JPH07506421A - 分離されたタンパク質類またはｄｎａ／ｒｎａなどの荷電巨大分子類を含有するゲルの電気溶出法およびこれに用いる装置と手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 分離されたタンパク質類またはＤＮＡ／　ＲＮＡなどの荷電巨大分子類を含有す るゲルの電気溶出法およびこれに用いる装置と手段 失盃立１ 本発明は、分離されたタンパク質類またはＤＮＡ／　ＲＮＡなどの荷電巨大分子 類を含有するゲルの電気溶出法に関する請求項１の冒頭部分に示すタイプの方法 に関する。本発明の方法は、請求項１の「特徴とする」部分において新規である 。さらに、本発明は、この方法に用いる装置と手段に関する。

１１長庸 大きさおよび／または荷電量が異なるタンパク質類またはＤＮＡ／　ＲＮＡの分 離には、ゲル電気泳動が広く用いられている。これらの化合物は、泳動距離が異 なっているので、ゲルを染色させたり、あるいは抗原−抗体実験用の膜に移行さ せたり、または他の親和力の相互作用によって研究されている。しかしながら、 従来から一般に、個々のタンパク質バンドを回収するには、ゲルを、単一のバン ドを含有するセグメントに分割し、電気溶出または単純分散のいずれかでこのセ グメントを均質化して溶出するという、困難で時間がかかる方法を取っていた。

しかも、この方法は、非能率的であり、ごく希薄な生成物しか得ることができな いことが多い。

アメリカ合衆国特許第３．９５６．０９９号明細書には、電気泳動操作中に成分 を個々の部屋に分離する、連続作業に好適な複合システムが開示されている。し かしながら、この方法は、従来のゲル中で予め巨大分子を分離してから溶出する のではな（、タンパク質類の大規模な精製用の分離装置を用いている。

アメリカ合衆国特許第４．０４９．５３４号、第４．７２５．３４８号および第 ４．７４７．９１８号明細書では、単一の成分を含有する小さなゲルフラグメン トの電気溶出に適している方法と成分とが開示されている。この方法では、所望 の分子を局在化して切除するという、時間がかかり、正確度にも問題がある操作 を行わな（ではならない。したがって、ゲル中で分離された全ての成分を同時に 検討するには適当な方法ではない。

ヨーロッパ公開特許第０３８０３１３号明細書には、特に高分子量化合物の移動 に適している電界反転電気吸収転移（ｆｉｅｌｄ　１ｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｅｌｅ ｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）と溶出装置が開示されている。この方法でも、予め 所望のバンドを同定しておかなければならないので、上記アメリカ合衆国特許第 ４．０４９．５３４号、第４．７２５．３４８号および第４，７４７．９１８号 明細書で開示されている方法と同じ様な限界がある。

アメリカ合衆国特許第４．１８１．５９４号明細書には、スラブゲルに含まれて いる化合物が上方の複数のウェルに直接に電気溶出されるマトリックス回収装置 が開示されている。各化合物は、かなりの厚さを持つ壁体で隔てられている数個 のウェルに溶出する。壁体の厚さのために移動にむらが出たり、非効率的となる 可能性がある。ウェルには異なるタンパク質指示薬が充填されている。この装置 には透析膜がないので、得られる生成物にはゲルからの塩と界面活性剤（ｄｅｔ ｅｒｇｅｎｔｓ）が含まれている。

プロットエル−ター（登録商標）装置（Ｂｌｏｔｅｌｕｔｏｒ　ａｐｐａｒａｔ ｕｓ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ　ｂｙ　Ｂｉｏｍｅｔｒａ、　Ｇｏｔｔｉｎｇ ｅｎ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）は、二次元ゲルからタンパク質類を溶出する専用装置 である。タンパク質類はかなりの厚さを持つ壁体で隔てられているウェルに溶出 する。この場合も壁体の厚さのために移動にむらが出る可能性がある。さらに、 この装置の方法では、生理緩衝液を使わないし、また前処置として平衡化を行っ て、溶出中にゲルの位置を確実に固定する工程がない。

これら従来のシステム何れを取ってみても一つとして、−次元ゲル中で全ての化 合物を分離して同時に溶出する従来の要求を満たしているものはない。これらの 特色を持つシステムがあれば、タンパク質／　ＤＮＡの複合混合物を生物学的化 学的にスクリーニングする方法を大きく発展させることであろう。

灸ｊＪど【旦 したがって本発明の目的は、タンパク質類またはＤＮＡ／　ＲＮＡなどの巨大分 子を予め分離することを可能にすることにある。本発明の方法では、タンパク質 類などの荷電巨大分子を、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルなどのゲル 全体中で分離して同時に溶出することができる。このようにすることにより、混 合物は単一の化合物、あるいは位置が近い複数の化合物を含む狭い範囲のフラグ メントに分割され、同時に共在しているドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の大 部分が取り除かれる。

本発明において、ゲル全体をひとまとめにして溶出することは新規である。前述 してきたところからみると、従来法では一般に、電気泳動完了時にゲルマトリッ クスを直接切断することが基本となっている。均質化の後、材料を電気溶出装置 に移動させる。前述のように、特にゲルの全タンパク質分をひとまとめにして（ 代表的には、フラクション２０−３０個）同時にスクリーニングすることが望ま しい場合には、このような方法は非常に困難であり、時間が掛かりすぎる。

本発明はさらに、本発明の方法を用いてゲル全体中で全ての化合物を分離して同 時に溶出する電気溶出装置を提供する。この装置は、非常に効率よく通常のゲル （厚さ０．５−１ｍｍ）を溶出するが、たいへん厚い（３−４ｍｍ）ゲルの溶出 にも適している。

以下、図面により本発明の方法と装置を説明する。

・　の　な舌　■ 図１は、本発明の複数の室を持つ電気溶出装置の概略図である。

図２は、本発明の方法により図１に示す装置から溶出されたゲルの写真である。

図３は、図１に示す電気溶出装置によるタンノ々り質類複合混合物の分画を示す 写真である。

図４は、複数の室を持つ電気溶出装置から溶出されたフラクションに対する細胞 の反応を示すグラフである。

図５は、複数の室を持つ電気溶出装置から溶出したフラクションは毒性がないこ とを示すグラフである。

ン、の詳　な萱日 図１は装置の断面を示している。この電気溶出装置全体は、黒鉛電極とその端子 を除いて、界面活性剤に対する抵抗性を持つプラスチックで出来ている。

装置は黒鉛陽極（４）を含む支持体（１）と、緩衝液を充填しているスポンジ（ ５）とからなっている。支持体（１）には溜めがあって、フレーム（２）搭載時 にスポンジが押されて出て（ろ過剰の緩衝液を受け取っている。スポンジの上に は透析膜などの半透過膜があり、フレームは指で回すネジにより支持体に強く接 続されている。

透析膜は任意により、例えば糊付けなどによりスポンジに固定しても良い。黒鉛 陰極（３）は安全カバー（８）に埋め込む。

フレームには三角形の世数の室（７）が平行に並んでおり、室の表面が下方の透 析膜（６）の表面と密接に接触することにより室が密閉されている。

室各々の容量は１５ｍ１以下、好ま１．　＜は約３ｍｌである。

フレームには窪みがあって、ここにゲル（９）を入れる。

緩衝液で濡らした濾紙（１０）を、ゲル（９）と黒鉛陰極（３）との間に挟むの が好ましい。装置の部品の一つに、窪みの大きさに合わせてゲルを正確に削り落 とす鋳型がある。

鋳型は、透明なアクリル系プラスチック製であり、各々のウェルの位置が明示さ れている。鋳型にはさらに、切除する前に鋳型の位置を正確に決めるだめの調整 線が書き込まれている。

ボルト電位は約４０ボルトを印加する。電源もこのボルトを印加できるような調 整機能をもっていなくてはならない。電源は電線（各々１１および１２）によっ て陰極（３）と陽極（４）に接続する。電源は、安全カバー（８）に埋め込んで も良い。

溶出完了までに要する時間は一般に、０．７５ｍｍのゲルに対しては８分から１ ５分である。溶出が終わったら１０秒間電流の方向を反転させて、膜に付いてい る物質をはがれ易（する。得られた生成物は、装置側面の採取口からプラスチッ クピペットで採取する。

電気溶出法は、先ず前処置として、分離されている分子を含有するゲルを緩衝液 中で、好ましくは約３０−４０分間、平衡化することにより開始する。例えば、 生成物を細胞分析に使用する場合に好ましい緩衝液は、低いイオン強度の生理緩 衝液、さらに好ましくは２ｍＭＩＪン酸塩緩衝液（ｐＨ・６゜５）である。平衡 化させている間に、ゲルは膨張して最大限にまで大きくなり、したがって溶出の 間中、ゲルの位置を確実に固定することが出来る。緩衝液は三回取り替えて、ゲ ルから余剰の塩とイオン性界面活性剤（ｉｏｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）を 確実に取り除（。ゲルを緩衝液から取り去り、清潔なガラス板上に載せ、溶出す る部分を鋳型により切除する。好ましい使用法としては、予め染色した分子量マ ーカーでゲルの周辺部に線を画く。鋳型の調整線をマーカーに合わせることによ って、ゲルの正確な位置を決めることができるし、また再現性よく切除すること もできる。ゲルのバンドと溶出室とを平行させることが重要であるが、この方法 によりこれを確実に行うことができる。

装置支持体のスポンジには緩衝液を充填する。緩衝液に浸した透析膜をスポンジ の上に置き、フレームを指回しネジで搭載する。スポンジは膜の支持体として機 能し、スポンジを押圧すると各室が密閉される。室には緩衝液を充填し、鋳型を 用いてゲルをフレームの窪みに移動させる。ゲルの大きさに合わせた厚い濾紙二 枚を緩衝液に浸して、ゲルの上におく。黒鉛陰極を搭載し、好ましくは約４０ボ ルトのボルト電位を印加する。溶出中に荷電分子は、ゲルから室に充填しである 緩衝液に移動する。三角形の室を隔てている壁の上部は鋭角に尖っていて、至適 の移動を妨げる表面をできる限り少なくしている。イオン性界面活性剤（ＳＤＳ ）は、透析膜を通過して陽極の方向に移動した後、緩衝液中で効果的に除去され る。溶出完了に要する時間は、実験対象化合物と使用されているマトリックスに よって異なるが、好ましくは８分から１６分である。溶出が終わったら短時間、 好ましくは約１０秒間電流の方向を反転させて、膜に付いている分子をはがれ易 くする。溶出後フレーム側面の開口部にピペットを当てて、生成物を吸い取って 回収する。生成物を採取した後、装置を解体し、ゲルにタンパク質／ＤＮＡ用の 染色を施して、移動の完了を確認する。全てのフラクションに充分な量のＰＢＳ ＸＩＯを添加して等張としてがら、生成物を細胞分析に使用する。

本発明の第二の実施態様は、この装置を使用して、電気溶出と電気吸収転移を同 時に実施することである。

この実施態様では、適当な膜一枚を装置の片側に挿入し、全ての室の変化する部 分を覆う。こうすることにより、分子は溶液中に移動し、膜に同時に吸収転移す る。好ましい形態では、分離されているタンパク質混合物に対するＴ細胞の反応 性と抗体反応は、同時に、簡単でしかも正確に分析することができる。

本発明の第三の実施態様は、単一の化合物を精製する簡単にして迅速な方法であ る。この方法は、ゲル細片または分離されている物質を含む電気吸収転移された 膜を除去する工程、および染色、または特定のプローブを用いて反応させること により、所望の化合物を局在化する工程からなっている。好ましい一実施例にお いては、前記のプローブはモノクローナル抗体である。各溶出室は、鋭角的に尖 らせた室壁からの影響によって、膜上に示される。ゲル片を染色する場合、溶出 する室の局在化を示す多数の２−３ｍｍの穴が開く。溶出する室の各々を正確に マークする鋳型により、正確な穴明けを容易に実施することができる。これらの 試料により対象化合物を含む室を正確に同定することができる。

図２に見られる通り、本発明の方法と装置によりゲルの全ての部分を効果的に溶 出することができる。ゲルはＡとＢの二つの部分に分割されている。

ゲルのＡ部分は、溶出前に取り出されて、タンパク性用に染色されたものである 。

溶出ゲル（Ｂ部分）は、溶出工程終了後、移動の完了を確認するためにタンパク 性用染色を行ったものである。

ゲル中に、室壁端の位置を示す細（淡い線と、ゲル底部にぼんやりとした二つの 部分が見える。これら二つの所見により、次の二つの重要事項が強調されている 。

ｌ：　室壁を鋭角的に尖らせると、至適移動を妨げる表面が可能な限り少なくな る。

２：　ゲル底部の空気泡は、タンパク質の移動に干渉する。

図３の写真は、タンパク質類の複合混合物の分画を示している。

ヒト結核菌培養物の濾液を１０−２０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ １０−２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、本発明の複数の室を持つ電気溶 出装置で分画したものである。濾液と得られたフラクションを、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅと銀染色（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）により分析した。

レーンＦはヒト結核菌の濾液である。

レーン１〜１８はフラクション１〜１８である。

図４は、ヒト結核菌を感染させたマウスから採取した牌臓リンパ細胞の増殖反応 を示している。ヒト結核菌培養物濾液のフラクションを１：５で希釈したもので 刺激した培養基で細胞を増殖した。元のままの濾液に対する増殖反応は１８６０ ０ｃｐｍであり、刺激しない細胞の反応は５００ｃｐｍであった。増殖の測定は 、増殖細胞のＤＮＡに３■チミジンを組み入れたものを液体シンチレーション計 数によって測定した。

図５から、本発明の複数の室を持つ電気溶出装置により得たフラクションは毒性 がないことが窺える。

複数の室を持つ電気溶出装置のフラクションに低度の刺激を加えたもの、中等度 の刺激を加えたもの、高度の刺激を加えたものを、１：５から１：５００までの 範囲で希釈して検討した。全てのフラクションに明白な用量依存の関係、すなわ ち用量を大きくすればするほど、増殖反応が大きくなることが認められた。これ らの結果から、電気溶出装置の生成物に毒性がないことが強調されている。

前記から明らかなように、本発明の方法と装置とは次の大きな利点があることが 分かる。

先ず、日常的に常用されている、−個の一次元ゲル中の全ての成分を分離してお いて同時に溶出する作業を、迅速かつ簡単に実施することが可能である。さらに 、各種の厚さを持つ一次元ゲルを使用することが可能となり、したがって本発明 は最大限の適応性を持っている。このため、電気溶出装置を、通常のタンパク質 精製方法の一部とすることができるし、生成物を定量的、定性的に分析すること もできる。

三角形のウェルによって、全てのタンパク質のバンドをむらなく移動させること ができる。

分離フレームをスポンジの方向に伸ばして、取扱の容易な効率的な容器とするこ とができる。

緩衝液には毒性がな（、また溶出中に問題となる可能性がある塩化物イオンもな い。電気溶出装置の全ての部分に同じ緩衝液が使用されていて、省力的である。

溶出が完了したら、生成物を吸い出すので、機械を分解する必要がない。これに よって高い純度が維持できる。生成物は完全に毒性がなく、数多くの各種目的に 使用することができる。

最後に、鋳型を使用して正確な、しかも再現性の良い分画を行なうことができる 。

Ｆ　１　２　３　４　５　６　７　Ｂ　９１０１１１２１３１４１５１６１７１ １１ｃｐｍ　ｘ　１０００ Ｆｒａｃｔｉｏｎ （ｐｍｘ　１０００ 国際調査報告 国際調査報告 ＮＯ，ＰＣＴ／ＤＫ　９２１０００５８フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３／４８３ 　Ｆ　７０５５−２Ｊ３３１５８　Ａ　７０５５−２Ｊ Ｉ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．分離されているタンパク質類またはＤＮＡ／ＲＮＡなどの荷電巨大分子を含 有するポリアクリルアミドまたはアガロースゲルなどのゲルの電気溶出方法にお いて、前処置としてゲルを平衡化した後、適当な特定の緩衝液を使用する電気溶 出装置でゲル全体をーまとめにして溶出することにより予め分離をしておき、巨 大分子を単一のまたはそれと位置が近い複数の化合物を含有する狭い範囲のフラ クションに分割し、使用したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の大部分を取り 除き、さらにこれに先だって、正確で再現性の良い分画を可能にする鋳型により ゲルを切断することを特徴とする溶出方法。
2. ２．請求項１に記載の溶出方法において、次の工程、（ａ）過剰の塩と使用した ＳＤＳの大部分を取り除くために、好ましくは約３０〜４０分間、前処置として 緩衝液中でゲルを平衡化する工程、 （ｂ）溶出工程でイオン強度が低い特定の緩衝液を使用する工程、 （ｃ）短時間、好ましくは約１０秒間、電流の方向を反転させて、膜に付いた分 子をはがれ易くする工程、および （ｄ）全てのフラクションに充分な量のＰＢＳ×１０を添加してフラクションを 等張にする工程 のうち、２以上からなることを特徴とする溶出方法。
3. ３．請求項２に記載の溶出方法において、（ｂ）工程で使用する緩衝液がリン酸 塩であり、好ましくはその濃度が２ｍＭであることを特徴とする溶出方法。
4. ４．請求項１に記載の、ゲル中で分離されている全ての成分を多数の分離してい るセルに同時に溶出させる電気溶出装置において、 ａ）黒鉛陽極（４）を含む支持体（１）と、透析膜（６）で覆われているスポン ジ（５）を含む緩衝液（ただし、前記透析膜は任意により、例えば糊づけにより スポンジに固定される）、 ｂ）前記透析膜により各々底部の境界を定められている平行する複数の室（７） を含むフレーム（２）、ｃ）単離された化合物を採取する前記フレーム側面の開 口部、 ｄ）安全カバー（８）に埋め込まれた黒鉛陰極（３）、および ｅ）ゲルを正確に切除してから電気溶出を行う鋳型よりなることを特徴とする溶 出装置。
5. ５．請求項４に記載の溶出装置において、前記の室（７）が鋭角的に尖った先端 を持つ三角形であるため、ゲル中で分離されている全ての化合物が至適の移動を することができることを特徴とする溶出装置。
6. ６．請求項４に記載の溶出装置において、透析膜（６）が所望の化合物を集中さ せるように働き、塩とイオン性界面活性剤が、透析膜を通過してから取り除かれ る溶出装置。
7. ７．請求項４に記載の溶出装置において、透析膜（６）で覆われている前記スポ ンジ（５）が強制的にフレーム（２）と密接に接触して多数の密閉セルを形成し ていることを特徴とする溶出装置。
8. ８．請求項４に記載の溶出装置において、電源が安全カバー（８）に埋め込まれ ていて、前記電源が自動的に電流の方向を反転させることができる溶出装置。
9. ９．請求項４に記載の溶出装置において、装置側面の開口部が外部から近づくこ とができるので、装置を解体することなく、得られたフラクションを採取するこ とができ、取扱が安全で、高純度の生成物を得ることができることを特徴とする 溶出装置。
10. １０．請求項４に記載の溶出装置において、前記鋳型に調整線が書き込まれてい るので、分子の移動に伴うゲルの位置決めを正確かつ再現性良く行なうことがで きることを特徴とする溶出装置。
11. １１．請求項４に記載の溶出装置において、溶出と吸収転移とを同時に行なうた めに膜が挿入されていることを特徴とする溶出装置。
12. １２．請求項４に記載の溶出装置で使用する鋳型において、各室の位置が明示さ れていて、所望の単一の分子を含む室を同定できることを特徴とする溶出装置。