JPH07506002A

JPH07506002A - 腫瘍免疫を誘導する方法

Info

Publication number: JPH07506002A
Application number: JP5518646A
Authority: JP
Inventors: チコシンスキ，マーク・エル; イラン，ジョゼフ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-04-20
Filing date: 1993-04-16
Publication date: 1995-07-06
Also published as: US6420172B1; CA2118123A1; MX9302294A; WO1993020691A1; EP0637201A1; EP0637201A4; AU4106393A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

５、エビソームベクターがＥＢＶ？ｉ製シグナルを含有する請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。６、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは二重鎖形成核酸を用いて腫瘍細胞における分子因子発現を低下させる請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。７　分子因子か核転写因子および細胞表面レセプターからなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。８、核転写因子かへリノクスールーブーヘリノクスおよびジンクフィンガー転写調節物質からなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。９、ヘリックス−ルーブーヘリックス転写調節物質かｍｙｏＤ、ＳＣＬ、Ｉｄからなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。１０、腫瘍細胞が固体腫瘍細胞である請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。１１、腫瘍細胞が神経膠芽腫、神経芽腫、肺癌、乳癌、骨癌、髄膜腫、結腸癌、偏平上皮癌、黒色腫、ウィルムス腫、奇形癌および悪性肝癌細胞からなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。１２、腫瘍細胞中の分子因子のレベルを低下させるように該腫瘍細胞を処理することからなる免疫原性腫瘍細胞の調製方法。１３、癌細胞を有する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、該腫瘍細胞中の分子因子のレベルを低下させて該腫瘍細胞の免疫原性を上昇させる工程を含む方法。１４、患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、正常な該腫瘍細胞に比べて分子因子の細胞内レベルか低下している同一腫瘍型の異種腫瘍細胞を該患者に投与する工程を含む方法。１５、患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、正常な該腫瘍細胞に比べて分子因子の細胞内レベルが低下している同一腫瘍型の自己腫瘍細胞を該患者に投与する工程を含む方法。１６、腫瘍細胞を有する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、正常な該腫瘍細胞に比べて分子因子の細胞内レベルが低下している修飾化腫瘍細胞の膜抽出物またはそれから単離したタンパク質を該患者に投与する工程を含む方法。１７、培養腫瘍細胞における分子因子コード化核酸の発現を阻害する工程を含む請求項１４．１５または１６に記載の方法。１８、腫瘍細胞の免疫原性を低下させる腫瘍細胞分子因子を同定する方法であって、腫瘍細胞における分子因子発現を阻害して改変腫瘍細胞を調製し、得られた阻害化腫瘍細胞の免疫原性を非阻害化腫瘍細胞と比較して測定する工程を含む方法。１９、腫瘍細胞免疫原性を増強するために有用な試薬を同定する方法であって、該試薬による腫瘍細胞内の分子因子の発現の阻害量を測定する工程を含む方法（該発現を阻害する試薬は腫瘍細胞免疫原性を増強するために潜在的に有用である）。２０、転写または翻訳の阻害量を測定する請求項１９に記載の方法。２１、リポータ−遺伝子に転写的に連結された分子因子の遺伝子プロモーターを提供することにより測定を行い、該リポータ−遺伝子の発現を検出する請求項１９に記載の方法。２２、腫瘍に対する免疫原を産生させる方法であって、細胞にとって利用可能な生物学的に活性な分子因子の割合を、該細胞の他の成分に比べて減少させる工程を含む方法。明　細　書腫瘍免疫を誘導する方法発明の背景本発明は、インビボ腫瘍細胞免疫を増強する方法および試薬に関する。（以下の開示は関連技術の一般的議論であり、そのいずれかが請求の範囲に記載の発明に対する先行技術であることを認めるものではない。引用または参考文献の全ては本明細書の一部を構成するものとする。）一般的には、新規に発生する腫瘍は免疫原性が乏しく、ゆえに宿主の抗腫瘍応答から逃れる［Ｈｅｖｉｔｔら、　、　３３　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２４１　（１９７６）］。この乏しい免疫原性についての理由はよく理解されていない。腫瘍免疫治療の分野における主な目的は、腫瘍予防および治療の両方に適用される可能性を有する、腫瘍免疫原性を増強させる方法の開発である。腫瘍免疫原性を増強するためのいくつかの実験方法、例えば突然変異誘発物質の使用または薬物治療［Ｖａｎ　ＰｅｌおよびＢｏｏｎ、　７９　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　４７１８　（１９８２）；　Ｆｒｏｓｔら、１５９　ＬｉＬ熟（１４９１（１９８４）；　およびＦｒｏｓｔら、　ＭａｌａｙおよびＮ１ｃｏ１ｓｏｎ（編）、「固体癌における隠れた結節転移」中、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ。Ｖｏｌ、５．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　（１９８７）］、インフルエンザ血球凝集素なとの外来性抗原をコードしている外来遺伝子による感染による方法［Ｆｅａｒｏｎら、３８　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２９７５　（＋９８８）］　：インターロイキンー２を発現している遺伝子腫瘍細胞増殖におけるサイトカインおよび増殖因子の役割は文献中で議論されている。例えば、ｗａｌｓｈら［１５５Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１５２　（１９９１）］：　Ｆｏｅｋｅｎｓら［６３Ｃａｎｃｅｒ　２１３９　（１９８９）］；　Ｋｏｅｎｕｍａら［８０Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎモ■秩@Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５１　（１９８９）コ；　Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓら［Ｆ＾ＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　４７１６　（１X９１）］：　＾ａｒｏｎｓｏｎ［２５４５ｃｉｅｎｃｅ　１１４６　（１９９１）］；　Ｍａｃａｕｌａｙら［５０Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２５P１　（１９インに対するレセプターと腫瘍形成性の間の関係を示唆している。例えば、Ｎｏｇｕ（１９９２）］を参照。また他の研究者らはこのような因子に対する抗体が腫瘍の増殖を阻害し得ることを示している。例えば、Ｇａｎ５ｌｅｒら［１３５Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ　９６１　（１９８９）］およびＥｐｐｓｔｅｉｎら［１４１Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＣｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　S２０（１９８９）］を楚照。さらに他の研究者らは薬物が腫瘍増殖を阻害し得ることを示している。例えば、Ｕｐｐら［１１５＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｊ、Ｓｕｒｇ、　２９　（１９８８）］；　ｌ＋ａｊｒｉら［２７Ｅｕｒ、　Ｊ。ＣＮＣＥＲ１２４７（１９９１）］　；　５ｃｈａｌｌｙ［４８Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　６９７７　（１９８８）］およびＬｏｎｇｎｅｃ汲■秩m２２Ｄｒｕｇ　ＩｎＬｅｌｌ、Ｃｌ１ｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　９９　（１９８８）］を参照。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−Ｉ＋の両方は増殖因子として詳細に、そして分化因子として比較的低い程度まで既に特徴付けられており、胚および胎児発生において重５ｐｅｎｃｅｒ　ＥＭ（編）、「インスリン様増殖因子の最新の概念」中＋　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、（１９９１）；　５ｈｅｎら、８３　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　９１７９　i１９８６）］。多くの場合において、胚または胎児形態においてＩＧＦを発現する細胞は、成人ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−１１はある範囲の腫瘍細胞型において高レベルで発現される［例えば、＾１ｔＯｎｉａｄｅｓら、　５０１ｎｔ１．Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２１５　（１９９２）：　Ｒｏｈｏｌｌら、１６Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　４５５　（１９９０）；　Ｗｉｌｌｔａｍｓら、　６１　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１３９　（P９８９）；Ｆｏｅｋｅｎｓら、６３　Ｃａｎｃｅｒ　２１３９　（１９８９）；　Ｋｏｅｎｕｍａら＋　８０　Ｊｐｎ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５P　（１９８９）；　Ｃｕ１ｏｕｓｃｏｕら、４０１ｎｔ１１．ｃａｎｃｅｒ　６４６　（１９８７）；＾ｎｔｏｎｉａｄｅｓら、５　ＦＡＳＥＢ　ＪB Ａ１１８４　（１９９１）；　Ｂｒｕｎｎｅｒら、１６　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、Ｔｒｅａｔ、１４８　（１９９０）；　Ｂ窒■翌■■ ら、　３１　Ｐｒｏｃ、＾ｎｎｕ、　Ｍｅｅｔ、Ａｍ、＾５ｓｏｃ、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　Ａ２４７　（１９９０）：およびＭａｃａｕ撃≠凾轣B ５０　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２５１１　（１９９０）を参照］。腫瘍細胞は一方もしくは他方、または両方の因子を発現する。さらに、多くの腫瘍はＩＧＦ −１に対するレセプターを発現する［Ｒｅｃｈｌｅｒら、４７人ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　４２５　（１９８５）およびＷｉｅｓｓら、１２４　Ｅｎｄｏｃｒ柿劇旦ひ１７２７　（１９８９）］。以前の腫瘍細胞の文献は、ＩＧＦ−１を産生ずる腫瘍細胞を増殖させる増殖因子としてのＩＧＦ−１の可能性ある役割に焦点を合わせていた。次いで、これは外来より加えられる抗ＩＧＦ−１または抗ＩＧＦ−１１抗体を用いてこのような腫瘍細胞の増殖を阻害する試みを導いた。抗ＩＧＦ−１および抗ＩＧＦ−１１抗体をインビトロで［例えば、Ｍｉｎｕｔｏら、　４８　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３７１６　（１９８ｇ）；　Ｈｕｆｆら＋　４６　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４６１３　（１９８６）；　ＢｌａｔＬら、１２３　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｏ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、３７３　（１９W４）］およびインビボで［Ｇｎａｓｌｅｒら、　１３５　Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、　９６１　（１９８９）］用いである程度の増殖阻害が主張されているが、インビボでの腫瘍発生は抗ＩＧＦ抗体によりブロックされなかった。同様に、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏＬｉｄｅ）を使用して腫瘍細胞の増殖を阻害する試みが存在する。この薬物を用いである程度の増殖阻害が主張されているが［例えば、Ｈａｊｒｉら、　２７　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　１２４？　（１９９１）コ、インビボでの腫瘍発生はオクトレオチドによりブロックされなかった。発明の要旨本出願人は、分化状態に影響を与える１またはそれ以上の分子因子、例えばサイトカイン［インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＣＦ−１およびＩＧＦ−１１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣ８Ｆ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）およびインターロイキン１１およびＩＩＩ（Ｉ　Ｌ−１１およびＩ　Ｌ−１１１）を含むがこれらに限定されない〕；核転写因子（例えばＤＮＡ中の調節配列に対して直接結合するもの）および転写調節物質に結合してそれらの転写調節機能を変調させる他の転写因子（例えばＩｄ）；他の例に含まれる塩基性へリノクスーループーヘソックス（ｂＨＬ　Ｈ）タンパク質（例えば−ｙｏＤタンパク質、ＳＣＬタンパク質、ＭＹＣタンパク質、Ｅ１２、Ｅ４７、Ｍｙｆ−５タンパク質、ミオゲニン（＋ｎｙｏｇｅｎｉｎ）およびショウジゴウバエ遺伝子ＡＳ−Ｃ，ｄａ。ｈおよびｅｓｃのヒト相同体）：塩基性ドメインを有する（ｂＺ　Ｉ　Ｐ）および有していない（Ｚ　Ｉ　Ｐ）ロイシンジノバータンパク質、例えハＪ　ｕｎタンパク質、Ｆｏｇタンパク質、ＡＴＦ／ＣＲＥＢタンパク質；および例えばエストロゲンによる分化制御と関連する細胞表面レセプターの、該腫瘍細胞内での発現の阻害により腫瘍細胞の免疫原性を顕著に増強し得ることを発見した（このような因子をいかに容易に同定することができるかについては以下の説明を参照）。その阻害が腫瘍細胞免疫原性を増強する他の遺伝子を同定する方法を本明細書中で明確化する。最も良い候補遺伝子は、それらが細胞の分化状態に影響を与えるという証拠がある遺伝子ものである。「分化状態」という用語はある時間の点での細胞の分子能力範囲を意味する。細胞分化状態の調節物質としての核転写因子の役割は文献中に開示されている［Ｇｒｅｅｎら、　１０助ＢＯＪ、　４１５３　（１９９１）］。これらの一部の転写因子はデオキシリボ核酸中の調節配列に直接結合し、その結果関連の遺伝子を活性化する。他の転写因子、例えば１ｄは他の転写調節物質に結合し、その結果それらの転写調節機能を変調させる。正常および新生物細胞の両方における核転写因子の発現は開示されている。分化制御に関連する一群の核転写因子の１つの例は、ヘリツタスーループーへリソクス（ＨＬＨ）タンパク質である。ＨＬＨタンパク質は約６０アミノ酸の距離を有し、介在ループにより分離される２つの予測される両親媒性αヘワックスを含むそれらの共通ＨＬＨドメインにより規定される［Ｍｕｒｒｅら、５６蝕ＩＩ　７７７　（１９８９）コ。ＨＬＨタンパク質は、このファミリーの特定の他の構成員とホモニ量体またはへテロ二量体性複合体のどちらかを形成することができ、結果としてそれらのＤＮＡ−結合親和性が変調される。偏在的に発現されるＨＬＨタンパク質が組織特異的ＨＬ　Ｈタンパク質と二重体化し、比較的高い親和性で標的配列に結合する複合体を形成することが示唆されている［Ｍｕｒｒｅら、５８並旦５３７　（１９８９）］。ＨＬＨタンパク質の増大するファミリーのほとんど全ての構成員は転写調節、腫瘍形成および／または細胞型決定および分化に関係している。例えば、Ｊｏｎｅｓ［６１Ｃｅ１ｌ　９（１９９０）］；　Ｖｉｓｖａｄｅｒら［１６ＴｌＢ５３：’１０　（１９９１）］を蓼照。例えば、ＨＬ　Ｈタンパク質ｍｙｏＤは様々な細胞型において筋原性プログラムを実施する。ＨＬＨタンノ（り質は高度に調節された細胞特異的な様式で分化［決定」に関係する。例えば、ｌＯｗａｒｄら［１１０Ｄｅｖｅｌ、１２２３　（１９９０）コ；　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎおよびＣ１１ｎｅら［２５１５ｃｉｅｎｃｅ　１０７１　（１９９１j］を参照。分化制御に関係する核転写因子の別の例はＳＣＬである。ＳＣＬは発達する中枢神経系において検出されるが、成人脳においては低レベルの発現しかない［Ｂｅｇｌｅｙら、　８６　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ＳｃｉυＳＡ　１０１２１１１　（１９８９）コ。ＳＣＬ発現はヒトＩＧｒｅｅｎら。６　岬堰すｅ　４７５　（１９９１）］および不ズミ［Ｋｏｕｚａｒ　１ｄｅｓら、　６０ｎｃｏｇｅｎｅ　１９５　（１，９９１）］組織の両方においてはとんと排他的に造血性である。ＳＣＬはＴ−ＡＬＬに関与することが多いか、ＳＣＬがＴ−リンパ球列において正常に発現されるという証拠はない。ゆえに、腫瘍胎児性の発現型を有する。ＨＬＨタンパク質の負の調節物質であるＨＬＨタンパク質の新規なサブセット、頴匹Ｊ、　３０９５　（１９８９）］が開示されている。サイトカインおよび核転写調節物質に加えて、他のクラスの分子が分化制御に関連している。例えば、ある種の細胞表面レセプターはそれら各々のりガントとかみ合った場合に細胞の分化状態に影響を与える。この−例はエストロゲンレセプターである。エストロゲンはエストロゲンレセプター−陽性胸、およびおそらくは他の例えば下垂体性腫瘍細胞上で分化因子としての役割を果たすと考えられている［Ｆｕｊｉｍｏｔｏら＋　８２　Ｊａｐａｎ　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、１４３６（１９９１）］。本出願人はこのような因子の発現の不在が、ある種の方法で腫瘍細胞のエピトープ表現型を変化させて、それが免疫原性となり宿主免疫系により認識され、そして腫瘍細胞に対して免疫応答が開始され得ると考える。この支持において、出願人はこのような発現の低下を有する腫瘍細胞の宿主動物への導入が腫瘍増殖だけではなく同じ宿主内の正常な腫瘍細胞（すなわち、正常な分子因子発現を膏する細胞）の増殖も低下させることを発見した。さらに、出願人はこれら因子の役割は腫瘍細胞の増殖（いくつかの因子の名称から暗示されるように）だけではなくむしろこのような細胞の分化の制御にあると考えている。本発明における因子の作用は、多くは因子の増殖変調特性よりむしろ腫瘍免疫原性に影響を与える分化表現型に対する因子の効果によるものであると考えられる。腫瘍細胞におけるサイトカインの発現により免疫原性を増強する上記の開示技術とは対照的に、本発明は、腫瘍細胞により正常に発現されるサイトカインなどの因子の該腫瘍細胞における発現をブロックすることによりさらに最適な様式で免疫原性の増大を誘導することができるという発見に基ついている。天然の因子は主な様式において腫瘍細胞を非免疫原性にするよう機能するようであり、ゆえに因子の発現の阻害は細胞を免疫原性にする。この発見に鑑みて、出願人は細胞分化状態および／または表現型を制御する因子がまた同時に細胞の免疫原性能力を指図し得ると考える。出願人は、サイトカイン発現を低下するよう操作した腫瘍細胞を免疫治療において用いて、腫瘍を効果的に予防または治療することができることを発見した。このような腫瘍細胞により誘導される免疫は自然状態で全身性であって長期間持続する。ＩＧＦ−１は腫瘍免疫原性を制御する因子の一例にすぎず、これは腫瘍細胞の免疫原性表現型制御において分子スイッチとして機能するようである。即ち、本出願人は、あらゆる腫瘍細胞、例えば固体腫瘍細胞または造血細胞の抗原性または免疫原性を、該細胞内の１またはそれ以上の分子因子の発現または活性の阻害により増大させることができることを発見した。従って、宿主内の腫瘍増殖低下を引き起こし、さらにこの宿主からの腫瘍細胞の完全な除去を引き起こすようこのような細胞を処理することができる。以下に提供する本出願人の発見および方法（その中で本発見の例を提供する）があれば、あらゆる具体的な標的腫瘍細胞をスクリーニングレＣ１該細胞内の分子因子発現の減少がその免疫原性を増強するか否かを決定することは、当業者にどって何の障害もない。以下に提供する実施例においで、分子因子発現を低下させる好ましい方法はアンチセンス法によるものであり：この方法は全ての腫瘍細胞に普遍的に適用され、ゆえにあらゆる腫瘍細胞に対する免疫原性を、１個の試薬、例えば所望のアンチセンス核酸を発現しているベクターまたはその等個物を用いて誘導することができる。腫瘍細胞の免疫原性を上昇させるために選択される特異的抗体の使用を含む分子因子発現を低下させる他の方法を用いることができる。従って、最初の態様において本発明は、未処理の腫瘍細胞に比べて分子因子レベルが低下するように処理した腫瘍細胞を含む免疫原性腫瘍細胞に関する。「免疫原性腫瘍細胞」とは、当業者により腫瘍細胞として認識され、細胞内分子因子発現のレベルまたは他の細胞性分子因子レベルを低下するようある種の方法で処理されている細胞を意味する。このような処理は未処理の細胞に比べてその腫瘍細胞の免疫原性を増強するであろう。「分子因子」および「サイトカイン」の用語は当業者により良く理解されており、それらの例は上に挙げている。「免疫原性」とは、免疫応答が腫瘍細胞に対して開始されておりこれにより宿主は腫瘍細胞の増殖を低下させることができることを意味する。このような性質を当分野で周知の方法により測定することができる。本発明において用いられるであろう腫瘍細胞の限定のためのものではない例には、神経膠芽腫、肉腫、甲状腺腫、乳癌細胞および小細胞肺癌が含まれる。「レベルの低下」とは、因子をコードしている遺伝子または１ＲＮＡの転写または翻訳の速度の低下、または因子自体の本質的活性の改変（例えば突然変異によるかまたは抗体もしくは特異的化学物質を含む化学物質による細胞内もしくは他の相互作用による）のどちらかにより分子因子の生物学的活性が低下していることを意味する。一部の態様において、因子はこのような細胞に存在しないかまたはわずかなレベルでのみ少なくとも検出可能であってよい。関連の態様において、本発明は、腫瘍細胞中の分子因子レベルを低下させるよう処理することによって免疫原性腫瘍細胞を生成させる方法：癌細胞を有する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、分子因子のレベルを低下させることにより腫瘍細胞の免疫原性を上昇させることによる方法：腫瘍細胞を何する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、同−腫瘍型の異種腫瘍細胞（これら異種腫瘍細胞の免疫原性を」二昇させるために分子因子のレベルが低下しているかまたは阻害されている）を該患者に投与することによる方法；および、腫瘍細胞を有する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、分子因子のレベルが低下しているかまたは阻害されている腫瘍細胞または同−腫瘍型の異種腫瘍細胞がら単離または精製した腫瘍細胞膜抽出物またはそれから単離したタンパク質を該患者に投与することによる方法に関する。「自己」とは、処置すべき患者由来、または通常の主要組織適合性表現型を有する別の患者由来の腫瘍細胞を本方法で用いることを意味する。「異種」とは、別の患者由来の腫瘍細胞を用いることを意味する。「同−腫瘍型の」とは、腫瘍細胞が患者と同じ表現型を何しており、同様の癌を有する患者から得られたことを意味する。「膜抽出物」とは、膜に富むが、必ずしも膜だけを含むわけではない腫瘍細胞の抽出物を意味する。このような抽出物は、免疫応答をインビボで腫瘍細胞に誘導するのに必要な抗原特性を有すると考えられるので、この抽出物を選択する。「単離されたタンパク質」とは、上記のように所望の免疫原性を依然として保持している抽出物からある程度まで精製された、１またはそれ以上のタンパク質を意味する。好ましい態様において、分子因子のレベルは細胞内で低下される。さらに他の態様において、本発明は腫瘍細胞の免疫原性を低下させる腫瘍細胞中の分子因子を同定する方法であって、腫瘍細胞中の該因子の発現または活性を阻害し、得られた阻害化腫瘍細胞の免疫原性を非阻害化腫瘍細胞と比較して測定することによる方法：および、腫瘍細胞の免疫原性を増強するのに有用な試薬（例えば、アンチセンス核酸またはりポザイムまたは抗体）を同定する方法であって、正常な腫瘍細胞を試験試薬と接触または試験試薬で処理し、処理された腫瘍細胞が未処理細胞より大きな免疫原性を有するか否かを測定することによる方法に関する。別の態様において、腫瘍細胞の免疫原性が研究されないが腫瘍細胞内の分子因子発現（例えば、因子の転写または翻訳）の阻害が研究される同様のアッセイを行う。この別法は腫瘍細胞の免疫原性を評価しなければならないときに必要なインビボ試験の量を減らす。特に、例えば［ＧＦ−１および容易に検出可能なマーカー（例えばクロラムフェニフールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）をコードしている融合遺伝子の使用によりＩＧＦ−１をコードしている遺伝子の転写を阻害する試薬を同定することにより、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１の発現の阻害を試験するのは有用である。上記の側面の好ましい態様において、本法は腫瘍治療を必要とする患者の同定、このような患者からの腫瘍細胞の入手、分子因子のレベルを低下させる前の腫瘍細胞の培養、このような腫瘍細胞内または培養腫瘍細胞内の１またはそれ以−Ｌの分子因子の発現または活性の阻害、および修飾腫瘍細胞を再び患者に投与することを含むであろう。非修飾腫瘍細胞の免疫原性の欠如を担っていると認識される分子因子の発現または活性を低下させるよう腫瘍細胞をある種の方法で修飾することは、このような方法がいかに行われるかとは無関係に本発明においてのみ重要である。さらに他の好ましい態様において、腫瘍細胞は原発性腫瘍細胞または転移性腫瘍細胞であり、本法は腫瘍退行を誘導するかまたは腫瘍再発を予防する。本法において処理されるかもしれない腫瘍細胞の例には、神経膠芽腫、神経芽腫、肺癌、乳癌、骨肉呻、髄膜腫、結腸癌、扁平上皮癌、黒色腫、ウィルムス腫、奇形癌および悪性肝癌細胞が含まれる。本発明のより好ましい態様において、アンチセンスＲＮＡを用いて分子因子発現を阻害するかまたは同等のりポザイム法を用いることができる。特に、エピソームベクター（エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）ｆｆｌ製シグナルを含んでいてよい）を用いてアンチセンスＲＮＡまたはりボザイムを産生ずるのが好ましい。レトロウィルス性および他の組込みヘクターを含む別のベクターを本発明において用いてアンチセンスＲＮＡまたはりボザイムを発現させてもよい。またアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重へリノクス形成核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ鎖）を本発明において用いてもよい。さらに、腫瘍細胞を形質転換するかまたは他の方法では遺伝的に操作して分子因子をコードしている遺伝子を崩壊または欠失させることかできる。さらに他の好ましい態様において、同種または異種の腫瘍細胞は培養されるかまたは原発性もしくは転移性腫瘍細胞のどちらか由来の培養セルラインから得ることができ、該腫瘍細胞のフラグメントの一部、例えば腫瘍細胞膜抽出物またはさらにそれから単離した１またはそれ以上のタンパク質が患者の免疫に使用される。免疫原性を増強するために阻害されるであろう分子因子を同定するために適した方法においては、インビトロでのアンチセンス遺伝子転移により因子の発現が阻害されること、修飾後の腫瘍細胞を実験動物に投与すること、修飾腫瘍細胞の腫瘍形成性をその実験動物において測定すること、次いで抗腫瘍免疫応答を誘導する修飾腫瘍細胞の能力を測定することか好ましい。従って、これら実験のために免疫系か損なわれていない実験動物を使用するのが好ましい。これら実験において、分子因子−阻害および非阻害腫瘍細胞を同時投与するかまたは別々に投与することかでき、実験動物内の原発性または転移性腫瘍部位に修飾腫瘍細胞を直接注射することができる。上の記載かられかるように、本発明は一般的に、腫瘍により発現される分子因子の阻害に関し、予防または治療方法のどちらかにおいてこのような腫瘍に対する免疫に適する試薬を提供し、このような腫瘍細胞内で阻害される最適因子を同定する方法に関する。本発明より前に、本出願人は腫瘍細胞の修飾により腫瘍免疫原性を変調して分子因子発現を低下させることをいかなる技術も開示していないと考え、このような分子因子発現の阻害によりどのように腫瘍細胞免疫原性が増強されるであろうかを開示するいかなる技術も知らない。本発明の利点は多数ある。腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞転移に対する免疫のために用いられるかまたはさらにあらゆる腫瘍の発生に対するワクチンとして用いられる、例えば１またはそれ以上の腫瘍の型に感受性であることが知られている患者において腫瘍細胞内の遺伝子発現の操作により用いられるであろう試薬が開示されるのは初めてである。本出願人は腫瘍細胞内の１またはそれ以上の分子因子の発現の阻害が１またはそれ以上の他の細胞表面分子の発現を増強し、次いで処理腫瘍細胞の免疫原性を増強するであろうと考える。従って、さらに本発明は阻害された腫瘍細胞上の細胞表面因子の発現の増強または上昇量についてスクリーニングする方法に関する。例えば、分子因子の量が細胞内で低下した場合に、転写の上昇によりＭＨＣ−クラス１タンパク質をそれらの発現において増強することかできるか、またはＭＨＣ−クラス１タンパク質の濃度を細胞表面で上昇させることができる。作用されるであろう他のタンパク質には細胞表面同時刺激分子または接着物質例えばＢ７、ＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−３が含まれる。このような物質を通常のウェスタンまたはさらにはノーザンブロノト分析にょリスクリーニングすることができる。このような因子が明らかになったら、これは腫瘍細胞免疫原性を上昇させ得る別の方法、すなわち腫瘍細胞内のそれら他のタンパク質の発現の増大を引き起こすためにそれらタンパク質をコードする核酸を提供することによるかまたは腫瘍細胞表面上のそれらの濃度を増大させるであろう方法でそれらタンパク質を投与することによる、例えば腫瘍細胞上に被覆され得るグリコホスファチジルイノントール（ＧＰＩ）アンカーを有するクラス−■ 修飾ＭＨＣを提供し、次いでワクチンを提供するためにその腫瘍細胞を患者に再び注射することによる方法を提供することを本出願人は認識する。有用であろうタンパク質には、ＭＨＣ−クラス１および接着物質だけではなく分子因子の発現と共に同時にその発現か低下する天然に存在する同時阻害物質が含まれる。本出願人は分子因子阻害により得られる腫瘍免疫原性の増強が腫瘍細胞内のいくつかの下流分子系における改変を反映するようであると考える。ゆえに、部分的効果を観察することができる一方で、免疫原性への十分な効果がただ１つの下流分子系の単純操作によっては再現されないようである。また、本出願人は分子因子による免疫原性の阻害が、分子因子の有効性をブロックし得る分子因子−結合タンパク質、例えばＩＧＦ−１結合タンパク質を発現させることにより逆転され、ゆえに免疫原性腫瘍細胞を産生じ得ることを示す。ＩＧＦ−１結合タンパク質のレベルを上昇させることにより、腫瘍細胞上のＩＧＦＩの生物学的活性は低下するが、これはその活性が他の分子よりもそのタンパク質と相互作用するからである。ゆえに、本発明の別の態様において、本発明は腫瘍細胞にとって利用可能な生物学的に活性な分子因子の比を、例えば腫瘍細胞表面の他の成分に比べて低下させることにより免疫原性腫瘍細胞を産生ずる方法に関する。「生物学的に活性な」とは、腫瘍細胞の免疫原性をブロックするよう作用する分子因子の活性を意味する。ゆえに、この用語は広い意味を存しており、因子が腫瘍細胞上のその正常部位で作用するのを防ぐよう作用する分子因子−結合分子の規定を含む。好ましい態様において、低下方法は、腫瘍細胞成分、例えば因子に結合する分子因子−結合分子の量を上昇させ、ゆえに腫瘍細胞に比べて因子の生物学的活性を低下させることを含み：因子の生物学的作用をブロックする分子、例えば抗体と因子を接触させることを含む。ＩＧＦ結合タンパク質および／または抗−ＩＧＦ抗体は、細胞表面レセプターに結合して細胞内に取り込まれるであろう第二リガンド、例えばトランスフェリンと各々のタンパク質をコンジュゲート化することにより細胞内区画に供給することができる。従って、本出願人は腫瘍細胞内の分子因子の活性を低下させることができるあらゆる方法は本発明の範囲内にあることを示す。上記の様々な方法の全ては互いに同じ目的、すなわち腫瘍細胞の免疫原性の増強をその腫瘍細胞内の分子因子の発現または活性に影響を与えるいくつかの方法により達成するものであることを当業者なら理解するであろう。腫瘍細胞の免疫原性にとって重要であるのは腫瘍細胞上の分子因子の利用可能性の低下であることを本出願人が最初に認識したとするなら、本出願人はこの概念をカバーするのに十分広い請求の範囲を可能にし、またその権利がある。これは当業者が当分野で周知の方法を用いて同じ最終結果をもたらす等価の方法を容易に設計することができるからである。本発明に従った腫瘍免疫原性を増強する方法としての分子因子発現の下方変調は、ある種のリンホカインの新発現（ｎｅｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）または他の免疫刺激性サイトカイ／と組み合わせである種の腫瘍型に対する免疫原性を増強してもよい。このようなリンホカインの−・例はインターロイキン＋Ｖである。実際、本出願人は本明細書中に記載される治療または方法を他の方法と組み合わせて腫瘍細胞の免疫原性を増強させるのは適していると考える。従って、例えば細胞内ＩＧＦ−１発現を阻害するだけではなく抗ＩＧＦ−１抗体および／またはＩＧＦ−ルベルに対して活性な薬物を同時に加えてこれら処理の組み合わせ効果を得、可能性ある共同作用的効果を達成するのが有用であると考えられる。本発明の他の特徴および利点は、以下に示す本発明の好ましい態様の説明および請求の範囲から明らかとなるであろう。好ましい態様の説明４、

【図面の簡単な説明】

顧図１はエビソームベクターｐＡｎｔｉ−Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１を構築するために用いられる工程の図式的表示である。図２８および２ｂは培養Ｃ６神経膠腫およびＢ−１０４神経芽腫細胞におけるＺｎＳＯ４によるアンチセンスＲＮＡ転写体の誘導を示すオートラジオグラムのコピーである。図はいくつかのＲＮＡ転移プロットの合成物である。レーン当たり合計１０μｇのＲＮＡを用いた。主な＋ＧＦ−ｒ転写体の分子サイズ（ｋｂ）を左に示す。図２８：レーン１：無血清培地に暴露された親の非トランスフェクションＣ６神経膠細胞。レーン２および３　：　Ｚｎ５Ｏ，の不在下（レーン２）または存在下（レーン３）の無血清培地中でインキュベートしたトランスフェクションＣ６神経膠腫細胞。レーン２および３については、ニックトランスレーンジンされたラット■ＧＦ−１ｃＤＮＡを用いた。レーン４および５：レーン２および３に示したプロットをニックトランスレーンジンされたヒトＩＧＦ−１ｃＤＮＡに再ハイブリダイズした。図２ｂ　レーンｌ　非トランスフェクションＢ−１０４神経芽ａｍ胞。レーン２および３　：　Ｚｎ５Ｏ，の不在（レーン２）または存在（レーン３）下でインキュベートしたトランスフェクションＢ−１０４神経芽腫細胞。図３　ａ〜３ｐはＣ６神経膠腫親およびトランスフェクション細胞におけるＩＧＦ−１アンチセンス転写体およびＩＧＦ−１タンパク質の局在性を示す写真のコピーである。図３ａ、３ｂ：ＰＡｎｔｉｌＣＦ−１によるトランスフェクション後２週間、各々Ｑ、２ｍｇ／ｍｌまたは０．５Ｂ／ａｌｌハイグロマイシンＢの存在下で増殖させたラソ）Ｃ６神経膠細胞（図３ａ）およびＢ−１０４神経芽腫細胞（図３ｂ）。図３ａにおいて、小さい矢印は２〜３週間にわたるハイグロマイシンＢ選択の間に徐々に除去された細胞の親集団を示す。大きな矢印はハイグロマイシンＢ選択を生き残った安定なトランスフェクション体を表す。図３ｂにおいて、直線矢印は上記のような細胞の親集団を表し、曲がった矢印はハイグロマイシンＢ選択を生き残った安定なトランスフェクション体を表す。（ａ、ｂ：Ｘ２５０）。図３ｃ、　３ｄ、３ｅ、　３ｆ、　３ｇ、３ｈ：定量的免疫ベルオキ７ダーゼ法を用いたＩＧＦ−１に対する抗体による培養細胞の免疫細胞化学的ラベル化。図３ｃ、３ｄ：５０μ＠Ｚｎ５Ｏ，の不在下（図３ｃ）または存在下（図３ｄ）でインキュベートした親Ｃ６の陽性染色。図３ｅ、３ｆ：Ｚｎ５Ｏａの不在下（図３ｅ）または存在下（図３ｄ）でインキュベートしたＢ−１０４神経芽腫細胞で得られた陰性反応。図３ｇ、３ｈ：　ＺｎＳＯ４の不在下（図３ｇ）または存在下（図３ｈ）でインキュベートしたＣ６神経膠腫トランスフエクシヨン細胞。（図３ｃ〜３ｆ：Ｘ２５０：図３ｇ、３ｈ：Ｘ１５０）。図３ｉ％　３３％　３に、　３ｂ３ｍ、３ｎ、３ｏおよび３ｐ：アンチセンス転写体を検出するための一本鎖３６３−ラベル化センスオリゴヌクレオチドによる培養細胞のｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン。図３ｉ、３ｊ、３におよび３１：Ｚｎ５Ｏ，の存在下（図３　ｉｓ　３　ｊ）または不在下（図３に、３１）で維持したＣ６）ランスフェクション細胞。矢印は陽性シグナルを示す細胞の例を示す。図３におよび３１において、バックグラウンドのハイブリダイゼーションのみが明らかである。図３ｍｓ　３ｎｓ　３ｏおよび３ｐ：　Ｚｎ５Ｏ，の存在下（図３ｍ、３ｎ）または不在下（図３ｏ、３ｐ）で維持したＢ−１０４）ランスフェクション細胞。図３１．３に、３ｍ、３ｏ：明るい視野１図３ｊ、３１．３ｎ、３ｐ：暗い視野。（図３１〜３ｐ：Ｘ２５０）。これら細胞をｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシコンにより一本鎖３５Ｓ−ラベル化ＩＧＦセンスプローブでプローブ化した。図４ａ〜４にはＩＧＦ−１アンチセンス転写体の同時位置決定およびインビトロでの神経膠腫細胞中のＩＧＦ−１タンパク質の染色、およびインビボでの神経膠腫細胞の免疫細胞化学的同定を示す写真のコピーである。図４ａ、４ｂ：間接免疫蛍光法を用いた抗ＩＧＦ−１抗体によるＣ６１−ランスフエクション細胞の免疫細胞化学的ラベル化。パネル図４８における［ＧＦ−１（ＦＩＴＣ蛍光）の存在および図４ｂにおけるＺｎ５Ｏ−で処理した細胞中の蛍光の不在に注意。核をｐ−フェニレンジアミン（ｐｐｄ）で対比染色する。（図４ａ、４ｂ：Ｘ２５０）。図４ｃ、４ｄ、４ｅ：Ｚｎ５Ｏ，の存在下で８〜１０時間維持したＣ６−）ランスフェクション細胞。図４ｃ、４ｄおよび４ｅは同じ顕微鏡視野を示す。アンチセンス転写体を図３と同様にｉｎ　５ｉｌｌハイブリダイゼーシヨンにより位置決定し、次いでＩＧＦ−１タンパク質の免疫蛍光ラベル化に供した。タンパク質の不在（図４ｃ）は核中で最初に位置決定された著しいｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルを伴う。（図４ｄ、明るい視野；図４ｅ、ＵＶランプと組み合わせた明るい視野）。図４ｆ、４ｇ：　ＺｎＳＯ４の存在下で８〜１０時間維持したＣ６神経膠腫の親およびトランスフェクション細胞混合培養物。同じ顕微鏡視野を図４ｒおよび４ｇ中で視覚化する。ＩＧＦ−Ｉに対して陽性の免疫蛍光ラベル化を示す細胞（図４ｒ、無地矢印）はＩＧＩ−１アンチセンス転写体に対していかなる検出可能なシグナルも示さない（図４ｇ、無地矢印）ニ一方でアンチセンス転写体に対して強い陽性シグナルを示す細胞（図４ｇ、中抜きの矢印）、おそらくトランスフェクション細胞はＩＧＦ−１に対するいかなる検出可能な蛍光染色も示さない（図４ｇ、中抜きの矢印）。図３も参照。（図４Ｃ〜４ｇ・核をｐ−ｐｃｉで対比染色している）。図４ｈ〜４に、注射した神経膠腫細胞の組織学的切片。図４ｈ：Ｃ６神経膠腫トランスフェク／ヨン細胞の注射局部で観察され、細胞注射の３週間後に除去された病変の切片（ヘマトキンリンおよびエオシン）。大部分かブラスマ細胞およびマクロファージ（星印）である単核細胞、ならびにリンパ球が、少数の神経膠細胞を取り囲む器官形成組織中に観察される（矢印）。図４ｉ：Ｃ６神経膠腫細胞（非トランスフェクンコン）の注射により誘導された腫瘍の小さな範囲の組織学的切片。散在する神経膠星状細胞型の小細胞に注意。それらのい（つかは偽性ロセノトを形成している（矢印）。（図４ｈ、４１゜Ｘ２００゜）　図４ｊ、４に：　ｌ−ランスフエクション細胞の注射により生じた病変における（図４３）、および非トランスフェクンヨン細胞の注射後に発生した腫瘍における（図４ｋ）神経膠原線維酸性タンパク質（Ｇ　Ｆ　Ａ、神経膠細胞の同定に用いられる）の免疫蛍光染色。図４５　単核細胞（図４ｈにおいて見られる）により取り囲まれているＧＦＡ−陽性細胞（蛍光、矢印）に注意。（図４ｋ）抗ＧＦＡ抗体との陽性反応を示す神経膠芽腫の範囲。（図４ｊ、４ｋ）中の核はｐ−ｐｄで対比染色した。（図４ｈ、　４ｉ：　Ｘ２００　Ｈ図４３：Ｘ４００：図４に：Ｘ２５０）。図５ａおよび５ｂはＣ６神経膠腫非トランスフエクシヨン細胞（図５ａ）およびトランスフェクションＢ１０４神経芽腫細胞（図５ｂ）由来の３週間の腫瘍の写真のコピーである。矢印は腫瘍の位置を示す。図５８の右のラットはＣ６神経膠腫トランスフエクシヨン細胞を注射したが、１年間の観察期間の過程で腫瘍を発生しなかった。１０匹のラットがこの群において観察された。また、アンチセンス■ＧＦ−１でトランスフェクションされたさらに各々１０匹のう、トの２群を各々４か月および２か月観察した。これら群のどちらにおけるラットも腫瘍を発生し腫瘍細胞内で阻害されるであろう分子因子ならびにこのような阻害のために用いられるであろう方法を一般的に上で記載した。このような発現の阻害を達成することのできる方法の例を以下に提供する。これら例は本発明において限定的ではなく、このような阻害に対して多くの同等なことを当業者が行い得ることを当業者なら理解するであろう。特に、メツセンジャーＲＮＡの生物学的発現のレベルまたはさらには１またはそれ以上の所望の分子因子の活性のレベルが腫瘍細胞中、可能性ある阻害化合物に対する反応において測定される通常のアッセイにより以下に開示するアンチセンス試薬以外の試薬が測定されるかもしれないことを本出願人は理解している。このような方法の使用により、多くの化合物を短期間で通常、スクリーニングすることかできる。１ＧＦ４またはＩＧＦ−１１発現レベルに対するあらゆる具体的な試薬の効果を研究することは特に有利である。次いで、以下でさらに詳しく説明するように、試薬を腫瘍細胞に投与してその試薬がインビボで分子因子の発現を低下させ、ゆえに腫瘍細胞の免疫原性を増強するか否かを測定することにより、このような分子因子の発現レベルまたは相対量を低下させるあらゆる試薬をインビボの系で試験することができる。次いで、この機能を発揮し得る試薬を試験して、それらが有意な副作用を有しておらず、腫瘍を有する患者の治療に用いうろことを確かめることかできる。腫瘍細胞の免疫原性を増強するのに適している適当な抗体またはその等捕物を今や発見することができる。このような抗体または他の試薬についてスクリーニングするための方法は現在では常法であることを当業者なら理解するであろう。例えば、本明細書中で説明するインビボモデルを用い、活性な免疫原糸を有する動物を用いて、１またはそれ以上の試薬で処理されている腫瘍細胞をスクリーニングして、その腫瘍細胞の免疫原性がその試薬との接触により増強されるか否かを決定することがてきる。従って、１またはそれ以上のサイトカインとの反応性について特異的な一群の抗体をスクリーニングして、それら抗体のどれが腫瘍細胞の免疫原性を増強するのかを決定することができる。このような抗体が検出されたら、腫瘍細胞を有する患者を治療するためにこの抗体をインビボまたはインビトロで用いることができる。適当な抗体を非修飾形態で供給するかまたは抗体を第二のリガンドにコンジュゲート化することができるが、後者は細胞表面レセプターに結合して細胞内区画への抗体の取り込みを可能にするものである。ゆえに、前記の技術とは異なり、本出願人はサイトカインに対する特異的抗体の使用により直接、腫瘍の増殖を阻害しようとはせず、それら抗体を用いて腫瘍細胞の免疫原性を増強させ、そして予防的様式でまたは腫瘍含有患者の治療のために用いられ得るワクチンを創製する。本発明の実施例を以下に示す。これら実施例は本発明を限定しようとするものではなく、多くの等価な方法および試薬を本請求の範囲内に発見することかできることを当業者なら理解するであろう。（以下、余白）実施例悪性神経膠原はヒトにおける全原発性脳腫瘍の２９％を占める最も一般的な原発性脳腫瘍である。生存率中央値は１年より短く、５年生存率は５．５％より低い。神経膠腫細胞の腫瘍形成性の分子基礎は明らかになっていない。う、＋−神神経腺腫培養細胞高レベルのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）転写体を蓄積する［Ｊｏｈｎｓｏｎら、　１１１　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　５０５ａ　（１９９１）およびＫｉｅｓｓら＋　１２４　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ盾戟B ｇｙ　１７２７　（１９８９）］。以下の実験系を用いてＩＧＦ−１発現が腫瘍形成性に関連するか否かを測定した。この系はＩＧＦ−１に対するアンチセンスＲＮＡを用いる混合インビボ／インビトロ系である。この目的のために、本発明者らはエプスタイン・バールウィルス複製ソゲナルおよびＺｎ５Ｏ，−誘導性メタロチオネイン■転写プロモーターを組み入れる発現ベクター中にアンチセンスＩＧＦ−１発現構築物を組み立てた。安定な神経膠原トランスフェクション体は、ＩＧＦ−１を構成性発現するＣ６神経膠腫細胞から得られた。また、同じ腫瘍から最初に得られるがＩＧＦ−１を発現しないＢ−１０４神経芽腫細胞を対照としてトランスフエク７ｇンした。Ｚｎ５Ｏ，の不在下で、Ｃ６トランスフ工クンヨン体は高レベルのＩＧＦ−１ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現し、各々ｉｎ　５ｉＬｕハイブリダイゼーンヲンおよび免疫細胞化学により検出された。Ｚｎ５Ｏ，の培養培地への添加により高レベルのアンチセンス転写体の蓄積が生じ、内因性ＩＧＦ−１１ＲＮＡｋよび１ＧＦ−■タンパク質のレベルを劇的に減少させた。非トランスフェクションＣ６親細胞またはＩＧＦ−１発現を担う配列を欠（同様のベクターでトランスフェクションされたＣ６細胞または成長ホルモンレセプターなどの無関係な転写体を発現している同様のベクターでトランスフェクションされたＣ６細胞のラットへの皮下注射の結果、トランスフェクションおよび非トランスフェクシコンＢ−１０４細胞の両方と同様に２週間後に大きな腫瘍を生じた。しかし、トランスフェクションされたＣ６細胞を注射したラットは観察の３２週間後にいかなる腫瘍も生じなかった。トランスフェクションされたＣ６細胞の注射の一年後に小さな嚢胞が６匹のラットにおいて明らかであった。組織学的切片は、多数の単核細胞により浸潤された少数の神経膠腫細胞を明らかにした。親（非トランスフェクション）細胞の注射の結果得られる神経膠肺腫瘍においては単核細胞のいかなる浸潤も明らかでなく、アンチセンスＩＧＦ−１）ランスフェクンコン体ではなく親細胞が宿主免疫応答から逃れることを示唆した。材料おも墾方−法細胞培養　ラ、ｌ−Ｃ６神経膠腫細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）から入手し、本質的にＫｉｅｓｓら［１２４Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１７２７　（１９８９）］が開示しているように培養した。簡単に説明すると、ダルベツコの修飾イーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　：　Ｇ　１ｂｃｏ　ＢＲＩ５．　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）（ＤＭＥＭで維持される細胞のために１５％新生子ウンつ清（Ｂｉｏｌｏｇｏｓ）を追加）中でそれらを維持した。Ｃ６神経膠腫ラインと同じ腫瘍から最初に得られ、対照として働＜　Ｂ−１０４神経芽腫細胞はＤｒ、Ｌｌｏｙｄ　Ｃｕ１ｐ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、@Ｃａ５ｅ　Ｙｅｓｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅａｒｖｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。トランスフェクション細胞のための培養培地には０．２ａ＋ｇ／ｎ＋１ハイグロマイシンＢ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を追加して選択圧をラット（雄性ＤＢ−Ｘ、３か月齢、生射当たり１０す細胞）への皮下注射の１０日前まで維持した。注射の２４時間前に細胞を洗浄して無血清培地中で維持した。埃伴、ヒトＩＣＦ−１に対するポリクローナル抗体はＮａｔｉｏｎａｌ　ｌｌｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｐｒｏｇｒａｍにより提供されたかまたはＫａｂｉｇｅｎ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）から市販品として入手した。ペルオキシダーゼによるＩＧＦ−１の免疫細胞化学的位置決定をＴｒｏｊａｎら［６Ｄｖ、−Ｎｅｕμ遷９Ｌ２５１　（１９８４）］が開示しているように行った。陽性対照として、切片にした成人ラット肝臓を用い、陰性対照としＣヒトおよびマウス線維芽細胞セルライン（各々ＨＴ−１０８０およびＬＴＫ）を用いた。染色の１終点」をプロ。トすることにより免疫細胞化学的に位置決定されたＩ　Ｇ　Ｆ　−１を半定量的に評価した。細胞内の陽性反応を依然として与える抗体の最大希釈としてこれら終点を規定した。染色の終点は１　：　２０００−１　：　３０００の希釈で得られ；感受性限界は１　：　１００−１　：　２００の希釈で発生した（陽性非特異的反応）。ＦＩＴＣ法は市販品として入手可能な第二抗体（ヤギ抗つサキ）（ＦＩＴＣにコンジュゲート化）を用いて常法により行った。感受性限界はｌ・２０〜１３０希釈であった。全ての写真について、用いた抗体希釈は１：４００〜１：５００であった。ハイブリダイゼーション：　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンは、ハイブリダイゼーション前ならびに最終洗浄工程でエタノールを省略したことを除いて、Ｂｏｅｂ＋＋ら［８６Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ６５６　（１９８９）］およびｆａｎｇら［２Ｍｏ１．ＥｎｄｏｃｒｉｎｏI、　２１７　（１９ＢＢ）１に記載のように行った。いくつかの実験において、末端基転移酵素および”５−ｄＡＴＰで３°−末端−ラベル化した一本鎖オリゴヌクレオチドブローブを用いてアンチセンス発現を評価した。転移プロットハイブリダイゼーションは、Ｊｏｈｎｓｏｎら［１１１Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５０５ａ　（１９９１）］＋　Ｊｏｈｎｓｏｎら［３Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、T８０（１９８９）］およびＪｏｈｎｓｏｎら［３０Ｍｏ１Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ＆Ｄｅｖｅ１０ｐ調ｎｔ、　９５　（１９９１）］か開示しているように行った。上２／３ヱノｌ乞ａ　４．　：　Ｃ６神経膠腫およびＢ−１０４神経芽腫細胞のトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて供給者の指示に従い行った。エヒソーム尾苛ｑズ之入肛ド、ｐＡｎす＝ＩＧ−Ｆす〕４貧箪・ベクターを組み立てるために用いた工程の図式的表示を図１に示す。単純ヘルペスチミジンキナーゼに融合されたマウスＭＴ−１プロモーターを含有するｐＭＫ’プラスミドは、Ｄｒ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ［５Ｌｕａｒｔら、　８１　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３１Ｂ　（１９８４）］ ■謔闍沂汲■ れた。ＩＧＦ−１に対するヒト肝臓ｃＤＮＡを含有しているｐｌＧＦ−１はＤｒ、１ａａｒＬｉｎ　Ｊａｎｓｅｎ、　Ｕｔｒｅｃｈｔ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ［Ｊａｎｓｅｎら、　３０６　Ｎａｔｕｒｅ　６０９　（１９８R）］により供給された。ｐＵ　ＣＩ　８　［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、３３　Ｇｅｎｅ　１０３　（１９８５）］はＤｒ、　Ｐｅｔｅｒｌｌａｒｔｅ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃａ５ｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅｒｖｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ■謔闍沂■ された。ｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｋ　Ｓ　＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は市販品として入手した。ＲＥＰ−４の構築はＧｒｏｇｅｒら［８１Ｇｅｎｅ　２８５　（１９８９）］が開示している。ＲＥＰ−４はエプスタイン・バールウィルス由来の２つの遺伝子、複製起点（ＥＢＶ　ｏｒｉ−Ｐ）およびＥＢＶ　ｏｒｉ−Ｐの複製機能を推進させるＥＢＮＡ−１核抗原をｐＡｎｔｉｌＧＦ−Ｉに与える。これら２つの遺伝子はｐＡｎｔｉｌＧＦ−１がエビソームとして複製するのを可能にする。ＳＶ４０ポリアゾ＝ル化シグナルは転写のための終結シグナルとしＣ６神経膠腫細胞の安定なトランスフェクション体が得られ、無血清培地に２４時間移した。無血清培地中、１ＧＦ−１転写体の発現は大きく増強する［Ｊｏｈｎｓ。ｎら、１１１　、ｊ、ｃｃｌｌ　Ｂｉリ−５０５ａ　（１９９１）コ。図２はトランスフエフ’／ｑ７および非トランスフェクションＣ６およびＢ−１０４細胞の全ｌＯμｇＲＮＡの転移プロットから得られたオートラジオグラムを示す。図２８、レーン１は無血清培地に暴露した非トランスフェクンヨンＣ６神経膠細胞を示す。ＩＧＦ１転写体のパターンは顕著なバンドを７５．１８およびｌｋｂに示す。図２ａ、レーン２および３は５０μｍ　ＺｎＳＯ４の不在下（レーン２）または存在下（レーン３）で２４時間、無血清培地に暴露した、ｐＡｎｔｉｌＧＦ−１でトランスフェクションしたＣ６神経膠腫細胞を示す。５０μｍ　Ｚｎ５Ｏ，ての処理は明らかにｌｋｂアンチセンス転写体の強い発現を誘導し、二本鎖の二ノクトランスレーンヨンされたラットＩＧＦ−１ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによりここで視覚化される。Ｚｎ５Ｏ，によるアンチセンスの誘導は、７．５および１．８ｋｂの内因性ＩＧＦ−１転写体のほとんど完全な消失を伴う。センスＩＧＦ−１ｍＲＮＡに特異的な一本鎖ｃＤＮＡプローブによる同じプロ、トの再ハイブリダイゼーションは、内因性１ｋｂ転写体も消失することを示した。図２ａ、レーン４および５はヒトニックトランスレ−７ヨン化二本鎖ＩＧＦ−１ｃＤＮＡでプローブされた同じプロ、トを示す。この場合、内因性うｙ　）　ＩＧＦ−１転写体は明らかではなく；アンチセンス転写体に特異的な一本鎖ｃＤＮＡプローブを用いたプロットの再ハイブリダイゼーションは、レーン４におけるＩｋｂ転写体が亜鉛の不在下でＭＴ−１プロモーターからのバックグラウンド発現であることを示した。誘導されたアンチセンス転写体ルはヒトプローブの使用により大きく増強する。図２ｂ、レーン１〜３はＢ−１０４神経芽腫細胞からのＲＮＡ転移プロットを示す。非トランスフェクションＢ−１０４細胞はいかなる検出可能なＩＧＦ−１転写体も示さないが（レーン１）、トランスフェクション細胞はＣ６細胞と同様に、ＺｎＳＯ４で処理した細胞におけるアンチセンス転写体の強い誘導を示す（レーン３とレーン２を比較）。安定なトランスフェクションは、結果としてＣ６神経膠腫細胞（形態が亜鉛の不在下で一層長くなるようである）（図３ａ）およびＢ−１０４神経芽腫（形態が長いものから一層不規則で大きいものへと変化する）（図３ｂ）の両方の形態変化を与えた。親Ｃ６細胞がＺｎ５Ｏ，の存在下（３ｄ）または不在下（３Ｃ）で免疫ペルオキシダーゼ法によりＩＧＦ−１に対する抗体と陽性の反応をするのは明らかである。対照的に、Ｂ−１０４神経芽腫細胞は上記の方法を用いてＺｎＳＯ４の不在下（３ｅ）または存在下（３ｒ）でいかなる染色反応も示さず、これら細胞内の検出可能なＩＧＦ−１タンパク質の欠失を示している。しかし、トランスフェクションＣ６神経膠腫細抱が免疫ペルオキシダーゼを用いて抗ＩＧＦ− １抗体と共に高強度の染色を示した（３ｇ）のに対して、Ｚｎ５Ｏ，の存在下、免疫染色はほとんど完全に消失した（３ｈ）。トランスフェクションＣ６神経膠腫細胞をＺｎ５Ｏ，で処理してラベル化ヒトＩＧＦ−１一本鎖３６８−ラベル化センスヌクレオチドでプローブした（アンチセンス転写体を検出するために）。ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ−ン目ンは、ＺｎＳＯ４で処理したトランスフェクション神経膠腫細胞がアンチセンス転写体を発現するのを示した（３ｉ、ｊ）。しかし、トランスフェクション神経膠腫細胞をＺｎＳＯ４を伴わずに増殖させた場合には、同じプローブを同じ比活性で用いたときにいかなるハイブリダイゼーションシグナルも明らかではない（３に、　１）。対照として、トランスフェク／ｇンＢ−１０４神経芽腫細胞は神経膠腫細胞について上で述べたものと同様の結果を与えた。Ｚｎ５Ｏ，で処理した細胞はアンチセンスＩＧＦ−１の誘導を示しく３ｍ、　ｎ）、Ｚｎ５Ｏ，の不在下ではいかなる明白な誘導も存在しない（３ｏ、　ｐ）。図４はさらにアンチセンスＩＧＦ−１転写体の誘導の結果ＩＧＦ−１タンパク質の消失が生じることを示す。トランスフエフシロン細胞においてＩＧＦ−１の存在を示している免疫蛍光（４ａ）は細胞をＺｎ５Ｏ，で処理した場合に消失する（４ｂ）。図４（ｃ＝ｅ）は、異なる光学条件で同じ顕微鏡視野の顕微鏡写真を示し、いかなる免疫蛍光染色も伴わないＺｎ５Ｏ，処理細胞を示す（４Ｃ）。同じ細胞が３５３−ラベル化センスオリゴヌクレオチドに強くハイブリダイズしく４ｄ）、これは細胞核内に局在化している。顕微鏡焦表面に関する銀粒子の位置の変動は、４ｄＳｅにおけるある種の細胞上の粒子の明らかな欠失を説明する。また、図４ｅ＝Ｈにおける写真感光乳剤の存在およびカバーグラスを使用せずに写真を撮る必要性は蛍光強度の変動を導いた。図ｉ、４ｇは、Ｚｎ５Ｏ，の存在下で維持したトランスフェクションおよび親Ｃ６細胞の混合培養物がＩＧＦ−１タンパク質について染色され（４ｒ）、さらに３５３−ラベル化センスオリゴヌクレオチドにｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシコンされる（４ｇ）ことを示す。従って、トランスフェクションおよび非トランスフェクンヨン細胞の両方を同じ実験処理に同時に暴露した。ＩＧＦ−１タンパク質に対する免疫蛍光染色を示さないトランスフェクション細胞のみがＲＮＡアンチセンスハイブリダイゼーションングナルを明示する（細胞群中に見られる染色を欠く中抜きの矢印近くの細胞と閉じた矢印近くの単離細胞を比較）。い（つかの異なる制限エンドヌクレアーゼ法により消化されたＣ６トランスフエクンヨン細胞から単離されたＤＮＡから調製されたサザンブロソトを３２Ｐ−ラベル化ｆ）ＡｎｔｉｌＧＦ−１とハイブリダイズし、同じゲル上を流した同様に処理したｐＡｎＬｉｌＧＦ−１から得られたハイブリダイゼ−７ヨンパターンと比較した。トランスフェクション細胞由来のＤＮＡ中のハイブリダイズしているフラグメントのパターンはトランスフエクシヨンのために用いた精製プラスミドのパターンと類似しており、少なくとも一部のｐＡｎｔｉｌＧＦ−１ベクターＤＮＡはエピソームとして維持されたことを示している（データは示さず）。このような実験は、エピソーム的に維持された細胞当たり１０コピーの推定値が精製ｐＡｎｔｉｌＧＦ−１の既知量と細胞性ＤＮＡにおけるハイブリダイゼーションシグナル強度の比較に基づくことを示唆した。Ｃ６神経膠腫細胞の腫瘍形成性は図５で示される結果において明らかである。１０匹のラットの右後脚上に１０’非トランスフエク／ＷンＣ６神経膠腫細胞を皮下注射した。２週間で１０匹全方のラットは大きな腫瘍を発生した。さらに１１匹のラットの同じ位置に１０７トランスフェクション神経膠腫細胞を皮下注射した。トランスフェクション細胞を注射したラットのいずれも一部の観察中に腫瘍を発生しなかった（別の群のラットは４か月間無腫瘍であった）。親Ｃ６神経膠腫細胞の注射後３週間に発生した腫瘍の大きさを図５ａ（矢印）に示し、トランスフェクション神経膠腫細胞を注Ｕ＝ｊした典型的なラットを右に示す。ＩＧＦ−１配列を含有しない発現ベクターでトランスフェクションしたＣ６細胞を別の５匹のラットに注射した。これら５匹のラット全では２週間後に腫瘍を発生した。別の対照として、Ｂ−１０４神経芽腫細胞をｐＡｎｔｉｌＧＦ−１でトランスフェクションした。図５ｂは、」１記のように１０７トランスフエクンヨンＢ−１０４？ＥＩＩ経芽腫細胞を注射したラットを示す。２週間の間に注射した１０匹全方のう、）において大きな腫瘍が明らかであった。このようなラットにおいて発生した腫瘍の例を図５ｂに示す。トランスフエクンヨンＣ６神経膠腫細胞を注射した１１匹の内６匹のラットは小さな病変（＜　１　ｃｍ）を注射の数Ｉヨ後に注射部位に発生した。３匹はさらに分析するために除去したが、他は２〜３週間後に消失した。これら病変のうちの１つの組織学的切片をヘマトキシリンおよびエオンンで染色して図４ｈに示す。これは多くの単核細胞、主にブラスマ細胞および時にはリンパ球様細胞を含有する器官形成組織により囲まれた少数の神経膠細胞（神経膠原線維酸タンパク質（ＧＦＡ）に対する免疫染色により陽性の同定がなされた）を示す。池の２つの病変は組織学的に同一であった。これは、宿主免疫系がトランスフェクション神経膠腫細胞に対して反応したことを示唆する。対照してみると、非トランスフェクションＣ６神経膠腫細胞の注射の結果中じた腫瘍（ＧＦＡに対して陽性染色された１図４ｋ）は腫瘍内の単核細胞のいかなる明白な浸潤も示さなかった（４１）。上記は予め選択された遺伝子のアンチセンス表現型模写に対応する遺伝的に工作された腫瘍細胞のインビトロおよびインビボ混合機能分析を示す。本発明者らは誘導性アンチセンスＲＮＡ転写系を用いてＣ６細胞におけるＩＧＦ−１発現の効率的なアンチセンスＲＮＡ−介在性阻害を得た。タンパク質産物の明らかに完全な遮断はインビトロでのアンチセンス誘導の後に観察された。インビトロでのＩＣＦ−１阻害の結果、インビボでの腫瘍形成性の損失を生じた。本発明者らは／−ザン分析による内因性ＩＧＦ−１センス転写体の有効なアンチセンス阻害、および免疫細胞化学によるタンパク質発現の阻害を示した。後者は同じ細胞におけるアンチセンス発現と関連していた。注目すべきは、Ｚｎ５Ｏａ誘導後に現れたアンチセンスＩＧＦ−１転写体がｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより核に顕著に局在化していたことである。この発見はアンチセンスＲＮＡ介在性阻害のための核内機構を結果的に支持する。安定なアンチセンストランスフェク／ヨン体の使用は、インビトロおよびインビボの両方でのそれらの表現型（腫瘍形成性を含む）特性の分析を可能にし、形質転換の可能性ある遺伝子をスクリーニングするために適したインビトロ／インビボアッセイ系を提供する。アンチセンスＩＧＦ−１トランスフェクション体に対する腫瘍形ｆｆ５Ｅ性の損失の基礎をなす機構は免疫原性の増強と関連がある。本出願人は、インビボで注射されたＣ６トランスフェクション細胞を取り囲む単核細胞の顕著な浸潤に注目する。このような浸潤物はインビボで形成された腫瘍における親（ＩＧＦ−１陽性）細胞に対して明白でなかった。これは腫瘍形成性の損失か、少なくとも一部はＩＧＦ−１陰性細胞に対する宿主免疫応答の増強によるであろうことを示す。この可能性は以下に提供する実施例により具体化される。この免疫学的成分は抗増殖効果と共に存在するであろう。無血清培地中で４８時間培養したトランスフェクンヨンＣ６細胞への３Ｈ−チミンン導入の速度は培養培地中のＺｎ５Ｏ，またはＩＧＦ−Ｉタンパク質（５０Ｐｇ／ｍｌ）の存在により影響を受けなかったから、Ｃ６細胞性増殖はＩＧＦ−１の他の因子にも関与するようである（データは示さず）。大旌桝ｌ　腫瘍保護実験トランスフェクション（アンチセンスＩＧＦ−１）神経膠腫細胞か親（非トランスフエクンヨン）神経膠肺腫瘍に対してインビボで免疫応答を導き出し得るか否かを測定するために、いくつかの実験を行った。最初の実験の組において、１０７親神経膠腫細胞を１０匹のラットの左後脚上に皮下注射した。４〜６日後、注射したラットの各々に腫瘍か明らかとなったら、反対側の後脚上に第二の注射を皮下投与した。この第二の注射はｌＯ７トランスフェクション（アンチセンスＩＧＦ−Ｉ）神経膠腫細胞を含んでいた。３週間以内に、１０匹すべてのラットにおいて腫瘍は完全に消失した。アンチセンスｌ　ＧＦ−１転写力七ノドを含まないエピソームで安定にトランスフエクシヨンされた神経膠腫細胞の第二注射を行ったラットを含む全ての対照において、腫瘍は存続し、２か列後に動物の屠殺を必要とする大きさまで成長した。これら結果は３つの別々の実験において確認された。さらに、実験の第二の組は既に存在する神経膠芽腫を治療するトランスフェクション（アンチセンスＩＧＦ−１）神経膠腫細胞の能力に注意を向けるものであった。腫瘍は上記のように１０匹のラットて確かめられ、３週間後（１０匹の動物の各々において大きな腫瘍が明白となったとき）に、腫瘍を全ての動物から外科的に切除した。欠いてこれら動物を２つの群に分けた。５匹の動物からなる第一群はこれ以上いかなる処置も受けなかった。それら全てにおいて、約３週間後に腫瘍の不完全切除を反映した腫瘍の局所的再発があった。５匹の動物からなる第二の群は上記のエビソームでトランスフェクションされた１０’神経膠腫細胞の注射を受けた。これらラットのいずれも切除または他の部位に腫瘍再発の徴候を示さなかった。この発見は３つの別々の実験において確認された。上記の各実験における腫瘍退化段階の間、組織学的分析は腫瘍が単核細胞により多量に浸潤されることを示した。免疫細胞化学により、６０〜７０％の浸潤細胞はＣＤ８’リンパ球であることが示された。残りの浸潤細胞はマクロファージおよびＣＤ４”リンパ球から構成された。第三の実験において、本発明者らは腫瘍治療から腫瘍予防に転換した。１０匹のラットの左後脚上に１０７親神経膠腫細胞および同時に右後脚上に１０７トランスフエクシヨン（アンチセンスＩＧＦ−，１）神経膠腫細胞を皮下注射した。いずれのラットにおいてもいかなる腫瘍も発生しなかったが、親神経膠腫細胞のみを第二部位に注射した場合には３週間後に各ラットにおいて両部位に大きな腫瘍が発生した。さらに、対照エピソーム（ＩＧＦ−１成分を欠く）でトランスフェクションされた神経膠腫細胞を５匹のラットの第二部位に注射した場合に、全ては腫瘍を発生した。別の対照は、ＩＧＦ−１配列をセンス配向でラット成長ホルモンレセプターｃＤＮＡと置き換えた類似エビソームで安定にトランスフェクションされた１０７神経膠腫細胞を注射した６匹のラットから構成された。６匹すべての動物は異常に大きな腫瘍を発生した。ゆえに、保護的効果は特にアンチセンスＩＧＦ−１を発現している腫瘍細胞と関連しており、その結果該細胞は親神経膠腫細胞に対してならびにそれら自体に対して宿主免疫応答を導き出す。宿主抗腫瘍免疫応答の特異性を第四の実験の組において示した。最初に、トラ：／スフ、クンヨン（アンチセンスＩＣＦ−Ｉ）および親神経膠腫細胞を共に混合し、細胞混合物を１０匹のう、１・の左後脚上に同時注射した。１年の観察の間どの動物においてもいかなる腫瘍も発生ｌ、なかった。小さな嚢胞が３匹の動物の注射部位に発生し、それらのうち２匹は組織学的検査のために外科的に除去し、第三のものはしばらく後に消失した。嚢胞は主にリンパ球系単核細胞からなり、それらの８０〜９０％はＣＤ８゛リンパ球であった。第二の腫瘍細胞混合実験を行い、この場合にはトランスフェクション（アンチセンスＩＧＦ−Ｉ）神経芽腫細胞および親神経膠腫細胞を組み合わせた。３週間後に、そのように注射した５全方てのラットにおいて大きな腫瘍が発生した。腫瘍を除去し、各場合における組織学的検査は神経芽腫ならびに神経膠腫細胞からなる混合腫瘍を示した。これは免疫細胞化学により確認された。第三のＩｆｉ細胞混合実験は、５匹のラットへのトランスフェクション（アンチセンス■ｃ　Ｆ　−１）神経ｆｆＷＩＨＩ胞およびトランスフェクション（アンチセンスＩＧＦ−１）神経芽腫細胞の組み合わせの注射から構成された。３週間後に、全ての動物は大きな腫瘍を発生し、この腫瘍は組織学的に神経芽腫成分のみからなることが判明した。これら実験は、トランスフェクション（アンチセンスＩＧＦ−１）神経膠腫細胞により誘導される宿主免疫応答が神経膠腫細胞に特異的であって混合腫瘍において神経膠原と神経芽腫成分を識別することができることを共に確認する。さらに、これは他の免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞により媒介される非特異的傍観者効果が腫瘍退行を本質的に担うものではないことを示す。結論として、本発明者らは神経膠腫細胞におけるＩＧＦ、Ｉ発現の阻害がこれら腫瘍細胞において免疫原性の高い表現型を導き出すことを明確に示した。この免疫原性は腫瘍予防の目的のためだけではなく、遠位に先夜する腫瘍の根絶のためにも用いることができる。さらに、宿主免疫応答は主にＣＤ８’リンパ球からなるようである。この宿主免疫応答は用いられる免疫原性腫瘍細胞型に対する特異性が高く、実際、これは１個の部位での混合腫瘍において混合された異なる腫瘍細胞型（ＩＧＦ−ドおよびＩＧＦ−１−）を識別することができる。これら発見は、ＩＧＦ−１が分化のみではなく重要なのは神経膠腫細胞の免疫原性表現型も規定する主なサイトカインとし、て機能するという概念と一致する。腫瘍形成性における重要な事象は、おそらくある種の腫瘍型に免疫系を逃れる能力を与える、ＩＣＦ−１により推進される表現型変化であろう。本発明はこのような腫瘍におけるＩＧＦ−１の阻害が免疫原性の高い表現型を誘導し得ることを開示する。ある種の腫瘍はＩＧＦ−１の代わりにＩＧＦ−Ｉ＋を発現するから、このような腫瘍においてはＩＧＦ−１１の阻害が免疫原性表現型の同様の誘導を可能にするであろうことが予想される。さらに本発明は、あらゆる腫瘍型における他のどのサイトカインか腫瘍免疫原性の下方変調を担うかを測定するための効率的に結合されたインビトロ／インビボアッセイ系を提供する。ＩＧＦ−１アンチセンスートランスフエクシジン細胞による処理が脳において確認された神経膠芽腫に対して有効であるか否かを確認するために、本発明者らは一部のラットの頭蓋内にｌＸＩＯ３〜２Ｘ１０＠親またはトランスフェクションＣ６細胞を注射した。１週間後、数匹のラットを層殺してそれらの脳組織を組織病理学的検査のために調製した。残りのラットのうち、ＩＧＦ−Ｉアンチセンストランスフェクション細胞を注射した６匹のうち６匹は、腫瘍発生の証拠を有さずに１年以上生存したが、親細胞を注射した５匹のうち５匹は注射局部で腫瘍成長が明らかとなったときに層殺した。６匹のラットからなる第二群にはＩ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’〜２Ｘ１０’親細胞を頭蓋内注射し、２〜３日後に右後脚上に１０７トランスフエクンヨン細胞を皮下注射した。これらう、ｌ−は全で１年以上無腫瘍であり続けた。脳における腫瘍退縮の間、単核細胞、主にＣＤ８”Ｊンバ球の豊富な浸潤が観察された（皮下的に退縮する腫瘍についての場合と同様）。これら実験はＴｒｏｊａｎら［「アンチセンスインスリン様増殖囚子Ｔ　ＲＮＡを発現している免疫原性Ｃ６細胞によるラット神経膠芽腫の治療および予防」、鈷μ＋ｎｃｅ　２５９：　９４−９７　（１９９３）］（図を含むこの文献全体は本明細書の一部を構成するものとする）が開示している。多能性胚幹細胞を含有するＰＣＣ３マウス奇形癌ラインを用いた実験は、これら細胞を皮下注射したときにそれらは複数の構造、例えば原始神経系、原始肝臓および原始軟骨などを有する肝癌へと発達することを示した。この発達の間、腫瘍形成構造はＩＧＦ−１を発現する。該細胞をＩＧＦ−Ｉ　ＤＮＡを発現するエピソームを基礎とするプラスミドでトランスフェクションし、安定なトランスフェクション体か得られた場合に、細胞はその腫瘍形成能力を失い、それらに対するＴ細胞を基礎とする免疫原性反応を、主に関与するＣＤＢ＋リンパ球と共に引き起こす。さらに、これら細胞は非トランスフェクシ３ン細胞により形成される腫瘍に対して保護し、これら細胞により引き起こされ存在する腫瘍からマウスを治療した。同等のヒト癌細胞と同様にＩＧＦ−１を発現するラット骨肉腫細胞を、同じプラスミドで同様にトランスフェクションして安定なトランスフェクション体が得られた。上記のように、この方法で注射した細胞は腫瘍を形成するその能ノコを失う。分子因子発現の阻害物質についてのアッセイ上記のように、上で説明したものと等価の方法を用いて上記のアンチセンス分子以外の阻害物質を発見することかできる。例えば、上で示したあらゆる分子因子または他の因子の発現阻害は、同様のアッセイ系において上で開示したアンチセンス法を用いて行うことかできる。免疫原性を改善する分子因子のあらゆる阻害は、本発明においてその発現または活性が有用に阻害され得る分子因子を明確化するであろう。さらに、分子因子の活性に影響を及ぼす抗体または他の特異的薬物を同様の方法を用いてアッセイすることかできる。上記のように、腫瘍細胞内または腫瘍細胞表面上の分子因子の活性を低下させるかまたは例えば分子因子作用をブロックするであろう他の薬物の利用可能性を上昇させることにより同様の様式で作用するであろうあらゆる方法が常法を用いて発見されるかもしれないことを当業者なら理解するであろう。本出願人により開示されている基本的概念は、相対的な分子因子レベルの低下により腫瘍細胞免疫原性を増強することができるということである。これが理解されたなら、当業者は、腫瘍細胞のどの成分かサイトカイン濃度に対するそれらの効果により免疫原性に関係しているかを測定するために常法を用いて他の成分の関連を容易にアッセイすることかできる。このような成分の明確化のために用いられるであろう方法を含むこれら成分の全ては本発明の範囲内にある。細胞の分画本出願人は腫瘍細胞全体をインビボで動物の免疫のために用い得ることを示す一方で、さらに本出願人はこのような細胞の一部分を免疫原性薬物として用いてもよいことを認識している。例えば、細胞を常法を用いて分画して細胞表面成分、例えば細胞膜上に存在する成分を単離し、それら細胞膜またはさらには単離したタンパク質またはそれから得たタンパク質分画を用いてインビボで動物を免疫することができる。活性な膜分画の測定方法が当分野で周知であり、ここでさらに詳しく述べる必要がないことを当業者なら理解するであろう。さらに、本出願人は、生きている腫瘍細胞の投与は、たとえ免疫原性であるとしても当業者の一部は抵抗するかもしれないことを理解している。従って、さらに本発明は不活性化免疫原性腫瘍細胞、例えば照射、エメチンまたはマイトマイシンＣなどの薬物処理のために細胞性免疫原として使用する前に不活性化されている腫瘍細胞に関する。腫瘍細胞の増殖能力を不活性化する方法は当業者により周知であり、本発明において等しく適用可能である。本発明の１つの態様に従い、関連のサイトカインの発現が阻害されている腫瘍細胞群から形質膜分画を調製する。このような形質膜分画は生きている細胞または照射細胞のどちらかから調製される。さらにこれら分画をＤＮＡ５ｅで処理して残りの全ての細胞性およびプラスミドＤＮＡを全体的に消化する。細胞から形質膜分画を調製する方法は当業者に周知である。このような方法に従い、ＡｒｏｎｓｏｎおよびＴｏｕｓｔｅｒ［ＡｒｏｎｓｏｎおよびＴｏｕｓｔｅｒ、　３１　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙ＋ｎｏ１．９０　（１９７４）］の方法の修飾により形質膜を単離する。細胞を０．２５Ｍショ糖を含有しているＴＭＫ緩衝液中でホモジナイズし、ゆる（合わせたダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズを行う。形質膜分画のほとんどはミクロソームビレット中にあるから（６０％）、後者のみを処理して核を捨てる。ミクロソーム分画中の形質膜の割合を５゛−ヌクレオチダーゼの活性から測定する。該文献に開示されているように不連続ショ糖勾配により形質膜をミクロソーム分画から精製する。薬物上記に示したように、本発明の好ましい態様には、腫瘍細胞内のＩＧＦまたは他の関連のサイトカインの発現を阻害してそれら細胞を免疫原性にするために遺伝子配列が用いられるものが含まれる。しかし、ＩＧＦおよび他のサイトカインが腫瘍免疫原性を制御する分子スイッチとして機能することを述べたように、他の治療的関連法を工夫して腫瘍免疫原性を増強するためにこれらサイトカインまたは他の分子因子の発現を阻害することができることは明らかである。本発明のこのような１つの別の態様に従い、分子因子コード化遺伝子の転写阻害物質として機能する薬物を用いる。このような薬物はインビトロまたはインビボのどちらかで用いることができる。インビボで用いた場合に、該薬物は分子因子の産生を性となるであろう）において起こる。免疫原性効果は最初の２〜３週間内で明らかになるであろうから、薬物の長期投与は必要ないであろう。さらに、正常組織における分子因子発現の短期間の阻害は著しい毒性問題を呈示しないと予測される。肝臓はＩＧＦ−１を輸出のために産生じており他の組織はこのサイトカインを生存のために必要としないから、肝臓によるＩＧＦ−１産生のブロックは毒性ではないたろう。特異的遺伝子に対する転写ブロッカ−として機能し得る薬物を同定するためのよく確認された実験法が存在する。例えば、目的がＩＧＦ−１転写阻害物質を同定することであるなら、既にクローン化されているＩＧＦ−１プロモーター／エンハンサ−要素をリポータ−遺伝子に連結することができる。このようなリポータ −遺伝子の１つは、感受性で容易にアッセイ可能なマーカーであるβ−ガラクトンダーセをコードしている遺伝子である。この構築物を用いて腫瘍細胞を安定にトランスフェクションし、９６−ウェルプレート中、プロモーターか構成性発現されリポータ−タンパク質産物か色反応により検出可能である条件下で培養することができる。大きな区分の薬物は、それらを細胞に加えてβ−ガラクト／ダーゼ活性の損失をスクリーニングすることにより容易にスクリーニングすることができる。同様のアッセイの広範な組を工夫することができるであろうことは当業者には明らかであろう。分子因　−結合タンパク質本発明のさらに別の態様に従い、腫瘍細胞を免疫原性にするためにＩＧＦ−結合タンパク質発現を操作することによりＩＧＦ−１または他の分子因子を腫瘍細胞において阻害することができる。例えば、サイトカインに結合してそれによりサイトカインを不活性化するよう機能するＩＧＦ−結合タンパク質をコードしている転写カセットを、腫瘍細胞中にトランスフェクションすることができる。この目的のためのエビソーム発現ベクターの使用は、大過剰のＩＧＦ−結合タンパク質産生を可能にする。また、ある種のＩＧＦ−結合タンパク質はＩＧＦ−１活性を刺激することが報告されている。従って、このようなタンパク質に対するアンチセンスを発現しているエピソームを基礎とする転写カセットを用いてＩＧＦ− １活性を抑制することができるであろう。結合タンパク質か分子因子機能を変調させる有意な役割を果たすことが知られているかまたは見いだされるであろう同様の方法を他の分子因子のために工夫することができる。核酸阻害法アンチセンス配列以外の遺伝子配列を用いて、腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１発現を遺伝子特異的な様式で阻害することができる。例えばヒ）ＩＧＦ−１の５゛− 非翻訳領域は、二本鎖形成のための標的として役に立つ２３ヌクレオチドの唯一の配列を含んでいる（５′−＾ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧ −３’　）。実際、当分野の現在の状態によれば、この特定配列は二本鎖形成のために最も良い適合を提供する。このような関係における二本鎖形成およびそれによる遺伝子特異的転写阻害を達成するために２つの別のアプローチを用いることができる。１つのアプローチはオリゴヌクレオチドＤＮＡ配列を常法に従い用いるものである。所望によりＤＮＡ５ｅ活性をこれら配列の間に差し込むことができる。第二のアプローチはＲＮＡ配列（例えば、５’−ｕｃｕｕｃｕｃｃｃｕｃｕｃｕｃｕｃｕｃｕｕｃｃ−ａ”、インビトロでの化学的合成により調製され、インビトロでＩＧＦ−１遺伝子のタンパク質合成を阻害し、培養細胞において三重へリノクス形成がこれら条件下で遺伝子転写を阻害することを示す）の使用を必要とするものであり、この配列は二本鎖ＤＮＡ標的と二本鎖を形成するであろう。この目的のために、ｌ　Ｇ　Ｆ　−１標的ＤＮＡ配列に結合してＩＧＦ− １発現を阻害する特異的ＲＮ　Ａ配列をコードするエピソームを基礎とする転写カセットを用いることかできる。勿論、染色体標的配列は長さおよび位置が変化し得る。分子因子転写阻害のために用られる遺伝子配列の別の例はりポザイム配列である。特異的遺伝子阻害のためにこのような配列を工夫する方法は当業者に周知である。分子因子発現においてブロックされる腫瘍細胞誘導体を開発するために用いられる遺伝子配列のさらに別の例は、相同的組換えにより遺伝子ノックアウトのために用いられ得る配列の使用である。このような方法により分子因子遺伝子の染色体コピーの両方がノックアウトされたなら、腫瘍細胞を腫瘍免疫原として用いることかできる。また、両染色体上の体細胞遺伝子置換または両染色体上の体細胞遺伝子突然変異を適用することができる。里塗上記の方法を、上記のようにまたは同等の手段により行うことができる。本発明において有用な阻害性分子、膜または腫瘍細胞をヒトまたは他の霊長類動物に常法により、例えばインビボでの腫瘍組織へのレトロウィルスまたは裸ＤＮＡ挿入によるかまたは腫瘍細胞のインビトロ処理により投与することができる。適当な投与法および投与プロトコールは常法により決定することができることを当業者なら理解するであろう。例えば、原発性固体腫瘍を外科的に除去して通常の増殖培地中に入れることができる。腫瘍組織を小片に細かく切断し、次いで当分野で既知であろう方法に従いトリプシン、コラゲナーゼまたはそれら両方で処理するであろう。細胞を短期培養において増殖させて酵素処理からの回収を可能にするであろう。次いで、アンチセンスＩＧＦ−Ｉ　ＲＮＡまたはＩＧＦｉ１転写カセント、または本発明において開示されるインビトロ／インビボアッセイにより免疫系にたよることにより腫瘍形成性をブロックするために重要であるとして示される分子因子に対応するあらゆる池のアンチセンス配列以外を有する２０μｇの環状エピソームを基礎とするベクター（１０７腫瘍細胞当たり）て細胞をトランスフェクションするであろう。安定なトランスフェクション体は良く確立されたプロトコールにより得られるであろう［例えば、ＨａＩ＋１ｂｏｒら、　８５　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　３５５５　（１９８ｇ）］。患者は１０＠〜１０ｇの安定にトランスフェクションされた腫瘍細胞を皮下注射されるであろう。また、安定にトランスフェクションされた腫瘍細胞は注射前に通常のプロトコールに従い照射されるであろう。本発明の別の態様は、」１記のようにインビトロで培養される単離腫瘍細胞の調製を必要とする。この場合において、アンチセンスＩ　Ｇ　Ｆ　−、ＩまたはアンチセンスＩＧＦ−１１オリゴヌクレオチド、またはＩＧＦ−１特異的リボザイムはインビトロで腫瘍細胞に加えられるであろう。［ＧＦ発現の阻害は免疫細胞化学およびノーサンＲＮＡプロット分析により詳細に記録されるであろう。阻害が確認されたなら、腫瘍細胞は上記のように皮下注射されるであろう。他の態様は以下に示す請求の範囲内にある。ａ　ｂんび２ＦＩＧ、　３ａ　ＦＩＧ、　３ｂ。ＲＧ、喀ＦＩＧ、　４ｈ。ＲＧ、４ｋ。ＦＩＧ、　５Ｃ１／’；／θ５ｂ。フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９Ｃ１２Ｑ　１１０２　６８０７−４Ｂ／／ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ　７０５５−２Ｊ３３１５７４　Ｚ　７０５５− ２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ。ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳＩ（７２）発明者　イラン、ジョゼフアメリカ合衆国４４１０６オハイオ、クリーブランド・ハイツ、プラウエア・ドライブ２２７６番

Claims

【特許請求の範囲】

１．分子因子の細胞内レベルが未処理腫瘍細胞と比較して低下するように処理された腫瘍細胞を含有する免疫原性腫瘍細胞。
２．分子因子をコードしているｍＲＮＡのレベルが細胞中で改変されている請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
３．アンチセンスＲＮＡを用いて腫瘍細胞中の分子因子発現を阻害する請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
４．エピソームベクターがアンチセンスＲＮＡを生成する請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
５．エピソームベクターがＥＢＶ複製シグナルを含有する請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
６．アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは三重鎖形成核酸を用いて腫瘍細胞における分子因子発現を低下させる請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
７．分子因子が核転写因子および細胞表面レセプターからなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
８．核転写因子がヘリックスーループーヘリックスおよびジンクフィンガー転写調節物質からなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
９．ヘリックスーループーヘリックス転写調節物質がｍｙｏＤ、ＳＣＬ、Ｉｄからなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
１０．腫瘍細胞が固体腫瘍細胞である請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
１１．腫瘍細胞が神経膠芽腫、神経芽腫、肺癌、乳癌、骨癌、髄膜腫、結腸癌、偏平上皮癌、黒色腫、ウィルムス腫、奇形癌および悪性肝癌細胞からなる群から選択される請求項１に記載の免疫原性腫瘍細胞。
１２．腫瘍細胞中の分子因子のレベルを低下させるように該腫瘍細胞を処理することからなる免疫原性腫瘍細胞の調製方法。
１３．癌細胞を有する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、該腫瘍細胞中の分子因子のレベルを低下させて該腫瘍細胞の免疫原性を上昇させる工程を含む方法。
１４．患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、正常な該腫瘍細胞に比べて分子因子の細胞内レベルが低下している同一腫瘍型の異種腫瘍細胞を該患者に投与する工程を含む方法。
１５．患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、正常な該腫瘍細胞に比べて分子因子の細胞内レベルが低下している同一腫瘍型の自己腫瘍細胞を該患者に投与する工程を含む方法。
１６．腫瘍細胞を有する患者において自己腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、正常な該腫瘍細胞に比べて分子因子の細胞内レベルが低下している修飾化腫瘍細胞の膜抽出物またはそれから単離したタンパク質を該患者に投与する工程を含む方法。
１７．培養腫瘍細胞における分子因子コード化核酸の発現を阻害する工程を含む請求項１４、１５または１６に記載の方法。
１８．腫瘍細胞の免疫原性を低下させる腫瘍細胞分子因子を同定する方法であって、腫瘍細胞における分子因子発現を阻害して改変腫瘍細胞を調製し、得られた阻害化腫瘍細胞の免疫原性を非阻害化腫瘍細胞と比較して測定する工程を含む方法。
１９．腫瘍細胞免疫原性を増強するために有用な試薬を同定する方法であって、該試薬による腫瘍細胞内の分子因子の発現の阻害量を測定する工程を含む方法（該発現を阻害する試薬は腫瘍細胞免疫原性を増強するために潜在的に有用である）。
２０．転写または翻訳の阻害量を測定する請求項１９に記載の方法。
２１．リポーター遺伝子に転写的に連結された分子因子の遺伝子プロモーターを提供することにより測定を行い、該リポーター遺伝子の発現を検出する請求項１９に記載の方法。
２２．腫瘍に対する免疫原を産生させる方法であって、細胞にとって利用可能な生物学的に活性な分子因子の割合を、該細胞の他の成分に比べて減少させる工程を含む方法。