JPH07505903A - オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基園１土届 この出願はここに同時出願されるパラメスワラ・メダ・レディ及びナエム・ホト ロス・ハナによる名称「オリゴヌクレオチド類の開裂及び脱保護の方法及び試薬 類」の米国特許出願番号第□号（ベックマン整理番号１２８Ｄ−１１１）に関係 している。その関連出願はここに参考として取り入れられる。

及」二旦号 本発明は一般に核酸類の合成、特に核酸類の合成において有用な保護基に関する 。

及五匹麓旦 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核Ｍ　（ＲＮＡ）は長い糸状の巨大分子で あり、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド類の鎖を含んでなり、ＲＮＡはリボヌ クレオチド類の鎖を含んでなる。ヌクレオチドはヌクレオシド及び１またはそれ 以上のリン酸（ホスフェート）基からなり、ヌクレオシドはペントース糖に結合 した含窒素塩基からなる。典型的には、リン酸基はペントース糖の第５炭素（Ｃ −５）ヒドロキシル基（ＯＨ）に付着しているが、第３炭素ヒドロキシル基（Ｃ −３０Ｈ）にも付着することができる。ＤＮＡの分子内で、ペントース糖はデオ キシリボースであり、他方ＲＮＡの分子内で、ペントース糖はリボースである。

ＤＮＡ中の含窒素塩基はアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及び チミン（Ｔ）である、これらの塩基はＲＮＡについてもウラシル（Ｕ）がチミン を置き換える以外同じである。したがって、集団的に［デオキシヌクレオチド類 」と呼ばれるＤＮＡの主要ヌクレオチド類は次の通りである：デオキシアデノシ ン（ｄＡ）　、デオキシシチジン（ｄＣ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）及びチ ミジン（Ｔ）である。対応するりボタクレオチド類はＡ、Ｃ，Ｇ及びＵで示され る。（便宜上、及び対応するチミジンリボヌクレオシドが存在しないから、デオ キシチミジンは典型的にＴで示されるが、整合性の上から、チミジンはこの開示 中ではｄＴで示す、） ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の含窒素塩基の配列はその分子内に含まれる遺伝情報をコ ード化する、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の糖及びリン酸基は構造的な役目を果たし 、分子のバックボーンを形成する。特に、各ヌクレオシドの糖部分は隣接ヌクレ オチドの糖部分に結合して、１つのヌクレオチドのペントース糖の３゛−ヒドロ キシルが隣接ヌクレオチドのペントース糖の５゛−ヒドロキシルに結合する。

２つのペントース糖量の結合は典型的にはリン酸ジエステル結合を経ている。こ の結合プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に基づいて、ヌクレオチド類の一端（末 端）は５゛末端（例えば、ヒドロキシル、トリリン酸など）を有しており、他端 は３°−ヒドロキシル基を有している。便宜上、ヌクレオチド類の塩基配列は５ ゛から３°の方向に記載され、すなわち、５°−ＡＴＣＧ−３’　または単にＡ ＴＣＧと記載される。

ＤＮＡ及びＲＮＡは生きている動物によりその内部で製造されるけれども、化学 的に合成することができ、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成ストランドが迅速かつ効果的 に製造できる。これらのストランドは「合成オリゴヌクレオチド」または「オリ ゴヌクレオチド」と呼ばれる。広く利用されるオリゴヌクレオチド類合成用の化 学的操作は「ホスホルアミダイト法」と呼ばれる。例えば、米国特許第４，４１ ５．７３２号、マクブリッド・エル及びカルザース・エム、テトラヘドロン・レ ターズ（ＭｃＢｒｉｄｅ　Ｌ、　＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）、２４　：　２４５−２４８　（１９８３）　、 及びシ：／／％　１　！ヌら、ヌクレイツク・アソツド・リサーチ（Ｓｉｎｈａ 、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　、Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５）上ユニ４５３ ９−４５５７　（１９８４）参照、これらは全てここに参考として取り入れられ る。ホスホルアミダイト法に基づく商品として入手可能なシンセサイザー（合成 装置）には例えばバイオリサーチ８７５０”及びＡＢＩ３８０ＢＴＭ、３９２Ｔ ゝ及び３９４７“ＤＮＡシンセサイザーが含まれる。

化学的合成オリゴヌクレオチド類の重要性は、基本的にそれらヌクレオチド類が 用いられる広く変化に富んだ用途による。例えば、オリゴヌクレオチド類は遺伝 子工学、組換えＤＮＡ技術、アンチセンスＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ検出、種々の系 からのＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、蛋白質−ＤＮＡ複合体の検出、サイト指向突 然変異誘発の検出、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用プライマー、ポリメラーゼ鎖反応や りガーゼ鎖反応などのような増幅技術用プライマー、鋳型、リンカ−１分子相互 作用研究を含む生物学研究において利用することができる。

ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の主要な構造は次のように表すことができる。

旦ΣＡ　且ＮＡ Ｂ；アデニン、チミン　Ｂ、＝アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン　グア ニン、シトジン核酸合成の鍵となる段階は１つのヌクレオチドの５゛　−ＯＨ基 ともう１つの３°　−ＯＨ基の間のヌクレオチド内リン酸結合を特異的かつ配列 順に形成させることである。したがって、オリゴヌクレオチドの典型的な合成に おいて、「入ってくる」ヌクレオチドのリン酸基はもう１つのヌクレオチドの５ ′　−ＯＨ基と結合する（すなわち、５°　−ＯＨ基が「リン酸化」または「亜 リン酸化」される）。

これらの基はオリゴヌクレオチドの合成に活性的に関与できなければならない。

このように、研究者が２つのそのようなヌクレオチドを反応室に導入し、その中 の条件を２つのヌクレオチドが正常に結合するよう調節し、そのような付加を一 連して順次行うことにより一定の配列を有するオリゴヌクレオチドの生成が正確 に達成できるように、５゛　−ＯＨ基は（典型的にはジメトキントリチル（ＤＭ Ｔ）基により）変性される。

ヌクレオチド類の４つの塩基、アデニン、チミン（ＲＮＡの場合はウラシル）、 グアノシン及びシトシン、は化学的に反応活性のある部分（例えば、環外アミノ 基）を含をする。これらの基は３゛−０Ｈ基及び５’　−ＯＨ基とは異なり、一 時的に保護されねばならず、すなわち、保護基はオリゴヌクレオチド合成の完了 後まで塩基上の全ての反応性部位を封鎖できるものでなければならず、その合成 が完了後これらの基はまたオリゴヌクレオチドの生物学的活性が悪影響されない ように塩基類から除去できるものでなければならない。

塩基を一時的に保護することの主要な理由は、そのような保護基がない場合、塩 基類の環外アミノ基（ＮＨ，）が５°−ＯＨ基と結合競争することになる。もし そのような反応が生じると、得られる生成物は有用でなくなる。したがって、こ れら保護基は副生成物形成、すなわち、化学的に類似であるが所望でない物質の 生成の発生を減少させるのに重要である。シチジンは特にオリゴヌクレオチドの 開裂及び脱保護（すなわち、それぞれ、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの 除去及びその保護基の除去）中に副生成物形成をうけ易い。ホスホルアミダイト 法に関連して最も広く用いられる保護基は、Ａ及びＣにはベンゾイル、Ｇ及びＣ にはイソブチリル（アミノ基を持たないチミンは本来保護基を必要としない）で ある０便宜上、ベンゾイルはｂｚ、インブチリルはｉｂｕで表し、それらで保護 されたデオキシヌクレオチドばｄＡ”、ｄＣ”、ｄＣ”１１．ｄＧｌｂｕで示す 。

ベンゾイル及びイソブチリルは下記の構造を持つ：有利にも、これら保護基はオ リゴヌクレオチドからアンモニアにより除去（すなわち、脱保護）することがで きる。その上、アンモニアはオリゴヌクレオチドが合成された固体支持体物質か らオリゴヌクレオチドを除去（すなわち、開裂）するのに用いることができる。

有利にも、アンモニアは副生酸物形成が制限されており開裂／脱保護試薬として 使用することができる。

しかしながら、アンモニアの開裂及び脱保護試薬としての使用に関し実用上の問 題が存在する。アンモニアは開裂及び脱保護を完了するのに（比較的）長い時間 を必要とする。平均して、オリゴヌクレオチドを成長させるのに各ヌクレオチド の化学的合成に６分間が必要であり、それゆえ約２１のヌクレオチドの平均的オ リゴヌクレオチド（２１−量体と呼ぶ）には、商品として入手できるＤＮＡシン セサイザーを用いて合成に約２時間を必要とすることが考えられる。しかしなが ら、アンモニアを用いるオリゴヌクレオチドの開裂及び脱保護には約２４時間（ 室温）から６時間（５５℃）が必要である。明らかに合成自体よりも開裂及び脱 保護の最終段階に、より多くの時間が必要である。このように、開裂及び脱保護 段階を合成自体とほぼ同じ程度の範囲で完了させることができる開裂及び脱保護 試薬の存在がめられている。そのような試薬が上記に引用し、参照のためここに 取り入れられる関連出願に開示される。

広くには、そのような試薬は１から約１０の炭素原子を含んでなる少なくとも１ つの直鎖アルキルアミン（−ＮＨ，（ＣＨ，）。−１゜−ＣＨ，で表すことがで きるようなアルキルアミン）を含んでなるものである。上記関連出願に開示され た試薬の特に好ましい態様において、メチルアミン及びｔ−ブチルアミンを含ん でなる試薬を室温で約９０分未満で、また約６５℃で約１０分未満で開裂及び脱 保護に利用することができる。

これらの試薬がｄＣ１′″′またはｄＣ”を含んでなるオリゴヌクレオチドと関 連して用いられた時に、所望でない副生成物、Ｎ−メチルシチジンの生成が発生 することが観察された。ｄｅｌｌｌに関してオリゴヌクレオチド内のシチジンの 約１０％がＮ−メチルシチジンであった。そのように、一方では開裂／脱保護操 作を迅速に達成できる開裂／脱保護剤が発見されたが、他方その試薬は塩基シチ ジン用のいわゆる伝統的なりｚ及びｉｂｕ保護基に関連して使用した時に、シチ ジン副生成物形成をもたらした。

そこで請求められるのはそのような有害な副作用を有さないオリゴヌクレオチド 合成に有用な保護基である。

光刃Ｆｌｌ斐 少なくとも前記の要求を満たす保護基をここに開示する。下記の特徴をもち、従 ってそれによって概括的に定義される開示の保護基は、ベンゾイル基よりも少な くとも約３０倍も不安定であり、しかもカルボニル基であってそれに結合した直 鎖アルキル基をもつカルボニル基を含有する。該アルキル基は１〜約１０個の炭 素原子、好ましくは１〜約６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜約３個の炭素 原子、最も好ましくは１個の炭素原子を有するものである。特に好ましい保護基 はアセチル基であり、次の式：％式％ で表わされ、本明細書では“Ａｃ”と呼ぶ。開示される保護基はシチジン塩基を 保護するのに使用するのが最も好ましい。ＡＣ保護したデオキシンチジン類（ｄ ｅｏｘｙｃｙｔｉｄｅ）を本明細書では“ｄＣ””と呼ぶ。

１１立皿工望説皿 下記の図面は好ましい態様の詳細な説明を明らかにするために使用するものであ る。

第１図は例■〜■に記載の化学合成について示す模式図であり。

第２図は、ｄＣＡｃとｄＣ”とを種々の割合で含有し且つメチルアミン／ｌ−ブ チルアミン・開裂／脱保護試薬又はアンモニア・開裂／脱保護試薬ノイずれかに ！ｌ露させた（ｓｕｂ　ｊｅｃｔｅｄ）種々の３５１体（３５−ｍａｒ）、５１ −量体及び！０１−量体のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の写真図であり ； 第３図は、ｄＣ”を３５％含有するヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）５１ −量体であって開裂／脱保護試薬としてのアンモニアに暴露させた５ｌ−ｆｉ体 の電気泳動図であり。

第４図は、ｄＣＡＣを３５％含有するヘテロ５１−量体であって開裂／脱保護試 薬としてのメチルアミン／ｌ−ブチルアミンに暴露させた５１−量体の電気泳動 図であり； 第５図はＰＣＲ−誘導した９５７塩基対増幅鋳型の写真図であり：第６図は前記 鋳型Ｍ１３ｍｐ１８の配列決定反応の写真図であり。

第７図は、ｄＣＡｃを含有する２２−量体であって開裂／脱保護試薬としてのメ チルアミン／ｌ−ブチルアミンに暴露させた２２−量体を使用して開始させた３ °−末端転移酵素伸張の電気泳動図であり：且つ第８図は、ｄＣ”を含有する２ ２−量体であって開裂／脱保護試薬としてのアンモニアに！露させた２２−量体 を使用して開始させた３゛−末端転移酵素伸張の電気泳動図である。

い　の−’ＡＵ日 当業者が認めるように、シチジン塩基はオリゴヌクレオチド類をを脱保護する間 に副生物の生成を最も受けやすい。従って、シチジン塩基は、慣例では、オリゴ ヌクレオチド合成及び脱保護の間のシチジンの副生成物の生成を監視するのに有 用である。

１〜約１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルアミンを含有してなる開裂／脱保 護試薬を研究する経過中に、ベンゾイル基（“ｂｚ”）又はイソブチリル（“ｉ ｂｕ　”　）基で保護されたシチジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドであっ てかかる試薬に！露させたオリゴヌクレオチドが、特にＮ−メチルシチジンの形 態のある種のシチジン副生物の生成を行うことが知見された。従って、かかる試 薬が特にアンモニアと比較してオリゴヌクレオチドを迅速に開裂し且つｇｉ、ｉ する晩方を付与するとはいえ、生じる副生物の生成がンチジン塩基用の異なる保 護基であって副生物の生成をもたらさない保護基の必要性を招いた。かかる保護 基は、少なくとも次の基準、すなわちｂｚ及びｉｂｕに匹敵する脱保護しやすさ 及び統計学的に有意な副生物の生成（すなわち平均して約０．０１％未満）を沼 かないことを、必要とする。さらにまた、得られるオリゴヌクレオチドはその生 物学的活性を保持しなければならない。すなわち、オリゴヌクレオチドは相捕的 塩基対、例えば塩基Ｃ及びＧに関して有用であらねばならない。

本発明はカルボニル基を含有してなる保護基であって、該カルボニル基がそれに 結合した直鎖アルキル基をもつものであり、該アルキル基がｌ〜約１０個の炭素 元素、好ましくは１〜約６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜約３個の炭素原 子、最も好ましくは１１の炭素原子を有するものである、カルボニル基を含有す る保護基である。本発明が１〜約１０個の炭素元素を有する直鎖アルキルアミン を少なくとも１個含有する開裂／脱保護試薬と共に使用される場合には、シチジ ン副生物の生成を著しく減少させる。

本明細書で使用する、“不安定な（ｌａｂｉｌｅ）”という用語は化学変化を受 ける能力を意味する。本発明の保護基は下記・の通りに表わし得る。

本明細書で使用する、”オリゴヌクレオチド”という用語は、合成オリゴヌクレ オチド及び修飾したオリゴヌクレオチド、すなわち３゛末端、５゛末端、糖又は 複素環式塩基が修飾されているオリゴヌクレオチド、並びに燐酸主鎖（例えばメ チルホスホネート、ホスホロチオエート及びホスホロアミデート）を包含するこ とを！味する。

また、オリゴヌクレオチドは結合したリポータ−基、例えばビオチン、アビジン 、ハプテン類、色素類、蛍光、化学発光標識、酵素標識又は放射線標識有するオ リゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを合成する固体支持体以外の固体支持 体を包含し得る。

開示に基づく持に好ましい保護基は下記のように表わされるアセチル基であり、 本明細書では“Ａｃ”として参照される。従って、アセチル基で保護されたデオ キシノチジンは本明細書では“ｄＣ””と呼ぶ。

特別な理論に束縛されることを望まないが、ｉｂｕに対するｂｚの相対的不安定 性は、アルキルアミン開裂／脱保護試薬の存在下におけ／チジン副生物の生成の 増大の原因になると思われる。ｉｂｕはｂｚよりも（比較的）不安定であり、ア ルキルアミンの存在下ではｉｂｕで保護されたシチジンを含有するオリゴヌクレ オチドは、ｂｚで保護されたシチジンを含有する比較用のオリゴヌクレオチドよ りも、Ｎ−メチルシチジン副生物の生成について低い生成率をもたらす。従って 、保護基として機能し得、しかもｂｚよりも不安定である化学的部分（ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はシチジン副生物の生成が少ないことを統計学的 に証明するかもしれないということが仮定された。また、不安定性はカルボニル 基と隣り合った基の電子供与性によって影響されるということが仮定される。す なわち、電子供与性が増大するのに従って、カルボニル炭素はより電気陽性度が 低くなり、従って脱保護試薬による親核的攻撃を受けに（い。例えば、ｉｂｕの 都二級（すなわち分岐した）炭素からそのカルボニル炭素への電子供与は、Ａｃ の第一級炭素からそのカルボニル炭素への電子供与よりも大きい。

アセチル基はｉｂｕよりも著しく不安定であり、さらにまた前記の開示され、定 義された保護基のなかで最も゛バルキー（嵩高）”でないものである。アセチル 基はシチジン塩基の環外アミノ基に容易に共役し得、しかも実験的に調べられた ように統計学的に有意な副生物の生成なしに、特にアリキルアミン開裂／脱保護 試薬と一緒に効率的に且つ効果的に利用し得る。

本発明の好ましい実施態様についての次の例は、開示または後の請求の範囲に限 定を加久ることを意図するものでなく、また限定を加えるものと解釈されるもの でもない。

■、物質と方法 Ａ９区ｌ １、開裂／脱保護試薬 すべての薬品は、少なくともＡＣ３級とした。水酸化アンモニウムは、Ａｌｄｒ ｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、２２．　 １２２−８）から得た。水に含むようにした４０重量％溶液としたメチルアミン は、ｔ−ブチルアミン（Ｃａｔ、、Ｎｏ、８８．　９２０−５）と同様にＡｌｄ ｒｉｃｈ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、Ｍ２．　７７５−１）から得た。

メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬は、１：１容量比を混合して準備し、室温 で５分間振盪し４℃で保存した。水酸化アンモニウムは、供給者の指示に従い保 存した。

２、保護されたデオキシヌクレオシド 次の保護されたデオキシヌクレオシドをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｔ　Ｃｏ、 （Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、）から得た。

ｄＡ”（Ｃａｔ、Ｎｏ、８　６１３０）；ｄＣ”（Ｃａｔ、Ｎｏ、８　５８８２ ）；ｄＣ”’　（Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｉ　６２６１）およびｄＧ　１１１”　（Ｃａ ｔ、　Ｎｏ、　Ｉ　６００７）　。

チミジンは、Ｓｉｇｍａ　（Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｔ　５０１８）から得た。

Ｂ、　臼・に　口　なプロトコール １、ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＰｃＲＪ）開示した開裂／脱保護試薬の影響下に 置いたオリゴヌクレオチドブライマーのＰＣＲ分析は、Ａｍｐｌ　ｉＴａｇ”（ Ｐａｒｔ　Ｎ。

、　Ｎ８０１−００５５）を有するＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｇ ｅｎｅＡｍｐＴＭ　ＤＮＡ適用試薬キットを用いて行った。′Ａ造者の指示に従 うようにした。

２、ＤＮＡ配列決定 配列決定反応は、α−［”Ｓ］−ｄＡＴＰを用い、米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 　５ｅｑｕｅｎａｓｅ■　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０のプロトコールに従い、Ｍ１ ３ｍｐ１８−木組ＤＮＡ鋳型（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ 、Ｎｏ、４０４−Ｃ＞を使用して行った。

Ｃ９儂詣 １、自動化したＤＮＡ合成装置 オリゴヌクレオチドの合成は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０Ｔ′ＤＮＡ合成装 置を用いて行った；制御したボアーグラス（ｐｏｒｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）（ ５００人−１０００人の子りの大きさ）を固体支持物質用に用いた。さまざまな 長さのホモオリゴヌクレオチドおよびヘテロオリゴヌクレオチドを、製造者の指 示に従い合成した。

２、毛管電気泳動 オリゴヌクレオチドの毛管電気泳動を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ、　Ｉｎｃ、Ｐ／ＡＣＥＴ″２０００高性能毛管電気詠動システムで行った。

３７ｃｍ　ＵｌｏｏＰ　ＵｒｅａＧｅｌ　Ｃｏｌｕｍ　（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｃａ ｔ、Ｎｏ、３３８４８０）を使用した。サンプルは、動電学注入法（ｅｌｅｃｔ ｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）（１０ｋＶ、３秒） によりカラムに充填した；分離は、オリゴヌクレオチドの長さに依存して、３０ −９０分間、１１ｋＶ／ｃｍで行った。

トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（「ＴＲ工Ｓ」）−ポレート７Ｍ尿素（ ランニング緩衝ｉ＆　（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｇｅ　ｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔ、 　Ｃａｔ、Ｎｏ、　３３８４８１））を用いた。吸光度検出は、オリゴヌクレオ チドの長さに主に依存して、０．０５−２．０’Ｄ！！。、、、／ｍｌの範囲で あった。

３、高圧液体クロマトグラフィー（ｒＨＰＬｃＪ　）ＨＰＬＣ分析は、ダイオー ドアレー検出モジエール１６８およびオートサンプラー５０７を備えたＢｅｃｋ ｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＧｏｌｄＴ′　ＨＰＬＣＰｒ ｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　５ｏｌｖｅｎｔ　Ｍｏｄｕｌｅにより行った。Ｃｌ８Ｕ ｌ　ｔｒａｓｐｈｅｒｅＴ′　ＨＰＬＣカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ。

Ｃａｔ、Ｎｏ、　２３５３９；　５μ粒子、４．６ｍｍｘ２５ｃｍ）を用いた。

瓶Ａは、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，９）を含み、瓶Ｂは、ＨＰＬＣ級 アセドアセトニトリルだ。システムは１次のような勾配モードで操作した（１ｍ ｌ／分の流量）：０−１０分＝８５％瓶Ａ、１５％瓶Ｂ；　２０−２５分ニア５ ％瓶Ａ、２５％瓶８．２５−２７分＝５０％瓶Ａ、５０％瓶Ｂ：２７−３０分： ５０％瓶Ａ、５０％瓶８．３０−５０分、１００％瓶Ａ、０％瓶Ｂ。

Ｉｌ、例１．２°−デオキシシチジンの調製２−デオキシシチジン−塩酸塩（Ｐ ｅｎｎｉｓｕｌａ　（カリフォルニア州ベルモント所在）；（：ａｔ、、（カタ ログ）　Ｎｏ、Ｎ１０１２］　７１ｇ　（２６９，３ミリモル）と塩化メチレン １６００ｍ１との懸濁物をトリエチルアミン（Ａｒｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ、Ｎｏ、 ２０６−３）　４２ｍ１（３０１ミリモル）と混合した。混合物を周囲温度で４ 時間激しく撹拌した。無色の結晶質固体を採取し、塩化メチレン（３Ｘ　８０ｍ １）で洗浄し、次いで自然乾燥した。１８５〜１９５℃の範囲内の融点をもつ物 質６１ｇ（収率９９％）を得た。遊離塩基２−デオキシシチジンの公表融点は１ ８５〜１９５℃である。

例Ｉ１．　Ｎ’　−アセチル−２゛−デオキシシチジンの調製無水Ｎ、Ｎ−ジメ チルホルムアミド（”ＤＭＦ　”　）　（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、　Ｎｏ。

２２．７０５０６１１３０００１１に溶解した例工の物質６１．２９ｇ（２７０ ミリモル）に無水酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１１，００４−３） 　２８ａ＋１　（２９６ミリモル）を加え、得られた混合物を室温で２０時間撹 拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた残留物を過剰のジメチルエーテル１ ００　ｍｌで処理した。結晶質生成物７１．４ｇ（収率９８％）を得、これを濾 取し、ジメチルエーテルで十分に洗浄し、五酸化リン上で３時間乾燥した。この 生成物は１５０〜１７０℃の融点を有していた。この生成物の公表融点は１５４ 〜１７６℃である。

Ｎ４−ア’Ｃ＋−ルー２°−デオキシシチジ：／−８２０（ＣｚＨ＋ｓＮ　ｘ　 Ｏ５−ＨｚＯ）の組成分子量の計算値は（ニー４５．９９．８−５．９７．及び Ｎ−１４，６３である。前記の結晶質生成物は、元素分析により測定した下記の 組成分子式Ｃ−４５，７１，８−６，１０，及びＮ−１４，３８を有していた。

また、赤外線スペクトルにより前記結晶質生成物が１個のカルボニルアミド部分 と１個のカルボニル環状アミドとを含有していることが決定された。

さらにまた、その構造は核磁気共鳴（”ＮＭＲ”）で確認された。前記生成物の 構造はＮ４−アセチル−２°−デオキシシチジンの構造と一致した。

例ＩＩ１．　Ｎ’　−アセチル−５−０−（４，４’−ジメトキシ−トリチル） −２−デオキシシチジンの調製 例ＩＩの生成物７０ｇ　（２６０，２ミリモル）を、乾燥ピリジン（Ａｌｄｒｉ ｃｈ：Ｃａむ、Ｎｏ、　２７．０９７−０）　２　Ｘ　５（ｌｏｌと共に一緒に 蒸発させることにより乾燥し、次いで乾燥ピリジン１３００ｍＮ：溶解し、水冷 し、その後にこの溶液に４，４°−ジメトキシ−トリチルクロリド（“ＤＭＴｒ −Ｃ１”）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｎ４０１１）　１０５ｇ　 （３１４ミリモル）を加えた。得られた混合物を５℃で２０時間撹拌しておいた 。ピリジンを減圧下で除去し、得られた残留物を塩化メチレン３．０リツトルに 溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶ｉ＆　（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ 、　２３，９３１−３）　２　ｘ　２リツトルで洗浄し、次いで脱イオン水でＩ Ｘ２リットルで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いでほとんど乾 固するまで（層線した。得られた生成物を、６　Ｘ　８０ＣＯ１のシリカゲルカ ラム（Ａｌｄｒｉｃｈ；７０〜２３０メツシｘ　；　Ｃａｔ、Ｎｏ、２８，８６ ４−４）で０〜６％の塩化メチレン−メタノール２０．０リツトルを用いて勾配 溶出することにより精製した。所望の画分を採取し、約３００ｍ１に濃縮し、冷 却（０℃）ヘキサン［Ｂａｘｔｅｒ　（イリノイ州ＭｃＧａｗ　Ｐｏｒｔ所在） ；　Ｃ：ａｔ、　Ｎｏ、２１６−４　ＤＫ　］３．０　リットルに浦和して生成 物を沈殿させた。沈殿した生成物を、濾過し、ヘキサンで洗浄し次いで自然乾燥 して生成物１１７ｇ　（収率７９％）を得た。

Ｎ４−アセチル−５−０−（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２−デオキシ シチジン（Ｃ３２Ｈ−３Ｎ　３０　？　）の組成分子量の計算値はＣ−６７、２ ４；Ｈ−５，８２，及びＮ−７，３５である。該生成物は元素分析により決定さ れた下記の組成分子式：　Ｃニー６６．０２．　Ｈ−６，０５，及びＮ−６，９ １を有しテいた。また、赤外線スペクトルにより前記結晶質生成物が１個のカル ボニルアミド部分と１個のカルボニル環状アミドとを含有していることが決定さ れた。さらにまた、その構造はＮＭＲで確認された。前記生成物の構造はＮ４− アセチル−５゛−ｏ〜（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２゜−デオキシシ チジンの構造と一致した。

例ＩＶ、　Ｎ’−７セチルー５−０−（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２ ゛−デオキシシチジン−３−〇−（Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエ チル−ホスホロアミダイトの調製例ＩＩＩの生成物１１．４４ｇ　（２０ミリモ ル）をピリジン、トルエン及びテトラヒドロフラン（“ＴＨＦ　”　）（Ａｌｄ ｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１８，６５６−２）と共に連続的に同時蒸発させる ことにより乾燥し、還流し、次いで水素化カルシウム上で蒸留した。得られた乾 燥残留物を乾燥ＴＨＦ１００ｍｌに溶解し、これにＮ、　Ｎ、　Ｎ−ジイソプロ ピルエチルアミン１４ｍ１　（８０ミリモル）を加えた。次いで、アルゴン雰囲 気下に室温で一定に撹拌しながら、β−シアノエチルモノクロローＮ、Ｎ−ジイ ソプロピルボスボロアミダイト８．９２ｍ＋１　（４０ミリモル）を５分間で（ 注射器で）滴下した。６０分間撹拌した後に、混合物に対してメタノール１．２ ａ＋１（４０ミリモル）を加え、さらに６０分間撹拌を続け、次いで蒸発乾固し た。得られた残留物を酢酸エチル（Ｂａｘｔｅｒ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、　ＣＰ８０ １３２−４ＤＫ）　６００ｍ１に溶解し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（２ ｘ　５００　ｍｌ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を蒸発 させ、得られた残留物をエーテル５０ｍ１に溶解した。次いで、これをヘキサン ７００ｍ１に室、昆で浦和した。この混合物をデカントし、沈殿した生成物をエ ーテル１００　ｍｌに溶解し、次いでヘキサン７００　ｍｌを加え、室温で撹拌 した。この混合物をデカントし、生成物を塩化メチレン５００　ｍｌに溶解し、 次いで塩基性アルミナ（Ａｌｄｒｉｃｈ；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１９，９４４−３） 　３０ｇを加え、室温で１時間撹拌した。得られた混合物をガラス製濾過器で濾 過し、蒸発させ、次いでデシケータ−中で塩化カルシウム、五酸化リン上で減圧 下に乾燥した。生成物１１ｇ（収率７６％）を得た。その純度は逆相ＨＰＬＣに より測定すると９８．４％であった。

Ｎ４−アセチル−５−０−（４，４°−ジメトキシ−トリチル）−２−デオキシ シチジン−３−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスホロ アミダイト（Ｃ４１ＨＳ。Ｎ、Ｏ，Ｐ）の組成分子量の計算値はＣ−６３，８０ ，）ｌ−６，５３，Ｎ−９，０７，及びＰ−４，０１である。元素分析により決 定された該生成物の組成分子式は、Ｃ−６２，５１，８−６，８４，Ｎ−８，６ ８及びＰ−３，６１であった。また、赤外線スペクトルによりこの生成物が１個 のカルボニルアミド部分と、１個のカルボニル環状アミドと、１個の−Ｃ＝Ｎ基 とを含有していることが決定された。さらにまた、その構造はＮＭＲで確認され た。前記生成物の構造はＮ“−アセチル−５’　−０−（４，４−ジメトキシ− トリチル）−２°−デオキシシチジン−３”−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル） −β−シアノエチル−ホスホロアミダイトの構造と一致した。

例ＩＶの生成物を、アセチル保護基を有するデオキシシチジンを示す“ｄＣＡｅ ″と呼ぶ０例工〜ＩＶの製造工程を概説する反応工程図を第１図に示す。

例■：　シチジン副生物の生成 認められるように、通常、デオキシシチジンはデオキシシチジンを含有するオリ ゴヌクレオチドを脱保護する間に副生物の生成を最も受けやすい。典型的には、 かかる副生成物の生成はアミノ基転移によるものである。

当業者が認めるように、オリゴヌクレオチドの合成は典型的には最終生成物をで きる限り迅速に回収することを意図して行われる。

しかしながら、場合によっては、可溶化させ、脱保護したオリゴヌクレオチドを 長時間、脱保護試薬中に保留させ得ることが可能である。さらにまた、当業者が 認めるように、オリゴヌクレオチドが前記試薬中に存在する場合のかかる時間の 増大は、アミノ基転移の機会を増大させ得、従って副生物生成の機会を増大させ 得る。

シチジン副生物の生成を、逆相ＨＰＬＣにより脱保護試薬としてメチルアミンと 、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンの両方を使用していくつかの時間と温度とに わたって調べた。

“伝統的な”シチジン保護基“ｂｚ”及び“ｉｂｕ”並びにアセチル保護基につ いて調べた。かかる試薬を使用した場合に認められた副生成物（核磁気共鳴によ り確認）はＮ−メチルシチジンであった。デオキシシチジンに対するＮ−メチル デオキシシチジンの生成の割合（パーセント）を、アセチル保護基で保護したデ オキシシチジンの溶液をベースとした脱保護に基づいて以下に示した。

Ｎ−メチルシチジンの生成率＊ メチルアミン　＜　ｏ、　０１１傘　＜０．０１　＜０．０１（６０分）（２０ 分）　（５分） メチルアミン　〜０．０５　〜０．２５　〜２．５（１６時間） メチルアミン／　＜　０．０１　＜　０．０１　〜０．６％し一ブチルアミン （１６時間） ＊　−平均パーセント これらの結果は、典型的なオリゴヌクレオチド合成（すなわち、研究者が完成最 終生成物をできる限り早（得ることを望む方法）については、メチルアミンは統 計学的に有意なシチジン副生物の生成を招かないということを示す、しかしなが ら、オリゴヌクレオチドが試薬中に滞留する時間が増大するに従って、シチジン 副生物の生成もまた増大する。従って、アミノ基転移抑制試薬（“ＴＳＡ”）の 使用が有効である。“ＴＳＡ”は、本明細書においては典型的には副生物の生成 として現われるアミノ基転移、すなわちヌクレオチドのアミンの交換の抑制に有 効な試薬として定義される。　ＴＳＡは水の極性指数値（ｐｏｌａｒｉｔｙ　１ ｎｄｅｘ　ｖａｌｕｅ）よりも少なくとも１．５倍小さい極性指数値をもつ薬剤 （又は複数の薬剤）であって、好ましくは１〜約ｌＯ個の炭素原子を有する直鎖 、分岐鎖、環状の飽和及び不飽和アルキルアミン類からなる群から選択される薬 剤（又は複数の薬剤）であるのが好ましい。また、該ＴＳＡは複数の官能基；エ タノール；メタノール；イソプロピルアミン；アセチルニトリル；ジメチルホル ムアミド：テトラヒドロフラン；及びこれらの組み合わせを含有していてもよい 。前記のアルキルアミンの代表例としては、以下のアミンに限定されないが、ｔ −ブチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチ ルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン及び５ｅｃ−ブチルアミンが挙げ られる。前記データは、メチルアミンに対して、ＴＳＡとしてメチルアミンとｔ −ブチルアミンとを含有してなる試薬がシチジン副生成物の生成を顕著に減少さ せることを示している。

第２の一連の研究は、これらの点について（ａｌｏｎｇ　ｔｈｅｓｅ　１ｉｎｅ ｓ）行った。これらの研究に関しては、前記試薬すなわちアミノ基転移抑制試薬 としてメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを使用して種々の時間と温度ニオイテ、 ｄＣ”、ｄＣ””　、　ｄＣ”、ｄＧ”″、　ｄＡ”及びｄ丁ニツいて副生成物 の生成（ヌクレオシドについて副生成物を生成しない相対率として）を調べた。

結果を第１Ｉ表に示す。

第１Ｉ表 副生成物の生成率＊ 温度（”Ｃ）　反応時間　ｃ”　ｃ’″ｕ　Ｃ″１　Ｃｌ　ｂ　ｕ　Ａ　ｂ　Ｌ 　Ｔ２５　９０分　中本　０．１５　１０．０　中本　＊傘　中本２５　１６時 間　中本　中本申　＊＊牟　本市　傘傘　中本３７　３０分　＊傘　０．１５　 １０．０　中本　車中　車中３７　５［４間　中本　本中本　本中本　＊傘　中 本　中本３７　１６　時間　傘＊　本中本　本中本　中本　本＊　中本６５　５ 分　車中　０．１５　１０．０　車中　中本　＊傘６５　１　時間　傘＊　中本 中　中本中　＊傘　傘＊　＊傘６５　１６時間　０．６　中本中　傘＊＊　傘＊ 　＊傘　車中８０　３時間　中本　０．１５　１０．０　中本　中本　本市８０ 　１　時間　傘帛傘　本中本　中本　傘＊　中本　本中本　平均 中本　＜　０．０１％ これらの結果は少なくとも幾つかのことを示している。第１に、ｄ（Ｊｆ護基に 関して前記のデータは、アセチル保護基が直鎖アルキルアミン開裂及び脱保護試 薬と一緒に使用した場合には侵れた結果を与λ、前記の複数の“伝統的”シチジ ン保護基が著しく高い副生物の生成をもたらすことを示している。第２に、この 脱保護及び開裂試薬は、高められた１度と所望の反応時間よりも長い時間とにお けるｄＣ”の脱保護を除いて、調査した温度又は反応時間のいずれにおいても保 護されたデオキシヌクレオシドについて統計学的に有意な副生物の生成を招かな い。従って、アセチル基で保護されたデオキシシチジンを含有してなるオリゴヌ クレオチドについては、かかる高められた温度、長い反応時間を使用しないこと が好ましい。

例ｖ工：未精製オリゴヌクレオチドの酵素消化分析酵素消化法と逆相ＨＰＬＣ法 とを使用して、数種のオリゴヌクレオチドの組成について分析を行った。これら の調査はアセチル基及び伝統的シチジン保護基、ｂｚで保護したデオキシシチジ ンを使用して行った。別種の保護基は全てオリゴヌクレオチド同志の間では一致 していた。下記の配列をもつ複数個の３５−量体（３５−ｍｅｒ）、５１−量体 及び１０１−量体について分析した。

用二１装 ５　’　−ＣＡＧ−ＴＧ（ニーＡＧＣ−ＴＣＣ−ＴＡＧ−ＣＡＧ−（：ＣＴ−Ａ ＧＣ−ＧＴＡ−（：ＴＡ−ＧＴＣ−ＴＴ−３’■二ｌ註 ５°−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＴＡ　Ｇ−ＴＣＡ　−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＡＧＴ−ＣＧＣ −ＴＣＡ　−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＡＧ−ＴＴＧ−ＣＡＣ−ＡＧＧ−ＴＣＡ−ＣＣ ，Ｔ−３゜圧と１具 ５°−ＧＣＴ−ＧＣＣ−ＡＧＴ−Ｔ（：Ｇ−ＧＴＣ−ＡＴＣ−ＣＧＡ−ＴＣＣ− ＴＣＧ−ＧＴＣ−ＡＣＧ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＴＣＡ　−ＡＣＧ−ＧＣＡ−ＣＣＴ −ＡＣ：Ｔ−ＣＣＴ−ＣＧＴ−ＡＡＣ−ＧＴＡ−ＧＧＡ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＧＡ Ｔ−ＴＣＧ−Ｃ４Ｃ−ＧＴＧ−ＣＡＡ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＴＴＣ−ＡＴ−３″前 記の複数のオリゴヌクレオチドを、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有して なる試薬を使用して２５℃で９０分間開裂及び脱保護するか又はアンモニアを使 用して６５℃で３時間開裂及び脱保護した。

可溶化し、脱保護された複数のオリゴヌクレオチドは、精製せずに分析した。結 果を第１ＩＩ表に下記の通り示す。

第１ＩＩ表 組成分析 測定値 理論値　ｄＣ”を含有してなる　ｄＣ”を含有してなるオリゴヌクレオチド　オ リゴヌクレオチドＣ１１１０，６７１０，６２ ３５−量体　Ｇ　８　７．８８　７．８４Ｔ　９　９．６５　９．４１ Ａ　７　６．８０　７．１３ ５１−量体　Ｇ　１１　１１．７１　１１．７２Ｔ　１１　１１．６１　１１． ０７ Ａ　１１　１０．６５　１０．８５ １０１−量体　Ｇ　２２　２０．７４　２０．７０７　２２　２１．７８　２１ ．７３ Ａ　２２　２５．０９　２５．０４ 種々の未精製オリゴヌクレオチドの理論組成と、実測組成とは良好な相関関係を 与える。さらにまた、前記データに基づいたデオキシシチジン保護基の違いは、 結果において統計学的に有意な差異を示していない。

例ＶＩ１．　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（“ＰＡＧＥ”）複数の３５−量 体（ｄＣ”３５％、　ｄＣＡｃ３５％；ｄＣ″”１００％；及びｄＣ”１００％ ）、複数の５１−量体（ｄＣ”３５％；　ｄＣＡｅ３５％、　ｄＣ”１００％； 及びｄ（：”１００％）及び複数の１０１−量体（ｄＣ”３５％、　ｄＣＡｃ３ ５％、ｄＣ”１００％；及びｄｃ’ＪＯｏ％）の分析をＰＡＧＥで分析した。ヘ テロ３５−量体、５１−量体及び１０１−量体は例ＩＶに記載のものであり、ホ モ３５−量体、５１−量体及び１０１−量体については、該オリゴマーは不溶化 したチミジンから合成した。ｄＣＡｃを含有してなる複数のオリゴヌクレオチド は、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有してなる試薬を使用して６５℃で９ ０分間開裂し且つ脱保護した。ｄＣ”　”を含有してなる複数のオリゴヌクレオ チドは、アンモニアを使用して６５℃で３時間開裂し且つ脱保護した。

予め混合したアクリルアミド／メチレン　ビス−アクリルアミド（２９：　１　 ）　［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　 （インディアナ州インディアナポリス所在）　；　Ｃａｔ、Ｎｏ、１００−１５ １１１００ｇに脱イオン水１０７、３＋ｏｌを加えて５０％原液（ｓｔｏｃｋ　 ５ｏｌｕｔｉｏｎ）を得ることにより、２２ｃｍＸ　１６．５ｃ＋ｏの大きさの 変性ゲルを調製した。５０％原液２０＋ａｌに尿素２２、５ｇ、トリス−硼酸塩 ／ＥＤＴＡ　（“ＴＢＥ　”　）　５ｍｌ及び十分な量の脱イオン水を加えて５ ０ｍ１にした。固体成分が溶解するように、得られた溶液を攪拌し、加熱した。

その後に、過硫酸アンモニウム２０ｍｇとＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ−テトラメチレンジ アミン（”ＴＥＭＥＤ“）２０μリツトルとを加えた。この溶液をきれいな皿（ プレート）に注いで、１時間ゲルを重合させ、ＩＸＴＢＥを用いて２０ｍＡで１ 時間予備試験した際に各オリゴヌクレオチドの０．２〜１．００Ｄｚｓａ、、ａ をｌｏｗ尿素ＩＯμリットルに加えた。混合物２０ＬＬリツトルを前記ゲルに装 填し、オリゴヌクレオチドの長さに応じて２８ｍＡで２〜８時間電気泳動した。

バンドをＴＬＣ型光板上でＵＶシャドウィング法又は臭化エチジウムにより可視 化させた。

写真結果を第２図に示し、レーンを下記の通りに定義した。

レーン　オリゴヌクレオチド １　３５−量体（ｄ（：”３５％） ２３５−量体（ｄＣ”３５％） ３　３５−量体（ｄｃ’ＪＯｏ％） ４３５−量体（ｄｃ”１１００％） ５　５１−量体（ｄＣＡｅ３５％　） ６５１−量体（ｄＣ”３５％） ７　５１−量体（ｄ（：”１００％） ８５１−量体（ｄＣ”１００％） ９１０１−量体（ｄＣ“３５％） １０　１０１−量体（ｄＣ”３５％） １１　１０１−量体（ｄｃＡｃｌＯＯ％）１２　１０１−量体（ｄＣ”１００％ ）第２図の結果は、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン・試薬に暴露したオリゴヌ クレオチドとＡｃ保護基とは、アンモニアに暴露したオリゴヌクレオチドと伝統 的デオキシシチジン保護基、ｂｚと比較してほぼ同じＰＡＧＥパターンを与える ことを示している。

例ＶＩＩ１．毛細管電気泳動 ｄＣ１′″を３５％又はｄＣＡｃを３５％含有してなるヘテロ５１−量体オリゴ ヌクレオチドを、アンモニアに６５℃で３時間暴露するか又はメチルアミン／ｌ −ブチルアミンに２５℃で９０分間暴露し、次いで毛細管電気泳動法により分析 した。アンモニアに暴露したオリゴヌクレオチド及びメチルアミン／ｌ−ブチル アミンを含有する試薬に暴露したオリゴヌクレオチドの電気泳動図を第３図及び 第４図にそれぞれに示す。

第３図及び第４図の結果は、試料導入から５１−量体の検出までの時間について はほぼ同一である。主要ピークの下の積分面積全体の割合は、第３図については ６６、９０２であり、第４図については６６、５７５でありほぼ同一である。ま た、これらの結果は、メチルアミン／１−ブチルアミン・試薬及びデオキシシチ ジン保護基Ａｃが、アンモニア及び伝統的デオキシシチジン保護基ｂｚと比較し て、比較的固等の可溶性の、保護されたオリゴヌクレオチドを与えることを示し ているす。

例Ｘ、　ポリメラーゼ連鎖反応 前記の語例は、１〜約１０個の炭素原子を含有する直鎖アルキルアミンを含有す る脱保護／開裂・試薬とアセチル保護基とが、オリゴヌクレオチド特にデオキシ シチジンを含有するオリゴヌクレオチドを統計学的に有意な副生成物の生成を伴 わずに迅速且つ効率的に開裂し且つ脱保護するのに使用し得ることを証明してい る。しかしながら、当業者が認めるように、かかるオリゴヌクレオチドを種々の 方法に利用できることが必要である。

ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド を生成させ、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬（この場合にはデオキシシチ ジンをＡｃで保護した）に２５℃で９０分間暴露した。プライマーは下記の通り であった。

Ｕヨ」【体 ５’−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−Ｃ：ＣＧ−ＡＧＴ−３’鋳型はＭ１３ ｍｐ１８　ＲＦＩ　ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａ ｔ、Ｎｏ、４００−Ｂ）であった、製造メーカーの指示書はＧｅｎｅＡｍｐ試薬 キットを使用することになっていた。

最初の溶融温度は９５℃で７分であった。下記のサイクルプロフィールでＰｅｒ ｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを用 いて２５サイクル運転した。

温度（”Ｃ）　時間（秒） 配列（Ｓｅｑ、）＃１　９４　１ 配列　＃２　９４　６０ 配列　＃３　３７　１ 配列　＃４　３７　１２０ 配列　＃５　７２　１ 配列　＃６　７２　１８０ 得られた９５７塩基対のＰＣＲ生成物を、トリス−アセテート／　ＥＤＴＡ（“ ＴＡＥ”）中で１％アガロース上で電気泳動にかけ、臭素化エチジウムで染色し た。写真結果を第５図に示す。第５図に示したレーンは下記の通りである。

レーン１　９５７ｂｐの生成物　（メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬とデオ キシシチジン用アセチル 保護基とを使用して誘導したプラ イマー）； レーン２　９５７ｂｐの生成物　（アンモニアとデオキシシチジン用ｂｚ保護基 とを使用して誘導したプ ライマー）： レーン３　ゲル標識　（）ｆｉｎｄ　Ｉ工Ｉ、２３２２ｂｐ標標及び２０２７ｂ ｐ標識を用いて消化したえＤＮＡ）　。

及び レーン４　ゲル標識　（）ｌｉｎｆＩ　、　１６３２ｂｐ標識及び５０６ｂｐ標 識を用いて消化したＰＢＲ３２２ＤＮＡ）第５図に示した結果は、メチルアミン ／ｌ−ブチルアミン試薬とアセチル保護基とを使用して誘導したプライマーが、 アンモニアで開裂及び脱保護し且つデオキシシチジン用ｂｚ保護基を使用するこ とにより生成させたプライマーから誘導した増幅（ａａ＋ｐｌｉｆｉｅｄ）生成 物と実質的に同じ増幅生成物の生成をもたらすことを示している。

例Ｘ１．　ＤＮＡ配列決定 デオキシシチジン用アセチル保護基と比較用の保護基ｂｚとを使用して２組の１ ８−量体を合成し、メチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有してなる試薬に２５ ℃で９０分間暴露するが、アンモニアに６５℃で３時間暴露した。前記２組の１ ８−量体は下記の配列を有していた。

組二１腟 ５°−ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−Ｃ（：Ｃ−ＡＧＴ−３゜可溶化され、 脱保護された複数のオリゴマーをＳｅｐ　Ｐａｋ　（Ｗａｔｅｒｓ。

Ｐａｒｔ　ｎｏ、５１９０）　ＤＮＡ精製キットを使用して精製した。これらの 精製オリゴマーは配列決定を目的としたプライマーとして用いた。鋳型はＭ１３ ａ＋ｐ１ｇ一本ｊｉＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｃａ ｔ、Ｎｏ、４０４−Ｃ）であった。配列決定はＵＳＢ配列決定材料及びプロトコ ールと一緒に前記複数の１８−量体を使用して行った。結果を第６図に示す。

第６図の結果が示すように、アンモニアとｂｚとによって誘導されたプライマー を使用する配列決定バンドに対して、メチルアミン／ｌ−ブチルアミン試薬とア セチル保護基とに暴露されたプライマーを使用する配列決定バンドのパターンは 実質的に同じである。

例ＸＩ１．　３°末端転移酵素伸張 複数の２２−量体をデオキシシチジン用のアセチル保護基又はｂｚ保護基のいず れかをを使用して合成し、それぞれメチルアミン／ｌ−ブチルアミンを含有して なる試薬に６５℃で９０分間暴露するか又はアンモニアに６５℃で３時間暴露し た。上記２２−量体は下記の配列を有し５−ＴＴＣニーＴＧＣ−ＣＧＴ−ＡＣＣ −ＧＴＴ−ＣＣＴ−ＧＴ（ニーＴ−３゜可溶化され、脱保護された複数のオリゴ マーをＳｅｐ　Ｐａｋ　ＤＮＡ精製キットを使用して精製した。これらの精製オ リゴマーは３゛末端転移酵素伸張調査用のプライマーとして用いた。

脱イオン水１５０μリットル；チミジン三燐酸５ｍｇ（ＴＴＰ”）（Ｓｉｇｍａ 、Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｔａ２０５　）　；末端デオキシヌクレオチジル／転移酵素（ ”ＴＤＴ　”　）　５μリツトル（１５Ｕ／　ｕリットル）　（ＢＲＬ、　Ｃａ ｔ、　Ｎｏ、　８００８ＳＢ）及びトレーリング緩衝液（ｔｒａｉｌｉｎｇ　ｂ ｕｆｆｅｒ）５０　ｕリットルに各オリゴヌクレオチド２．５０Ｄ＊ａ。□ヨを 加えた。混合物を３７℃で１夜インキユベートし、得られた物質をＳｅｐ　Ｐａ ｋ　Ｃ１８カートリッジを使用して下記のようにして精製した。すなわち、反応 混合物を０．５ｍ酢酸アンモニウムに１＝２で希釈し、上記カートリッジに充填 し、次いで該カートリッジを脱イオン水で洗浄し、生成物を６０％メタノール脱 イオン水溶液で溶出した。生成物を毛細管電気泳動により分析した。

電気泳動結果を第７図及び第８図に示す。

第７図及び第８図の電気泳動図は、アセチル基で保護し且つメチルアミン／ｌ− ブチルアミン試薬に暴露させたシチジンを含有してなるプライマー（第７図）と 、ｂｚで保護し且つアンモニアに暴露させたシチジンを含有してなるプライマー （第８図）とはそれらの３°末端において両方共に伸張されたことを示し、また 得られた生成物同志が実質的に同一であることを示している。

前記の記載は相当に詳細に説明しているが、詳細な説明及び例に記載された態様 が該記載又は後記の請求の範囲に限定すると解釈されるべきでないことが理解さ れるべきである０本発明は自動ＤＮＡ合成装置に限定されない。本発明はデオキ シリボ核酸オリゴヌクレオチド類に限定されないばかりではな（、リボ核酸オリ ゴヌクレオチド類と共に利用し得る０本発明は開示された保護基の塩基シトシン についてのみの使用に限定されない０本発明は参照した同時継続中の出願に記載 の試薬の特定の態様と一緒に使用することに限定されないし、本発明はむしろ特 に本明細書に概括的に記載し、特許請求した試薬類と共に利用されることを意図 するものである。当業者の範囲内にある改良及び改変は以下の請求の範囲の中に 入るものである。

９１０　Ｉ＋　１２ １　ｚ　３４ ｌ抄、６ 蜘　（ｘ　１ｏ−３）　”＠ Ｉ−一、わ、Ｎ・　ＰＣＴ八Ｓへ９３１０３３３７、　、　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＵＳ 　９３１０３３３７

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．オリゴヌクレオチドの合成に有用であり、下記の式を有する環外アミノ保護 基： −Ｃ−（ＣＨ２）Ａ−ＣＨ２ 式中、“Ａ”は０から約９の整数である。
2. ２．Ａが０から約５の整数である請求項１の保護基。
3. ３．Ａが０から約２の整数である請求項１の保護基。
4. ４．Ａが０である請求項１の保護基。
5. ５．下記構造を有する化合物； ▲数式、化学式、表などがあります▼ 式中、“Ａ”は０から約９の整数であり；Ｂはアデニン、グアニン、及びシトシ ンからなる群から選ばれ；Ｃは水素原子、リポータ−基、ヌクレオチドの５′一 炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌクレオ チドの５′一炭素原子に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合す ることができる基からなる群から選ばれ；Ｄは水素、リポーター基、ヌクレオチ ドの３′一炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及 びヌクレオチドの３′一炭素に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中 結合することができる基からなる群がら選ばれる。
6. ６．Ａが０から５の整数である請求項５の化合物。
7. ７．Ａが０から２の整数である請求項５の化合物。
8. ８．Ａが０である請求項５の化合物。
9. ９．下記構造を有する化合物： ▲数式、化学式、表などがあります▼ 式中、“Ａ”は０から約９の整数値であり；Ｂはアデニン、グアニン、及びシト シンからなる群から選ばれ；Ｃ′は水素原子、リポーター基、及び２′一酸素原 子から化学的に除去でき、それにより水素原子と置き換えることができる基から なる群から選ばれ；Ｃは水素原子、リポーター基、ヌクレオチドの５′一炭素原 子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌクレオチドの ５′一炭素原子に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合すること ができる基からなる群から選ばれ；Ｄは水素、リポーター基、ヌクレオチドの３ ′一炭素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合することができる基、及びヌク レオチドの３′一炭素に結合した酸素原子にオリゴヌクレオチドの合成中結合す ることができる基からなる群から選ばれる。
10. １０．Ａが０から約５の整数である請求項９の化合物。
11. １１．Ａが０から約２の整数である請求項９の化合物。
12. １２．Ａが０である請求項９の化合物。
13. １３．該保護基がオリゴヌクレオチドの合成に使用されるヌクレオチドの環外ア ミノ基を保護するのに用いられ、オリゴヌクレオチドが１から約１０の炭素原子 を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試薬にさらされ る請求項１の環外アミノ保護基。
14. １４．オリゴヌクレオチドの合成に使用され、オリゴヌクレオチドが１から約１ ０の炭素原子を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミンを含んでなる試 薬にさらされる請求項５の化合物。
15. １５．オリゴヌクレオチドの合成に使用され、オリゴヌクレオチドが１から約１ ０の炭素原子を含んでなる少なくとも１つの直鎖アルキルアミンにさらされる請 求項９の化合物。