JPH0371437B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、蛍光を発するヌクレオシド又はヌク
レオチドに関する。 生体高分子、特に蛋白質や核酸における構造と
機能の相関を明らかにするために、蛍光プローブ
を利用した研究が広く行なわれている。そして核
酸の研究において、核酸中に存在する蛍光性の微
量塩基をプローブとして用いる方法や、核酸へ蛍
光分子を化学的に導入してこれをプローブとして
用いる方法がある。蛍光性塩基を有するヌクレオ
シドの例としては、アデノシン類やシチジン類を
クロルアセトアルデヒドで化学修飾して得られ
る、下記式で示されるような蛍光性のエテノ誘導
体がある。

【式】１，N⁶−エテノアデノシン

【式】３，N⁴−エテノシチジン 特に、エテノアデノシン類は、中性で強く蛍光
を発することから、これをプローブとして用いて
種々の研究が行なわれてきた。しかし、これらは
塩基対形成能を有しない。 本発明者らは、蛍光性を有しグアニンあるいは
アデニンとの塩基対形成が可能な、ビリミジンヌ
クレオシド又はヌクレオチド誘導体を得るべく鋭
意研究を行ない、本発明に到達した。 即ち、本発明は、 一般式（）で表わされる蛍光性ヌクレオシド
又はヌクレオチドである。 〔式（）において、X₁とY₁は各々

【式】を表わす（ｎは０，１，２又は ３の整数を示す）。Z₁はＨ−又は

【式】を表わす（ｍは０，１，２又は ３の整数を示す）。W₁はＨ−又はHO−を表わ
す。〕 一般式（）において特に好ましいのは、X₁
とY₁が共にHO−でZ₁がＨ−又はHO−でW₁がＨ
−の化合物、あるいはX₁及び／又はY₁が

【式】（ｎは１，２又は３の整数を示 す）でZ₁がＨ−又はHO−でW₁がＨ−である。
水酸基が公知の適当な保護基で保護されているも
のも、本発明の範囲に含まれる。 一般式（）の化合物の製造法を、X₁とY₁が
共にHO−で、Z₁とW₁が共にＨ−の場合を例に
とつて説明する。 一つの方法は、糖部の水酸基を保護した５−ヨ
ードデオキシシチジンにＯ−ヨードベンゾイルク
ロライドを作用させ、得られた化合物をDMF中
で、２価のPdの存在下に加熱処理し、次いで保
護基を除去する方法である。 他の方法は、デオキシシチジンから容易に得ら
れるN⁴−ベンゾイルデオキシシチジン誘導体を、
メタノール中でヨウ素の存在下で光照射し、次い
で常法により脱保護を行なう方法である。 上記の如くして得られた蛍光性ヌクレオシド
は、その3′位又は5′位に後述の如き方法でリン酸
基を導入しヌクレオチドとすることができる。 かくして得らた一般式（）の化合物は、蛍光
性でありかつ核酸塩基のグアニンあるいはアデニ
ンと塩基対を形成する能力があるので、これを分
子中又は分子末端に有するオリゴ又はポリヌクレ
オチドは、蛍光プローブとして利用できる。ある
いは、これらの化合物は、DNA二重らせん中に
組み入れた際に、塩基部分は空間的に適合してお
り、塩基間の水素結合形成能力やスタツキング作
用を増強する可能性も考えられる。 従つて、本発明により、分子中又は分子末端
に、一般式（）で表わされる蛍光性ヌクレオチ
ドを、少なくとも１個有するオリゴ又はポリヌク
レオチドを得ることができる。 〔式（）において、X₂は

【式】又 は

【式】を表わし、X₂が

【式】 のときY₂又はZ₂は−Ｏ−を表わし（但し他方は
Ｈ−又はHO−を表わす）， X₂が

【式】のときY₂又はZ₂は−Ｏ−又 は

【式】を表わす（但し他方はＨ−又 はHO−を表わす）（ｒは０，１，２又は３の整
数を示し、ｓは１，２又は３の整数を示す）。W₂
はＨ−又はHO−を表わす。〕 一般式（）において特に好ましいのは、X₂
が

【式】であり、Y₂が−Ｏ−でW₂がＨ− である、オリゴ又はポリヌクレオチドである。 蛍光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをDNA
オリゴマーあるはポリマーへ導入するには、有機
化学的に合成する方法と、酵素化学的に導入する
２通りの方法がとられる。 有機化学的に合成する方法は、蛍光性ヌクレオ
シド(F)を含むオリゴヌクレオチドを直接合成する
方法である。Itakuraらが開発した、固相リン酸
トリエステル法を用いて、第１図に示すサイクル
に従つて合成を行なつた。 すなわちステツプ１として、ベンゼンスルホン
酸（BSA）で、5′−水酸基のジメトキシトリチル
基（DNTr基）を除去し、ステツプ２で、ダイマ
ーブロツクをメシチレンスルホン酸ニトロトリア
ゾール（MSNT）で縮合し、固相に担持され
Ｆ含有オリゴマーの鎖を伸長した。また、目的と
異なる配列のオリゴマー生成を防ぐために、縮合
反応において未反応の5′−水酸基は、４−ジメチ
ルアミノピリジン（DMAP）存在下無水酢酸
（Ac₂Ｏ）でキヤツピングを行なつた。 このサイクルをくり返すことによつて、目的と
するオリゴマーを合成した。オリゴマヌクレオチ
ドのポリマー支持体からの切り出しとリン酸の保
護基の除去は、室温でアンモニア水で処理するこ
とにより行なつた。 更にアンモニア水で加熱処理することにより、
塩基部のアシル基を除去した。次いで逆層のシリ
カゲルカラムクロマトグラフイーで精製し、必要
なフラクシヨンを分取し、5′末端のDMTr基を除
去し、更に高速液体クロマトグラフイーで精製し
た。 蛍光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをDNA
オリゴマーあるいはポリマーに酵素化学的に導入
する方法としては、例えば、 （） DNAポリメラーゼを用いるニツクトラ
ンスレーシヨン （Rigby，P.W.ら，J.Mol.Biol.，113，237
（1977）参照） （） 末端デオキシヌクレオチドトランスフエ
ラーゼを用いる3′−末端付加反応 （F.J.Bollum，The Enzymes，（P.D.
Boyer，ed.），3rd Ed.Vol.10，pp.145−171，
Academic Press，New York，N.Y.（1974）
参照） の２つが、通常用いられる。 いずれの酵素を用いる場合にも、基質として
は、好ましくは、ヌクレオシド5′−トリリン酸が
用いられる。蛍光性ヌクレオシドの5′−モノリン
酸の合成は、Yoshikawaら（Tetrahedron
Lett.，5065（1967））の方法に従つて合成できる。
また、5′−モノリン酸をイミダゾリドとした後ジ
リン酸と反応させる、5′−トリリン酸の合成は、
Ottoらの方法（J.An.Chem.Soc.，87，1785−
1788（1965））に従つて行なうことができる。 次に合成した5′−トリリン酸を基質として用
い、DNAポリメラーゼを用いて、ニツク・トラ
ンスレーシヨンを行なうと、シチジンの代りに、
蛍光性ヌクレオチドが導入され蛍光標識されたオ
リゴマーあるいはポリマーを調整することができ
る。また、末端デオキシヌクレオチドトランスフ
エラーゼを用いると、3′−末端に蛍光性ヌクレオ
チドポリマーを付加することができる。 以下、実施例、参考例により本発明を詳述す
る。 実施例 １ (1) ５−ヨードデオキシシチジン(a)500mgを無水
ピリジン10mlに、懸濁させ、これに１，１，
３，３−テトライソプロピル−１，３−ジクロ
ルジシロキサン0.57ml（1.2当量）を氷冷下で
加え、その後室温で２時間反応させた。 氷冷下で、水２mlを加えて反応を停止し、10
分間放置した後、溶媒を減圧下留去した。残渣
を水−クロロホルム系で抽出し、クロロホルム
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホ
ルムを留去した後、シリカゲルクロマトグラフ
イーにより精製し、メタノールで再結晶して、
3′，5′−０−（１，１，３，３−テトライソプ
ロプルジシロキサン−１，３−ジイル）−５−
ヨードデオキシシチジン(b)750mgを得た。物性
値は次の通りであつた。 m.p. 210−211℃ UV λメタノ哀

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（）で表わされる蛍光性ヌクレオシ
   ド又はヌクレオチド。 ［式（）において、X₁とY₁は各々
   【式】を表わす（ｎは０，１，２又は ３の整数を示す）。Z₁はＨ−又は
   【式】を表わす（ｍは０，１，２又は ３の整数を示す）。W₁はＨ−又はHO−を表わ
   す。］ ２ 一般式（）において、X₁とY₁が共にH0−
   でZ₁がＨ−又はHO−でW₁がＨ−である、特許
   請求の範囲第１項記載の蛍光性ヌクレオシド。 ３ 一般式（）において、X₁及び／又はY₁が
   【式】（ｎは１，２又は３の整数を示 す）でZ₁がＨ−又はHO−でW₁がＨ−である、
   特許請求の範囲第１項記載の蛍光性ヌクレオチ
   ド。