェラーゼ遺伝子をクローニングする目的で用いられる。

したオ！ゴヌクレ　チド　いたＰＣＲクローニン相同性の保たれた領域の５゛及 び３′末端に対応する二つの縮重したオリゴヌクレオチド（第１３図参照）が合 成された（Ｇｅｎｏｓｙｓ）。

５′及び３′のプライマー配列は、それぞれ５’　ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＴ ＲＧＴＹＴＴＮＳＮＳＣＣＡＣＲＴＣ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ＋ＣＳ　Ｓ＝Ｇ＋Ｃ，Ｒ ＝Ａ十Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ，Ｙ＝Ｃ＋Ｔ）であった。ＰＣＲ操作はそれぞれ１００１ ００ｐのプライマーと、鋳型としての新生ラットの脳から合成された第１番目の ｃＤＮＡ配列とを用いて行った。増幅を、９４℃で１分間、３７℃で１分間、そ して７２℃で２分間というサイクルを３０回繰り返して行った。ＰＣＲによる生 成物を、Ｂａｍ　ＨＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩを用いて切断してから、ブルースク リプト　Ｋ　Ｓ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　１１０９９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒ ｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３７）の これらの部位にサブクローニングした。得られたサブクローンは、Ｔ３プライマ ーを用いて配列決定することによって特徴を決定した。これらのサブクローンの 一つから増幅したフラグメントであるＳＭＩは、シアリルトランスフェラーゼを コードするＳＭＩ含有遺伝子をスクリーニングするために以下のように用いた。

ＳＭＩＡ　′　−のクローニン ランダムプライマーを用いて作成した新生ラットの脳のｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ −ＮｏｔＩリンカ−を用いて接合し、続いてＥｃ。

ＲＩで切断したλｇｔｌｏに接合した。結果的に得られたライブラリーは、抽出 物をパッケージするＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩを用いてパ ッケージされて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｈｆｌ上に植えつけられた。約１０６ 個のプラークがクローン化したＳＭＩ　ＰＣＲフラグメントを用いてスクリーニ ングされた。４個のクローン、５ＴＸ１−４が精製されてからブルースクリプト （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔ１部位にサブクローニングさね、次の分析が 行われた。

ムニｆ之公所 ラットの組織から得られた全ＲＮＡは前述した酸フェノール法を用いて調製され た（Ｃｈｏｍｏｚｎｓｙｉ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　１６２．１３６−１５９　［１９８７コ参照）。新生のＲＮＡサンプ ルは、生後４日以内の子ラットから単離された。ＲＮＡは、ホルムアルデヒドを 含む１％のアガロースゲル内で電気泳動が行わわ、ニトロセルロースに転写され たのち、続く標準的な手法を用いてハイブリダイゼーションが行われた（Ｋｒｉ ｅｇｌｅｒ、　Ｍ、　Ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　ｅｚｐｒｅｓｓｉ ｏｎ、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、　Ｙ、、　Ｎ、　Ｙ、　［１９９ ０コ参照）。精製されたゲルと、放射ラベルさね、５ＴＸＩから単離された９０ ０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして用いてノーザンプロット分析 が行なわれへ 足工入■ユ蓋社ＩΩ」蓬 切り取られた形のＳＴＸ、　即ちペンリーディングフレームの３１個のアミノ酸 を欠如したＳＴＸは、インフレームのＢａｍ　Ｈ１部位を含む５゛プライマーと 、ｓｔｐコドンの５０ｂｐ下流側に位置づけられている３゛プライマーとを用い たＰＣＲ増幅によって調製された。増幅は、９４℃で１分間、４５℃で１分間そ して７２℃で２分間を３０回サイクル処理して行われた。組み入れられたベクタ −ｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡには、ｐＧＩＲ２０１（コロンビア大学のＤｒ、　 Ｋ、　Ｄｒｉｃｋａｍｅｒより譲り受けた。）のＢａｍ　Ｈ１部位に、ｐ　ＲＩ 　Ｔ　５　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、　１ ０２５　Ａｔ１ａｎｔｉｃ　Ａｖｅｎｕｅ、　５ｕｉｔｅ　１０１．　Ａｌａｍ ｅｄａ、　ＣＡ　９４５０１）から単離されたＢｃｌＩ／Ｂａｍ　Ｈｌフラグメ ントが挿入さね、タンパク質ＡＩｇＧ結合領域をコードさせることによって構築 されｔ：６　その増幅されたフラグメントは、ｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡのＢａ ｍ　ＨＩ部位にサブクローニングさね、結果としてインスリンシグナル配列及び ベクターにあるタンパク質ＡにＳＴＸの融合がなされた。この融合タンパク質を 含有するＮｈｅフラグメントは、プラスミドｐＳＶＬにサブクローニングされて 、その結果、発現型プラスミドＡＸ７８が得られた。

ＳＴＸの口゛　型の 発現型プラスミドＡＸ７８　（１０μｇ）は１０ｃｍのプレートに載せたＣＯ５ −１細胞にトランスフェクションされた。トランスフェクションした後の２日目 に、この培養培地を回収し、それをＩｇＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 　を用いて１時間、室温下でインキュベートした。ビーズを、アクセプターの基 質としてオリゴ糖、アンチフリーズ糖タンパク質、混合ガングリオシド、あるい はノイラミニダーゼで処理された新生ラットの脳の膜を用いてシアリルトランス フェラーゼ活性についてアッセイした。これらのアクセプターへのシアリル酸の トランスファーは、イオン交換法を用いて測定された（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　 Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７１３８３５− １３８４４　［１９８２］、　５ｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　（Ｉｄ、）、ａ ｎｄｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ　ｐａｐｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈＹ　（Ｍ ｃＣｏｙ、　Ｒ，Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６ ０１２６９５−１２６９９　［１９８５］）参照）。

相同性のトランスフェクションは、パルス−チェイスラベリング装置で行われた 。３６時間の発現期間に引続き、そのプレートを３７℃で２．５ｍｌのＤＭＥＭ −メ千オンとともにインキュベートした。１時間経過後、２５０ｕＣＩ３５Ｓ− トランスラベル（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　２６３６　Ｓ、　Ｃ１ａｉｒｅｂｒｏｏ ｋ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｂｔｓ、　ＩＬ　６０００５）をその培地 中に加えてから、そのプレートを更に３時間インキュベートした。

このあと、そのプレートを洗浄し、完全なりＭＥＭを用いて一晩インキユベート した。ラベルされた融合タンパク質は、ＩｇＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｆ ａ）を用いたインキュベートによって単離された。

続いてそのビーズを結合した後、洗浄し、ラエマリーサンプル緩衝液中でボイル し、分泌されたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーによって分 析した。

が日゛かにされたシアミルトランスフェラーゼに　る６　゛の　た　のＰＣＲ− 一 特徴が明らかにされたシアリルトランスフェラーゼの相同性の保存された領域に 存在するアミノ酸は、そのうち約７０％が保存されている。保存性のある最大の 連続領域は、相同性の保存された領域の末端部分のアミノ酸配列に存在している （第１３図参照）。相同性の保存された領域のＣ−末端近くのアミノ酸配列には 、７個の不変な残基の連続配列か含まれていることが分かっている。このアミノ 酸配列のしっかりとした保存性があることが、コドンの利用において観察された 全てのバリエーションを含んだ２５６倍の縮重性をもつ相対的に複雑性の低いオ リゴヌクレオチドのデザインを可能にした。相同性の保存された領域のＮ−末端 に対応するオリゴヌクレオチドをデザインすることは、更に困難である。この領 域に存在するアミノ酸は、相同性の保存された領域の反対側の末端に存在してい るアミノ酸配列よりもかなり変化に富んでいることを示している。

オリゴヌクレオチドのデザインは、アミノ酸のコドンの重複度が高いためにより 複雑となる。相同性の保たれた領域の５゛末端からのオリゴヌクレオチドは、こ れらの要因を補償するために、１０２６倍の縮重度で合成されｔ＝　複雑性のこ の程度は、ＰＣＲＥ実験で許される縮重性の限界付近であるが、結果として得ら れたプライマーは、相同性の保存された領域のこの領域をコードすることが見い だされた全ての核酸配列を明らかにした。

神経の発生は、細胞表面の炭水化物発現物に見いだされる劇的な変化から明かと なるように、グリコジルトランスフェラーゼがダイナミックな調節の主因として 働く複雑な過程である。この理由により生まれたばかりのラット脳は、新しいシ アリルトランスフェラーゼを単離するためのソースとして選ばれている。鋳型と して生まれたばかりのラット脳ｃＤＮＡを用いることによって、縮重プライマー を用いたＰＣＲ実験は、１５０ｂｐバンド、すなわち相同性の保存された領域の 既知のサイズに一致したものの増幅をもたらす。サブクローニングや配列決定は 、そのバンドが、二つのＤＮＡフラグメントの混合物であることを明らかにした 。特徴づけされた３０個の単離物のうち、５６％がαの相同性の保存された領域 をコードしていた。さらに、残りのクローンはＳＭｌという相同性の独特の保存 された領域をコードしていた。やや驚くべきことに、ＳＭｌは、三つの既にクロ ーン化されたシアリルトランスフェラーゼで不変であることが見いだされたアミ ノ酸において、五つの変化を含んでいる。これらの変化は、不変残基のトータル 数を減らすが、ＳＭＩの特徴づけによってもたらされた新しい配列情報は、コン センサス配列の全体的な保存性を高める。

ＳＭＩの差し示されたアミノ酸配列は、相同性の保存された個別のいかなる領域 にたいする予想にも反する。いくつかの場所（アミノ酸　１．２．５３．５４） で、ＳＭＩは、相同性のα２，６の保存された領域に似ている。他の場所（アミ ノ酸　８．９．５４．５５）では、ＳＭｌは、相同性のα２，３の保存された領 域に見いだされる配列を反映している。相同性の保存された領域は、８５％保存 されているが、この類似性のバランスは、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子フ ァミリーの他のメンバーにおよそ４５％の相同性のあるＳＭＩとなるように導く 。

遣］−一　むＳＭＩの１゛１ １．５Ｋｂクローンの５ＴＸＩの配列解析は、先のＰＣＲ実験で特徴づけされた 相同性の保存されたＳＭＩの領域をコードする、−続きの３７５個のアミノ酸の オーブンリーディングフレームを同定した（図１４）。ＳＴＩの決定されたアミ ノ酸配列は、他のクローンされたそれぞれのグリコジルトランスフェラーゼに見 られるように、このタンパク質は、タイプＩＩの膜貫通タンパク質である。ＳＴ １の指し示されたアミノ酸配列は、シグナル−アンカー領域として役立つであろ う、タンパク質のアミノ末端から８個の残基からなる疎水性領域の存在を示して いる。相同性の保存された領域は、タンパク質の中心付近に位置している。ＳＴ Ｘタンパク質の全サイズと疎水性領域と相同性の保存された領域の両方の相対的 な位置関係は、クローン化されたシアリルトランスフェラーゼの一次配列の特徴 に類似している。ＳＴＸは、相同性の保存された領域を除いてクローン化された シアリルトランスフェラーゼに対する相同性を少しも示さないけれども、これら 遺伝子の前述した構造類似性があることで、ＳＴＸが、この遺伝子ファミリーの 最も新しい一員であることが明らになっている。

Σニス！」ＩＩ清劃側 シアリルトランスフェラーゼの自然になる可溶性の形態は、様々ｅｍ、　４９８ ２９−８３７　［１９７１］）。これらの可溶性の形態は、シアリルトランスフ ェラーゼのステム領域を切断して、膜貫通のアンカーから触媒領域を切り離すと いうタンパク質分解から生じる。可溶性シアリルトランスフェラーゼは、内在性 のシグナル−アンカーを切断可能なシグナル配列で置き換えることによる組換え 技術を用いて作ることができる（Ｃｏｌｌｅｙ、　Ｋ、　Ｊ：、ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４１７６１９−１７６２２　［１９８９ ］）。ＳＴＸの機能的解析を行うため（ミそのタンパク質の可溶性形態は、最初 の３１個のアミノ酸を切断できるインシュリンシグナル配列やプロティンＡ　Ｉ ｇＧ結合領域で置き換えることによって作られた。ＩｇＧ結合領域は、可溶性の ＳＴＸタンパク質の検出に係わるところに含まれていた。５Ｔ３Ｎとの同様な融 合体は、ＩｇＧセファロースに結合されることで、発現細胞から積極的に分泌さ ね、酵素的に活性である。プロティンＡやＳＴＸ融合体を含む発現プラスミドが 、ＣＯ５−１細胞で発現さね、８５Ｋｄタンパク質が単離された。融合体タンパ ク質のサイズは、多くのＳＴＸの強力なＮ結合グリコシレージョン部位が使われ るべきだと提案されたポリペプチドの示された分子量より大きくて、およそ１５ Ｋｄである。

結合した融合タンパク質については、様々な基質受容体を用いてシアリルトラン スフェラーゼ活性が試験された。活性は、Ｇａｌβ１．３　（４）Ｇ　Ｉ　ｃＮ Ａｃ配列を含むβ−ガラクトシド受容体を用いると検出されなかった。同様に、 シアル酸をアンチフリーズ糖タンパク質の〇−結合したオリゴサツカライドに転 移する活性も検出されなかった。脳組織内でＳＴＸの発現から、その遺伝子が糖 脂質生合成に関係していることが示唆された。しかし、成熟したウシ脳由来の雑 多なガングリオシドは、基質受容体として役立たなかっｔ島ニューロアミダーゼ 処理された新生児脳膜は、たった１つの基質に対してのみ受容体としての能力の 片鱗を見せた。ＳＴＸ融合タンパク質で処理された細胞膜をインキュベートする ことで、バックグラウンドに対して５０％の活性増加が示された。

ＳＴＸの、生゛　と、、　・ ＳＴＸ遺伝子の発現パターンとその強度を決定する目的で、５ＴＸ１から単離さ れた９００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとしてノーザンプロット分 析を行った。試験された様々な組織の５．５ｋｂｐを目的とするハイブリダイゼ ーションは、新生児ラット脳ＲＮＡでのみ観察されｔミ　相同性が保存された領 域近辺に対するクロスーハイプリダイセーションは観察されなかった。ＳＴＸの 制限された発現は、特徴のあるシアリルトランスフェラーゼに観察される組織特 異的な発現から出発する。これらの遺伝子がそれぞれ独立にコントロールさね、 その結果、組織特異的発現の異なるパターンを生み出す一方で、一般にどのシア リルトランスフェラーゼも多様多彩な組織でさまざまに発現している（Ｐａｕｌ ｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ ４１０９３１−１０９３４　［１９８９コ）。これとは対照的に、ＳＴＸは新生 児脳でのみ発現さね、その発現は、新生児腎臓では検出されないように、法則化 された初期発生の段階では現れない。

ロＱＯロロロロロロロロロロロロロロロのｎのψトかψ〜いい寸■の一〜寸−ト Ｑ口φ円■ψ−〜　曽−！−い−ψ〜ト〜■〜ＯＳ曽Ｏｘ　ｌ”）　Ｃｆｆ：　 （”１ｓｒ−５占十′ｌ！（ラクトースン ＣＴＰ　（ｍＭ７ ２１　Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＣＤＤＨ 第５図 目 ↓雨量 Ｓｒ　（ツ千Ｊ）主１２シアソｌレトラシスフエラー也゛）ロ　シフ゛′ｒル− 了ンカー々胸仁灸゛θσ１２−２７）図１−ｒｌ騒”　（ａａ　２ａ−５ｔｙ） 口ｈｇＱｄ、　（００５６−Ｊ４Ｊ） ｓｐ−５Ｔ　（シフ′切しヘ・）３テドーシ７・）ルートラ〉スフェラーゼノシ ブナ・レベフ・子ドめｍダしｔ＞イ立ロ　インシシ１）ンシブルへｏ７°すＶ、 ｑ−ｙミノ饋口触嫌値威（ａａ４６−３４３７ 第８図 区　ミづミミ冶ジｅ弓＆ミ） Φ　相ブす強戊 法 ｏ　５　ｏ　も　ｏ　ｃｂ　ｃｂ　ｃｂ　ｃｂ　ｂ　５（）ＯＨζ　へ　癲　喝 　聾　１　Ｎ　Ｎ１対強爪 区 Ｌｌ”＞６　Ｌ、Ｉ−ロー ′″　′″−２″′　壕 、、、、、、、、＝ＮｌｌＰＣＴ／ＵＳ９３１０２００２．　、、　ＰＣＴ／Ｕ Ｓ　９３１０２００２フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ。

Ａ （７２）発明者　ボールソン　ジェームス　イー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９０２１４　デルマー　トーレイパインズテラス２０９ （７２）発明者　ウエン　シャオホン アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２１２２　サンディエゴ　カララブレイスフ２６０−エイ （７２）発明者　リビングストン　プライアン　デュアンアメリカ合衆国　カリ フォルニア州 ９２１２６　サンディエゴ　コピナストリートロ１５ （７２）発明者　ジレスピー　ウィリアムアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９０２３０　カルバ−シティ　ガルビンストリート１０７６１ （７２）発明者　ケルム　ソージ ドイツ　ディー−２３００キエル　１４　ドルフシュトラーセ　１４ （７２）発明者　バーリンゲイム　アルマ　エル。

アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４９６５　サウサリート　アレクサンダーアベニュー　２６ （７２）発明者　メドツィラドスキー　カラリンアメリカ合衆国　カリフォルニ ア州 ９４１２２　サンフランシスコ　エイスアベニュー　１８６７

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．ｉｎ ｖｉｖｏの生理的環境に存在する物質が本質的に含まれず、ただしそ のシアリルトランスフェラーゼがラットのＧａＩβ１、４ＧＩｃＮＡｃ α−２ ，６−シアリルトランスフェラーゼ以外のシアリルトランスフェラーゼであるこ とを特徴とするシアリルトランスフェラーゼ。
2. ２．前記シアリルトランスフェラーゼカ、水溶性であることを特徴とする請求の 範囲第１項に記載のシアリルトランスフェラーゼ。
3. ３．所定のアミノ酸残基の置換、あるいは所定のアミノ酸残基の挿入、あるいは 所定のアミノ酸残基の欠損が起きていることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載のシアリルトランスフェラーゼ。
4. ４．アミノ末端の膜貫通領域が欠損していることを特徴とする請求の範囲第３項 に記載のシアリルトランスフェラーゼ。
5. ５．アミノ末端の細胞質領域が欠損していることを特徴とする請求の範囲第３項 に記載のシアリルトランスフェラーゼ。
6. ６．アミノ末端の膜貫通領域、細胞質領域、及びステム領域が欠損していること を特徴とする請求の範囲第３項に記載のシアリルトランスフェラーゼ。
7. ７．請求の範囲第１項に記載のシアリルトランスフェラーゼが天然のグリコシレ ーションを伴わないシアリルトランスフェラーゼであり、かつラットのＧａＩβ １、４ＧＩｃＮＡｃ　α−２，６−シァリルトランスフェラーゼ以外であること を特徴とするシアリルトランスフェラーゼ。
8. ８．シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ単離物であって、そのＤＮ Ａ単離物がラットのＧａｌβ１、４ＧＩｃＮＡｃ　α−２，６−シアリルトラン スフェラーゼ以外のＤＮＡ単離物であることを特徴とするＤＮＡ単離物。
9. ９．前記ＤＮＡ単離物が、シアリルトランスフェラーゼイントロンを含まないこ とを特徴とするＤＮＡ単離物。
10. １０．請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ単離物がもう一つのポリペプチドをコー ドする遺伝子ＤＮＡを含まず、そのもう一つのポリペプチドのＤＮＡが前記ＤＮ Ａ単離物と同一種から得られることを特徴とするＤＮＡ単離物。
11. １１．シアリルトランスフェラーゼをコードする前記ＤＮＡが、少なくとも約２ ０個のアミノ酸の相同性の保存された領域を含むことを特徴とする請求の範囲第 ８項に記載のＤＮＡ単離物。
12. １２．シアリルトランスフェラーゼをコードする前記ＤＮＡが、ヘプタペプチド である【配列があります】からなる７個のアミノ酸のうちの少なくとも約５個の アミノ酸の相同性の保存された領域を含むことを特徴とする請求の範囲第８項に 記載のＤＮＡ単離物。
13. １３．少なくともだいたいのヘプタペプチドモチーフの保存された領域が、第２ 図に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１５６−２１０番目から選択されたこ とを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ単離物。
14. １４．前記ヘプタペプチドモチーフが、【配列があります】であることを特徴と する請求の 範囲第１３項に記載のＤＮＡ単離物。
15. １５．少なくともだいたいのヘプタペプチドモチーフの保存された領域が、第１ 図に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１４２−１９６番目から選択されたこ とを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ単離物。
16. １６．前記ヘプタペプチドモチーフが、【配列があります】であることを特徴と する請求の 範囲第１５項に記載のＤＮＡ単離物。
17. １７．前記ＤＮＡシアリルトランスフェラーゼが、少なくとも約４８個のアミノ 酸の相同性の保存された領域を含むことを特徴とする請求の範囲第８項に記載の 単離物。
18. １８．少なくとも約５５個のアミノ酸の相同性の保存された領域が、第２図に示 されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１５６−２１０番目から選択されたことを特 徴とする請求の範囲第１７項に記載の単離物。
19. １９．シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクタ ーであって、そのシアリルトランスフェラーゼがラットのＧａＩβ１、４ＧＩｃ ＮＡｃ　α−２，６−シアリルトランスフェラーゼでないシアリルトランスフェ ラーゼであることを特徴とする組換え発現ベクター。
20. ２０．請求の範囲第１９項に記載された組換え発現ベクターを用いて形質転換さ れだ細胞を含むことを特徴とする構成物。
21. ２１．前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の 構成物。
22. ２２．シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを持つベクターを構築す る工程、そのベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、及びその形質転換 された細胞を培養する工程を含むシアリルトランスフェラーゼを産生する方法で あって、前記シアリルトランスフェラーゼがＧａＩβ１、４ＧＩｃＮＡｃ　α− ２，６−シアリルトランスフェラーゼでないことを特徴とするシアリルトランス フェラーゼを産生する方法。
23. ２３．請求の範囲第２２項に記載のシアリルトランスフェラーゼを産生する方法 が更に、前記シアリルトランスフェラーゼを回収する工程を含むことを特徴とす るシアリルトランスフェラーゼを産生する方法。
24. ２４．前記宿主細胞が、真核細胞であることを特徴とする請求の範囲第２３項に 記載のシアリルトランスフェラーゼを産生する方法。
25. ２５．前記真核細胞が、ＣＯＳ細胞系であることを特徴とする請求の範囲第２４ 項に記載のシアリルトランスフェラーゼを産生する方法。
26. ２６．前記真核細胞が、ヒトの腎の真核細胞系であることを特徴とする請求の範 囲第２４項に記載のシアリルトランスフェラーゼを産生する方法。
27. ２７．第１図あるいは第２図に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードするＤＮＡ単離物。
28. ２８．次の工程（ａ）〜（ｄ）、即ち、ａ．シアリルトランスフェラーゼの相同 性が保存された領域に対応するオリゴヌクレオチドプローブを準備する工程、ｂ ．前記オリゴヌクレオチドプローブを用いてＤＮＡライブラリーをハイブリダイ ゼーションすることによってスクリーニングする工程、 ｃ．前記工程ｂのハイブリダイゼーションを検出する工程、ｄ．前記工程ｃの生 成物を回収する工程からなることを特徴とするシアリルトランスフェラーゼをコ ードするＤＮＡを生成する方法。
29. ２９．前記オリゴヌクレオチドプローブが、【配列があります】及びその変異体 をコードする ヌクレオチド配列を持つ請求の範囲第２８項に記載されたＤＮＡを生成する方法 。
30. ３０．次の工程（ａ）〜（ｆ）、即ち、ａ）シアリルトランスフェラーゼをコー ドする遺伝子を含む核酸ライブラリーを構築する工程、 ｂ）相同性の保存された領域におけるヘプタペプチドから得られる少なくとも約 ５個のアミノ酸をコードする塩基対に結合するブライマーを用いてポリメラーゼ チェインリアクション（ＰＣＲ）法を行うことによって、シアリルトランスフェ ラーゼをコードするＤＮＡを増幅する工程、 ｃ）好適なベクターにＰＣＲ生成物をサブクローニングする工程、ｄ）クローン を含有する相同性の保存された領域を同定するために個々のＰＣＲクローンを配 列する工程、ｅ）前記工程（ｄ）の生成物を用いて核酸ライブラリーをスクリー ニングする工程、 ｆ）前記工程ｅ）の生成物を回収する工程、からなることを特徴とするシアリル トランスフェラーゼをコードするＤＮＡの回収方法。
31. ３１．第２図に示されたアミノ酸配列の１５６−２１０の４８個のアミノ酸のう ち少なくとも１７個のアミノ酸が保存されていることを特徴とする請求の範囲第 ８項に記載の単離物。
32. ３２．第１図に示されたアミノ酸配列１４２−１９６の４８個のアミノ酸のうち 少なくとも１７個のアミノ酸が保存されていることを特徴とする請求の範囲第８ 項に記載の単離物。
33. ３３．第１４図に示されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求の範囲第１ 項に記載のシアリルトランスフェラーゼ。
34. ３４．第１４図に示されたヌクレオチド配列を持つことを特徴とする請求の範囲 第８項に記載のＤＮＡ単離物。
35. ３５．請求の範囲第１９項に記載された組換え発現ベクターにおいて、そのベク ターのＤＮＡが、第１４図に示されたヌクレオチド配列を有することを特徴とす る組換え発現ベクター。
36. ３６．請求の範囲第１５項に記載された組換え発現ベクターを用いて形質転換さ れた細胞からなることを特徴とする構成物。
37. ３７．請求の範囲第２２項に記載されたシアリルトランスフェラーゼを産生する 方法において、そのシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、第１４ 図に示されたヌクレオチド配列を持つことを特徴とするシアリルトランスフエラ ーゼを産生する方法。
38. ３８．相同性の保存された領域をコードするＤＮＡフラグメント。
39. ３９．第１３図に示された核酸配列を持つことを特徴とする請求の範囲第３８項 に記載のＤＮＡフラグメント。