JPH07505903A

JPH07505903A - オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基

Info

Publication number: JPH07505903A
Application number: JP5519276A
Authority: JP
Inventors: レディー、パラメスワラ　メダ; ハンナ、ネイーム　バトロス
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-09
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: EP0637314B1; US5428148A; DE69319336D1; EP0637314A1; DE69319336T2; JP3368352B2; WO1993022326A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基園１土届この出願はここに同時出願されるパラメスワラ・メダ・レディ及びナエム・ホトロス・ハナによる名称「オリゴヌクレオチド類の開裂及び脱保護の方法及び試薬類」の米国特許出願番号第□号（ベックマン整理番号１２８Ｄ−１１１）に関係している。その関連出願はここに参考として取り入れられる。

及」二旦号本発明は一般に核酸類の合成、特に核酸類の合成において有用な保護基に関する。

及五匹麓旦デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核Ｍ　（ＲＮＡ）は長い糸状の巨大分子であり、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド類の鎖を含んでなり、ＲＮＡはリボヌクレオチド類の鎖を含んでなる。ヌクレオチドはヌクレオシド及び１またはそれ以上のリン酸（ホスフェート）基からなり、ヌクレオシドはペントース糖に結合した含窒素塩基からなる。典型的には、リン酸基はペントース糖の第５炭素（Ｃ −５）ヒドロキシル基（ＯＨ）に付着しているが、第３炭素ヒドロキシル基（Ｃ −３０Ｈ）にも付着することができる。ＤＮＡの分子内で、ペントース糖はデオキシリボースであり、他方ＲＮＡの分子内で、ペントース糖はリボースである。

ＤＮＡ中の含窒素塩基はアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）である、これらの塩基はＲＮＡについてもウラシル（Ｕ）がチミンを置き換える以外同じである。したがって、集団的に［デオキシヌクレオチド類」と呼ばれるＤＮＡの主要ヌクレオチド類は次の通りである：デオキシアデノシン（ｄＡ）　、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）及びチミジン（Ｔ）である。対応するりボタクレオチド類はＡ、Ｃ，Ｇ及びＵで示される。（便宜上、及び対応するチミジンリボヌクレオシドが存在しないから、デオキシチミジンは典型的にＴで示されるが、整合性の上から、チミジンはこの開示中ではｄＴで示す、）ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の含窒素塩基の配列はその分子内に含まれる遺伝情報をコード化する、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖及びリン酸基は構造的な役目を果たし、分子のバックボーンを形成する。特に、各ヌクレオシドの糖部分は隣接ヌクレオチドの糖部分に結合して、１つのヌクレオチドのペントース糖の３゛−ヒドロキシルが隣接ヌクレオチドのペントース糖の５゛−ヒドロキシルに結合する。

２つのペントース糖量の結合は典型的にはリン酸ジエステル結合を経ている。この結合プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に基づいて、ヌクレオチド類の一端（末端）は５゛末端（例えば、ヒドロキシル、トリリン酸など）を有しており、他端は３°−ヒドロキシル基を有している。便宜上、ヌクレオチド類の塩基配列は５゛から３°の方向に記載され、すなわち、５°−ＡＴＣＧ−３’　または単にＡＴＣＧと記載される。

ＤＮＡ及びＲＮＡは生きている動物によりその内部で製造されるけれども、化学的に合成することができ、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成ストランドが迅速かつ効果的に製造できる。これらのストランドは「合成オリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。広く利用されるオリゴヌクレオチド類合成用の化学的操作は「ホスホルアミダイト法」と呼ばれる。例えば、米国特許第４，４１５．７３２号、マクブリッド・エル及びカルザース・エム、テトラヘドロン・レターズ（ＭｃＢｒｉｄｅ　Ｌ、　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）、２４　：　２４５−２４８　（１９８３）　、及びシ：／／％　１　！ヌら、ヌクレイツク・アソツド・リサーチ（Ｓｉｎｈａ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　、Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５）上ユニ４５３９−４５５７　（１９８４）参照、これらは全てここに参考として取り入れられる。ホスホルアミダイト法に基づく商品として入手可能なシンセサイザー（合成装置）には例えばバイオリサーチ８７５０”及びＡＢＩ３８０ＢＴＭ、３９２Ｔゝ及び３９４７“ＤＮＡシンセサイザーが含まれる。

化学的合成オリゴヌクレオチド類の重要性は、基本的にそれらヌクレオチド類が用いられる広く変化に富んだ用途による。例えば、オリゴヌクレオチド類は遺伝子工学、組換えＤＮＡ技術、アンチセンスＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ検出、種々の系からのＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、蛋白質−ＤＮＡ複合体の検出、サイト指向突然変異誘発の検出、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用プライマー、ポリメラーゼ鎖反応やりガーゼ鎖反応などのような増幅技術用プライマー、鋳型、リンカ−１分子相互作用研究を含む生物学研究において利用することができる。

ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の主要な構造は次のように表すことができる。

旦ΣＡ　且ＮＡＢ；アデニン、チミン　Ｂ、＝アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン　グアニン、シトジン核酸合成の鍵となる段階は１つのヌクレオチドの５゛　−ＯＨ基ともう１つの３°　−ＯＨ基の間のヌクレオチド内リン酸結合を特異的かつ配列順に形成させることである。したがって、オリゴヌクレオチドの典型的な合成において、「入ってくる」ヌクレオチドのリン酸基はもう１つのヌクレオチドの５ ′　−ＯＨ基と結合する（すなわち、５°　−ＯＨ基が「リン酸化」または「亜リン酸化」される）。

これらの基はオリゴヌクレオチドの合成に活性的に関与できなければならない。

このように、研究者が２つのそのようなヌクレオチドを反応室に導入し、その中の条件を２つのヌクレオチドが正常に結合するよう調節し、そのような付加を一連して順次行うことにより一定の配列を有するオリゴヌクレオチドの生成が正確に達成できるように、５゛　−ＯＨ基は（典型的にはジメトキントリチル（ＤＭＴ）基により）変性される。

ヌクレオチド類の４つの塩基、アデニン、チミン（ＲＮＡの場合はウラシル）、グアノシン及びシトシン、は化学的に反応活性のある部分（例えば、環外アミノ基）を含をする。これらの基は３゛−０Ｈ基及び５’　−ＯＨ基とは異なり、一時的に保護されねばならず、すなわち、保護基はオリゴヌクレオチド合成の完了後まで塩基上の全ての反応性部位を封鎖できるものでなければならず、その合成が完了後これらの基はまたオリゴヌクレオチドの生物学的活性が悪影響されないように塩基類から除去できるものでなければならない。

塩基を一時的に保護することの主要な理由は、そのような保護基がない場合、塩基類の環外アミノ基（ＮＨ，）が５°−ＯＨ基と結合競争することになる。もしそのような反応が生じると、得られる生成物は有用でなくなる。したがって、これら保護基は副生成物形成、すなわち、化学的に類似であるが所望でない物質の生成の発生を減少させるのに重要である。シチジンは特にオリゴヌクレオチドの開裂及び脱保護（すなわち、それぞれ、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの除去及びその保護基の除去）中に副生成物形成をうけ易い。ホスホルアミダイト法に関連して最も広く用いられる保護基は、Ａ及びＣにはベンゾイル、Ｇ及びＣにはイソブチリル（アミノ基を持たないチミンは本来保護基を必要としない）である０便宜上、ベンゾイルはｂｚ、インブチリルはｉｂｕで表し、それらで保護されたデオキシヌクレオチドばｄＡ”、ｄＣ”、ｄＣ”１１．ｄＧｌｂｕで示す。

ベンゾイル及びイソブチリルは下記の構造を持つ：有利にも、これら保護基はオリゴヌクレオチドからアンモニアにより除去（すなわち、脱保護）することができる。その上、アンモニアはオリゴヌクレオチドが合成された固体支持体物質からオリゴヌクレオチドを除去（すなわち、開裂）するのに用いることができる。

有利にも、アンモニアは副生酸物形成が制限されており開裂／脱保護試薬として使用することができる。

しかしながら、アンモニアの開裂及び脱保護試薬としての使用に関し実用上の問題が存在する。アンモニアは開裂及び脱保護を完了するのに（比較的）長い時間を必要とする。平均して、オリゴヌクレオチドを成長させるのに各ヌクレオチドの化学的合成に６分間が必要であり、それゆえ約２１のヌクレオチドの平均的オリゴヌクレオチド（２１−量体と呼ぶ）には、商品として入手できるＤＮＡシンセサイザーを用いて合成に約２時間を必要とすることが考えられる。しかしながら、アンモニアを用いるオリゴヌクレオチドの開裂及び脱保護には約２４時間（室温）から６時間（５５℃）が必要である。明らかに合成自体よりも開裂及び脱保護の最終段階に、より多くの時間が必要である。このように、開裂及び脱保護段階を合成自体とほぼ同じ程度の範囲で完了させることができる開裂及び脱保護試薬の存在がめられている。そのような試薬が上記に引用し、参照のためここに取り入れられる関連出願に開示される。

広くには、そのような試薬は１から約１０の炭素原子を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミン（−ＮＨ，（ＣＨ，）。−１゜−ＣＨ，で表すことができるようなアルキルアミン）を含んでなるものである。上記関連出願に開示された試薬の特に好ましい態様において、メチルアミン及びｔ−ブチルアミンを含んでなる試薬を室温で約９０分未満で、また約６５℃で約１０分未満で開裂及び脱保護に利用することができる。

これらの試薬がｄＣ１′″′またはｄＣ”を含んでなるオリゴヌクレオチドと関連して用いられた時に、所望でない副生成物、Ｎ−メチルシチジンの生成が発生することが観察された。ｄｅｌｌｌに関してオリゴヌクレオチド内のシチジンの約１０％がＮ−メチルシチジンであった。そのように、一方では開裂／脱保護操作を迅速に達成できる開裂／脱保護剤が発見されたが、他方その試薬は塩基シチジン用のいわゆる伝統的なりｚ及びｉｂｕ保護基に関連して使用した時に、シチジン副生成物形成をもたらした。

そこで請求められるのはそのような有害な副作用を有さないオリゴヌクレオチド合成に有用な保護基である。

光刃Ｆｌｌ斐少なくとも前記の要求を満たす保護基をここに開示する。下記の特徴をもち、従ってそれによって概括的に定義される開示の保護基は、ベンゾイル基よりも少なくとも約３０倍も不安定であり、しかもカルボニル基であってそれに結合した直鎖アルキル基をもつカルボニル基を含有する。該アルキル基は１〜約１０個の炭素原子、好ましくは１〜約６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜約３個の炭素原子、最も好ましくは１個の炭素原子を有するものである。特に好ましい保護基はアセチル基であり、次の式：％式％で表わされ、本明細書では“Ａｃ”と呼ぶ。開示される保護基はシチジン塩基を保護するのに使用するのが最も好ましい。ＡＣ保護したデオキシンチジン類（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｅ）を本明細書では“ｄＣ””と呼ぶ。

１１立皿工望説皿下記の図面は好ましい態様の詳細な説明を明らかにするために使用するものである。

第１図は例■〜■に記載の化学合成について示す模式図であり。

第２図は、ｄＣＡｃとｄＣ”とを種々の割合で含有し且つメチルアミン／ｌ−ブチルアミン・開裂／脱保護試薬又はアンモニア・開裂／脱保護試薬ノイずれかに！ｌ露させた（ｓｕｂ　ｊｅｃｔｅｄ）種々の３５１体（３５−ｍａｒ）、５１ −量体及び！０１−量体のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の写真図であり；第３図は、ｄＣ”を３５％含有するヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）５１ −量体であって開裂／脱保護試薬としてのアンモニアに暴露させた５ｌ−ｆｉ体の電気泳動図であり。

第４図は、ｄＣＡＣを３５％含有するヘテロ５１−量体であって開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンに暴露させた５１−量体の電気泳動図であり；第５図はＰＣＲ−誘導した９５７塩基対増幅鋳型の写真図であり：第６図は前記鋳型Ｍ１３ｍｐ１８の配列決定反応の写真図であり。

第７図は、ｄＣＡｃを含有する２２−量体であって開裂／脱保護試薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンに暴露させた２２−量体を使用して開始させた３ °−末端転移酵素伸張の電気泳動図であり：且つ第８図は、ｄＣ”を含有する２２−量体であって開裂／脱保護試薬としてのアンモニアに！露させた２２−量体を使用して開始させた３゛−末端転移酵素伸張の電気泳動図である。

い　の−’ＡＵ日当業者が認めるように、シチジン塩基はオリゴヌクレオチド類をを脱保護する間に副生物の生成を最も受けやすい。従って、シチジン塩基は、慣例では、オリゴヌクレオチド合成及び脱保護の間のシチジンの副生成物の生成を監視するのに有用である。

１〜約１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルアミンを含有してなる開裂／脱保護試薬を研究する経過中に、ベンゾイル基（“ｂｚ”）又はイソブチリル（“ｉｂｕ　”　）基で保護されたシチジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドであってかかる試薬に！露させたオリゴヌクレオチドが、特にＮ−メチルシチジンの形態のある種のシチジン副生物の生成を行うことが知見された。従って、かかる試薬が特にアンモニアと比較してオリゴヌクレオチドを迅速に開裂し且つｇｉ、ｉする晩方を付与するとはいえ、生じる副生物の生成がンチジン塩基用の異なる保護基であって副生物の生成をもたらさない保護基の必要性を招いた。かかる保護基は、少なくとも次の基準、すなわちｂｚ及びｉｂｕに匹敵する脱保護しやすさ及び統計学的に有意な副生物の生成（すなわち平均して約０．０１％未満）を沼かないことを、必要とする。さらにまた、得られるオリゴヌクレオチドはその生物学的活性を保持しなければならない。すなわち、オリゴヌクレオチドは相捕的塩基対、例えば塩基Ｃ及びＧに関して有用であらねばならない。

本発明はカルボニル基を含有してなる保護基であって、該カルボニル基がそれに結合した直鎖アルキル基をもつものであり、該アルキル基がｌ〜約１０個の炭素元素、好ましくは１〜約６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜約３個の炭素原子、最も好ましくは１１の炭素原子を有するものである、カルボニル基を含有する保護基である。本発明が１〜約１０個の炭素元素を有する直鎖アルキルアミンを少なくとも１個含有する開裂／脱保護試薬と共に使用される場合には、シチジン副生物の生成を著しく減少させる。

本明細書で使用する、“不安定な（ｌａｂｉｌｅ）”という用語は化学変化を受ける能力を意味する。本発明の保護基は下記・の通りに表わし得る。

本明細書で使用する、”オリゴヌクレオチド”という用語は、合成オリゴヌクレオチド及び修飾したオリゴヌクレオチド、すなわち３゛末端、５゛末端、糖又は複素環式塩基が修飾されているオリゴヌクレオチド、並びに燐酸主鎖（例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート及びホスホロアミデート）を包含することを！味する。

また、オリゴヌクレオチドは結合したリポータ−基、例えばビオチン、アビジン、ハプテン類、色素類、蛍光、化学発光標識、酵素標識又は放射線標識有するオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを合成する固体支持体以外の固体支持体を包含し得る。

開示に基づく持に好ましい保護基は下記のように表わされるアセチル基であり、本明細書では“Ａｃ”として参照される。従って、アセチル基で保護されたデオキシノチジンは本明細書では“ｄＣ””と呼ぶ。

特別な理論に束縛されることを望まないが、ｉｂｕに対するｂｚの相対的不安定性は、アルキルアミン開裂／脱保護試薬の存在下におけ／チジン副生物の生成の増大の原因になると思われる。ｉｂｕはｂｚよりも（比較的）不安定であり、アルキルアミンの存在下ではｉｂｕで保護されたシチジンを含有するオリゴヌクレオチドは、ｂｚで保護されたシチジンを含有する比較用のオリゴヌクレオチドよりも、Ｎ−メチルシチジン副生物の生成について低い生成率をもたらす。従って、保護基として機能し得、しかもｂｚよりも不安定である化学的部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はシチジン副生物の生成が少ないことを統計学的に証明するかもしれないということが仮定された。また、不安定性はカルボニル基と隣り合った基の電子供与性によって影響されるということが仮定される。すなわち、電子供与性が増大するのに従って、カルボニル炭素はより電気陽性度が低くなり、従って脱保護試薬による親核的攻撃を受けに（い。例えば、ｉｂｕの都二級（すなわち分岐した）炭素からそのカルボニル炭素への電子供与は、Ａｃの第一級炭素からそのカルボニル炭素への電子供与よりも大きい。

アセチル基はｉｂｕよりも著しく不安定であり、さらにまた前記の開示され、定義された保護基のなかで最も゛バルキー（嵩高）”でないものである。アセチル基はシチジン塩基の環外アミノ基に容易に共役し得、しかも実験的に調べられたように統計学的に有意な副生物の生成なしに、特にアリキルアミン開裂／脱保護試薬と一緒に効率的に且つ効果的に利用し得る。

本発明の好ましい実施態様についての次の例は、開示または後の請求の範囲に限定を加久ることを意図するものでなく、また限定を加えるものと解釈されるものでもない。

■、物質と方法Ａ９区ｌ１、開裂／脱保護試薬すべての薬品は、少なくともＡＣ３級とした。水酸化アンモニウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、２２．　１２２−８）から得た。水に含むようにした４０重量％溶液としたメチルアミンは、ｔ−ブチルアミン（Ｃａｔ、、Ｎｏ、８８．　９２０−５）と同様にＡｌｄｒｉｃｈ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ｍ２．　７７５−１）から得た。

メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬は、１：１容量比を混合して準備し、室温で５分間振盪し４℃で保存した。水酸化アンモニウムは、供給者の指示に従い保存した。

２、保護されたデオキシヌクレオシド次の保護されたデオキシヌクレオシドをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｔ　Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、）から得た。

ｄＡ”（Ｃａｔ、Ｎｏ、８　６１３０）；ｄＣ”（Ｃａｔ、Ｎｏ、８　５８８２）；ｄＣ”’　（Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｉ　６２６１）およびｄＧ　１１１”　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｉ　６００７）　。

チミジンは、Ｓｉｇｍａ　（Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｔ　５０１８）から得た。

Ｂ、　臼・に　口　なプロトコール１、ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＰｃＲＪ）開示した開裂／脱保護試薬の影響下に置いたオリゴヌクレオチドブライマーのＰＣＲ分析は、Ａｍｐｌ　ｉＴａｇ”（Ｐａｒｔ　Ｎ。

、　Ｎ８０１−００５５）を有するＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ　ＤＮＡ適用試薬キットを用いて行った。′Ａ造者の指示に従うようにした。

２、ＤＮＡ配列決定配列決定反応は、α−［”Ｓ］−ｄＡＴＰを用い、米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ■　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０のプロトコールに従い、Ｍ１３ｍｐ１８−木組ＤＮＡ鋳型（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ、Ｎｏ、４０４−Ｃ＞を使用して行った。

Ｃ９儂詣１、自動化したＤＮＡ合成装置オリゴヌクレオチドの合成は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０Ｔ′ＤＮＡ合成装置を用いて行った；制御したボアーグラス（ｐｏｒｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）（５００人−１０００人の子りの大きさ）を固体支持物質用に用いた。さまざまな長さのホモオリゴヌクレオチドおよびヘテロオリゴヌクレオチドを、製造者の指示に従い合成した。

２、毛管電気泳動オリゴヌクレオチドの毛管電気泳動を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、Ｐ／ＡＣＥＴ″２０００高性能毛管電気詠動システムで行った。

３７ｃｍ　ＵｌｏｏＰ　ＵｒｅａＧｅｌ　Ｃｏｌｕｍ　（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｃａｔ、Ｎｏ、３３８４８０）を使用した。サンプルは、動電学注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）（１０ｋＶ、３秒）によりカラムに充填した；分離は、オリゴヌクレオチドの長さに依存して、３０ −９０分間、１１ｋＶ／ｃｍで行った。

トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（「ＴＲ工Ｓ」）−ポレート７Ｍ尿素（ランニング緩衝ｉ＆　（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｇｅ　ｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、　３３８４８１））を用いた。吸光度検出は、オリゴヌクレオチドの長さに主に依存して、０．０５−２．０’Ｄ！！。、、、／ｍｌの範囲であった。

３、高圧液体クロマトグラフィー（ｒＨＰＬｃＪ　）ＨＰＬＣ分析は、ダイオードアレー検出モジエール１６８およびオートサンプラー５０７を備えたＢｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＧｏｌｄＴ′　ＨＰＬＣＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　５ｏｌｖｅｎｔ　Ｍｏｄｕｌｅにより行った。Ｃｌ８Ｕｌ　ｔｒａｓｐｈｅｒｅＴ′　ＨＰＬＣカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ。

Ｃａｔ、Ｎｏ、　２３５３９；　５μ粒子、４．６ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いた。

瓶Ａは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，９）を含み、瓶Ｂは、ＨＰＬＣ級アセドアセトニトリルだ。システムは１次のような勾配モードで操作した（１ｍｌ／分の流量）：０−１０分＝８５％瓶Ａ、１５％瓶Ｂ；　２０−２５分ニア５％瓶Ａ、２５％瓶８．２５−２７分＝５０％瓶Ａ、５０％瓶Ｂ：２７−３０分：５０％瓶Ａ、５０％瓶８．３０−５０分、１００％瓶Ａ、０％瓶Ｂ。

Ｉｌ、例１．２°−デオキシシチジンの調製２−デオキシシチジン−塩酸塩（Ｐｅｎｎｉｓｕｌａ　（カリフォルニア州ベルモント所在）；（：ａｔ、、（カタログ）　Ｎｏ、Ｎ１０１２］　７１ｇ　（２６９，３ミリモル）と塩化メチレン１６００ｍ１との懸濁物をトリエチルアミン（Ａｒｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ、Ｎｏ、２０６−３）　４２ｍ１（３０１ミリモル）と混合した。混合物を周囲温度で４時間激しく撹拌した。無色の結晶質固体を採取し、塩化メチレン（３Ｘ　８０ｍ１）で洗浄し、次いで自然乾燥した。１８５〜１９５℃の範囲内の融点をもつ物質６１ｇ（収率９９％）を得た。遊離塩基２−デオキシシチジンの公表融点は１８５〜１９５℃である。

例Ｉ１．　Ｎ’　−アセチル−２゛−デオキシシチジンの調製無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（”ＤＭＦ　”　）　（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、　Ｎｏ。

２２．７０５０６１１３０００１１に溶解した例工の物質６１．２９ｇ（２７０ミリモル）に無水酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１１，００４−３）　２８ａ＋１　（２９６ミリモル）を加え、得られた混合物を室温で２０時間撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた残留物を過剰のジメチルエーテル１００　ｍｌで処理した。結晶質生成物７１．４ｇ（収率９８％）を得、これを濾取し、ジメチルエーテルで十分に洗浄し、五酸化リン上で３時間乾燥した。この生成物は１５０〜１７０℃の融点を有していた。この生成物の公表融点は１５４〜１７６℃である。

Ｎ４−ア’Ｃ＋−ルー２°−デオキシシチジ：／−８２０（ＣｚＨ＋ｓＮ　ｘ　Ｏ５−ＨｚＯ）の組成分子量の計算値は（ニー４５．９９．８−５．９７．及びＮ−１４，６３である。前記の結晶質生成物は、元素分析により測定した下記の組成分子式Ｃ−４５，７１，８−６，１０，及びＮ−１４，３８を有していた。

また、赤外線スペクトルにより前記結晶質生成物が１個のカルボニルアミド部分と１個のカルボニル環状アミドとを含有していることが決定された。

さらにまた、その構造は核磁気共鳴（”ＮＭＲ”）で確認された。前記生成物の構造はＮ４−アセチル−２°−デオキシシチジンの構造と一致した。

例ＩＩ１．　Ｎ’　−アセチル−５−０−（４，４’−ジメトキシ−トリチル） −２−デオキシシチジンの調製例ＩＩの生成物７０ｇ　（２６０，２ミリモル）を、乾燥ピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｃａむ、Ｎｏ、　２７．０９７−０）　２　Ｘ　５（ｌｏｌと共に一緒に蒸発させることにより乾燥し、次いで乾燥ピリジン１３００ｍＮ：溶解し、水冷し、その後にこの溶液に４，４°−ジメトキシ−トリチルクロリド（“ＤＭＴｒ −Ｃ１”）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｎ４０１１）　１０５ｇ　（３１４ミリモル）を加えた。得られた混合物を５℃で２０時間撹拌しておいた。ピリジンを減圧下で除去し、得られた残留物を塩化メチレン３．０リツトルに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶ｉ＆　（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、　２３，９３１−３）　２　ｘ　２リツトルで洗浄し、次いで脱イオン水でＩＸ２リットルで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いでほとんど乾固するまで（層線した。得られた生成物を、６　Ｘ　８０ＣＯ１のシリカゲルカラム（Ａｌｄｒｉｃｈ；７０〜２３０メツシｘ　；　Ｃａｔ、Ｎｏ、２８，８６４−４）で０〜６％の塩化メチレン−メタノール２０．０リツトルを用いて勾配溶出することにより精製した。所望の画分を採取し、約３００ｍ１に濃縮し、冷却（０℃）ヘキサン［Ｂａｘｔｅｒ　（イリノイ州ＭｃＧａｗ　Ｐｏｒｔ所在）；　Ｃ：ａｔ、　Ｎｏ、２１６−４　ＤＫ　］３．０　リットルに浦和して生成物を沈殿させた。沈殿した生成物を、濾過し、ヘキサンで洗浄し次いで自然乾燥して生成物１１７ｇ　（収率７９％）を得た。

Ｎ４−アセチル−５−０−（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２−デオキシシチジン（Ｃ３２Ｈ−３Ｎ　３０　？　）の組成分子量の計算値はＣ−６７、２４；Ｈ−５，８２，及びＮ−７，３５である。該生成物は元素分析により決定された下記の組成分子式：　Ｃニー６６．０２．　Ｈ−６，０５，及びＮ−６，９１を有しテいた。また、赤外線スペクトルにより前記結晶質生成物が１個のカルボニルアミド部分と１個のカルボニル環状アミドとを含有していることが決定された。さらにまた、その構造はＮＭＲで確認された。前記生成物の構造はＮ４− アセチル−５゛−ｏ〜（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２゜−デオキシシチジンの構造と一致した。

例ＩＶ、　Ｎ’−７セチルー５−０−（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２゛−デオキシシチジン−３−〇−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスホロアミダイトの調製例ＩＩＩの生成物１１．４４ｇ　（２０ミリモル）をピリジン、トルエン及びテトラヒドロフラン（“ＴＨＦ　”　）（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１８，６５６−２）と共に連続的に同時蒸発させることにより乾燥し、還流し、次いで水素化カルシウム上で蒸留した。得られた乾燥残留物を乾燥ＴＨＦ１００ｍｌに溶解し、これにＮ、　Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１４ｍ１　（８０ミリモル）を加えた。次いで、アルゴン雰囲気下に室温で一定に撹拌しながら、β−シアノエチルモノクロローＮ、Ｎ−ジイソプロピルボスボロアミダイト８．９２ｍ＋１　（４０ミリモル）を５分間で（注射器で）滴下した。６０分間撹拌した後に、混合物に対してメタノール１．２ａ＋１（４０ミリモル）を加え、さらに６０分間撹拌を続け、次いで蒸発乾固した。得られた残留物を酢酸エチル（Ｂａｘｔｅｒ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、　ＣＰ８０１３２−４ＤＫ）　６００ｍ１に溶解し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｘ　５００　ｍｌ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を蒸発させ、得られた残留物をエーテル５０ｍ１に溶解した。次いで、これをヘキサン７００ｍ１に室、昆で浦和した。この混合物をデカントし、沈殿した生成物をエーテル１００　ｍｌに溶解し、次いでヘキサン７００　ｍｌを加え、室温で撹拌した。この混合物をデカントし、生成物を塩化メチレン５００　ｍｌに溶解し、次いで塩基性アルミナ（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１９，９４４−３）　３０ｇを加え、室温で１時間撹拌した。得られた混合物をガラス製濾過器で濾過し、蒸発させ、次いでデシケータ−中で塩化カルシウム、五酸化リン上で減圧下に乾燥した。生成物１１ｇ（収率７６％）を得た。その純度は逆相ＨＰＬＣにより測定すると９８．４％であった。

Ｎ４−アセチル−５−０−（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２−デオキシシチジン−３−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスホロアミダイト（Ｃ４１ＨＳ。Ｎ、Ｏ，Ｐ）の組成分子量の計算値はＣ−６３，８０，）ｌ−６，５３，Ｎ−９，０７，及びＰ−４，０１である。元素分析により決定された該生成物の組成分子式は、Ｃ−６２，５１，８−６，８４，Ｎ−８，６８及びＰ−３，６１であった。また、赤外線スペクトルによりこの生成物が１個のカルボニルアミド部分と、１個のカルボニル環状アミドと、１個の−Ｃ＝Ｎ基とを含有していることが決定された。さらにまた、その構造はＮＭＲで確認された。前記生成物の構造はＮ“−アセチル−５’　−０−（４，４−ジメトキシ− トリチル）−２°−デオキシシチジン−３”−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル） −β−シアノエチル−ホスホロアミダイトの構造と一致した。

例ＩＶの生成物を、アセチル保護基を有するデオキシシチジンを示す“ｄＣＡｅ ″と呼ぶ０例工〜ＩＶの製造工程を概説する反応工程図を第１図に示す。

例■：　シチジン副生物の生成認められるように、通常、デオキシシチジンはデオキシシチジンを含有するオリゴヌクレオチドを脱保護する間に副生物の生成を最も受けやすい。典型的には、かかる副生成物の生成はアミノ基転移によるものである。

当業者が認めるように、オリゴヌクレオチドの合成は典型的には最終生成物をできる限り迅速に回収することを意図して行われる。

しかしながら、場合によっては、可溶化させ、脱保護したオリゴヌクレオチドを長時間、脱保護試薬中に保留させ得ることが可能である。さらにまた、当業者が認めるように、オリゴヌクレオチドが前記試薬中に存在する場合のかかる時間の増大は、アミノ基転移の機会を増大させ得、従って副生物生成の機会を増大させ得る。

シチジン副生物の生成を、逆相ＨＰＬＣにより脱保護試薬としてメチルアミンと、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンの両方を使用していくつかの時間と温度とにわたって調べた。

“伝統的な”シチジン保護基“ｂｚ”及び“ｉｂｕ”並びにアセチル保護基について調べた。かかる試薬を使用した場合に認められた副生成物（核磁気共鳴により確認）はＮ−メチルシチジンであった。デオキシシチジンに対するＮ−メチルデオキシシチジンの生成の割合（パーセント）を、アセチル保護基で保護したデオキシシチジンの溶液をベースとした脱保護に基づいて以下に示した。

Ｎ−メチルシチジンの生成率＊メチルアミン　＜　ｏ、　０１１傘　＜０．０１　＜０．０１（６０分）（２０分）　（５分）メチルアミン　〜０．０５　〜０．２５　〜２．５（１６時間）メチルアミン／　＜　０．０１　＜　０．０１　〜０．６％し一ブチルアミン（１６時間）＊　−平均パーセントこれらの結果は、典型的なオリゴヌクレオチド合成（すなわち、研究者が完成最終生成物をできる限り早（得ることを望む方法）については、メチルアミンは統計学的に有意なシチジン副生物の生成を招かないということを示す、しかしながら、オリゴヌクレオチドが試薬中に滞留する時間が増大するに従って、シチジン副生物の生成もまた増大する。従って、アミノ基転移抑制試薬（“ＴＳＡ”）の使用が有効である。“ＴＳＡ”は、本明細書においては典型的には副生物の生成として現われるアミノ基転移、すなわちヌクレオチドのアミンの交換の抑制に有効な試薬として定義される。　ＴＳＡは水の極性指数値（ｐｏｌａｒｉｔｙ　１ｎｄｅｘ　ｖａｌｕｅ）よりも少なくとも１．５倍小さい極性指数値をもつ薬剤（又は複数の薬剤）であって、好ましくは１〜約ｌＯ個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖、環状の飽和及び不飽和アルキルアミン類からなる群から選択される薬剤（又は複数の薬剤）であるのが好ましい。また、該ＴＳＡは複数の官能基；エタノール；メタノール；イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホルムアミド：テトラヒドロフラン；及びこれらの組み合わせを含有していてもよい。前記のアルキルアミンの代表例としては、以下のアミンに限定されないが、ｔ −ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン及び５ｅｃ−ブチルアミンが挙げられる。前記データは、メチルアミンに対して、ＴＳＡとしてメチルアミンとｔ −ブチルアミンとを含有してなる試薬がシチジン副生成物の生成を顕著に減少させることを示している。

第２の一連の研究は、これらの点について（ａｌｏｎｇ　ｔｈｅｓｅ　１ｉｎｅｓ）行った。これらの研究に関しては、前記試薬すなわちアミノ基転移抑制試薬としてメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを使用して種々の時間と温度ニオイテ、ｄＣ”、ｄＣ””　、　ｄＣ”、ｄＧ”″、　ｄＡ”及びｄ丁ニツいて副生成物の生成（ヌクレオシドについて副生成物を生成しない相対率として）を調べた。

結果を第１Ｉ表に示す。

第１Ｉ表副生成物の生成率＊温度（”Ｃ）　反応時間　ｃ”　ｃ’″ｕ　Ｃ″１　Ｃｌ　ｂ　ｕ　Ａ　ｂ　Ｌ　Ｔ２５　９０分　中本　０．１５　１０．０　中本　＊傘　中本２５　１６時間　中本　中本申　＊＊牟　本市　傘傘　中本３７　３０分　＊傘　０．１５　１０．０　中本　車中　車中３７　５［４間　中本　本中本　本中本　＊傘　中本　中本３７　１６　時間　傘＊　本中本　本中本　中本　本＊　中本６５　５分　車中　０．１５　１０．０　車中　中本　＊傘６５　１　時間　傘＊　中本中　中本中　＊傘　傘＊　＊傘６５　１６時間　０．６　中本中　傘＊＊　傘＊　＊傘　車中８０　３時間　中本　０．１５　１０．０　中本　中本　本市８０　１　時間　傘帛傘　本中本　中本　傘＊　中本　本中本　平均中本　＜　０．０１％これらの結果は少なくとも幾つかのことを示している。第１に、ｄ（Ｊｆ護基に関して前記のデータは、アセチル保護基が直鎖アルキルアミン開裂及び脱保護試薬と一緒に使用した場合には侵れた結果を与λ、前記の複数の“伝統的”シチジン保護基が著しく高い副生物の生成をもたらすことを示している。第２に、この脱保護及び開裂試薬は、高められた１度と所望の反応時間よりも長い時間とにおけるｄＣ”の脱保護を除いて、調査した温度又は反応時間のいずれにおいても保護されたデオキシヌクレオシドについて統計学的に有意な副生物の生成を招かない。従って、アセチル基で保護されたデオキシシチジンを含有してなるオリゴヌクレオチドについては、かかる高められた温度、長い反応時間を使用しないことが好ましい。

例ｖ工：未精製オリゴヌクレオチドの酵素消化分析酵素消化法と逆相ＨＰＬＣ法とを使用して、数種のオリゴヌクレオチドの組成について分析を行った。これらの調査はアセチル基及び伝統的シチジン保護基、ｂｚで保護したデオキシシチジンを使用して行った。別種の保護基は全てオリゴヌクレオチド同志の間では一致していた。下記の配列をもつ複数個の３５−量体（３５−ｍｅｒ）、５１−量体及び１０１−量体について分析した。

用二１装５　’　−ＣＡＧ−ＴＧ（ニーＡＧＣ−ＴＣＣ−ＴＡＧ−ＣＡＧ−（：ＣＴ−ＡＧＣ−ＧＴＡ−（：ＴＡ−ＧＴＣ−ＴＴ−３’■二ｌ註５°−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＴＡ　Ｇ−ＴＣＡ　−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＡＧＴ−ＣＧＣ −ＴＣＡ　−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＡＧ−ＴＴＧ−ＣＡＣ−ＡＧＧ−ＴＣＡ−ＣＣ，Ｔ−３゜圧と１具５°−ＧＣＴ−ＧＣＣ−ＡＧＴ−Ｔ（：Ｇ−ＧＴＣ−ＡＴＣ−ＣＧＡ−ＴＣＣ− ＴＣＧ−ＧＴＣ−ＡＣＧ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＴＣＡ　−ＡＣＧ−ＧＣＡ−ＣＣＴ −ＡＣ：Ｔ−ＣＣＴ−ＣＧＴ−ＡＡＣ−ＧＴＡ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＧＡＴ−ＴＣＧ−Ｃ４Ｃ−ＧＴＧ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＴＴＣ−ＡＴ−３″前記の複数のオリゴヌクレオチドを、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有してなる試薬を使用して２５℃で９０分間開裂及び脱保護するか又はアンモニアを使用して６５℃で３時間開裂及び脱保護した。

可溶化し、脱保護された複数のオリゴヌクレオチドは、精製せずに分析した。結果を第１ＩＩ表に下記の通り示す。

第１ＩＩ表組成分析測定値理論値　ｄＣ”を含有してなる　ｄＣ”を含有してなるオリゴヌクレオチド　オリゴヌクレオチドＣ１１１０，６７１０，６２３５−量体　Ｇ　８　７．８８　７．８４Ｔ　９　９．６５　９．４１Ａ　７　６．８０　７．１３５１−量体　Ｇ　１１　１１．７１　１１．７２Ｔ　１１　１１．６１　１１．０７Ａ　１１　１０．６５　１０．８５１０１−量体　Ｇ　２２　２０．７４　２０．７０７　２２　２１．７８　２１．７３Ａ　２２　２５．０９　２５．０４種々の未精製オリゴヌクレオチドの理論組成と、実測組成とは良好な相関関係を与える。さらにまた、前記データに基づいたデオキシシチジン保護基の違いは、結果において統計学的に有意な差異を示していない。

例ＶＩ１．　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（“ＰＡＧＥ”）複数の３５−量体（ｄＣ”３５％、　ｄＣＡｃ３５％；ｄＣ″”１００％；及びｄＣ”１００％）、複数の５１−量体（ｄＣ”３５％；　ｄＣＡｅ３５％、　ｄＣ”１００％；及びｄ（：”１００％）及び複数の１０１−量体（ｄＣ”３５％、　ｄＣＡｃ３５％、ｄＣ”１００％；及びｄｃ’ＪＯｏ％）の分析をＰＡＧＥで分析した。ヘテロ３５−量体、５１−量体及び１０１−量体は例ＩＶに記載のものであり、ホモ３５−量体、５１−量体及び１０１−量体については、該オリゴマーは不溶化したチミジンから合成した。ｄＣＡｃを含有してなる複数のオリゴヌクレオチドは、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有してなる試薬を使用して６５℃で９０分間開裂し且つ脱保護した。ｄＣ”　”を含有してなる複数のオリゴヌクレオチドは、アンモニアを使用して６５℃で３時間開裂し且つ脱保護した。

予め混合したアクリルアミド／メチレン　ビス−アクリルアミド（２９：　１　）　［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（インディアナ州インディアナポリス所在）　；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１００−１５１１１００ｇに脱イオン水１０７、３＋ｏｌを加えて５０％原液（ｓｔｏｃｋ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）を得ることにより、２２ｃｍＸ　１６．５ｃ＋ｏの大きさの変性ゲルを調製した。５０％原液２０＋ａｌに尿素２２、５ｇ、トリス−硼酸塩／ＥＤＴＡ　（“ＴＢＥ　”　）　５ｍｌ及び十分な量の脱イオン水を加えて５０ｍ１にした。固体成分が溶解するように、得られた溶液を攪拌し、加熱した。

その後に、過硫酸アンモニウム２０ｍｇとＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ−テトラメチレンジアミン（”ＴＥＭＥＤ“）２０μリツトルとを加えた。この溶液をきれいな皿（プレート）に注いで、１時間ゲルを重合させ、ＩＸＴＢＥを用いて２０ｍＡで１時間予備試験した際に各オリゴヌクレオチドの０．２〜１．００Ｄｚｓａ、、ａをｌｏｗ尿素ＩＯμリットルに加えた。混合物２０ＬＬリツトルを前記ゲルに装填し、オリゴヌクレオチドの長さに応じて２８ｍＡで２〜８時間電気泳動した。

バンドをＴＬＣ型光板上でＵＶシャドウィング法又は臭化エチジウムにより可視化させた。

写真結果を第２図に示し、レーンを下記の通りに定義した。

レーン　オリゴヌクレオチド１　３５−量体（ｄ（：”３５％）２３５−量体（ｄＣ”３５％）３　３５−量体（ｄｃ’ＪＯｏ％）４３５−量体（ｄｃ”１１００％）５　５１−量体（ｄＣＡｅ３５％　）６５１−量体（ｄＣ”３５％）７　５１−量体（ｄ（：”１００％）８５１−量体（ｄＣ”１００％）９１０１−量体（ｄＣ“３５％）１０　１０１−量体（ｄＣ”３５％）１１　１０１−量体（ｄｃＡｃｌＯＯ％）１２　１０１−量体（ｄＣ”１００％）第２図の結果は、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン・試薬に暴露したオリゴヌクレオチドとＡｃ保護基とは、アンモニアに暴露したオリゴヌクレオチドと伝統的デオキシシチジン保護基、ｂｚと比較してほぼ同じＰＡＧＥパターンを与えることを示している。

例ＶＩＩ１．毛細管電気泳動ｄＣ１′″を３５％又はｄＣＡｃを３５％含有してなるヘテロ５１−量体オリゴヌクレオチドを、アンモニアに６５℃で３時間暴露するか又はメチルアミン／ｌ −ブチルアミンに２５℃で９０分間暴露し、次いで毛細管電気泳動法により分析した。アンモニアに暴露したオリゴヌクレオチド及びメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有する試薬に暴露したオリゴヌクレオチドの電気泳動図を第３図及び第４図にそれぞれに示す。

第３図及び第４図の結果は、試料導入から５１−量体の検出までの時間についてはほぼ同一である。主要ピークの下の積分面積全体の割合は、第３図については６６、９０２であり、第４図については６６、５７５でありほぼ同一である。また、これらの結果は、メチルアミン／１−ブチルアミン・試薬及びデオキシシチジン保護基Ａｃが、アンモニア及び伝統的デオキシシチジン保護基ｂｚと比較して、比較的固等の可溶性の、保護されたオリゴヌクレオチドを与えることを示しているす。

例Ｘ、　ポリメラーゼ連鎖反応前記の語例は、１〜約１０個の炭素原子を含有する直鎖アルキルアミンを含有する脱保護／開裂・試薬とアセチル保護基とが、オリゴヌクレオチド特にデオキシシチジンを含有するオリゴヌクレオチドを統計学的に有意な副生成物の生成を伴わずに迅速且つ効率的に開裂し且つ脱保護するのに使用し得ることを証明している。しかしながら、当業者が認めるように、かかるオリゴヌクレオチドを種々の方法に利用できることが必要である。

ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを生成させ、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬（この場合にはデオキシシチジンをＡｃで保護した）に２５℃で９０分間暴露した。プライマーは下記の通りであった。

Ｕヨ」【体５’−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−Ｃ：ＣＧ−ＡＧＴ−３’鋳型はＭ１３ｍｐ１８　ＲＦＩ　ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、４００−Ｂ）であった、製造メーカーの指示書はＧｅｎｅＡｍｐ試薬キットを使用することになっていた。

最初の溶融温度は９５℃で７分であった。下記のサイクルプロフィールでＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用いて２５サイクル運転した。

温度（”Ｃ）　時間（秒）配列（Ｓｅｑ、）＃１　９４　１配列　＃２　９４　６０配列　＃３　３７　１配列　＃４　３７　１２０配列　＃５　７２　１配列　＃６　７２　１８０得られた９５７塩基対のＰＣＲ生成物を、トリス−アセテート／　ＥＤＴＡ（“ ＴＡＥ”）中で１％アガロース上で電気泳動にかけ、臭素化エチジウムで染色した。写真結果を第５図に示す。第５図に示したレーンは下記の通りである。

レーン１　９５７ｂｐの生成物　（メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬とデオキシシチジン用アセチル保護基とを使用して誘導したプライマー）；レーン２　９５７ｂｐの生成物　（アンモニアとデオキシシチジン用ｂｚ保護基とを使用して誘導したプライマー）：レーン３　ゲル標識　（）ｆｉｎｄ　Ｉ工Ｉ、２３２２ｂｐ標標及び２０２７ｂｐ標識を用いて消化したえＤＮＡ）　。

及びレーン４　ゲル標識　（）ｌｉｎｆＩ　、　１６３２ｂｐ標識及び５０６ｂｐ標識を用いて消化したＰＢＲ３２２ＤＮＡ）第５図に示した結果は、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬とアセチル保護基とを使用して誘導したプライマーが、アンモニアで開裂及び脱保護し且つデオキシシチジン用ｂｚ保護基を使用することにより生成させたプライマーから誘導した増幅（ａａ＋ｐｌｉｆｉｅｄ）生成物と実質的に同じ増幅生成物の生成をもたらすことを示している。

例Ｘ１．　ＤＮＡ配列決定デオキシシチジン用アセチル保護基と比較用の保護基ｂｚとを使用して２組の１８−量体を合成し、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有してなる試薬に２５ ℃で９０分間暴露するが、アンモニアに６５℃で３時間暴露した。前記２組の１８−量体は下記の配列を有していた。

組二１腟５°−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−Ｃ（：Ｃ−ＡＧＴ−３゜可溶化され、脱保護された複数のオリゴマーをＳｅｐ　Ｐａｋ　（Ｗａｔｅｒｓ。

Ｐａｒｔ　ｎｏ、５１９０）　ＤＮＡ精製キットを使用して精製した。これらの精製オリゴマーは配列決定を目的としたプライマーとして用いた。鋳型はＭ１３ａ＋ｐ１ｇ一本ｊｉＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、４０４−Ｃ）であった。配列決定はＵＳＢ配列決定材料及びプロトコールと一緒に前記複数の１８−量体を使用して行った。結果を第６図に示す。

第６図の結果が示すように、アンモニアとｂｚとによって誘導されたプライマーを使用する配列決定バンドに対して、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬とアセチル保護基とに暴露されたプライマーを使用する配列決定バンドのパターンは実質的に同じである。

例ＸＩ１．　３°末端転移酵素伸張複数の２２−量体をデオキシシチジン用のアセチル保護基又はｂｚ保護基のいずれかをを使用して合成し、それぞれメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有してなる試薬に６５℃で９０分間暴露するか又はアンモニアに６５℃で３時間暴露した。上記２２−量体は下記の配列を有し５−ＴＴＣニーＴＧＣ−ＣＧＴ−ＡＣＣ −ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＧＴ（ニーＴ−３゜可溶化され、脱保護された複数のオリゴマーをＳｅｐ　Ｐａｋ　ＤＮＡ精製キットを使用して精製した。これらの精製オリゴマーは３゛末端転移酵素伸張調査用のプライマーとして用いた。

脱イオン水１５０μリットル；チミジン三燐酸５ｍｇ（ＴＴＰ”）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｔａ２０５　）　；末端デオキシヌクレオチジル／転移酵素（ ”ＴＤＴ　”　）　５μリツトル（１５Ｕ／　ｕリットル）　（ＢＲＬ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８００８ＳＢ）及びトレーリング緩衝液（ｔｒａｉｌｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）５０　ｕリットルに各オリゴヌクレオチド２．５０Ｄ＊ａ。□ヨを加えた。混合物を３７℃で１夜インキユベートし、得られた物質をＳｅｐ　Ｐａｋ　Ｃ１８カートリッジを使用して下記のようにして精製した。すなわち、反応混合物を０．５ｍ酢酸アンモニウムに１＝２で希釈し、上記カートリッジに充填し、次いで該カートリッジを脱イオン水で洗浄し、生成物を６０％メタノール脱イオン水溶液で溶出した。生成物を毛細管電気泳動により分析した。

電気泳動結果を第７図及び第８図に示す。

第７図及び第８図の電気泳動図は、アセチル基で保護し且つメチルアミン／ｌ− ブチルアミン試薬に暴露させたシチジンを含有してなるプライマー（第７図）と、ｂｚで保護し且つアンモニアに暴露させたシチジンを含有してなるプライマー（第８図）とはそれらの３°末端において両方共に伸張されたことを示し、また得られた生成物同志が実質的に同一であることを示している。

前記の記載は相当に詳細に説明しているが、詳細な説明及び例に記載された態様が該記載又は後記の請求の範囲に限定すると解釈されるべきでないことが理解されるべきである０本発明は自動ＤＮＡ合成装置に限定されない。本発明はデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド類に限定されないばかりではな（、リボ核酸オリゴヌクレオチド類と共に利用し得る０本発明は開示された保護基の塩基シトシンについてのみの使用に限定されない０本発明は参照した同時継続中の出願に記載の試薬の特定の態様と一緒に使用することに限定されないし、本発明はむしろ特に本明細書に概括的に記載し、特許請求した試薬類と共に利用されることを意図するものである。当業者の範囲内にある改良及び改変は以下の請求の範囲の中に入るものである。

９１０　Ｉ＋　１２１　ｚ　３４ｌ抄、６蜘　（ｘ　１ｏ−３）　”＠Ｉ−一、わ、Ｎ・　ＰＣＴ八Ｓへ９３１０３３３７、　、　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３３３７

Claims

【特許請求の範囲】

１．オリゴヌクレオチドの合成に有用であり、下記の式を有する環外アミノ保護基： −Ｃ−（ＣＨ２）Ａ−ＣＨ２式中、“Ａ”は０から約９の整数である。
２．Ａが０から約５の整数である請求項１の保護基。
３．Ａが０から約２の整数である請求項１の保護基。
４．Ａが０である請求項１の保護基。
５．下記構造を有する化合物； ▲数式、化学式、表などがあります▼ 式中、“Ａ”は０から約９の整数であり；Ｂはアデニン、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれ；Ｃは水素原子、リポータ−基、ヌクレオチドの５′一炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌクレオチドの５′一炭素原子に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基からなる群から選ばれ；Ｄは水素、リポーター基、ヌクレオチドの３′一炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌクレオチドの３′一炭素に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基からなる群がら選ばれる。
６．Ａが０から５の整数である請求項５の化合物。
７．Ａが０から２の整数である請求項５の化合物。
８．Ａが０である請求項５の化合物。
９．下記構造を有する化合物： ▲数式、化学式、表などがあります▼ 式中、“Ａ”は０から約９の整数値であり；Ｂはアデニン、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれ；Ｃ′は水素原子、リポーター基、及び２′一酸素原子から化学的に除去でき、それにより水素原子と置き換えることができる基からなる群から選ばれ；Ｃは水素原子、リポーター基、ヌクレオチドの５′一炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌクレオチドの５′一炭素原子に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基からなる群から選ばれ；Ｄは水素、リポーター基、ヌクレオチドの３ ′一炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌクレオチドの３′一炭素に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基からなる群から選ばれる。
１０．Ａが０から約５の整数である請求項９の化合物。
１１．Ａが０から約２の整数である請求項９の化合物。
１２．Ａが０である請求項９の化合物。
１３．該保護基がオリゴヌクレオチドの合成に使用されるヌクレオチドの環外アミノ基を保護するのに用いられ、オリゴヌクレオチドが１から約１０の炭素原子を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試薬にさらされる請求項１の環外アミノ保護基。
１４．オリゴヌクレオチドの合成に使用され、オリゴヌクレオチドが１から約１０の炭素原子を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試薬にさらされる請求項５の化合物。
１５．オリゴヌクレオチドの合成に使用され、オリゴヌクレオチドが１から約１０の炭素原子を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミンにさらされる請求項９の化合物。